CN102971007A - 生物学雌性避孕药 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了工程化以表达抑制精子运动性或受精的抗体片段的共生生物，及含有其的组合物等。本发明提供了工程化的共生生物或含有其的组合物作为雌性的有效避孕方式的用途。

Description

生物学雌性避孕药
发明领域
本发明提供了工程化以表达抑制精子运动性，受精或其组合的抗体片段的共生生物，及含有所述共生生物的组合物。本发明提供了此类工程化共生生物或含有所述共生生物的组合物作为避孕药的用途。
发明背景
需要开发新的避孕药，以对所有个体提供方便的生育控制，而不受社会，财政或教育的限制。
尽管目前有许多不同的避孕药可用，但没有一种避孕药是没有问题的。到目前为止，最常用的避孕药是口服的雌激素，孕酮，或其组合的制剂，尽管所述制剂是有效的，但已提示所述制剂在某些群体中在长期使用的情况下可能引起肿瘤。
屏障方法，如隔膜或子宫内装置，显示出降低的效果，以及不依从性(对于前者)，和更大的盆腔炎性疾病的风险(在使用后者的情况下)。杀精子剂也被用于这方面，但其效果较差，并且，更高的性传播疾病的风险与其使用相关。
因此，需要与上面的限制无关的、易于使用的微创(minimallyinvasive)避孕药。
发明概述
在一个实施方案中，本发明提供了基因工程化的细胞，其产生抗精子抗原的抗体片段，并由此可以用作避孕药。
在一个实施方案中，本发明提供了工程化的雌性生殖道共生细菌，其中所述细菌被工程化以表达抗精子的抗体或其片段，其能有效阻止精子运动性，精子-卵子融合或卵子的精子穿透，或其组合。在某些实施方案中，抗体片段是单链Fv分子(scFv)。
在某些实施方案中，对精子抗原特异的抗体片段是来自人的或人源化的。在某些实施方案中，抗体片段与精子上顶体或质膜位置的抗原或其片段特异性相互作用。在某些实施方案中，抗体片段与精子颈部区域位置的抗原或其片段特异性相互作用。在某些实施方案中，抗体片段从工程化细菌中分泌，而在某些实施方案中，抗体片段与细菌细胞壁结合或相连接。
在某些实施方案中，工程化细菌是乳杆菌(Lactobacillus)，或在某些实施方案中，是乳球菌(Lactococcus)。在某些实施方案中，工程化细菌是大肠杆菌(Escherichia coli)Nissle 1917株。在某些实施方案中，工程化细菌是戈登氏链球菌(S.gordonii)。在某些实施方案中，工程化细菌是詹氏乳杆菌(L.jensenii)或卷曲乳杆菌(L.crispatus)。
在某些实施方案中，scFv跟与SEQ ID NO：1或2有至少90％同一性的肽特异性相互作用。在某些实施方案中，scFv具有与SEQID NO：8有至少90％的同一性的序列。在某些实施方案中，scFv由多核苷酸编码，该多核苷酸具有与SEQ ID NO：7有至少90％同一性的序列。
在某些实施方案中，本发明提供了包含本文所述的工程化细菌的组合物。在某些实施方案中，组合物是阴道栓剂，乳膏或泡沫的形式。在某些实施方案中，避孕药与阴道环结合或包含于阴道环上。
在某些实施方案中，本发明提供了避孕的方法，所述方法包括将雌性对象生殖道细胞与在雌性对象中足以抑制或阻止精子运动性，精子-卵子融合或卵子穿透的量的本发明所述的工程化细菌相接触的步骤。在某些实施方案中，依据该方面，该方法包括将足以抑制或阻止的量的包含工程化细菌的组合物施用到有此需要的雌性对象的生殖道中。
在某些实施方案中，本发明提供了降低雌性群体妊娠的发生率的方法，所述方法包括将雌性对象的生殖道细胞与在雌性对象中足以削弱，抑制或阻止精子运动性，精子-卵子融合或卵子穿透的量的本发明所述的工程化细菌相接触的步骤，由此降低雌性的妊娠的发生率并由此降低雌性群体中的妊娠的发生率。
在某些实施方案中，本发明提供了降低雌性群体受精的发生率的方法，所述方法包括将雌性对象生殖道细胞与在雌性对象中足以削弱，抑制或阻止精子运动性，精子-卵子融合或卵子穿透的量的本发明所述的工程化细菌相接触的步骤，由此降低雌性中的受精发生率并由此降低雌性群体中的受精的发生率。
在某些实施方案中，本发明提供了本发明描述的工程化细菌或组合物在制备用于降低雌性群体妊娠的发生率的药物中的用途。在某些实施方案中，本发明提供了本发明描述的工程化细菌或组合物在制备用于降低雌性群体受精的发生率的药物中的用途。
附图简述
图1以图形方式描述了通过ELISA测定法确定的，分离并克隆的噬菌体展示的scFv对精子肽的相对亲和力。1-3列显示了三种scFv与源于精子FA-1的肽的结合，而4-6列显示了三种scFv与源于精子YLP(12)的肽的结合。BSA用作阴性结合对照。
图2描述了分离并克隆的一些噬菌体展示的scFv对用作探针的(probed)精子肽的相对亲和力。当与肽相关的OD值更高(与BSA对照或未与肽温育的样品相比)时，克隆被认为具有高亲和力。特别地，克隆102，103，105和106显示出对于肽相对高的亲和力，并且进一步描述了克隆102的体外和体内特征。
图3以图形方式描述了鉴定一系列非结合scFv的ELISA结合测定的结果，这些非结合scFv随后被用作对照与克隆102进行比较，如图2所示，发现克隆102对用作探针的肽具有良好的亲和力。在该情况下，通常使用一个这样的scFv克隆，J112。也测试了对照A和B，其分别为不含有scFv噬菌体或不含有肽和scFv的样品。通过测量样品中的OD(用抗噬菌体HRP标记的抗体(抗PVIII的抗体)进行探测)来检测结合。
图4A是pSLP111.1载体的质粒图谱。图4B是描绘质粒的NcoI和NotI消化产物的照片。使用NcoI-和NotI在37℃剪切质粒三小时。在几个代表性克隆中清楚地显示了质粒插入物。
图5A分别描述了J102的核酸和氨基酸序列(SEQ ID NO：7-8)。图5B描述了J102 scFv中的各个结构域。
图6描述了表达J102的乳杆菌与鼠精子在体外的特异性结合。图6A是显示表达scFv的乳杆菌与小鼠精子的显著结合的光显微照片，几乎每个进行评价的精子细胞都显示显著的染色。图6B是表达J112的乳杆菌(用作对照)的光显微照片，其中没有明显可见的与鼠精子的结合。
图7以图形方式描述了表达J102的乳杆菌的功效的体内证实。图7A绘制了，在两个试验中被施以表达抗精子scFv J102的詹氏乳杆菌或表达不结合精子的scFv(J112)的对照乳杆菌的雌性小鼠的妊娠率；在每个试验中，相对于J112处理的小鼠，J102处理的小鼠中显示出了有效的避孕。图7B绘制了，如图7A所述进行的两个试验的每一个试验中的幼崽总数和每笼幼崽数目；与对照相比，在表达J102的詹氏乳杆菌的情况下，幼崽总数和每笼幼崽数目都被减少。
发明详述
在一个实施方案中，本发明提供了重组的细胞(在一个实施方案中，其包括微生物在内)，以及使用其以产生杀精子化合物的方法。在一个实施方案中，所述方法和细胞提供了有效的避孕方法。
在一个实施方案中，重组的细胞是雌性生殖道共生生物。在一个实施方案中，共生生物是细菌。
在一个实施方案中，重组的细胞是非哺乳动物细胞，其存留在雌性生殖道粘膜中足以表达干扰精子运动性，精子-卵子融合或卵子的精子穿透的化合物的一段时间。在某些实施方案中，当在被处理对象的雌性生殖道中由定殖于此的共生生物表达时，化合物在所述对象中导致降低的繁殖力。在某些实施方案中，当在被处理对象的雌性生殖道中表达时，化合物在施以这样的共生生物的群体中导致降低的妊娠率。
在一个实施方案中，本发明提供了表达杀精子化合物的工程化共生生物，此类生物能够定殖于雌性生殖道或其区域之中。
在一个实施方案中，细胞被工程化以表达核酸片段，所述核酸片段包括编码序列之前(5’非编码序列)和之后(3’非编码序列)的调节序列，且能够被表达为特定蛋白。
可以通过本领域技术人员知晓的任何方法，将基因工程化的细菌工程化为在特定基因中具有缺陷，或者可以通过本领域已知的方法，将工程化生物工程化以过表达特定基因。
在一个实施方案中，将构建体引入本发明的细菌，以便能够为基因敲除过程选择细菌中的同源重组事件。本领域普通技术人员可以容易地设计敲除构建体，包括阳性和阴性选择基因，以有效选择经历该构建体的同源重组事件的转染的细胞。
在另一个实施方案中，基因表达、活性和功能的变化，尤其是基因表达的增强，减弱，和消除，可以使用整合入细胞基因组的基因构建体来实现。在另一个实施方案中，基因表达，活性和功能的变化可以使用染色体外的基因构建体来实现，并且在一个实施方案中，该构建体保持在染色体外。
在一个实施方案中，术语构建体或载体是指，含有已亚克隆入载体中的目的序列的核酸运载工具。
为了产生本发明的载体，可以将编码目的序列的多核苷酸连接入适于转导/转化原核细胞并在转导/转化的细胞内指导重组产物表达的合适的表达载体系统。应当理解，可以通过常用的重组技术容易地修饰此类合适的载体系统，以替换，复制或突变已有的启动子或增强子序列和/或导入任何另外的多核苷酸序列，例如编码另外的选择标记的序列或者编码报告基因的序列。
根据另一个实施方案，载体进一步包括调节元件，如调节分离的核酸的表达的启动子。已知此类启动子为转录所需的顺式作用序列元件，因为其用于结合DNA依赖性RNA聚合酶，而该酶转录位于其下游的序列。在另一个实施方案中，载体可以包括诱导型启动子，或组成性表达目的序列的启动子。
本发明的载体可以进一步包括复制起点，并可以在多于一个种类的原核细胞中增殖，并且在某些实施方案中，可以构建载体以便于其在所选择的生物的基因组中整合。在其他实施方案中，如技术人员所理解的，载体可以是例如质粒，杆状病毒穿梭载体(bacmid)，噬菌粒或噬菌体，或任何适合的载体。
此类载体的实例在下文实施例部分描述并使用。然而，技术人员将理解，本发明不限于任何此类载体的使用，并且本领域中为了优化插入或纳入的序列(载体用作所述序列的基因递送/工程化运载工具)的异源表达的目的，创建新的载体和/或修饰已有的载体是常规的。
适合使用的载体的一些例子包括：M.Posno等，Appl EnvironMicrobiol.1991 June；57(6)：1822-1828；M Shimizu-Kadota等，Appl Environ Microbiol.1991 November；57(11)：3292-3300；T.Duong等，Microbial Biotechnology Volume 4，Issue 3，pages 357-367，May 2011；V V Aleshin等，MikrobiologiiaVolume：69，Issue：1，Pages：75-80；X.Liu等，Antimicrobialagents and chemotherapy 2006，vol.50，no.10，pp.3250-3259；WO/2005/112567；Luca Vangelista等，Antimicrobial Agentsand Chemotherapy，July 2010，pp.2994-3001，Vol.54，No.7；美国专利7,179,458；美国专利7,754,467；Caren J.Chancey等.The Journal of Immunology，2006，176：5627-5636；美国专利5,733,540等。
可以通过本领域公知的多种方法来实现在细胞中纳入所需核酸序列。可以使用核酸构建体来稳定或瞬时转染或转导细胞。
本领域中有许多已知的技术可以用于将载体导入本发明的细胞，例如但不限于，直接DNA摄取技术，和噬菌体，质粒，线性DNA或脂质体介导的转导，受体介导的摄取，以及使用磷酸钙介导的和DEAE-葡聚糖介导的导入方法的磁电穿孔(magnetoporation)方法，电穿孔或脂质体介导的转染(关于进一步的细节，参见例如，″Methods in Enzymology″Vol.1-317，Academic Press，Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel F.M.等(编)Greene Publishing Associates，(1989)和Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Sambrook等.Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1989)，或其他标准实验手册)。还涉及使用核酸包覆的颗粒的轰击。应当理解，可以使用任何此类方法来将需要的序列导入细胞，以产生本发明的细胞，和实施本发明的方法。
电穿孔已被成功用于转化多种细胞。
也可以使用依赖于供体和受体细胞的直接接触的细菌接合来将基因转移入细菌。细菌接合过程可以包括，将“供体”和“受体”细胞互相紧密接触地混合在一起。结合通过在供体和受体细菌间形成细胞质连接而发生，并且新合成的供体DNA被直接转移入受体细胞。接合中的受体通过水平转移从供体细菌接收DNA。接合转移中的供体可以具有接合质粒，接合转座子，或可移动的质粒。
在某些情况下，接合仅需要供体和受体。这发生在待转移的质粒是接合的和可移动的自传播质粒(即，携带tra基因和编码Mob蛋白的基因)时。通常，该过程包括下列步骤：1)双链质粒DNA在oriT的特定位置上产生切口；2)单链DNA通过孔或菌毛结构被释放给受体；3)DNA释放酶(relaxase)在oriT切割双链DNA并结合至释放的5’末端(形成作为中间结构的松弛小体)；和4)随后，辅助蛋白复合体在oriT装配以促进DNA转移过程。
将供体质粒转移到受体也可能需要“三亲本”接合。在这种类型的接合中，涉及供体细胞，受体细胞，和“助手”质粒。供体细胞携带可移动的质粒或接合转座子。可移动的载体含有oriT(编码切口酶的基因)，并具有编码Mob蛋白的基因；然而，单独的Mob蛋白不足以实现基因组的转移。因此，除非助手质粒提供适合的接合系统(位于供体中或“助手”细胞中)，否则可移动的质粒不能够促进自身的转移。需要接合质粒来形成配合对并转移DNA，因为该质粒编码参与孔或菌毛形成的转移用蛋白(Tra)。
当用于例如细胞，或核酸，蛋白，或载体时，术语“重组的”或“重组改变的”表示，已通过导入异源核酸或蛋白或者改变天然核酸或蛋白而修饰细胞，核酸，蛋白，或载体，或者表示，细胞源自如此修饰的细胞。因此，例如，重组的细胞表达在天然(非重组)形式的细胞中未发现的基因，或者表达在非重组细胞中异常表达，低表达或完全不表达的天然基因。
当用于核酸时，术语“异源”表示，核酸包含两个或更多个的子序列，这些子序列在天然状态下未发现与异源核酸中的关系相同的相互关系。例如，通常重组产生核酸，其具有两个或更多个来自不相关的基因且被安排以产生新的功能性核酸的序列，例如来自一个来源的启动子和来自另一个来源的编码区。类似地，异源蛋白表示，蛋白包含两个或更多个的子序列，这些子序列在天然状态下未发现与异源蛋白中的关系相同的相互关系(如，融合蛋白)。
术语“表达盒”是重组或合成产生的核酸，其具有一系列允许特定核酸在宿主细胞中转录的特定的核酸元件。表达盒可以是质粒，病毒，或核酸片段的一部分。通常，表达载体包含可操作地连接至启动子的待转录的核酸。
在另一个实施方案中，用于本发明的核酸包括，制自核苷酸类似物的RNA或DNA类似物。该术语包括由天然发生的核酸碱基，糖和共价核苷间(骨架)连接组成的寡核苷酸，以及具有类似作用的具有非天然发生部分的寡核苷酸。相比于天然形式，此类经修饰的或取代的寡核苷酸经常是优选的，因为其具有期望的性质，例如，增强的细胞摄取，增强的对核酸靶的亲和力，在核酸酶存在时增加的稳定性和/或有效的基因沉默。
可以通过任何合成或重组过程，如本领域公知的过程来产生用于本发明的核酸。可以通过本领域已知的技术手段进一步修饰核酸，以改变生物物理学或生物学性质。例如，可以修饰核酸以增加其对抗核酸酶的稳定性(例如“封端”)，或改变其亲脂性，溶解性，或与互补序列的结合亲和力。
也可以通过本领域已知的方法化学合成本发明的DNA。例如，可以通过本领域已知的方法从四种核苷酸整体或部分化学合成DNA。这样的方法包括Caruthers(1985)中描述的那些。也可以通过制备重叠的双链寡核苷酸，填充间隙，并将末端连接在一起来合成DNA(一般参见Sambrook等.(1989)和Glover等.(1995))。可以通过定点诱变从野生型DNA制备表达蛋白的功能性同源物的DNA(参见例如，Zoller等(1982)；Zoller(1983)；和Zoller(1984)；McPherson(1991))。可以通过本领域已知的方法扩增获得的DNA。一种适合的方法是Saiki等(1988)，Mullis等，美国专利号4,683,195，和Sambrook等(1989)中描述的聚合酶链式反应(PCR)方法。
在另一个实施方案中，可以在克隆入载体，例如粘粒，噬菌体，质粒，或BAC(细菌人工染色体)中的基因组DNA上进行体外转座。可以使用克隆入等位基因置换载体的基因组DNA，在非天然具有能力的生物中进行类似的高密度诱变(参见例如，美国专利号6,207,384，所述方法可用于工程化本文描述的生物)。
就例如它们的转化能力，表达异源蛋白的能力，和/或粘膜表面，来选择适合的细菌宿主菌株。可使用标准技术，如氯化铷法或电穿孔，来使细菌宿主具有转化能力(参见例如，Wei等，J.Microbiol.Methods 21：97-109(1995))。
可以通过修改例如Luchansky等(J.Dairy Sci.74：3293-3302(1991))中描述的标准方法来进行共生生物例如詹氏乳杆菌的电穿孔转化。简言之，在MRS培养基中培养新鲜接种的詹氏乳杆菌(如，在37℃和5％CO2下培养到0.6-0.7的OD600)。细菌细胞被收获，清洗，并再悬浮于冷的蔗糖和MgCl2溶液中。随后将感受态细胞与DNA混合并进行电穿孔。然后，允许细胞恢复，然后将细胞涂板于含有抗生素等选择剂的选择性琼脂平板上。随后将工程化的细胞施用给对象，例如，以栓剂，乳膏或泡沫剂型。
任选地，在将本发明的细菌导入阴道之前，可以使用抗生素预处理来预清理原住细菌的粘膜表面(参见例如，Freter等，Infect.Immun.，39：686-703(1983))。抗生素可以口服提供或直接施用至阴道。
在某些实施方案中，本发明提供了选择按照本发明方法工程化的细菌菌株的非限制性方法，这些菌株能有效地定殖到施加细菌的粘膜表面上，该方法可包括，在动物或人粘膜层上重复选择快速定殖的细菌。例如，将野生型细菌菌株施加到粘膜表面，并重复分离和体外培养所述细菌，在每一步都返回到粘膜表面。在某些实施方案中，依照这个方面，最终获得具有增强的定殖能力的细菌。
在另一个实施方案中，本发明提供了按照本发明方法工程化细菌菌株的非限制性方法，这些菌株能有效地定殖到施加细菌的粘膜表面上，该方法可包括在重组细菌表面上表达融合蛋白。融合蛋白由与目的多肽连接的宿主结合结构域构成。宿主结合结构域允许细菌以高亲和力与所选宿主粘膜表面上的某些决定簇(蛋白或碳水化合物)结合，由此赋予细菌超过原住菌群(microflora)的生存优势。
另一个工程化本发明细菌菌株的示例性方法包括通过以噬菌体导入基因来诱导原住菌群表达异源蛋白。已经开发了多种噬菌体载体以用于不同细菌中。例如，可以使用基于温和噬菌体adh的噬菌体载体(参见例如，Raya等，J.Bacteriol.174：5584-5592(1992)和Fremaux等，Gene 125：61-66(1993))。该载体在确定的噬菌体(attP)和细菌(attB)附着位点上位点特异性整合入宿主染色体。类似地，可以使用乳杆菌特异性噬菌体来将载体或其他多核苷酸转导入乳杆菌染色体。乳杆菌特异性噬菌体包括mv4(Auvray等，J.Bacteriol.，179：1837-1845(1997))，adh(Fremaux等，Gene 126：61-66(1993))，gle(Kakikawa等，Gene175：157-165(1996))，以及属于阴道乳杆菌分离株中的Bradley组A或B的那些(Kilic等，Clin.Diagn.Lab.Immunol.8：31-39(2001))。
也可以将不刺激粘膜上皮细胞的某些制剂加入到单位剂量的细菌中以辅助定殖。粘膜表面上的许多细菌分泌包膜材料，所述包膜材料联合形成覆盖整个粘膜表面的生物膜。添加消化该生物膜材料的酶以促进工程化细菌穿透生物膜(从而更成功地定殖)可能是有益的。这样的酶包括DNA酶，肽酶，胶原酶，透明质酸酶，和其他碳水化合物降解酶。也可以添加工程化细菌本身对其不易感的抗生素来降低粘膜表面原住细菌的数量，以便于工程化细菌的有效定殖。
使用P59(van der Vossen等，Appl.Environ.Microbiol.58：3142-3149(1992))或P23(Elliot等Cell 36：211-219(1984))启动子的异源多核苷酸或多肽的表达可以是组成型的。可选地，表达可以在诱导型启动子的控制下。例如，芽孢杆菌淀粉酶(Weickert等，J.Bacteriol.171：3656-66(1989))或木糖(Kim等Gene 181：71-76(1996))启动子以及乳球菌乳链球菌素启动子(Eichenbaum等，Appl.Environ.Microbiol.64：2763-2769(1998))可以用于驱动诱导型表达。此外，可以使用酸或碱诱导的启动子。例如，可以使用在阴道的相对酸性的条件下具有活性的启动子(例如，美国专利号6,242,194描述的那些)。可选地，可以使用由阴道中响应精液的变化来诱导的启动子。例如，使用碱诱导的启动子来响应由精液导入而引起的阴道的增加的碱性条件而诱导表达。
已知多种信号和锚定序列指导多肽至膜，胞外间隙或细胞壁表达(如，通过与肽葡聚糖共价连接)。示例性的信号序列包括，来自噬淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)的α-淀粉酶的信号序列(Giraud&Cuny，Gene 198：149-157(1997))或者来自卷曲乳杆菌的S-层基因(cbsA)的信号序列(例如，MKKNLRIVSAAAAALLAVAPVAA(SEQ ID NO：3)或MKKNLRIVSAAAAALLAVATVSA(SEQ ID NO：4))。信号序列通常位于多肽的氨基末端。
锚定序列通常位于被编码的蛋白序列的羧基末端。锚定序列包括例如，细胞壁结合序列；序列LPQ(S/A/T)(G/A)，其中括号中的残基表示该位置的不同选项；和疏水序列，以及任选地，带电荷的序列。在某些实施方案中，锚定序列包含：
VTRTINVVDPITGKISTSVQTAKFTREDKNSNAGYTDPVTGKTTMNPWTPAKQGLRA
VNVEQIKGYVAKVDGNVDAVVVTPDSANMVVTITYQANKPEGQNITNKKDTVPDP
ADGIKNKDDLPDGTKYTWKEVPDVNSVGEKTGIVTVTFPDGTSVDVKVTVYVDPVV
ESNRDTLSKEANTGNTNVAKAATVTSSKVESKKTLPQTGSKTEQVGILGLAIATVGS
LLGLGVNRKKRQK(SEQ ID NO：5)；或，
KKAEEVKNNSNATQKEVDDATNNLKQAQNDLDGQTTDKSKLDEAIKSADDTKSTD
KYNNASDDTKSKFDEALKKAEEVKNNSNATQKEVDDATKNLKQAQNDLDGQTTN
KDAINDAIKDANNAKGTDKYNNASDDTKSKFDDALKKAEDVKNDSNANQKEVDD
ATKNLKNTLNNLKGQPAKKANLIASKDNAKIHKQTLLPQTGTETNPLTAIGIGLMAL
GAGIFAKKKRKDDEA(SEQ ID NO：6)，或，
与SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6基本相同的序列。
可以使用标准方法确定多肽的正确定位和折叠。例如可以通过下述来获得乳杆菌的细胞壁富集的级分：将细菌悬浮于缓冲溶液(如，25％蔗糖，1mM EDTA，10mM Tris-HCl，pH 8.0)，随后用细胞壁降解酶(如，溶菌酶和变溶菌素)进行处理，并接着以差速离心分离出得到的原生质体(Piard等.，J.Bacteriol.179：3068-3072(1997))。可以通过Western印迹法来筛选级分，以确认在细胞壁中的表达。
也可以使用标准方法来确定表达的多肽的折叠和生物学活性。例如，使用对天然折叠的多肽特异的抗体的ELISA测定可以用于确认多肽的折叠和三维结构。当然，生物学活性测定将依多肽的活性而变化。例如，对于与精子结合的多肽，可以使用标准结合测定来检测表达的多肽。
当合成在宿主细胞中具有改善的表达的基因时，期望的是设计该基因，以便其密码子使用频率接近于宿主细胞的优选密码子使用频率。合成的基因的优选密码子使用频率与宿主细胞使用的频率的百分比偏差可以通过下述来计算：首先确定单个密码子的使用频率与宿主细胞的频率的百分比偏差，随后获得所有密码子的平均偏差。
可以改变编码特定多肽的多核苷酸序列，以与特定宿主的密码子使用一致。例如，乳杆菌的密码子使用可以用于衍生编码本发明多肽并包含优选的乳杆菌密码子的多核苷酸。宿主细胞所显示的优选密码子使用频率，可以通过对宿主细胞表达的大量基因中的优选密码子使用频率求平均来计算。该分析优选限于宿主细胞高表达的基因。例如，Pouwels&Leunissen(Nucleic Acids Res.22：929-936(1994))提供了各种乳杆菌物种所显示的高表达基因的密码子使用频率。密码子使用表也可以通过因特网获得。
在另一个实施方案中，本发明涉及的载体进一步包括编码标记多肽的异源核酸序列的插入。标记多肽可以包括，例如，绿色荧光蛋白(GFP)，DS-红(红色荧光蛋白)，分泌型碱性磷酸酶(SEAP)，β-半乳糖苷酶，萤光素酶，或任何数量的本领域技术人员已知的其他报告蛋白。
通过修饰来自维多利亚多管水母(Aequorea victoria)的天然发生的GFP的氨基酸序列，已经设计了多种具有有用的激发和发射光谱的多管水母相关的GFP(Prasher等，1992，Gene，111：229-233；Heim等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，91：12501-12504；PCT/US95/14692)。
在一个实施方案中，将具有编码杀精子化合物的序列的核酸转移入异源生物，导致表达。
检测表达产物的方法是本领域公知的，并且在一个实施方案中，可以包括，RNA印迹，PCR，HPLC，质谱，ELISA，RIA，或蛋白印迹分析[参见“Cell Biology：A Laboratory Handbook”，Volumes I-III Cellis，J.E.，编(1994)；“Current Protocolsin Immunology”Volumes I-III Coligan J.E.，ed.(1994)；Stites等(编)]。
在某些实施方案中，可以将抗生素抗性盒导入本发明描述的生物中，作为确认导入的构建体的表达的标记物。在某些实施方案中，将抗生素易感盒导入生物，作为导入对象的构建体的安全方案，并且在某些实施方案中，用于消除避孕效果，促进安全方式怀孕，例如，通过给对象注射短疗程抗生素治疗(其清除生物学避孕药)。
在某些实施方案中，本发明提供了表达杀精子化合物的工程化细胞。在一个实施方案中，杀精子化合物可以包括抗精子的抗体或其片段，其能有效阻止精子运动性，精子-卵子融合或卵子的精子穿透，或其组合。
抗体例如作为完整的免疫球蛋白或多种良好表征的片段存在。在某些实施方案中，scFv片段被考虑作为工程化生物，组合物，试剂盒的一部分，且用于本发明的方法中。在某些实施方案中，其他考虑的片段包括F(ab′)2，一种Fab′单体。Fab′单体本质上是具有铰链区的一部分的Fab(见Paul(编)FundamentalImmunology，第三版，Raven Press，NY(1993))。尽管各种抗体片段以完整抗体的消化进行定义，但技术人员理解，这样的片段可以通过化学方法或通过使用重组DNA方法从头合成。因此，本发明中使用的术语抗体也包括通过修饰完整抗体而产生的抗体片段，或者使用重组DNA方法从头合成的抗体片段(如，单链Fv(scFv))。
本发明描述了制备此类细胞的示例性方法，然而技术人员理解，任何杀精子化合物或化合物的组合可以在共生生物中重组产生。
在某些实施方案中，使用抗体片段，其在各种动物物种中是杀精子的，或否则抑制精子运动性，或精子-卵子融合能力或卵子的精子穿透。例如，在某些实施方案中，抗体片段，如scFv，与在动物物种和人中保守的高度保守的精子特异性表位特异性相互作用，从而可以在动物模型中进行体内效果测试，而相同抗体片段例如人scFv或其人源化形式的验证可以在人体临床试验中进行。
在某些实施方案中，如本领域技术人员理解的，此类抗体/抗体片段可以如本发明中例举的，或如Xu，等Arch Androl.1994Sep-Oct；33(2)：141-4；Clarke等，Arch Androl.1995 Jul-Aug；35(1)：21-7；WO0107083A1；美国专利号5,830,472，5,753,231，5,227,160中描述的，或通过任何适合的方法来产生。工程化共生生物以表达这样的化合物也可以通过任何方法，如PNAS 102：11993-11998(2003)中描述的方法来完成。
完全人的抗体/抗体片段用于人类女性的避孕是特别理想的。可以通过本领域已知的多种方法来制备人抗体/抗体片段，包括本发明中描述的，使用源自人免疫球蛋白序列的抗体/抗体片段文库的噬菌体展示方法。参见美国专利号4,444,887和4,710,111；以及WO98/46645；WO99/50433；WO98/24893；WO98/16654；WO96/34096；WO96/33735；和WO91/10741，其各自以引用方式整体纳入本文，并且包括下文提供的实施例。
应当理解，本文中引用的任何参考文献被认为以引用方式整体纳入本文。
也可以使用不能表达功能性内源免疫球蛋白，但可以表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠来生产人抗体或抗体片段，例如scFv。关于这种生产人抗体的技术的概述，可参见Lonberg和Huszar，1995。关于这种生产人抗体和人单克隆抗体的技术以及生产此类抗体及其片段的方案的详细讨论，可参见例如，WO98/24893；WO92/01047；WO96/34096；WO96/33735；EP 0598877；美国专利号5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771；5,939,598；其以引用方式整体纳入本文。此外，公司如Abgenix，Inc.(Freemont，Calif.)，Kirin，Inc.(Japan)，Medarex(NJ)和Genpharm(San Jose，Calif.)可使用与上面所描述的技术类似的技术来提供抗所选抗原的人抗体。
也可以通过Davis等(美国专利号4,179,337)所描述的方法和偶联剂来修饰本发明的抗体，以产生基本上不诱导免疫原性应答的抗体片段。
在某些实施方案中，本发明提供了包含本发明所描述的工程化细菌的组合物。
在某些实施方案中，组合物可以包含本发明所描述的工程化细菌，其中组合物包含表达不同的异源抗精子剂的细菌，所述细胞包含于相同组合物中，作为施用的单位剂量的一部分。在某些实施方案中，表达不同的异源抗精子剂的此类细菌可以依对特定抗原或表位的特异性而变化，或者依片段所结合的抗原或表位而变化，或者依对表位的亲和力而变化，或者依其所衍生自的同种型而变化，或依这些的组合而变化。
在某些实施方案中，此类组合物也可以包括表达相同或不同异源抗精子剂的不同细菌菌株，所述菌株也包含在相同组合物中，作为施用的单位剂量的一部分。
在某些实施方案中，组合物是阴道栓剂，液体，喷雾剂，泡沫，乳膏，摩丝，或任何适合阴道递送的运载体的形式。
在某些实施方案中，工程化的细菌或含有其的组合物被施用至或包含于阴道环中，所述阴道环随后被施用给雌性对象。在某些实施方案中，本发明涉及避孕套，其含有施用于避孕套外表面并且被保持的工程化的细菌或包含所述细菌的组合物，以便在性交期间避孕套的佩戴者可以将工程化的细菌转移给其雌性伴侣。
在某些实施方案中，术语“包含”或其语法形式，是指含有所指示的活性剂，如本发明的工程化共生生物或者本发明描述的噬菌体，以及含有其他活性剂和制药工业中已知的药学可接受的载体，赋形剂，润滑剂，稳定剂等。在某些实施方案中，术语“基本上由……组成”是指这样的组合物，其仅有的活性成分是所指示的活性成分，即本发明描述的工程化共生生物，但还可以包括用于稳定，保存制剂等，但不直接参与避孕效果的其他试剂/组分/化合物。在某些实施方案中，术语“基本上由……组成”可以指这样的组分，其通过与工程化共生生物的机制不同的机制发挥避孕效果，其增强避孕效果或延长避孕效果或具有这两种效果。在某些实施方案中，术语“基本上由……组成”可以指这样的组分，其促进工程化共生生物的释放(例如通过增强工程化共生生物从栓剂制剂或其他制剂中释放)，促进有效定殖，促进均匀定殖，和其他想要的效果，其促进工程化共生生物的活性，但并非工程化共生生物的组分。在某些实施方案中，此类试剂可以包括，诱导编码的抗精子剂表达的试剂，或在某些实施方案中，增强编码的抗精子剂表达的试剂。在某些实施方案中，术语“组成”是指这样的组合物，其含有活性成分和药学上可接受的载体或赋形剂。
工程化细菌至期望的粘膜表面的递送，依赖于该区域的可到达性和局部条件。例如，工程化细菌可以被置于盐溶液，乳膏，栓剂中或者泡沫中以递送到阴道粘膜上。泡沫可以包括，如一种或多种疏水改性的多糖，如纤维素和壳聚糖。纤维素包括，例如，羟乙基纤维素，羟丙基纤维素，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，羟乙基甲基纤维素等。壳聚糖包括，例如，下面的壳聚糖盐；壳聚糖乳酸盐，壳聚糖水杨酸盐，壳聚糖吡咯烷酮羧酸盐，壳聚糖衣康酸盐，壳聚糖烟酸盐，壳聚糖甲酸盐，壳聚糖乙酸盐，壳聚糖没食子酸盐，壳聚糖谷氨酸盐，壳聚糖马来酸盐，壳聚糖天冬氨酸盐，壳聚糖乙醇酸盐，和季胺取代的壳聚糖及其盐等。泡沫也可以包括其他组分，例如水，乙醇，异丙醇，甘油，丙三醇，丙二醇，和山梨糖醇。任选地，杀精子剂可包括于细菌组合物中。泡沫和泡沫递送运载体的其他例子描述于例如美国专利号5,595,980和4,922,928中。
在某些实施方案中，细菌可以作为栓剂或子宫托来递送，参见例如，美国专利号4,322,399。在某些实施方案中，本发明的细菌在例如美国专利号6,468,526中描述的保存基质中制备，并且在由可溶聚合物材料和/或就溶解特性选择的复合碳水化合物材料制成的可溶元件中递送，以便其在使用前基本保持固体形式，并且在使用时由于人的体温和湿度而溶解，并以期望的定时释放和剂量来释放药剂材料。参见例如，美国专利号5,529,782。细菌也可以在如美国专利号4,693,705中描述的海绵递送运载体中递送。
在某些实施方案中，需要定期重复将工程化细菌应用于粘膜表面；优化的给药间隔可以常规地确定，但会随不同的粘膜环境和细菌菌株而变化。在某些实施方案中，给药间隔可以在每天一次到每2-4周或更长时间一次之间变化。在某些实施方案中，根据雌性月经周期进行施用，以便施用在月经停止或近似停止之后进行，从而在由此处理的雌性排卵之前优化定殖。
在导入噬菌体以转化天然乳杆菌的某些实施方案中，可以操纵所选噬菌体的核酸，以便异源基因替换编码噬菌体衣壳蛋白的基因，从而使噬菌体是复制缺陷的。将这些重组DNA分子加入含有功能性噬菌体蛋白的细胞裂解液，将导致携带异源基因的功能性噬菌体颗粒的组装。随后这些复制缺陷型噬菌体颗粒可以被导入到所需的粘膜表面上以感染所选的细菌菌群。通常的剂量是施加到粘膜表面的108-1012PFU/ml。溶液与处理的表面的比率应接近0.1＝1.0ml每平方厘米粘膜表面。运载体与上文描述的细菌运载体类似。
在某些实施方案中，本发明提供了避孕的方法，所述方法包括，将雌性生殖道细胞与本发明描述的工程化细菌接触的步骤。在某些实施方案中，依据该方面，所述方法包括，将含有工程化细菌的组合物(在某些实施方案中，包括本发明描述的组合物)施用到有此需要的雌性对象的生殖道中。在某些实施方案中，本发明也提供了，将雌性生殖道与本发明描述的噬菌体接触，其又导致共生菌群的原位工程化，以获得本发明描述的工程化细菌。
在某些实施方案中，术语“接触”或“施用”是指直接和间接暴露于所指材料。
在某些实施方案中，施用到雌性生殖道的剂量可以为105-109个重组细菌。在某些实施方案中，针对特定宿主或群体优化剂量。在某些实施方案中，此类优化的剂量可以为107-109个重组细菌，或106-108个重组细菌，或108-109个重组细菌。
证明有效避孕的各种方法是本领域已知的，所有这些方法被认为可用于本发明，其中的某些方法在本文中进行了例举。
在一个实施方案中，通过评价施用了本发明避孕药的雌性动物每繁殖周期产生的后代数，来确定本发明生物学避孕药的避孕效果。例如，在对例如小鼠施用生物学避孕药1到3天后，将雌性小鼠个体与雄性小鼠置于笼中。随后在交配后1-7天之间移走雄性小鼠。然后每天观察雌性小鼠的幼崽出生。通过施用后妊娠的减少和/或每窝产仔数目的减少来确定施用的避孕药的避孕效果。例如对于每窝平均产生3个或更多个后代的动物物种(例如，如下文例举的，当使用远亲杂交品系时，小鼠平均每窝产生11个或更多个后代)，如果妊娠率或每窝产仔数目降低10％-100％，30％-100％，或50％至100％，或60％-100％，70％-100％，或80％至100％，或90％-100％，或95％-100％，或更多，则避孕蛋白可以被认为是有效的。如本发明中例举的，当评价表达J102的詹氏乳杆菌菌株的避孕效果时，观察到至少50％的避孕效果，而且，由于本文进行的定殖研究显示乳杆菌在约50％的小鼠中良好定殖，因此预期，已知更易于接受乳杆菌定殖的其他动物将具有更高的避孕效果。
如果每窝产仔数目降低至少50％，则避孕药被认为是有效的，因此，图7表明产生了有效的生物学雌性避孕药，其包括表达抗精子剂的工程化共生生物。
在某些实施方案中，可以通过测量粘膜分泌物中表达的抗体的水平来确定本发明避孕药的有效性。也可以，例如在性交后收集的分泌物中，通过以免疫组化技术观察与精子结合的抗体来评价避孕药的有效性。
如本文中例举的，当将表达抗精子scFv的詹氏乳杆菌定殖到小鼠时，观察到50-58％之间的妊娠率的降低，并且每笼和由此每小鼠产生的后代数目的同时降低也很显著。
在一个实施方案中，表达抗精子剂的共生生物可以被进一步工程化，以表达有效对抗被处理雌性中引起性传播疾病的生物的感染的试剂。在一个实施方案中，如本领域技术人员理解的，引起性传播疾病的生物是衣原体，HIV，HPV等等。
在一个实施方案中，有效对抗被处理雌性中引起性传播疾病的生物的感染的此类试剂，可以干扰所述生物的感染，或在另一个实施方案中，此类试剂可以降低感染几率或感染负荷。在某些实施方案中，此类试剂可以干扰生物感染的发病机制。应理解，在该方面设想了有效对抗被处理雌性中引起性传播疾病的生物的感染的任何试剂的进一步掺入，并且其被视为本发明的一部分。
依据这方面，在某些实施方案中，本发明的避孕药可以被视为组合的避孕-抗-STD疗法。
尽管预期本发明的工程化共生生物可以被进一步工程化，例如以表达抗衣原体scFv，或者抗HPV或抗HIV scFv，或者其他抗HIV试剂，例如蓝藻抗病毒蛋白(cyanovirin)，但应理解，雌性生殖道中野生型乳杆菌定殖的存在提供抗STD感染的保护。还预期，本发明的表达抗精子剂的工程化生物，与单独的野生型乳杆菌相比，在降低使用本文描述的此类生物的雌性群体中的性传播疾病的发生率方面，一样有效，或在某些实施方案中，更有效。
应当理解，适用于本发明的任何或所有方法的本文描述的任何实施方案，被视为本发明的一部分。本说明书中引用的所有出版物和专利申请以引用的方式纳入本文，如同每一个单独的出版物或专利申请被明确和单独地指明以引用方式纳入本文。
本领域技术人员理解，可以在其中进行形式和细节的各种变化，而不背离附属的权利要求书中所示的本发明的精神和范围。通过使用不超过常规的试验，本领域技术人员将认识到或能够确认本文描述的本发明具体实施方案的许多等同形式。此类等同形式意欲包括在权利要求书的范围中。
应理解，除非有相反指示或者根据上下文可以明显得出，否则本文中涉及物品的词如“a”“an”和“t he”表示一个或多于一个。除非有相反指示或者根据上下文可以明显得出，否则如果一个，多于一个，或所有组成员存在于，用于，或以其他方式与给定的产品或方法相关，那么在组的成员间包括“或”或者“和/或”的权利要求或描述被认为是满足的。本发明包括这样的实施方案，其中确切的一个组成员存在于，用于，或以其他方式与给定的产品或方法相关。本发明也包括这样的实施方案，其中多于一个或全部的组成员存在于，用于，或以其他方式与给定的产品或方法相关。此外，应当理解，除非另外指出或除非其对于本领域技术人员而言明显引起矛盾或不一致，否则本发明在各种实施方案中提供了所有的变化，组合，及排列，其中来自一个或多个所列的权利要求的一个或多个限定，要素，子句，描述性术语等被引入从属于相同基础权利要求的另一个权利要求。当要素以列表(如马库什形式等)存在时，应当理解，要素的每个亚组也被公开，并且可以从组中移除任何要素。应当理解，通常，当发明或发明的方面被称为包含特定要素，特征等时，本发明的某些实施方案或本发明的某些方面由或基本上由这样的要素，特征等组成。为了简单起见，在本发明的言语中未明确陈述这些实施方案的每一种情况。为方便起见，某些权利要求以从属权利要求的形式存在，但申请人保留以独立权利要求的形式重写任何从属权利要求(以包括该权利要求所从属的独立权利要求和任何其他权利要求的要素或限定)的权利，并且这样重写的权利要求被认为在所有方面等同于从属权利要求，无论其在以独立权利要求的形式重写之前是何种形式(修改或未修改的)。
下文意欲以举例说明的目的提供材料，方法和实施例(作为实施/执行本发明的方式)，而不意欲是限制性的。
实施例
一般来说，本文使用的术语和本发明中使用的实验方法包括分子，生化，微生物和重组DNA技术。此类技术已在文献中得到详细解释。参见例如，″Molecular Cloning：Alaboratory Manual″Sambrook等，(1989)；″Current Protocols in MolecularBiology″Volumes I-III Ausubel，R.M.，编.(1994)；Ausubel等，″Current Protocols in Molecular Biology″，John Wiley和Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，″A PracticalGuide to Molecular Cloning″，John Wiley&Sons，New York(1988)；Watson等，″Recombinant DNA″，Scientific AmericanBooks，New York；Birren等(编)″Genome Analysis：A LaboratoryManual Series″，Vols.1-4，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，New York(1998)；美国专利号4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中描述的方法；″CellBiology：A Laboratory Handbook″，Volumes I-III Cellis，J.E.，编(1994)；″Current Protocols in Immunology″VplumesI-III Coligan J.E.，编(1994)；Stites等(编)，″Basic andClinical Immunology″(第八版)，Appleton&Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell和Shiigi(编)，″Selected Methods inCellular Immunology″，W.H.Freeman和Co.，New York(1980)；可使用的免疫测定法在专利和科技文献中得到广泛描述，参见例如，美国专利号3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；″Oligonucleotide Synthesis″Gait，M.J.，编(1984)；″Nucleic Acid Hybridization″Hames，B.D.，和Higgins S.J.，编(1985)；″Transcription and Translation″Hames，B.D.和Higgins S.J.编(1984)；″Animal Cell Culture″Freshney，R.I.，编(1986)；″Immobilized Cells and Enzymes″IRL Press，(1986)；″A Practical Guide to Molecular Cloning″Perbal，B.，(1984)；以及″Methods in Enzymology″Vol.1317，Academic Press；″PCR Protocols：A Guide To Methods AndApplications″，Academic Press，San Diego，CA(1990)；Marshak等，″Strategies for Protein purification andCharacterization-A Laboratory Course Manual″CSHL Press(1996)，所有这些文献以引用方式纳入本文，如同在本文中进行了完整的描述。其他的一般参考在本文件中提供。其中的方法被认为是本领域公知的并被提供以方便读者。其中包含的所有信息以引用方式纳入本文。
实施例1
抗人精子抗体的制备
通过将P3-X63-Ag8-653小鼠骨髓瘤细胞与来自Balb/c小鼠(其用Tergitol NP-40去垢剂溶解的人附睾精子免疫)的淋巴细胞融合，来制备抗人精子抗原的单克隆抗体。在间接免疫荧光法中，就对甲醇固定的精子是顶体阳性的和对未固定的精子是质膜阳性的，测试得自注射了这些杂交瘤的小鼠的腹水。验证抗体与鼠和兔精子的交叉反应性。
如所述的(Naz，R.K.等Proc Natl Acad Sci USA(1986)83(15)：5713-7)，通过使用单克隆抗体MA-24的免疫亲和层析，从脱氧胆酸或者二碘水杨酸锂溶解的小鼠睾丸中纯化受精抗原，FA-1。如上制备另外的抗FA-1单克隆抗体，并且也验证其与人和兔精子的交叉反应性。
实施例2
抗人精子抗体的克隆
RNA制备：
选择分泌杀精子或减少精子细胞运动性的抗体的杂交瘤细胞。将细胞培养并计数，以便使用FastTrack 2.0试剂盒(Invitrogen)处理1千万个细胞以收集RNA。使用去垢剂裂解和蛋白降解缓冲液从细胞中直接分离总RNA。随后使用其中mRNA结合到oligo dT树脂上的修改的Aviv和Leder方案分离Poly(A)+RNA。随后用低盐缓冲液清洗树脂以去除多余的总RNA，且Poly(A)+RNA被从树脂上洗脱。260nm和280nm处的光谱分析指示Poly(A)+RNA的终浓度。
Poly(A)+RNA的反转录和扩增
鉴定抗体的表位识别区域和互补决定区(CDR)，并设计作为探针检测Ig重链和轻(κ)链亚单位的寡核苷酸。
重链寡核苷酸获自Ig-Prime试剂盒(Novagen)，并用dH2O稀释到1.0μg/μl的终浓度。
使用Promega的Access RT-PCR系统在单个反应中进行各杂交瘤Poly(A)+RNA的反转录和聚合酶链式反应扩增。简言之，将5μg杂交瘤Poly(A)+RNA，1μg每条适合的引物(用于重链的引物1和2，用于轻链的引物3和4)，1μl 10mM dNTP混合物，10μl 5×AMV反转录缓冲液，2μl 25mM MgSO4，1μl AMV反转录酶，1μl Tf1聚合酶和30μl无核酸酶的dH2O在0.5ml的微量离心管中混合。依照标准方案进行PCR反应并优化循环温度和时间。在琼脂糖凝胶上分析扩增的产物，并进行凝胶纯化。
抗体克隆和测序
将经凝胶纯化的产物亚克隆到适合的载体上，所述载体产生高产量的产物。将载体，缓冲液，cDNA和T4DNA连接酶在室温下孵育1小时，并随后在65℃加热10分钟。使用超级感受态(Supercometent)大肠杆菌细胞，将DNA加入到细胞中并在冰上孵育，随后在42℃加热，并加入SOC培养基。随后细胞在37℃摇动水浴中孵育1小时。然后将这些细胞涂布在含选择化合物的LB皮氏培养皿上并在37℃孵育过夜。选择阳性克隆并培养以纯化质粒。
依照制造商说明书，使用Qiagen-tip 20柱纯化质粒。
为了确认cDNA插入物在纯化的质粒中的存在，以适合的限制性内切酶消化每个克隆，并且将消化产物在琼脂糖凝胶上电泳。对含有插入物的克隆进行测序。
重链和轻链克隆的序列分析
依照制造商说明书，使用Fidelity试剂盒(Oncor)测序阳性克隆。测序反应物由质粒DNA，引物(如位于pCR-Script载体5’克隆位点上游的T3引物)，和dH2O组成，其被加热到95℃5分钟，加入退火缓冲液，随后反应物在37℃孵育15分钟。通过添加反应缓冲液，33PαATP，T4DNA聚合酶和dH2O来标记反应物，并在400℃孵育15分钟，随后加入A，C，G或T终止混合物并在40℃孵育5分钟。通过加入蛋白酶K溶液来终止反应，并在加载于丙烯酰胺测序凝胶上之前将其加热到95℃。凝胶随后在2000伏下电泳2小时，在Whatman 3MM滤纸上在真空下干燥，并在室温下暴露至X射线胶片过夜。在胶片显影后，在灯箱上判读凝胶。
也可以使用自动化DNA测序仪(如ABI Prism 377)进行测序。对于每个克隆，将cDNA和引物与四种染料标记的双脱氧核苷酸以及AmpliTaq聚合酶FS混合。将整个反应物加载到单个泳道中，在36cm便于读取的5.0％丙烯酰胺凝胶上电泳。用激光扫描与CCD相机成像来实现单独的电泳片段的实时检测。
表达载体的构建
获得如McCracken A.等(2000)Arch.Microbial.173：383-389；Perez-Casal，j.等(2003)Mol.Microbiol.8：809-819；Kruger C.等(2002)Nature Biotechnology 20：702-706；Rao，S.等(2005)PNAS 102：11993-11998；Liu X.等(2006)Antimicrobial Agents and Chemotherapy 50：3250-3259；del RioB.等(2008)Clinical and Vaccine Immunology 15：1429-1435；美国专利号7,312,076，或欧洲专利号1 011 721 B1中描述的表达载体，或者其变体可以通过本领域已知的方法制备。
可选地，如下构建载体：
通过将大肠杆菌复制起点从pBluescript亚克隆到骨架载体(Fons，M.，等(1997)Plasmid 37，199-203)中，并随后去除全长的M6编码区(PstI)来创建穿梭载体。将该质粒用SmaI消化，用NdeI部分消化，用DNA聚合酶I(Klenow片段)填充并自连接。得到的质粒含有与乳杆菌兼容的复制起点(repA)和阳性选择标记，如抗生素抗性基因，并已用于在多种乳杆菌物种中表达异源蛋白。
将扩增的抗体片段克隆入载体
将对应于重链和轻链的扩增产物凝胶纯化并重悬浮于dH2O中。可以通过组装PCR(Stemmer W.P.等，(1995)Gene 164：49-53)重新编码(recode)抗体，以更密切符合最佳乳杆菌密码子使用。
通过PCR扩增来构建表达盒，并将其亚克隆入载体的适合位点。表达盒含有四种组件，包括乳杆菌兼容性启动子元件，抗体片段，用于分泌的信号序列或细胞壁锚定结构域。在每种组件之间从5′到3′端分别放置独特的限制性位点。通过使用Pfu DNA聚合酶来进行每个组件的PCR扩增。通过用5′-GTG GAG CTC CCC GAAAAG CCC TGA CAA CCC-3′和5′-GGA AAC ACG CTA GCA CTA ACT TCATT-3′引物扩增来产生来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的P23启动子(van der Vossen，J.M.，等(1987)Appl.Environ.Microbiol.53，2452-2457)。为指导抗体的分泌，设计引物以扩增在5′和3′末端分别具有独特位点的，从推定的核糖体结合位点到信号肽酶切割位点的卷曲乳杆菌S-层基因(cbsA)序列。随后，对应于MKKNLRIVSAAAAALLAVAPVAA的扩增的S-层信号核苷酸序列(CbsAss)被消化并用于克隆到表达盒中。
将产物连接到载体中，将TAA终止密码子插入到锚定基序的N-末端以确保分泌。在转化到乳杆菌菌株中之前进行序列验证。
乳杆菌转化
细菌菌株和培养。卷曲乳杆菌，格氏乳杆菌(L.gasseri)和詹氏乳杆菌等的天然发生的人阴道分离株可以从健康志愿者的阴道拭样获得，或者可选地，可以使用商业上可获得的菌株，将其在37℃(5％CO2/95％空气)下用de Man，Rogosa and Sharpe(MRS)培养基或Rogosa SL培养基(Difco)培养。对于蛋白表达分析，也使用Medium 199(Invitrogen)。通过电穿孔将质粒导入大肠杆菌DH12S(Invitrogen)中。为了保持质粒，在37℃将转化的大肠杆菌DH12S在补充了红霉素(300μg/ml)的LB培养基(Difco)中培养。基本上如对于格氏乳杆菌所描述的(Luchansky，J.B.，Tennant，M.C.&K1aenhammer，T.R.(1991)J.Dairy Sci.74，3293-3302)，通过电穿孔将质粒转化入詹氏乳杆菌中。转化的詹氏乳杆菌在含有20μg/ml红霉素的液体培养基中常规地增殖。
如下文所述探测工程化乳杆菌的抗精子活性。
实施例3
一系列抗精子scFv的产生
文库构建
使用人scFv丝状噬菌体展示文库，以分离抗精子蛋白的人VH-VL紧密联系(tethered)的可变结构域。使用根据在V Base(http://vbase.mrccpe.cam.ac.uk)获得的序列而设计的引物并按照Barbas&Lerner(Barbas，Bain等1992 Proc Natl Acad SciUSA 89(10)：4457-61；Gram，Marconi等1992 Proc Natl AcadSci USA 89(8)：3576-80；Zebedee，Barbas等1992 Proc NatlAcad Sci USA 89(8)：3175-9；Barbas，Amberg等1993 Gene137(1)：57-62)，Winter(Hawkins，Russell等1992 J Mol Biol226(3)：889-96；Hawkins和Winter 1992 Eur J Immunol 22(3)：867-70；Hoogenboom，Marks等1992 Immunol Rev 130：41-68；Hoogenboom和Winter 1992 Immunol Rev 130：41-68；Marks，Griffiths等，1992 Biotechnology(N Y)10(7)：779-83；Marks，Hoogenboom等，1992 J Biol Chem 267(23)：16007-10；Marks和Winter 1992 Behring Inst Mitt(91)：6-12；Orlandi，Gussow等，1992 Biotechnology 24：527-31；Tomlinson，Walter等1992J Mol Biol 227(3)：776-98)和Benhar实验室(Azriel-Rosenfeld，Valensi等2004 J Mol Biol 335(1)：177-92)之前描述的技术来制备人scFv文库。使用人脾脏和外周血淋巴细胞cDNA作为模板，进行抗体基因的PCR扩增。在该文库中，人重链和轻链可变结构域的库被以组合的方式联系在一起，以产生所有可能的VH-VL人工结合分子的组合，所述人工结合分子与m13丝状噬菌体p3基因融合，随后融合的蛋白在噬菌体表面上展示(通常平均每个噬菌体单个拷贝)。
精子抗原
分别从精子抗原FA-1和YLP(12)设计肽。下面的肽1是从抗原FA-1设计的35个残基的肽，而下面的肽2是YLP(12)肽。所述肽被生物素化以易于与下面所述方法中的磁珠结合。由于肽序列相对较短，肽2在生物素与肽之间加入了连接物。如下文所述，针对两种肽筛选噬菌体展示scFv文库。
抗体筛选
文库储备物在LB+Amp(100μg/ml)+1％葡萄糖中在37℃下培养。加入助手噬菌体M13KO7，并且培养物与助手噬菌体一起在100μg/ml Amp+30μg/ml kan存在下在30℃孵育过夜。以4000RPM旋转培养物10分钟，上清通过0.45微米过滤器过滤，加入1/5体积的PEG/NaCl，将滤液置于冰上最少1小时，随后以4000RPM旋转30分钟，之后将含噬菌体的沉淀物悬浮于PBS中。以4％BSA封闭噬菌体最少30分钟，并按照R.Kontermann和S.Dubel(编)，Antibody Engineering Vol.1，Springer-Verlag BerlinHeidelberg 2010，pages 267-287中描述的方案，完成基于磁珠的抗体选择。以2％BSA进行封闭最少30分钟。将封闭的珠粒加入封闭的噬菌体中，然后取出珠粒，由此取出结合链霉亲和素的所有噬菌体。随后将封闭的噬菌体与生物素孵育30分钟，接着与珠粒孵育30分钟，之后弃去珠粒。
将噬菌体与下列肽孵育1小时：
ACGVSRPVIACSVTIKEGSQLKQQIQSIQQSIERL(SEQ ID NO：1)-----生物素；和YLPVGGLRRIGG(SEQ ID NO：2)----Ahx---并随后与珠粒孵育30分钟，清洗并洗脱。随后将中和的洗脱液与dh5αF+细胞在37℃混合60分钟并在LB+100μg/ml Amp+1％葡萄糖平板上培养过夜。淘选的步骤被重复多个循环。
抗体片段特异性
使用肽作为探针进行ELISA测定，并通过O.D.评估片段相对亲和力。
将用淘选出的噬菌体(如上所述)感染的大肠杆菌TG-1铺板以产生个体菌落。将这些菌落挑入平底无菌96孔板的孔中的100μl YTAG培养基中并在30℃，以150RPM摇动培养。将10μl噬菌体转移到含有90μl YTAG+2.5μl/ml(5X108CFU)M13KO7助手噬菌体的新鲜96孔板中，并在37℃在不摇动的情况下培养30分钟，随后以150RPM摇动培养30分钟。板在4000RPM，14℃下离心5分钟，弃去上清。加入200μl/孔的YTAK(含有卡那霉素)并将板在30℃，150RPM下摇动培养过夜。随后细菌平板在4000RPM，4℃下离心5分钟，然后将与100μl PBST混合的100μl上清用于ELI SA。
将100μl/孔的抗原和对照抗原铺于ELISA平板上4℃过夜，以包被平板。ELISA平板用清洗缓冲液(300μl/孔的PBST)清洗一次，并用3％牛奶/PBS在室温下(RT)封闭1小时。平板用清洗缓冲液清洗一次。随后向平板中加入噬菌体并在室温下孵育1小时，接着以清洗缓冲液清洗3次。加入50-100μl/孔的HRP缀合的抗噬菌体，稀释的抗M13噬菌体抗体，并在室温孵育1小时。在用清洗缓冲液清洗3次之后，加入100μl/孔的OPD底物溶液，在室温下孵育20分钟。随后以50ml 1M HCL溶液终止反应，在450nM处读板。使用辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗噬菌体抗体实现检测，使用自动化ELISA读取器读取从底物-酶反应得到的颜色。
另一个ELISA方案用2μg/ml BSA-生物素(在PBS中)在室温下包被平板2小时。平板用PBST清洗并随后用2μg/ml链霉亲和素(在PBS中)在室温下包被2小时，并再次用PBST清洗。平板随后用2μg/ml的肽在PBS中在4℃包被过夜，用PBST清洗一次并用3％牛奶/PBS溶液在37℃封闭1小时，该方案的其余部分与上述方案相同，除了平板用50μl/孔的在SDDW中稀释4倍的TMB(四甲基联苯胺)终止试剂显影，并在5分钟后用50μl/孔的1M H2SO4终止之外。
结果
图1以图形方式描述了分离并克隆的噬菌体展示的scFv对用作探针的精子肽的相对亲和力。1-3列显示了三种scFv与源于FA-1的肽的结合，而4-6列显示了三种scFv与源于YLP(12)的肽的结合。BSA被用作阴性结合对照。与对照相比，所述scFv显示出显著的对所指示的肽的亲和力。图2描述了分离并克隆的某些噬菌体展示的scFv对用作探针的精子肽的相对亲和力。图3显示了鉴定一系列非结合scFv的ELISA结合测定的结果，这些非结合scFv随后被用作对照。在本文中，通常使用一个这样的scFv克隆，J112。克隆J102显示出比其他克隆以及对照A和B更大的亲和力，对照A和B分别为不含有scFv噬菌体，或不含有肽和scFv的样品。通过测量用抗噬菌体HRP标记的抗体(抗PVIII的抗体)探测的样品中的OD来检测结合。这些scFv中的一些随后用于下面的实施例中，按照其所适合的，用作对照和避孕药。
实施例4
表达scFv的工程化乳杆菌
抗体克隆和测序
按照既有方案，通过用Nco I和Not I酶切消化，将scFv从噬菌粒基因组中释放，以在噬菌体克隆中展示完整的scFv片段。将凝胶纯化的产物亚克隆到Dr.Jos Seegers馈赠的pSLP111.1载体中，其产生高产量的产物。图4A中提供了载体的图谱。通过用独特的引物PCR扩增scFv来进行亚克隆，所述引物在5′引物上含有Nco I限制性位点而在3′引物上含有AscI位点(5′-GCG CCATGG CCG AGG TGC AGC TGT TG，3′-GCG GGC GCG CCC CAG CAC AGT GAGTTT GGT CCC)。凝胶纯化扩增的DNA，并且通过用NcoI和AscI切割来激活限制性位点。随后，限制性酶切的DNA片段被再次凝胶纯化，并且被连接到(使用T4连接酶)之前已用NcoI和AscI酶切并凝胶纯化的PSLP111.1载体上。连接化合物用于转化大肠杆菌DH5α，所述大肠杆菌DH5α用氯化钙技术(Maniatis)制备为感受态。将转化的细菌涂布于LB琼脂氯霉素平板上(10微克/mL)，在孵育过夜后挑取菌落，并且从24个菌落中制备质粒DNA。使用Qiagen miniprep质粒试剂盒从这些菌落中制备质粒DNA，并用NcoI和AscI进行酶切，以鉴定含有适合大小的DNA插入物的菌落。随后如下文所述，将阳性克隆转移到詹氏乳杆菌中。
依照制造商说明书，使用Qiagen-tip 20柱纯化质粒。
为了确认cDNA插入物在纯化的质粒中的存在，以NcoI-AscI消化每个克隆，并且将消化的产物在琼脂糖凝胶上电泳。对含有插入物的克隆进行测序。
重链和轻链克隆的序列分析
通过Weizman研究所的测序服务来测序阳性克隆，其中以按照制造商说明书的所有条件和试剂使用ABI自动测序仪。使用的初始测序引物为：
正向CCATGATTACGCCAAGCTTGGGAGCC(SEQ ID NO：9)
反向GAATTCAACCTTCAAATTGCC(SEQ ID NO：10)
将扩增的抗体片段克隆入载体
将凝胶纯化的扩增产物亚克隆入载体的适合位点。表达盒含有四个组件，包括与乳杆菌兼容的启动子元件，抗体片段，用于分泌的信号序列或细胞壁锚定结构域。
在转化入乳杆菌菌株之前，进行序列验证。
乳杆菌转化
使用编号25258的詹氏乳杆菌菌株ATCC人阴道分离株，并将其在37℃(5％CO2/95％空气)下用de Man，Rogosa and Sharpe(MRS)培养基(Difco)培养。通过氯化钙技术将含有插入片段的pSLP111.1导入詹氏乳杆菌。转化的詹氏乳杆菌在含有10μg/ml红霉素的液体培养基中常规地增殖。
精子结合和运动性测定
按照既有的方案分离小鼠精子[Liu Z等，Journal ofBiological Chemistry(2010)285，2758-2770]。将106个精子悬于锥形管里的精子缓冲液(Ham′s F-10，补充有21mM HEPES；4mM碳酸氢钠；0.6％人血清白蛋白；3.6ml乳酸钠(60％储备液)和庆大霉素：10微克/ml)中，以促进其游到管顶部的能力的方式保存精子，其中通过取出小体积(数百微升)的缓冲液来收集能动的精子。通过血球计数器验证精子计数，并以1∶1或1∶2的精子∶乳杆菌(cfu)的比率孵育精子。
分离小鼠精子，并通过使用噬菌体展示scFv的结合测定来评估scFv与精子的结合。如上所述的游动测定用于选择能动的精子，其被分离并置于腔室玻片中，风干，随后将含有目的scFv的噬菌体(108)应用于腔室中，并孵育1小时，清洗，随后用以1∶200稀释的连接至HRP的抗-cp8抗体(ENCO，Israel)探测精子，随后清洗腔室，并以DAB和过氧化物显影。
结果
图4B显示了质粒的NcoI和NotI消化产物。以NcoI-和NotI在37℃酶切质粒3小时。
发现一种实施的scFv，J102具有对高度保守的精子抗原的高结合亲和力。测序该克隆得到了如图5A-5B中所示的完整DNA和蛋白序列(SEQ ID NO：7-8)。
就与人和鼠精子的结合探测scFv J102等。尽管scFv J102是来自人的片段，但FA-1抗原的物种间的高度保守性导致J102能与鼠和人精子结合，如体外测定所确定的。图6A显示了表达scFv的乳杆菌与小鼠精子的显著结合，其中几乎每一个评价的精子细胞都显示出显著的染色，然而表达抗非精子抗原的scFv的对照乳杆菌未与鼠精子显著结合(图6B)。人精子结合研究与小鼠中的发现一致(数据未显示)。
如上文方法部分中所描述的，以人精子进行运动性研究。虽然表达无关对照的乳杆菌在体外显示对精子运动性的中度影响，但是当使用表达结合精子的scFv的乳杆菌时，观察到削弱精子运动性的显著效果，其包括在检测scFv J102的效果的测定中发现，与对照相比，运动性降低了50％，这表明了表达结合精子的scFv的乳杆菌干扰精子功能的潜力。
实施例5
工程化詹氏乳杆菌的抗精子活性
受精的抑制
将各个物种的105个精子在相关和对照抗体(以1∶50，1∶5或1∶1稀释)，或者产生对照和相关抗体的构建体的溶液中冷孵育过夜，然后加入卵子，此时允许精子与卵子的结合进行1小时。随后清洗卵子，确定每个卵子结合的精子的数量，并将其表示为与对照样品结合的精子数的百分数。进一步评价具有最大抑制百分数的构建体。
体内受精抑制研究
将纯化的相关抗体片段，纯化的对照抗体片段，表达相关抗体片段的工程化乳杆菌，和表达对照抗体片段的工程化乳杆菌注入雌性(小鼠，兔)阴道内。在将各种试剂施用到雌性阴道内后的多个点将1只雄性与2-4只雌性关在一起。分组后24小时，每日目视检查雌性中阴道栓的存在。标记雌性以在它们之间进行区分(例如通过连续耳部打孔)和任选地，在交配开始后两周，将雌性移到单独的笼中。3周后，计数产仔的怀孕雌性和后代。随后选择具有最大避孕活性的构建体并进行进一步的评价/优化。
如下进行融合抑制测定。年轻雌性小鼠(8-10周龄)被腹膜内注射5个单位的在0.9％NaCl中的孕马血清(PMS)。48小时后，小鼠被腹膜内注射5个单位的在0.9％NaCl中的hCG(人绒毛膜促性腺激素)以触发超排卵。注射hCG 14-16小时后，收集排出的卵母细胞并用透明质酸酶处理以去除卵丘细胞。用蛋白酶混合物去除透明带。将无透明带的卵子在培养基中与指定浓度的肽孵育30分钟[Hogan，B.等，Manipulating The Mouse Embryo，91-101，(1986)]。从雄性小鼠附睾收集的精子通过孵育来催熟，并如Fleming和Yanagimachi[Gamete Res.4，253-273(1981)]所述进行顶体反应，然后在对照和相关抗体，和表达对照和相关抗体的构建体的存在下被加入到卵子中，并孵育15分钟。随后卵子被转移到无精子培养基中，并孵育另外1小时45分钟。随后如Primakoff等[J.Cell.Biol.104，141(1987)]所述，固定并染色卵子。随后计数膨胀的精子头部的总数。膨胀的精子头部是精子和卵子已经融合的标志。
基于这些观察，计算若干指数。通过将膨胀的头部的总数除以卵子的总数来确定受精指数(F.I.)。受精率(F.R.)为受精的卵子的百分数。通过将实验肽的受精指数除以对照肽的受精指数来确定抑制百分数。选择具有最大活性的构建体。
实施例6
用作有效避孕药的工程化的詹氏乳杆菌
按照实施例4中描述的方法，检测其他动物物种。评价了兔，大鼠，豚鼠，迷你猪，猴子和其他物种。在该情况下，评价了数种构建体，并且注意动物物种的差异。在每个动物品系中确定每种构建体的有效性百分数。
此外，使用从验证了繁殖力的雄性获得的精液，对每个物种进行AIF，其中评估了精子计数和运动性。阴道内施用表达相关和对照抗体片段的乳杆菌，并在施用后的不同时间进行AIF。在人工授精时，通过注射例如100IU hCG来诱导排卵。在排卵和人工授精后，允许雌性完成怀孕过程以评估其潜在的致畸效果。
评价给雌性施用的乳杆菌对照和表达相关抗体片段的乳杆菌在生殖道中的持久性。
为此，通过将无菌PBS反复吹吸入阴道口来收集阴道分泌物。通过在微量离心机中短暂旋转来混合液体和粘液，测定上清液中scFv的存在。通过ELISA确定血清和阴道清洗物中的抗精子抗体片段的滴度。
进行时间进程研究。将施用了乳杆菌的雌性重复地与雄性关在一起，并评估妊娠率/避孕效果，将其作为施用后时间的函数。
实施例7
表达结合精子的scFv的詹氏乳杆菌是小鼠的有效避孕药
小鼠施用和交配研究
用0.1ml/gm体重的氯胺酮溶液(浓度100mg/ml)，0.5ml赛拉嗪(浓度20mg/ml)和8.5ml 0.9％生理盐水麻醉雌性ICR小鼠。随后麻醉的小鼠被阴道内施以108个新鲜培养的指数中期的(通过OD来确定)工程化詹氏乳杆菌J102或对照J112株。(N＝12只小鼠每组)。施用之后，雌性被保持仰面，骨盆向上倾斜30-60分钟。每日给雌性施用乳杆菌，进行3天，随后与年龄匹配的ICR品系雄性交配。将雄性与雌性关在一起7天，在此期间将雄性每隔一天轮换，然后移走。然后目视评估雌性中栓的存在，记录怀孕的小鼠的数目和每笼产生的后代的数目。
小鼠定殖研究
在第一次阴道内施用后12到24小时之间，雌性被以拭子擦拭或灌洗阴道，并将回收的样品/液体涂布在含氯霉素的MRS平板上并在37℃培养24小时。菌苔的存在用作阴道定殖的指示。
结果
小鼠定殖研究表明，高达50％的灌洗液产生了菌苔，这表明，在单次阴道内施用后，高达50％的小鼠中发生了定殖。在通过擦拭来显示定殖的动物中发现，施用的乳杆菌的阴道内持久性高至施用后5天。
进行两个单独的实验，其中雌性被施以表达抗精子scFv的詹氏乳杆菌或对照菌株，并且在每个实验中，都证实了有效的避孕(图7A)。虽然在每个实验中，92％的对照雌性怀孕，但是用表达抗精子scFv的詹氏乳杆菌处理的雌性显示出妊娠率的明显降低(58％或50％)。
作为施用表达抗精子scFv的詹氏乳杆菌的结果，总后代数目和每笼的后代数目，与对照相比，也降低(图7B)。基于这些发现，与对照相比，被处理的雌性中每只小鼠的后代数目也降低。
实施例8
生物学避孕药的安全性
评价工程化乳杆菌对阴道应激性的影响。以乳杆菌阴道内处理动物例如小鼠，每日一次，进行连续10-30天。随后处死动物，并通过肉眼和显微镜检查生殖道。
检查阴道组织的上皮溃疡，水肿，白细胞浸润和血管充血，将其作为导入乳杆菌，和表达对照和相关抗体的工程化乳杆菌的函数。将用工程化乳杆菌处理的动物与施用了天然分离株的动物，以及未处理的动物相比较。如果存在的话，将注意到生殖道组织学的改善。
实施例9
避孕药的可逆性
尽管重复交配但仍然没有妊娠(由于施用乳杆菌)的雌性动物被施以抗生素并进行交配。评价妊娠，作为工程化乳杆菌的可逆性的量度。类似地，评价动物生殖道中乳杆菌的持久性。在指示工程化乳杆菌群体的减少或消失后，将动物进行交配，并确定它们的妊娠次数(gravidity)。
一旦已经在适合的动物模型中进行了安全性和有效性研究(例如，如上文所描述的)，则随后也考虑进行人体临床试验。
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Figure IPA00001657088400031
Figure IPA00001657088400041
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Claims (25)

1.基因工程化的雌性生殖道共生细菌，其中所述基因工程化的细菌被工程化以表达抗精子剂。
2.权利要求1的工程化细菌，其中所述抗精子剂是抗精子的scFv抗体片段。
3.权利要求2的工程化细菌，其中所述抗精子的scFv抗体片段是人的或人源化的。
4.权利要求2的工程化细菌，其中所述scFv抗体片段与顶体或质膜特异性相互作用。
5.权利要求2的工程化细菌，其中所述scFv抗体片段与精子颈部区域特异性相互作用。
6.权利要求2的工程化细菌，其中所述scFv抗体片段与精子FA-1抗原或其片段特异性相互作用。
7.权利要求2的工程化细菌，其中所述scFv抗体片段跟与SEQ ID NO：1或2具有至少90％同一性的肽特异性相互作用。
8.权利要求2的工程化细菌，其中所述scFv抗体片段具有与SEQ ID NO：8具有至少90％同一性的序列。
9.权利要求2的工程化细菌，其中所述scFv抗体片段由多核苷酸编码，该多核苷酸具有与SEQ ID NO：7具有至少90％同一性的序列。
10.权利要求1的工程化细菌，其中所述共生细菌是乳杆菌。
11.权利要求8的工程化细菌，其中所述共生细菌是詹氏乳杆菌，卷曲乳杆菌或干酪乳杆菌。
12.权利要求1的工程化细菌，其中所述共生细菌是乳球菌。
13.权利要求1的工程化细菌，其中所述共生细菌是大肠杆菌Nissle 1917株。
14.权利要求1的工程化细菌，其中所述共生细菌是戈登氏链球菌。
15.包含权利要求1的工程化细菌的组合物。
16.权利要求15的组合物，其中所述组合物是阴道栓剂，海绵，乳膏或泡沫的形式。
17.权利要求15的组合物用于雌性避孕方法的用途。
18.权利要求15的组合物在制备用于降低雌性群体妊娠的发生率的药物中的用途。
19.权利要求15的组合物在制备用于降低雌性群体受精的发生率的药物中的用途。
20.权利要求1的工程化细菌在制备用于降低雌性群体妊娠的发生率的药物中的用途。
21.权利要求1的工程化细菌在制备用于降低雌性群体受精的发生率的药物中的用途。
22.插入阴道的装置，其包含权利要求1的工程化细菌。
23.权利要求22的插入阴道的装置，其中所述装置是插入阴道的环。
24.避孕的方法，所述方法包括将雌性对象生殖道细胞与在所述雌性对象中能有效抑制或阻止精子运动性、精子-卵子融合或卵子穿透的量的权利要求1的工程化细菌相接触的步骤。
25.权利要求24的避孕方法，所述方法包括将雌性对象生殖道细胞与在所述雌性对象中能有效抑制或阻止精子运动性，精子-卵子融合或卵子穿透的量的权利要求15的组合物相接触的步骤。
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