CN103059106B - 多粘菌素衍生物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及多粘菌素衍生物，其中R1、R2和R3是任选的，R1、R2、R3、R5、R8和R9是阳离子氨基酸残基或中性氨基酸残基，其被选择成使得在生理pH下正电荷总数至少是2但不超过3；本发明还涉及包含至少两种这样的衍生物的组合产品。本发明还涉及通过向受试者施用治疗有效量的本发明衍生物来治疗、减轻或改善所述受试者中由革兰氏阴性菌所造成的感染的方法；本发明还涉及通过同时或以任意顺序依次向受试者施用治疗有效量的抗菌剂和本发明衍生物来使得革兰氏阴性菌对所述抗菌剂致敏的方法；本发明还涉及用于开发新抗生素的方法；用于降低肾毒性的方法，用于改善天然多粘菌素和八肽菌素的药代动力学特性的方法；以及用于使得具有临床重要性的细菌对血清中存在的宿主防御机制补体致敏的方法。最后，本发明涉及制备此类多粘菌素衍生物的方法。

Description

多粘菌素衍生物及其用途
本申请是申请号为200780029855.5的中国专利申请的分案申请，原申请是国际申请PCT/FI2007/050441的中国国家阶段申请。
技术领域
本发明涉及多粘菌素衍生物及其在治疗由革兰氏阴性菌引起的感染中的用途。所述多粘菌素衍生物可具有抗菌效果，或者可使细菌致敏，以增强其他抗菌剂的效果。
背景技术
脓毒症每年使超过215000名美国人丧生。估计每年有750000名美国人感染重症脓毒症，其中29％死亡。脓毒症死亡占美国所有死亡人数中的9％。在美国，脓毒症造成的死亡人数与心肌感染相同，甚至比交通事故还多。
每年有两百万至三百万美国人发生医院感染，其中10％发展成为脓毒症。这些患者中超过90000名死于在医院感染的脓毒症。
根据2000年的OECD健康报告，在欧盟，重症监护室(ICU)中重症脓毒症和脓毒性休克(重症脓毒症合并低血压)每年夺走多达135000条生命。在英国，隶属于NHS组织的急症护理医院中每年100000名患上医院感染的患者中有5000名死于脓毒症。
由于易患脓毒症患者(例如老人、早产儿以及癌症患者)数量的增长，尤其是因为许多严重疾病比以前更容易治疗，因此死亡人数逐年增加。同样，侵入性医疗装置和积极性方法的使用也有所增加。
革兰氏阴性菌所造成的脓毒症性感染超过总数的40％，许多革兰氏阴性菌具有极高的多重抗药性。对革兰氏阴性菌的治疗比革兰氏阳性菌更有挑战性，因为它们具有独特的结构——作为其最外层结构的外膜。位于外膜的脂多糖分子抑制许多抗菌剂向其最终靶标所处的细胞深处扩散。1972-1991年间超过95％从自然界中分离或化学合成的新型抗菌素对革兰氏阴性菌缺乏活性(Vaara 1993)。
多粘菌素是由多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)菌株及相关生物所产生的一组密切相关的抗生素物质。这些阳离子药物是分子量约为1000的相对简单的肽。多粘菌素(例如多粘菌素B)是十肽抗生素，即它们由10个氨酰基残基组成。它们具有杀菌性，对革兰氏阴性菌(例如大肠杆菌(Escherichia coli)以及肠杆菌(Enterobacteriaceae)、假单胞菌(Pseudomonas)、波美不动杆菌(Acinetobacter baumannii)等的其他物种)尤其有效。但是，多粘菌素具有严重的副作用，包括肾毒性和神经毒性。因此，由于其高全身毒性，这些药物作为治疗剂的用途十分有限。
多粘菌素已经用于治疗由这些细菌所造成的严重感染，但是由于其毒性，在上世纪70年代当开发了更新、耐受更好的抗生素时，它们大多被弃用。尽管它们具有毒性，最近革兰氏阴性菌多重抗药性菌株的出现使得多粘菌素治疗性应用成为最后的手段，并且因为许多较低毒性的抗生素对所述细菌的特定菌株已丧失效力，所以多粘菌素的应用已经再次出现增长。
因此，现在多粘菌素再次成为治疗工具，尽管由于其毒性而规模极为有限。但是，其全身(即非局部)应用大多仅限于治疗由绿脓假单胞菌(Ps.aeruginosa)和波美不动杆菌(A.baumannii)的多重抗药性菌株以及由具有卡巴培南抗性的肠细菌所造成的危及生命的感染。
多粘菌素由环状七肽部分和线性部分组成，所述线性部分由三肽部分和与所述三肽的N端氨基酸残基之α氨基相连的疏水脂肪酸尾组成，其可以由以下通式表示：
其中，R1-R3代表三肽侧链部分；R4-R10代表七肽环部分，R(FA)代表与所述三肽的N端氨基酸残基之α氨基相连的疏水脂肪酸尾。
多粘菌素组包含下列多粘菌素：A1、A2、B1-B6、C、D1、D2、E1、E2、F、K1、K2、M、P1、P2、S和T(Storm等1977；Srinivasa和Ramachandran 1979)。所有多粘菌素都是多阳离子的，并且除带有4个正电荷的多粘菌素D、F和S以外均带有5个正电荷。值得注意的是，缺乏脂肪酸部分R(FA)但带有R1-R10的修饰多粘菌素与其所来源的天然多粘菌素相比具有一个额外的正电荷，这是由于所述衍生物N端的游离α氨基。因此，例如，这样的多粘菌素B或多粘菌素E衍生物带有总共6个正电荷。
临床使用的多粘菌素B和多粘菌素E彼此仅在残基R6存在差异，它在多粘菌素B中是D-苯丙氨酰残基，而在多粘菌素E中则是D-亮氨酰残基。
环杆菌素(circulin)A和B也归类为多粘菌素(Storm等1977)。它们与其他多粘菌素的差异仅在于R7位带有异亮氨酰残基，而其他多粘菌素在所述位置带有苏氨酰或亮氨酰残基。一些多粘菌素结构的总结可参见表1。
表1
选定的多粘菌素和八肽菌素及其选定衍生物的结构
多粘菌素B由下式表示：
市售多粘菌素B是混合物，其中R-FA主要是6-甲基辛酰基(6-MOA，在多粘菌素B1中)，但也可以是相关的脂肪酰基如6-甲基庚酰基(6-MHA，在多粘菌素B2中)、辛酰基(在多粘菌素B3中)或庚酰基(多粘菌素B4中)(Sakura等2004)。所有这些变体针对革兰氏阴性菌(例如大肠杆菌)均同样有效(Sakura等2004)。十分类似的是，在多粘菌素E1(粘杆菌素A)中和环杆菌素A中，R-FA是6-MOA，而在多粘菌素E2(粘杆菌素B)中和环杆菌素B中，R-FA是6-MHA。许多研究人员已将多种疏水部分(包括多种脂肪酰残基)附着到多粘菌素衍生物和类似物的N端，并显示所得衍生物具有强有力的抗菌活性(Chihara等1973，Sakura等2004和美国专利公开2006004185中)。甚至，带有9-芴甲氧羰基大疏水残基作为R-FA的衍生物在抑制大肠杆菌和其他革兰氏阴性菌生长方面几乎与多粘菌素B一样有效(Tsubery等2001)。
就生物活性而言，七肽环结构是必要的(Storm等1997)。具有八肽环的衍生物作为抗生素的活性显著降低。
已经对多粘菌素和多种多粘菌素样合成分子进行了多种修饰，它们其中某些限制仍保留其生物学活性。所述修饰包括但不限于在侧链上的修饰，以及其中固有的疏水氨基酸残基(例如DPhe或Leu)被替换为另一种疏水氨基酸残基或者其中阳离子Dab被替换为另一种带阳离子氨酰残基(例如Lys、Arg或鸟氨酸残基)的分子(Storm等1997，Tsubery等2000a，Tsubery等2002，US专利公开2004082505，Sakura等2004，US专利公开2006004185)。
产生具有至少部分微生物学活性的化合物的修饰包括但不限于烷酰基酯，其中苏氨酰残基的OH基与烷酰基(例如丙酰基和丁酰基)形成酯(美国专利3450687)。
八肽菌素与多粘菌素E(粘杆菌素)其他各处均相同，只是共价键取代了残基R1-R2(表1)。在本发明中，R的位置根据天然多粘菌素中的位置编号，因此，八肽菌素的侧链中惟一的氨基酰残基被定义为R3。因此，八肽菌素是八肽，而所有天然多粘菌素都是十肽，并且它们仅带有4个正电荷。多种八肽菌素(A1、A2、A3、B1、B2、B3、C1)中的R-FA残基包括：3-OH-8-甲基癸酸、3-OH-8-甲基壬酸和β-OH-6-甲基辛酸。带有6-18个碳原子的脂肪酰残基的衍生物具有抗大肠杆菌的强抗菌活性(Storm等1977)。
多粘菌素在革兰氏阴性菌中的第一靶标是其外膜(outer memberane，OM)，它是抗许多毒性剂(包括大(Mw大于700d)抗生素和疏水抗生素)的有效透过性屏障。通过与暴露于OM外表面的脂多糖(LPS)的结合，多粘菌素破坏OM的结构和功能，结果多粘菌素本身及许多其他毒剂可透过OM(即使其成为可透过的)(Nikaido和Vaara 1985，Vaara 1992，Nikaido 2003)。多粘菌素的最终和致死靶标(杀菌靶标)被认为是细菌的细胞质膜(内膜)。
已经进行了许多努力来降低多粘菌素的毒性。用甲醛和亚硫酸氢钠处理多粘菌素E(粘杆菌素(colistin))产生甲磺酸粘杆菌素，其中5个二氨基丁酸残基的游离氨基被甲磺基基团取代(表1)。该制备物由单-、二-、三-、四-和五-取代的化合物的不确定混合物组成。甲磺酸化的制备物在新溶解于水时，起初缺乏母体分子的抗菌活性和毒性，但是当所述化合物在溶液中、血液中或者组织中开始分解时，产生较少取代的衍生物和游离的粘杆菌素，恢复了部分抗菌活性和毒性。另外，市售的药物制剂中最初的甲磺酸化程度各有不同。已经有许多其他封闭所有游离氨基的方法被公开。其实例包括但不限于与氨基酸形成不稳定的希夫碱(Storm等1977)。
1973年，通过酶促处理多粘菌素E获得的并且缺乏R-FA和R1的多粘菌素E九肽(PMEN，粘杆菌素九肽，表1)在小鼠的急性毒性测定(推测由于直接神经肌肉阻断而立即死亡)中显示出比母体化合物更低的毒性(Chihara等1973)。但是，它也缺乏抗菌活性，如对其抑制细菌生长的能力所进行测量的(Chirara等1973)。
另一方面，Vaara和Vaara显示，多粘菌素B九肽(PMBN，表1)保留了透过革兰氏阴性菌OM的能力(Vaara和Vaara 1983a，b，c；美国专利4,510,132；Vaara 1992)。因此，即使它缺乏直接的抗菌能力(即抑制细菌生长的能力)，它也能够使细菌对多种抗菌剂(例如疏水抗生素和大抗生素以及一些其他毒剂)致敏(即使其敏感或者如所称的使其易感)。
PMBN也使细菌对作为对抗侵入物的第一道防御系统而存在于新鲜人血清中的人补体系统的抗菌活性致敏(Vaara和Vaara 1983a，Vaara等1984，Vaara 1992)。另外，它使细菌对血清补体和人多形核白细胞的联合杀菌活性致敏(Rose等1999)。
PMBN类似于PMEN，在小鼠的急性毒性测定中比未修饰多粘菌素的毒性更低。在其他的毒理学测定中，一些标准证明PBMN具有比其母体化合物更低的毒性，但是此多粘菌素衍生物仍然被判定为对临床应用来说肾毒性过高(Vaara 1992)。
PMBN带有5个正电荷。接下来的研究表明，正如所预期的那样，也带有5个正电荷的PMEN以及都带有6个正电荷的脱酰基多粘菌素B和脱酰基多粘菌素E都是能使得细菌对其他抗生素致敏的有力药剂(Viljanen等1991，Vaara 1992)。另外，显示出结构上进一步简化的衍生物多粘菌素B八肽(PMBO)保留了非常有效的穿透活性，而多粘菌素B七肽(PMBH)活性较低(Kimura等1992)。PMBN、PMEN和PMBO带有5个正电荷，而PMBH仅带有4个正电荷。此差异可解释PMBH较弱的活性。
Ofek、Tsubery和Friedkin小组最近描述了与吸引多形核白细胞的趋化肽(例如fMLF)相连的多粘菌素样肽(美国专利公开2004082505，Tsubery等2005)。他们描述了均带4个正电荷的肽fMLF-PMBN、MLF-PMBN、fMLF-PMEN、fMLF-PMBO和MLF-PMBO，它们使得革兰氏阴性菌对抗生素致敏，尽管没有公开与浓度逐渐增加的所述化合物进行的比较研究(Tsubery等2005)。
为了研究多粘菌素的结构和功能特性，一些研究工作公开了带少于4个正电荷的多粘菌素衍生物等。
Teuber(1970)描述了用醋酸酐处理多粘菌素B，产生含有多粘菌素B及其单-、二-、三-、四-和五-N-乙酰化形式的制备物。Teuber还分离了每个组，并使用琼脂扩散测定非定量地报告了五-乙酰化和四-乙酰化形式缺乏停止鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)生长的能力，而二-和单乙酰化形式具有此能力。三乙酰化形式具有部分此能力。
Srinivasa和Ramachandran(1978)分离了部分甲酰化的多粘菌素B衍生物，并显示二甲酰基衍生物和三甲酰基衍生物抑制绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的生长。他们未公开所述化合物使细菌对抗生素致敏的能力。另外，1980年，他们显示，三甲酰基多粘菌素B在残基R1和R3上的游离氨基以及二甲酰基多粘菌素B在残基R1、R3和R5上的游离氨基对于生长抑制是必要的，而R8和R9上的游离氨基则不是必要的(Srinivasa和Ramachandran，1980a)。
Sakura等(2004)公开了缩短的多粘菌素B衍生物辛酰基多粘菌素B七肽。将辛酰基残基附着到多粘菌素B七肽的R4残基N端产生仅带3个正电荷的化合物。Sakura等发现了辛酰基多粘菌素B七肽仅在非常高浓度(128μg/ml)时抑制细菌生长，而其他衍生物(例如都带有4个电荷的辛酰基多粘菌素B八肽和辛酰基多粘菌素B九肽)是抑制细菌生长的强力药剂。
美国专利公开2006004185最近公开了某些可用于合成新型肽抗生素的多粘菌素衍生物和中间产物。所述抗菌化合物带有4或5个正电荷。
对于有效治疗细菌感染(特别是多抗性革兰氏阴性菌造成的感染)仍然有着迫切的需求。
发明内容
本发明涉及多粘菌素衍生物，其中在生理pH下正电荷总数至少为2但不超过3，其前提为当R(FA)-R1-R2-R3构成天然多粘菌素B侧链时R8和R9不全是甲酰化的，并且当R4-R10构成天然多粘菌素B环结构时R4不直接与辛酰基相连。更特别的，本发明涉及这样的衍生物，其中R1-R10选自SEQ ID NO：9-26，更优选选自SEQ ID NO：9-20。
本发明还涉及包含两种或更多种本发明衍生物的组合产品，并涉及包含此类衍生物或其组合以及可药用载体和赋形剂的药物组合物。
另外，本发明涉及治疗、减轻或改善个体中由革兰氏阴性菌所造成的感染的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的本发明衍生物或组合，其中所述细菌可选自大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和波美不动杆菌(Acinetobacterbaumanni)。
在另一个实施方案中，本发明涉及使得革兰氏阴性菌对抗菌剂致敏的方法，所述方法包括同时或以任意顺序依次施用治疗有效量的所述抗菌剂和本发明衍生物，其中所述抗菌剂可选自：克拉霉素、阿奇霉素、红霉素和其他大环内酯类药物、酮内酯类、克林霉素和其他林可酰胺类、链阳性菌素类、利福平、利福布汀、利福拉齐及其他利福霉素类、夫西地酸、莫匹罗星、噁唑烷酮类、万古霉素、达巴万星(dalbavancin)、特拉万星(telavancin)、奥利万星(oritavancin)及其他糖肽抗生素、氟喹诺酮类、杆菌肽、四环素衍生物、β内酰胺抗生素、新生霉素、截短侧耳素类、叶酸合成抑制剂、去甲酰酶抑制剂和细菌流出泵抑制剂。
本发明还提供了开发新抗生素的方法；用于降低天然多粘菌素、八肽菌素及其衍生物的毒性的方法；用于改善天然多粘菌素、八肽菌素及其衍生物的药物代谢动力学特性的方法；以及用于使得在临床上具有重要性的细菌对血清中存在的宿主防御机制补体致敏的方法。
本发明还提供了本发明多粘菌素衍生物在制备用于治疗革兰氏阴性菌(例如大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和波美不动杆菌(Acinetobacterbaumanni))所引起的感染的药剂中的用途；在制备用于使革兰氏阴性菌对抗菌剂致敏的药剂中的用途；以及在制备用于使革兰氏阴性菌对存在于血清中的宿主防御机制补体致敏的药剂中的用途。
最后，本发明还涉及用于制备本发明多粘菌素衍生物的方法，所述方法包括通过用中性残基或共价键替换1至4个所述带正电残基或者通过将1至4个所述带正电残基转变成中性残基来修饰带有4至6个带正电残基的天然或合成的多粘菌素或八肽菌素或其衍生物，以获得带有2或3个正电残基的式(I)的多粘菌素衍生物。
定义
本文所用的“生理pH”指高于7.0并低于7.6的pH值，例如在7.1至7.5范围内的pH值，如7.2至7.4范围内的pH值。
本文所用的“正电荷”指在上述生理pH下的正电荷。
本文所用的“阳离子”分子指含有一个或多个正电荷的分子。
本文所用的“氨基酸残基”指L-或D-构型的任何天然的、非天然的或经修饰的氨基酸残基。
本文所用的“等价残基”旨在包括对例如氨基酸进行的导致产生非天然氨基酸或其衍生物但保留所替代残基的结构和/或功能性能力的明显修饰。
本文所用的“天然多粘菌素”指多粘菌素类和环杆菌素类。
对于本发明的目的，“多粘菌素衍生物”指天然多粘菌素或八肽菌素的合成的或半合成衍生物，其具有环状七肽(或七肽环)部分R4-R10和与N端氨酰基残基R4相连的侧链。所述侧链可由R(FA)-三氨酰基(R1-R3)、R(FA)-二氨酰基(R2-R3)、R(FA)-单氨酰基(R3)组成，或者仅由R(FA)组成。
本文所使用的“化合物”包括所述化合物的所有立体化学异构体。
本文所使用的“致敏活性”或“致敏能力”旨在包括任何提高细菌对抗菌剂的敏感性、使细菌对抗菌剂敏感或易感的能力。
缩写
脂肪酸：FA，脂肪酰残基；6-MOA和MOA，6-甲基辛酰基；6-MHA和MHA，6-甲基庚酰基残基；MO(H)A，多粘菌素B中6-甲基辛酰基、6-甲基庚酰基残基和相关脂肪酰残基的混合物；OHMDA，3-OH-8-甲基癸酸；
氨基酸：Dab，α，γ-二氨基-正丁酰基残基；fDab，N-γ-甲酰基-二氨基-正丁酰基残基；acDab，N-γ-乙酰二氨基-正丁酰基残基；Abu，α-氨基丁酰基残基；Thr，苏氨酰残基；Ser，丝氨酰残基；Phe，苯丙氨酰残基；Leu，亮氨酰残基；Ile，异亮氨酰残基；Ala，丙氨酰残基；sm-Dab，γ-甲磺酸化α，γ-二氨基-正丁酰基残基。用于经修饰氨酰残基的单字母代码是：X，Dab；Z，Abu；B，N-γ-fDab；J，N-γ-acDab。
肽：DAPB，脱酰基多粘菌素B；DAC，脱酰基粘杆菌素；PMBN，多粘菌素B九肽；PMEN，多粘菌素E九肽；PMBO，多粘菌素B八肽；PMHP，多粘菌素B七肽。
其他：cy，环(指括号中所包含的肽的环状部分)；f，甲酰基；ac，乙酰基；LPS，脂多糖；OM，外膜；CFU，集落形成单位。符号＊在本文中用于标示化合物的七肽环部分在其间闭合使得该分子其余部分为侧链的残基。
具体实施方式
现已发现，含至少2个但不超过3个正电荷的多粘菌素衍生物仍具有针对革兰氏阴性菌的抗菌活性，和/或具有使革兰氏阴性菌对抗菌剂致敏的活性，所述抗菌剂例如抗生素、半合成抗生素、化疗剂和宿主防御因子(如补体)。
相比于天然多粘菌素及其已知衍生物，这一正电荷的减少可改善本发明衍生物的药学特性。更具体的，相比于临床上使用的多粘菌素及其之前描述过和表征过的衍生物(例如多粘菌素B九肽)，它可减少所述化合物的毒性(包括肾毒性)和/或减少由所述化合物所引起的宿主组织的组胺释放，和/或带来更合适的药物代谢动力学特性，例如更长的血清半衰期或更不易于被聚阴离子组织和脓组分失活。
因此，本发明涉及可由通式I表示的多粘菌素衍生物或其可药用盐：
其中R1、R2和R3可以不存在；和
其中所述化合物中游离的非取代阳离子电荷总数至少是2，并且不超过3。
在天然多粘菌素和八肽菌素中，R(FA)是6-甲基辛酸(6-MOA)、6-甲基庚酸(6-MHA)、辛酸、庚酸、壬酸、3-OH-6-甲基辛酸、3-OH-8-甲基癸酸、3-OH-8-甲基壬酸、3-OH-8-癸酸和3-OH-6-甲基辛酸。具有抗菌活性的已知衍生物实例包括其中R(FA)是γ-苯基丁酸、异戊酸、9-芴甲氧碳酸、一系列C：9至C：14非分枝脂肪酸以及异C：9和异C：10脂肪酸的衍生物。
在本发明的衍生物中，R(FA)可以是任何疏水脂肪酸残基，优选选自辛酰基、癸酰基和6-MHA残基。
本领域技术人员可容易认识到这些优选疏水R(FA)残基的等价物，其可选自：例如酰基残基，如任选取代的烷基残基、任选取代的异烷基残基、任选取代的环烷基残基、任选取代的烯基残基、任选取代的环烯基残基、任选取代的芳基残基、任选取代的杂芳基残基、任选取代的杂环残基，其中所述残基优选具有多于5个的碳原子，并且其中所述取代基还可包括任选的设计成位于酰基残基和所述肽N端之间的取代基。R(FA)还可以是一段疏水寡肽。可能的R(FA)残基实例包括(但不限于)辛酰基、壬酰基、异壬酰基、癸酰基、异癸酰基、十一酰基、十二酰基、十四酰基、环己基、环庚酰基、环辛酰基、环壬酰基、环异壬酰基、环癸酰基、环异癸酰基、环十一酰基、环十二酰基、环十四酰基、己基、庚酰基和9-芴甲氧羰基残基。
在天然多粘菌素和八肽菌素中，R1是Dab或不存在(即被共价键所替换)。具有抗菌活性的已知衍生物的实例包括其中R1是Ala或共价键的那些。
在本发明的衍生物中，R1(如果存在的话)可以是任何氨基酸残基，只要所述衍生物中的正电荷总数不超过3并且侧链部分的正电荷总数不超过2即可，优选是Abu(如果存在的话)。
在天然多粘菌素和八肽菌素中，R2是Thr或不存在(即被共价键所替换)。具有抗菌活性的已知衍生物实例包括其中R2是O-乙酰-Thr、O-丙酰-Thr、O-丁酰-Thr或共价键的那些。
在本发明的衍生物中，R2(如果存在的话)可以是任何氨基酸残基，只要所述衍生物中的正电荷总数不超过3并且侧链部分的正电荷总数不超过2即可，优选选自Thr、DThr和DAla(如果存在的话)。本领域技术人员还会认识到，Thr的等价残基是Ser。
在天然多粘菌素和八肽菌素中，R3是Dab、DDab或DSer。许多具有抗菌活性的已知合成衍生物的实例包括其中R3是Lys或2-氨基-4-胍基丁酸的那些。
在本发明的衍生物中，R3(如果存在的话)可以是任何氨基酸残基，只要所述衍生物中的正电荷总数不超过3并且侧链部分的正电荷总数不超过2即可，优选选自Thr、DThr、Ser、DSer、DAla、Dab和Abu(如果存在的话)。
本领域技术人员可容易认识到这些优选残基R1、R2和R3的等价残基，其可选自例如，共价键、丙氨酸、2-氨基己二酸、α-正丁酸、N-(4-氨基丁基)甘氨酸、α-氨基丁酸、γ-氨基丁酸、α-氨基己酸、氨基环丙烷羧酸、氨基异丁酸、氨基降冰片基羧酸(aminonorbornylcarboxylate)、α-氨基正戊酸、精氨酸、Nω-甲基-精氨酸、天冬酰胺、α-甲基天冬氨酸、天冬氨酸、N-苄基甘氨酸、N-(2-氨基甲酰基乙基)甘氨酸、N-(氨甲酰基乙基)甘氨酸、1-羧基-1(2，2-二苯基乙基氨基)环丙烷、半胱氨酸、Nα-甲基二氨基-正丁酸、Nγ-乙酰基二氨基正丁酸、Nγ-甲酰基二氨基-正丁酸、Nγ-甲基二氨基正丁酸、N-(N-2，2-二苯基乙基)氨甲酰基甲基-甘氨酸、N-(N-3，3-二苯基丙基)氨甲酰基甲基(1)甘氨酸、N-(3，3-二苯基丙基)甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、叔丁基甘氨酸、2-氨基-4-胍基丁酸、N-(3-胍基丙基)甘氨酸、组氨酸、高苯丙氨酸、异锁链赖氨素、异亮氨酸、亮氨酸、正亮氨酸、羟基赖氨酸、Nα-甲基赖氨酸、赖氨酸、Nα-甲基羟基赖氨酸、Nα-甲基赖氨酸、Ne-乙酰基羟基赖氨酸、Ne-乙酰基赖氨酸、Ne-甲酰基羟基赖氨酸、Ne-甲酰基赖氨酸、Ne-甲基羟基赖氨酸、Ne-甲基赖氨酸、甲硫氨酸、α-甲基-γ-氨基丁酸、α-甲基-氨基异丁酸、α-甲基环己基丙氨酸、α-萘基丙氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、α-甲基鸟氨酸、Nα-甲基鸟氨酸、Nδ-乙酰基鸟氨酸、Nδ-甲酰基鸟氨酸、Nδ-甲基鸟氨酸、鸟氨酸、青霉胺、苯丙氨酸、羟基脯氨酸、脯氨酸、Nα-甲基二氨基-正丙酸、Nβ-乙酰基二氨基-正丙酸、Nβ-甲酰基二氨基-正丙酸、Nβ-甲基二氨基正丙酸、磷酸丝氨酸、丝氨酸、磷酸苏氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、正缬氨酸和缬氨酸。
在天然多粘菌素和八肽菌素中，R4是Dab。具有抗菌活性的合成衍生物实例包括其中R4是Lys的那些。
在本发明的衍生物中，R4是包含能够使所述分子环化的功能侧链的氨基酸残基，并可选自以下等同残基：Lys、羟基赖氨酸、鸟氨酸、Glu、Asp、Dab、二氨基丙酸、Thr、Ser和Cys，优选Dab。
在天然多粘菌素和八肽菌素中，R5、R8和R9是Dab。具有抗菌活性的合成衍生物实例包括其中R5、R8和R9可以是Lys或2-氨基-4-胍基丁酸的那些。
在本发明的衍生物中，R5、R8和R9是带正电或中性的氨基酸残基，优选Dab或Abu，只要所述衍生物的总电荷数不超过3即可。
本领域技术人员可容易地认识到这些优选残基的等价残基，其可选自：例如二氨基丁酸、二氨基丙酸、赖氨酸、羟基赖氨酸、鸟氨酸、2-氨基-4-胍基丁酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、D-苯丙氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、丝氨酸、α-氨基正丁酸、α-氨基正戊酸、α-氨基己酸、Ne-甲酰基赖氨酸、Ne-乙酰基赖氨酸、Ne-甲基赖氨酸、Ne-甲酰基羟基赖氨酸、Ne-乙酰基羟基赖氨酸、Ne-甲基羟基赖氨酸、L-Nα-甲基羟基赖氨酸、Nγ-甲酰基二氨基正丁酸、Nγ-乙酰基二氨基正丁酸、Nγ-甲基二氨基正丁酸、Nβ-甲酰基二氨基正丙酸、D-Nβ-甲酰基二氨基正丙酸、Nβ-乙酰基二氨基正丙酸、Nβ-甲基二氨基正丙酸、Nδ-甲酰基鸟氨酸、Nδ-乙酰基鸟氨酸和Nδ-甲基鸟氨酸。
在天然多粘菌素和八肽菌素中，R6是DPhe或DLeu，R7是Leu、Ile、Phe或Thr。具有抗菌活性的合成衍生物实例包括其中R6是DTrp和R7是Ala的那些。
在本发明的衍生物中，R6是任选取代的疏水氨基酸残基，优选DPhe或DLeu，以及R7是任选取代的疏水残基，优选是Leu、Thr或Ile。
本领域技术人员可容易地认识到这些优选疏水残基的等价残基，其可选自：例如苯丙氨酸、a-氨基正丁酸、色氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、异亮氨酸和酪氨酸。本领域技术人员还可了解，苏氨酸的等价残基是丝氨酸。
在天然多粘菌素和八肽菌素中，R10是Thr和Leu。具有抗菌活性的合成衍生物实例包括其中R10是O-乙酰-Thr，O-丙酰-Thr或O-丁酰-Thr的那些。
在本发明的衍生物中，R10是Leu或任何非疏水氨基酸残基，只要所述衍生物中的正电荷总数不超过3即可。优选R10是Thr或Leu。
本领域技术人员还可了解，苏氨酸的等价残基是丝氨酸。
更具体的，以如下方式选择优选的残基，使得：当R(FA)-R1-R2-R3组成天然多粘菌素B侧链时，R8和R9不都是甲酰化的；当R4-R10组成天然多粘菌素B环结构时，R4不直接与辛酰基残基相连。
上文所述最多3个正电荷的具体位置可以位于七肽环部分和/或侧链中(如果存在的话)。当本发明衍生物中存在3个正电荷时，所述3个正电荷可位于七肽环中；或者2个正电荷可位于七肽环中，而剩下的1个正电荷位于侧链中；或者1个正电荷可位于七肽环中，而剩下的2个正电荷位于侧链中。优选地，至少2个正电荷位于七肽环中。
在一个实施方案中，本发明衍生物可选自下述衍生物的组，所述衍生物中R1-R10选自：Thr-DSer-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-]，即SEQ ID NO.10；Thr-DThr-cy[Dab-Dab-DPhe-Thr-Dab-Dab-Thr-]，即SEQ IDNO.11；Thr-DSer-cy[Dab-Dab-DPhe-Thr-Dab-Dab-Thr-]，即SEQ ID NO.12；Thr-Abu-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-]，即SEQ ID NO.13；Abu-Thr-Abu-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-]，即SEQ ID NO.14；Thr-Dab-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Abu-Dab-Th r-]，即SEQ ID NO.15；Thr-Abu-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Leu-]，即SEQ ID NO.16；Thr-DAla-cy[Dab-Dab-DPhe-Thr-Dab-Dab-Thr-]，即SEQ ID NO.17；Thr-Dab-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Abu-Thr-]，即SEQ ID NO.18；Thr-Abu-cy[Dab-Dab-DLeu-Leu-Dab-Dab-Thr-]，即SEQ ID NO.19；DAla-DAla-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-]，即SEQ ID NO.20；cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-]，即SEQ IDNO.9；Abu-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-]，即SEQ ID NO.21；Thr-Dab-cy[Dab-Abu-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-]，即SEQ ID NO.22；Dab-Thr-Dab-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Abu-Abu-Thr-]，即SEQ ID NO.23；Thr-Abu-cy[Dab-Lys-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-]，即SEQ ID NO.24；Thr-Abu-cy[Dab-Abu-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-]，即SEQ ID NO.25；和Thr-Abu-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Abu-Thr-]，即SEQ ID NO.26.
在另一些实施方案中，本发明衍生物可选自：OA-Thr-DSer-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-]，即OA-SEQ ID NO.10；DA-Thr-DSer-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-]，即DA-SEQ ID NO.10；OA-Thr-DThr-cy[Dab-Dab-DPhe-Thr-Dab-Dab-Thr-]，即OA-SEQ ID NO.11；OA-Thr-DSer-cy[Dab-Dab-DPhe-Thr-Dab-Dab-Thr-]，即OA-SEQ ID NO.12；DA-Thr-Abu-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-]，即DA-SEQ ID NO.13；OA-Thr-Abu-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-]，即OA-SEQ ID NO.13；MHA-Thr-Abu-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-]，即MHA-SEQ ID NO.13；MHA-Abu-Thr-Abu-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-]，即MHA-SEQ ID NO.14；OA-Thr-Dab-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Abu-Dab-Thr-]，即OA-SEQ ID NO.15；OA-Thr-Abu-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Leu-]，即OA-SEQ ID NO.16；OA-Thr-DAla-cy[Dab-Dab-DPhe-Thr-Dab-Dab-Thr-]，即OA-SEQ ID NO.17；OA-Thr-Dab-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Abu-Thr-]，即OA-SEQ ID NO.18；OA-Thr-Abu-cy[Dab-Dab-DLeu-Leu-Dab-Dab-Thr-]，即OA-SEQ ID NO.19；OA-DAla-DAla-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-]，即OA-SEQ ID NO.20；DA-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-]，即DA-SEQ ID NO.9；OA-Abu-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-]，即OA-SEQ ID NO.21；OA-Thr-Dab-cy[Dab-Abu-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-]，即OA-SEQ ID NO.22；MHA-Dab-Thr-Dab-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Abu-Abu-Thr-]，即MHA-SEQ ID NO.23；OA-Thr-Abu-cy[Dab-Lys-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-]，即OA-SEQ ID NO.24；OA-Thr-Abu-cy[Dab-Abu-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-]，即OA-SEQ ID NO.25；和OA-Thr-Abu-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Abu-Thr-]，即OA-SEQ ID NO.26.
优选地，本发明衍生物可选自：OA-Thr-DSer-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-]，即OA-SEQ I D NO.10；DA-Thr-DSer-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-]，即DA-SEQ ID NO.10；OA-Thr-DThr-cy[Dab-Dab-DPhe-Thr-Dab-Dab-Thr-]，即OA-SEQ ID NO.11；OA-Thr-DSer-cy[Dab-Dab-DPhe-Thr-Dab-Dab-Thr-]，即OA-SEQ ID NO.12；DA-Thr-Abu-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-]，即DA-SEQ ID NO.13；OA-Thr-Abu-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-]，即OA-SEQ ID NO.13；MHA-Thr-Abu-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-]，即MHA-SEQ ID NO.13；MHA-Abu-Thr-Abu-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-]，即MHA-SEQ ID NO.14；OA-Thr-Dab-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Abu-Dab-Thr-]，即OA-SEQ ID NO.15；OA-Thr-Abu-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Leu-]，即OA-SEQ ID NO.16；OA-Thr-DAla-cy[Dab-Dab-DPhe-Thr-Dab-Dab-Thr-]，即OA-SEQ ID NO.17；OA-Thr-Dab-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Abu-Thr-]，即OA-SEQ ID NO.18；OA-Thr-Abu-cy[Dab-Dab-DLeu-Leu-Dab-Dab-Thr-]，即OA-SEQ  ID NO.19；OA-DAla-DAla-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-]，即OA-SEQ ID NO.20；和DA-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-]，即DA-SEQ ID NO.9.
如本文实施例部分所示，仅带有3个正电荷的本发明化合物可以是非常有效抑制革兰氏阴性菌生长或使其对抗菌剂致敏的药剂，甚至仅带有2个正电荷的衍生物也可具有相同效果，尽管是在更温和的水平上。
对于直接抗菌活性，至少2个和更优选3个正电荷位于七肽环部分；对于致敏活性，至少1个和更优选2个或3个正电荷位于七肽环部分。另外，侧链部分中两个羟基的存在显著增强直接抗菌活性。
Teuber(1970)、Srinivasa和Ramachandran(1980a)和Sakura等(2004)的工作公开了仅具有2个或3个正电荷的衍生物及其他多粘菌素衍生物。但是，所公开衍生物的抗菌活性非常弱且无临床意义(Sakura等1980)，这是由于与本发明发现完全相反的氨基酸残基(Srinivasa和Ramachandran 1980a)，或者由于因为不完全纯化而完全非特异性的氨基酸残基(Teuber 1970)。另外，上述工作均未描述、提示或启发研究这些衍生物使革兰氏阴性菌对抗菌剂致敏的能力。如本发明实施例明白所示，人们不可能基于多粘菌素衍生物抑制革兰氏阴性菌生长的能力来预测多粘菌素衍生物使革兰氏阴性菌对抗菌剂致敏的能力。例如，尽管需要高达128微克/毫升的无临床意义浓度的辛酰基多粘菌素B七肽来抑制大肠杆菌生长(Sakura等2004)，但低至4微克的量就足以使所述细菌对利福平适度致敏，如本文实施例部分所示。
Teuber(1970)所述的乙酰化多粘菌素衍生物是不同乙酰化的衍生物的混合物。醋酸酐可与多粘菌素B分子的5个游离氨基中的任何一个反应，产生单乙酰化多粘菌素。因此，Teuber的单乙酰化多粘菌素是5种单乙酰化多粘菌素衍生物的混合物，每种在不同的氨基处乙酰化。Teuber的二乙酰化多粘菌素是10种不同乙酰化衍生物的混合物，三乙酰化也是10种不同乙酰化衍生物的混合物。Teuber没有尝试将这些衍生物从所述混合物中分离出来。这种修饰多粘菌素的问题在于部分修饰可导致特异性降低。因此，对于抗菌活性具有重要性的一些氨基被部分取代(因此失活)，而一些不重要的氨基保持部分未取代。另外，取代的程度可导致批次间的差异。
相反，本发明多粘菌素衍生物是分离的且在结构上明确限定和鉴定的化合物。
Srinivasa和Ramachandran(1980a)认为，对于抑制绿脓假单胞菌生长而言，三甲酰基多粘菌素B在残基R1和R3的游离侧链氨基以及二甲酰基多粘菌素B在残基R1、R3和R5的游离氨基是关键的，而R8和R9的游离氨基不是关键的。与他们的结论不同，本发明的化合物包括缺少R1和R3游离氨基而在R5、R8和R9带有游离氨基、但仍是有力的抗绿脓假单胞菌及其他革兰氏阴性菌的药剂的化合物。
Sakura等(2004)公开了缩短的多粘菌素B衍生物辛酰基多粘菌素B七肽。辛酰基残基与多粘菌素B七肽的R4残基N端相连得到了仅具有3个正电荷的化合物。Sakura等发现辛酰基多粘菌素B七肽仅在非常高(且无临床意义)浓度(128微克/毫升)下抑制细菌生长，而其他衍生物例如均带有4个电荷的辛酰基多粘菌素B八肽和辛酰基多粘菌素B九肽是非常有力的抑制细菌生长的药剂。Sakura等没有公开或提示辛酰基多粘菌素B七肽使细菌对抗菌剂致敏的能力，也没有公开或提示更长的脂肪酸尾提高其抗菌活性，如本文实施例部分所示。
在一个方面中，本发明提供了仅具有2个或3个正电荷而仍能够抑制一种或多种革兰氏阴性菌物种生长和/或使一种或多种革兰氏阴性菌物种对抗生素或抗菌剂致敏的新的多粘菌素衍生物。
细菌对抗菌剂的易感性可以通过两种微生物学方法来确定。一种快速但粗略的方法使用已被特定量的抗菌剂所浸透的市售滤纸片。这些片被置于已接种了所测试生物体悬液的琼脂平板的表面，观察所述平板的生长抑制区。一种更精确的技术(培养液稀释易感性测试)包括准备含有液体培养基中药物的连续稀释液的试管，然后将所测试生物接种到所述管中。在适当的孵育期后，抑制所述细菌生长的最低药物浓度被认为是最小抑制浓度(MIC)。
本发明衍生物可抑制具有临床重要性的革兰氏阴性菌生长，或使其对抗菌剂致敏，所述细菌例如属于下列的那些：不动杆菌属(Acinetobacter)、产气单孢菌属(Aeromonas)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、博德特菌属(Bordetella)、布兰汉氏菌属(Branhamella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、肠杆菌属(Enterobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)、弗朗西丝氏菌属(Francisella)、梭杆菌属(Fusobacterium)、嗜血菌属(Haemophilus)、螺杆菌属(Helicobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、军团菌属(Legionella)、莫拉氏菌属(Moraxella)、巴斯德氏菌属(Pasteurella)、邻单胞菌属(Plesiomonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、志贺氏菌属(Shigella)和耶尔森氏菌属(Yersinia)的物种。所述细菌可以是，例如：大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、其他肠杆菌物种、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、其他假单胞菌物种、波美不动杆菌(Acinetobacter baumanni)，以及许多其他非发酵型革兰氏阴性菌物种。所述细菌还包括幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)，以及其他具有临床重要性的革兰氏阴性菌。
所治疗的细菌感染包括，例如，菌血症、败血症、皮肤和软组织感染、肺炎、脑膜炎、盆腔腹膜区的感染、异物感染、血液病患者的发烧；与静脉内线或其他导管、canyl和/或装置相关的感染；胃肠道、眼内或耳内的感染；浅表皮肤感染以及潜在毒性细菌在胃肠道、黏膜和/或皮肤的定殖。
细菌感染性疾病包括(但不限于)严重的医院获得的感染、免疫受损患者的感染、器官移植患者的感染、重症监护室(ICU)中的感染、烧伤创面的严重感染、严重的社区获得的感染、囊性纤维化患者的感染，以及多重抗性革兰氏阴性菌造成的感染。
本发明还涉及两种或更多种本发明衍生物用于联合治疗的组合。所述组合可包括具有不同抗菌活性谱或者能够使不同革兰氏阴性菌物种或菌株对抗菌剂致敏的衍生物。
本发明的另一方面涉及包含与一种或多种可药用载体和赋形剂配制在一起的本发明多粘菌素衍生物、其盐形式、其选定组合以及任选地抗菌剂的药物组合物。它们有助于将活性化合物加工成可药用的制备物，其包括：例如稀释剂、填充剂、缓冲剂、增稠剂、润湿剂、分散剂、增溶剂、助悬剂、乳化剂、粘合剂、稳定剂、崩解剂、包裹剂、包衣剂、包埋剂、润滑剂、着色剂和调味剂以及吸附剂、吸附增强剂、保湿剂、防腐剂等，它们是本领域技术人员公知的。
药物组合物包括其中含有有效实现预期目的之量的活性成分的组合物。更具体地，治疗有效量指在可用于任何医学治疗的合理的受益/风险比下有效治疗、预防、减轻或改善病理症状或延长被治疗受试者存活时间的化合物的量。对治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围之内。
可通过本领域公知的方法制备组合物，例如通过传统的混合、溶解、包裹、包埋、冻干、乳化和造粒过程。合适的制剂取决于所选的施用途径，药物组合物可被制备成立即释放或缓释(例如为了延长疗效和/或改善耐受性)。另外，可方便地通过药剂学领域已知的方法将所述制剂制成单位剂型的形式。
本发明的药物组合物包括(但不限于)旨在用于静脉内、肌内、经口或局部施用的那些，以及作为栓剂或作为吸入气雾剂形式施用的那些。所述组合物包括静脉内、肌内、腹膜内、皮下、髓内、鞘内、心室内、鼻内或眼内注射剂，吸入气雾剂以及旨在用于直肠、经口、阴道内、透粘膜或透皮递送的那些。
对于胃肠外施用(例如通过单次注射、快速输注或者慢速输注)，本发明化合物以及上文所述组合可在无菌水溶液中配制成合适的盐或酯形式，所述无菌水溶液优选生理相容性流体，例如盐水、5％葡萄糖、任氏溶液和Hank’s溶液。所述制剂还可包含有机溶剂，例如丙二醇、聚乙二醇、丙二醇或相关化合物以及防腐剂和表面活性剂。
可以由无机和有机酸制备可药用酸加成盐。来自无机酸的盐包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。来自有机酸的盐包括醋酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、延胡索酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等。
另外，用于胃肠外施用的药物组合物可以是在油或水载体中的混悬液或乳液，并可含有配制剂，例如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。合适的亲脂载体和溶剂包括脂肪油，例如天然和/或合成脂肪酸酯，例如油酸乙酯和甘油三酯或脂质体。所述混悬液可含有增加混悬液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡萄糖。
胃肠外组合物可被制成单位剂量或多剂量密封容器的形式，例如安瓿和小瓶，并可保存于冷冻干燥(冻干)条件下，对于注射剂而言，仅需在临用前加入无菌液体赋形剂，例如注射用水。
对于经口施用，固体形式制剂包括，例如，粉剂、片剂、丸剂、糖丸剂、锭剂、胶囊剂、扁囊剂(cachet)和微粒制剂。可使用固体赋形剂制备药物制剂：任选地将所得混合物粉碎，在需要时加入合适助剂后加工所述混合物制粒，以得到片剂或糖衣丸核心。固体载体/赋形剂可以是一种或多种还可用作稀释剂、增溶剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、防腐剂、调味剂、润湿剂、片剂崩解剂或者胶囊材料的物质。合适的载体包括但不限于碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、葡萄糖、乳糖、果胶、淀粉、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可脂等。
适于经口施用的液体制备物包括，例如，水溶液、糖浆、酏剂、水性混悬剂、乳剂和凝胶剂。可以通过将活性成分溶解于水中和加入合适的稳定剂和增稠剂以及着色剂和调味剂来制备水溶液。可通过将粘性材料(例如天然或合成树胶、树脂、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠以及其他公知助悬剂)与细微分开的活性成分一起分散于水中，来制备水性混悬剂。乳剂可在丙二醇水溶液中制备，或者可含有乳化剂，例如卵磷脂、失水山梨醇单油酸酯或者阿拉伯树胶。
本发明化合物或上述组合还可配制成用于局部施用。在无菌条件下将所述活性化合物与可药用载体/赋形剂混合，其包括任何所需的缓冲剂和防腐剂。可以例如用水或油基础物质并添加合适乳化剂、分散剂、助悬剂、增稠剂、稳定剂或着色剂来制备膏剂、霜剂和洗剂。常用赋形剂包括动物和植物脂肪和油、蜡、凡士林、淀粉、纤维素衍生物、黄芪胶和聚乙二醇。
其他局部制剂包括但不限于，滴耳液、滴眼液和透皮贴剂。
对于透皮和透粘膜施用，可将本领域常用的渗透剂用于所述制剂中。
对于吸入施用，本发明化合物和上述组合以从使用合适抛射剂(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳)通风器、加压装置或喷雾器中产生的气雾剂形式递送。在加压气雾剂的情况下，可以通过提供阀来确定剂量单位，以递送计量的量。用于吸入器或吹入器中的例如明胶的胶囊和药筒(cartridge)可配制成含有所述化合物和合适粉末基础物质(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
本发明化合物和上述组合还可配置成直肠用组合物，例如保留灌肠剂或栓剂，其中使用常规栓剂基础物质，例如可可脂、其他甘油酯、聚乙二醇或栓剂用蜡。
本发明还涉及使用本发明多粘菌素衍生物或这些衍生物的组合作为患有感染性疾病的人或动物受试者临床治疗(或预防方案)的一部分的方法，其包括将治疗有效剂量的至少一种本发明衍生物(任选地与抗菌剂相组合)施用给所述受试者。
本发明还涉及使革兰氏阴性菌对抗菌剂致敏的方法，其中同时或以任何顺序依次施用本发明衍生物以及治疗有效量的所述抗菌剂。
本发明衍生物和抗菌剂可在一种制剂中一起施用或者通过不同途径施用。例如，所述多粘菌素衍生物可以静脉内施用，而所述抗菌剂肌内、静脉内、皮下、经口或腹膜内施用。或者，所述衍生物可肌内或腹膜内施用，而所述抗菌剂可静脉内、肌内或腹膜内施用，或者所述衍生物可以气雾剂或喷雾剂形式施用，而抗菌剂通过例如静脉内施用。所述衍生物和抗菌剂可同时或依次施用，只要它们以足以使得两者都在感染部位达到有效浓度的方式给药即可。
“治疗有效性”基于成功的临床结局，它不要求本发明衍生物(任选地与抗菌剂组合)杀死参与感染的100％的细菌。成功的治疗依赖于在感染部位达到一定水平的抗菌活性，其足以以使平衡有利于宿主的方式抑制细菌。当宿主防御最高效时，所需要的抗菌效果可以是中等的。即便将生物载量仅减少一个对数级(10倍)也可使得宿主自身的防御能够控制感染。另外，激发早期杀菌/抑菌作用可能比长期杀菌/抑菌作用更重要。这些早期事件是治疗成功的重要和关键部分，因为它们赢得了激活宿主防御机制的时间。提高杀菌率对于例如脑膜炎、骨或关节感染的感染来说可能特别重要。
抗菌剂的治疗有效性依赖于细菌物种在有临床意义浓度的本发明衍生物下对所述抗菌剂的易感性。可在体内动物模型(例如小鼠腹膜炎或兔菌血症测定)中证实本发明化合物在改善抗菌剂体内治疗有效性的作用，并且可基于多种体外测试进行预测，其包括(1)确定抑制革兰氏阴性菌生长24小时所需的抗菌剂最小抑制浓度(minimum inhibitoryconcentration，MIC)，(2)确定抗菌剂对革兰氏阴性菌动力学生长曲线的影响，和(3)仅有抗菌剂连续稀释液或者与化合物连续稀释液联合的MIC方格测定(checkerboard assay)。示例性模型或测试是本领域公知的。
使用体外测定24小时的MIC，可显示本发明衍生物降低抗菌剂的MIC。根据此结果，预计体内同时施用所述化合物会提高革兰氏阴性菌对所述抗菌剂的易感性。还可显示本发明化合物将抗菌剂的MIC从被认为生物体有临床抗性的范围降低到生物体临床易感的范围。根据此结果，预计体内同时施用一种或多种本发明化合物和抗菌剂会逆转抗生素抗性生物的抗性，并且将其有效地转变成抗生素易感性生物。
通过在存在或不存在本发明化合物的情况下测量抗菌剂对革兰氏阴性菌体外生长曲线的影响，可以显示所述化合物在优选小于24小时的时期内增强抗菌剂的早期抗菌作用。早期杀菌/生长抑制作用的增强对于治疗结局的决定是很重要的。
本发明多粘菌素衍生物和抗菌剂还可具有超越每种药剂自身的单独作用或者所述药剂一起的加合作用的协同或增效作用。在方格测定中，本发明化合物与抗菌剂的组合可产生“协同”分数抑制浓度指数(fractionalinhibitory concentration index，FIC)。方格方法是基于加合性的，其假设使用多种药物所观察到的结果是所测试药物单独作用的总和；根据此系统，小于0.5的FIC的得分为协同，1的得分为加合，大于1但小于2的得分为无关的。
适于与本发明衍生物联用的抗菌剂包括：例如，大环内酯类药物如克拉霉素、阿奇霉素和红霉素；酮内酯类、林可酰胺类如克林霉素；链阳性菌素类；利福霉素类如利福平、利福布汀和利福拉齐；夫西地酸、莫匹罗星、噁唑烷酮类；糖肽抗生素如万古霉素、达巴万星、特拉万星和奥利万星；氟喹诺酮类；四环素衍生物；青霉素的疏水衍生物；头孢菌素类；单环内酰胺类；卡巴培南类、培南类和其他β内酰胺抗生素；新生霉素；截短侧耳素类；叶酸合成抑制剂；去甲酰酶抑制剂和细菌流出泵抑制剂。治疗革兰氏阴性菌感染领域的技术人员可轻易地确定其他可使用的有临床意义的抗菌剂。优选地，所述抗菌剂选自疏水或中度疏水抗菌剂，对其来说革兰氏阴性菌的外膜是有效的透过屏障。
本发明还包括本发明化合物或其组合用于使本文所列具有临床重要性的细菌对宿主防御机制补体(存在于人和动物新鲜血清中)致敏的用途，所述致敏通过在临床感染或疑似感染过程中使所述细菌受到本发明化合物或其组合的作用来实现。可以例如通过补体和多形核白细胞的联合作用来发挥宿主防御。
医药领域的普通技术人员可通过考虑本领域公知的因素而容易地优化本发明化合物和同时施用的抗生素的有效剂量和施用方案，所述因素包括接受给药受试者的类型、年龄、体重、性别和医学状况、施用途径、受试者的肾功能和肝功能、期望效果、所使用的具体本发明化合物以及受试者对其的耐受性。所有抗微生物剂的剂量在肾损伤或肝功能不全的患者中都应进行调整，因为在有这些情况的患者中药物的代谢和/或排泄降低。儿童中的剂量一般也应根据体重而减少。
施用给人或动物的本发明衍生物的日总剂量可有所不同，例如0.1至100毫克/千克体重的量，优选0.25至25毫克/千克体重。
本领域普通技术人员还了解，最优治疗过程(即对于确定的天数每天给药的次数)将由所治疗状况的性质和程度、施用的形式、途径和部位以及所治疗的具体患者来决定，并且这些最适条件可通过常规技术来确定。
本发明还提供了用于测定本发明化合物针对有害革兰氏阴性菌的抗菌活性和/或使其对抗菌剂和/或血清中存在的补体致敏的能力的方法，所述化合物是天然多粘菌素或八肽菌素的衍生物，其中与其来源的天然化合物相比，所述衍生物仅具有2-3个正电荷，所述方法包括使细菌与天然多粘菌素或八肽菌素的所述衍生物接触以及鉴定具有抗菌活性和/或使所述细菌致敏之活性的衍生物的步骤。
本发明还提供了筛选与测试动物中或来自测试动物或来自人来源的肾组织或其成分结合能力降低的多粘菌素和八肽菌素衍生物的方法，其通过测量它们竞争性阻断氨基糖苷与肾组织或其成分结合的能力或阻断已知结合到肾组织或其成分的其他物质的结合能力的降低来进行。
在又一个方面中，本发明提供了开发新型抗生素的方法，其包括以下步骤：提供具有总共4或5个正电荷或者像脱酰基多粘菌素中一样具有总共6个正电荷的天然多粘菌素或八肽菌素化合物或其衍生物；用不带正电荷的残基或者共价键取代1至4个带1个或多个正电荷的残基，由此产生具有2或3个正电荷的多粘菌素衍生物；测定所述衍生物化合物针对革兰氏阴性菌的抗菌活性和/或使革兰氏阴性菌对抗菌剂致敏的能力；以及选择具有抗革兰氏阴性菌的抗菌活性或使革兰氏阴性菌对抗菌剂致敏的能力的化合物。
本发明还提供了分别通过化学或酶促处理天然多粘菌素或八肽菌素可得到的半合成多粘菌素衍生物，或者通过经遗传修饰的生物产生的其变体。化学处理包括但不限于用醋酸酐、甲酸、肼和草酸进行处理。酶促处理包括但不限于用例如多粘菌素脱酰基酶、无花果蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、枯草杆菌肽酶、枯草杆菌蛋白酶、粘杆菌素水解酶和Nagarse酶的处理。
根据一个实施方案，优选的化合物比天然多粘菌素或八肽菌素的阳离子少，仅带有2个或3个正电荷，并且：
(a)能够抑制大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)或波美不动杆菌(Acinetobacterbaumanni)的生长和/或使其中任意种对抗生素致敏，和/或
(b)如体内动物模式中所显示的，比临床使用的多粘菌素毒性更小，和/或
(c)如动物模式和/或测量所述化合物对肾结构的亲和力之体外测试中所显示的，比临床使用的多粘菌素肾毒性更小，和/或
(d)当局部施用或作为气雾剂吸入时能够比临床使用的多粘菌素更少地使组织释放组胺，和/或
(e)药物代谢动力学更有利，例如相比于临床使用的多粘菌素具有更长的血清半衰期和/或更少被聚阴离子组织和脓组分失活。
用于合成本发明化合物的方法包括但不限于下述方法。对于待合成的具体化合物，本领域普通技术人员能够选择合适的方法。
1、可通过下述方法制备带有未变化七肽部分和经修饰的酰基-氨基酰基侧链的多粘菌素和八肽菌素半合成衍生物：
通过本领域技术人员已知的方法保护起始材料(多粘菌素或八肽菌素或其修饰物)中的游离氨基。可通过使用例如叔丁氧羰基(tBoc)、芴甲氧羰基(Fmoc)、苯甲氧羰基(CBZ，Z)、烯丙氧羰基(ALOC)、3-吡啶基-N-氧代-甲氧羰基(如专利公开GB 1323962中所述)的残基来实现保护，通过使用希夫碱(例如苯甲醛)用日本专利公开7115630/1971中所述的方法实现保护，等等，它们可通过与产品性质相容的常规条件所移除。
在水溶性差有时候给后续步骤带来问题的情况下，可使用带负电的封闭基团(例如Fmoc的磺酸衍生物或Fmoc的羧酸衍生物)进行保护，所述方法描述于美国专利公开2006004185。可通过将合适的可移除带负电的高亲水性封闭基团与苏氨酸的OH基相连来增加水溶性。
其后，用酶(例如多粘菌素脱酰基酶、多粘菌素水解酶、木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、枯草杆菌肽酶、Nagarse酶或其他酶)对所述化合物进行酶处理，所述酶移除多粘菌素或八肽菌素化合物侧链的末端部分，或者甚至移除整个侧链。此处理后可任选地进行Edman降解步骤。所得化合物缺少整个侧链，仅仅由环状七肽部分组成，但具有游离N端α氨基。
或者，可用草酸或甲酸处理具有受苯甲氧羰基或叔丁氧羰基保护之氨基的多粘菌素和八肽菌素，产生受保护的脱酰基衍生物，所述方法描述于Kurihara等(1974)。所述步骤之后是进一步如上所述酶处理和/或Edman降解，以产生七肽。
其后，将合适的残基与七肽环部分的游离α氨基位置相连。所述残基可含有酰基或相关残基和任选地氨基酸残基，优选地多至三个残基。例如，可通过将合成的N-(酰基)-苏氨酰-D苏氨酰残基添加到上述七肽来制备一种具有酰基和两个氨基酸残基的半合成化合物。这可以通过有机化学领域熟知的常规的一般技术来实现，这些技术包括使用US 2006004185中所述的N-羟基-琥珀酰亚胺相连的残基。在此特定合成中，方法可包括使用2-N-(正辛酰基)-丙氨酰-氨基丁酰基-N-羟基琥珀酰亚胺。
2、带3个游离氨基的乙酰化的多粘菌素九肽。多粘菌素D仅带有4个正电荷。可用木瓜蛋白酶或无花果蛋白酶通过Chihara等(1973)和Vaara和Vaara(1983a，b)所述方法对其进行处理，产生相应九肽。然后可通过酰基异硫氰酸酯(通过本领域技术人员公知的方法，其描述于US2006004185)、通过酰氯(通过本领域技术人员公知的方法，其描述于Chihara等1974)或者通过使用与N-羟基-琥珀酰亚胺相连的残基(通过本领域技术人员公知的方法，其描述于US 2006004185)对所述九肽进行酰化。乙酰化多粘菌素D九肽仅带有3个游离氨基，都在七肽环部分中。
或者，可通过上述方法保护多粘菌素D的游离氨基。这之后是酶处理和任选地Edman降解步骤，以产生九肽，然后可通过酰基异硫氰酸酯(通过本领域技术人员公知的方法，其描述于US 2006004185)、通过酰氯(通过本领域技术人员公知的方法，其描述于Chihara等1974)或者通过使用与N-羟基-琥珀酰亚胺相连的残基(通过本领域技术人员公知的方法，其描述于US 2006004185)对其进行酰化，最后除去保护基团。
以类似的方式，可制得酰基化多粘菌素S九肽和酰基化多粘菌素F九肽。它们都仅带有3个游离氨基。
3、酰基化多粘菌素和八肽菌素七肽。可通过对天然化合物进行Nagarse酶处理制得七肽，如Kimura等1992所述。或者，它们可通过用其他例如多粘菌素酰基化酶、多粘菌素水解酶、无花果蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和枯草杆菌肽酶来制得，然后是任选地Edman降解步骤。还可通过肼或酸(例如甲酸和草酸)对天然化合物脱酰基来制得它们，然后是Edman降解。然后例如通过使用本领域技术人员公知的酰氯技术(描述于Chihara等1974)来酰基化所述七肽。酰基化多粘菌素七肽仅带有3个游离氨基。
4、可通过本领域技术人员已知的极为常规的技术制得全合成的多粘菌素和八肽菌素衍生物。这些方法包括液相合成方法以及固相合成方法，其描述于例如Sakura等(2004)、Tsubery等(2000a、2000b、2002、2005)和Ofek等(2004)。所述方法包括例如在关键的位置使用保护剂(如Fmoc、tBoc和CBZ)以及环化步骤，其中使用DPPA(叠氮磷酸二苯酯)或六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧代-三吡咯烷基-鏻(PyBop)、N-羟基苯并三唑(HoBt)和N-甲基吗啉(NMM)。许多不常见以及D-氨基酸的Fmoc衍生物是市售的。
5、涉及转化游离氨基以产生具有2个或3个正电荷的本发明化合物的示例性反应包括(但不限于)如下反应：
A)所述化合物的游离氨基与包含反应性环氧基团的缀合部分反应，由此产生β-羟基胺连接；
B)所述化合物的游离氨基与包含反应性磺酰基卤化物的缀合部分反应，由此产生磺酰胺连接；
C)所述化合物的游离氨基与包含反应性羧酸的缀合部分反应，由此产生胺基连接；
D)所述化合物的游离氨基与包含反应性醛基的缀合部分反应(还原性条件下)，由此产生胺基连接；
E)所述化合物的游离氨基与包含反应性酮基的缀合部分反应(还原性条件下)，由此产生胺基连接；
F)所述化合物的游离氨基与包含反应性异氰基的缀合部分反应，由此产生尿素连接；
参考文献列表
本申请中引用的所有参考文献均通过参考整体并入本文。
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实施例
下述实施例举例说明了本发明的一些实施方案，但不应认为是对本发明范围的限制。
实施例1
肽合成
使用标准Fmoc保护策略，通过常规固相化学法合成多粘菌素衍生物(“NAB肽”或“NAB化合物”)。C端氨基酸是预先连接在固相上市售的，当用酸将其从树脂上切下时，得到C端羧酸。
保护策略是使用三个水平的独立保护——对α氨基功能的暂时性Fmoc保护，其在酸切割阶段被移去的基团；以及在环化反应发生过程中覆盖反应性侧链功能的半永久性保护。在将所述肽从树脂上切下之后，C端羧酸与氨基酸之一的侧链上氨基功能反应，形成环状肽。在环化步骤之后，除去半永久性保护基得到NAB肽。
因此，所述氨基酸的α氨基功能被芴甲氧羰基(Fmoc)保护，在每个循环用DMF中20％哌啶除去Fmoc。用叔丁氧羰基(tBoc，在切割步骤被除去的酸不稳定基团)保护参与环化的氨基酸(例如二氨基丁酸)。用在酸切割步骤中稳定的基团(即苯甲氧羰基(Z))保护所有其他具有功能性侧链基团的氨基酸。氨基酸苯丙氨酸和亮氨酸天然地不需要侧链保护。氨基端不被保护；这使得在酰基化过程中发生直接反应。
在商品化自动合成仪中进行合成步骤，其中使用六氟磷酸2-(6氯-1-H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基-铵(HCTU)作为活化剂。
6-甲基庚酸(6-MHA)来自Ultra Scientific Inc，North Kingstown，RI，USA(产品号：FLBA002)。其他脂肪酸来自标准供应商。
通过使用4倍摩尔过量的每种氨基酸或脂肪酸、4倍摩尔过量的活化剂HCTU(见上文)和8倍摩尔过量的N-甲基吗啉进行酰基化。反应时间为30分钟。
已受保护的氨基酸购买自标准供应商。通过用95％三氟乙酸和5％水的溶液在室温反应2小时将肽从树脂上移去，得到部分保护的产物。用二乙醚沉淀所得肽。
所使用的环化混合物是六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧代-三吡啶烷基-鏻(PyBop)、N-羟基苯并三唑(HoBt)和N-甲基吗啉(NMM)，分别摩尔过量2、2和4倍。所述肽溶解于二甲基甲酰胺，加入环化混合物，使之反应2小时。通过加入冷的二乙醚沉淀环化的受保护肽。通过用水洗涤所述肽除去任何残余的PyBop。
通过催化脱氢除去剩下的侧链保护基(Z)。所述肽在氢气气氛和钯炭(palladium charcoal)催化剂存在下溶解于乙酸-甲醇-水(5∶4∶1)中。
通过反相色谱使用常规乙腈∶水∶三氟乙酸梯度纯化所述肽。通过冻干使产物干燥。
产量为20-40毫克，约为从与树脂结合的第一氨酰基残基摩尔量(约100微摩尔)计算所得理论值的20％-40％。
如反相HPLC所估计的，纯度超过95％。对于酰基化残基，Edman降解产物不显示任何氨基酸残基，表明与预期一致，N端氨基酸残基的α氨基由于成功的N-酰基化而被封闭。在实验误差范围内，所得的质量是如理论值所预计的质量。
实施例2
所述化合物针对大肠杆菌的直接抗菌活性
对均带有至少2个但不超过3个正电荷的实施例1中所合成的肽抑制大肠杆菌生长的能力进行了研究。利用LB琼脂(LBAgar Lennox，Difco，BD，Sparks，MD，USA)平板进行此测定。指示生物大肠杆菌IH3080(K1：O18)是带荚膜菌株，最初分离自患有脑膜炎的新生儿(Vaara等，1984)，并且获得自国家公共卫生研究院(赫尔辛基，芬兰)。
从IH3080在LB琼脂上的过夜生长培养物中制得0.9％NaCl中约108个细胞/毫升的混悬液。然后用移液器将此混悬液的等分试样置于琼脂平板上，轻轻晃动平板以使混悬液均匀铺满平板的整个表面。之后，通过用巴斯德移液管移去未吸收的混悬液部分。在表面干燥之后，用无菌的边缘锋利的窄金属管、一次性枪头和真空吸引器在平板上钻出小孔(直径2毫米，每个平板5个孔)。然后将0.9％NaCl中的肽溶液(1微克/毫升和0.1微克/毫升的浓度)样品(4微升和10微升)移至孔中，使样品液体被吸收。对照包括不含待测试化合物的0.9％NaCl溶液。然后在37℃将平板孵育18小时，之后测量每个孔周围生长抑制区的直径；不减去孔自身的直径。最后，将直径转化成生长抑制的表面面积(以平方毫米计)。
表2显示，所述衍生物针对大肠杆菌IH3080的抗菌活性与等量的多粘菌素B和一些与本发明无关的多粘菌素衍生物的比较。NAB734、NAB737、NAB739和NAB740是最强的抗菌化合物，甚至强于多粘菌素B对大肠杆菌IH3080的抗菌性。含有4微克NAB739的孔产生高达133平方毫米的生长抑制面积。在所有这些4种NAB化合物中，侧链均由两个带有羟基的氨酰残基组成。
与NAB739不同，NAB7061在4微克时不具有抗菌性。但是，它在10微克时显示显著的抗菌活性。NAB7061仅在R3带有Abu(代替DSer)这一点上不同于NAB739。脂肪酰基部分从NAB7061中的C8延长至NAB7062中的C10导致在4微克时显示显著增强的抗菌活性。另外，3种其他的肽(NAB738、NAB716和NAB719)显示显著的抗菌活性，尽管明显弱于NAB739和其他最强的抗菌化合物。
对大肠杆菌具有直接抗菌性的化合物的普遍特征是存在3个正电荷，其中所有三个或至少2个位于环部分的合适位置。在后者的情况下，所述电荷的相对位置显著影响对大肠杆菌的抗菌活性的效力。
另外，如表2所示，侧链的结构和长度也显著影响抗菌活性的效力。存在由至少两个氨酰残基组成的侧链似乎对所述化合物针对大肠杆菌的抗菌性而言十分重要，因为缺少R2(NAB713)或缺少R2和R3(辛酰基PBHP)的化合物在所述测定使用的条件下也缺少直接抗菌活性。但是，可以预计，可通过使用更长的如R(FA)残基代替辛酰基残基来补偿这些残基的缺少。
表2
化合物结构及其针对大肠杆菌IH3080的抗菌活性＊
＊以LB平板上含4或10微克化合物的孔周围的生长抑制(以平方毫米计)测得的抗菌活性
＊＊氨酰基残基的单字母代码：A，Ala；F，Phe；K，Lys；L，Leu；S，Ser；T，Thr；X Dab；Z，Abu；B，N-γ-甲酰基-Dab；J，N-γ-乙酰基-Dab.下划线字母表示处于D构型的残基。粗体字母表示带有正电荷的残基。粗体+表示所述肽游离N端的α氨基基团的正电荷。缩写：cy，环。
＊＊＊在序列表中，X、Z、B、J和D构型的氨基酸被称为Xaa，定义为修饰残基(MOD_RES)。
实施例3
选定的NAB化合物针对波美不动杆菌和绿脓假单胞菌的直接抗菌活性
通过使用实施例2中所述的易感性测定方法测定12种NAB化合物针对波美不动杆菌ATCC 19606和绿脓假单胞菌ATCC 27853的直接抗菌活性。结果显示于表3。五种化合物(NAB7062、NAB734、NAB737、NAB739和NAB740)针对抗波美不动杆菌具有显著的活性。在实施例2中，相同的化合物显示出对大肠杆菌非常有效。NAB739和NAB740的抗菌活性与多粘菌素B相当或者甚至更强。
针对绿脓假单胞菌，活性最强的NAB化合物是NAB739、NAB740以及针对大肠杆菌和波美不动杆菌几乎没有活性的NAB736。NAB740是活性最强的化合物，其活性与多粘菌素B一样强。所有三种NAB化合物在侧链中都没有正电荷，而仍然对绿脓假单胞菌有抗性。此发现与Srinivasa和Ramachandran(1980a)称R1和R3的游离氨基基团对抑制绿脓假单胞菌生长十分必要的结论不一致。
出人意料的，NAB736对绿脓假单胞菌相当有效，而辛酰基PMBH的效果则差得多。因此，将R(FA)部分从C8延长到C10对活性有显著影响。
表3
十二种新化合物针对波美不动杆菌和绿脓假单胞菌的抗菌活性＊
＊以LB平板上含4或10微克化合物的孔周围的生长抑制(以平方毫米计)测得的抗菌活性
实施例4
NAB734针对选定的革兰氏阴性菌的直接抗菌活性
通过使用实施例2所述易感性测定方法，比较11种革兰氏阴性菌(9种不同物种)对NAB734和多粘菌素B的易感性。所述菌株包括属于粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)和奇异变性菌(Proteus mirabilis)的物种，两种物种都是公知对多粘菌素有抗性的。另外，还使用公知也抗多粘菌素的革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)进行易感性测定。十种来源于ATCC的菌株(美国典型培养物保藏中心，Manassas，VA，USA)，一种来源于CCUG(哥德堡大学培养物保藏中心，瑞典)。大肠杆菌IH3080的来源描述于实施例2。硫酸多粘菌素B来自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)。
表4中的结果显示，NAB734一般可被认为针对大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)和弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)大致一样有效。它针对波美不动杆菌的效力似乎略微低于多粘菌素B，针对绿脓假单胞菌的效力明显低于多粘菌素B。已知多粘菌素抗性细菌物种的代表对于NAB734也有抗性。这提示NAB734具有高度特异性的抗菌作用，其作用模式非常类似于多粘菌素B。
表4
NAB734针对选定的革兰氏阴性菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性＊
＊以LB平板上含4或10微克化合物的孔周围的生长抑制(以平方毫米计)测得的抗菌活性
实施例5
NAB化合物使大肠杆菌IH3080对模式抗生素利福平致敏的能力
还研究了本发明均带有至少2个但不超过3个正电荷的新型NAB肽使大肠杆菌IH3080对利福平致敏的能力。此测定通过使用含有浓度逐渐增加(0.1μg/ml、0.3μg/ml、1μg/ml)利福平(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，U.S.A)的LB平板与实施例2中所述的易感性测定平行进行。
表5显示了NAB化合物(4微克)在利福平(0.1和1微克/毫升)存在针对下大肠杆菌IH3080的活性与等量的前述已知使革兰氏阴性菌对抗菌剂致敏的物质(即多粘菌素B七肽、脱酰基多粘菌素B、脱酰基粘杆菌素、多粘菌素B九肽)以及多粘菌素B之活性的比较。所述化合物还包括辛酰基PMBH，之前未曾报道过能够使细菌对抗生素致敏的药剂。
一些NAB化合物使大肠杆菌IH3080对浓度低至0.1微克/毫升利福平的抗菌作用致敏。在所测试化合物不存在时，抑制作用需要一百倍浓度(10微克/毫升)的利福平。一些在4微克时缺少显著直接抗菌活性的化合物能够使靶标细菌对利福平致敏。这些化合物包括NAB7061、NAB717、NAB718和NAB733。
另外，大多数具有直接抗菌活性(即利福平不存在时的抗菌活性，参见实施例2)的NAB化合物在利福平存在时更加有效地抑制靶标细菌。活性最强的化合物NAB734、NAB737、NAB738和NAB739的效力明显强于公知的有效OM穿透剂PMBN。
活性最强的NAB化合物带有3个正电荷并且在环部分的合适位置上有至少2个正电荷，其相对位置影响增敏活性的效力。特别应该注意，在环部分仅带有两个正电荷并且在R3带有Dab形式的第三正电荷的NAB716能够显著地使大肠杆菌对利福平致敏。
在具有最弱致敏活性的缺少R2和R3的均具有辛酰基残基作为R(FA)的辛酰基PMHP系列化合物中，缺少R2的NAB713具有略强的活性，带有R2和R3的NAB7061具有很强的活性。这表明，R2和R3的存在是有利的。但是，其缺少至少可被R(FA)部分的延长(像在NAB736中一样)所部分补偿。它带有癸酰基残基作为R(FA)部分，缺少R2和R3，是相当有活性的致敏剂。
所带的2个正电荷都在环部分的NAB化合物活性比其他结构上类似、只是所带全部3个正电荷都在环部分的NAB化合物要低，或者对于1个化合物(NAB708)，其在所使用的研究条件下没有活性。
在所使用的研究条件下，在侧链中带有2个正电荷并且在环部分带有1个正电荷的NAB化合物即便有活性也非常低。在所使用的研究条件下，所有3个正电荷都在侧链中的NAB735没有活性。同样，所述电荷在环部分中的相对位置影响了致敏活性的效力。
表5
化合物(4微克)在利福平存在下针对大肠杆菌IH3080的抗菌活性＊
＊以不含利福平或者含有利福平(0.1或1.0微克/毫升)的平板上含4微克化合物的孔周围的生长抑制(以平方毫米计)测得的抗菌活性
＊＊括号内的值是使用含有10微克化合物的孔所获得的
实施例6
NAB化合物使波美不动杆菌和绿脓假单胞菌对模式抗生素利福平致敏的能力
还研究了本发明涉及的NAB肽使波美不动杆菌和绿脓假单胞菌对利福平致敏的能力(表6)。此测定通过使用含有浓度逐渐增加(0.1μg/ml、0.3μg/ml、1μg/ml)利福平的LB平板与实施例3中所述的易感性测定平行进行。
一些NAB化合物具有非常显著的使波美不动杆菌对利福平致敏的能力。活性最强的化合物NAB734、NAB737和NAB739的效力甚至明显强于公知的有效OM穿透剂PMBN。NAB739对绿脓假单胞菌生长的抑制在利福平存在时略强于不存在利福平时。
表6
十二种新化合物(4微克)在利福平(0.1μg/ml或0.3μg/ml)存在下针对波美不动杆菌和绿脓假单胞菌的抗菌活性＊
＊以不含利福平(对照)或者含有利福平(0.1或0.3微克/毫升)的平板上含4微克化合物的孔周围的生长抑制(以平方毫米计)所测的抗菌活性
实施例7
NAB7061使大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌对广范围的抗菌剂致敏
通过使用存在和不存在NAB7061(4微克/毫升)的Mueller-Hinton琼脂培养基(产品号LabO39；LabM Ltd.，Bury，Lancs，UK)，测定一组代表性临床应用抗微生物剂对两株大肠杆菌(ATCC25922和IH3080)、肺炎克雷伯氏菌ATCC13883和阴沟肠杆菌ATCC23355的最低抑制浓度(MIC)。通过使用E-strips(Biodisk Ltd.，Solna，Sweden)根据制造商的说明测定MIC。所使用的NAB7061浓度本身并不抑制靶细菌生长。NAB7061对大肠杆菌IH3080和肺炎克雷伯氏菌ATCC13883的MIC＞16μg/ml，对大肠杆菌ATCC25922为16μg/ml，对肺炎克雷伯氏菌ATCC23355为8μg/ml。
结果在表7中显示。NAB7061在4微克/毫升浓度时能够以170至1500的因数使测试菌株对利福平致敏。致敏因数定义为不存在NAB7061时抗生素的MIC与4微克/毫升NAB7061存在下的MIC的比值。对克拉霉素(63-380)、莫匹罗星(24-512)、阿奇霉素(31-94)、红霉素(21-48)也观察到相当高的致敏因数，对于一些菌株，夫西地酸、奎奴普丁-达福普汀、克林霉素、利奈唑胺和万古霉素也观察到相当高的致敏因数。所有这些抗菌剂都是非常疏水的或大的(万古霉素)，并已知被革兰氏阴性菌的完整OM所阻挡，但可以透过受损的OM。没有发现对哌拉西林、头孢他啶、头孢噻肟、左氧氟沙星、环丙沙星、美罗培南和妥布霉素显著致敏(致敏因数＜2，通过使用大肠杆菌ATCC25922测定)，所有这些药剂都是亲水的或者相对亲水的，对它们来说，完整OM不是有效的穿透屏障。
表7
在NAB7061浓度为4微克/毫升时选定抗菌剂的致敏因数＊
＊致敏因数是不存在NAB7061时抗生素的MIC与4微克/毫升NAB7061存在下MIC的比值
＊＊来自5个独立测定的结果
＊＊＊来自2个独立测定的结果
实施例8
33种不同革兰氏阴性菌株在NAB7061(4微克/毫升)存在下对利福平和克拉霉素的易感性
通过如实施例7中的E-test方法并使用含有或不含NAB7061(4微克/毫升)的Mueller-Hinton琼脂，测定利福平和克拉霉素对一组代表性临床相关革兰氏阴性菌不同菌株的最低抑制浓度(minimum inhibitoryconcentrations，MIC)。此浓度的NAB7061本身不抑制靶细菌的生长。菌株来源于ATCC(11种菌株)、CCUG(11种菌株)和NCTC(英国国家典型培养物保藏中心，C0lindale，UK；2种菌株)。8种菌株(F菌株)购自M0bidiag Ltd.，赫尔辛基，芬兰。大肠杆菌IH3080的来源在实施例2中给出。致敏因数在实施例7中有定义。
结果显示于表8。对于属于大肠杆菌、产酸克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌和弗氏柠檬酸杆菌的所有菌株(17种)来说，存在NAB7061时(4微克/毫升)利福平的MIC低至≤0.125微克/毫升，致敏因数为85至2000不等。克拉霉素得到非常类似的结果。对于17种属于大肠杆菌、产酸克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌和弗氏柠檬酸杆菌的菌株中的15种，存在NAB7061时(4微克/毫升)克拉霉素的MIC低至≤0.25微克/毫升，对于所有17种菌株，致敏因数为90至1000不等。肺炎克雷伯氏菌菌株对两种抗生素都仍更有抗性，致敏因数为10至500不等。对于波美不动杆菌的3种菌株，致敏因数为24至125不等，所得MIC值相当低(利福平为≤0.125微克/毫升，克拉霉素为≤0.5微克/毫升)
表8
NAB7061使革兰氏阴性菌对模式抗生素(利福平和克拉霉素)致敏的能力
＊结果来自2个独立测定
＊＊致敏因数是不存在NAB7061时与4微克/毫升NAB7061存在时利福平MIC的比值
＊＊＊致敏因数是不存在NAB7061时与4微克/毫升NAB7061存在时克拉霉素MIC的比值
＊＊＊＊结果来自5个(利福平)和2个(克拉霉素)独立测定
＊＊＊＊＊结果来自3个独立测定(利福平)
实施例9
NAB7061使卡巴培南抗性的不动杆菌(Acinetobacter)菌株对卡巴培南致敏
通过如实施例7中的E-test方法并使用含有或不含NAB7061(4微克/毫升)的Mueller-Hinton琼脂，测定两种卡巴培南(亚胺培南和美罗培南)对三种波美不动杆菌菌株的最低抑制浓度(MIC)。此浓度的NAB7061本身不抑制靶细菌的生长。致敏因数在实施例7中定义。结果显示于表9。NAB7061以≥4的因数使卡巴培南抗性菌株(F263、F264)对两种卡巴培南均致敏。
表9
在NAB7061不存在和存在(4微克/毫升)时亚胺培南和美罗培南针对波美不动杆菌菌株的易感性
实施例10
NAB7061使大肠杆菌对新鲜正常血清中的补体致敏
按照Vaara等(1984)所述的方法研究NAB7061使大肠杆菌的带荚膜光滑菌株对正常豚鼠血清(guinea pig serum，GPS)的抗菌作用致敏的能力。在37℃的翻转摇床上将大肠杆菌IH3080(018，K1)在LB液体培养基(LB broth Lennox，Difco，BD，Sparks，MD，USA)中培养至对数生长早期，用PBS(磷酸盐缓冲盐溶液，每升含8.0g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4×2H2O和0.2g KH2PO4)洗涤，重悬于PBS至约109个细胞/ml。GPS用作补体来源。其保存于-70℃待用。为了使补体失活，将血清在56℃孵育30分钟。
实验步骤如下。以约每毫升500CFU(菌落形成单位)的细菌接种PBS中的10％GPS，吸取0.2毫升等分试样放入微滴定板的孔中。所述孔已含有0.020毫升0.9％NaCl中量递增的NAB7061。将所述板在37℃孵育2小时，然后将每个孔移空至LB平板上。在37℃过夜孵育所述平板，对产生的菌落计数。
结果显示于表10。NAB7061本身在不存在GPS时或者存在热失活10％GPS时不显著减少CFU计数。但是，在存在10％的新鲜GPS时，低至2微克/毫升浓度的NAB7061足以减少约100倍的CFU计数。因此NAB7061与新鲜血清中存在的抗菌补体机制协同作用，如公知具有此特性的药剂PMBN一样。
表10
NAB7061和10％豚鼠血清(GPS)针对大肠杆菌IH3080(O18：K1)的协同抗菌活性＊
＊测量为37℃处理2小时后的存活％
实施例11
NAB7061与肾皮质的刷状缘膜(brush-border membrane，BBM)亲和力的降低
可以通过测量本发明化合物抑制放射性标记的庆大霉素与BBM结合的能力来间接测定本发明化合物与分离自肾皮质的刷状缘膜(BBM)的结合。因此，与BBM的亲和力低于例如多粘菌素B的本发明化合物以低于多粘菌素B的程度抑制放射性标记庆大霉素的结合。
通过按照Nagai等(2006)所述使用Mg2+/EGTA沉淀技术，从雄性白化小鼠的肾皮质分离BBM。根据Nagai等(2006)所述方法，通过将10mM HEPES(pH7.5)中的BBM囊泡(20微升)与存在20μM[3H]庆大霉素(Amersham Biosciences Inc.，Buckinghamshire，U.K.)的100mM甘露醇在带有或不带有待测试化合物或阳性对照的情况下一起孵育来测量庆大霉素的结合。在4℃孵育60分钟之后，加入1毫升冰冷的上述缓冲液，通过Millipre滤器(0.45μm；HAWP)过滤混合物。用缓冲液洗涤滤器，通过使用闪烁计数器测量保留在滤器上的放射性。如Nagai等(2006)所述使用Hill方程确定IC50值。
所研究NAB化合物和对照的IC50值(μM)如下：NAB7061为187.3+24.3(2个独立实验的平均值，每个进行3个平行测定)，多粘菌素B为39.3+5.5(2个独立实验的平均值，每个进行3个平行测定)，未标记庆大霉素为90.2+9.7(3个平行测定)。因此，NAB7061与BBM的亲和力仅约为庆大霉素与BBM亲和力的一半，约为多粘菌素B与BBM亲和力的五分之一。
实施例12
NAB7061在小鼠中实验性大肠杆菌腹膜炎模型中的活性
从血琼脂平板(Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark)上的过夜培养物中制备大肠杆菌IH3080(K1：O18)在盐水(0.9％NaCl)中的悬液。在腹部的侧下四分之一处对所有小鼠(来自Harlan Scandinavia，Denmark的雌性NMR1，体重25-30g)腹膜内接种0.5毫升每毫升含0.96×106CFU的悬液。在第1小时，从3只小鼠中测定CFU计数，剩下的小鼠(每组4只)用皮下注射0.2毫升红霉素的盐水溶液(对应于5毫克/千克体重)或者NAB7061的盐水溶液(对应于5毫克/千克体重)，或红霉素与NAB7061的盐水溶液(对应于两种药物都是5毫克/千克体重；在两个不同部位给药)进行处理。对照组接受两个0.2毫升盐水注射。在感染后4.5小时，用CO2麻醉所有小鼠并处死。腹膜内注射无菌盐溶液(2毫升)，轻轻按摩腹部，然后将其打开，对液体取样。将所述液体的合适稀释液铺在血琼脂平板上，过夜孵育所述平板，对菌落计数。
在感染后第1小时，CFU计数是0.74(+0.7)×106/ml.在感染后4.5小时(对应于处理后3.5小时)，CFU计数(每ml)是11.1(±6.2)×106(对照组)、8.9(±6.4)×106(红霉素组)、1.1(±0.6)×106(NAB 7061组)和2.1(±1.2)×106(NAB加红霉素组)。因此，在不存在NAB7061时，细菌计数增加15倍(盐水组)或12倍(红霉素组)，而在NAB7061存在时，相应倍数是1.5至3。
实施例13
NAB7061的毒性研究
通过两周内每天两次静脉内施用NAB7061剂量(1、2、4、8、16和32mg/kg/天)以及对照化合物多粘菌素B来测定年幼大鼠(研究开始时约150g体重)中的毒性。每个给药方案研究一组10只大鼠。每天进行临床观察，每周两次测量体重，每周两次测量食物消耗。在第二周结束时，处死所有动物。
对照化合物多粘菌素B在低至1mg/kg/天的剂量下对体重增加产生负影响，而具有此作用的NAB7061最低剂量是8mg/kg。32mg/kg/天的多粘菌素B造成致死(死亡率100％)，而所有接受NAB7061的大鼠均在整个实验过程中保持存活。在研究结束时，接受16mg/kg/天的多粘菌素的组中血液尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)比对照或低剂量多粘菌素组(1mg/kg/天)高15％。在接受16mg/kg/天的NAB7061的组中，没有发现此升高，在接受32mg/kg/天的NAB7061的组中，升高7％。
对每个动物进行肾脏的组织病理学研究，在接受NAB7061的3个高剂量组中进行所有组织的组织病理学研究。在一般性病理学和任何器官的组织病理学研究中或者在接受NAB7061的任何动物的肾脏组织病理学研究中，都没有发现与NAB7061相关的病理学所见。
以下内容对应于母案申请中的原始权利要求书，现作为说明书的一部分并入此处：
1、通式(I)的多粘菌素衍生物或其可药用盐，
其中R1、R2和R3是任选的；其特征在于R1、R2、R3、R5、R8和R9是阳离子或中性氨基酸残基，其被选择成使得在生理pH下正电荷总数至少是2但不超过3；
其前提为当R(FA)-R1-R2-R3构成天然多粘菌素B侧链时R8和R9不都是甲酰化的，当R4-R10构成天然多粘菌素B环结构时R4不直接与辛酰基相连。
2、根据项1的衍生物，其中所述正电荷选自游离的未取代氨基和其它阳离子基团。
3、根据项1-2中任一项的衍生物，其中R1-R10选自SEQ ID NO：9-26。
4、根据项1-3中任一项的衍生物，其中R(FA)选自OA、DA和MHA。
5、根据项1-4中任一项的衍生物，其中所述正电荷的数目是3。
6、根据项5的衍生物，其中R1-R10选自SEQ ID NO：9-20。
7、根据项6的衍生物，其选自OA-SEQ ID NO.10、DA-SEQ ID NO.10、OA-SEQ ID NO.11、OA-SEQ ID NO.12、DA-SEQ ID NO.13、OA-SEQID NO.13、MHA-SEQ ID NO.13、MHA-SEQ ID NO.14、OA-SEQ ID NO.15、OA-SEQ ID NO.16、OA-SEQ ID NO.17、OA-SEQ ID NO.18、OA-SEQ ID NO.19、OA-SEQ ID NO.20和DA-SEQ ID NO.9。
8、包含两种或更多种项1至7中任一项所述衍生物的组合产品。
9、包含至少一种项1至7中任一项所述衍生物以及至少一种可药用载体和/或赋形剂的药物组合物。
10、根据项9的药物组合物，其另外包含抗菌剂。
11、一种治疗、减轻或改善受试者中由革兰氏阴性菌造成的感染的方法，所述方法包括施用治疗有效量的根据项1至7任一项所述衍生物或者根据项8的组合。
12、根据项11的方法，其中所述细菌选自大肠杆菌(Escherichiacoli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和波美不动杆菌(Acinetobacter baumanni)。
13、一种使得革兰氏阴性菌对抗菌剂致敏的方法，所述方法包括同时或以任意顺序依次施用治疗有效量的所述抗菌剂以及根据项1至7任一项所述衍生物或根据项8的组合。
14、根据项13的方法，其中所述抗菌剂选自克拉霉素、阿奇霉素、红霉素和其它大环内酯类药物，酮内酯类，克林霉素和其它林可酰胺类，链阳性菌素类，利福平、利福布汀、利福拉齐及其它利福霉素类，夫西地酸、莫匹罗星、噁唑烷酮类、万古霉素、达巴万星、特拉万星、奥利万星及其它糖肽抗生素、氟喹诺酮类、杆菌肽、四环素衍生物、β内酰胺抗生素类、新生霉素、截短侧耳素类、叶酸合成抑制剂、去甲酰酶抑制剂和细菌流出泵抑制剂。
15、根据项14的方法，其中所述抗菌剂选自克拉霉素、阿奇霉素、红霉素、克林霉素、链阳性菌素组合奎奴普丁-达福普汀、利福平、夫西地酸、莫匹罗星、噁唑烷酮类利奈唑胺、万古霉素、氟喹诺酮类莫西沙星以及叶酸合成抑制剂三甲氧苄氨嘧啶。
16、根据项13的方法，其中所述细菌选自大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreutndii)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和波美不动杆菌(Acinetobacter baumanni)。
17、一种开发新型抗生素的方法，其包括以下步骤，
(a)提供具有总共4至6个正电荷的天然多粘菌素或八肽菌素化合物，或其衍生物；
(b)用不带正电荷的残基或者用共价键替换1至4个带1个或多个正电荷的残基，由此产生具有2或3个正电荷的多粘菌素化合物的衍生物；
(c)测定所述衍生物化合物针对革兰氏阴性菌的抗菌活性或者使革兰氏阴性菌对抗生素致敏的能力；和
(d)选择具有针对革兰氏阴性菌的抗菌活性或者能使革兰氏阴性菌对抗菌剂致敏的化合物。
18、一种用于降低天然多粘菌素、八肽菌素及其衍生物在其治疗个体中感染的应用期间的毒性的方法，其包括以下步骤：
(a)提供具有总共4至6个正电荷的天然多粘菌素或八肽菌素化合物或其衍生物；
(b)用不带正电荷的残基或者共价键取代1至4个带1个或多个正电荷的残基，由此产生具有2或3个正电荷的衍生物；和
(c)对所述个体施用所述衍生物。
19、项18的方法，其中所述毒性是肾毒性。
20、一种改善天然多粘菌素、八肽菌素及其衍生物的药物代谢动力学特性的方法，其包括以下步骤：
(a)提供具有总共4至6个正电荷的天然多粘菌素或八肽菌素化合物或其衍生物；
(b)用不带正电荷的残基或者共价键取代1至4个带1个或多个正电荷的残基，由此产生具有2或3个正电荷的衍生物；
其中所述改善的药物代谢动力学特性由以下组成：相比于起始化合物具有更长的血清半衰期或者更不易于被多阴离子组织和脓组分失活。
21、一种使具有临床重要性的革兰氏阴性菌对血清中存在的宿主防御机制补体致敏的方法，其中在临床感染过程中使根据项1-7中任一项的衍生物作用于所述细菌。
22、根据项21的方法，其中所述细菌选自：大肠杆菌(Escherichiacoli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和波美不动杆菌(Acinetobacter baumanni)。
23、根据项1-7中任一项的衍生物在制备治疗革兰氏阴性菌所造成感染的药物中的用途。
24、根据项23的用途，其中所述细菌选自大肠杆菌(Escherichiacoli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和波美不动杆菌(Acinetobacter baumanni)。
25、根据项1-7中任一项的衍生物在制备使革兰氏阴性菌对抗菌剂致敏的药物中的用途。
26、根据项25的用途，其中所述细菌选自大肠杆菌(Escherichiacoli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和波美不动杆菌(Acinetobacter baumanni)。
27、根据项25的用途，其中所述抗菌剂选自：克拉霉素、阿奇霉素、红霉素和其它大环内酯类药物，酮内酯类、克林霉素和其它林可酰胺类，链阳性菌素类，利福平、利福布汀、利福拉齐及其它利福霉素类，夫西地酸、莫匹罗星、噁唑烷酮类、万古霉素、达巴万星、特拉万星、奥利万星及其它糖肽抗生素、氟喹诺酮类、杆菌肽、四环素衍生物、β内酰胺抗生素、新生霉素、截短侧耳素类、叶酸合成抑制剂、去甲酰酶抑制剂和细菌流出泵抑制剂。
28、根据项27的用途，其中所述抗菌剂选自：克拉霉素、阿奇霉素、红霉素、克林霉素、链阳性菌素组合奎奴普丁-达福普汀、利福平、夫西地酸、莫匹罗星、噁唑烷酮类利奈唑胺、万古霉素、氟喹诺酮类莫西沙星以及叶酸合成抑制剂三甲氧苄氨嘧啶。
29、根据项1-7中任一项的衍生物在制备使革兰氏阴性菌对血清中存在的宿主防御机制补体致敏的药物中的用途。
30、根据项29的用途，其中所述细菌选自：大肠杆菌(Escherichiacoli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和波美不动杆菌(Acinetobacter baumanni)。
31、用于制备项1所限定的式(I)的多粘菌素衍生物的方法，其包括修饰具有4至6个带正电残基的天然或合成多粘菌素或八肽菌素化合物或其衍生物，以获得具有2或3个带正电残基的根据项1的式(I)多粘菌素衍生物，所述修饰通过用中性残基或用共价键替换1至4个所述带正电残基来或者通过将1至4个所述带正电残基转化成中性残基来进行。
32、根据项31的方法，其包括以全合成方法来实施所述方法。
33、根据项31的方法，其包括以半合成方法来实施所述方法。
34、根据项33的方法，其包括下述步骤：
(a)切割天然或合成的多粘菌素或八肽菌素化合物或其衍生物以除去所述多粘菌素化合物的侧链，并回收所述化合物的环部分，和
(b)将步骤(a)中获得的环部分与合成制备的侧链相偶联，以获得根据项1的式(I)的多粘菌素衍生物。
35、项34的方法，其包括以酶促方式进行步骤(a)中的切割。
36、项34的方法，其包括以化学方式进行步骤(a)中的切割。
37、项34的方法，其包括使用化学处理和酶促处理的组合进行步骤(a)中的切割。

Claims (26)

1.通式(I)的多粘菌素衍生物或其可药用盐，
其中
R1不存在或者是α-氨基丁酰基残基；
R2选自苏氨酰基、丝氨酰基和丙氨酰基残基；
R3选自苏氨酰基、丝氨酰基、丙氨酰基、α-氨基丁酰基和α,γ-二氨基正丁酰基残基；
R4是α,γ-二氨基正丁酰基；
R5选自α,γ-二氨基正丁酰基、α-氨基丁酰基和赖氨酰基残基；
R6选自D-苯丙氨酰基和D-亮氨酰基残基；
R7选自亮氨酰基、苏氨酰基和异亮氨酰基残基；
R8选自α,γ-二氨基正丁酰基和α-氨基丁酰基残基；
R9选自α,γ-二氨基正丁酰基和α-氨基丁酰基残基；
R10选自苏氨酰基和亮氨酰基残基；和
R(FA)选自辛酰基、癸酰基和6-MHA；
其中所述氨基酸残基被选择成使得在生理pH下正电荷总数是3，以及七肽环部分R4-R10的正电荷总数至少是2，由此所述多粘菌素衍生物仍具有针对革兰氏阴性菌的抗菌活性，和/或具有使革兰氏阴性菌对抗菌剂致敏的能力。
2.根据权利要求1的衍生物，其中R1-R10选自SEQ ID NO:10-22和24。
3.根据权利要求1-2中任一项的衍生物，其中R1-R10选自SEQ IDNO:10-20。
4.根据权利要求3的衍生物，其选自OA-SEQ ID NO.10、DA-SEQ IDNO.10、OA-SEQ ID NO.11、OA-SEQ ID NO.12、DA-SEQ ID NO.13、OA-SEQ ID NO.13、MHA-SEQ ID NO.13、MHA-SEQ ID NO.14、OA-SEQ ID NO.15、OA-SEQ ID NO.16、OA-SEQ ID NO.17、OA-SEQID NO.18、OA-SEQ ID NO.19和OA-SEQ ID NO.20。
5.包含两种或更多种权利要求1至4中任一项所述衍生物的组合产品。
6.包含至少一种权利要求1至4中任一项所述衍生物以及至少一种可药用载体和/或赋形剂的药物组合物。
7.根据权利要求6的药物组合物，其另外包含抗菌剂。
8.权利要求1至4中任一项所述衍生物或者权利要求6的组合在制备治疗、减轻或改善受试者中由革兰氏阴性菌造成的感染的药物中的用途。
9.根据权利要求8的用途，其中所述革兰氏阴性菌选自大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和波美不动杆菌(Acinetobacter baumanni)。
10.抗菌剂以及根据权利要求1至4任一项所述衍生物或根据权利要求6的组合在制备使得革兰氏阴性菌对所述抗菌剂致敏的药物中的用途，所述药物与治疗有效量的所述抗菌剂同时或依次施用。
11.根据权利要求10的用途，其中所述抗菌剂选自克拉霉素、阿奇霉素、红霉素和其它大环内酯类药物，酮内酯类，克林霉素和其它林可酰胺类，链阳性菌素类，利福平、利福布汀、利福拉齐及其它利福霉素类，夫西地酸、莫匹罗星、噁唑烷酮类、万古霉素、达巴万星、特拉万星、奥利万星及其它糖肽抗生素、氟喹诺酮类、杆菌肽、四环素衍生物、β内酰胺抗生素类、新生霉素、截短侧耳素类、叶酸合成抑制剂、去甲酰酶抑制剂和细菌流出泵抑制剂。
12.根据权利要求10的用途，其中所述抗菌剂选自克拉霉素、阿奇霉素、红霉素、克林霉素、链阳性菌素组合奎奴普丁-达福普汀、利福平、夫西地酸、莫匹罗星、噁唑烷酮类利奈唑胺、万古霉素、氟喹诺酮类莫西沙星以及叶酸合成抑制剂三甲氧苄氨嘧啶。
13.根据权利要求10的用途，其中所述革兰氏阴性菌选自大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和波美不动杆菌(Acinetobacter baumanni)。
14.根据权利要求1至4任一项所述衍生物在制备使具有临床重要性的革兰氏阴性菌对血清中存在的宿主防御机制补体致敏的药物中的用途。
15.根据权利要求14的用途，其中所述革兰氏阴性菌选自：大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和波美不动杆菌(Acinetobacter baumanni)。
16.根据权利要求1-4中任一项的衍生物在制备使革兰氏阴性菌对抗菌剂致敏的药物中的用途。
17.根据权利要求16的用途，其中所述革兰氏阴性菌选自大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和波美不动杆菌(Acinetobacter baumanni)。
18.根据权利要求16的用途，其中所述抗菌剂选自：克拉霉素、阿奇霉素、红霉素和其它大环内酯类药物，酮内酯类、克林霉素和其它林可酰胺类，链阳性菌素类，利福平、利福布汀、利福拉齐及其它利福霉素类，夫西地酸、莫匹罗星、噁唑烷酮类、万古霉素、达巴万星、特拉万星、奥利万星及其它糖肽抗生素、氟喹诺酮类、杆菌肽、四环素衍生物、β内酰胺抗生素、新生霉素、截短侧耳素类、叶酸合成抑制剂、去甲酰酶抑制剂和细菌流出泵抑制剂。
19.根据权利要求18的用途，其中所述抗菌剂选自：克拉霉素、阿奇霉素、红霉素、克林霉素、链阳性菌素组合奎奴普丁-达福普汀、利福平、夫西地酸、莫匹罗星、噁唑烷酮类利奈唑胺、万古霉素、氟喹诺酮类莫西沙星以及叶酸合成抑制剂三甲氧苄氨嘧啶。
20.用于制备权利要求1所限定的式(I)的多粘菌素衍生物的方法，其包括修饰具有4至6个带正电残基的天然或合成多粘菌素或八肽菌素化合物或其衍生物，以获得根据权利要求1的在生理pH下正电荷总数是3并且七肽环部分R4-R10的正电荷总数至少是2的式(I)多粘菌素衍生物，所述修饰通过用中性残基或用共价键替换1至3个所述带正电残基或者通过将1至3个所述带正电残基转化成中性残基来进行。
21.根据权利要求20的方法，其包括以全合成方法来实施所述方法。
22.根据权利要求20的方法，其包括以半合成方法来实施所述方法。
23.根据权利要求22的方法，其包括下述步骤：
(a)切割天然或合成的多粘菌素或八肽菌素化合物或其衍生物以除去所述多粘菌素化合物的侧链，并回收所述化合物的环部分，和
(b)将步骤(a)中获得的环部分与合成制备的侧链相偶联，以获得根据权利要求1的式(I)的多粘菌素衍生物。
24.权利要求23的方法，其包括以酶促方式进行步骤(a)中的切割。
25.权利要求23的方法，其包括以化学方式进行步骤(a)中的切割。
26.权利要求23的方法，其包括使用化学处理和酶促处理的组合进行步骤(a)中的切割。
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