CN103068794A - 制备树花素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及合成树花素的方法，更特别涉及合成树花素的方法以及防止树花素分解的方法，该合成方法包括使2-肼基酚与在C-1处具有受保护的羧基和在C-2处具有受保护的氨基的L-谷氨酸反应。按照本发明，可以以高产率合成具有优异的抗氧化和抗炎活性的树花素，并由此可大量制造。此外，树花素可以稳定地长期保存，并由此可以容易地用于工业目的。

Description

制备树花素的方法
技术领域
本发明涉及合成树花素（ramalin）的方法，更特别涉及合成树花素的方法以及防止树花素分解的方法，所述合成方法包括使2-肼基酚与在C-1处具有受保护的羧基和在C-2处具有受保护的氨基的L-谷氨酸反应。
背景技术
地衣类似于不开花的植物，指的是真菌（地衣共生菌）和藻类（共生光合生物）和/或蓝藻菌的共生组合。在地衣中，真菌形成含有特征次级代谢产物的原植体或地衣基质（Ahmadjin V.,The lichen symbiosis,Wiley,New York,第1-6页,1993）。难以获得充足量的天然地衣样品，并且培养大量地衣的技术也是未知的。为此，与对高等植物的研究相比，对地衣的研究不足。
随着地衣的组织培养方法、批量生产方法和生化分析方法的改善，对其进行了积极的研究（Behera,B.C.等人,Lebensm.Wiss.Technol.,39:805,2006）。已经从地衣中分离出具有各种生物活性（包括细胞毒性、抗真菌活性、抗微生物活性和抗氧化活性）的化合物，包括脂肪酸、缩酚酸、缩酚酸环醚、二苯并呋喃、二萜类、蒽醌、萘醌、地衣酸、普耳文酸、呫吨酮和桥二硫哌嗪二酮（epidithiopiperazinediones）（Muller,K.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,56:9-16,2001）。
孔树花（Ramalina terebrata）是一种天然生长在南极乔治王岛（AntarcticKing George Island）上的地衣，并可以从乔治王岛上轻松地收集。在对南极地衣孔树花进行研究的过程中，本发明人之前已经分离了具有优异的抗氧化活性的新化合物树花素（韩国专利申请公布第10-2010-0052130号）。此外，已经报道了树花素具有优异的抗炎活性（韩国专利申请公布第10-2010-0052551号）。
因为证实树花素具有优异的抗氧化和抗炎活性，需要大量生产树花素。但是，用甲醇从孔树花中分离树花素的常规方法（韩国专利申请公布10-2010-0052130号）伴随着问题，其中树花素的生产是昂贵且耗时的，因为极地的地衣缓慢的生长速率，因为难以在自然界收集大量的极地地衣，并且从孔树花中提取的树花素的量非常小。此外，树花素因其高抗氧化活性而易于分解。此外，树花素难以保存，因为其如此不稳定以至于在室温下4天内超过其一半的量会消失。
L-谷氨酸是一种已经用作氨基酸基调味品的氨基酸，并且在商业上用作膳食补充剂、营养强化剂、增味剂或作为盐的替代品。由此，L-谷氨酸是廉价的，可以大量获得，并且同时具有类似树花素的光学活性位点。
因此，本发明人付出艰苦的努力开发化学合成树花素的方法，结果发现当使类似于树花素的具有光学活性位点的L-谷氨酸与2-肼基酚反应时，合成了表现出与源自天然材料的树花素效果相同的树花素，并且当合成的树花素与维生素C一起储存时，防止其分解，使得其可以长期保存，由此完成了本发明。
发明内容
本发明的一个目的在于提供合成具有优异的抗氧化和抗炎活性的树花素、其盐、其溶剂合物、或其盐的溶剂合物的方法。
本发明的另一目的在于提供防止合成的树花素分解的方法。
为了实现上述目的，本发明提供合成下式1表示的树花素、其盐、其溶剂合物或其盐的溶剂合物的方法，该方法包括：使2-肼基酚与在C-1处具有受保护的羧基和在C-2处具有受保护的氨基的L-谷氨酸反应，接着脱保护：
[式1]
Figure BDA00002830042800021
本发明还提供防止树花素分解的方法，该方法包括将树花素保持在溶解于含有维生素C（L-抗坏血酸）的溶剂中的状态下。
附图说明
图1是显示原材料L-谷氨酸和2-肼基酚彼此进行反应的反应位点的示意图。
图2是显示包括由L-谷氨酸合成树花素的过程的反应的一个实例的示意图。
图3是显示包括由2-氨基酚合成2-肼基酚的过程的反应的一个实例的示意图。
图4是显示合成的树花素的1H NMR结果的照片。
图5是显示测量在25℃和38℃下随保存时间改变的树花素的保存量的结果的一组图。
图6是显示合成树花素与天然材料衍生的树花素之间抗氧化活性比较的图。
具体实施方式
除非另行规定，本文中所用的所有技术和科技术语具有与本发明所涉及领域的普通技术人员通常理解的相同含义。通常，本文中所用的术语是公知的并通常用于本领域。
在一方面，本发明涉及合成下式1表示的树花素、其盐、其溶剂合物或其盐的溶剂合物的方法，该方法包括：使2-肼基酚与具有在C-1处具有受保护的羧基和在C-2处具有受保护的氨基的L-谷氨酸反应，接着脱保护：
[式1]
Figure BDA00002830042800031
本发明的树花素是一种新化合物，具有抗氧化活性，从南极地衣孔树花中分离。树花素的高分辨率ES-MS表明树花素是分子量为254.1141、分子式为C11H16N3O4并具有式1中所示结构的化合物。因为其是从孔树花中分离的化合物，因此命名为“树花素”。
本发明人已经努力开发化学合成树花素的方法以取代从孔树花中分离和提取树花素，结果发现，通过使2-肼基酚与在C-1处具有受保护的羧基和在C-2处具有受保护的氨基的L-谷氨酸反应，接着脱保护，可以合成树花素。
在本发明中，树花素的盐没有具体限制，只要其是药学可接受的盐。药学可接受的盐可以通过本领域已知的常规方法制备。例如，该药学可接受的盐可以是无机酸，如盐酸、氢溴酸、硫酸、硫酸氢钠、磷酸或碳酸的盐；有机酸，如甲酸、乙酸、草酸、苯甲酸、柠檬酸、酒石酸、葡糖酸、龙胆酸、富马酸、乳糖酸、水杨酸或乙酰水杨酸（阿司匹林）的盐；通过与碱金属，如钠和钾反应形成的金属盐；或通过与铵离子反应形成的另一种药学可接受的盐。
本文中所用的术语“溶剂合物”是指本发明的树花素或其盐的一种形式，其在固态或液态下通过与溶剂分子配位形成络合物。水合物是溶剂合物的特殊形式，其中与水发生配位。在本发明中，溶剂合物优选为水合物。
在本发明中，原材料2-肼基酚可以为甲苯磺酸盐形式。甲苯磺酸盐形式的2-肼基酚可以通过包括以下步骤的方法制备：（a）将2-氨基酚溶解在甲醇中并向其中加入氯化氢气体以获得2-氨基酚盐酸盐（HCl）；（b）将2-氨基酚盐酸盐溶解在乙醇中并向其中加入亚硝酸异戊酯以制造硝酰胺中间产物；和（c）将该中间产物加入到含有对甲苯磺酸（PTSA或TsOH）和氯化亚锡（SnCl2）的乙醇溶液中，由此获得2-肼基酚甲苯磺酸盐。
在本发明的优选实施方案中，在步骤（a）中，在向其中加入氯化氢气体时，2-氨基酚溶液可以保持在pH2-5下，结果可以以固体形式获得2-氨基酚盐酸盐。在步骤（b）中，2-氨基酚盐酸盐在乙醇中的溶液可以在大约-5℃下与亚硝酸异戊酯反应以制造硝酰胺中间产物。在步骤（c）中，该中间产物在乙醇中的溶液可以在低温（-5℃）下缓慢地添加到含有对甲苯磺酸（PTSA或TsOH）和氯化亚锡（SnCl2）的乙醇溶液中，由此获得2-肼基酚甲苯磺酸盐。
在本发明中用于制备2-肼基酚甲苯磺酸盐的化合物可以表示为下式：2-氨基酚（式2）、2-氨基酚盐酸盐（式3）、2-氨基酚硝酰胺中间产物（式4）和2-肼基酚甲苯磺酸盐（式5）。
[式2]
[式3]
Figure BDA00002830042800051
[式4]
Figure BDA00002830042800052
[式5]
Figure BDA00002830042800053
在本发明中，在C-1处具有受保护的羧基和在C-2处具有受保护的氨基的L-谷氨酸可以采用通常已知用于保护羧酸和氨基的方法进行保护。例如，羧基和氨基可以通过引入苄基来保护。但是，如果苄基用作保护基团，其可能不仅引入到C-1和C-2中，还可能引入到在C-5处的羧基中，为此，额外需要从C-5的羧基上除去苄基的步骤。在这种情况下，保护C-1的羧基的苄基也会被除去，导致产率降低。此外，在与2-肼基酚反应后除去该保护基团的步骤可能进行得较缓慢。
由此，在本发明的优选实施方案中，在C-1处具有受保护的羧基和在C-2处具有受保护的氨基的L-谷氨酸可以是其中该羧基与氨基环化的L-谷氨酸内酯。
在本发明更优选的实施方案中，该L-谷氨酸内酯可以通过将L-谷氨酸转化为仲胺形式，接着环化来获得。
如果将L-谷氨酸的伯胺环化，不仅C-1，而且C-5也会环化以形成7员环，说明不会发生所需反应。
在本发明的一个实施例中发现，当使用Troc将L-谷氨酸转化为仲胺形式的反应使用碳酸氢钠（NaHCO3）进行24小时时，可以在没有单独的提纯过程的情况下以大约85%的产率获得L-谷氨酸内酯。
在本发明的另一个实施例中发现，通过使用Troc将L-谷氨酸转化为伯酸形式，在作为酸催化剂的PTSA（对甲苯磺酸）的存在下在含有多聚甲醛的甲苯中回流转化的L-谷氨酸，除去反应过程中产生的水，当不再产生水时用碳酸钾（K2CO3）除去该催化剂，并从二乙醚和石油醚中重结晶残余物，由此可以获得白色纯净固体伯酸。该伯酸是L-谷氨酸，并具有下式6表示的结构：
[式6]
Figure BDA00002830042800061
由此，在本发明最优选的实施方案中，可以通过将氯甲酸-2,2,2-三氯乙酯（Troc）加入到L-谷氨酸中并使混合物反应来制备仲胺形式。
在本发明的一个实施例中发现，当式6的L-谷氨酸（伯酸）(在C-1处具有受保护的羧基和在C-2处具有受保护的氨基)与在C-5的羧基活化后与2-肼基酚偶联，以50%的产率获得反应产物。
由此，在本发明中，在C-1处具有受保护的羧基和在C-2处具有受保护的氨基的L-谷氨酸优选在C-5处具有活化的羧基。例如，羧基的活化可以通过加入二环己基碳二亚胺（DCC）、1-羟基苯并三唑（HOBt）、亚硫酰氯或氯甲酸乙酯来引发。
在本发明的一个实施例中发现，当二环己基碳二亚胺（DCC）和1-羟基苯并三唑（HOBt）用于活化羧基时，与活化同时发生偶联反应，但是处于不稳定状态的2-肼基酚分解，因为反应时间为20小时或更久。而当亚硫酰氯或氯甲酸乙酯用作活化化合物时，该反应产率为30%。因此，优选使用DCC和HOBt活化该羧基（产率：50%）。
由此，在本发明最优选的实施方案中，用二环己基碳二亚胺（DCC）和1-羟基苯并三唑（HOBt）处理在C-1处具有受保护的羧基和在C-2处具有受保护的氨基的L-谷氨酸以活化C-5处的羧基，并额外地用三乙胺（TEA）处理。
在本发明的一个实施例中，使用锌和乙酸将受保护的基团脱保护，由此获得树花素。
由此，在本发明中，锌和乙酸均可用于脱保护。此外，本领域已知的任何方法可用于脱保护。
在本发明的一个实施例中发现，当树花素（因其高抗氧化活性，树花素在室温下很短时间内分解）溶解并保持在含有维生素C的溶剂中时，其保持了一段相当长的时间。
由此，在另一方面，本发明涉及防止树花素分解的方法，该方法包括将树花素保持在溶解于含有维生素C（L-抗坏血酸）的溶剂中的状态下。
在本发明中，树花素以与维生素C相同的浓度溶解。溶解树花素的溶剂优选为水。更优选地，维生素C和树花素以1000ppm的浓度溶解在水中。
实施例
下面参照实施例更详细地描述本发明。对本领域普通技术人员显而易见的是，这些实施例仅为示例目的而不解释为限制本发明的范围。
实施例1：制备在C-1处具有受保护的羧基和在C-2处具有受保护的氨基 的谷氨酸和2-肼基酚
1-1：制备Troc-L-谷氨酸
如图1中所示，合成树花素所需的Troc-L-谷氨酸以如下方式制备。
在500毫升双口圆底烧瓶中，将31.5克（0.375摩尔）的NaHCO3溶解在125毫升水中以制造溶液。在该烧瓶装备回流冷凝器和滴液漏斗后，在室温下在用磁棒搅拌下缓慢地向其中加入14.7克（0.1摩尔）的L-谷氨酸。反应溶液的温度升高至35℃，向其中缓慢滴加氯甲酸-2,2,2-三氯乙酯。将反应混合物加热至40～45℃并搅拌6小时。
接着，将温度降低至室温，随后将反应混合物继续搅拌大约15小时。在反应完成后，向反应溶液中加入二乙醚（30毫升），洗涤水层，除去有机层。通过缓慢加入5M的HCl将水层pH调节至2，随后用乙酸乙酯（EA）萃取三次（50毫升×3），将保留在水层中的产物溶出。该EA萃取物用MgSO4干燥以除去水并在旋转蒸发器中浓缩。在完全除去EA后，获得浅黄色液体的标题产物。
结果，可以以大约85%的高产率和在没有单独的提纯过程情况下以高纯度获得类似图2中第一反应后所显示的化合物，被N-Troc保护的Troc-L-谷氨酸。
为了确定产物的结构，使用JEOL JNM ECP-400光谱仪（对1H为500MHz，对13C为500MHz）除D2O外在丙酮-d6中记录NMR谱（1D和2D），并相对于残留的丙酮-d6（dH/dC=2.22/21.0）标记化学位移。对1JCH=140Hz和nJCH=8Hz优化HMQC和HMBC试验。
1H NMR(δppm,丙酮d6):1.55-2.75(m,4H,CH2CH2);4.15-4.55(m,1H,CH);4.70(s,2H,CH2CCl3);6.65(d,J8Hz,1H,NH);10.6(s,2H,OH)。
1-2：环化
为了环化实施例1-1中获得的Troc-L-谷氨酸的受保护的羧基和氨基，以如下方式进行环化。在500毫升原底烧瓶中，将N-Troc谷氨酸（0.04摩尔）溶解在甲苯（200毫升）中。烧瓶装有迪安-斯塔克分离器和回流冷凝器，随后将2.4克（0.08摩尔）的多聚甲醛和0.46克（0.0024摩尔）的PTSA加入到烧瓶中。反应温度升高至120℃，反应混合物在回流下搅拌并加热大约3小时，直到迪安-斯塔克分离器中不再产生水。
在反应完成后，反应混合物冷却至室温，并向其中加入50毫升EA。随后加入4毫升的0.3M的K2CO3以便使反应溶液分层，将有机层分离。有机层用5毫升水洗涤三次并用MgSO4干燥，并通过蒸发除去溶剂。通过加入5毫升乙醚和5毫升石油醚洗涤所得白色固体。
结果，在过滤和干燥后以85%的产率获得白色纯净固体的类似图2中第二反应后显示的化合物。该白色固体发现为N-三氯乙氧基羰基-L-谷氨酸内酯，其中在C-1处的羧基和在C-2处的氨基被环化所保护。
为了确定产物的结构，使用JEOL JNM ECP-400光谱仪（对1H为500MHz，对13C为500MHz）除D2O外在丙酮-d6中记录NMR谱（1D和2D），并相对于残留的丙酮-d6（dH/dC=2.22/21.0）标记化学位移。对1JCH=140Hz和nJCH=8Hz优化HMQC和HMBC试验。
1H NMR(δppm,丙酮d6):2.15-2.65(m,4H,CH2CH2);4.51(m,1H,CH);4.82-5.00(m,2H,CH2CCl3);5.37-5.59(m,2H,NCH2O);10.32(s,1H,OH)。
1-3：制备2-肼基酚
以如下方式制备2-肼基酚。在圆底烧瓶中，在室温下将50克（0.46摩尔）的2-氨基酚完全溶解在甲醇中。溶液在大约2-5的pH下搅拌15小时或更久，同时通过单独的HCl气体管鼓泡。当pH保持在2-5时，反应溶液用氮气吹扫大约30分钟，随后在旋转蒸发器中浓缩以获得棕色固体。该固体用EA:己烷=3:7的溶液洗涤，过滤并干燥至干。收集制得的固体（2-氨基酚盐酸盐）。
60克（0.41摩尔）收集的固体完全溶解在300毫升乙醇中并冷却至-5℃。将55.3克（0.41摩尔）的亚硝酸异戊酯稀释在乙醇中并滴加到起始溶液中，接着搅拌30分钟（在-5℃）。在另一圆底烧瓶中，将156.3克（0.82摩尔）氯化亚锡和78.4克（0.41摩尔）PTSA溶解在EtOH中并冷却至-5℃，在搅拌下经1小时或更久将上文的氨基酚混合物缓慢添加到其中。在反应完成后，向反应混合物中加入500毫升二乙醚，随后搅拌10分钟，过滤沉淀的固体。过滤的固体用200毫升EA和400毫升己烷洗涤并干燥，由此获得2-羟基苯基肼甲苯磺酸盐。图3示意性地显示该反应。
结果，以大约80%的产率制备类似图3结尾处显示的化合物，2-肼基酚。
为了确定产物的结构，使用JEOL JNM ECP-400光谱仪（对1H为500MHz，对13C为500MHz）除D2O外在丙酮-d6中记录NMR谱（1D和2D），并相对于残留的丙酮-d6（dH/dC=2.22/21.0）标记化学位移。对1JCH=140Hz和nJCH=8Hz优化HMQC和HMBC试验。
1H NMR(δppm,CD3OD):2.37(s,3H);6.85(m,2H);7.00(m,2H);7.24(d,J=10,2H);7.71(d,J=10,2H)。
实施例2：合成树花素
2-1：2-肼基酚与L-谷氨酸内酯偶联
2-1-1：与通过DCC和HOBt活化的L-谷氨酸内酯偶联
将5克（14.9毫摩尔）实施例1-2中制备的N-三氯乙氧基羰基-L-谷氨酸内酯溶解在80毫升MC（二氯甲烷）中，随后向其中加入4.16克（5毫升/毫摩尔）的1.35当量的DCC和3.03克的1.5当量的HOBt，混合物用磁棒搅拌。在另一烧瓶中，将4.9克（1.2当量）2-肼基酚甲苯磺酸盐（2-羟基苯基肼甲苯磺酸盐）和2.5毫升TEA添加到MC中并冷却至0℃。所得肼溶液在0℃下缓慢地滴加到上述起始溶液中。在0℃下反应1小时后，使反应混合物在室温下反应12小时。当通过TLC确定反应完成时，反应混合物分别用1N的HCl、饱和NaHCO3和盐水各洗涤三次。将有机层分离并用MgSO4干燥以除去水。
结果，获得不含溶剂的粗产物。其可以在没有提纯过程的情况下用于后继反应。提纯结果表明反应产率为大约50%。
2-1-2：与被亚硫酰氯保护的L-谷氨酸内酯偶联
在50毫升烧瓶中，将0.01摩尔实施例1-2中制备的N-三氯乙氧基羰基-L-谷氨酸内酯溶解在2毫升纯CCl4中，并在搅拌下向其中加入3.7毫升（0.05摩尔）亚硫酰氯。烧瓶装有回流冷凝器，混合物在水浴中加热至70℃。在加热过程中生成气体，并用气量计或气球检查气体的生成。当不再生成气体时，将温度降低至室温，并完全除去溶剂。向残余物中加入纯的无水CH2Cl2，并通过蒸发除去残余的HCl或二氧化硫。
接着，在完全干燥的100毫升圆底烧瓶中，将大约0.01摩尔活化的L-谷氨酸内酯溶解在50毫升CH2Cl2中。在另一个烧瓶中，使2-肼基酚甲苯磺酸盐（0.0095摩尔）和三乙胺（0.0095摩尔）完全溶解在MC中。所得肼溶液缓慢地添加到上述起始溶液中，并向其中加入吡啶（0.8毫升）。反应溶液在40℃下加热大约3小时，随后降低至室温并搅拌大约15小时。随后，反应溶液用15毫升蒸馏水和15毫升NaHCO3饱和溶液洗涤，随后用15毫升蒸馏水洗涤两次。有机层用MgSO4处理以除去水，随后将其过滤并浓缩，由此获得粗产物。
结果发现以大约30%的产率获得粗产物。
2-2：通过脱保护获得树花素的反应
为了通过从实施例2-1的产物（即，N-苄氧基羰基-L-谷氨酸内酯苯基肼）上除去保护基团以获得纯树花素，将790毫克（0.0018摩尔）的该产物添加到100毫升圆底烧瓶中并溶解在6毫升乙酸中。在用磁棒搅拌下向该溶液中缓慢加入7毫升的水，并向其中加入1克锌粉末。在距离锌粉加入的时间点大约2分钟时，反应溶液的颜色变澄清。此时，向溶液中缓慢加入5毫升水，随后搅拌5分钟。在5分钟后，将反应溶液过滤以除去锌，并用10毫升MC洗涤两次。将水层浓缩并通过反相柱色谱法提纯，由此获得树花素。图1至3示意性地显示实施例1-1至2-2的反应。
通过上述反应，以大约40%（在提纯后）的产率获得了树花素，纯度为大约99%。合成的树花素以固态储存在低温（-24℃）下。
为了确定产物的结构，使用JEOL JNM ECP-400光谱仪（对1H为500MHz，对13C为500MHz）除D2O外在丙酮-d6中记录NMR谱（1D和2D），并相对于残留的丙酮-d6（dH/dC=2.22/21.0）标记化学位移。对1JCH=140Hz和nJCH=8Hz优化HMQC和HMBC试验。
如图4中所示，合成的树花素的NMR分析结果如下：1H NMR(δppm,CD3OD d6):2.18(m,2H);2.50(m,2H);3.77(t,J=6,1H);6.85(m,4H)。由此发现合成的树花素的结构与从天然材料中分离的树花素相同。
实施例3：通过HPLC检测树花素的提高的稳定性
因其高抗氧化活性，树花素容易分解，并且其如此不稳定以至于在室温下4天中将有超过一半的量消失。由此，为了找到长期保存树花素的方法，将树花素与维生素C（L-抗坏血酸）以1:1（各1000ppm）的比例混合并在25℃和38℃下储存，并分析其稳定性。
在变化的时间点，使用Agilent Eclipse XDB-C18柱（4.6×150毫米）通过半制备反相HPLC分析10微升样品。所用的溶剂体系由含0.1%富马酸的水（A线）和含0.1%富马酸的甲醇（B线）组成。在下列条件下进行分析总计30分钟：由0%至5%15分钟，由5%至90%5分钟，由90%至0%5分钟，最后由0%至5分钟。流速为0.7毫升/分钟。随后，通过HPLC的面积值（mAU×S）测定树花素量的变化。
结果，如在图5中可以看到，单独的树花素随时间推移快速分解。但是，当树花素和维生素C（L-抗坏血酸）以1:1（各1000ppm）的比例混合并储存在水中时，保持树花素的稳定性。此外，当树花素与维生素C一起储存时，其甚至在38℃也相当稳定，单独储存的树花素在该温度下将完全消失。换言之，在38℃下，维生素C提前分解，随后树花素开始消失，在大约200小时后（维生素C几乎消失），树花素相当稳定。
实施例4：比较源自天然材料的树花素和合成的树花素之间的抗氧化活性
为了比较合成的树花素与源自天然材料的树花素的抗氧化活性，测量树花素针对2,2-二(4-叔辛基苯基)-1-苦肼基（DPPH）自由基的活性。丁基化羟基茴香醚（BHA）用作对照物。此外，用于该实验的测量的化合物均具有98%或更高的纯度。
具体而言，以不同浓度（0.1-3.0微克/毫升）溶解在甲醇中的各1.5毫升的源自天然材料的树花素、合成的树花素和对照物BHA与0.5毫升0.1mM溶解在相同溶剂中的DPPH混合。在不存在光的情况下使混合物在室温下反应30分钟，随后用UV-可见分光光度计（SCINCO，Korea）测量在517纳米处的吸光度。作为空白，使用0.5毫升0.1mM的DPPH与1.5毫升甲醇之间的反应产物。使用下列方程计算给电子能力（DEA）：
给电子能力(DEA)%={1-(S/B)}×100
其中S是DPPH与样品之间的反应产物在517纳米处的吸光度，B是DPPH与甲醇之间的反应产物在517纳米处的吸光度。
结果，如在图6和下表1中可见，源自天然材料的树花素的IC50值为1.22微克/毫升，合成的树花素的IC50值为0.96微克/毫升，表明源自天然材料的树花素与合成的树花素具有差不多类似的抗氧化活性。
表1
化合物 IC50值(μg/ml)
合成的树花素 0.96
作为对照物的丁基化羟基茴香醚（BHA） 1.43
源自天然材料的树花素 1.22
工业实用性
如上所述，按照本发明，可以以高产率合成具有优异的抗氧化和抗炎活性的树花素，由此可以大量制造。此外，树花素可以稳定地长时间保存，并由此可以容易地用于工业目的。
尽管参照特定特征对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员将明白，该说明仅仅是针对优选的实施方案而不限制本发明的范围。由此，本发明的真实保护范围将由所附权利要求及其等同物来限定。

Claims (10)

1.一种合成下式1表示的树花素、其盐、其溶剂合物或其盐的溶剂合物的方法，所述方法包括：使2-肼基酚与在C-1处具有受保护的羧基和在C-2处具有受保护的氨基的L-谷氨酸反应，然后脱保护：
[式1]
Figure FDA00002830042700011
2.如权利要求1所述的方法，其中2-肼基酚为甲苯磺酸盐形式。
3.如权利要求2所述的方法，其中甲苯磺酸盐形式的2-肼基酚通过包括以下步骤的方法制备：
（a）将2-氨基酚溶解在甲醇中并向其中加入氯化氢气体以获得2-氨基酚盐酸盐（HCl）；
（b）将2-氨基酚盐酸盐溶解在乙醇中并向其中加入亚硝酸异戊酯以制造硝酰胺中间产物；和
（c）将所述中间产物加入到含有对甲苯磺酸（PTSA或TsOH）和氯化亚锡（SnCl2）的乙醇溶液中，由此获得2-肼基酚甲苯磺酸盐。
4.如权利要求1所述的方法，其中在C-1处具有受保护的羧基和在C-2处具有受保护的氨基的L-谷氨酸是其中的羧基与氨基环化的L-谷氨酸内酯。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述L-谷氨酸内酯通过将L-谷氨酸转化为仲胺形式，接着环化而获得。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述仲胺形式通过将氯甲酸-2,2,2-三氯乙酯（Troc）添加到L-谷氨酸并使混合物反应来制备。
7.如权利要求1或4所述的方法，其中在C-1处具有受保护的羧基和在C-2处具有受保护的氨基的L-谷氨酸优选在C-5处具有活化的羧基。
8.如权利要求7所述的方法，其中通过用二环己基碳二亚胺（DCC）和1-羟基苯并三唑（HOBt）处理所述L-谷氨酸来活化C-5处的羧基。
9.如权利要求8所述的方法，其中通过额外地用三乙胺（TEA）处理所述L-谷氨酸来活化C-5处的羧基。
10.一种防止树花素分解的方法，所述方法包括将树花素保持在溶解于含有维生素C（L-抗坏血酸）的溶剂中的状态下。
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