CN103048410A - 一种治疗睡眠障碍的薄膜包衣片的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种治疗睡眠障碍的复方远枣宁神薄膜包衣片的检测方法，所述复方远枣宁神薄膜包衣片按重量份由远志，酸枣仁（炒），绞股蓝，徐长卿，萱草花和蜘蛛香制成。本发明在现有质量标准的基础上，增加了针对复方远枣宁神薄膜包衣片中的细叶远志皂苷、丹皮酚和大类成分总皂苷鉴别方法和含量测定方法；可以对复方远枣宁神薄膜包衣片的主要药物成分进行更有效控制，使得复方远枣宁神薄膜包衣片的质量监控水平有了很大的提高。既更有利于生产厂家和监督管理部门对产品质量的监测，也可以为医疗部门和患者的治疗提供更好的保障。
Description
技术领域
本发明涉及一种治疗睡眠障碍的薄膜包衣片（商品名：复方远枣宁神薄膜包衣片）的检测方法，属于制药技术领域。
背景技术
复方远枣宁神薄膜包衣片是一种治疗睡眠障碍的中药制剂。复方远枣宁神薄膜包衣片配方中的组分所含的细叶远志皂苷、丹皮酚和大类成分总皂苷是复方远枣宁神薄膜包衣片的特征性指标成份。而现有的质量标准中，没有针对复方远枣宁神薄膜包衣片中细叶远志皂苷、丹皮酚和大类成分总皂苷的检测方法，因此对产品质量的控制存在不足。为了更进一步保证该产品的质量及更有利于对该产品质量的监督、管理，所以有必要对该产品的检测进行改进，从而更进一步保证该产品的质量和疗效。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种治疗睡眠障碍的复方远枣宁神薄膜包衣片的检测方法。本发明在现有质量标准的基础上，增加了针对复方远枣宁神薄膜包衣片中的细叶远志皂苷、丹皮酚和大类成分总皂苷鉴别方法和含量测定方法，可以对复方远枣宁神薄膜包衣片的主要药物成分进行更有效控制。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案如下：一种治疗睡眠障碍的薄膜包衣片的检测方法，所述复方远枣宁神薄膜包衣片按重量份由远志179g，酸枣仁（炒）268g，绞股蓝143g，徐长卿179 g，萱草花143 g和蜘蛛香107g共制成1000片，（每片约重0.5克）包括以下步骤
远志的鉴别；取本品5片，碾碎，准确称取粉末1g，置于250ml平底烧瓶中，加入10%NaOH溶液50ml，水解2小时，冷却至室温，用浓HCL调节pH至pH为4～5，用水饱和正丁醇萃取三次，每次50ml，挥干正丁醇，溶于6ml甲醇，静置，取上清液即为供试品溶液；称取缺远志药材的阴性样品0.88g，配制方法同前（置于250ml平底烧瓶中，加入10%NaOH溶液50ml，水解2小时，冷却至室温，用浓HCL调节pH至pH为4～5，用水饱和正丁醇萃取三次，每次50ml，挥干正丁醇），溶于6ml甲醇，静置，取上清液即为阴性样品溶液；精密称取细叶远志皂苷对照10.00mg，于10ml容量瓶中，用色谱甲醇溶解并定容，摇匀，浓度为1.00mg/ml；分别吸取上述供试品溶液、阴性样品溶液及细叶远志皂苷对照品溶液14μl点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以6：3：0.5的氯仿-甲醇-水作为展开剂，饱和25分钟；用10%硫酸乙醇溶液为显色剂；上行展开14cm；在105℃烘箱中烘至细叶远志皂苷斑点至紫红色，结果供试品色谱中，在对照品色谱相应的位置上，制剂与对照品在相同位置上均显紫红色斑点，阴性样品无干扰。
前述的治疗睡眠障碍的薄膜包衣片的检测方法，还包括以下步 骤：
酸枣仁（炒）的鉴别；取本品5片，碾碎，准确称取粉末2g，加热水40ml溶解，过滤，滤液用萃取3次，每次40ml石油醚，弃去石油醚层，水层用水饱和正丁醇萃取5次，每次40ml水饱和正丁醇，合并正丁醇层，于80℃水浴挥干，残渣用适量热水溶解，吸取3ml上大孔吸附树脂柱，吸附30分钟，用100ml水、100ml30%乙醇、100ml50%乙醇依次冲洗，收集50%乙醇的洗脱液，水浴挥干，残渣加甲醇1.5ml溶解，即为制剂薄层供试品溶液；称取炒酸枣仁药材10g于250ml平底烧瓶中，加60%乙醇100ml回流提取2小时，取出，过滤，滤液在水浴挥干，残渣加10ml甲醇溶解，即为药材供试品溶液；准确称取缺酸枣仁药材的阴性样品，碾碎，粉末1.7g，加热水溶解，制备方法同上（过滤，滤液用萃取3次，每次40ml石油醚，弃去石油醚层，水层用水饱和正丁醇萃取5次，每次40ml水饱和正丁醇，合并正丁醇层，于80℃水浴挥干，残渣用适量热水溶解，吸取3ml上大孔吸附树脂柱，吸附30分钟，用100ml水、100ml30%乙醇、100ml50%乙醇依次冲洗，收集50%乙醇的洗脱液，水浴挥干，残渣加甲醇1.5ml溶解），得阴性样品溶液；准确称取酸枣仁皂苷A对照品10.00mg于10ml容量瓶中，用色谱甲醇溶解并定容，摇匀，其浓度为1.00mg/ml；分别吸取上述制剂薄层供试品溶液、药材供试品溶液和阴性样品溶液5μl及酸枣仁皂苷A对照品溶液5μl点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以13：7：2的氯仿-甲醇-水为展开剂，饱和25分钟，上行展开；以0.1%香草醛4%硫酸乙醇 溶液为显色剂，用热风吹至显色清晰，可见光下检视；结果供试品色谱中，在对照品色谱相应的位置上，制剂与对照品在相同位置上均显相同的绿色斑点，阴性样品无干扰。
前述的治疗睡眠障碍的薄膜包衣片的检测方法，还包括以下步骤：
徐长卿的鉴别；取本品10片，碾碎，准确称取粉末4g，加乙醚10ml，密塞，振摇10min，滤过，滤液挥干，残渣加丙酮1ml溶解，即为制剂样品溶液；准确称取徐长卿药材粗粉约1g，制备方法同上（加乙醚10ml，密塞，振摇10min，滤过，滤液挥干，残渣加丙酮1ml溶解），即为药材溶液；准确称取缺徐长卿药材的阴性制剂样品3g，制备方法同上（碾碎，加乙醚10ml，密塞，振摇10min，滤过，滤液挥干，残渣加丙酮1ml溶解），即得缺徐长卿药材阴性制剂样品溶液；精密称取丹皮酚对照品15.00mg于20ml容量瓶中，用色谱甲醇溶解并定容，摇匀，其浓度为0.75mg/ml；分别吸取上述制剂样品溶液、药材溶液、阴性制剂样品溶液丹皮酚对照品各15μl点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以10：2.5的正己烷-乙酸乙酯为展开剂，饱和20分钟，上行展开，晾干，以10%硫酸乙醇溶液为显色剂，105℃烘烤至斑点清晰，置365nm荧光下观察，结果供试品色谱中，在对照品色谱相应的位置上，制剂与对照品在相同位置上均显浅绿色主斑点，阴性样品无干扰。
前述的治疗睡眠障碍的薄膜包衣片的检测方法，还包括以下步骤：
蜘蛛香的鉴别；取本品5片，碾碎，准确称取粉末2g，加乙醚15ml，密塞，振摇15分钟，滤过，滤液挥干，残渣加1ml甲醇溶解，作为供试品溶液；准确称取蜘蛛香药材粗粉0.5g，制备方法同上（加乙醚15ml，密塞，振摇15分钟，滤过，滤液挥干，残渣加1ml甲醇溶解），作为药材溶液；准确称取缺蜘蛛香药材阴性制剂样品约1.5g，制备方法同上（碾碎，加乙醚15ml，密塞，振摇15分钟，滤过，滤液挥干，残渣加1ml甲醇溶解），作为阴性样品溶液；分别吸取上述供试品溶液、药材溶液和阴性样品溶液各4μl点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以10：2.5的正己烷-乙酸乙酯为展开剂，以10%硫酸乙醇溶液为显色剂显色，在105℃烘烤至斑点可见，可视光下观察，结果供试品色谱中，在对照品色谱相应的位置上，制剂与对照品在相同位置上均显相同的黄色主斑点，阴性样品无干扰。
前述的治疗睡眠障碍的薄膜包衣片的检测方法，还包括以下步骤：
细叶远志皂苷HPLC法含量测定，
（1）色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂； 流动相为55:45的甲醇和0.05％磷酸；流速为1.0ml/min；柱温为30℃；检测波长为202nm，理论塔板数以细叶远志皂苷峰计应不低于5000；
（2）对照品溶液的制备：精密称定细叶远志皂苷对照品10.00mg于10ml容量瓶中，用色谱甲醇溶解并定容，摇匀，即得浓度为 1.00mg/ml的对照品溶液；
（3）供试品溶液的制备：取本品10片，碾碎，准确称定约1000mg 于250ml平底烧瓶中，加入10%NaOH溶液100ml，水解2h，水解后取出，冷却，用盐酸调pH值至4～5，用水饱和的正丁醇萃取4次，合并正丁醇层，80℃水浴挥干，用甲醇溶解残渣并转移至25ml容量瓶中，定容，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；
（4）测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，按峰面积值采用外标一点法对制剂中的细叶远志皂苷进行含量计算；
本品每片含细叶远志皂苷（C36H55O12）不得少于2.5mg。
前述的治疗睡眠障碍的薄膜包衣片的检测方法，细叶远志皂苷HPLC法含量测定中，所述的用水饱和的正丁醇萃取4次，具体为，用100ml水饱和的正丁醇萃取一次，然后用水饱和的正丁醇萃取三次，每次用50ml水饱和的正丁醇萃取。
前述的治疗睡眠障碍的薄膜包衣片的检测方法，还包括以下步骤：
丹皮酚HPLC法含量测定，
（1）色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为62：38的甲醇和水；检测波长λ=274nm；流速为1.0ml/min；柱温为25℃；柱压为9.4MPa，理论塔板数以丹皮酚峰计应不低于5000；
（2）对照品溶液的制备：精密称取丹皮酚对照品10.00mg 于 20ml容量瓶中，用色谱甲醇溶解并定容，摇匀，即得对照品溶液，其浓度为0.50mg/ml；
（3）供试品溶液的制备：取本品5片，碾碎，准确称定约200mg于25ml量瓶中，加甲醇10ml，超声10min溶解，冷却后，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；
（4）测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，按峰面积值采用外标一点法对制剂中的丹皮酚进行含量计算；
本品每片含丹皮酚（C9H10C3）不得少于1.0mg。
前述的治疗睡眠障碍的薄膜包衣片的检测方法，丹皮酚HPLC法含量测定中，所述的超声为500w、50Hz的超声。
前述的治疗睡眠障碍的薄膜包衣片的检测方法，还包括以下步骤：
制剂中大类成分总皂苷UV法含量测定，
（1）测定条件：用比色法，547±2nm 为测定波长，显色剂为5％香草醛－冰醋酸溶液0.2ml和0.8ml高氯酸；
（2）对照品溶液的制备：精密称取人参皂苷Rb1对照品10.00mg于10ml容量瓶中，加入色谱甲醇溶解并定容，摇匀即得对照品溶液，其浓度为1.00mg/ml；
（3）供试品溶液的制备：取本品5片碾碎，准确称取细粉45mg于25ml容量瓶中，加入10ml热蒸馏水溶解，溶液置分液漏斗中，用石油醚脱脂3次，弃去石油醚层，水层用水饱和的正丁醇萃取4次， 合并正丁醇层于250ml分液漏斗中，用正丁醇的饱和水溶液80ml洗涤1次，弃去水层，正丁醇层于80℃水浴挥干，残渣用甲醇溶解并转移至25ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；
（4）测定法：准确移取1.5ml溶液于具塞比色管中，70℃水浴挥干甲醇，将挥干甲醇的比色管准确加入5％香草醛－冰醋酸溶液0.2ml和0.8ml高氯酸溶液，60℃密闭显色10min后，冰浴10min，再加入5ml冰醋酸摇匀后，以不加样的甲醇同法制备为随行空白，按照2010版药典一部紫外—可见分光光度法在547±2nm下进行吸光度的测定，测得总皂苷吸光度代入人参皂苷Rb1回归方程计算，即得；
本品每片含总皂苷以人参皂苷Rb1（C54H92C3）计不得少于15mg。
前述的治疗睡眠障碍的薄膜包衣片的检测方法，制剂中大类成分总皂苷UV法含量测定中，所述的用石油醚脱脂3次，具体为，用沸程为60～90℃的石油醚脱脂3次，每次10ml；所述的用水饱和的正丁醇萃取4次，具体为，用水饱和的正丁醇萃取4次，每次20ml。
前述的治疗睡眠障碍的薄膜包衣片的检测方法，还包括以下步骤：
形状检测，本薄膜包衣片除去薄膜包衣后完整光滑，无裂缝，硬度较好，淡棕色，色泽均匀，有特殊气味；
检查，应符合片剂项下相关的各项规定。
前述的治疗睡眠障碍的薄膜包衣片的检测方法，所述的薄膜包衣片可以按常规制剂工艺制备，或按以下步骤制成：
A. 按配方称取远志、酸枣仁（炒）、绞股蓝、萱草花四味药材， 用60％乙醇加热提取3次，得提取液，为A品；
B. 将A品趁热过400目滤布，减压浓缩回收乙醇后，得清膏为B品；
C. 将B品置于减压70℃烘箱中或微波真空干燥机中干燥，得干膏，粉碎后过五号筛，得干膏粉为C品；
D. 按上述配方取徐长卿、蜘蛛香二味药材，先洁净、干燥、灭菌，然后粉碎过六号筛，得粉末为D品；
E. 将C品与D品混合均匀，然后通过滚压法干法制粒，过五号筛，整粒，过二号筛，得颗粒为E品；
F. 将E品压片，包衣，质量检查，包装即成薄膜包衣片。
本发明在现有质量标准的基础上，增加了针对复方远枣宁神薄膜包衣片中的细叶远志皂苷、丹皮酚和大类成分总皂苷鉴别方法和含量测定方法；可以对复方远枣宁神薄膜包衣片的主要药物成分进行更有效控制，使得复方远枣宁神薄膜包衣片的质量监控水平有了很大的提高。既更有利于生产厂家和监督管理部门对产品质量的监测，也可以为医疗部门和患者的治疗提供更好的保障。
为了验证本发明检测方法的合理性，申请人对该方法进行了试验研究和筛选。
(一) 制剂中有效成分细叶远志皂苷的含量测定方法学研究
复方中君药远志中的五环三萜皂苷类（约4.7%）为其镇静催眠、安神益智、祛痰的活性成分,2010年版《中国药典》（一部）中以细叶远志皂苷作为对照品对远志药材进行含量测定，且细叶远志皂苷 （Tenuiform）是远志总皂苷碱水解生成的次级皂苷,远志总皂苷经碱水解均能转化为细叶远志皂苷，其测定不仅能反映远志总皂苷的含量，而且水解产物转化稳定，是控制含远志复方制剂内在质量较理想的指标，而有效成分是药效学的物质基础，此均与本复方制剂的功能主治相吻合，可在很大程度上反映和控制本品的内在质量，以此作为中药质量标准中的关键内容之一。
1. 最大吸收波长的确定
取细叶远志皂苷对照品溶液于紫外扫描仪上扫描（200～800nm），得出细叶远志皂苷最大吸收为201.8nm，再根据文献报道，故选择202nm为检测波长。
2. 色谱条件的选择与考察
为了验证方法学及测定结果的准确性与可靠性，本研究分别对不同色谱柱与不同流动相进行了考察。
2.1 不同色谱柱的选择
在提取工艺细叶远志皂苷方法学研究完成的基础上，只选择依利特OD柱5μm（4.6mm ×250mm）来进行方法学的研究,研究结果表明依利特OD柱5μm（4.6mm ×250mm）在分离细叶远志皂苷时，理论塔板数、分离度、对称性均能达到要求，所以依然选择依利特OD柱5μm（4.6mm×250mm）作为本次试验研究的色谱柱。
2.2 不同流动相比例的选择
在提取工艺方法学研究的基础上，选择了不同比例的乙腈-水、乙腈-0.05％磷酸、甲醇-0.05％磷酸作为流动相进行考察，检测波长 202nm，流速1ml/min,柱温25℃，进样量10μl，准确吸取3供试品溶液10μl注入液相色谱仪，记录，结果见表1。
表1 细叶远志皂苷含量测定不同比例乙腈-水与乙腈-0.05％磷酸的考察
由表1可见：用乙腈-水、乙腈-0.05％磷酸做流动相分离效果差，所得色谱峰很宽，理论塔板数低，故不选择作为分离细叶远志皂苷的流动相，又以下又对不同比例的甲醇-0.05%磷酸进行考察。结果见表2。
表2 细叶远志皂苷含量测定不同比例甲醇-0.05％磷酸的考察
由表2可见，甲醇-0.05％磷酸为（57:43）时，细叶远志皂苷峰没有完全分开且拖尾因子没有达到要求；而甲醇-0.05％磷酸为（56:44）、（55:45）与（53:47）时，虽然分离度与拖尾因子均达到要求，但（56:44）理论塔板数较低，（53:47）保留时间较长，而（55：45）时保留时间较短，各方面均达到要求，故最终选择甲醇-0.05％磷酸（55：45）作为分离细叶远志皂苷的流动相比例。
3. 系统适用性试验
色谱条件：流动相：甲醇-0.05％磷酸（55：45）；λ：202nm；流速：1.0ml/min；柱温：30℃。
3.1 分离度、对称度及理论塔板数
分别准确吸取细叶远志皂苷对照品溶液（浓度为259μg/ml）、样品溶液各10μl注入液相色谱仪，记录。结果见表3。
表3 制剂样品系统适用性试验考察结果
结果在本试验条件下，细叶远志皂苷的出峰时间为27分钟，分离度大于1.5，对称度在0.95～1.05之间，理论塔板数以细叶远志皂苷峰计，应不低于5000。
3.2 重复性试验
准取吸取细叶远志皂苷对照品溶液（浓度为259μg/ml）10μl，注入液相色谱仪，重复进样6次，记录峰面积，结果见表4。
表4 制剂样品重复性试验测定结果（n=6）
结果在本试验条件下，重复性试验结果RSD％=0.26%＜3% （n=6），故符合要求。
4. 样品前处理方法的考察
4.1 对制剂样品是否过滤的考察
为了减少两个生药粉对含测时的干扰，故考察了过滤对远志中有效成分细叶远志皂苷的含量是否会有影响。
样品溶液的制备：取同一批号复方远枣宁神薄膜包衣片10片，碾碎，分别准确称取约1000mg 各3份，其中样品①用100ml热水溶解，超声30分钟，取出后过滤，滤液蒸干，加入10%NaOH100ml，沸水浴水解2小时；样品②用100ml甲醇溶解，超声30分钟，80℃水浴挥干甲醇，残渣用10%NaOH100ml溶解，沸水浴中水解2小时；样品③直接加入10%NaOH100ml沸水浴中水解2小时。3个样品均水解后取出，冷却，调pH值至4～5，用水饱和的正丁醇萃取4次（50ml/每次），合并正丁醇层，80℃水浴挥干，用甲醇溶解残渣并转移至25ml容量瓶中，定容，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，准确吸取续滤液及细叶远志皂苷对照品溶液（浓度为259μg/ml）各10μl，注入液相色谱仪，记录，结果见表5。
表5 对制剂样品是否过滤的考察（n=2）
由表5可见，用热水溶解超声过滤与用甲醇溶解超声过滤的样品峰面积均下降约50%，表明远志中的细叶远志皂苷经过滤后损失较大，故不采用过滤的方法。
4.2 对制剂中远志总皂苷水解时间的考察
细叶远志皂苷是远志总皂苷碱水解生成的次级皂苷, 远志总皂苷经碱水解均能转化为细叶远志皂苷。为了考察不同水解时间对其影响，故分别水解2、3、4hr。
样品溶液的制备：取同一批号复方远枣宁神薄膜包衣片10片，碾碎，分别称取约1000mg各6份，分别置于250ml平底烧瓶中，加入10%NaOH溶液50ml，分别沸水解2hr、3hr、4hr，平行两份，水解后取出，冷却，调pH值至4～5，用水饱和的正丁醇萃取4次（50ml/每次），合并正丁醇层，80℃水浴挥干，用甲醇溶解残渣并转移至25ml容量瓶中，定容，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液10μl，注入液相色谱仪，记录，结果见表6。
表6 远志总皂苷不同水解时间的考察（n=2）
由表6可见，水解2、3、4hr的细叶远志皂苷含量差异不大，为了节省时间，故将水解时间确定为2hr为宜。
4.3 不同用量NaOH溶液水解对细叶远志皂苷含测影响的考察
样品溶液的制备：取同一批号复方远枣宁神薄膜包衣片15片，碾碎，分别精密称定1000mg各8份，分别置于250ml平底烧瓶中，加入10%NaOH溶液，①②加入10%NaOH溶液25ml，③④加入10%NaOH溶液50ml，⑤⑥加入10%NaOH溶液100ml，⑦⑧加入10%NaOH溶液125ml，水解2hr，平行两份，水解后取出，冷却，调pH值至4～5，用水饱和的正丁醇萃取4次（50ml/每次），合并正丁醇层，80℃水浴挥干，用甲醇溶解残渣并转移至25ml容量瓶中，定容，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，准确吸取续滤液10μl注入液相色谱仪，记录。结果见下表。
比较了不同的体积10%NaOH溶液水解后细叶远志皂苷的含量，结果见表7。
表7 细叶远志皂苷不同体积用量NaOH溶液水解的考察（n=2）
由表7可见，100ml的10％NaOH溶液水解后细叶远志皂苷含量高于25ml、50ml、75ml及125ml的NaOH溶液水解后的细叶远志皂苷含量，故选择100ml的10％NaOH溶液用来水解为宜。
4.4 石油醚及乙酸乙酯萃取对细叶远志皂苷含量影响的考察
4.4.1 石油醚萃取对细叶远志皂苷含量影响的考察
样品溶液的制备：取复方远枣宁神薄膜包衣片5片，碾碎，分别精密称定1000mg平行两份于250ml平底烧瓶中，加入10%NaOH溶液50ml，水解2hr，水解后取出，冷却，调pH值至4～5，用石油醚（沸程60～90℃）50ml萃取2次，合并石油醚层于80℃水浴挥干，水层继续用水饱和正丁醇萃取4次（50ml/每次），合并正丁醇层，80℃水浴挥干，用甲醇分别溶解石油醚与正丁醇残渣，并分别转移至25ml容量瓶中，定容，摇匀，得石油醚及正丁醇萃取液的样品溶液，分别用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液10μl注入液相色谱仪，记录，结果用石油醚萃取后，石油醚层几乎没有溶解细叶远志皂苷，而正丁醇层色谱图中峰形未见较大变化，对细叶远志皂苷峰基本没有改善，为了简便前处理步骤，故不用石油醚萃取。
4.4.2 乙酸乙酯萃取对细叶远志皂苷含量影响的考察
取复方远枣宁神薄膜包衣片5片，碾碎，分别准确称取约1000mg，加入50ml热蒸馏水溶解，用50ml乙酸乙酯萃取一次，乙酸乙酯层水浴挥干，水层中加入5gNaOH水解2hr，平行两份，水解后取出，冷却，调pH值至4～5，用水饱和正丁醇萃取四次（50ml/每次），合并正丁醇层，80℃水浴挥干，将乙酸乙酯残渣与正丁醇残渣分别定溶于25ml容量瓶中，摇匀，分别用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液10μl注入液相色谱仪，记录，结果见表8
表8 乙酸乙酯层与正丁醇层的比较
由表8可见，用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层中溶解了部分细叶远志皂苷，使正丁醇层中的细叶远志皂苷含量减少，故不采用乙酸乙酯萃取。
4.5 水饱和正丁醇萃取次数对细叶远志皂苷含量影响的考察
样品溶液的制备：取复方远枣宁神薄膜包衣片10片，碾碎，分别准确称取约1000mg各8份，分别置于250ml平底烧瓶中，加入100ml 10%NaOH溶液，水解2hr，平行两份，水解后取出，冷却，调pH值至4～5。①②用水饱和的正丁醇萃取3次（第一次100ml ，后二次50ml/每次），③④萃取4次，⑤⑥萃取5次，⑦⑧萃取6次，合并正丁醇层，80℃水浴挥干，用甲醇溶解残渣并转移至25ml容量瓶中，定容，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液10μl，注入液相色谱仪，记录。结果见表9。
表9 水饱和正丁醇萃取次数的考察
结果，由表9可见，随着萃取次数的增加，细叶远志皂苷含量增加，但4次、5次与6次之间只相差很小，为了简便前处理步骤，节约时间，故选择用水饱和正丁醇萃取4次为宜。
5. 专属性试验的考察
5.1 细叶远志皂苷对照品与样品溶液HPLC-MS扫描
为了验证样品中远志总皂苷经碱水解是否确实转化为细叶远志皂苷，故对细叶远志皂苷对照品及样品溶液进行了HPLC-MS扫描。
试验条件：
HP1100 LC-MSD，色谱工作站：HP Chenstation色谱工作站；离子源参数：大气压电喷雾（API-ES）；大气压化学电离（APCI）；色谱柱：依利特OD柱，5μm，4.6mm×250mm，柱号：E1919538；流动相：因为磷酸属于不易挥发的酸，不适合做HPLC-MS，故流动相改为甲醇-0.2％甲酸（53:47）。流速：1ml/min；λ：202nm；柱温：25℃。
样品溶液的制备：取复方远枣宁神薄膜包衣片剂10片，碾碎，准确称定约1000mg于250ml平底烧瓶中，加入10%NaOH溶液 100ml，分别水解2hr，平行两份，水解后取出，冷却，调pH值至4～5，用水饱和的正丁醇萃取4次（第一次100ml ，后三次50ml/每次），合并正丁醇层，80℃水浴挥干，用甲醇溶解残渣并转移至25ml容量瓶中，定容，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得。
分别采用正模式与负模式对对照品及样品溶液进行了质谱检验。结果如图1-图3所示。经HPLC-MS验证，由图4-图6可见，样品中远志总皂苷经碱水解确实均转化为细叶远志皂苷。
5.2 制剂样品专属性的考察
为了验证细叶远志皂苷含量测定方法有专属性，故制备了缺远志药材的阴性制剂样品。
缺远志药材阴性制剂样品的制备：准确称取缺远志药材阴性样品878mg于250ml平底烧瓶中，加入10％NaOH溶液100ml，沸水浴中水解2hr，放冷，用浓盐酸调pH值至4～5，用水饱和的正丁醇萃取4次（第一次100ml ，后三次50ml/每次），合并正丁醇层，80℃水浴挥干，用甲醇溶解残渣并转移至25ml容量瓶中，定容，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液10μl，注入液相色谱仪，重复进样2次，记录，结果缺远志药材的阴性制剂样品，在细叶远志皂苷相应的保留时间无干扰峰，主成分与各有关物质完全分离，故本实验条件专属性好。
6. 细叶远志皂苷的含量测定
6.1 色谱条件
流动相：甲醇-0.05％磷酸（55:45）；λ：202nm；流速：1.0ml/min； 柱温：30℃。理论塔板数以细叶远志皂苷峰计，应不低于5000；分离度﹥1.5；拖尾因子0.95～1.05。
6.2 线性关系考察
对照品溶液的配制 取细叶远志皂苷对照品储备液（1.85mg/ml），分别精密移取0.2ml,0.3 ml, 0.4ml,0.5ml,0.7ml,0.9ml于5ml容量瓶中，用色谱甲醇稀释至刻度，摇匀，得到一系列浓度的对照品溶液：74μg/ml、111μg/ml、148μg/ml、185μg/ml、259μg/ml、333μg/ml，分别吸取上述对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱， 以对照品进样量C(μg)对峰面积A（μV.S）进行线性回归计算，得线性回归方程：C=2.18×10-6A+4.5×10-4；相关系数r=0.9999；线性范围：0.74μg～3.33μg。结果如表10所示。
线性回归结果及含量计算方式选择的评价：① 对照品浓度与峰面积均呈线性关系（r=0.9999）；② 线性范围为4.5倍（0.74μg～3.33μg）；③用公式a/bX≤1.0%时，评价线性回归方程是否过原点，代入最小峰面积平均值计算，得出4.5×10-4/2.18×10-6A=0.06%＜1%，可近似认为a值很小，趋近于过原点，故采用外标一点法对制剂中的细叶远志皂苷进行含量计算。因其系统误差的控制在＜1%以内。
表10 细叶远志皂苷线性关系考察（n=3）
6.3精密度试验的考察
供试品溶液的制备：取同一批号复方远枣宁神薄膜包衣片5片，碾碎，准确称取约1000mg于250ml平底烧瓶中，制备方法同前，用0.45μm微孔滤膜滤过，准确吸取续滤液10μl，注入液相色谱仪，重复进样6次，记录，结果见表11。
表11 细叶远志皂苷含量测定的精密度试验考察
结果表明，细叶远志皂苷含量测定方法RSD％=0.14%(n=6)，故仪器精密度良好，符合要求。
6.3.1 中间精密度试验
仪器设备 岛津高效液相色谱仪LC-20AT，SPD-20A紫外检测器（SER1AL NO 20134405530）,泵1（L20114404484， P/N 228－45001－38），泵2（L20114404596， P/N 228－45001－38），HT-220A柱温箱。
色谱柱：依利特OD柱，5μm（4.6mm×250mm），柱号：E1919538。
色谱条件 流动相：甲醇-0.05％磷酸（55：45）；λ：202nm；流速：1.0ml/min；柱温：30℃。理论塔板数以细叶远志皂苷峰计，应不低于5000；分离度﹥1.5；拖尾因子0.95～1.05。
供试品溶液的制备 取同一批号复方远枣宁神薄膜包衣片5片，碾碎，准确称取约1000mg于250ml平底烧瓶中，制备同前,用0.45μm微孔滤膜滤过，即得。
精密度试验（Ⅰ）
仪器设备 设备编号：20062681（贵阳中医学院生药实验室）。
分别准确吸取续滤液及细叶远志皂苷对照品(浓度为259μg/ml)溶液各10μl，注入液相色谱仪，供试品溶液重复进样6次，记录，结果见表12。
表12 细叶远志皂苷含量测定中间精密度试验结果 (n=6)
结果表明，在本试验中细叶远志皂苷含量测定方法的精密度RSD %为1.5%(n=6)，故仪器精密度试验良好，符合要求。
精密度试验（Ⅱ）
仪器设备 设备编号：20062682（贵阳中医学院中药炮制实验室）。
分别准确吸取细叶远志皂苷对照品(浓度为259μg/ml)溶液及上配供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，供试品溶液重复进样6次，计算，结果见表13。
表13 细叶远志皂苷含量测定中间精密度试验结果 (n=6)
结果表明，在本试验中细叶远志皂苷含量测定方法的精密度RSD %=4%(n=6)。
精密度试验（Ⅲ）
仪器设备 设备编号：20062683（贵阳中医学院中药炮制实验室）。
分别准确吸取细叶远志皂苷对照品溶液(浓度为259μg/ml)及上配供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，供试品溶液重复进样6次，计算，结果见表14。
表14 细叶远志皂苷含量测定中间精密度试验结果 (n=6)
结果表明，在本试验中细叶远志皂苷含量测定方法的精密度RSD%=0.7%(n=6)，故仪器精密度良好，符合要求。
6.3.2 细叶远志皂苷的重现性试验
表15 细叶远志皂苷含量测定的的重现性试验结果
结果表明，用三种不同编号的高效液相色谱仪及不同人员操作所 测得的细叶远志皂苷的含量RSD％＜3%（n=6）。
7. 耐用性试验的考察
仪器设备、色谱条件及供试品溶液的制备同中间精密度试验。
7.1 不同色谱柱的考察
色谱柱：Diamonsil C18 5μm（4.6mm×250mm），ser.no8037243；依利特Hypersil OD 5μm（4.6mm×250mm），柱号：E1919538；Agela Promosil C18 5μm（4.6mm×250mm）；汉邦柱 C18 5μm（4.6mm×250mm），SN：09070802。
色谱条件 流动相：甲醇-0.05％磷酸（55：45）；λ：202nm；流速：1.0ml/min；柱温：30℃。
分别准确吸取细叶远志皂苷对照品溶液(浓度为259μg/ml)及上配供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，计算，结果见表16。
表16 不同品牌的色谱柱比较的耐用性试验（n=2）
结果表明：用Agela Promosil C18进行分离时，基线漂移严重，很长时间都没有平衡，故使用以上三种色谱柱进行分离；通过使用三种色谱柱进行分离，计算其含量的RSD%=0.4%＜3%，故用三种不 同品牌的色谱柱对细叶远志皂苷的含测影响较小，但Diamonsil C18柱的基线漂移较另两种色谱柱严重，而依利特柱的峰形又优于汉邦柱的，故建议进行细叶远志皂苷含测时首选依利特柱。
7.2 不同流动相比例的考察
供试品溶液制备方法同前中间精密度。
色谱条件 色谱柱：依利特Hypersil OD 5μm（4.6 mm×250 mm），柱号：E1919538；流动相：甲醇-0.05％磷酸；λ：202nm；流速：1.0ml/min；柱温：30℃。
分别准确吸取细叶远志皂苷对照品溶液(浓度为259μg/ml)及上配供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，计算，结果见表17。
表17 不同流动相比例变化比较的耐用性试验结果
由表17可见：在三种不同流动相比例下，分离度均＞1.5，计算其含量及RSD％值为0.5％（＜3%），符合要求，故三个不同流动相组成比例变化比较的耐用性试验结果表明，本方法在流动相组成比例略有变化时，对测定结果影响不大，耐用性能较好。但在55：45的比例下出峰时间短，为了达到快速、简便的目的，故最好选择流动相的比例为甲醇-0.05％磷酸（55：45）。
7.3 不同柱温的考察
色谱柱：依利特Hypersil OD 5μm（4.6 mm×250 mm），柱号： E1919538。
流动相：甲醇-0.05％磷酸（55：45）；λ：202nm；流速：1.0ml/min-1；
分别准确吸取细叶远志皂苷对照品溶液(浓度为259μg/ml)及上配供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，计算，结果见表18。
表18 不同柱温变化比较的耐用性试验结果
由表18可见：当柱温升高时（35℃、40℃），其分离效果较差，分离度均＜1.5，不符合要求，故在分离细叶远志皂苷时，选择柱温为30℃为宜。
7.4 耐用性试验小结：
①通过对不同色谱柱的考察得出，用Agela Promosil C18进行分离时，基线漂移严重，很长时间都没有平衡；而其他三种色谱柱分离度均＞1.5，符合要求，故三种色谱柱在分离细叶远志皂苷时对其含量测定没有影响，但从对称因子来看，依利特柱分离的色谱峰峰形较好，故首选依利特柱。
②通过对三种不同流动相的考察，得出甲醇-0.05％磷酸（55：45）的比例下出峰时间短，为了达到快速简便的目的，故选择流动相的比例为甲醇-0.05％磷酸（55：45）。
③通过对不同柱温的选择得出，随着柱温升高，细叶远志皂苷的 分离度降低，并且35℃、40℃情况下，没有分开，故柱温选择为30℃。
8. 重复性试验的考察
供试品溶液的配制：取同一批号复方远枣宁神薄膜包衣片5片，碾碎，准确称取约1000mg，共6份，分别置于250ml平底烧瓶中，制备方法同前精密度试验考察下方法。
分别准确吸取细叶远志皂苷对照品（浓度259μg/ml）溶液及上配供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，供试品溶液各重复进样2次，计算，结果见表19。
表19 细叶远志皂苷含量测定的重复性试验考察（n=2）
试验结果表明，细叶远志皂苷含量测定方法的重复性试验平均含量为0.6391％，RSD％ =1.5％(n=6)，样品重复性试验结果良好，故符合相关质量标准方法学研究的效能指标要求。
9. 稳定性试验的考察
供试品溶液制备方法同前精密度试验考察方法。
测定：分别准确吸取细叶远志皂苷对照品（浓度259μg/ml）溶液及上配用0.45μm微孔滤膜滤过的供试品溶液各10μl，间隔相应时间进样1次，记录，结果见表20。
表20 细叶远志皂苷含量测定的稳定性试验
注：含量相对百分比是以0hr为100％计算的。
结果表明，样品在12hr内基本保持稳定，RSD％＝0.18％（n＝6），所以样品配制后最好在12hr内测定结果较好。
10. 加样回收率试验
样品溶液的制备：取复方远枣宁神薄膜包衣片10片，碾碎，精密称取粉末9份，每份约250mg于250ml平底烧瓶瓶中，其中1～3号精密加入相当于其样品中细叶远志皂苷含量的80%的细叶远志皂苷对照品品溶液，4～6号精密加入相当于其样品中细叶远志皂苷含量的100%的细叶远志皂苷对照品溶液，7～9号精密加入相当于其样品中细叶远志皂苷含量的120%的细叶远志皂苷对照品溶液。样品处 理方法同精密度试验考察方法。取上述溶液用0.45μm微孔滤膜滤过，准确吸取续滤液及对照品溶液（浓度为259μg/ml）各10ul注入液相色谱仪，记录，结果见表21。
表21 细叶远志皂苷含量测定加样回收率试验（n=9）
结果表明，本复方中细叶远志皂苷含量测定方法有较好的加样回收率结果，平均回收率为99.88％，RSD％＝0.4％（n=9），故符合要求，所得数据准确性较高。
（二） 制剂中丹皮酚含量测定的方法学研究
本复方制剂中徐长卿含挥发性的成分丹皮酚，对易挥发性成分丹皮酚建立相应的含量测定方法，规定含量范围，控制其含量，则有利于控制制剂质量，保证制剂质量的稳定性，故将丹皮酚作为指标性成分来控制制剂的质量及稳定性，选择高效液相色谱法对制剂中的丹皮酚进行含量测定的方法学研究。
1. 最大吸收波长的确定
取丹皮酚对照品溶液于安捷伦1100液相色谱仪上用DAD检测器扫描，得出丹皮酚的最大吸收波长为274nm，故选择274nm为丹皮酚的检测波长。
2. 色谱条件的选择与考察
为了验证方法学及测定结果的准确性与可靠性，本研究分别选择了不同色谱柱与不同流动相及超声时间的考察。
2.1 不同色谱柱的选择
分别对依利特OD柱5μm（4.6 mm×250 mm）、迪马Diamonsil C18 5μm（4.6 mm×250 mm）柱、迪马kromasil C18柱（4.6 mm×250 mm）及Agilent短柱进行了比较，色谱条件：流动相：甲醇-水（45：55）；λ=274nm；流速：1.0ml/min；柱温：25℃；结果见表22。
表22 丹皮酚含量测定不同色谱柱的比较
由表22可见，每个色谱柱分离丹皮酚时均有拖尾，但Diamonsil C18 5μm（4.6 mm×250 mm）柱分离效果优于其他色谱柱，对称性相对较好，且理论塔板数、分离度均能达到要求，所以选用Diamonsil C18 5μm（4.6 mm×250 mm）柱作为本次试验研究的色谱柱。
2.2 不同流动相的选择
首先参照并依据2010版药典（一部）牡丹皮项下含测的色谱条 件：流动相甲醇-水，检测波长λ=274nm；流速：1.0ml/min；柱温：25℃；上述供试品溶液用0.45μm微孔滤膜滤过，准确吸取续滤液及对照品溶液（浓度29.68μg/ml）各10ul注入液相色谱仪，记录。结果见表23。
表23 丹皮酚含量测定不同比例甲醇-水的考察
结果，按药典方法分离较好，出峰时间也较短，为了节约时间，提高效率，调整流动相比例后，结果甲醇-水（62：38）时出峰快且分离度良好但略有拖尾，为了改善峰形，故又对甲醇-磷酸、甲醇-冰醋酸进行了考察，结果见表24。
表24 丹皮酚含量测定不同比例流动相（甲醇-0.05％磷酸）的考察
由表24可见，拖尾因子仍未达到要求，故又增加了流动相中磷酸的浓度进行考察，结果见表25。
表25 丹皮酚含量测定不同比例流动相（甲醇-0.10％磷酸）的考察
由表25可见，拖尾因子仍没有达到要求，故又对甲醇-0.05%冰 醋酸进行考察，结果见表26。
表26 丹皮酚含量测定不同比例流动相（甲醇-0.05％冰醋酸）的考察
由表26可见，不同比例的甲醇－冰醋酸依然对该峰的对称性没有改善，故又对不同比例流动相甲醇-三乙胺进行了考察，结果见表27。
表27 丹皮酚含量测定不同比例流动相甲醇-三乙胺的考察
由表27可见，不同比例的流动相甲醇-三乙胺也未能改善丹皮酚色谱峰的对称性，并且峰面积减少，故流动相仍确定为甲醇-水（62：38）为宜。
3.系统适用性试验
色谱条件：流动相：甲醇-水（62：38）；λ：274nm；流速：1.0ml.min-1；柱温：25℃。理论塔板数以丹皮酚峰计算，应不低于5000。
3.1 分离度、对称度及理论塔板数
分别准确吸取丹皮酚对照品溶液（浓度29.68μg/ml）、供试品溶液各10μ注入液相色谱仪，结果见表28。
表28 丹皮酚含量测定系统适用性试验考察结果
结果在本试验条件下，丹皮酚的出峰时间为12分钟，分离度大于1.5，拖尾因子在0.95～1.077之间，理论塔板数以丹皮酚峰计，应不低于5000。
3.2 重复性试验
准确吸取丹皮酚对照品溶液（浓度29.68μg/ml）10μl，注入液相色谱仪，重复进样6次，记录并计算，结果见表29。
表29 丹皮酚含量测定重复性试验
由结果可见，RSD％=0.16%＜3%，故重复性良好。
4. 样品超声时间的考察
因为丹皮酚经超声提取溶于甲醇中进行含量测定，故考察不同超声时间对其含量的影响。
供试品溶液的制备：取同一批号复方远枣宁神薄膜包衣片5片， 碾碎，准确称取6份，每份约200mg，置25ml量瓶中，加甲醇适量，其中①②超声10分钟，③④超声20分钟，⑤⑥超声30分钟，超声（500W，50kHZ）后，取出，放冷，定容，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，准确吸取续滤液及对照品溶液（浓度29.68μg/ml）各10ul注入液相色谱仪，记录。如表30所示。
表30 丹皮酚含测制剂样品不同超声时间的考察
由表30可见，随着超声时间延长，丹皮酚含量增加，但幅度很小，为了节约时间，故将超声时间确定为10min为宜。
5. 制剂样品专属性的考察
制剂样品溶液的制备：准确称取同一批号制剂样品200mg，置25ml量瓶中，加甲醇适量，超声（500W，50kHZ）10min溶解，放冷后，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得。
缺徐长卿药材阴性制剂样品溶液的制备：准确称取缺徐长卿药材阴性制剂样品150mg，于25ml容量瓶中，制备方法同上，用0.45μm微孔滤膜滤过，准确吸取上述2种样品续滤液及对照品溶液（浓度29.68μg/ml）各l0μl,注入高效液相色谱仪，重复进样2次，记录，结果缺徐长卿药材的阴性制剂样品，在丹皮酚相应的保留时间均无干扰峰，主成分也与各有关物质完全分离，故该方法对于本复方制剂中丹皮酚的含量测定具有专属性。
6. 线性关系的考察
对照品溶液的配制 取丹皮酚对照品储备液（浓度为7.42mg.ml-1），分别精密移取0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml分别至25ml的量瓶中，用色谱甲醇分别稀释至刻度，摇匀，得一系列浓度的对照品溶液： 0.5936μg/ml、11.872μg/ml、17.808μg/ml、23.744μg/ml、29.68μg/ml，分别吸取上述对照品溶液各10μl，注 入液相色谱仪，记录色谱， 以对照品进样量C（μg）对峰面积A（μV.S）进行线性回归计算，得线性回归方程：C= 1.67×10-7A -1.75×10-4；相关系数r = 0.9999；线形范围：0.05936μg～0.2968μg。结果如表31所示。
线性回归结果及含量计算方式选择的评价：① 对照品浓度与峰面积均呈线性关系（r=0.9999）；② 线性范围为5倍（0.05936μg～0.2968μg）；③用公式a/bX≤1.0%时，评价线性回归方程是否过原点，代入最小峰面积平均值计算，得出得出1.75×10-4/1.67×10-6A=0.31%＜1%，可近似认为a值很小，趋近于过原点，故采用外标一点法对制剂中的丹皮酚进行含量计算。因其系统误差的控制在＜1%以内。
表31 丹皮酚线性关系考察（n=2）
7. 精密度试验的考察
供试品溶液的配制： 取同一批号的复方远枣宁神薄膜包衣片5片，碾碎，精密称取0.1998g，至25ml量瓶中，制备方法同前，用0.45μm微孔滤膜滤过，准确吸取续滤液10μl，注入液相色谱仪，重复进样6次，记录，结果见表32。
表32 丹皮酚含量测定的精密度试验（n=6）
结果表明，丹皮酚含量测定方法RSD%=0.4%＜3%，表明仪器精密度良好，符合要求。
7.1 中间精密度试验
仪器设备 岛津高效液相色谱仪LC-20AT，SPD-20A紫外检测器（SER1AL NO 20134405530）,泵1（L20114404484， P/N 228－45001－38），泵2（L20114404596， P/N 228－45001－38），HT-220A柱温箱。
色谱柱：Diamonsil C18，5μm（4.6mm ×250mm）。
色谱条件 流动相：甲醇-水（62：38）；检测波长λ=274nm；流速1.0ml/min；柱温：25℃；柱压：9.4MPa，理论塔板数以丹皮酚峰计，应不低于5000。
供试品溶液的制备 取同一批号的复方远枣宁神薄膜包衣片5片，碾碎，精密称取0.1997g，至25ml量瓶中，制备方法同前，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得。
精密度试验（Ⅰ）
仪器设备 设备编号：20062681（贵阳中医学院生药实验室）。
分别准确吸取供试品续滤液及对照品溶液（浓度29.68μg/ml）各l0μl,注入液相色谱仪，供试品溶液重复进样6次，记录，结果见表33。
表33 丹皮酚含量测定中间精密度试验 (n=6)
结果表明，在本试验中丹皮酚含量测定方法的精密度RSD %=1.8%(n=6)，表明仪器精密度良好，符合要求。
精密度试验（Ⅱ）
仪器设备 设备编号：20062682（贵阳中医学院中药炮制实验室）。
分别准确吸取续滤液及丹皮酚对照品(浓度29.68μg/ml)溶液各10μl，注入液相色谱仪，供试品溶液重复进样6次，记录，结果见表34。
表34 丹皮酚含量测定中间精密度试验(n=6)
结果表明，在本试验中丹皮酚含量测定方法的精密度RSD %=2.3%(n=6)，表明仪器精密度良好，符合要求。
精密度试验（Ⅲ）
仪器设备 设备编号：20062683（贵阳中医学院中药炮制实验室）。
分别准确吸取续滤液及丹皮酚对照品(浓度29.68μg/ml)溶液各10μl，注入液相色谱仪，供试品溶液重复进样6次，记录，结果见表35。
表35 丹皮酚含量测定中间精密度试验(n=6)
结果表明，在本试验中丹皮酚含量测定方法的精密度RSD%=2.1%＜3% (n=6)，故仪器精密度良好，符合要求。
7.2 丹皮酚中间精密度重现性试验
表36 丹皮酚含量测定的重现性试验结果
结果表明，如表36所示，用三种不同编号的高效液相色色谱仪及不同人员操作所测得的丹皮酚的含量RSD％=2.3%＜3%，故精密度良好，符合相关质量标准方法学研究的效能指标要求。
8. 耐用性试验的考察
仪器设备、色谱条件及供试品溶液的制备同中间精密度试验。
8.1 不同色谱柱的考察
色谱柱：Diamonsil C18 5μm（4.6 mm×250 mm），ser.no 8037243；依利特Hypersil OD 5μm（4.6 mm×250 mm），柱号： E1919538；Agela Promosil C18 5μm（4.6 mm×250 mm）；汉邦柱 C18 5μm（4.6 mm×250 mm），SN：09070802。
色谱条件：流动相：甲醇-水（62：38）， 检测波长λ=274nm，流速1.0ml/min，柱温：25℃。柱压：9.4MPa，理论塔板数以丹皮酚峰计，应不低于5000。
供试品溶液的制备同7.1项下。
表37 丹皮酚含测不同品牌色谱柱比较的耐用性试验
由表37可见，用依利特柱分离丹皮酚时，分离度没有达到要求，故不能用来分离该复方中的丹皮酚；而汉邦柱 C18的分离度也略＜1.5，而Diamonsil C18柱与Agela C18分离度＞1.5，符合要求，故Diamonsil C18柱与Agela C18柱均可用于测定及分离该复方中丹皮酚。
8.2 不同柱温的考察
色谱柱：Diamonsil C18 5μm（4.6 mm×250 mm），ser.no 8037243；
色谱条件：流动相：甲醇-水（62：38）；检测波长λ=274nm；流速1.0ml/min；柱温：25℃。
供试品溶液的制备 取同一批号的复方远枣宁神薄膜包衣片5 片，碾碎，精密称取200.1mg，至25ml量瓶中，制备方法同前，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得。
表38 丹皮酚含测中不同柱温变化比较的耐用性试验（n=2）
由上表可见：在三种不同柱温的条件下，其分离效果均较好，分离度均＞1.5，符合要求，RSD%=1.6%＜3%，故在分离丹皮酚时，三种条件均可，符合相关质量标准方法学研究的效能指标要求。
8.3 不同检测波长的考察
色谱柱：Diamonsil C18，5μm（4.6mm ×250mm），ser.no 8037243；
色谱条件 流动相：甲醇-水（62：38）；检测波长λ=274nm；流速1.0ml/min；柱温：25℃。
供试品溶液的制备同8.2项下。
表39 不同检测波长下的耐用性试验结果（n=2）
由表39可见：在三种不同检测波长下，其分离效果均较好，分离度均＞1.5，符合要求；但RSD%=4%＞3%，在274nm下的对称度较好，故在分离丹皮酚时，检测波长首选274nm。
8.4 耐用性试验小结：
① 通过对不同色谱柱的考察得出，用依利特柱分离丹皮酚时，分离度没有达到要求，故不能用来分离该复方中的丹皮酚；汉邦柱 C18的分离度也略＜1.5， 而Diamonsil C18柱与Agela C18分离度＞1.5，符合要求，故将Diamonsil C18柱与Agela C18柱作为分离该复方中丹皮酚的首选色谱柱。
②在三种不同柱温的条件下，其分离效果均较好，分离度均＞1.5，RSD%=1.6%＜3%，符合要求。故在分离丹皮酚时，三种条件均可，也符合相关质量标准方法学研究的效能指标要求。
③在三种不同检测波长下，其分离效果均较好，分离度均＞1.5，但 RSD%=4%＞3%，在274nm下的对称度较好，故在分离丹皮酚时，检测波长首选274nm。
9. 重复性试验
供试品溶液的配制：取同一批号复方远枣宁神薄膜包衣片5片， 碾碎，称取6份，每份约200mg，置25ml量瓶中，制备同前。
分别准确吸取丹皮酚对照品（浓度29.68μg/ml）溶液及上配供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，供试品溶液各重复进样2次，计算，结果见表40。
表40 丹皮酚含量测定的重复性试验 (n=6)
结果表明，重复性试验平均含量为0.29%，RSD%=2.2%(n=6)，样品重复性试验结果良好，故符合相关质量标准方法学研究的效能指标要求。
10. 稳定性试验
供试品溶液的制备 取同一批号的复方远枣宁神薄膜包衣片5片，碾碎，精密称取201.1mg，至25ml量瓶中，制备方法同前，用 0.45μm微孔滤膜滤过，即得。
分别准确吸取丹皮酚对照品（浓度29.68μg/ml）溶液及上配供试品溶液各10μl，分别在不同时间（0，1，2，3，4，6，8hr）测定，记录，结果见表41。
表41 丹皮酚含量测定的稳定性考察
（注：含量百分比是以0hr的含量为100％计算）
结果表明，样品在8小时内基本保持稳定，RSD％=0.3％，所以样品配制后最好在8小时内测定结果较好。
11. 加样回收率试验
样品溶液的制备： 取同一批号复方远枣宁神薄膜包衣片5片，碾碎，准确称取9份，每份约90mg于容量瓶中，其中1～3号精密加入相当于其样品中丹皮酚含量的80%的丹皮酚标准品溶液，4～6号精密加入相当于其样品中丹皮酚含量的100%的丹皮酚标准品溶液，7～9号精密加入相当于其样品中丹皮酚含量的120%的丹皮酚标准品溶液。供试品溶液配制方法同前精密度试验考察方法。取上述溶 液用0.45μm微孔滤膜滤过，准确吸取续滤液及对照品溶液（浓度为29.68μg/ml）的各10ul注入液相色谱仪，记录，结果见表42。
表42 丹皮酚含量测定的加样回收率试验（n=2）
结果表明，本复方制剂中丹皮酚含量测定方法有较好的加样回收率结果，平均回收率为99.83％，RSD％＝0.6％（n=9），故符合要求，所得数据准确性较高。
（三） 制剂中大类成分总皂苷含量测定方法学的研究
该复方制剂在提取的4味药材中，有三味药材含有三萜皂苷类，根据查阅相关文献资料，三萜皂苷类成分是本方中具有镇静安神作用的主要有效成分，故选择总皂苷类的含量作为本研究中大类有效成分的测定指标，以提高制剂产品质量的可控性，因为药材绞股蓝中含有人参皂苷Rb1，故选择人参皂苷Rb1作为对照品，所测总皂苷的含量均以人参皂苷Rb1计。
1. 人参皂苷Rb1对照品溶液的配制
精密称取人参皂苷Rb1对照品11.39mg于10ml容量瓶中，加入色谱甲醇溶解并定容，得对照品储备液浓度为1.139mg/ml。再精密移取此对照品储备液1ml于25ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得到浓度为45.56μg/ml。
2. 试验条件的选择及考察
为了验证方法学及测定结果的准确可靠，本试验分别考察了显色剂的种类、石油醚脱脂次数、水饱和正丁醇萃取次数、正丁醇的饱和水溶液的洗涤次数、甲醇挥干温度、显色时间，显色温度、冰浴时间等条件。
2.1 显色剂的选择
在提取工艺总皂苷方法学研究中所选用显色剂为香草醛－高氯酸，但由于其不稳定，必须现用现配，故我们对直接用高氯酸也进行了考察。
2.1.1 显色剂的配制
准确称取香草醛粉末0.5g于10ml容量瓶中，加入适量冰醋酸超声溶解，放冷，用冰醋酸稀释至刻度，摇匀即得5％香草醛－冰醋酸溶液。
2.1.2 两种显色剂的比较
取远枣宁神薄膜包衣片10片，准确称取约45mg，平行2份，于25ml容量瓶中，用适量热水溶解，用同体积的石油醚脱脂2次（10ml/每次），弃去石油醚层，水层用水饱和正丁醇萃取2次（20ml/每次），合并正丁醇层，用正丁醇饱和的水溶液40ml洗涤一次，正 丁醇层于80℃水浴挥干，用适量甲醇溶解，并定容于25ml容量瓶中，准确各吸取2ml于2根具塞比色管中，80℃水浴挥干甲醇。
①香草醛－高氯酸显色
取一份准确加入5％香草醛－冰醋酸溶液0.2ml和0.8ml高氯酸溶液，60℃密闭显色10min后，冰浴10min，再加入5ml冰醋酸摇匀后，以不加样的甲醇同法制备为随行空白，按照2010版药典一部紫外——可见分光光度法(附录VA)进行可见光区的扫描（200～800nm）。
②高氯酸显色
取另一份直接加入1ml高氯酸，60℃密闭显色10min后，冰浴10min，再加入5ml冰醋酸摇匀后，以不加样的甲醇同法制备为随行空白，按照2010版药典一部紫外——可见分光光度法(附录V A)进行可见光区的扫描（200～800nm），
结果高氯酸显色其最大吸收在277.76nm附近，其靠近干扰区，所测结果误差较大，而香草醛一高氯酸其最大吸收在546.56nm附近，没有干扰，并且香草醛一高氯酸为常用显色剂，显色灵敏度高，试剂空白溶液色浅，常用作三萜皂苷的显色剂。其反应机理可能是皂苷在强氧化性酸的作用下脱氢，氧化后再与香草醛加成。显色后，香草醛一高氯酸能与皂苷反应形成特征的紫红色。所以将显色剂确定为5％香草醛－冰醋酸溶液0.2ml和0.8ml高氯酸。
2.2 最大选择吸收波长的确定
准确移取45.56μg/ml的人参皂苷Rb1对照品2ml于具塞比色管 中，80℃水浴挥干甲醇，将挥干甲醇的比色管精密加入5％香草醛－冰醋酸溶液0.2ml和0.8ml高氯酸溶液，60℃密闭显色10min后，冰浴10min，再加入5ml冰醋酸摇匀后，以不加样的甲醇同法制备为随行空白，按照2010版药典一部紫外—可见分光光度法(附录V A)进行可见光区的扫描（400～800nm）。
扫描结果所示表明，人参皂苷Rb1对照品溶液在546.56nm处有最大吸收（随行空白溶液在此处无吸收），故选择547±2nm 为测定波长。
2.3 制剂样品是否超声提取时间的考察
取远枣宁神薄膜包衣片10片，碾碎，准确称取约45mg各6份于10ml容量瓶中，加入适量热水溶解，其中①号超声5 min，②号超声10 min，③号超声20 min，④超声30 min，⑤超声40 min，制备方法同3.1.2。取2ml样品以不加样的甲醇同法制备为随行空白，在547±2nm下进行紫外扫描，结果见表43。
表43 远枣宁神薄膜包衣片中总皂苷含量测定超声提取时间的考察（n=2）
注：由于超声提取使总皂苷测定的吸光度增大，为了减少误差，使测得吸光度的值在0.3～0.7，故在超声10min后，样品的取样量均改为30mg。
由表43可见，随着超声时间的延长，总皂苷的吸光度逐渐增大，但是其最大吸收波长均紫移，故不采用超声这一步骤。
2.4 制剂样品是否过滤的考察
由于远枣宁神薄膜包衣片中的徐长卿、蜘蛛香直接以生药粉入药，在样品处理前最好要先除去生药粉，以免对总皂苷的测定有干扰，故考察了过滤前后样品的吸光度。结果见表44。
表44 对制剂样品是否过滤的考察（n=2）
由表44可见，过滤的供试品吸光度下降了50%，主要是因为过滤对总皂苷损失较多，故确定不采用过滤步骤。
2.5 石油醚脱脂次数的考察
石油醚脱脂后在可见光区有最大吸收，可使紫外吸收曲线变窄， 故进行了脱脂次数的考察。
取远枣宁神薄膜包衣片10片，碾碎，准确称取约45mg各3份，于25ml容量瓶中，加入适量热蒸馏水使之溶解后，将其置入分液漏斗中用同体积石油醚脱脂（10ml/每次），分别脱脂2次、3次、4次，弃去石油醚层，水层分别用水饱和正丁醇萃取3次（20ml/每次），合并正丁醇层于250ml分液漏斗中，用正丁醇的饱和水溶液80ml洗涤1次，弃去水层，正丁醇层70℃减压浓缩至干，残渣用甲醇溶解并转移至25ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，准确移取2ml、3ml、4ml溶液于具塞比色管中，80℃水浴挥干甲醇，将挥干甲醇的比色管准确加入5％香草醛－冰醋酸溶液0.2ml和0.8ml高氯酸溶液，60℃密闭显色10min后，冰浴10min，再加入5ml冰醋酸摇匀后，以不加样的甲醇同法制备为随行空白，在547±2nm 下测定其吸光度。结果见表45。
表45 制剂中总皂苷含测石油醚脱脂次数的考察（n=2）
由表45可见，脱脂次数（2次、3次、4次）对总皂苷的吸光度有一定的影响，脱脂3次的吸光度最大，并且脱脂3次时不同体积的测定结果成线性关系，故石油醚脱脂次数选择3次为宜。
2.6 水饱和正丁醇萃取次数的考察
经资料查阅，皂苷类成分在水饱和正丁醇中溶解性最好，故选择 水饱和正丁醇作为萃取溶剂。因水溶液体积约10ml，故正丁醇萃取量，每次以20ml正丁醇（双倍体积量），考察了萃取的次数：3次、4次、5次。样品制备方法见石油醚脱脂的方法，以不加样的甲醇同法制备为随行空白，在547±2nm 下进行测定。结果见表46。
表46 制剂中总皂苷含测的水饱和正丁醇萃取次数的考察（n=2）
由表46可见，随着萃取次数的增多，吸光度增大，且萃取4次与5次之间吸光度相差较小，但萃取5次时最大吸收波长已超过547±2nm的范围，紫移较大，故水饱和正丁醇萃取次数选择4次为宜。
2.7 正丁醇的饱和水溶液洗涤次数的考察
实验证明，用正丁醇的饱和水溶液洗涤可去掉正丁醇层中的一些杂质，使吸收峰变窄，故对其洗涤次数进行了考察，目的既要除去杂质又不降低总皂苷含量，故考察了洗涤次数（1次、2次、3次）。样品制备方法同石油醚脱脂次数考察的方法，以不加样的甲醇同法制备为随行空白，在547±2nm 下进行测定。结果见表47。
表47 制剂中总皂苷含测正丁醇的饱和水溶液洗涤次数的考察（n=2）
由表47可见，用正丁醇的饱和水溶液洗涤次数增加，吸光度降低较大，且最大吸收波长紫移，故洗涤次数选择1次为宜。
以上样品前处理的考察结果小结：制剂样品溶于适量热水中，滤液用同体积石油醚脱脂3次，弃去石油醚层，水层用水饱和正丁醇萃取4次（20ml/每次），合并正丁醇层，再用正丁醇饱和的水80ml洗涤1次，弃去水层，正丁醇层于80℃水浴挥干，残渣溶于适量甲醇，并定容于25ml容量瓶中。
2.8 甲醇挥干温度的考察
显色前需先将甲醇挥去，为了确定甲醇挥干温度对总皂苷含量是否会有影响，故考察了甲醇挥干的温度（60℃、70℃、80℃、沸水）。样品制备方法见上述3.7的考察小结，以不加样的甲醇同法制备为随行空白，在547±2nm 下进行测定，结果见表48。
表48 制剂中总皂苷含测甲醇挥干温度的考察（n=2）
由表48可见，随着甲醇挥干温度的升高，吸光度略增大，但由70℃升高到沸水时，吸光度反而降低，可能是因为80℃及沸水温度已经超过甲醇的沸点，挥干比较剧烈，使皂苷类成分结构破坏所致，故将甲醇挥干温度定为70℃为宜。
2.9 显色条件的选择
2.9.1显色温度的考察
显色时的温度对于总皂苷测定时的吸光度影响很大，为了找出最佳显色温度，显色后是否稳定？故对显色温度进行了考察。样品制备方法见考察小结，甲醇挥干温度定为70℃，以不加样的甲醇同法制备为随行空白，在547±2nm下进行测定，结果见表49。
表49 显色温度的考察（n=2）
由表49可见，显色温度越高，吸光度越大，但其最大吸收波长 紫移越多，而60℃下显色的吸光度较高，并且最大吸收波长接近547±2nm，故显色温度确定为60℃。
2.9.2 显色时间的考察
显色时间对于总皂苷测定时的吸光度影响同样很大，所以对其进行了考察。样品制备方法见考察小结，甲醇挥干温度定为70℃，显色温度为60℃。
以不加样的甲醇同法制备为随行空白，在547±2nm 下进行测定。结果见表50。
表50 制剂总皂苷含量测定中显色时间的考察（n=2）
由表50可见，显色时间越长，吸光度越大，但其最大吸收波长已发生紫移到530nm处，故显色20分钟及30分钟对FFYZNS片中总皂苷含测有很大影响，而显色10分钟的吸光度最大吸收波长在547±2 nm处，故选择显色时间以10分钟为宜。
表51 显色10分钟后对于稳定性影响的考察（n=2）
由表51可见，考察其稳定性时发现，随着时间延长，吸光度逐渐降低，但最大吸收波长均在547±2nm范围内，故显色时间确定为 10分钟为宜。
2.9.3 冰浴时间的考察
将上述处理好的样品溶液分别准确移取1.5ml于两根比色管中，于70℃水浴挥干甲醇后，准确加入5％香草醛－冰醋酸溶液0.2ml和0.8ml高氯酸溶液，60℃密闭显色10min后，分别冰浴各5min、10min，再各加入5ml冰醋酸摇匀后，以不加样的甲醇同法制备为随行空白，在547±2nm下进行测定，结果见表52。
表52 制剂总皂苷含量测定中冰浴时间的考察（n=2）
注：因为选用的溶剂为冰醋酸，其冰点低（16℃），冰浴时间越长，显色溶剂的温度就会越低，加入冰醋酸后密度越小，自身吸光度就会增加，会造成测定结果的虚高，故没有对冰浴20分钟、30分钟等进行考察。
由表52可见随着冰浴时间的延长，吸光度略增大，并且冰浴10分钟其最大吸收波长在547±2nm附近，故冰浴时间确定为10分钟。
2.10 远枣宁神薄膜包衣片专属性的考察
因本复方中远志，酸枣仁及绞股蓝中均含有镇静安神的皂苷类成分，为了验证复方远枣宁神薄膜包衣片中总皂苷含量测定方法有否专属性，故制备了缺远志、酸枣仁及绞股蓝阴性制剂样品。
缺远志、酸枣仁及绞股蓝阴性制剂样品的制备：准确称取缺3味药的阴性制剂样品约27mg于25ml容量瓶中，制备方法同前，以不加样的甲醇同法制备为随行空白，在547±2nm下进行吸光度的测 定，阴性制剂样品吸光度应小于0.04以下。结果见表53。
表53 制剂样品与却总皂苷阴性制剂样品的比较（n=4）
由表53可见阴性制剂样品与制剂样品的吸光度比值约为25%，阴性制剂样品吸光度必须低于制剂样品吸光度5%以下，说明采用紫外分光光度法测定FFYZNS片中的总皂苷含量时，阴性制剂样品存在干扰。
为了排除阴性制剂样品的干扰，故对制剂样品及阴性制剂样品的前处理方法重新进行了如下研究。
2.10.1 乙醚及石油醚脱脂比较的考察
由于乙醚的脱脂效果优于石油醚，首先对制剂样品与缺3味药的阴性制剂样品进行了脱脂的考察，结果见表54。
表54 制剂样品中乙醚及石油醚脱脂比较的考察
由表54可见，用石油醚与乙醚脱脂，缺3味药阴性制剂样品的吸光度均有所降低，但用乙醚脱脂的制剂样品与阴性制剂样品的最大 吸收波长均红移，而石油醚脱脂制剂样品及阴性制剂样品的最大吸收波长仍然在546.56nm处，故仍选用石油醚进行脱脂为宜。
2.10.2 大孔树脂分离的考察
通过进一步的查阅文献资料，大孔吸附树脂对分离纯化皂苷类成分通常有较好的效果，故我们又对制剂样品及阴性制剂样品过大孔吸附树脂柱（D101型、HPD100型）各进行了考察，分别以水及20%80%的乙醇及40%、70%、100%甲醇溶液分别进行了洗脱，但通过紫外扫描结果得出，过两种大孔吸附树脂柱所测得的阴性制剂样品及制剂样品的吸光度之比依然大于5%，故依然没有达到消除阴性干扰的目的。
2.10.3分级沉淀法的考察
对样品进行前处理后，准确吸取供试品溶液4ml，浓缩至1ml，分别用石油醚、乙醚、丙酮及乙醚：丙酮（1:1）混合溶剂分别精制总皂苷，同法显色后，在547nm下进行紫外扫描，通过扫描结果可知采用分级沉淀精制总皂苷的过程中，依然没有消除阴性制剂样品的干扰，并且制剂样品的吸光度下降较多，故不采取此法。
2.11 样品前处理制备的总结
经过以上各步骤的考察，确定紫外分光光度法测定中总皂苷含量样品的处理方法为，取复方远枣宁神薄膜包衣片10片碾碎，准确称取细粉45mg于25ml容量瓶中，加入适量热蒸馏水溶解，溶液置分液漏斗中，用同体积石油醚（沸程60～90℃）脱脂3次（10ml/每次），弃去石油醚层，水层用水饱和的正丁醇萃取4次（20ml/每次），合并 正丁醇层于250ml分液漏斗中，用正丁醇的饱和水溶液80ml洗涤1次，弃去水层，正丁醇层于80℃水浴挥干，残渣用甲醇溶解并转移至25ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，准确移取1.5ml溶液于具塞比色管中，70℃水浴挥干甲醇，将挥干甲醇的比色管准确加入5％香草醛－冰醋酸溶液0.2ml和0.8ml高氯酸溶液，60℃密闭显色10min后，冰浴10min，再加入5ml冰醋酸摇匀后，以不加样的甲醇同法制备为随行空白，按照2010版药典一部紫外—可见分光光度法(附录V A)在547±2nm下进行吸光度的测定。
2.12 注意事项
①采用香草醛一高氯酸比色法对FFYZNS片中总皂苷进行定量测定时，显色反应过程中吸光度随加热时间和温度的改变而变化，测定时要严格按照操作步骤进行。
②所用的香草醛一冰醋酸溶液要现用现配，否则空白值的颜色会加深，影响测定的结果。
③紫外分光光度法测定总皂苷的含量，误差较HPLC法大，为了得到准确可靠的试验结果，每次应平行称取2份样品，分别显色后每份样品再各测2次吸光度值，取4次测定值的平均值。
3. 线性关系的考察
人参皂苷Rb1对照品储备液（1.139mg/ml）中分别精密移取0.40ml、0.48ml、0.56ml、0.64ml、0.80ml于5ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，得到了一系列的不同浓度的人参皂苷Rb1对照品：91.12μg/ml、109.344μg/ml、127.568μg/ml、145.792μg/ml、 182.24μg/ml。分别各精密移取1.00ml不同浓度人参皂苷Rb1对照品溶液于7根具塞比色管中，70℃水浴挥干甲醇，将挥干甲醇的比色管准确加入新配置的5％香草醛－冰醋酸溶液0.2ml和0.8ml高氯酸溶液，60℃密闭显色10min后，冰浴10min，再加入5ml冰醋酸摇匀后，以不加对照品的甲醇同法制备为随行空白，在547±2nm下进行测定。以对照品的量（μg）对吸光度A进行线性回归，得线性回归方程：C=357.14A-1.06。
①相关系数r=0.9996；②线形范围：91.12～182.24μg；③用公式a/bX≤1.0%对所得直线进行评价，将最小吸光度平均值带入，得出1.06/357.14A=1.95%﹥1%，故采用标准曲线法对制剂样品中的总皂苷进行含量测定；结果见表55。
表55 远枣宁神薄膜包衣片总皂苷含量测定线性关系的考察（n=3）
4. 精密度试验的考察
取复方远枣宁神薄膜包衣片10片，碾碎，准确称取45mg于25ml容量瓶中，方法同前，以不加样的甲醇同法制备为随行空白，在547±2nm下进行测定，测得总皂苷吸光度代入人参皂苷Rb1回归方程计算。结果见表56。
表56 远枣宁神薄膜包衣片中总皂苷含量测定的精密度试验（n=2）
结果表明，在本试验中总皂苷含量测定方法的精密度RSD％=1.9%﹤3％（n=6），故仪器有较好的精密度，符合要求。
4.1 中间精密度试验
4.1.1精密度试验（Ⅰ）
仪器设备：紫外分光光度计；型号：UV2501PC；产地：日本岛津；设备编号20010529；
供试品溶液的制备：方法同前，以不加样的甲醇同法制备为随行空白，在547±2nm下进行测定，测得总皂苷吸光度代入人参皂苷Rb1回归方程计算。结果见表57。
表57 制剂总皂苷含测中间精密度试验考察Ⅰ（n=2）
结果表明，在本试验中总皂苷含量测定方法的精密度RSD％=1.8%﹤3％（n=6），故仪器精密度良好，符合要求。
4.1.2 精密度试验（Ⅱ）
仪器设备：紫外分光光度仪GBC(INTRA20)，澳大利亚照生公司；设备编号20060789
供试品溶液的制备：方法同前5，以不加样的甲醇同法制备为随行空白，在547±2nm下进行测定，测得总皂苷吸光度代入人参皂苷Rb1回归方程计算。结果见表58。
表58 制剂中总皂苷含测中间精密度试验考察Ⅱ（n=2）
由表58可见，在本试验中总皂苷含量测定的精密度为RSD％=2.6%﹤3％（n=6）。
4.1.3 精密度试验（Ⅲ）
仪器设备：紫外分光光度仪GBC(INTRA20)，澳大利亚照生公司；设备编号20060788
供试品溶液的制备：方法同前，以不加样的甲醇同法制备为随行空白，在547±2nm下进行测定，测得总皂苷吸光度代入人参皂苷Rb1回归方程计算。结果见表59。
表59 制剂中总皂苷含测中间精密度试验考察Ⅲ（n=2）
由表59可见，在本试验中总皂苷含量测定的精密度为RSD％=2.2%﹤3％（n=6），故仪器有较好的精密度，符合要求。
4.2 总皂苷含测的重现性试验
表60 总皂苷含测的重现性试验结果
结果表明，如表60所示，用三种不同品牌及编号的紫外分光光度计及不同人员操作所测得的总皂苷的吸光度RSD％=2.6%＜3%，故方法及仪器精密度良好。
5. 重复性试验的考察
取同一批号远枣宁神薄膜包衣片10片，碾碎，准确称取约45mg各6份，分别于25ml容量瓶中，制备方法同前，以不加样的甲醇同法制备为随行空白，在547±2nm下进行测定，测得总皂苷吸光度代入人参皂苷Rb1回归方程计算。结果见表61。
表61 总皂苷含量测定的重复性试验考察（n=6）
试验结果表明，总皂苷含量测定方法的重复性试验考察RSD%=1.2﹤3％（n=6），重复性良好，符合要求。
6. 稳定性试验的考察
取远枣宁神薄膜包衣片10片，碾碎，准确称取45mg于25ml容量瓶中，制备方法同前。
6.1 样品溶液的稳定性考察
为了解经过以上处理所得到的样品甲醇溶液在多长时间内测定结果较为可靠，考察了样品甲醇溶液在8hr内的稳定性。
将甲醇溶液每隔1h准确移取1ml溶液于具塞比色管中，70℃水浴挥干甲醇，将挥干甲醇的比色管准确加入5％香草醛－冰醋酸溶液0.2ml和0.8ml高氯酸溶液，60℃密闭显色10min后，冰浴10min，再加入5ml冰醋酸摇匀后，以不加样的甲醇同法制备为随行空白在547±2nm下进行测定，结果见表62。
表62 总皂苷含量测定的样品溶液稳定性考察（n=2）
注：吸光度相对百分比是以0hr的平均吸光度为100％计算。
结果表明，RSD%=2.5%﹤3％（n=6）;该样品的甲醇溶液未显色时，在6hr内显色测定结果较为稳定。
6.2 显色后的稳定性考察
为了解样品溶液显色后在多长时间内测定结果可靠，故考察了溶液显色后的稳定性。
取远枣宁神薄膜包衣片10片，碾碎，准确称取45mg于25ml容量瓶中，制备方法同前，以不加样的甲醇同法制备为随行空白，每隔10min在547±2nm下进行测定，结果见表63。
表63 制剂中总皂苷含量测定的样品溶液显色后的稳定性考察（n=2）
注：吸光度相对百分比是以0hr的平均吸光度为100％计算的。
结果表明，样品总皂苷含量测定时，显色后的样品溶液在30min内测定结果基本保持稳定，RSD%＝2.8％（n＝6），在70min时吸光度已下降为0hr的91.95％，故样品显色后最好在30min内测定结果较好。
7. 加样回收率试验
准确称取样品6份，每份约23mg于10ml容量瓶中，在每份样品中分别加入2.1ml人参皂苷Rb1对照品溶液（45.56μg/ml）,制备方法同，以不加样的甲醇同法制备为随行空白，在547±2nm下进行测定，测得总皂苷吸光度代入人参皂苷Rb1回归方程计算。结果下表64。
表64 远枣宁神薄膜包衣片中总皂苷含量测定加样回收率的考察（n=2）
结果表明，总皂苷含量测定方法平均加样回收率为98.12％， RSD％=1.4<3％(n=6)，故准确度较好，结果可靠，符合相关质量标准方法学研究的效能指标要求。
（四） 制剂中六味药的薄层鉴别的方法学研究
复方远枣宁神薄膜包衣片中君药远志与酸枣仁均含有三萜皂苷类成分，此类成分为镇静催眠的有效成分；臣药绞股蓝中三萜类总皂苷及多糖类对中枢神经系统尚有显著的镇静、催眠、抗紧张、抗疲劳、抗抑郁作用；萱草花中总黄酮类也有明显的镇静作用；徐长卿中含挥发性成分及其他成分有镇静、催眠作用；蜘蛛香的环烯醚萜类也有明显的镇静、镇痛作用。薄层色谱鉴别的方法，是中药材真实性鉴别的重要手段之一，具有快速、直观、信息量大、灵敏及专属性强的特点，能够从一个方面反映中药材的质量，控制该复方制剂的质量，故对3个批号制剂样品中的6味药材进行薄层鉴别。
A. 试验方案设计思路
建立本制剂6味药材的薄层鉴别中3个验证系统，制备多张图谱进行鉴别,以达到充分利用色谱信息，提高鉴别效率，能从多个侧面反映复方制剂的整体特征。
B. 评价指标
以对照药材或对照品对3个批次复方远枣宁神薄膜包衣片中的6味药材进行药材真实性的薄层鉴别，以求控制制剂的内在质量，体现出该条件下本制剂的特征。
1. 君药远志的薄层鉴别
远志在2010版药典中收载的品种有远志（Polygala tenuifolia Willd.）及卵叶远志（Polygala sibirica L.）两种，参照并依据2010版中国药典（一部）远志项下的鉴别试验，应对复方制剂中远志药材及缺远志的阴性制剂样品进行薄层鉴别。但由于本实验中远志药材来源并不明确是何品种,当多基源中药材薄层鉴别行为不同时,则可采用对照品来进行对照，因远志的2个来源均含有细叶远志皂苷，应采用细叶远志皂苷对照品作为对照，而不宜采用远志药材作对照。故在本实验中，只对复方中远志药材的有效成分细叶远志皂苷作为对照品与制剂样品、缺远志的阴性制剂样品进行薄层鉴别。
1.1 对照品溶液的制备
精密称取细叶远志皂苷对照品18.50mg，于10ml容量瓶中，用色谱甲醇溶解并定容，摇匀，其浓度为1.85mg/ml。
1.2 制剂供试品溶液的制备
取同一批号复方远枣宁神薄膜包衣片5片，碾碎，准确称取粉末1g，置于250ml平底烧瓶中，加入10%NaOH溶液50ml，水解2小时，取出冷却至室温，用浓HCL调节pH4～5，用水饱和正丁醇萃取三次，每次50ml，挥干正丁醇，溶于6ml甲醇，静置，取上清液即为供试品溶液。
1.3 缺远志阴性样品溶液的制备
称取缺远志药材的阴性样品0.88g，配制方法同1.2，溶于6ml甲醇，静置，取上清液即为阴性样品溶液。
分别吸取上述两种溶液及细叶远志皂苷对照品溶液14μl点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水 （6：3：0.5）作为正系统展开剂，饱和25分钟；用10%硫酸乙醇溶液为显色剂；上行展开14cm；并以氯仿-无水乙醇-水（6：3：0.4）及二氯甲烷-甲醇-水（6：2：0.2）两个系统作为系统适用性验证系统进行验证，分别饱和25分钟；用10%硫酸乙醇溶液为显色剂；上行展开10cm左右；
结果：在105℃烘箱中烘至细叶远志皂苷斑点至紫红色，制剂与对照品在相同位置上均显紫红色斑点，斑点清晰，故亦能得到相似的分离效果；阴性样品无干扰，说明3批制剂中的远志有远志药材中的有效成分细叶远志皂苷。本鉴别专属性强，分离效果较好，本法灵敏、快速、简便，经3个批号样品试验，重现性好。
2.君药酸枣仁的薄层鉴别
2.1 酸枣仁皂苷A对照品溶液的制备
准确称取酸枣仁皂苷A对照品11.2mg于10ml容量瓶中，用色谱甲醇溶解并定容，摇匀，其浓度为1.12mg/ml。
2.2 酸枣仁药材溶液的制备
称取炒酸枣仁药材10g于250ml平底烧瓶中，加60%乙醇100ml回流提取2小时，取出，过滤，滤液在水浴挥干，残渣加10ml甲醇溶解，即为药材供试品溶液。
2.3 制剂供试品溶液的制备
准确称取同一批号复方远枣宁神薄膜包衣片，碾碎，粉末2g，加热水40ml溶解，过滤，滤液用石油醚萃取3次（40ml/每次），弃去石油醚层，水层用水饱和正丁醇萃取5次（40ml/每次），合并正丁 醇层，于80℃水浴挥干，残渣用适量热水溶解，吸取3ml上大孔吸附树脂柱，吸附30分钟，用100ml水、100ml30%乙醇、100ml50%乙醇依次冲洗，收集50%乙醇洗脱液，水浴挥干，残渣加甲醇1.5ml溶解，即为制剂薄层供试品溶液。
2.4 缺酸枣仁药材阴性制剂溶液的制备
准确称取复方远枣宁神薄膜包衣片碾碎粉末1.64g，加热水溶解，制备方法同上制剂薄层供试品溶液的制备。
分别吸取上述三种溶液15μl及酸枣仁皂苷A对照品溶液5μl点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水（13：7：2）为正系统展开剂，并以氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水（1.5：5：3.5：1）与正丁醇-冰醋酸-水（4：1：5）作为系统适用性试验验证系统进行验证，分别饱和25分钟，上行展开。以0.1%香草醛4%硫酸乙醇溶液为显色剂，用热风吹至显色清晰，可见光下检视。
结果在薄层色谱上，酸枣仁药材与3批制剂样品在与对照品溶液同一位置上有相同的绿色斑点，斑点清晰，故亦能得到相似的分离效果；阴性制剂样品无干扰，说明制剂中的酸枣仁来自酸枣仁药材。本鉴别专属性强，分离效果较好，本法灵敏、快速、简便，经3个批号样品试验，重现性好。
3. 臣药绞股蓝的薄层鉴别
3.1 人参皂苷Rb1对照品溶液的制备
精密称取人参皂苷Rb1对照品11.39mg于10ml容量瓶中，加入色谱甲醇溶解并定容，得对照品储备液浓度为1.139mg/ml。
3.2 绞股蓝药材溶液的制备
准确称取绞股蓝药材10g，加100ml60%乙醇，超声提取40分钟，过滤，滤液浓缩至5ml过D101型大孔树脂柱，吸附30分钟，分别用水、20%乙醇、40%乙醇、50%乙醇、70%乙醇各50ml冲洗，收集50%洗脱液，水浴挥干，用1ml甲醇溶解即为供试品。
3.3 制剂供试品溶液的制备
准确称取同一批号制剂样品碾碎粉末2g，混合，加热水30ml溶解，趁热过滤，制备方法同上。用1ml甲醇溶解即为制剂供试品。
3.4 缺绞股蓝药材阴性制剂样品的制备
准确称取缺绞股蓝药材制剂样品碾碎粉末2g，制备方法同上，用1ml甲醇溶解即为阴性制剂供试品。
分别吸取上述三种供试品40μl点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水（13：7：2）为展开剂，10%硫酸乙醇溶液为显色剂，用热风吹至显色清晰，可见光下检视。
注意事项：用热风吹时，时间比较长，待人参皂苷Rb1对照品斑点清晰为止。
结果在薄层色谱上，绞股蓝药材与3批制剂样品在与对照品溶液同一位置上有相同紫色斑点，斑点清晰，故亦能得到相似的分离效果；阴性样品无干扰，说明制剂中的绞股蓝来自绞股蓝药材。本鉴别专属性强，分离效果较好，本法灵敏、快速、简便，经3批样品试验，重现性好。
4. 萱草花的薄层鉴别
4.1 萱草花药材溶液的制备
准确称取萱草花药材10g于平底烧瓶中，加入80%乙醇150ml浸泡过夜后，超声1小时，滤过，滤液置于水浴上挥至适量，冷却，以同体积的石油醚（沸程60～90℃）萃取3次，弃去石油醚层，水层至水浴上挥干，加5ml甲醇溶解，即得萱草花药材供试品溶液。
4.2 制剂供试品的制备
准确称取同一批号制剂样品碾碎粉末3g，加入60%乙醇40ml溶解，过滤，滤液水浴挥至适量，冷却，以同体积的石油醚（沸程60～90℃）萃取3次，弃去石油醚层，水层水浴挥干，加5ml甲醇溶解，即得制剂薄层供试品溶液。
4.3 缺萱草花药材阴性制剂样品的制备
准确称取缺萱草花药材阴性制剂样品3g，加入60%乙醇40ml溶解，方法同前。
① 分别准确吸取上述三种溶液各15μl点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（10：3：1：2）为展开剂，饱和20分钟，上行展开，晾干，以5%三氯化铝乙醇溶液为显色剂，置365nm荧光下观察，结果在薄层色谱板上，萱草花药材、3批制剂样品及缺萱草花阴性制剂样品均有相同绿色的荧光，因为萱草花药材以黄酮类成分为指标性成分进行鉴别，而制剂中远志、酸枣仁中均含有黄酮类成分，而缺萱草花药材的阴性制剂样品的干扰可能来自于以上2味药，故萱草花鉴别阴性样品有干扰。
② 调整不同的展开剂继续对萱草花进行薄层鉴别，分别准确吸 取分别吸取上述三种溶液各15μl点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5：4：1）为展开剂，饱和20分钟，上行展开，晾干，以5%三氯化铝乙醇溶液为显色剂，置365nm荧光下观察，结果在薄层色谱板上，萱草花药材、3批制剂样品及缺萱草花阴性制剂样品均仍有相同绿色的荧光，故萱草花鉴别阴性样品仍然有干扰。
5. 制剂中徐长卿的薄层鉴别
5.1 丹皮酚对照品的制备
精密称取丹皮酚对照品14.84mg于20ml容量瓶中，用色谱甲醇溶解并定容，摇匀，其浓度为0.742mg/ml。
5.2 徐长卿药材溶液的制备
依照10版药典丹皮酚薄层鉴别的方法来进行考察。准确称取徐长卿药材粗粉约1g，加乙醚10ml，密塞，振摇10min，滤过，滤液挥干，残渣加丙酮1ml溶解，即为药材溶液。
5.3 制剂供试品的制备
准确称取同一批号制剂碾碎粉末4g，制备方法同上，即为制剂样品溶液
5.4 缺徐长卿药材阴性制剂样品的制备
准确称取缺徐长卿药材的阴性制剂样品3g，制备方法同上，即得缺徐长卿药材阴性制剂样品。
①分别吸取上述三种溶液及丹皮酚对照品各15μl点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯（10： 2.5）、环己烷-氯仿-乙酸乙酯（10：2：1）及环己烷-乙酸乙酯（10：2.5）为展开剂，饱和20分钟，上行展开，晾干，以10%硫酸乙醇溶液为显色剂，105℃烘烤至斑点清晰，置365nm荧光下观察，结果在薄层色谱板上，徐长卿药材与制剂供试品在于丹皮酚对照品相应位置上均有一模糊斑点，因丹皮酚在高温下挥发导致斑点不清，而徐长卿药材与制剂样品在同一位置有相同浅绿色主斑点，斑点清晰，故亦能得到相似的分离效果；阴性样品无干扰，说明制剂中的徐长卿来自于徐长卿药材。本鉴别专属性强，分离效果较好，本法灵敏、快速、简便，经3批样品试验，重现性好。
②因丹皮酚在高温下易挥发导致其斑点不清，故采用丹皮酚专属显色剂5%盐酸酸性三氯化铁进行显色，分别吸取上述三种溶液及丹皮酚对照品各15μl点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯（3：1）为展开剂，饱和20分钟，上行展开，晾干，以5%盐酸酸性三氯化铁乙醇溶液为显色剂，105℃烘烤至斑点清晰。
结果在薄层色谱板上，徐长卿药材与制剂供试品在于丹皮酚对照品相应位置上均有同一颜色斑点，而阴性样品无干扰，说明制剂中的丹皮酚来自徐长卿药材。本鉴别专属性强，分离效果较好，本法灵敏、快速、简便，经3批样品试验，重现性好。
6. 药材蜘蛛香的薄层鉴别
6.1 药材蜘蛛香的前处理
准确称取蜘蛛香药材粗粉0.5g，加乙醚15ml，密塞，振摇15分 钟，滤过，滤液挥干，残渣加1ml甲醇溶解，作为药材溶液。
6.2 制剂供试品的制备
准确称取制剂碾碎粉末2g，制备方法同上，残渣加甲醇1ml溶解，作为供试品溶液。
6.3 缺蜘蛛香药材阴性制剂样品的制备
准确称取缺蜘蛛香药材阴性制剂样品约1.5g，制备方法同上，残渣加甲醇1ml溶解，作为阴性样品。
分别吸取上述三种溶液各4μl点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯（10：2.5）为正系统展开剂，还以环己烷-丙酮-乙酸（10：3：0.1）及石油醚-丙酮-乙酸（10：2.5：0.1）为展开剂，以系统适用性试验作为验证系统进行验证，以10%硫酸乙醇溶液为显色剂显色，在105℃烘烤至斑点可见，可视光下观察，
结果在薄层色谱上，蜘蛛香药材制剂样品在同一位置有相同的黄色主斑点，斑点清晰，故亦能得到相似的分离效果；阴性样品无干扰，说明制剂中的蜘蛛香来自蜘蛛香药材。本鉴别专属性强，分离效果较好，本法灵敏、快速、简便，经3批样品试验，重现性好。
附图说明
图1是本发明制剂中有效成分细叶远志皂苷的含量测定方法学研究中细叶远志皂苷对照品与样品溶液HPLC-MS扫描中细叶远志皂苷对照品正模式MS图；
图2是本发明制剂中有效成分细叶远志皂苷的含量测定方法学 研究中细叶远志皂苷对照品与样品溶液HPLC-MS扫描中样品中细叶远志皂苷正模式MS图；
图3是本发明制剂中有效成分细叶远志皂苷的含量测定方法学研究中细叶远志皂苷对照品与样品溶液HPLC-MS扫描中细叶远志皂苷对照品负模式MS图；
图4是本发明制剂中有效成分细叶远志皂苷的含量测定方法学研究中制剂样品专属性的考察中细叶远志皂苷对照品色谱图；
图5是本发明制剂中有效成分细叶远志皂苷的含量测定方法学研究中制剂样品专属性的考察中细叶远志皂苷制剂样品色谱图；
图6是本发明制剂中有效成分细叶远志皂苷的含量测定方法学研究中制剂样品专属性的考察中缺远志药材的阴性制剂样品色谱图。
注：图3中因细叶远志皂苷在负模式下响应值低，所以只在正模式下进行HPLC-MS扫描。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例：
一种治疗睡眠障碍的薄膜包衣片的检测方法，所述复方远枣宁神薄膜包衣片按重量份由远志179g，酸枣仁（炒）268g，绞股蓝143g，徐长卿179 g，萱草花143 g和蜘蛛香107gg共制成1000片，（每片约重0.5克）包括以下步骤：
远志的鉴别；取本品5片，碾碎，准确称取粉末1g，置于250ml平底烧瓶中，加入10%NaOH溶液50ml，水解2小时，冷却至室温， 用浓HCL调节pH至pH为4～5，用水饱和正丁醇萃取三次，每次50ml，挥干正丁醇，溶于6ml甲醇，静置，取上清液即为供试品溶液；称取缺远志药材的阴性样品0.88g，配制方法同前（置于250ml平底烧瓶中，加入10%NaOH溶液50ml，水解2小时，冷却至室温，用浓HCL调节pH至pH为4～5，用水饱和正丁醇萃取三次，每次50ml，挥干正丁醇），溶于6ml甲醇，静置，取上清液即为阴性样品溶液；精密称取细叶远志皂苷对照10.00mg，于10ml容量瓶中，用色谱甲醇溶解并定容，摇匀，浓度为1.00mg/ml；分别吸取上述供试品溶液、阴性样品溶液及细叶远志皂苷对照品溶液14μl点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以6：3：0.5的氯仿-甲醇-水作为展开剂，饱和25分钟；用10%硫酸乙醇溶液为显色剂；上行展开14cm；在105℃烘箱中烘至细叶远志皂苷斑点至紫红色，结果供试品色谱中，在对照品色谱相应的位置上，制剂与对照品在相同位置上均显紫红色斑点，阴性样品无干扰。
该检测方法还包括以下步骤：
酸枣仁（炒）的鉴别；取本品5片，碾碎，准确称取粉末2g，加热水40ml溶解，过滤，滤液用萃取3次，每次40ml石油醚，弃去石油醚层，水层用水饱和正丁醇萃取5次，每次40ml水饱和正丁醇，合并正丁醇层，于80℃水浴挥干，残渣用适量热水溶解，吸取3ml上大孔吸附树脂柱，吸附30分钟，用100ml水、100ml30%乙醇、100ml50%乙醇依次冲洗，收集50%乙醇的洗脱液，水浴挥干，残渣加甲醇1.5ml溶解，即为制剂薄层供试品溶液；称取炒酸枣仁药材10g 于250ml平底烧瓶中，加60%乙醇100ml回流提取2小时，取出，过滤，滤液在水浴挥干，残渣加10ml甲醇溶解，即为药材供试品溶液；准确称取缺酸枣仁药材的阴性样品，碾碎，粉末1.7g，加热水溶解，制备方法同上（过滤，滤液用萃取3次，每次40ml石油醚，弃去石油醚层，水层用水饱和正丁醇萃取5次，每次40ml水饱和正丁醇，合并正丁醇层，于80℃水浴挥干，残渣用适量热水溶解，吸取3ml上大孔吸附树脂柱，吸附30分钟，用100ml水、100ml30%乙醇、100ml50%乙醇依次冲洗，收集50%乙醇的洗脱液，水浴挥干，残渣加甲醇1.5ml溶解），得阴性样品溶液；准确称取酸枣仁皂苷A对照品10.00mg于10ml容量瓶中，用色谱甲醇溶解并定容，摇匀，其浓度为1.00mg/ml；分别吸取上述制剂薄层供试品溶液、药材供试品溶液和阴性样品溶液5μl及酸枣仁皂苷A对照品溶液5μl点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以13：7：2的氯仿-甲醇-水为展开剂，饱和25分钟，上行展开；以0.1%香草醛4%硫酸乙醇溶液为显色剂，用热风吹至显色清晰，可见光下检视；结果供试品色谱中，在对照品色谱相应的位置上，制剂与对照品在相同位置上均显相同的绿色斑点，阴性样品无干扰。
该检测方法还包括以下步骤：
徐长卿的鉴别；取本品10片，碾碎，准确称取粉末4g，加乙醚10ml，密塞，振摇10min，滤过，滤液挥干，残渣加丙酮1ml溶解，即为制剂样品溶液；准确称取徐长卿药材粗粉约1g，制备方法同上（加乙醚10ml，密塞，振摇10min，滤过，滤液挥干，残渣加丙酮 1ml溶解），即为药材溶液；准确称取缺徐长卿药材的阴性制剂样品3g，制备方法同上（碾碎，加乙醚10ml，密塞，振摇10min，滤过，滤液挥干，残渣加丙酮1ml溶解），即得缺徐长卿药材阴性制剂样品溶液；精密称取丹皮酚对照品15.00mg于20ml容量瓶中，用色谱甲醇溶解并定容，摇匀，其浓度为0.75mg/ml；分别吸取上述制剂样品溶液、药材溶液、阴性制剂样品溶液丹皮酚对照品各15μl点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以10：2.5的正己烷-乙酸乙酯为展开剂，饱和20分钟，上行展开，晾干，以10%硫酸乙醇溶液为显色剂，105℃烘烤至斑点清晰，置365nm荧光下观察，结果供试品色谱中，在对照品色谱相应的位置上，制剂与对照品在相同位置上均显浅绿色主斑点，阴性样品无干扰。
该检测方法还包括以下步骤：
蜘蛛香的鉴别；取本品5片，碾碎，准确称取粉末2g，加乙醚15ml，密塞，振摇15分钟，滤过，滤液挥干，残渣加1ml甲醇溶解，作为供试品溶液；准确称取蜘蛛香药材粗粉0.5g，制备方法同上（加乙醚15ml，密塞，振摇15分钟，滤过，滤液挥干，残渣加1ml甲醇溶解），作为药材溶液；准确称取缺蜘蛛香药材阴性制剂样品约1.5g，制备方法同上（碾碎，加乙醚15ml，密塞，振摇15分钟，滤过，滤液挥干，残渣加1ml甲醇溶解），作为阴性样品溶液；分别吸取上述供试品溶液、药材溶液和阴性样品溶液各4μl点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以10：2.5的正己烷-乙酸乙酯为展开剂，以10%硫酸乙醇溶液为显色剂显色，在105℃烘烤至斑点 可见，可视光下观察，结果供试品色谱中，在对照品色谱相应的位置上，制剂与对照品在相同位置上均显相同的黄色主斑点，阴性样品无干扰。
该检测方法还包括以下步骤：：
细叶远志皂苷HPLC法含量测定，
（1）色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂； 流动相为55:45的甲醇和0.05％磷酸；流速为1.0ml/min；柱温为30℃；检测波长为202nm，理论塔板数以细叶远志皂苷峰计应不低于5000；
（2）对照品溶液的制备：精密称定细叶远志皂苷对照品10.00mg于10ml容量瓶中，用色谱甲醇溶解并定容，摇匀，即得浓度为1.00mg/ml的对照品溶液；
（3）供试品溶液的制备：取本品10片，碾碎，准确称定约1000mg mg于250ml平底烧瓶中，加入10%NaOH溶液100ml，水解2h，水解后取出，冷却，用盐酸调pH值至4～5，用水饱和的正丁醇萃取4次，合并正丁醇层，80℃水浴挥干，用甲醇溶解残渣并转移至25ml容量瓶中，定容，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；
（4）测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，按峰面积值采用外标一点法对制剂中的细叶远志皂苷进行含量计算；
本品每片含细叶远志皂苷（C36H55O12）不得少于2.5mg。
细叶远志皂苷HPLC法含量测定中，所述的用水饱和的正丁醇萃 取4次，具体为，用100ml水饱和的正丁醇萃取一次，然后用水饱和的正丁醇萃取三次，每次用50ml水饱和的正丁醇萃取。
该检测方法还包括以下步骤：
丹皮酚HPLC法含量测定，
（1）色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为62：38的甲醇和水；检测波长λ=274nm；流速为1.0ml/min；柱温为25℃；柱压为9.4MPa，理论塔板数以丹皮酚峰计应不低于5000；
（2）对照品溶液的制备：精密称取丹皮酚对照品10.00mg 于20ml容量瓶中，用色谱甲醇溶解并定容，摇匀，即得对照品溶液，其浓度为0.50mg/ml；
（3）供试品溶液的制备：取本品5片，碾碎，准确称定约200mg于25ml量瓶中，加甲醇10ml，超声10min溶解，冷却后，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；
（4）测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，按峰面积值采用外标一点法对制剂中的丹皮酚进行含量计算；
本品每片含丹皮酚（C9H10C3）不得少于1.0mg。
丹皮酚HPLC法含量测定中，所述的超声为500w、50Hz的超声。
该检测方法还包括以下步骤：
制剂中大类成分总皂苷UV法含量测定，
（1）测定条件：用比色法，547±2nm 为测定波长，显色剂为5％ 香草醛－冰醋酸溶液0.2ml和0.8ml高氯酸；
（2）对照品溶液的制备：精密称取人参皂苷Rb1对照品10.00mg于10ml容量瓶中，加入色谱甲醇溶解并定容，摇匀即得对照品溶液，其浓度为1.00mg/ml；
（3）供试品溶液的制备：取本品5片碾碎，准确称取细粉45mg于25ml容量瓶中，加入10ml热蒸馏水溶解，溶液置分液漏斗中，用石油醚脱脂3次，弃去石油醚层，水层用水饱和的正丁醇萃取4次，合并正丁醇层于250ml分液漏斗中，用正丁醇的饱和水溶液80ml洗涤1次，弃去水层，正丁醇层于80℃水浴挥干，残渣用甲醇溶解并转移至25ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；
（4）测定法：准确移取1.5ml溶液于具塞比色管中，70℃水浴挥干甲醇，将挥干甲醇的比色管准确加入5％香草醛－冰醋酸溶液0.2ml和0.8ml高氯酸溶液，60℃密闭显色10min后，冰浴10min，再加入5ml冰醋酸摇匀后，以不加样的甲醇同法制备为随行空白，按照2010版药典一部紫外—可见分光光度法在547±2nm下进行吸光度的测定，测得总皂苷吸光度代入人参皂苷Rb1回归方程计算，即得；
本品每片含总皂苷以人参皂苷Rb1（C54H92C3）计不得少于15 mg。
制剂中大类成分总皂苷UV法含量测定中，所述的用石油醚脱脂3次，具体为，用沸程为60～90℃的石油醚脱脂3次，每次10ml；所述的用水饱和的正丁醇萃取4次，具体为，用水饱和的正丁醇萃取4次，每次20ml。
Claims (10)
1.一种治疗睡眠障碍的薄膜包衣片的检测方法，其特征在于，所述薄膜包衣片按重量份由远志179g，酸枣仁（炒）268g，绞股蓝143g，徐长卿179 g，萱草花143 g和蜘蛛香107g共制成1000片，包括以下步骤：
远志的鉴别；取本品5片，碾碎，准确称取粉末1g，置于250ml平底烧瓶中，加入10%NaOH溶液50ml，水解2小时，冷却至室温，用浓HCL调节pH至pH为4～5，用水饱和正丁醇萃取三次，每次50ml，挥干正丁醇，溶于6ml甲醇，静置，取上清液即为供试品溶液；称取缺远志药材的阴性样品0.88g，配制方法同前，溶于6ml甲醇，静置，取上清液即为阴性样品溶液；精密称取细叶远志皂苷对照10.00mg，于10ml容量瓶中，用色谱甲醇溶解并定容，摇匀，浓度为1.00mg/ml；分别吸取上述供试品溶液、阴性样品溶液及细叶远志皂苷对照品溶液14μl点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以6：3：0.5的氯仿-甲醇-水作为展开剂，饱和25分钟；用10%硫酸乙醇溶液为显色剂；上行展开14cm；在105℃烘箱中烘至细叶远志皂苷斑点至紫红色，结果供试品色谱中，在对照品色谱相应的位置上，制剂与对照品在相同位置上均显紫红色斑点，阴性样品无干扰。
2.根据权利要求1所述的治疗睡眠障碍的薄膜包衣片的检测方法，其特征在于，该检测方法还包括以下步骤：
酸枣仁（炒）的鉴别；取本品5片，碾碎，准确称取粉末2g，加热水40ml溶解，过滤，滤液用萃取3次，每次40ml石油醚，弃去石油醚层，水层用水饱和正丁醇萃取5次，每次40ml水饱和正丁醇，合并正丁醇层，于80℃水浴挥干，残渣用适量热水溶解，吸取3ml上大孔吸附树脂柱，吸附30分钟，用100ml水、100ml30%乙醇、100ml50%乙醇依次冲洗，收集50%乙醇的洗脱液，水浴挥干，残渣加甲醇1.5ml溶解，即为制剂薄层供试品溶液；称取炒酸枣仁药材10g于250ml平底烧瓶中，加60%乙醇100ml回流提取2小时，取出，过滤，滤液在水浴挥干，残渣加10ml甲醇溶解，即为药材供试品溶液；准确称取缺酸枣仁药材的阴性样品，碾碎，粉末1.7g，加热水溶解，制备方法同上制剂薄层供试品溶液的制备，得阴性样品溶液；准确称取酸枣仁皂苷A对照品10.00mg于10ml容量瓶中，用色谱甲醇溶解并定容，摇匀，其浓度为1.00mg/ml；分别吸取上述制剂薄层供试品溶液、药材供试品溶液和阴性样品溶液5μl及酸枣仁皂苷A对照品溶液5μl点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以13：7：2的氯仿-甲醇-水为展开剂，饱和25分钟，上行展开；以0.1%香草醛4%硫酸乙醇溶液为显色剂，用热风吹至显色清晰，可见光下检视；结果供试品色谱中，在对照品色谱相应的位置上，制剂与对照品在相同位置上均显相同的绿色斑点，阴性样品无干扰。
3.根据权利要求2所述的治疗睡眠障碍的薄膜包衣片的检测方法，其特征在于，该检测方法还包括以下步骤：
徐长卿的鉴别；取本品10片，碾碎，准确称取粉末4g，加乙醚10ml，密塞，振摇10min，滤过，滤液挥干，残渣加丙酮1ml溶解，即为制剂样品溶液；准确称取徐长卿药材粗粉约1g，制备方法同上，即为药材溶液；准确称取缺徐长卿药材的阴性制剂样品3g，制备方法同上，即得缺徐长卿药材阴性制剂样品溶液；精密称取丹皮酚对照品15.00mg于20ml容量瓶中，用色谱甲醇溶解并定容，摇匀，其浓度为0.75mg/ml；分别吸取上述制剂样品溶液、药材溶液、阴性制剂样品溶液丹皮酚对照品各15μl点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以10：2.5的正己烷-乙酸乙酯为展开剂，饱和20分钟，上行展开，晾干，以10%硫酸乙醇溶液为显色剂，105℃烘烤至斑点清晰，置365nm荧光下观察，结果供试品色谱中，在对照品色谱相应的位置上，制剂与对照品在相同位置上均显浅绿色主斑点，阴性样品无干扰。
4.根据权利要求3所述的治疗睡眠障碍的薄膜包衣片的检测方法，其特征在于，该检测方法还包括以下步骤：
蜘蛛香的鉴别；取本品5片，碾碎，准确称取粉末2g，加乙醚15ml，密塞，振摇15分钟，滤过，滤液挥干，残渣加1ml甲醇溶解，作为供试品溶液；准确称取蜘蛛香药材粗粉0.5g，制备方法同上，作为药材溶液；准确称取缺蜘蛛香药材阴性制剂样品约1.5g，制备方法同上，作为阴性样品溶液；分别吸取上述供试品溶液、药材溶液和阴性样品溶液各4μl点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以10：2.5的正己烷-乙酸乙酯为展开剂，以10%硫酸乙醇溶液为显色剂显色，在105℃烘烤至斑点可见，可视光下观察，结果供试品色谱中，在对照品色谱相应的位置上，制剂与对照品在相同位置上均显相同的黄色主斑点，阴性样品无干扰。
5.根据权利要求1-4所述的治疗睡眠障碍的薄膜包衣片的检测方法，其特征在于，该检测方法还包括以下步骤：：
细叶远志皂苷HPLC法含量测定，
（1）色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为55:45的甲醇和0.05％磷酸；流速为1.0ml/min；柱温为30℃；检测波长为202nm，理论塔板数以细叶远志皂苷峰计应不低于5000；
（2）对照品溶液的制备：精密称定细叶远志皂苷对照品10.00mg于10ml容量瓶中，用色谱甲醇溶解并定容，摇匀，即得浓度为1.00mg/ml的对照品溶液；
（3）供试品溶液的制备：取本品10片，碾碎，准确称定1000mg 于250ml平底烧瓶中，加入10%NaOH溶液100ml，水解2h，水解后取出，冷却，用盐酸调pH值至4～5，用水饱和的正丁醇萃取4次，合并正丁醇层，80℃水浴挥干，用甲醇溶解残渣并转移至25ml容量瓶中，定容，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；
（4）测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，按峰面积值采用外标一点法对制剂中的细叶远志皂苷进行含量计算；
本品每片含细叶远志皂苷（C36H55O12）不得少于2.5 mg。
6.根据权利要求5所述的治疗睡眠障碍的薄膜包衣片的检测方法，其特征在于：细叶远志皂苷HPLC法含量测定中，所述的用水饱和的正丁醇萃取4次，具体为，用100ml水饱和的正丁醇萃取一次，然后用水饱和的正丁醇萃取三次，每次用50ml水饱和的正丁醇萃取。
7.根据权利要求6所述的治疗睡眠障碍的薄膜包衣片的检测方法，其特征在于：该检测方法还包括以下步骤：
丹皮酚HPLC法含量测定，
（1）色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为62：38的甲醇和水；检测波长λ=274nm；流速为1.0ml/min；柱温为25℃；柱压为9.4MPa，理论塔板数以丹皮酚峰计应不低于5000；
（2）对照品溶液的制备：精密称取丹皮酚对照品10.00mg 于20ml容量瓶中，用色谱甲醇溶解并定容，摇匀，即得对照品溶液，其浓度为0.50mg/ml；
（3）供试品溶液的制备：取本品5片，碾碎，准确称定约200mg于25ml量瓶中，加甲醇10ml，超声10min溶解，冷却后，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；
（4）测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，按峰面积值采用外标一点法对制剂中的丹皮酚进行含量计算；
本品每片含丹皮酚（C9H10C3）不得少于1.0mg。
8.根据权利要求7所述的治疗睡眠障碍的薄膜包衣片的检测方法，其特征在于：丹皮酚HPLC法含量测定中，所述的超声为500w、50Hz的超声。
9.根据权利要求8所述的治疗睡眠障碍的薄膜包衣片的检测方法，其特征在于：该检测方法还包括以下步骤：
制剂中大类成分总皂苷UV法含量测定，
（1）测定条件：用比色法，547±2nm 为测定波长，显色剂为5％香草醛－冰醋酸溶液0.2ml和0.8ml高氯酸；
（2）对照品溶液的制备：精密称取人参皂苷Rb1对照品10.00mg于10ml容量瓶中，加入色谱甲醇溶解并定容，摇匀即得对照品溶液，其浓度为1.00mg/ml；
（3）供试品溶液的制备：取本品5片碾碎，准确称取细粉45mg于25ml容量瓶中，加入10ml热蒸馏水溶解，溶液置分液漏斗中，用石油醚脱脂3次，弃去石油醚层，水层用水饱和的正丁醇萃取4次，合并正丁醇层于250ml分液漏斗中，用正丁醇的饱和水溶液80ml洗涤1次，弃去水层，正丁醇层于80℃水浴挥干，残渣用甲醇溶解并转移至25ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；
（4）测定法：准确移取1.5ml溶液于具塞比色管中，70℃水浴挥干甲醇，将挥干甲醇的比色管准确加入5％香草醛－冰醋酸溶液0.2ml和0.8ml高氯酸溶液，60℃密闭显色10min后，冰浴10min，再加入5ml冰醋酸摇匀后，以不加样的甲醇同法制备为随行空白，按照2010版药典一部紫外—可见分光光度法在547±2nm下进行吸光度的测定，测得总皂苷吸光度代入人参皂苷Rb1回归方程计算，即得；
本品每片含总皂苷以人参皂苷Rb1（C54H92C3）计不得少于15mg。
10.根据权利要求9所述的治疗睡眠障碍的薄膜包衣片的检测方法，其特征在于：制剂中大类成分总皂苷UV法含量测定中，所述的用石油醚脱脂3次，具体为，用沸程为60～90℃的石油醚脱脂3次，每次10ml；所述的用水饱和的正丁醇萃取4次，具体为，用水饱和的正丁醇萃取4次，每次20ml。
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