PT2057185E

PT2057185E - Derivados de polimixina e suas utilizações

Info

Publication number: PT2057185E
Application number: PT07803704T
Authority: PT
Inventors: Vaara Martti; Vaara Timo
Original assignee: Northern Antibiotics Oy
Priority date: 2006-08-11
Filing date: 2007-08-10
Publication date: 2016-06-17
Also published as: CN103059106B; CA2694289C; BRPI0715095B8; NO341982B1; PL2057185T3; MX2009001398A; HRP20160552T1; EP2057185A4; CY1117848T1; CN101501063B; WO2008017734A8; ES2575521T3; IL220270A0; EP3078672A1; CN101501063A; RU2009107857A; AU2007283514A1; KR101502453B1; IL196693A0; KR20150008198A

Description

DESCRIÇÃO "DERIVADOS DE POLIMIXINA E SUAS UTILIZAÇÕES"

CAMPO TÉCNICO A presente invenção refere-se a derivados de polimixina e à utilização dos referidos derivados de polimixina para utilização no tratamento de infecções causadas por bactérias Gram-negativas. Os derivados de polimixina podem ter efeitos antibacterianos ou podem tornar as bactérias sensíveis para melhorar os efeitos de outros agentes antibacterianos.

ANTECEDENTES A sepsia mata mais de 215000 americanos por ano. Estima-se gue 750000 americanos estejam infectados com sepsia grave e dos guais 29% deles morrem em seu resultado a cada ano. As mortes por sepsia perfazem 9% de todos os casos de morte nos EUA. A sepsia mata tantos americanos como as infecções do miocárdio, mais ainda do gue acidentes de viação.

Dois a três milhões de americanos adguirem uma infecção hospitalar cada ano e 10% destas infecções progridem para sepsia. Mais de 90000 destes pacientes morrem de sepsia, infectados em hospitais. A sepsia grave e choque séptico (sepsia grave combinada com pressão arterial baixa) levou até 135000 vidas em cada ano nas unidades de cuidados intensivos (UCI) na União Europeia, de acordo com o Relatório da Saúde da OCDE de 2000. Na Grã Bretanha, 5000 de cada 100000 pacientes que adquiriram uma infecção hospitalar morrem de sepsia todos os anos em hospitais de cuidados agudos pertencentes à organização do SNS. 0 número de mortos tem aumentado ano após ano devido ao facto de o número de doentes com predisposição à sepsia, como os idosos, recém-nascidos prematuros e pacientes com cancro, ter aumentado, até porque muitas doenças graves são mais tratáveis do que antes. Além disso, a utilização de dispositivos médicos invasivos e procedimentos agressivos aumentou.

As bactérias Gram-negativas causam mais de 40% de todas as infecções de septicemia e muitas das bactérias Gram-negativas são extremamente multirresistentes. As bactérias Gram-negativas proporcionam um desafio mais dificil na terapia do que as Gram-positivas, uma vez que possuem uma estrutura única, a membrana exterior, como a sua estrutura mais externa. As moléculas de lipopo-lissacáridos localizadas na membrana exterior inibem a difusão de diversos agentes antibacterianos para o interior da célula, onde os seus alvos finais estão localizados. Mais de 95% dos novos agentes antibacterianos isolados da natureza ou sintetizados quimicamente em 1972-1991 não apresentam actividade contra bactérias Gram-negativas (Vaara 1993).

As polimixinas são um grupo de substâncias com propriedades antibióticas bastante aparentadas produzidas por estirpes de Paenibacillus polymyxa e organismos relacionados. Estes fármacos catiónicos são péptidos relativamente simples com pesos moleculares de cerca de 1000. As polimixinas, tais como, a polimixina B, são antibióticos decapeptidicos, isto é, são formadas por dez (10) resíduos de aminoacilo. Elas são bactericidas e especialmente eficazes contra as bactérias Gram-negativas, tais como, a Escherichia coli e outras espécies de Enterobacteriaceae, Pseudomonas, Acinetobacter baumannii, e outras. No entanto, as polimixinas têm efeitos adversos graves, incluindo a nefrotoxicidade e a neurotoxicidade. Estes fármacos têm, assim, uma utilização limitada como agentes terapêuticos por causa da elevada toxicidade sistémica.

As polimixinas têm sido utilizadas na terapia de infecções graves causadas por essas bactérias, mas por causa da toxicidade, a sua utilização foi largamente abandonada na década de 70, quando foram desenvolvidos antibióticos novos, melhor tolerados. O recente surgimento de estirpes multirresistentes de bactérias Gram-negativas, exigiu a utilização terapêutica de polimixinas como último recurso, apesar de sua toxicidade e, como muitos dos antibióticos menos tóxicos tinham já perdido a sua eficácia contra as estirpes particulares da referida bactéria, a utilização de polimixinas aumentou novamente.

Deste modo, as polimixinas foram então recuperadas para o arsenal terapêutico, embora, devido à sua toxicidade, numa escala muito limitada. A sua utilização sistémica (isto é, não-tópica) é, no entanto, em grande parte, restrita à terapia de infecções potencialmente fatais causadas por estirpes de Ps. aeruginosa e Acinetobac-ter baumannii com resistências múltiplas, bem como por bactérias entéricas resistentes a carbapenemes.

As polimixinas consistem numa parte heptape-ptídica cíclica e uma parte linear que consiste numa porção tripeptídica e uma cauda de ácido gordo hidrofóbica ligada ao grupo α-amina do resíduo do aminoácido N-terminal do tripéptido e podem ser representadas pela fórmula geral:

em que R1-R3 representam a porção da cadeia lateral do tripéptido; R4-R10 a porção do anel de heptapéptido e R (FA) representa a cauda de ácido gordo hidrofóbica ligada ao grupo α-amina do resíduo de aminoácido N-terminal do tripéptido. 0 grupo polimixina inclui as seguintes polimixinas: Al, A2, B1-B6, C, Dl, D2, El, E2, F, Kl, K2, M, PI, P2, SI e T (Storm et al. 1977; Srinivasa e Ramachandran 1979) . Todas as polimixinas são policatiónicas e possuem cinco (5) cargas positivas, com a excepção das polimixina D, F e S, que possuem quatro (4) cargas positivas. Deve notar-se que polimixinas modificadas que não possuem a parte R(FA) do ácido gordo mas contêm R1-R10 têm uma carga positiva adicional quando comparadas com as polimixinas naturais das quais derivam devido ao grupo examina livre na extremidade N do derivado. Por conseguinte, por exemplo, um tal derivado de polimixina B ou polimixina E apresenta seis (6) cargas positivas no total.

As polimixina B e polimixina E clinicamente utilizadas diferem uma da outra apenas no resíduo R6, que é o resíduo D-fenilalanilo na polimixina B e o resíduo de D-leucilo na polimixina E.

Também as circulinas A e B são classificadas como polimixinas (Storm et al., 1977). Elas diferem de outras polimixinas apenas em terem o resíduo isoleucilo na posição R7, enquanto que outras polimixinas apresentam o resíduo treonilo ou o resíduo leucilo na referida posição. Para uma visão geral das estruturas de algumas polimixinas, ver Tabela 1. PE2057185 - 6 -

Tabela 1

Estrutura de poliraixinas e octapeptinas seleccionadas, bem como seus derivados.

A polimixina B é representada pela seguinte fórmula:

A polimixina B comercialmente disponível é uma mistura, em que R-FA é predominantemente 6-metiloctanoílo (6-MOA, na polimixina Bl), mas também pode ser um acilo gordo relacionado, tal como 6-metil-heptanoílo (6-MHA, na polimixina B2), octanoílo (na polimixina B3), ou heptanoílo (polimixina B4) (Sakura et al. 2004). Todas estas variantes são igualmente potentes contra bactérias Gram-negativas, tais como, E. coli (Sakura et al., 2004). Muito analogamente, na polimixina El (colistina A) e na circulina A, R-FA é 6-MOA e na polimixina E2 (colistina B) e na circulina B, R-FA é 6-MHA. Numerosos investigadores têm ligado várias porções hidrofóbicas, incluindo vários resíduos de acilos gordos na extremidade N de derivados de polimixina e análogos, e mostraram que os derivados resultantes têm uma forte actividade antibacteriana (Chihara et al. 1973, Sakura et al., 2004 e na publicação da patente US 2006004185) . Mesmo o derivado que contém o resíduo hidrofóbico volumoso 9-fluorenilmetoxicarbonilo como o R-FA é quase tão potente como a polimixina B na inibição do crescimento de E. coli e outras bactérias Gram-negativas (Tsubery et al. 2001).

Para a actividade biológica, a estrutura do anel com heptapéptido é essencial (Storm et al. 1997). Um derivado com um anel com octapéptido é significativamente menos activo como antibiótico.

Modificações múltiplas de polimixinas e várias moléculas sintéticas semelhantes a polimixinas foram realizadas, e com certos limites preservaram a sua actividade biológica. As modificações compreendem, mas não estão limitadas àquelas na cadeia lateral, bem como moléculas em que um resíduo de aminoácido inerentemente hidrofóbico (como DPhe ou Leu) foi substituído por outro resíduo de aminoácido hidrofóbico ou em que o Dab catiónico foi substituído por outro resíduo de amino acilo catiónico, tal como, resíduo Lis, Arg, ou ornitina (Storm et al., 1997, Tsubery et al., 2000a, Tsubery et al., 2002, publicação da patente US 2004082505, Sakura et al. 2004, publicação da patente US 2006004185).

Outras modificações que resultam em compostos, pelo menos parcialmente, microbiologicamente activos compreendem, mas não se limitam a ésteres de alcanoílo em que os grupos -OH dos resíduos treonilo formam ésteres com alcanoílos, tais como, propionilo e butirilo (Patente US 3, 450, 687) .

As octapeptinas são de resto idênticas às polimixinas, mas têm uma ligação covalente em vez dos resíduos R1-R2 (Tabela 1). Na presente invenção, as posições R são numeradas de acordo com aquelas das polimixinas naturais e, portanto, o único resíduo aminoacilo na cadeia lateral das octapeptinas é definido como R3. Assim, as octapeptinas são octapéptidos enquanto que todas as polimixinas naturais são decapéptidos, e possuem apenas quatro (4) cargas positivas. Os resíduos R-FA, entre várias octapeptinas (Al, A2, A3, Bl, B2, B3, Cl), incluem o seguinte: ácido 3-OH-8-metildecanóico, ácido 3-OH-8-metilnonanóico, e ácido β-ΟΗ-6-metiloctanóico. Os derivados que possuem um resíduo de acilo gordo com 6 a 18 átomos de carbono têm uma potente actividade antibacteriana contra E. coli (Storm et al. 1977) . O primeiro alvo de polimixinas em bactérias Gram-negativas é a sua membrana exterior (ME) , que é uma barreira com permeabilidade eficaz contra muitos agentes nocivos, incluindo antibióticos grandes (PM superior a 700 d), bem como os antibióticos hidrofóbicos. Através da ligação ao lipopolissacárido (LPS), as moléculas expostas na superfície exterior da ME, as polimixinas danificam a estrutura e a função da ME e, como resultado, permeabilizam (isto é, tornam permeável) a ME para a própria polimixina, bem como para muitos outros agentes nocivos (Nikaido e

Vaara 1985, Vaara 1992, Nikaido 2003) . Acredita-se que o alvo final e fatal (o alvo bactericida) das polimixinas é a membrana citoplasmática (a membrana interna) das bactérias. Têm sido feitos vários esforços para reduzir a toxicidade das polimixinas. O tratamento de polimixina E (colistina) com formaldeido e bissulfito de sódio produz sulfometato de colistina, em que os grupos amina livres dos cinco resíduos de ácido diaminobutírico têm sido parcialmente substituídos por grupos sulfometilo (Tabela 1). As preparações consistem em misturas indefinidas de compostos mono-, di-, tri-, tetra- e penta-substituídos. As preparações sulfometiladas, quando dissolvidas de fresco em água, carecem inicialmente da actividade antibacteriana e da toxicidade da molécula parental, mas quando os compostos começam a decompor-se na solução, no sangue ou nos tecidos, para se obter derivados menos substituídos e a colistina livre, tanto a actividade antibacteriana como a toxicidade são parcialmente restauradas. Além disso, o grau de sulfometilação inicial aparentemente varia entre as preparações farmacêuticas comercialmente disponíveis. Muitas outras formas de bloquear todos os grupos amina livres foram publicadas. Os exemplos compreendem, mas não se limitam à formação de bases de Shiff instáveis com aminoácidos (Storm et al. 1977). M 1973, mostrou-se que o nonapéptido de polimixina E (PMEN, nonapéptido colistina, Tabela 1), obtida por tratamento enzimático da polimixina E e não tendo o R-FA e Rl, era menos tóxica do que o composto parental num ensaio de toxicidade aguda (morte imediata presumivelmente devido ao bloqueio neuromuscular directo) em ratinhos (Chihara et al. 1973). No entanto, também era desprovida de actividade antibacteriana, tal como medida pela sua capacidade de inibir o crescimento bacteriano (Chirara et al. 1973).

Vaara e Vaara, por outro lado, mostraram, que o nonapéptido de polimixina B (PMBN, Tabela 1) retém a capacidade para permeabilizar a ME de bactérias Gram-negativas (Vaara e Vaara, 1983a,b,c; Patente US 4,510,132; Vaara 1992) . Por conseguinte, mesmo que não possua a actividade antibacteriana directa (isto é, a capacidade para inibir o crescimento bacteriano), é capaz de sensibilizar (isto é, tornar sensivel ou, como também denominado, tornar susceptível) as bactérias para muitos agentes antibacterianos, tais como, antibióticos hidrofó-bicos, bem como, grandes antibióticos e alguns outros agentes nocivos. PMBN também sensibiliza as bactérias para a actividade bactericida do sistema de complemento humano, presente em soro humano fresco como um sistema de defesa de primeira linha contra os invasores (Vaara e Vaara 1983a, Vaara et al. 1984, Vaara 1992). Além disso, sensibiliza as bactérias para a actividade bactericida conjunta de complemento de soro e células brancas polimorfonucleares humanas (Rose et al. 1999). Ο ΡΜΒΝ assemelha-se ao ΡΜΕΝ sendo menos tóxico no ensaio de toxicidade aguda em ratinhos do que as polimi-xinas não modificadas. Em ensaios toxicológicos adicionais, vários critérios provaram que o PBMN é menos tóxico do que o seu composto parental, mas este derivado de polimixina ainda foi considerado demasiado nefrotóxico para utilização clinica (Vaara 1992). 0 PMBN tem cinco (5) cargas positivas. Estudos subsequentes revelaram, muito previsivelmente, que o PMEN, também com cinco (5) cargas positivas, bem como a deacilpolimixina B e a deacilpolimixina E, ambas contendo seis (6) cargas positivas, são agentes potentes para sensibilizar as bactérias a outros antibióticos (Viljanen et al. 1991, Vaara 1992). Além disso, mostrou-se que um derivado do octapéptido de polimixina B (PMBO) estruturalmente mais reduzido retém uma actividade de permeabilização muito eficaz, enquanto que o heptapéptido da polimixina B (PMBH) é menos activo (Kimura et al., 1992) . Os PMBN, PMEN e PMBO têm cinco (5) cargas positivas, enquanto que o PMBH tem apenas quatro (4) cargas positivas. Esta diferença pode explicar a actividade mais fraca do PMBH. 0 grupo de Ofek, Tsubery e Friedkin descreveram recentemente péptidos idênticos a polimixinas que foram ligados a péptidos quimiotáticos, tais como fMLF, que atrai leucócitos polimorfonucleares (publicação da patente US 2004082505, Tsubery et al. 2005). Descreveram os péptidos fMLF-PMBN, MLF-PMBN, fMLF-PMEN, fMLF-PMBO e MLF-PMBO, todos com quatro (4) cargas positivas, que sensibilizam as bactérias Gram-negativas aos antibióticos, embora não existam estudos comparativos publicados com concentrações crescentes dos compostos (Tsubery et al., 2005).

De modo a estudar as estruturas e propriedades funcionais de polimixinas, foram divulgados alguns trabalhos, entre outros compostos, derivados de polimixina com menos de quatro (4) cargas positivas.

Teuber (1970) descreveu o tratamento de polimixina B com anidrido acético que proporciona uma preparação contendo polimixina B, bem como as suas formas mono, di, tri, tetra, e penta-N-acetiladas. Teuber também separou cada grupo e reportou de modo não quantitativo, usando um ensaio de difusão em agar, que as formas penta-acetilada e tetra-acetilada, não tinham a capacidade de interromper o crescimento de Salmonella typhimurium, enquanto que as formas mono- e diacetiladas apresentavam essa capacidade. A forma triacetilada tinha alguma capacidade.

Srinivasa e Ramachandran (1978) isolaram derivados parcialmente formilados de polimixina B e mostraram que um derivado de diformilo assim como um derivado de triformilo inibiram o crescimento de Pseudomonas aeruginosa. Eles não revelaram a capacidade dos compostos em sensibilizar as bactérias aos antibióticos. Além disso, em 1980, eles mostraram que os grupos amina livres de triformilpolimixina B nos resíduos RI e R3, assim como, os grupos amina livres de diformilpolimixina B nos resíduos Rl, R3 e R5 são essenciais, enquanto que os grupos amina livres em R8 e R9 não são essenciais para a inibição do crescimento (Srinivasa e Ramachandran, 1980a).

Um derivado de polimixina B encurtado, o heptapéptido do octanoílo de polimixina B foi divulgado por Sakura et al. (2004) . A ligação do resíduo de octanoílo à extremidade N do resíduo R4 do heptapéptido da polimixina B resulta num composto que tem apenas três (3) cargas positivas. Sakura et al. descobriram que o heptapéptido do octanoílo de polimixina B inibe o crescimento de bactérias apenas a uma concentração muito elevada (128 pg/mL), enquanto que os outros derivados, tais como, o octapéptido do octanoílo de polimixina B, e o nonapéptido do octanoílo de polimixina B, ambos com quatro cargas (4), eram agentes muito potentes para inibir o crescimento bacteriano. A publicação da patente US2006004185 divulgou recentemente determinados derivados de polimixina e intermediários que podem ser utilizados para sintetizar novos antibióticos peptídicos. Os compostos antibacterianos descritos possuíam quatro (4) ou cinco (5) cargas positivas.

Weinstein J. et al, "Selective chemical modifications of Polymyxin B" Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 1998, 8(23), 3391-3369, divulga derivados de polimixina com quarto (4) cargas positivas ou mais. Urn composto com seis (6) cargas positivas foi identificado como tendo o melhor perfil de toxicidade-actividade.

Clausella A. et al, "Influence of polymyxins on the structural dynamics of Escherichia coli lipid membranes", Talanta, 2003, 60 (2-3), 225-234, divulga compostos com um número total de cargas positivas de cinco (5) ou nenhuma.

Tsubery H. et al. "N-terminal modifications of Polymyxin B nonapeptides and their effect on antibacterial activity", Peptides, 2001, 22, 1675-1681, divulga modificações de polimixina B e o efeito destes novos análogos. O número total de cargas positivas nestes derivados é quatro (4) ou cinco (5).

Vaara M. et al. "Group of peptides that act synergistically with hydrophobic antibiotics against gramnegative enteric bacteria", Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1996, 40(8), 1801-1805, divulga péptidos catiónicos totalmente sintéticos contendo 4 a 7 cargas positivas.

Existe ainda uma necessidade urgente de tratamentos eficazes contra infecções bacterianas, em particular para as infecções causadas por bactérias Gram-negativas multirresistentes.

SUMÁRIO A presente invenção refere-se a um derivado de polimixina de fórmula geral (I),

em que Rl está ausente ou Abu: R2 é seleccionado do grupo consistindo de Ser, Thr, DThr e DAla; e R3 é seleccionado do grupo consistindo de Thr, DThr, Ser, DSer, DAla, Dab e Abu; R4 é Dab, R6 é DPhe ou DLeu; R7 é Leu, Thr ou Ile; R5, R8 e R9 são cada um Dab ou Abu; RIO é Leu ou Thr; e R(FA) é seleccionado do grupo que consiste em resíduos octanoílo, decanoílo, e 6-metil-heptanoílo; em que os referidos resíduos de aminoácidos são seleccionados de modo que o número total de cargas positivas a um pH fisiológico seja, pelo menos, dois, mas não mais do que três, e o número total de cargas positivas na porção da cadeia lateral R(FA)-R1-R2-R3, não excede dois, por meio do qual o referido derivado de polimixina ainda possui actividade antibacteriana contra bactérias Gram-negativas, e/ou possui a capacidade de sensibilizar bactérias Gram-negativas a agentes antibacterianos; ou um sal farmaceuticamente aceitável do referido derivado.

Mais especialmente, a presente invenção refere-se a um derivado, em que R1-R10 é seleccionado do grupo consistindo da SEQ ID No:s 9-20 e 22. A invenção também se refere a um produto de combinação compreendendo dois ou mais derivados de fórmula (I), e a uma composição farmacêutica compreendendo tais derivado(s) ou uma sua combinação e veículos e excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

Além disso, a presente invenção refere-se à utilização de um derivado de polimixina de formula (I) na produção de um medicamento para o tratamento, alívio ou melhoria de uma infecção num indivíduo, causada por uma bactéria Gram-negativa, em que a referida bactéria pode ser seleccionada do grupo consistindo de: Escherichia coli,

Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii, Pseudomonas aeruginosa, e Acinetobacter baumannii. A presente invenção também se refere à utilização de um derivado de polimixina de formula (I) para a produção de um medicamento para sensibilizar bactérias Gram-negativas a um agente antibacteriano, em que o referido agente antibacteriano pode ser seleccionado do grupo consistindo de claritromicina, azitromicina, eritromicina e outros macrólidos, cetolideos, clindamicina e outras lincosaminas, estreptograminas, rifampicina, rifabutina, rifalazil, e outras rifamicinas, ácido fusídico, mupiro-cina, oxazolidinonas, vancomicina, dalbavancina, telavan-cina, oritavancina e outros antibióticos glicopéptidos, fluoroquinonas, derivados de bacitracina e tetraciclina, antibióticos betalactâmicos, novobiocina, pleuromutilinas, inibidores da síntese do folato, inibidores da deformilase, e inibidores de bombas de efluxo bacterianas.

Mais, a invenção refere-se à utilização do derivado de polimixina de formula (I) para a produção de um medicamento para sensibilizar bactérias Gram-negativas a um complemento do mecanismo de defesa do hospedeiro presente no soro.

Mais, a presente invenção refere-se a um processo de preparação de um derivado de polimixina de formula (I) compreendendo a modificação natural ou sintética da polimixina ou do composto de octapeptina, ou um seu derivado, com 4 a 6 resíduos carregados positivamente através da substituição de 1 a 4 desses resíduos por resíduos neutros, ou por uma ligação covalente, ou convertendo 1 a 4 desses resíduos em resíduos neutros de modo a obter um derivado de polimixina de formula (I), de acordo com a reivindicação 1, com 2 ou 3 resíduos carregados positivamente.

Definições "pH fisiológico", tal como aqui utilizado, refere-se a um valor de pH de mais do que 7,0 e inferior a 7,6, tal como um valor de pH na gama de desde 7,1 a 7,5, por exemplo, na gama de desde 7,2 a 7,4. "Carga positiva", tal como aqui utilizado, significa cargas positivas ao valor de pH fisiológico definido acima.

Molécula "catiónica", tal como aqui utilizada refere-se a uma molécula que contém uma ou mais cargas positivas. "Resíduo de aminoácido", tal como aqui utilizado, refere-se a qualquer resíduo de aminoácido modificado ou não natural, ou natural, seja na configuração L- ou na configuração D-. "Resíduos equivalentes", tal como aqui utilizado, destina-se a abranger modificações óbvias de, por exemplo, aminoácidos, resultando em aminoácidos não naturais ou seus derivados, mas conservando a capacidade funcional e/ou estrutural do resíduo substituído. "Polimixina(s) natural (is)" refere-se, para o propósito desta invenção, a derivados sintéticos ou semi-sintéticos de polimixinas ou octapeptinas naturais, os quais têm uma porção de heptapéptido cíclico (ou anel heptapetídico) R4-R10 e uma cadeia lateral ligada ao aminoacilo N-terminal do resíduo R4. A cadeia lateral pode consistir num resíduo R(FA)-triaminoacil(R1-R3) , um R(FA)-diaminoacil(R2-R3), um R(FA)-monoaminoacil(R3) , ou num R(FA) sozinho. "Compostos", tal como aqui utilizado, incluem todos os isómeros do referido composto. "Actividade sensibilizante" ou "capacidade de sensibilizar", tal como aqui utilizado, destina-se a incluir qualquer capacidade para aumentar a sensibilidade, ou para tornar susceptível, uma bactéria a um agente antibacteriano.

Abreviaturas Ácidos gordos: FA, resíduo de ácido gordo; 6-MOA e MOA, resíduo 6-metiloctanoílo; 6-MHA e MHA, resíduo 6- metail-heptanoílo; MO(H)A, a mistura de 6-metiloctanoílo, 6-metail-heptanoilo e resíduos de acilos gordos semelhantes que ocorrem na polimixina B; OHMDA, ácido 3-OH-8-metildecanóico, OA, resíduo de octanoílo; DA, resíduo de decanoílo;

Aminoácidos: Dab, resíduo a,β-diamino-n-butirilo; fDab, resíduo Ν-γ-formil-diamino-n-butirilo; acDab, resíduo Ν-γ-acetildiamino-n-butirilo; Thr, resíduo treonilo; Ser, resíduo serinilo; Phe, resíduo fenil-alaninilo; Leu, resíduo leucilo; Ile, resíduo isoleucilo; Ala, resíduo alanilo; sm-Dab, resíduo γ-sulfometilado, a, γ-diamino-n-butirilo. Códigos de uma letra para resíduos de amino acilo modificados: X, Dab; Z, Abu; B, Ν-γ-fDab; J, Ν-γ-acDab. Péptidos: DAPB, diacilpolimixina B; DAC, diacilcolistina; PMBN, nonapéptido de polimixina B; PMEN, nonapéptido de polimixina E; PMBO, octapéptido de polimixina B; PMHP, heptapéptido de polimixina B.

Outros: cy, ciclo (para indicar a parte cíclica do péptido, entre parêntesis); f, formilo; ac, acetilo; LPS, lipopolissacárido; ME, membrana exterior; UFC, unidade formadora de colónias. 0 símbolo * é aqui utilizado para marcar os resíduos entre os quais a porção do anel de heptapéptido do composto está fechada, deixando a parte restante da molécula como uma cadeia lateral.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Verificou-se agora que os derivados de polimixina contendo, pelo menos duas (2) mas não mais de três (3) cargas positivas ainda possuem actividade antibacteriana contra bactérias Gram-negativas, e/ou possuam a capacidade de sensibilizar as bactérias Gram-negativas aos agentes antibacterianos, tais como antibióticos semissintéticos, antibióticos, agentes quimioterapêuticos e factores de defesa do hospedeiro, tal como o complemento.

Esta redução de cargas positivas pode melhorar as propriedades farmacológicas dos derivados de acordo com a presente invenção, quando comparadas com polimixinas naturais e os seus derivados conhecidos. Mais especificamente, pode reduzir a toxicidade, incluindo a nefrotoxicidade dos compostos e/ou reduzir a libertação de histamina a partir do tecido do hospedeiro, exercida pelos compostos e/ou resultar em propriedades farmacocinéticas mais adequadas tais como o soro com meia vida mais longa ou suscepti-bilidade inferior à inactivação pelo tecido polianiónico e constituintes do pus, em comparação com as polimixinas clinicamente utilizadas e os seus derivados anteriormente descritos e caracterizados, tais como nonapéptido de polimixina B.

Em polimixinas e octapeptinas naturais, R(FA) é ácido 6-metiloctanóico (6-MOA), ácido 6-metil-heptanóico (6-MHA), ácido octanóico, ácido heptanóico, ácido nonanói- co, ácido 3-OH-6-metiloctanóico, ácido 3-OH-8-metilde-canóico, ácido 3-OH-8-metilnonanóico, ácido 3-OH-8-deca-nóico, e ácido 3-OH-6-metiloctanóico. Exemplos de derivados conhecidos que apresentam actividade antibacteriana incluem aqueles em que R(FA) é ácido γ-fenilbutírico, ácido iovalérico, ácido 9-fluorenilmetoxicarbónico, uma série de ácidos gordos C:9 a C:14 não ramificados, assim como, ácidos gordos iso C:9 e iso C:10.

Num derivado de acordo com a presente invenção, o R(FA) é seleccionado do grupo que consiste nos resíduos de octanoílo, decanoílo e 6-MHA.

Um perito na técnica pode facilmente reconhecer equivalentes destes resíduos preferidos hidrofóbicos R(FA), que podem ser seleccionados do grupo consistindo de, por exemplo, resíduos de acilo, tais como, um resíduo de alquilo opcionalmente substituído, um resíduo de isoalquilo opcionalmente substituído, um resíduo de cicloalquilo opcionalmente substituído, um resíduo de alcenilo opcionalmente substituído, um resíduo de cicloalcenilo opcionalmente substituído, um resíduo de arilo opcionalmente substituído, um resíduo de heteroarilo opcionalmente substituído, um resíduo heterocíclico opcionalmente substituído, em que os referidos resíduos têm preferivelmente mais do que cinco (5) átomos de carbono e em que as substituições podem também incluir as opcionalmente concebidas entre o resíduo de acilo e a extremidade N do péptido. 0 R(FA) pode também ser uma extensão de um oligopéptido hidrofóbico. Exemplos de possíveis resíduos de R(FA) incluem (mas não estão limitados a) resíduos de octanoílo, nonanoílo, isononanoílo, decanoílo, isodecanoí-lo, undecanoílo, dodecanoílo, tetradecanoílo, ciclo-hexa-noílo, ciclo-heptanoílo, ciclo-octanoílo, ciclononanoílo, cicloisononanoílo, ciclodecanoílo, cicloisodecanoílo, ci-cloundecanoílo, ciclododecanoílo, ciclotetradecanoílo, he-xanoílo, heptanoílo, e 9-fluorenilmetoxicarbonilo.

Em polimixinas e octapeptinas naturais, RI é Dab ou ausente (i.e., substituído por uma ligação covalente). Exemplos de derivados conhecidos que têm actividade antibacteriana incluem aqueles em que Rl é Ala ou uma ligação covalente.

Num derivado, de acordo com a presente invenção, Rl, se presente, pode ser Abu.

Em polimixinas e octapeptinas naturais, R2 é Thr ou ausente {i.e., substituído por uma ligação covalente). Exemplos de derivados conhecidos que têm actividade antibacteriana incluem aqueles em que R2 é O-acetil-Thr, 0-propionil-Thr, O-butiril-Thr ou uma ligação covalente.

Num derivado, de acordo com a presente invenção, R2, é seleccionado do grupo consistindo de Ser, Thr, DThr e DAI a.

Em polimixinas e octapeptinas naturais, R3 é Dab, DDab ou DSer. Exemplos de numerosos derivados sintéticos conhecidos que têm actividade antibacteriana incluem aqueles em que R3 é Lys, ou ácido 2-amino-4-quanidino butirico.

Num derivado, de acordo com a presente invenção, R3 é seleccionado do grupo consistindo de Thr, DThr, Ser, DSer, DAla, Dab e Abu.

Um perito na técnica pode facilmente reconhecer residuos equivalentes destes residuos preferidos Rl, R2 e R3, e pode seleccioná-los de um grupo consistindo de, por exemplo, uma ligação covalente, alanina, ácido 2-aminoadípico, ácido α-η-butírico, N-(4-aminobutil)glicina, ácido α-aminobutírico, ácido γ-aminobutírico, ácido a-ami-nocapróico, aminociclopropanocarboxilato, ácido aminoisobu-tírico, aminonorbornilcarboxilato, ácido a-amino-n-valérico, arginina, Νω-metilarginina, asparagina, a-metilaspartato, ácido aspártico, N-benziglicina, N-(2-carbamiletil)glicina, N-(carbamiletil)glicina, 1-carboxi-l-(2,2-difeniletilamino)ciclopropano, cisterna, ácido Na-metildiamino-n-butirico, ácido Νγ-formildiamino-n-butirico, ácido Νγ-metil-diamino-n-butirico, N-(N-2,2-difeniletil)-carbamilmetil-glicina, N-(N-3,3-difenilpropil)carbamilme-til(1)glicina, N-(3,3-difenilpropil)glicina, ácido glutâ-mico, glicina, t-butilglicina, ácido 2-amino-4-guanidino-butírico, N-(3-guanidinopropil)glicina, histidina, homofe-nilalanina, isodesmosina, isoleucina, leucina, norleucina, hidroxilisina, Na-metilisina, lisina, Na-metil-hidroxilisi- na, Να-metilisina, Νε-acetil-hidroxilisina, Νε-acetil-lisi-na, N6-f ormil-hidroxilisina, N6-f ormilisina, N8-metil-hidro-xilisina, Ne-metilisina, metionina, a-metil-y-aminobu-tirato, a-metil-aminoisobutirato, a-metilciclo-hexilalani-na, α-naftilalanina, norleucina, norvalina, a-metilor-nitina, Na-metilornitina, Νδ-formil-ornitina, Νδ-metilorni-tina, ornitina, penicilamina, fenilalanina, hidroxiprolina, prolina, ácido Na-metildiamino-n-propiónico, ácido Np-ace-tildiamino-n-propiónico, ácido Np-formildiamino-n-propió-nico, ácido Np-metildiamino-n-propiónico, fosfoserina, se-rina, fosfotreonina, treonina, triptofano, tirosina, norvalina, e valina.

Em polimixinas e octapeptinas naturais, R4 é Dab. Exemplos de derivados sintéticos que têm actividade antibacteriana incluem aqueles em que R4 é Lys.

Num derivado de acordo com a presente invenção R4 é Dab.

Em polimixinas e octapeptinas naturais, R5, R8 e R9 são Dab. Exemplos de derivados sintéticos que têm actividade antibacteriana incluem aqueles em que R5, R8, e R9 podem ser Lys ou ácido 2-amino-4-guanidino butirico.

Num derivado de acordo com a presente invenção R5, R8 e R9 são cada um Dab ou Abu.

Um perito na técnica, pode facilmente reconhecer resíduos equivalentes destes resíduos preferidos e pode seleccionar cada um de um grupo consistindo de, por exemplo, ácido diaminobutírico, ácido diaminopropiónico, lisina, hidroxilisina, ornitina, ácido 2-amino-4-guanidino butírico, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, D-fenilalanina, metionina, treonina, serina, ácido α-amino-n-butírico, ácido α-amino-n-valérico, ácido α-amino-capróico, N6-f ormil-lisina, N8-acetilisina, N8-me-tilisina, Νε-formil-hidroxilisina, N6-acetil-hidroxilisina, Νε-metil-hidroxilisina, L-N6-metil-hidroxilisina, ácido Ny-metildiamino-n-butírico, ácido Np-formildiamino-n-propió-nico, ácido D-Np-formildiamino-n-propiónico, ácido Np-acetildiamino-n-propiónico, ácido Np-metildiamino-n-propi-ónico, Νδ-acetildiamino-n-propiónico, ácido Νδ-metildiamo-ino-n-propiónico, Νδ-formilornitina, Νδ-acetilornitina e Νδ-metilornitina.

Em polimixinas e octapeptinas naturais, R6 é DPhe ou DLeu e R7 é Leu, Ile, Phe ou Thr. Derivados sintéticos que têm actividade antibacteriana incluem aqueles em que R6 é DTrp e em que R7 é Ala.

Num derivado de acordo com a presente invenção, R6 é DPhe ou DLeu e R7 é Leu ou Ile; ou Thr.

Um perito na técnica pode facilmente reconhecer resíduos equivalentes destes resíduos hidrofóbicos preferidos e pode seleccioná-los de um grupo consistindo em, por exemplo, fenilalanina, ácido a-amino-n-butírico, triptofano, leucina, metionina, valina, norvalina, isoleu-cina e tirosina. Um perito na técnica pode também reconhecer que o residuo equivalente da treonina é a serina.

Em polimixinas e octapeptinas naturais, RIO é Thr e Leu. Exemplos de derivados conhecidos que têm actividade antibacteriana incluem aqueles em que RIO é O-acetil-Thr, O-propionil-Thr ou O-butiril-Thr.

Num derivado de acordo com a presente invenção, RIO é Thr ou Leu.

Um perito na técnica, pode também reconhecer que o resíduo equivalente da treonina é a serina.

Mais especificamente, os resíduos preferidos são escolhidos de tal forma que R8 e R9 não são ambos formilados quando R(FA)-R1-R2-R3 constitui a cadeia lateral da polimixina B nativa; e quando R(FA) está directamente liqado a R4, então R(FA) é decanoílo.

As posições específicas das, no máximo, três (3) cargas positivas referidas acima podem ser localizadas na porção do anel de heptapéptido e/ou na cadeia lateral, se presente. Quando as três (3) cargas positivas estão presentes nos derivados, de acordo com a invenção, as referidas três (3) cargas positivas podem ser localizadas na porção do anel de heptapéptido; ou as duas (2) cargas positivas podem ser localizadas na porção do anel de heptapéptido enquanto que a carga positiva remanescente está localizada na cadeia lateral; ou uma (1) carga positiva pode ser localizada na porção do anel de heptapéptido enquanto que as restantes duas (2) cargas positivas são localizadas na cadeia lateral. Preferencialmente, pelo menos duas (2) cargas positivas são localizadas na porção do anel de heptapéptido.

Numa forma de realização, os derivados, de acordo com a presente invenção, podem ser seleccionados do grupo de derivados em que R1-R10 é seleccionado a partir do grupo que consiste em Thr-DSer-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-], isto é, SEQ ID No. 10; Thr-DThr-cy[Dab-Dab-DPhe-Thr-Dab-Dab-Thr-], isto é, SEQ ID No. 11; Thr-DSer-cy[Dab-Dab-DPhe-Dab-Dab-Thr-] , isto é, SEQ ID No. 12; Thr-Abu-cy [Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-] , isto é, SEQ ID No. 13; Abu-Thr-Abu-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-], isto é, SEQ ID No. 14; Thr-Dab-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Abu-Dab-Thr-], isto é, SEQ ID No. 15; Thr-Abu-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Leu], isto é, SEQ ID No. 16; Thr-DAla-cy[Dab-Dab-DPhe-Thr-Dab-Dab-Thr-], isto é, SEQ ID No. 17; Thr-Dab-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Abu-Thr-], isto é, SEQ ID No. 18; Thr-Abu-c[Dab-Dab-DLeu-Leu-Dab- Dab-Thr-], isto é, SEQ ID No. 19; Dala-Dala-cy [Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-], isto é, SEQ ID No. 20; e Thr-Dab-cy[Dab-Abu-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-], isto é, SEQ ID No. 22.

Noutras formas de realização, os derivados de acordo com a presente invenção podem ser seleccionados a partir do grupo que consiste em: OA-Thr-DSer-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-], isto é, OA-SEQ ID No. 10; DA-Thr-DSer-cy[Dab-Dab- DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-] , isto é, DA-SEQ ID No. 10; OA-Thr-DThr-cy[Dab-Dab-DPhe-Thr-Dab-Dab-Thr-] , isto é, OA-SEQ ID No. 11; OA-Thr-DSer-cy[Dab-Dab-DPhe-Thr-Dab-Dab-Thr-], isto é, OA-SEQ ID No. 12; DA-Thr-Abu-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-], isto é, DA-SEQ ID No. 13; OA-Thr-Abu-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-] , isto é, OA-SEQ ID NO. 13; MHA-Thr-Abu-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-], isto é, MHA-SEQ ID No. 13; MHA-Abu-Thr-Abu-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr- ] , isto é, MHA-SEQ ID No. 14; OA-Thr-Dab-cy [Dab-Dab-DPhe-Leu-Abu-Dab-Thr-], isto é, OA-SEQ ID No. 15; OA-Thr-Abu-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Leu], isto é, OA-SEQ ID No. 16; OA-Thr-DAla-cy[Dab-Dab-DPhe-Thr-Dab-Dab-Thr-], isto é, OA-SEQ ID No. 17; OA-Thr-Dab-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Abu-Thr-], isto é, OA-SEQ ID No. 18; OA-Thr-Abu-cy [Dab-Dab-DLeu-Leu-Dab-Dab-Thr-], isto é, OA-SEQ ID No. 19; OA-DAla-DAla-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-], isto é, OA-SEQ ID No. 20; OA-Thr-Dab-cy[Dab-Abu-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-], isto é, OA-SEQ ID No. 22.

Preferencialmente, os derivados de acordo com a presente invenção são seleccionados a partir do grupo que consiste em: OA-Thr-DSer-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-], isto é, OA-SEQ ID No. 10; DA-Thr-DSer-cy-[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr- ] ; isto é, DA-SEQ ID No. 10; OA-Thr-DThr-cy [Dab-Dab-DPhe-Thr-Dab-Dab-Thr-] , isto é, OA-SEQ ID No. 11; OA-Thr-DSer-cy [Dab-Dab-DPhe-Thr-Dab-Dab-Thr-], isto é, OA-SEQ ID No. 12; DA-Thr-Abu-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-

Thr-], isto é, DA-SEQ ID No. 13; OA-Thr-Abu-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-] , isto é, OA-SEQ ID No. 13; MHA-Thr-Abu-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr-] , isto é, MHA-SEQ ID No. 13; MHA-Abu-Thr-Abu-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Thr-], isto é, MHA-SEQ ID No. 14; OA-Thr-Dab-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Abu-Dab-Thr-], isto é, OA-SEQ ID No. 15; OA-Thr-Abu-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Leu], isto é, OA-SEQ ID No. 16; OA-Thr-DAla-cy[Dab-Dab-DPhe-Thr-Dab-Dab-Thr-], isto é, OA-SEQ ID No. 17; OA-Thr-Dab-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Abu-Thr-] , isto é, OA-SEQ ID No. 18; OA-Thr-Abu-cy[Dab-Dab-DLeu-Leu-Dab-Dab-Thr-], isto é, OA-SEQ ID No. 19; e OA-Dala-cy[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr- ] , isto é, OA-SEQ ID No. 20.

Como aqui mostrado na secção dos exemplos, os compostos de acordo com a presente invenção apresentando apenas três (3) cargas positivas podem ser agentes muito potentes para inibir o crescimento de bactérias Gram-nega-tivas ou para as sensibilizar para os agentes antibac-terianos, e mesmo derivados que apresentem apenas duas (2) cargas positivas podem ter o mesmo efeito, embora a um nivel mais moderado.

Para a actividade antibacteriana directa, pelo menos duas (2) e mais preferencialmente três (3) cargas positivas estão localizadas na porção do anel heptapéptido, e para a actividade de sensibilização pelo menos uma (1) e mais preferencialmente duas (2) , ou três (3) cargas positivas estão localizadas na parte de anel heptapeptidico. Além disso, a presença de dois grupos hidroxilo na parte da cadeia lateral aumenta significativamente a actividade antibacteriana directa.

Os trabalhos de Teuber (1970), Srinivasa e

Ramachandran (1980a), e Sakura et al. (2004) descrevem, entre outros, derivados de polimixina, derivados tendo apenas duas (2) ou três (3) cargas positivas. No entanto, a actividade antibacteriana dos derivados divulgados é muito fraca e clinicamente irrelevante (Sakura et al., 1980), atribuida aos residuos de aminoácidos, em plena contradição com as conclusões da presente invenção, (Srinivasa e

Ramachandran 1980a) ou atribuida a resíduos de aminoácidos não específicos, devido à purificação incompleta (Teuber 1970). Além disso, nenhum dos trabalhos acima citados descreve, sugere ou motiva o estudo da possibilidade de tais derivados em sensibilizar as bactérias Gram-negativas aos agentes antibacterianos. Como os exemplos da presente invenção mostram com clareza, não se pode prever a capacidade de um derivado de polimixina para sensibilizar as bactérias Gram-negativas aos agentes antibacterianos no pressuposto da sua capacidade para inibir o crescimento das mesmas. Por exemplo, enquanto uma concentração clinicamente irrelevante do heptapéptido do octanoílo de polimixina B tão elevada como 128 pg/mL é necessária para inibir o crescimento de E. coli (Sakura et al. 2004), uma quantidade tão baixa quanto 4 pg é suficiente para uma sensibilização moderada da bactéria à rifampicina, como aqui mostrado na secção de exemplos.

Os derivados acetilados de polimixina descritos por Teuber (1970) são misturas de diferentes derivados acetilados. O anidrido acético pode reagir com qualquer um dos cinco grupos amina livres da molécula de polimixina B, para produzir uma polimixina monoacetilada. Assim, uma polimixina monoacetilada, de acordo com Teuber, é uma mistura de cinco derivados de polimixina monoacetilada, cada uma acetilada num grupo amina diferente. Uma polimixina diacetilada, de acordo com Teuber, é uma mistura de dez derivados diacetilados diferentes e polimixinas triacetiladas é também uma mistura de dez derivados triacetilados diferentes. Teuber não tentou isolar estes derivados a partir das misturas. O problema com tais polimixinas modificadas é que a modificação parcial pode resultar numa especificidade reduzida. Portanto, alguns dos grupos amina que são importantes para a actividade antibacteriana são parcialmente substituídos (e, portanto, inactivados), enquanto que alguns dos grupos amina não importantes permanecem parcialmente não substituídos. Além disso, o grau de substituição pode levar a variações lote a lote.

Os derivados de polimixina, de acordo com a presente invenção, por outro lado, são isolados e compostos claramente e estruturalmente definidos e identificados.

Srinivasa e Ramachandran (1980a) propuseram que os grupos amina livres da cadeia lateral de triformil-polimixina B nos resíduos RI e R3, assim como, os grupos amina livres de diformilpolimixina B nos resíduos Rl, R3 e R5 são essenciais, enquanto os grupos amina livres em R8 e R9 não são essenciais para a inibição do crescimento de Pseudomonas aeruginosa. Em contraste com as suas conclusões, os compostos na presente invenção incluem aqueles que não possuem os grupos amina livres em Rl e R3, mas que os apresentam em R5, R8 e R9, e são ainda potentes agentes contra Ps. aeruginosa, bem como outras bactérias Gram-negativas.

Um derivado de heptapéptido do octanoílo de polimixina B encurtado foi divulgado por Sakura et al. (2004). A ligação do resíduo de octanoílo à extremidade N do resíduo R4 do heptapéptido da polimixina B resulta num composto que tem apenas três (3) cargas positivas. Sakura et al. descobriram que o heptapéptido do octanoílo de polimixina B inibe o crescimento de bactérias apenas a uma concentração muito elevada (e clinicamente irrelevante) (128 pg/mL), ao passo que os outros derivados, tais como, o octapéptido do octanoílo de polimixina B e o nonapéptido do octanoílo de polimixina B, tendo ambos quatro cargas (4) são agentes muito potentes para inibir o crescimento bacteriano. Sakura et al. não descrevem ou sugerem a capacidade do heptapéptido do octanoílo de polimixina B para sensibilizar as bactérias a agentes antibacterianos, nem ensinam que uma cauda de ácido gordo mais longa aumenta a sua actividade antibacteriana, tal como aqui mostrado na secção de exemplos. A presente invenção fornece, num aspecto, novos derivados de polimixina com apenas duas (2) ou três (3) cargas positivas, que são ainda capazes de inibir o crescimento de uma ou mais espécies de bactérias Gram-nega-tivas e ou sensibilizar uma ou mais espécies bacterianas Gram-negativas a um antibiótico ou agente antibacteriano. A susceptibilidade das bactérias a um agente antibacteriano pode ser determinada por dois métodos microbiológicos. Um processo rápido, mas grosseiro utiliza discos de papel de filtro disponíveis comercialmente que foram impregnados com uma quantidade especifica do agente antibacteriano. Estes discos são colocados sobre a superfície de placas de agar que foram inoculadas com uma suspensão do organismo a ser testado, e as placas foram observadas para as zonas de inibição do crescimento. Uma técnica mais precisa, o teste de susceptibilidade por diluição do caldo, envolve a preparação de tubos de ensaio contendo diluições sequenciais do fármaco no meio líquido de cultura, inoculando, em seguida, o organismo a ser testado para os tubos. A concentração mais baixa de fármaco que inibe o crescimento das bactérias, após um período adequado de incubação, é apresentada como a concentração inibitória mínima (MIC).

Os derivados, de acordo com a presente invenção, podem inibir o crescimento de, ou sensibilizar para agentes antibacterianos clinicamente importantes, bactérias Gram-negativas, tais como aquelas que pertencem a um género das espécies Acinetobacter, Aeromonas, Alcaligenes, Bordetella, Branhamella, Campylobacter, Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Francisella, Fusobacterium, Haemophilus, Helicobacter, Klebsiella, Legionella, Moraxella, Pasteurella, Plesiomonas, Pseudomonas, Salmonella, Serratia, Shigella e Yersinia. As bactérias podem ser, por exemplo, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, outras espécies de Enterobacter, Citrobacter freundii, Pseudomonas aeruginosa, outras espécies de Pseudomonas, Acinetobacter baumannii, bem como, muitas outras espécies de bactérias Gram-negativas não fermentativas. As bactérias também incluem Helicobacter pylori, assim como, outras bactérias Gram-negativas clinicamente importantes.

As infecções bacterianas a ser tratadas incluem, por exemplo, a bacteremia, septicemia, infecção da pele e dos tecidos moles, pneumonia, meningite, infecções na região pélvica peritoneal, infecção por corpos estranhos, febre em pacientes hematológicos, infecção associada a uma linha intravenosa ou outro cateter, cânula e/ou dispositivo, infecção no tracto gastrointestinal, no olho, ou no ouvido, infecções superficiais da pele, e colonização do tracto gastrointestinal, membranas mucosas e/ou pele por bactérias potencialmente nocivas.

As doenças infecciosas bacterianas incluem (mas não estão limitadas a) infecções hospitalares graves, infecções dos pacientes imunocomprometidos, infecções dos pacientes após transplante de órgãos, infecções nas unidades de cuidados intensivos (UCI), infecções graves de queimaduras, infecções adquiridas na comunidade, infecções de pacientes com fibrose quística, bem como, infecções provocadas por bactérias Gram-negativas multirresistentes. A presente invenção é também dirigida a combinações de dois ou mais derivados de acordo com a presente invenção para um tratamento de combinação. As combinações podem incluir derivados com diferentes espectros de actividade antibacteriana ou uma capacidade de sensibilizar as diferentes espécies ou estirpes de bactérias Gram-negativas aos agentes antibacterianos.

Outro aspecto da presente invenção é dirigido a composições farmacêuticas compreendendo derivados de poli-mixina de acordo com a presente invenção, as suas formas de sal, combinações seleccionadas dos mesmos, e, opcionalmente, um agente antibacteriano formulado em conjunto com um ou mais veículos e excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Eles facilitam o processamento dos compostos activos em preparações que podem ser utilizadas farma-ceuticamente e incluem, por exemplo, agentes diluentes, de enchimento, tamponizantes, espessantes, molhantes, disper-santes, solubilizantes, de suspensão, emulsionantes, ligan-tes, estabilizantes, desintegrantes, de encapsulamento, de revestimento, de incorporação, lubrificantes, corantes, e agentes aromatizantes, bem como absorventes, intensifi-cadores de absorção, humectantes, conservantes, bem conhecidos de um perito na técnica.

As composições farmacêuticas incluem composições em que os ingredientes activos estão contidos numa quantidade eficaz para atingir o objectivo pretendido. Mais especificamente, uma quantidade terapeuticamente eficaz significa uma quantidade de composto eficaz para tratar, prevenir, aliviar ou melhorar os sintomas da patologia ou prolongar a sobrevivência do indivíduo a ser tratado com um benefício razoável em relação risco aplicável a qualquer tratamento médico. A determinação de uma quantidade terapeuticamente eficaz é bem conhecida dos peritos na técnica da medicina.

As composições podem ser produzidas por processos bem conhecidos na arte, por exemplo, por meio de processos convencionais de mistura, dissolução, encapsulação, aprisionamento, liofilização, emulsificação e granulação. A formulação adequada é dependente da via de administração escolhida, e a composição farmacêutica pode ser formulada para libertação imediata ou para libertação lenta (por exemplo, a fim de prolongar o efeito terapêutico e/ou melhorar a tolerabilidade). Além disso, as formulações podem ser convenientemente apresentadas em forma de dosagem única por modos conhecidos na técnica farmacêutica.

As composições farmacêuticas, de acordo com a presente invenção, incluem (mas não estão limitadas a) aquelas destinadas a administração intravenosa, intramuscular, oral, ou tópica, assim como aquelas que são administradas como um supositório, ou como um aerossol inalável. As composições incluem as vias intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, subcutânea, intramedular, intratecal, intraventricular, intranasal, ou injecções intra-oculares, aerossóis inaláveis, bem como aqueles destinados para administração rectal, oral, intra-vaginal, transmucosal ou transdérmica.

Para a administração parentérica (por exemplo, por injecção bolus, infusões de funcionamento rápido, ou infusões lentas) , os compostos de acordo com a presente invenção bem como as combinações descritas acima podem ser formuladas como as suas formas de sal ou de éster adequadas em soluções aquosas estéreis, de preferência fluidos fisiologicamente compatíveis, tal como, soro fisiológico, dextrose a 5%, solução de Ringer, e solução de Hank. A formulação pode também incluir solventes orgânicos, tais como, propileno glicol, polietileno glicol, propileno glicol ou compostos relacionados, bem como agentes conservantes e surfactantes.

Os sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis podem ser preparados a partir de ácidos inorgânicos e orgânicos. Os sais derivados de ácidos inorgânicos incluem ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, e ácido fosfórico. Os sais derivados de ácidos orgânicos incluem ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido málico, ácido malónico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido citrico, ácido benzóico, ácido cinâmico, ácido mandélico, ácido metanossulfónico, ácido etanossulfónico, ácido p-tolueno-sulfónico, e ácido salicílico.

Além disso, as composições farmacêuticas para administração parentérica podem ser suspensões ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos, e podem conter agentes de formulação tais como de suspensão, estabilizantes e/ou dispersantes. Os veículos e solventes lipofílicos adequados incluem óleos gordos, tais como, ésteres de ácidos gordos naturais e/ou sintéticos, tais como, oleato de etilo e triglicéridos, ou lipossomas. As suspensões podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão, tais como, carboximetil celulose de sódio, sorbitol ou dextrano.

As composições parentéricas podem ser apresentadas em recipientes selados de dose única ou de multidose, tais como, ampolas e frascos, e podem ser armazenados numa condição liofilizada (liofilizado) requerendo apenas a adição do excipiente líquido estéril, por exemplo, água, para injecções, imediatamente antes da utilização.

Para a administração oral, as preparações na forma sólida incluem por exemplo, pós, comprimidos, pílulas, drageias, trociscos, cápsulas, hóstias e preparações microgranulares. As preparações farmacêuticas podem ser preparadas utilizando um excipiente sólido, opcionalmente moendo a mistura resultante, e processando a mistura de grânulos, após adição de auxiliares adequados, se desejado, para obter comprimidos ou núcleos de drageias. Um veiculo/excipiente sólido pode ser uma ou mais substâncias que podem também actuar como diluentes, solubilizantes, lubrificantes, agentes de suspensão, ligantes, conservantes, agentes aromatizantes, agentes molhantes, agentes de desintegração de comprimidos, ou um material enca-psulante. Os veículos apropriados incluem, mas não estão limitados a, carbonato de magnésio, estearato de magnésio, talco, dextrose, lactose, pectina, amido, gelatina, tragacanto, metilcelulose, carboximetilcelulose de sódio, uma cera de baixo ponto de fusão, e manteiga de cacau.

As preparações líquidas adequadas para administração oral incluem, por exemplo, soluções aquosas, xaropes, elixires, suspensões aquosas, emulsões e géis. As soluções aquosas podem ser preparadas dissolvendo o componente activo em água e adicionando agentes estabilizantes e espessantes adequados, bem como, corantes e aromatizantes. As suspensões aquosas podem ser preparadas por dispersão do componente activo finamente dividido em água com material viscoso, tal como, gomas naturais ou sintéticas, resinas, metilcelulose, carboximetilcelulose de sódio, e outros agentes de suspensão bem conhecidos. As emulsões podem ser preparadas em soluções, em soluções aquosas de propileno glicol ou podem conter agentes emulsionantes, tais como, lecitina, mono-oleato de sorbitano ou acácia.

Os compostos, de acordo com a invenção, ou com- binações descritas acima, também podem ser formulados para administração tópica. Os compostos activos são adicionados sob condições estéreis com veículos/excipientes farmaceuti-camente aceitáveis, incluindo quaisquer agentes tampo-nizantes necessários e conservantes. Os unguentos, cremes e loções podem, por exemplo, ser formulados com uma base aquosa ou oleosa com a adição de agentes emulsionantes adequados, dispersantes, de suspensão, espessantes, esta-bilizantes, ou corantes. Os excipientes vulgarmente utilizados incluem gorduras e óleos animais e vegetais, ceras, parafinas, amido, derivados de celulose, tragacanto, e polietileno glicol.

Outras formulações tópicas incluem, mas não estão limitadas a, gotas para os ouvidos, gotas oculares e pensos transdérmicos.

Para a administração transdérmica, bem como administração transmucosal, os penetrantes geralmente conhecidos na técnica podem ser utilizados na formulação.

Para a administração por inalação, os compostos, de acordo com esta invenção, e as combinações descritas acima são apresentadas sob a forma de uma apresentação de spray em aerossol a partir de um ventilador, embalagem pressurizada ou um nebulizador com a utilização de um propulsor adequado, por exemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano ou dióxido de carbono. No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada proporcionando uma válvula para administrar uma quantidade medida. As cápsulas e os cartuchos de, por exemplo, gelatina para utilização num inalador ou insuflador podem ser formulados contendo uma mistura em pó do composto e uma base em pó adequada, tal como, lactose ou amido.

Os compostos, de acordo com esta invenção, e as combinações descritas acima podem também ser formulados em composições rectais, tais como, supositórios ou enemas de retenção, utilizando bases de supositório convencionais, tais como, manteiga de cacau, outros glicéridos, polietileno glicol, ou uma cera de supositório. A presente invenção também se refere a um método para a utilização dos presentes derivados de polimixina ou uma combinação de tais derivados como parte do tratamento clinico de (ou um regime profiláctico preventivo para) indivíduos humanos ou animais que sofrem de uma doença infecciosa, e compreende a administração ao referido indivíduo de uma dose terapeuticamente eficaz de, pelo menos, um derivado de acordo com a presente invenção, opcionalmente em combinação com um agente antibacteriano. A presente invenção também se relaciona com um método de sensibilização de bactérias Gram-negativas a um agente antibacteriano, em que o derivado, de acordo com a presente invenção, é administrado em simultâneo, ou sequencialmente por qualquer ordem, com uma quantidade terapeuticamente eficaz do referido agente antibacteriano. 0 derivado da presente invenção e o agente antibacteriano podem ser administrados em conjunto, como uma formulação, ou por vias diferentes. Por exemplo, o derivado de polimixina pode ser administrado por via intravenosa, enquanto que o agente antibacteriano é administrado por via intramuscular, por via intravenosa, subcutaneamente, por via oral ou por via intraperitoneal. Alternativamente, o derivado pode ser administrado por via intramuscular ou por via intraperitoneal, enquanto o agente antibacteriano é administrado por via intravenosa, por via intramuscular ou por via intraperitoneal, ou o derivado pode ser administrado numa forma de aerossol ou nebulizado, enquanto o agente antibacteriano é administrado, por exemplo, por via intravenosa. 0 derivado e os agentes antibacterianos podem ser administrados simultaneamente ou sequencialmente, desde que sejam fornecidos de uma forma suficiente para permitir atingir concentrações eficazes no local da infecção. "Eficácia terapêutica" baseia-se num resultado clinico bem sucedido, e não exige que um derivado de acordo com a presente invenção, opcionalmente em combinação com um agente antibacteriano, mate 100% das bactérias envolvidas numa infecção. Um tratamento bem sucedido depende na obtenção de um nivel de actividade antibacteriana no local da infecção, suficiente para inibir as bactérias de uma maneira equilibrada a favor do hospedeiro. Quando as defesas do hospedeiro são maximamente eficazes, o efeito antibacteriano necessário pode ser modesto. Reduzindo a carga do organismo, mesmo por um log (um factor de 10) pode permitir que as próprias defesas do hospedeiro controlem a infecção. Além disso, aumentando um efeito precoce bactericida/bacteriostático pode ser mais importante do que o efeito bactericida/bacteriostático a longo prazo. Estes eventos precoces são uma parte significativa e critica do sucesso terapêutico, porque permitem dar tempo para que os mecanismos de defesa do hospedeiro sejam activados. 0 aumento da taxa bactericida pode ser particularmente importante para infecções, tais como, a meningite, infecções ósseas ou articulares. A eficácia terapêutica de um agente antibacteriano depende da susceptibilidade das espécies bacte-rianas para o referido agente antibacteriano na concentração clinicamente relevante do derivado, de acordo com a presente invenção. O efeito dos compostos, de acordo com a presente invenção, para melhorar a eficácia terapêutica de agentes antibacterianos in vivo pode ser demonstrado em modelos animais in vivo, tais como, ensaios de peritonite em rato ou de bacteremia em coelho, e pode ser previsto com base numa variedade de ensaios in vitro, incluindo (1) determinações da concentração inibidora minima (MIC) de um agente antibacteriano necessária para inibir o crescimento de uma bactéria Gram-negativa durante 24 horas, (2) determinações do efeito de um agente antibacteriano na cinética da curva de crescimento de uma bactéria Gram-negativa, e (3) testes do tipo "checkerboard" da MIC de diluições em série do agente antibacteriano isolado, ou em combinação com diluições em série dos composto (s). Exemplos de modelos ou testes são bem conhecidos na técnica.

Usando determinações in vitro da MIC às 24 horas, pode-se demonstrar que um derivado de acordo com a presente invenção reduz a MIC do agente antibacteriano. Com este resultado, espera-se que a administração concomitante do composto in vivo aumente a sensibilidade de uma bactéria Gram-negativa ao agente antibacteriano. Pode também ser demonstrado que um composto de acordo com a presente invenção pode reduzir a MIC de um agente antibacteriano a partir do intervalo em que o organismo é considerado clinicamente resistente a um intervalo em que o organismo é considerado clinicamente sensível. Com este resultado, espera-se que a administração concomitante in vivo do ou de mais composto(s), de acordo com a presente invenção, com o agente antibacteriano irá reverter a resistência e converter eficazmente o organismo resistente aos antibióticos num organismo sensível aos antibióticos.

Ao medir o efeito de agentes antibacterianos nas curvas de crescimento in vitro de bactérias Gram-negativas, na presença ou ausência de um composto, de acordo com a presente invenção, pode demonstrar-se que o composto pode aumentar o efeito antibacteriano precoce dos agentes antibacterianos num período de preferencialmente menos de 24 horas. 0 aumento dos efeitos inibitórios iniciais bactericida/crescimento é importante na determinação do resultado terapêutico.

Um derivado de polimixina, de acordo com a presente invenção, e um agente antibacteriano podem também ter efeitos sinérgicos ou potenciadores superiores aos efeitos individuais de cada agente em si, só, ou aos efeitos aditivos dos agentes em conjunto. Num ensaio do tipo "checkerboard", a combinação de um composto, de acordo com a presente invenção, com agentes antibacterianos pode resultar num indice "sinérgico" de concentração inibitória fraccional (FIC) . 0 método de ensaio do tipo "checkerboard" baseia-se num hipótese aditiva, que assume que o resultado observado com múltiplos fármacos é a soma dos efeitos independentes dos fármacos a serem testados; de acordo com este sistema uma FIC de menos do que 0,5 é pontuada como sinergia, 1 é pontuada como aditiva, e superior a 1 mas inferior a 2 é pontuada como indiferente.

Os agentes antibacterianos adequados para utilização em combinação com os derivados de acordo com a presente invenção, incluem, por exemplo, macrólidos, tais como, claritromicina, azitromicina, e eritromicina, cetó-lidos, lincosaminas, tais como, clindamicina, estreptogra-minas, rifamicinas, tais como, a rifampicina, rifabutina e rifalazil, ácido fusidico, mupirocina, oxazolidinonas, antibióticos glicopéptidos, tais como, vancomicina, dalbavancina, telavancina e oritavancina, fluoroquinolonas, derivados de tetraciclina, derivados de penicilinas hidrofóbicos, cefalosporinas, monobactamos, carbapenemes, penemes e outros antibióticos betalactâmicos, novobiocina, pleuromutilinas, inibidores da síntese de folato, inibidores de deformilase, e inibidores de bombas de efluxo bacterianas. Um perito na técnica de tratamento em infecções por Gram-negativas pode facilmente reconhecer agentes antibacterianos adicionais clinicamente relevantes que podem ser úteis. De preferência, os referidos agentes antibacterianos são seleccionados a partir de um grupo de agentes antibacterianos hidrofóbicos ou moderadamente hidrofóbicos contra os quais a membrana exterior das bactérias Gram-negativas actua como uma barreira de permeabilidade eficaz. A invenção também inclui a utilização dos presentes compostos ou combinações dos mesmos para sensibilizar bactérias clinicamente importantes aqui indicadas para o mecanismo complemento de defesa do hospedeiro (presente no soro fresco humano e de animal) por sujeitar as referidas bactérias à acção de tais compostos durante uma infecção clínica ou de uma suspeita de infecção. A defesa do hospedeiro pode ser exercida, por exemplo, através da acção combinada do complemento e de leucócitos polimorfonucleares.

Os peritos na técnica da medicina podem facilmente optimizar dosagens eficazes e regimes de administração para os compostos de acordo com a presente invenção, bem como para os antibióticos em administração simultânea, tendo em conta factores bem conhecidos na técnica, incluindo o tipo de indivíduo a ser administrada a dose, a idade, peso, sexo e condição médica do indivíduo, da via de administração, a função renal e hepática do indivíduo, o efeito desejado, o composto particular empregue, de acordo com a presente invenção, e a tolerância do indivíduo a ele. As dosagens de todos os agentes antimicrobianos devem ser ajustadas em doentes com insuficiência renal ou hepática, devido ao metabolismo reduzido e/ou excreção dos fármacos em pacientes com estas condições. As doses em crianças devem também ser reduzidas, geralmente de acordo com o peso corporal. A dose diária total de um derivado de acordo com a presente invenção administrada a um ser humano ou um animal pode variar, por exemplo, em quantidades de 0,1 a 100 mg por kg de peso corporal, preferencialmente 0,25 a 25 mg por kg de peso corporal.

Também será reconhecido por um perito na técnica que o curso óptimo do tratamento, isto é, o número de doses administradas por dia durante um número definido de dias, será determinado pela natureza e extensão da condição a ser tratada, a forma, a via e o local de administração, e o paciente particular a ser tratado, e que esses óptimos podem ser determinados por técnicas convencionais.

Também é proporcionado um método para o ensaio de um composto de acordo com a presente invenção, sendo o referido composto um derivado de uma polimixina ou octapeptina natural, em que o referido derivado tem apenas 2-3 cargas positivas, em contraste com o composto que ocorre naturalmente, a partir do qual é derivado, para a actividade antibacteriana contra uma bactéria Gram-negativa prejudicial e/ou para a capacidade de sensibilizar para agentes antibacterianos e/ou o complemento presente no soro, compreendendo o referido método o passo de contacto da bactéria com o referido derivado de uma polimixina ou octapeptina natural, e identificação de derivados possuindo actividade antibacteriana e/ou actividade de sensibilização para a referida bactéria.

Também é proporcionado um método para o rastreio de derivados de polimixina e octapeptina com ligação reduzida ao tecido renal ou seus constituintes em ou a partir de animais de teste ou de origem humana, medindo a sua capacidade reduzida para bloquear competitivamente a ligação de aminoglicósidos para o mesmo, ou bloquear a ligação de outras substâncias que se sabe ligarem ao mesmo.

Num aspecto adicional é proporcionado um método para o desenvolvimento de novos antibióticos que compreendem os passos de proporcionar um composto de polimixina ou octapeptina natural, ou um derivado do mesmo, com um total de 4 ou 5 cargas positivas, ou um total de 6 cargas positivas, como nas decacilpolimixinas, substituindo de 1 a 4 resíduos com uma ou mais cargas positivas, com um resíduo sem carga positiva, ou com uma ligação covalente, gerando assim um derivado de polimixina com 2 ou 3 cargas positivas, testando o referido composto derivado para a actividade antibacteriana contra as bactérias Gram-negativas e/ou para a capacidade de sensibilizar as bactérias Gram-negativas a um agente antibacteriano, e seleccionando compostos possuindo actividade antibacteriana contra bactérias Gram-negativas, ou a capacidade de sensibilizar as bactérias Gram-negativas a um agente antibacteriano.

Também é proporcionado, de acordo com a presente invenção, um derivado semi-sintético de polimixina obtido pelo tratamento químico ou enzimático de polimixinas ou octapeptinas que ocorrem naturalmente, respectivamente, ou as suas variantes, que são fabricadas por organismos geneticamente modificados. Os tratamentos químicos incluem, mas não estão limitados a, aqueles com anidrido acético, ácido fórmico, hidrazina, e ácido oxálico. Os tratamentos enzimáticos incluem, mas não estão limitados a, com enzimas, tais como, polimixina desacilase, ficina, papaína, bromelaina, subtilopeptidases, subtilisina, colistina hidrolase, e Nagarse.

Os compostos preferidos, de acordo com uma forma de realização, são menos catiónicos do que as polimixinas ou octapeptinas naturais, têm apenas duas (2) ou três (3) cargas positivas, e são: (a) capazes de inibir o crescimento de Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca,

Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii, Pseudomonas aeruginosa ou Acinetobacter baumannii e/ou de sensibilizar qualquer uma delas aos antibióticos, e/ou (b) menos tóxicos do que as polimixinas utilizadas clinicamente, como evidenciado no modelo animal in vivo, e/ou (c) menos nefrotóxicos do que as polimixinas clinicamente utilizadas, como evidenciado num modelo animal e/ou num teste in vitro que mede a afinidade dos compostos para estruturas nos rins, e/ou (d) capazes de causar menor libertação de histamina dos tecidos do que as polimixinas clinicamente utilizadas, quando administrados por via tópica ou por inalação na forma de aerossol, e/ou (e) farmacocineticamente mais favoráveis, tal como terem uma meia-vida mais longa no soro e/ou por serem menos inactivados pelo tecido polianiónico e constituintes do pus do que as polimixinas utilizadas clinicamente.

Os métodos para sintetizar compostos, de acordo com a presente invenção, incluem, mas não estão limitados ao que se segue descrito abaixo. Para um composto especifico a ser sintetizado, um perito na técnica é capaz de escolher o método apropriado. 1. Derivados semi-sintéticos de polimixinas e octapeptinas que têm parte de um heptapéptido inalterado e uma cadeia lateral de acilo-aminoacilo modificada podem ser preparados pelos procedimentos descritos como se segue: A protecção dos grupos amina livres no material de partida (polimixina ou octapeptina, ou suas variantes), por métodos conhecidos dos peritos na técnica. A protecção pode ser alcançada através da utilização de residuos, tais como, t-butoxicarbonilo (tBoc), fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc), benziloxicarbonilo (CBZ, Z) , aliloxicarbonilo (ALOC), 3-piridil-N-óxido-metoxicarbonilo (como descrito na publicação da patente GB 1323962), usando bases de Schiff, tais como, benzaldeido, pelo método descrito na publicação de patente japonesa 7115630/1971 ou semelhante, que podem ser removidos por condições convencionais, compatíveis com a natureza do produto.

Em condições onde a fraca solubilidade em água coloca ocasionalmente um problema nos passos subsequentes, a protecção pode ser feita por meio de grupos bloqueadores carregados negativamente, tais como, um derivado de ácido sulfónico de Fmoc, ou um derivado de ácido carboxílico de Fmoc, sendo o método descrito na publicação da patente US 2006004185. A solubilidade em água pode também ser melhorada através da ligação de um grupo bloqueador muito hidrofílico apropriado, removível, carregado negativamente, ao grupo OH de treonina.

Em seguida, o composto é submetido a um tratamento enzimático com enzimas, tais como, polimixina desa-cilase, polimixina hidrolase, papaína, ficina, bromelaina, subtilopeptidase, Nagarse ou outras enzimas que removem uma parte terminal da cadeia lateral ou mesmo toda a cadeia lateral de compostos de polimixina ou octapeptina. Este tratamento pode, opcionalmente, ser seguido pelo procedimento de degradação de Edman. 0 composto resultante é desprovido da totalidade da cadeia lateral e consiste apenas na parte do heptapéptido ciclico, mas tem um grupo amina alfa livre N-terminal.

Alternativamente, as polimixinas e octapeptinas que têm grupos amina protegidos por benziloxicarbonilo podem ser tratadas por ácido oxálico ou ácido fórmico para obter derivados deacilados protegidos, sendo o método descrito por Kurihara et al. (1974). 0 procedimento é seguido por tratamento adicional com enzima, como descrito acima e/ou por degradação de Edman, para se obter um heptapéptido.

Em seguida, um residuo adequado é ligado à posição amina alfa livre da porção do anel de heptapéptido. 0 residuo pode conter um residuo de acilo ou semelhante, bem como, opcionalmente, residuos de aminoácidos, preferencialmente, até três residuos. Por exemplo, um composto semi-sintético com um grupo acilo e dois residuos de aminoácidos podem ser preparados pela adição, ao composto acima descrito heptapéptido, de um residuo sintético de N-(acil)-treonil-Dtreonil. Isto pode ser conseguido por técnicas convencionais gerais conhecidas daqueles familiarizados com a técnica da química orgânica, incluindo estas técnicas a utilização de resíduos ligados a N-hidroxi-succinimida, tal como descrito em US 2006004185. Nesta síntese particular, o procedimento pode envolver a utilização de 2-N-(n-octanoil)-treonil-Dtreonil-N-hidro-xisuccinimida. 2. Nonapéptidos de polimixina acilados com três (3) grupos amina livres. A polimixina D possui apenas quatro (4) cargas positivas. Os grupos amina livres de polimixina D podem ser protegidos pelos meios descritos acima. Segue-se um tratamento enzimático e um passo opcional da degradação de Edman, para se obter um nona-péptido, que pode então ser acilado por acilisotiocianato (pelo método bem conhecido de uma pessoa perita na técnica e descrito no documento US 2006004185), por cloreto de acilo (pelo método bem conhecido de uma pessoa perita na técnica e descrito em Chihara et al. 1974), ou pela utilização de resíduos ligados a N-hidroxisuccinimida (através do método bem conhecido de uma pessoa perita na técnica e descrito em US 2006004185). Finalmente, os grupos protectores são removidos.

De um modo análogo, o nonapéptido de polimixina S acilado e o nonapéptido de polimixina F acilado podem ser preparados. Ambos têm apenas três (3) grupos amina livres. 3. Heptapéptidos de polimixina e octapeptina acilados. Os heptapéptidos podem ser preparados pelo tratamento com Nagarse dos compostos naturais, como descrito por Kimura et ai. 1992. Alternativamente, podem ser preparados por meio de tratamentos com outras enzimas, tais como, polimixina acilase, polimixina hidrolase, ficina, papaina, bromelaina, e subtilopeptidase, seguido de passos opcionais de degradação de Edman. Eles também podem ser preparados por desacilação dos compostos naturais por hidrazina ou ácidos, tais como, ácido fórmico e ácido oxálico, seguido por passos de degradação de Edman. 0 heptapéptido pode então ser acilado, por exemplo, usando a técnica de cloreto de acilo, bem conhecida de uma pessoa perita na técnica e descrito em Chihara et al. (1974). 0 heptapéptido de polimixina acilado apresenta apenas três (3) grupos amina livres. 4. Os derivados totalmente sintéticos de polimixina e octapeptina podem ser preparados pelos métodos convencionais bem conhecidos dos peritos na técnica. Tais métodos incluem os procedimentos de sintese em fase liquida, bem como os procedimentos de sintese em fase sólida, descritos por exemplo por Sakura et al. (2004), Tsubery et al. (2000a, 2000b, 2002, 2005), e Ofek et al. (2004) . Os métodos incluem, por exemplo, o uso de agentes protectores, tais como, Fmoc, tBoc, e CBZ em posições estratégicas, bem como o passo de ciclização em que DPPA (difenil fosforazidato) ou uma mistura de benzotrizol-l-il-oxi-tris-pirrolidino-fosfonium hexafluorofosfato (PyBop), N-hidroxibenzotriazole (HOBt), e N-metilmorfolina (NMM) são usados. Os muitos derivados de Fmoc não triviais, bem como, os aminoácidos-D estão comercialmente disponíveis. 5. Exemplos de reacções relacionadas com a conversão dos grupos amina livres para gerar compostos, de acordo com a presente invenção, com 2 ou 3 cargas positivas podem incluir (mas não se limitam a) às seguintes reacções: A) reacção de um grupo amina livre do composto com uma porção de conjugação compreendendo um grupo epóxido reactivo, gerando assim uma ligação β-hidroxi-amina; B) reacção do grupo amina livre do composto com uma porção de conjugação compreendendo um halogeneto de sulfonilo reactivo, gerando assim uma ligação de sulfonamida; C) reacção de um grupo amina livre do composto com uma porção de conjugação, compreendendo um ácido carboxilico reactivo, gerando assim uma ligação amina; D) reacção de um grupo amina livre do composto com uma porção de conjugação que compreende um grupo aldeído reactivo {sob condições redutoras), gerando assim uma ligação amina; E) reacção de um grupo amina livre do composto com uma porção de conjugação, compreendendo um grupo cetona reactivo (sob condições redutoras), gerando assim uma ligação amina; F) reacção do grupo amina livre do composto com uma porção de conjugação compreendendo um grupo isocianato reactivo, gerando assim uma ligação de ureia.

LISTA DE REFERÊNCIAS

Chihara S, Tobita T, Yahata M, Ito A, Koyama Y. 1973. Enzymatic degradation of colistin. Isolation and identification of α-Ν-Acyl a, γ-diaminobutyric acid and colistin nonapeptide. Agr Biol Chem 37: 2455-2463.

Chihara S, Ito A, Yahata M, Tobita T, Koyama Y. 1974. Chemical synthesis, isolation and characterization of α-Ν-fattyacyl colistin nonapeptide with special reference to the correlation between antimicrobial activity and carbon number of fattyacyl moiety. Agric Biol Chem 38: 521-529.

Kimura Y, Matsunaga H, Vaara M. 1992. Polymyxin B octapeptide and polymyxin B heptapeptide are potent outer membrane permeability-increasing agents. J Antibiot 45: 742-749.

Kurihara T, Takeda H, Ito H, Sato H, Shimizu M, Kurosawa A. 1974. Studies on the compounds related to colistin. IX. On the chemical deacylation of colistin and colistin derivatives. Yakugaku Zasshi 94: 1491-1494.

Nagai J, Saito M, Adachi Y, Yumoto R, Takano M. 2006. Inhibition of gentamicin binding to rat renal brush-border membrane by megalin ligands and basic peptides. J Control Release 112: 43-50.

Nikaido H. 2003. Molecular basis of bacterial outer membrane permeability revisited. Microbiol Molec Biol Rev 67: 593-656.

Nikaido H, Vaara Μ. 1985. Molecular basis of bacterial outer membrane permeability. Microbiol Rev 49: 1-32.

Rose F, Heuer KU, Sibelius U, Hombach-Klonisch S, Ladislau K, Seeger W, Grimminger F. 1999. Targeting lipopolysaccharides by the nontoxic polymyxin B nonapeptide sensitizes resistant E. coli to the bactericidal effect of human neutrophils. J Infect Dis 182: 191-199.

Sakura N, Itoh T, Uchida Y, Ohki K, Okimura K, Chiba K, Sato Y, Sawanishi H. 2004. The contribution of the N-terminal structure of polymyxin B peptides to antimicrobial and lipopolysaccharide binding activity. Bull Chem SocJpn 77: 1915-1924.

Srinivasa BD, Ramachandran LK. 1978. Chemical modification of peptide antibiotics: Part VI - Biological activity of derivatives of polymyxin B. Ind J Brochem Biophys 14: 54-58.

Srinivasa BD, Ramachandran LK. 1979. The polymyxins. J Scient Industr Res 38: 695-709.

Srinivasa BD, Ramachandran LK. 1980. Essential amino groups of polymyxin B. Ind J Brochem Biophys 17: 112-118.

Storm DR, Rosenthal KS, Swanson PE. 1977. Polymyxin and related peptide antibiotics. Annu Rev Biochem 46: 723-63.

Teuber M. 1970. Preparation of biologically active mono-N-acetyl(14C)-derivatives of the membrane-specific polypeptide antibiotic polymyxin B. Z Naturforsch 25b: 117.

Tsubery H, Ofek I, Cohen S, Fridkin M. 2000a. Structure-function studies of polymyxin B nonapeptide: Implications to sensitization of Gram-negative bacteria. J. Med Chem 43: 3085-3092.

Tsubery H, Ofek I, Cohen S, Fridkin M. 2000b. The functional association of polymyxin B with bacterial lipopolysaccharide is stereospecific: Studies on polymyxin B nonapeptide. Biochemistry 39: 11837-11844.

Tsubery H, Ofek I, Cohen S, Fridkin M. 2001. N-terminal modifications of polymyxin B nonapeptide and their effect on antibacterial activity. Peptides 22: 1675-1681.

Tsubery H, Ofek I, Cohen S, Eisenstein M, Fridkin M. 2002. Modulation of the hydrophobic domain of polymyxin B nonapeptide: effect on outer-membrane permeabilization and lipopolysaccharide neutralization. Molecular Pharmacology 62: 1036-42.

Tsubery H, Yaakov H, Cohen S, Giterman T, Matityahou A, Fridkin M, Ofek I. 2005. Neopeptide antibiotics that function as opsonins and mem-brane-permeabilizing agents for gram-negative bacteria. Antimicrob Agents Chemother 49: 3122-3128.

Vaara M. 1992. Agents that increase the permeability of the outer membrane. Microbiol Rev 56: 395-411.

Vaara M. 1993. Antibiotic-supersusceptible mutants of Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Antimicrob Agents Chemother 37: 2255-2260.

Vaara M, Vaara T. 1983a. Sensitization of Gramnegative bacteria to antibiotics and complement by a nontoxic oligopeptide. Nature (London) 303: 526-528.

Vaara M, Vaara T. 1983b. Polycations sensitize enteric bacteria to antibiotics. Antimicrob Agents Chemother 24: 107-113.

Vaara M, Vaara T. 1983c. Polycations as outer membrane-disorganizing agents. Antimicrob Agents Chemother 24: 114-122.

Vaara M, Viljanen P, Vaara T, Makela P. 1984. An outer membrane disorganizing peptide PMBN sensitizes E. coli strains to serum bactericidal action. J Immunol 132: 2582-2589.

Viljanen P, Matsunaga H, Kimura Y, Vaara M. 1991. The outer membrane permeability-increasing action of deacylpolymyxins. J Antibiotics 44: 517-523.

EXEMPLOS

Os exemplos seguintes ilustram certas formas de realização da presente invenção e não devem ser interpretados como limitando o âmbito da invenção.

Exemplo 1.

Sintese de péptidos

Os derivados de polimixina ("péptidos NAB" ou "compostos NAB") foram sintetizados por química de fase sólida convencional, usando a estratégia convencional de protecção Fmoc. 0 aminoácido na extremidade C encontra-se comercialmente disponível como pré-ligado à fase sólida e, quando clivado da resina com ácido, origina um ácido carboxílico na extremidade C. A estratégia para a protecção era usar três níveis de protecção ortogonal, protecção Fmoc temporária para as funções alfa amina, grupos que são removidos durante a fase de clivagem ácida e protecção semipermanente para cobrir funções de cadeia lateral reactivas, enquanto a reacção de ciclização ocorre. Após a clivagem do péptido da resina, faz-se reagir o ácido carboxílico C-terminal com uma função amina na cadeia lateral de um dos aminoácidos de modo a formar um péptido cíclico. Depois do passo de ciclização, os grupos de protecção semipermanentes são removidos para se obter o péptido NAB.

Deste modo, a função alfa amina do aminoácido foi protegida por fluorenil-metoxicarbonilo (Fmoc) e o Fmoc foi removido com piperidina a 20% em DMF em todos os ciclos. O aminoácido que está envolvido na ciclização, por exemplo, ácido diaminobutírico, foi protegido com t-butoxicarbonilo (tBoc), um grupo ácido lábil, que foi removido no passo de clivagem. Todos os outros aminoácidos que têm grupos funcionais na cadeia lateral foram protegidos por um grupo que é estável à fase de clivagem ácida, isto é, benziloxicarbonilo (Z). Os aminoácidos fenilalanina e leucina, naturalmente, não precisavam de protecção da cadeia lateral. A amina terminal não foi protegida; isso permitiu a reacção directa no processo de acilação.

As etapas de síntese foram efectuadas num sintetizador automático comercial que utilizou O-(6-clorobenzotriazol-l-il)-Ν,Ν,Ν',N',-tetrametilurónio (HCTU) como activador. O ácido 6-metail-heptanóico (6-MHA) foi da Ultra Scientific Inc, North Kingstown, RI, EUA (número do produto, FLBA 002) . Os outros ácidos gordos foram fornecidos a partir de um fornecedor convencional. A acilação foi realizada utilizando um excesso molar de quatro vezes de cada aminoácido ou do ácido gordo, um excesso molar de quatro vezes do activador HCTU (ver acima), e um excesso molar de oito vezes de N-metil morfolina. 0 tempo de reacção foi de 30 min.

Os aminoácidos foram adquiridos já protegidos a partir de um fornecedor convencional. O péptido foi removido da resina por meio de reacção com uma solução de ácido trifluoroacético a 95% e água a 5% durante 2 horas à temperatura ambiente, para se obter o produto parcialmente protegido. O péptido resultante foi precipitado com éter dietilico. A mistura de ciclização utilizada foi hexafluo-rofosfato de benzotriazol-l-il-oxi-tris-pirrolidino-fos-fónio (PyBop), N-hidroxibenzotriazole (HOBt), e N-metil-morfolina (NMM) ao excesso molar de 2, 2, e 4, respec-tivamente. O péptido foi dissolvido em dimetilformamida, a mistura de ciclização foi adicionada e deixada reagir durante 2 horas. O péptido protegido, ciclizado foi precipitado pela adição de éter dietilico frio. Qualquer PyBop residual foi removido por lavagem do péptido com água.

Os restantes grupos de protecção da cadeia lateral (Z) foram removidos por desidrogenação catalítica. O péptido foi dissolvido em água-metanol-ácido acético (5:4:1), sob uma atmosfera de hidrogénio e na presença de um catalisador de paládio com carvão. O péptido foi purificado por cromatografia de fase reversa, utilizando gradientes convencionais de acetonitrilo: água: ácido trifluoroacético. 0 produto foi seco por liofilização. 0 rendimento foi de 20-40 mg representando aprox. 20%-40% do teórico, calculado a partir da quantidade molar (aprox. 100 micromoles) do primeiro resíduo de amino acilo ligado à resina. A pureza, tal como estimada por HPLC em fase reversa foi superior a 95%. Para péptidos acilados, o produto de degradação de Edman não revelou qualquer resíduo de aminoácido, indicando que o grupo α-amina do resíduo do aminoácido N-terminal foi bloqueado, conforme o esperado, devido à N-acilação bem sucedida. Dentro do erro experimental, as massas obtidas foram aquelas esperadas a partir dos valores teóricos.

Exemplo 2.

Actividade antibacteriana directa dos compostos contra Escherichia coli

Os péptidos sintetizados no Exemplo 1, todos tendo, pelo menos, duas (2) , mas não mais de três (3) cargas positivas, foram estudados quanto à sua capacidade para inibir o crescimento de E. coli. Isto foi testado utilizando placas de agar LB (LB Agar Lennox, Difco, BD, Sparks, MD1 E.U.A) placas. O organismo indicador E. coli IH3080 (Kl:018) foi uma estirpe encapsulada originalmente isolada de um recém-nascido sofrendo de meningite (Vaara et al. 1984) e obtido do Instituto Nacional de Saúde Pública, Helsínquia, Finlândia.

Preparou-se uma suspensão de aprox. 108 células/mL, a partir de uma cultura crescida durante a noite de IH3080, cultivada em agar LB em 0,9% de NaCl. Aliquotas desta suspensão foram então pipetadas sobre as placas de agar e as placas foram suavemente agitadas para espalhar uniformemente a suspensão sobre a totalidade da superfície da placa. Depois disso, a parte não absorvida da suspensão foi removida utilizando uma pipeta de Pasteur. Após a secagem da superfície, foram perfurados pequenos poços (diâmetro, 2 mm) nas placas (cinco poços por placa) utilizando um tubo estreito de metal afiado estéril, ponta de pipeta descartável e sucção com vácuo. As amostras (4 pL e 10 pL) da solução de péptido em 0,9% de NaCl (em concentrações de 1 pg/mL e 0,1 pg/mL) foram então pipetadas para os poços e deixou-se a absorver os fluidos da amostra. Os controlos incluíram 0,9% de solução de NaCl sem o composto a ser testado. As placas foram então incubadas durante 18 h a 37°C, após o que os diâmetros das zonas de inibição de crescimento em torno de cada poço foram medidos; o diâmetro do próprio poço não foi reduzido. Finalmente, os diâmetros foram convertidos em áreas da superfície de inibição do crescimento (em mm quadrados). A Tabela 2 mostra a actividade antibacteriana dos derivados contra E. coli IH3080, em comparação com a uma quantidade igual de polimixina B, bem como de alguns derivados de polimixina não relacionados com a presente invenção. NAB734, NAB737, NAB739 e NAB740 foram os compostos com maior actividade antibacteriana e apresentaram ainda mais actividade antibacteriana do que a polimixina B contra E. coli IH3080. Um poço contendo 4 pg de NAB739 produziu uma área de inibição de crescimento tão ampla quanto 133 mm quadrados. Em todos estes quatro compostos NAB, a cadeia lateral consiste em dois resíduos de amino acilo que têm grupos hidroxilo.

Ao contrário de NAB739, NAB7061 não teve efeito antibacteriano a 4 pg. No entanto, apresentou uma actividade antibacteriana notável com 10 pg. Ο NAB7061 difere NAB739 apenas por ter Abu (em vez de DSer) em R3. Prolongando o comprimento da parte do acilo gordo de C8 em NAB7061 para CIO em NAB7062 resultou na actividade antibacteriana notavelmente melhorada manifestando-se a 4 pg. Além disso, três outros péptidos (NAB738, NAB716 e NAB719) apresentaram uma actividade antibacteriana notável, embora claramente mais fraca do que NAB739 e dos outros compostos com maior actividade antibacteriana.

Uma propriedade comum dos compostos directamente antibacterianos para E. coli foi a presença de três cargas positivas, das quais, todas as três ou, pelo menos, duas estavam localizadas em posições adequadas na parte cíclica. No último caso, as posições relativas das referidas cargas afectaram significativamente a potência da actividade antibacteriana contra E. coli.

Além disso, como mostrado na Tabela 2, também a estrutura e o comprimento da cadeia lateral tem influência significativa sobre a potência da actividade antibacte-riana. A presença de uma cadeia lateral contendo pelo menos dois resíduos de amino acilo parece ser importante para os compostos antibacterianos contra E. coli, uma vez que, os compostos sem ou R2 (NAB713) ou ambos R2 e R3 (octanoílo PBHP), também não têm actividade antibacteriana directa nas condições utilizadas no ensaio. No entanto, pode prever-se, que a ausência desses resíduos pode ser compensada utilizando, em vez de resíduo de octanoílo, um resíduo mais extenso, como o R(FA).

Tabela 2

Estrutura dos compostos e sua actividade antibacteriana* contra Escherichia coli IH3080

(continuação)

* Actividade antibacteriana medida ccmo a inibição do crescimento (em milímetros quadrados) em tomo de um poço contendo 4 ou 10 microgramas de um ccmposto em placas de meio IB ** Códigos de uma letra para os resíduos amino acilo: A, Ala; F, Phe; K, Lys; L, leu; S, Ser; T, Thr; X Dab; Z, Abu; B, N-7-formil-Dab; J, INHy-acetil-Dab. As letras sublinhadas indicam resíduos que estão na configuração D. As letras a negro indicam os resíduos que transportam uma carga positiva. Um sinal + a negro indica a carga positiva do grupo a-amino na extremidade N livre do péptido. Abreviatura: cy, ciclo. *** Na Listagem de sequências X, Z, B, J e aminoácidos na configuração D são indicados Xaa, e definidos ccmo resíduos modificados (M0D_RES).

Exemplo 3.

Actlvidade antibacteriana dlrecta de compostos NAB seleccionados contra Acinetobacter baumannii e Pseudomonas aeruginosa A actividade antibacteriana directa de doze compostos NAB contra Acinetobacter baumannii ATCC 19606 e Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 foi testada usando ο método de determinação da sensibilidade descrito no Exemplo 2. Os resultados são mostrados na Tabela 3. Cinco compostos (NAB7 0 62, NAB7 34, NAB737, NAB739 e NAB740) apresentaram actividade notável contra A. baumannii. No Exemplo 2, os mesmos compostos mostraram ser muito potentes contra E. coli. A actividade antibacteriana de NAB739 e NAB740 foi tão forte quanto, ou mesmo mais forte, do que a da polimixina B.

Os compostos NAB mais activos contra P. aeruginosa foram NAB739, NAB740, bem como, NAB736, que é bastante inactivo contra E. coli e Acinetobacter baumannii. Ο ΝΑΒ740 foi ο composto mais activo e sua actividade foi tão forte como a da polimixina B. Todos os três compostos NAB não têm cargas positivas na cadeia lateral e foram ainda activos contra P. aeruginosa. Esta constatação é contra a conclusão de Srinivasa e Ramachandran (1980a) de que os grupos amino livres em RI e R3 são essenciais para a inibição do crescimento de P. aeruginosa.

Surpreendentemente, ο NAB736 é bastante eficaz contra P. aeruginosa enquanto que o octanoilo PMBH é muito menos eficaz. Por conseguinte, o alongamento da parte R(FA) de C8 a CIO possui um efeito significativo sobre a actividade.

Tabela 3

Actividade antibacteriana* de doze (12) novos compostos contra Acinetobacter baumannii e Pseudomonas aeruginosa

(continuação)

* Actividade antibacteriana medida como a inibição do crescimento (em milímetros quadrados) em torno de um poço contendo 4 ou 10 pg do composto em placas de meio LB

Exemplo 4.

Actividade antibacteriana directa de NAB734 contra bactérias Gram-negativas seleccionadas A sensibilidade de onze estirpes de bactérias Gram-negativas (nove espécies diferentes) a NAB734 e à polimixina B foi comparada usando o método de determinação da sensibilidade descrito no Exemplo 2. As estirpes incluíam as que pertencem às espécies de Serratia marcescens e Proteus mirabilis, ambas as espécies geralmente conhecidas por serem resistentes à polimixina.

Além disso, a determinação da sensibilidade foi também realizada utilizando a bactéria Gram-positiva, Staphylococcus aureus, também geralmente conhecida por ser resistente à polimixina. Dez das estirpes originadas da ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA, E.U.A.), e uma da CCUG (Culture Collection of University of Gotemburgo, Suécia). A origem de E. coll IH3080 foi descrita no Exemplo 2. 0 sulfato de polimixina B foi obtido da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).

Os resultados na Tabela 4 mostram que NAB734 pode ser geralmente considerado como sendo aproximadamente tão potente como a polimixina B contra E. coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter cloacae, e Citrobacter freundii. Parece ser de algum modo menos potente do que a polimixina B contra Acinetobacter baumannii e claramente menos potente do que a polimixina B contra Pseudomonas aeruginosa. Representantes de diversas espécies bacterianas que se sabe serem resistentes à polimixina foram resistentes também a NAB734. Isto sugere que NAB734 tem uma acção antibacteriana muito especifica e que o seu modo de acção é bastante semelhante ao da polimixina B.

Tabela 4

Actividade antibacteriana* de NAB 734 contra bactérias Gram-negativas seleccionadas e Staphylococcus aureus

* Actividade antibacteriana medida como a inibição do crescimento (em milímetros quadrados) em torno de poços contendo 4 ou 10 pg do composto em placas de meio LB

Exemplo 5. A capacidade dos compostos NAB para sensibilizar E. coli IH3080 a um antibiótico modelo rifampicina

Os novos péptidos NAB, de acordo com a presente invenção e os compostos de referência, todos contendo pelo menos duas (2) mas não mais de três (3) cargas positivas, também foram estudados quanto à sua capacidade de sensibilizar E. coli IH3080 à rifampicina. Isto foi testado em paralelo com as determinações de sensibilidade descritas no Exemplo 2 e utilizando placas de LB que contêm concentrações crescentes (0,1 pg/mL, 0,3 pg/mL, 1 pg/mL) de rifampicina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, E.U.A.). A Tabela 5 mostra a actividade dos compostos NAB (4 pg) contra E. coli IH3080 na presença de rifampicina (0,1 e 1 pg/mL) em comparação com a actividade de uma quantidade igual de substâncias anteriormente descritas, conhecidas por sensibilizar as bactérias Gram-negativas a agentes antibacterianos, isto é, heptapéptido de polimixina B, deacilpolimixina B, desacilcolistina, nonapéptido de polimixina B, bem como com polimixina B. Os compostos também incluíram octanoilo PMBH, um agente que não tinha sido previamente reportado como sendo capaz de sensibilizar as bactérias aos antibióticos. Vários compostos NAB tornaram E. coli IH3080 sensível ao efeito antibacteriano de um valor tão baixo como uma concentração de rifampicina de 0,1 pg/mL. Na ausência dos compostos testados, foi necessária uma concentração cem vezes superior (10 pg/mL) de rifampicina para o efeito inibitório. Vários compostos aos quais faltava uma actividade antibacteriana directa notável a 4 pg foram capazes de sensibilizar a bactéria alvo à rifampicina. Tais compostos incluíram NAB7061, NAB717, NAB718, e NAB733.

Além disso, a maioria dos compostos NAB que tinha actividade antibacteriana directa, isto é, a actividade antibacteriana na ausência de rifampicina (ver Exemplo 2), inibiu a bactéria alvo, mesmo de forma mais eficaz na presença de rifampicina. A capacidade dos compostos mais activos NAB734, NAB737, NAB738, e NAB739 foi claramente ainda melhor do que a de PMBN, o conhecido permeabilizante eficaz da ME.

Os compostos NAB mais activos têm três (3) cargas positivas e têm, pelo menos, duas (2) cargas positivas adequadamente posicionadas na parte ciclica, cujo posicionamento relativo afecta a potência da actividade de sensibilização. Com efeito, deve notar-se, que NAB716, que tem apenas duas cargas positivas na parte ciclica e tem a terceira carga positiva sob a forma de um resíduo Dab em R3, é, notavelmente, capaz de sensibilizar E. coli à rifampicina.

Entre a série de compostos, todos tendo o resíduo octanoílo como R (FA) , PMHP octanoílo, que não tem R2 nem R3, possuíam a actividade de sensibilização mais fraca, NAB713, que não tem R2, possuía uma actividade um pouco melhor, e NAB7061, que possuía tanto R2 como R3 tinha uma actividade notável. Isto indica que a presença de R2 e R3 é vantajosa. No entanto, a sua ausência pode ser, pelo menos, parcialmente compensada pelo alongamento da parte R(FA), tal como em NAB736. Este tem o resíduo decanoílo como a parte R (FA) , não tem R2 nem R3, e é muito activo como um sensibilizante.

Os compostos NAB que têm ambas as suas duas (2) cargas positivas na parte ciclica eram menos activos do que os compostos NAB de outro modo estruturalmente análogos que têm todas as suas três (3) cargas positivas na parte ciclica, ou, para um composto (NAB708), inactivo nas condições de estudo utilizadas.

Os compostos NAB que têm duas (2) cargas positivas na cadeia lateral e uma (1) carga positiva na parte ciclica têm uma actividade muito modesta, se alguma, nas condições do estudo utilizadas. 0 NAB735, que tem todas as suas três (3) cargas positivas na cadeia lateral é inactivo nas condições do estudo utilizadas. Mais uma vez, as posições relativas das referidas cargas na parte ciclica afectaram a potência da actividade de sensibilização.

Tabela 5

Actividade antibacteriana dos compostos (4 pg) contra E. coli IH3080 na presença de rifampicina*

(continuação)

* Actividade antibacteriana medida ocrno a inibição do crescimento (an milírtetros quadrados) an tomo de um poço contendo 4 pg de um ccnposto an placas san rifartpicina ou can rifartpicina (0,1 ou 1,0 pg/rriL) ** O valor entre parêntesis foi obtido utilizando un poço contendo 10 pg do ccnposto

Exemplo 6. A capacidade dos compostos ΝΆΒ para sensibilizar Acine-tobacter baumannii e Pseudomonas aeruginosa a um antibiótico modelo rifampicina

Os péptidos NAB relacionados com a presente invenção, também foram estudados quanto à sua capacidade de sensibilizar A. baumannii e P. aeruginosa à rifampicina (Tabela 6) . Isto foi testado em paralelo com as determinações de sensibilidade descritas no Exemplo 3 e utilizando placas de meio LB que contêm concentrações crescentes (0,1 pg/mL, 0,3 pg/mL, 1 pg/mL) de rifampicina. Vários compostos NAB possuiam uma capacidade de sensibilização muito marcante para A. baumannii à rifampicina. A capacidade dos compostos mais activos NAB734, NAB737, e NAB739 foi claramente ainda melhor do que a de PMBN, o conhecido agente permeabilizante eficaz da ME. Ο NAB739 inibiu o crescimento de P. aeruginosa um pouco melhor, na presença de rifampicina, do que na sua ausência.

Tabela 6

Actividade antibacteriana* de doze (12) novos compostos (4 pg) contra Acinetobacter baumannii e Pseudomonas aeruginosa na presença de rifampicina (0,1 ou 0,3 pg/mL)

* Actividade antibacteriana medida como a inibição do crescimento (em milímetros quadrados) em torno de um poço contendo 4 pg de um composto em placas sem rifampicina (controlo) ou com rifampicina (0,1 ou 0,3 pg/mL)

Exemplo 7. NAB7061 sensibiliza E. coli, Klebsiella pneumoniae e Enterobacter cloacae para uma ampla variedade de agentes antibacterianos

Foram determinadas as concentrações inibitórias mínimas (MIC) de um conjunto representativo de agentes antimicrobianos utilizados clinicamente para duas estirpes de E. coli (ATCC25922 e IH3080), K. pneumoniae ATCC13883, e E. cloacae ATCC23355 usando o meio de agar de Mueller-Hinton (produto no. Lab039; LabM Ltd., Bury, Lanes, Reino Unido), na presença de NAB7061 (4 pg/mL), bem como na sua ausência. As MICs foram determinadas usando tiras E-strip (Biodisk Ltd., Solna, Suécia) de acordo com as instruções do fabricante. A concentração de NAB7061 utilizada não inibiu, ela própria, o crescimento das bactérias alvo. A MIC de NAB7061 para E. coli IH3080 e K. pneumoniae ATCC13883 foi > 16 pg/mL, para E. coli ATCC25922 16 pg/mL, e para E. cloacae ATCC23355 8 pg/mL.

Os resultados são mostrados na Tabela 7. 0 NAB7061, a uma concentração de 4 pg/mL foi capaz de sensibilizar as estirpes testadas à rifampicina por um factor que varia desde 170 a 1500. O factor de sensibilização é definido como a razão entre a MIC de um antibiótico na ausência de NAB7061 relativamente àquela na presença de 4 pg/mL de NAB7061. Foram observados factores de sensibilização extremamente altos também para claritromicina (63-380), mupirocina (24-512), azitromicina (31-94), eritromixina (21- 48), e para alguma das estirpes, para o ácido fusidico, quinupristina-dalfopristina, clindamicina, linezolida, e vancomicina. Todos estes agentes antibacterianos são notavelmente hidrofóbicos ou grandes (vancomicina) e são conhecidos por serem excluídos pela ME intacta de bactérias Gram-negativas, mas penetram na ME danificada. Não foi revelada uma sensibilização significativa (factor de sensibilização <2, testado usando E. coli ATCC25922) para piperacilina, ceftazidima, cefotaxima, levofloxacina, ciprofloxacina, meropeneme, e tobramicina, todos agentes que são hidrofílicos ou relativamente hidrofílicos e contra os quais a ME intacta não é uma barreira de permeabilidade eficaz.

Tabela 7

Factores de sensibilização* para agentes antibacterianos seleccionados em NAB7061, concentração de 4 pg/mL

*0 factor de sensibilização é a razão entre a MIC do antibiótico na ausência de NAB 7061 e aquele na presença de 4 pg/mL de NAB 7061 ** Resultados de cinco determinações independentes *** Resultados de duas determinações independentes

Exemplo 8.

Susceptibilidade de 33 estirpes diferentes de bactérias Gram-negativas à rifampicina e claritromicina na presença de NAB7061 (4 pg/mL)

As concentrações inibitórias minimas (MIC) de rifampicina e claritromicina para um conjunto representativo de diferentes estirpes de bactérias Gram-negativas clinicamente relevantes foram determinadas pelo método do "E-test", como no Exemplo 7 e usando agar de Mueller-Hinton, com ou sem NAB7061 (4 pg/mL). Esta concentração de NAB7061 não inibiu ela própria o crescimento das bactérias alvo. As estirpes provenientes de ATCC (11 estirpes), CCUG (11 estirpes) e NCTC (The National Collection of Type Cultures, Colindale, Reino Unido; 2 estirpes). Oito estirpes (as estirpes-F) foram adquiridas à Mobidiag Ltd., Helsínquia, Finlândia. A fonte de E. coli IH3080 foi dada no Exemplo 2. 0 factor de sensibilização foi definido como no Exemplo 7.

Os resultados são mostrados na Tabela 8. Para todas as estirpes (17) pertencentes ao grupo consistindo em E. coli, K. oxytoca, E. cloacae, e C. freundii, a MIC de rifampicina foi baixa ^0,125 pg/mL na presença de NAB7061 (4 pg/mL) e o factor de sensibilização variou desde 85 a 2000. Resultados muito semelhantes foram obtidos com a claritromicina. Para quinze das dezassete estirpes pertencentes ao grupo que consiste em E. coli, K. oxytoca, E. cloacae, e C. freundii, a MIC de claritromicina foi tão baixa quanto <0,25 pg/mL na presença de NAB7061 (4 pg/mL) e para todas as 17 estirpes, o factor de sensibilização variou entre 90 e 1000. Estirpes de K. pneumoniae, permaneceram algo mais resistentes a ambos os antibióticos, e os factores de sensibilização variaram entre 10 e 500. Para as três estirpes de A. baumannii, os factores de sensibilização variaram entre 24 e 125, e os valores resultantes da MIC foram bastante baixos (à rifampicina <0,125 pg/mL e à claritromicina <0,5 pg/mL).

Tabela 8 A capacidade do NAB 7061 para sensibilizar bactérias Gram-negativas para antibióticos modelos (rifampicina e claritromicina)

Estirpe bacteriana MIC (pg/ml) da Eàctor de MIC (pg/ml) da Eàctor de rifampicina na sensibiliza- claritraidcina na sensibilização presença de 4 ção à rifam- presença de 4 *** à pg/ml picina** pg/ml ciaritrcrnicina _de MB 7061*_de NRB 7061__

(continuação)

Estirpe bacteriana MIC (pg/ml) Eàctor de MIC (pg/ml) da Eàctor de da sensibiliza- claritranicina na sensibilização rifarrpicina ção à rifam- presença de 4 *** à na presença picina** pg/ml claritrrxnicina de 4 pg/ml de NAB 7061 _de MB 7061*_ _

* Resultados de duas determinações independentes ** Eàctor de sensibilização é a razão entre a MIC cte rifarrpicina na ausência de NAB 7061 para o mesmo na presença de 4 pg/mL cte NAB 7061 *** Eãctor de sensibilização é a razão entre a MIC de claritranicina na ausência cte NAB 7061 para o mesmo na presença de 4 pg/rriL de NAB 7061 **** Resultados de cinco (rifartpicina) e duas (claritrcmicina) determinações independentes ***** Resultados de três determinações independentes (rifartpicina)

Exemplo 9. NAB7061 sensibiliza estirpes de Acinetobacter resistentes a carbapeneme s

As concentrações inibitórias mínimas (MIC) de dois carpapenemes, imipenem e meropenem, para três estirpes de A. baumannii foram determinadas pelo método do "E-test", como no Exemplo 7 e utilizando agar de Mueller-Hinton, com ou sem NAB7061 (4 pg/mL). Esta concentração de NAB7061 por si só não inibiu o crescimento das bactérias alvo. 0 factor de sensibilização foi definido como no Exemplo 7. Os resultados estão apresentados na Tabela 9. NAB7061 sensibilizou ambas as estirpes resistentes aos carbapenemes (F263, F264) para ambos os carbapenemes por um factor > 4.

Tabela 9

Actividade antibacteriana do imipenem e meropenem contra estirpes de Acinetobacter baumannii na ausência de NAB 7061 e na presença de NAB 7061 (4 pg/mL)

Estirpe MIC (pg/mL) de MIC (pg/mL) de imipenem à meropenem à concentração concentração indicada (pg/mL) indicada (pg/mL) _de NAB 7 0 61_de NAB 7 0 61

Exemplo 10. NAB7061 sensibiliza E. coli para o complemento no soro normal fresco A capacidade de NAB7061 para sensibilizar a estirpe lisa, encapsulada de E. coli à acção bactericida do soro normal de porquinhos da índia (GPS) foi estudada através do método descrito por Vaara et al. (1984). E. coli IH3080 (018,Kl) foi crescida em meio LB (meio LB Lennox,

Difco, BD, Sparks, MD, E.U.A.) a 37°C num agitador orbital até ao inicio da fase exponencial de crescimento, lavada com PBS (tampão fosfato solução salino, 8,0 g de NaCl, 0,2 g de KC1, 1,44 g de Na2HPC>4 x2H20 e 0,2 g de KH2PO4 por litro) e ressuspendida em PBS, até aprox. 109 células/mL). O GPS foi usado como fonte de complemento. Foi armazenado a -70°C antes da utilização. Para inactivar o complemento, o soro foi incubado a 56°C, durante 30 min. O procedimento experimental foi como se segue. Inoculou-se 10% GPS em PBS com aprox. 500 UFC (unidades formadoras de colónias) de bactérias por mL e pipetou-se em aliquotas de 0,2 mL para poços de microplacas. Os poços continham previamente quantidades crescentes de NAB7061 em 0,020 mL de 0,9% de NaCl. A placa foi incubada a 37°C, durante 2 h, após o que cada poço foi esvaziado para placas com meio LB. As placas foram incubadas durante a noite, a 37°C e as colónias que se desenvolveram foram contadas.

Os resultados são mostrados na Tabela 10. O NAB7061 não reduziu significativamente, por si próprio, a contagem de UFC na ausência de GPS, ou na presença de 10% de GPS inactivado pelo calor. No entanto, uma concentração tão baixa de NAB7061 como 2 pg/mL foi suficiente para reduzir a contagem de UFC por um factor de aprox. 100 na presença de GPS 10% fresco. Assim, ο NAB7061 age sinergicamente com a maquinaria de complemento bactericida presente no soro fresco, como faz PMBN, o agente bem conhecido por ter esta propriedade.

Tabela 10 A actividade bactericida sinérgica de NAB7061 e 10% de soro de porquinho da índia (GPS) contra E. coli IH3080 (018:K1)*

* medida como a % de sobrevivência após tratamento de 2 horas, a 37°C

Exemplo 11.

Afinidade reduzida de NAB7061 à membrana de bordadura em escova (BBM) do córtex renal A ligação dos compostos, de acordo com esta invenção, a membrana de bordadura em escova (BBM) isolada a partir do córtex renal pode ser medida indirectamente por medição da sua capacidade para inibir a ligação de gentamicina com marcação radioactiva à BBM. Por conseguinte, os compostos de acordo com a presente invenção, que têm menos afinidade para a BBM do que, por exemplo, a polimixina B inibem a ligação de gentamicina marcada radioactivamente num grau menor do que a polimixina B. A BBM foi isolada a partir do córtex renal de ratos albinos machos utilizando a técnica de precipitação de Mg2+/EGTA, tal como descrito por Nagai et al. (2006) . A ligação da gentamicina foi medida, de acordo com o método descrito por Nagai et al. (2006) através da incubação de vesículas de BBM (20 pL) em 10 mM de HEPES (pH 7,5) com 100 mM de manitol, na presença de 20 μΜ [3H] gentamicina (American Radiolabeled Chemicals, Inc. (St. Louis, MO, USA) ) com ou sem o composto a ser testado ou um controlo positivo. Após uma incubação de 60 min a 4°C, foi adicionado 1 mL de tampão arrefecido em gelo acima descrito, e a mistura foi filtrada através de um filtro Millipore (0,45 pm; HAWP). O filtro foi lavado com tampão e a radioactividade remanescente no filtro foi medida utilizando um contador de cintilação líquida. Os valores de IC50 foram determinados como em Nagai et al. (2006) usando a equação de Hill.

Os valores de IC50 (pM) para o composto NAB estudado e os controlos foram os seguintes: 187,3 + 24,3 para NAB7061 (média de duas experiências independentes, cada uma com três determinações paralelas), 39,3 +5,5 para polimixina B (média de duas experiências independentes, cada uma com três determinações paralelas), e 90,2 + 9,7 para gentamicina não marcada (três determinações paralelas) . Por conseguinte, a afinidade de NAB7061 para BBM é apenas aproximadamente metade da afinidade da gentamicina para BBM e aproximadamente de um quinto da afinidade de polimixina B para BBM.

Exemplo 12. A actividade de NAB7061 em modelo experimental de peritonite por E. coli em ratinhos

Preparou-se uma suspensão de E. coli IH3080 (Kl:018) em solução salina (0,9% NaCl) a partir de uma cultura crescida durante a noite numa placa de agar de sangue (Statens Serum Institut, Copenhaga, Dinmarca). Todos os ratinhos (fêmea NMR1 de Harlan Scandinavia, Allerçd, Dinmarca; peso, 25-30 g) foram inoculados intraperi-tonealmente com 0,5 mL da suspensão contendo 0,96 x 106 UFC por mL, no quadrante inferior lateral do abdómen. Em lh, a contagem de UFC foi determinada a partir de três ratinhos e os ratinhos restantes (quatro ratos por grupo) foram tratados com uma injecção subcutânea de 0,2 mL de solução de eritromicina em solução salina (correspondendo a 5 mg/kg de peso corporal), ou NAB7061 em solução salina (correspondendo a 5 mg/kg de peso corporal), ou em conjunto eritromicina e NAB7061 (correspondendo a 5 mg/kg de peso corporal de ambos os fármacos; dadas em dois locais separados). 0 grupo de controlo recebeu duas injecções de 0,2 ml de solução salina. 4,5 h após a infecção, todos os ratinhos foram anestesiados com CO2 e sacrificados. A solução salina estéril (2 mL) foi injectada intraperitonealmente e o abdómen foi gentilmente massajado antes de ser aberto e o fluido foi recolhido. As diluições apropriadas do fluido foram plaqueadas em placas de agar de sangue, as placas foram incubadas durante a noite, e as colónias foram contadas.

Em 1 h após a infecção, a contagem de UFC era de 0,74 (+ 0,7) x 106 por mL. Em 4,5 h após a infecção (correspondendo a 3,5 h após o tratamento), as contagens de UFC (por mL) foram de 11,1 (± 6,2) x 106 (grupo controlo), 8,9 (± 6,4) x 106 (grupo com eritromicina) , 1,1 (± 0,6) x 106 (grupo com NAB 7061), e 2,1 (± 1,2) x 106 (grupo com eritromicina mais NAB). Por conseguinte, na ausência de NAB 7061, a contagem de bactérias aumentou por um factor de 15 (grupo salino) ou por um factor de 12 (grupo com eritromicina) , enquanto que, na presença de NAB 7061, os factores correspondentes variaram de 1,5 a 3.

Exemplo 13.

Estudos de toxicidade em NAB7061 A toxicidade em ratos jovens (peso aprox. 150 g no inicio do estudo) foi determinada pela administração de doses (1, 2, 4, 8, 16, e 32 mg/kg por dia) de NAB7061, bem como o composto de controlo, polimixina B por via intravenosa duas vezes (2) por dia durante duas semanas. Foi estudado um grupo de dez (10) ratos para cada regime de dose. As observações clinicas foram feitas diariamente, o peso corporal medido duas vezes por semana, e o consumo de alimento duas vezes por semana. No final da semana 2, todos os animais foram sacrificados. O composto de controlo, polimixina B influenciou negativamente o aumento do peso corporal numa dose tão baixa quanto 1 mg/kg por dia, enquanto que a dose mais baixa de NAB7061 que teve este efeito foi de 8 mg/kg. A polimixina B causou mortalidade com 32 mg/kg por dia (100% de mortalidade) , enquanto que todos os ratos que receberam NAB7061 permaneceram vivos ao longo de todo o estudo. No final do estudo, os niveis de azoto de ureia no sangue (BUN) foram 15% mais elevados no grupo que recebeu 16 mg/kg por dia de polimixina do que no grupo controlo ou no grupo com dose baixa de polimixina (1 mg/kg por dia). No grupo que recebeu NAB7061 na dose de 16 mg/kg por dia, não se observou nenhum aumento, e no grupo que recebeu NAB7061 na dose de 32 mg/kg por dia, o aumento foi de 7%. A histopatologia dos rins foi realizada para cada animal e a histopatologia de todos os tecidos foi realizada em três grupos que receberam doses elevadas de NAB7061. Não foram observadas descobertas patológicas relacionados com NAB7061 na patologia geral e na histopatologia de quaisquer órgãos ou na histopatologia dos rins em quaisquer animais que receberam NAB7061.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Northern Antibiotics Ltd Vaara, Martti Vaara, Timo <120> Derivados da polimixina e suas utilizações <130> 2070627PC / NAB-1 <150> US 60/837,426 <151> 2006-08-11 <150> DK 200601055 <151> 2006-08-11 <160> 34 <170> Patentln versão 3.3 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> bacteriana <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Dab <220> <221> MOD_RES <222> (3) .. (5) <223> Dab <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(10) <223> circular <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> D-Phe <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(9) <223> Dab <400> 1

Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Thr 15 10 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> bacteriana <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Dab <220> <221> MOD_RES <222> (3) . . (5) <223> Dab <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(10) <223> circular <220> <221> MOD_RES <222> (6).. (6) <223> D-Leu <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(9) <223> Dab <400> 2

Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Thr 15 10 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> bacteriana <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Dab <220> <221> MOD_RES <222> (3) . . (5) <223> Dab <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(10) <223> circular <220>

<221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> D-Phe <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(9) <223> Dab <400> 3

Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Thr 15 10 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> bacteriana <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Dab <220> <221> MOD_RES <222> (3) . . (5) <223> Dab <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(10) <223> circular <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> D-Leu <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(9) <223> Dab <400> 4

Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Thr 15 10 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> bacteriana <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(4) <223> Dab <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3).. (9) <223> circular <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> D-Phe <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(8) <223> Dab <400> 5

Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Thr 1 5 2 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> bacteriana <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(2) <223> Dab <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(7) <223> circular <220> <221> MOD_RES <222> (3) . . (3) <223> D-Phe <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(6) <223> Dab <400> 6

Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Thr 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> bacteriana <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Abu <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(4) <223> Dab <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(9) <223> circular <220> <221> MOD_RES <222> (5) . . (5) <223> D-Phe <220> <221> MOD_RES <222> (7).. (8) <223> Dab <400> 7

Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Thr 1 5 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> bacteriana <220>

<221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Abu <220> <221> MOD_RES <222> (3) . . (3) <223> Abu <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(5) <223> Dab <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(10) <223> circular <220>

<221> MOD_RES <222> (6) . . (6) <223> D-Phe <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(9) <223> Dab <400> 8

Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Thr 15 10 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> bacteriana <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(2) <223> Dab <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(7) <223> circular <220> <221> MOD_RES <222> (3) . . (3) <223> D-Phe <220> <221> MOD_RES <222> (5) . . (6) <223> Dab <400> 9

Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Thr 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> bacteriana <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> D-Ser <220> <221> MOD_RES <222> (3) ..(4) <223> Dab <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(9) <223> circular <220> <221> MOD_RES <222> (5) . . (5) <223> D-Phe <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(8) <223> Dab <400> 10

Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Thr 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> bacteriana <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> D-Thr <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(4) <223> Dab <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(9) <223> circular <220> <221> MOD_RES <222> (5) . . (5) <223> D-Phe <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(8) <223> Dab <400> 11

Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Thr 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> bacteriana <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> D-Ser <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(4) <223> Dab <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(9) <223> circular <220> <221> MOD_RES <222> (5) . . (5) <223> D-Phe <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(8) <223> Dab <400> 12

Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Thr 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> bacteriana <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Abu <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(4) <223> Dab <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(9) <223> circular <220> <221> MOD_RES <222> (5) . . (5) <223> D-Phe <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(8) <223> Dab <400> 13

Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Thr 1 5 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> bacteriana <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Abu <220> <221> MOD_RES <222> (3) . . (3) <223> Abu <220> <221> MOD_RES <222> (4) . . (5) <223> Dab <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(10) <223> (urcular <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> D-Phe <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(9) <223> Dab <400> 14

Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Thr 15 10 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> bacteriana <220> <221> MOD_RES <222> (2) . . (4) <223> Dab <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(9) <223> circular <220> <221> MOD_RES <222> (5) . . (5) <223> D-Phe <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Abu <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Dab <400> 15

Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Thr 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> bacteriana <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Abu <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(4) <223> Dab <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(9) <223> circular <220> <221> MOD_RES <222> (5) . . (5) <223> D-Phe <220>

<221> MOD_RES <222> (7)..(8) <223> Dab <400> 16

Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Leu 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> bacteriana <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> D-Ala <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(4) <223> Dab <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(9) <223> circular <220> <221> MOD_RES <222> (5) . . (5) <223> D-Phe <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(8) <223> Dab <400> 17

Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Thr 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> bacteriana <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(4) <223> Dab <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(9) <223> circular <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> D-Phe <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Dab <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Abu <400> 18

Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Thr 1 5 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> bacteriana <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Abu <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(4) <223> Dab <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(9) <223> circular <220> <221> MOD_RES <222> (5) . . (5) <223> D-Leu <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(8) <223> Dab <400> 19

Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Thr 1 5 <210> 20 <211> 9

<212> PRT <213> bacteriana <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(2) <223> D-Ala <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(4) <223> Dab <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(9) <223> circular <220> <221> MOD_RES <222> (5) . . (5) <223> D-Phe <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(8) <223> Dab <400> 19

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Thr 1 5 <210> 21 <211> 8 <212> PRT <213> bacteriana <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Abu <220> <221> MOD_RES <222> (2) . . (3) <223> Dab <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(8) <223> circular <220>

<221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> D-Phe <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(7) <223> Dab <400> 21

Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Thr 1 5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> bacteriana <220> <221> MOD_RES <222> (2) . . (3D <223> Dab <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(9) <223> circular <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Abu <220> <221> MOD_RES <222> (5) . . (5) <223> D-Phe <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(7) <223> Dab <400> 22

Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Thr 1 5 <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> bacteriana <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Dab <220> <221> MOD_RES <222> (3) . . (5) <223> Dab <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(10) <223> circular <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> D-Phe <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(9) <223> Abu <400> 23

Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Thr 15 10 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> bacteriana <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Abu <220> <221> MOD_RES <222> (3).. (3) <223> Dab <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(9) <223> circular <220> <221> MOD_RES <222> (5) . . (5) <223> D-Phe <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(8) <223> Dab <400> 24

Thr Xaa Xaa Lys Xaa Leu Xaa Xaa Thr 1 5 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> bacteriana <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Abu <220> <221> MOD_RES <222> (3) . . (3) <223> Dab <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(9) <223> circular <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Abu <220> <221> MOD_RES <222> (5) . . (5) <223> D-Phe <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(8) <223> Dab <400> 25

Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Thr 1 5 <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> bacteriana <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Abu <220> <221> MOD_RES <222> (3) ..(4) <223> Dab <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(9) <223> circular <220> <221> MOD_RES <222> (5) . . (5) <223> D-Phe <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Dab <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Abu <400> 26

Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Thr 1 5 <210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> bacteriana <220> <221> MOD_RES <222> (2) . . (2) <223> Abu <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(4) <223> Dab <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(9) <223> circular <220> <221> MOD_RES <222> (5) . . (5) <223> D-Phe <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Abu <220> <221> MOD_RES . <222> (8)..(8) <223> Dab <400> 27

Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Thr 1 5 <210> 28 <211> 10 <212> PRT <213> bacteriana <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Dab <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(4) <223> Dab <220> <221> MISCFEATURE <222> (4)..(10) <223> circular <220> <221> MOD_RES <222> (5) . . (5) <223> Abu <220> <221> MOD_RES <222> (6).. (6) <223> D-Phe <220> <221> MOD_RES <222> (8) ..(8) <223> Dab <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Abu <400> 28

Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Thr 15 10 <210> 29 <211> 10

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Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Thr 15 10 <210> 30 <211> 10 <212> PRT <213> bacteriana <220> <221> MOD_RES <222> (D ·. CD <223> DAb <220>

<221> MOD_RES <222> (3)..(4) <223> DAb <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(10) <223> circular <220> <221> M0D_RES <222> (5)..(5) <223> Abu <220> <221> M0D_RES <222> (6)..(6) <223> D-Phe <220> <221> M0D_RES <222> (8). . (9) <223> Abu <400> 30

Xaa Thr Xaa Xaa Xaa'Xaa Leu Xaa Xaa Thr 15 10 <210> 31 <211> 10 <212> PRT <213> bacteriana <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(4) <223> Dab <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(10) <223> circular <220> <221> MOD_RES <222> (5) . . (5) <223> Abu <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> D-Phe <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(9) <223> Abu <400> 31

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Thr 15 10 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> bacteriana <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(4) <223> Dab <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(9) <223> circular <220> <221> MOD_RES <222> (5) . . (5) <223> D-Phe <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(8) <223> Abu <400> 32

Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Thr 1 5 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> bacteriana <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(4) <223> Dab <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(9) <223> circular <220> <221> MOD_RES <222> (5) . . (5) <223> D-Phe <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(8) <223> N-gama-formil-Dab <400> 33

Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Thr 1 5 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> bacteriana <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(4) <223> Dab <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(9) <223> circular <220> <221> MOD_RES <222> (5) . . (5) <223> D-phe <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(8) <223> N-gama-acetil-Dab <400> 34

Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Thr 1 5

Lisboa, 9 de junho de 2016

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Um derivado de polimixina de fórmula geral (I) ,

em que RI está ausente ou é Abu: R2 é seleccionado a partir do grupo que consiste em Ser, Thr, DThr e DAla; e R3 é seleccionado a partir do grupo que consiste em Thr, DThr, Ser, DAla, Dab e Abu; R4 é Dab, R6 é Phe ou DLeu; R7 é Leu, Thr ou lie; R5, R8 e R9 são cada um Dab ou Abu; RIO é Leu ou Thr; e R(FA) é seleccionado a partir do grupo de residuos consistindo em octanoilo (OA), decanoilo (DA), e 6-metil-heptanoilo (6-MHA); em que os referidos resíduos de aminoácidos são selec-cionados de modo que o número total de carqas positivas a pH fisiológico seja três, e o número total de cargas positivas na porção R4-R10 do anel de heptapéptido seja pelo menos dois, pelo meio do qual, o referido derivado de polimixina ainda possui actividade antibacteriana contra bactérias Gram-negativas, e/ou possui capacidade para sensibilizar bactérias Gram-negativas a agentes antibac-terianos; ou um sal farmaceuticamente aceitável do referido derivado.

2. 0 derivado, de acordo com a reivindicação 1, em que R1-R10 é seleccionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID No: 10-20 e 22.

3. O derivado, de acordo com a reivindicação 1, em que R1-R10 é seleccionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID No: 10-20.

4. O derivado, de acordo com a reivindicação 3, seleccionado a partir do grupo que consiste em OA-SEQ ID No. 10, DA-SEQ ID No. 10, OA-SEQ ID No. 11, OA-SEQ ID No. 12, DA-SEQ ID No. 13, OA-SEQ ID No. 13, MHA-SEQ ID No. 13, MHA-SEQ ID No. 14, OA-SEQ ID No. 15, OA-SEQ ID No. 16, OA-SEQ ID No. 17, OA-SEQ ID No. 18, OA-SEQ ID No. 19, e OA-SEQ ID No. 20.

5. O derivado, de acordo com a reivindicação 4, seleccionado a partir do grupo que consiste em OA-SEQ ID No. 13, OA-SEQ ID No. 17, OA-SEQ ID No. 18, OA-SEQ ID No. 19, e OA-SEQ ID No. 20.

6. O derivado, de acordo com a reivindicação 5, seleccionado a partir do grupo que consiste em OA-SEQ ID No. 13.

7. O derivado, de acordo com a reivindicação 4, seleccionado a partir do grupo que consiste em OA-SEQ ID No. 10, DA-SEQ ID No. 10, OA-SEQ ID No. 11, e OA-SEQ ID No. 12.

8. O derivado, de acordo com a reivindicação 7, seleccionado a partir do grupo que consiste em OA-SEQ ID No. 10.

9. Um produto de combinação compreendendo dois ou mais dos derivados, de acordo com as reivindicações 1 a 8.

10. Uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos um derivado de acordo com uma das reivindicações 1 a 8, e pelo menos um veiculo e/ou excipiente farma-ceuticamente aceitável.

11. A composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 10, compreendendo ainda um agente antibac-teriano.

12. Utilização de um derivado, de acordo com uma das reivindicação 1 a 8, no fabrico de um medicamento para tratar infecções causadas por bactérias Gram-negativas.

13. A utilização, de acordo com a reivindicação 12, em que as referidas bactérias são seleccionadas do grupo que consiste em: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter cloacae, Ci-trobacter freundii, Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii.

14. Utilização de um derivado, de acordo com qualquer uma das reivindicação 1 a 8, para o fabrico de urn medicamento para sensibilizar bactérias Gram-negativas contra agentes antibacterianos.

15. A utilização, de acordo com a reivindicação 14, em que as referidas bactérias são seleccionadas do grupo que consiste em: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter cloacae, Citro-bacter freundii, Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii.

16. A utilização, de acordo com a reivindicação 14, em que o referido agente antibacteriano é seleccionado do grupo que consiste em claritromicina, azitromicina, eritromicina e outros macrólidos, cetólidos, clindamicina e outras lincosaminas, estreptograminas, rifampicina, rifa-butina, rifalazile e outras rifamicinas, ácido fusidico, mupirocina, oxazolidinonas, vancomicina, dalbavancina, te-lavancina, oritavancina e outros antibióticos glicopé-ptidos, fluoroquinolonas, bacitracina, derivados de tetra-ciclina, antibióticos betalactâmicos, novobiocina, pleuro-mutilinas, inibidores da sintese de fosfato, inibidores de deformilase, e inibidores da bomba de efluxo bacteriano.

17. A utilização, de acordo com a reivindicação 16, em que o referido agente antibacteriano é seleccionado a partir do grupo que consiste em: claritromicina, azitro-micina, eritromicina, clindamicina, a combinação de estre-ptogramina quinupristina-dalfopristina, rifampicina, ácido fusidico, mupirocina, a linezolida oxazolidinona, vancomicina, a moxifloxacina fluoroquinolona, e o inibidor da sintese de folato, trimetoprima.

18. Utilização de um derivado, de acordo com qualquer uma das reivindicação 1 a 8, para o fabrico de um medicamento para sensibilizar bactérias Gram-negativas para um mecanismo de defesa de complemento presente no soro.

19. A utilização, de acordo com a reivindicação 18, em que as referidas bactérias são seleccionadas do grupo que consiste em: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter cloacae, Citro-bacter freundii, Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii.

20. Um processo para preparar um derivado de polimixina de fórmula (I), como definido na reivindicação 1, compreendendo a modificação de um composto de polimixina ou octapeptina, natural ou sintético, ou um seu derivado tendo 4 a 6 residuos carregados positivamente, através da substituição de 1 a 4 dos referidos residuos em residuos neutros, ou através de uma ligação covalente, ou convertendo 1 a 4 dos referidos residuos em residuos neutros, de modo a obter um derivado de polimixina de fórmula (I), de acordo com a reivindicação 1, tendo 2 ou 3 residuos carregados positivamente.

21. 0 processo, de acordo com a reivindicação 20, compreendendo a realização do processo como um processo sintético total.

22. O processo, de acordo com a reivindicação 20, compreendendo a realização do processo como um processo semi-sintético.

23. O processo, de acordo com a reivindicação 20, compreendendo os passos de: a) sujeitar o composto de polimixina ou octapeptina, natural ou sintético, ou um seu derivado, a uma clivagem de modo a remover a cadeia lateral do referido composto de polimixina, e recuperando a parte cíclica do referido composto, e b) acoplamento, à parte cíclica obtida no passo a) , da cadeia lateral preparada sinteticamente, de modo a obter um derivado de polimixina de fórmula (I), de acordo com a reivindicação 1.

24. 0 processo, de acordo com a reivindicação 23, compreendendo a realização da clivagem no passo a) por via enzimática.

25. 0 processo, de acordo com a reivindicação 23, compreendendo a realização da clivagem no passo a) por via quimica.

26. 0 processo, de acordo com a reivindicação 23, compreendendo a realização da clivagem no passo a) utilizando uma combinação de ambos os tratamentos enzi-mático e quimico. Lisboa, 9 de junho de 2016 REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento da patente Europeia. Ainda que tenha sido tomado o devido cuidado ao compilar as referências, podem não estar excluídos erros ou omissões e ο IEP declina quaisquer responsabilidades a esse respeito. Documentos de patentes citadas na Descrição * pb 2ao6s»*ies a * aeiasmgA * yp b * ν'-; a, ϊ4χο?-;\· * us ‘ U S BOSS?A * OR KXWJHiSS * OSfiôtítmA Literatura que não é de patentes citada na Descrição * WCBtSTEStt fi. ót ?J, Soiootty»· cAosTtot Rsoslfci- * PAKAIDOH, fAokífisi&r RsAs ís? fissififiíA mot's· *# Poifttifm δ &#* v. MMjxim cntm·' msmM. Mimvmt woo §m 19¾¾ *os o·<τλ 0331-%¾¾ ««y; sosa, «aay. .* CLAUSES ♦ NmASTOM «ò :íí;;k73! aysssssss oí sseteífctftS ®o8 ísgid ovsfiv owAx «ysmísr^e pofíooatyslity PtoJÍífctf fí&A titAS. fcts*xs& ^ 6Ô{£'3í.2£«-r^[$0íí| xsL 4¾ 1-32 ·* TSUSe^YM rfsL^í«^5jn^^5ffc3tC.mí>ÍM-- » ROSE f : HEiSER K.U; SSBEUÍíS U; ROfiS* yx-ys;·!': 6 w«ji«o6» ãítíi tf»»;' etfeçí sx âotAsm BACH-KLONTSSH S . EADíStÂU K: BEEBER W; ssfimx ! í''x, BOfi5 >»» ?* Ό"3-!3κϊ efBfêSSINOER F "Oí^oíl·^ ^pQfNíyset^effeíest by firo rioofirxic gíAytoysfi» B ?xx»spopís.T» sostsftpyss >o- * VAARÂ Sfi «i ;B Bvii'ij;·; of ^íSfAssi t}·»^ ssrs í<y»xx- síoisfstE «»SBiSA<sBactsoç.:d,3! fiffmyfií Rim;»» 080- gtsassSy *ííf» ί:»ί:>'>;::·ίίίΧχ: isítfiptofit,·» ogaiosl fiopftgs JÁíSsfiíBSA. 1R3S.v8i.1fi2, TBT-1BS jBtSfi] grsAVii^sivsiíírA-sciLXxa^fts ♦ SAKURft H; ÍTOH T; tíCHffiA Y; OHK? K; aís# 1-3¾.¾. voi 4« BA. ISSt-t&TS- ORSRIURAK.;CH{gAK;SATC?Y 0®AWA«SfSHiH. Ih® «of&SsARto ot 8s« R~teí?ofifijt stme-tas oí p«ty- * CHBíARA S TDBíTA T; YAHATA M . f?0 A , myxo B çmgSik» to s»tt8*satfi8í asftti Spfipolysao- KOfA%È* > ίχίΡγΡχΓ-'ί OííQoPtsâúf» -RoossSo ίχο- «Rood» ftc&rôy, êm&.úl^-Sm-iimv-Wb*, fctgOfc -wí «Soísftfioaptws οϊ' «-Ní-As-yí ss.f-ossfitnitloOs» v«!. ??, 1ΒΤ&··1Β24 tyrfc &-?} «»03 oofcsr txmsspogtkfií. Ag? Sfcf Cmm. * BRÍRÍVASASB : RAMACíHANDRANí LK, CíBíffSísst 19?S, vtc-f .'? y^r."'-í4?<í ηχκΜοχϊί'ϊοofsíséAíííoBst-!V»-StokígXs? * CXtMARA S : íTO A YAHATA ^ . TOStYA T . sis:Sfe»Sy ííí íte?>vs5A3ys cs fsáyt?>yjísfs B. (>?;'? y Bííx-Así'?? KOYAMA Y OOfessÍveai topiemit. is£ssíís:sf»s»xs í?fw- tst?ít. v<4. tA. &t«Sè 30íys;;s' \ \» \v; ríytsijo oo'»popi>'ío xtiA * SRífSfSYASA 8P, RA^ACMARpRAR LR. Yo® p*t- y|íOÇ;;-t! <ví<?oiAPR so «'s'- vorsgystkx» Oes^oís OíBifriy yjoystiss J$··»»;?'B79. voJ 3¾. Sfíífc-x! ;ís» ísíOo" ís-..;r;?feor?;tf:^t?yssy#ífxofety Agi^a.x %-}Ύ! í;s?A vot ,í« iíít-SÀ» ♦ SRPSVASA SD ;RAStACHA^CRA?t kK. EssonfesS * KtitBfí A v', MAT SijtíAGA H ; VA ARA Boíyxiy» í-.«’sx.' «sups oí ooiyjoyssfs B. ma J BmckBm Sicphys, s»y S x UossAOs? sex! pofymysla B teptapepmj* a«» -198^.:vsi. 1Y-· ttS-t TB : pxsfeoí vutèf »x>*«t>f3f^ sí>px^iã:tyAíXSSís&ff^ » STORfiS DR: í?OSBHY«At MS c SWANSON PL s@0f:í,·. gAfS^Ot 49 7<Í'Y4S P<SpTY^f! s3?Xt fYk:A0á SísíS»íte: A»ífS^SX:0, AfTSX? BíA? * KíJRSHAPA Y TAKEOA H ; ítO M; SATO H; BstxYfíJíO iY??. >Λ'?ί 4B, íès^BT EMPSSsTít fi5 : KiíHOSAWA A, SSysiXjií fito Ytf- sXtfO- * t&At&ER S3. PíOJSiíííSkXf 0? f:»ts>ks|K;%' fSs> gos.Si.fis !$syts;<3 !0í.»::?ss!í': ly, ^í?so^vofí>:fiof yos- sfiytstK't) o? "Os-sS;': oos? (ístíks': s1«òvfi5'fiàí Vfií-s.g.-Así dísc. |.xs^f»pi»<fs SfsOixCitit:: ps^yxtyxfo 8 J <YssSj>'ã»'- iOSí.,fií, »i»?A v-st A-T •pis? · 1434 fioA vcT 2B&. Í1? * NAC-tAi 3 : SAÍTO Sí ; .ADACHS Y ; YUS30T0 B * TSUSERY H ; OfEK l; COHEÍT B: FRÍDKI8 14. TAKAtsO kt. Ss'sAsí>iS:<fitt oí yyíisoite S5»sxty»§ to »'-.y SifasUyO-ttififiSofistoiSfis s'ii'txSjysvy.sios 8 οοοορορ” íOfiSS 0?ssfs-0<s0>-s fty Ot?X;St4<; sfiOí fiiS t-tOS' 3fiO»í;»!s>.'iyí í-y so»>ftiSS5<tOO !,>? 0»»;fi-i'-«-sJiStivO AfsSiísttss.,fiíí05fB3s . C-\oí'5>'Ao?S'hi4o, ->>.» kSfii&fió. -í kA o B »<*?. 3003 -"'4 43. TOSB-TB?1'? * TSU&ÊfcVM ;0£ERí , ÍA Ihs - VÀARÀ fci. Ar;si.isk>^£^up^rs^c*«iibte miiíssVs of & *<δϊίí^oSmoS Esotxsttohia «*8 amd Safou*»?* SypUfowbfS Λ^· S^ajpsihfs^sfifiSíííSB is sfcswspKsSo: Sitss&ss:m íxá - Aí^ísA- 5ffcSí\<fftti>f, *?Κλ T? ?2$& (S3mtfpe$<r}«3& Bs*4w*stíí&ííV 3!0CSS v«i .V« «8£SMt*â*4· ·*: VAAftA M, VAARA t. SamSStotóm aí €*a«$»sw$*· * ¥SííSE&¥ Μ . 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VSUANSN F; VAASSAT . «*ÂK*U p. * tsusew H ; YAAXOV H ; çom# S rSITERSWi As 0»®*' í^s<'Oíaos Oi«sgo<iR®§ fs^KJ» RMB® T: RSÂTÉTV&HOU A ; FRiCfRSNM ; OFEXi RA2i:2-;v SOASiKSKSO £. ;.&i ®»S2® VjSAASB OtSí^OM?^ Sítoo &1A âOA-RSSteS ·Αλ> íysuaw* SS ARSOSim mi ow- V SBSSjyrsftí. mi4 vot Uv:. 2V22-2SSV 0ίΑθΑ2'^>ίΤίΑ&;.Αν;ί;2 r-joí;® te; ^íV^ssrb tete- * VSUANEN P: SSAT&íPíASA H : KSSSUSÍA Y; SeriA AoíÁORlRíO 4gm\$ VAVRRteW 2¾¾. Vte A® V*W5A te T!® OBSíte íOOSteteAO pAf<A«SfeiiAy-i:>- MSS-Ste® orsasfog ««'tioí: «i iíasoviooROiyíSfís J Αώ&ώϋββ» ií VAAFí* fit. A^sníS íAof :OSf®assem» ρ*Γ!Ώ®8ϊΐί?^ sf liW voi 4Λ 21Í-223 Sha otsos tjssfbfjotoo AV.-:-ft;ès;V A<>:,·. R>:á?. ws SS, 3S^fí