MX2012012576A - Anticonceptivos femeninos biologicos. - Google Patents

Abstract

Esta invención proporciona, entre otras cosas, los organismos comensales preparados por ingeniería para expresar fragmentos de anticuerpos, que inhiben la motilidad del esperma o la fertilización y composiciones que comprenden los mismos. La presente invención se proporciona para el uso de los organismos comensales preparados por ingeniería o composiciones que comprenden los mismos como medios de anticoncepción efectivos en sujetos del sexo femenino.

Description

ANTICONCEPTIVOS FEMENINOS BIOLÓGICOS CAMPO DE LA INVENCION Esta invención proporciona organismos comensales preparados por ingeniería para expresar fragmentos de anticuerpo, que inhiben la motilidad del esperma, fertilización o una combinación de los mismos y composiciones que comprenden los mismos. La presente invención se proporciona para el uso de tales organismos comensales preparados por ingeniería o composiciones que comprenden los mismos como anticonceptivos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El desarrollo de nuevos anticonceptivos es necesario para proporcionar métodos anticonceptivos accesibles para todas las personas, a pesar de las limitaciones sociológicas, económicas o de educación.

Aunque están disponibles actualmente un número de anticonceptivos diferentes, ninguno está libre de problemas. Por el momento, el anticonceptivo utilizado más comúnmente es una formulación de estrógeno, progesterona, o combinación de los mismos, que aunque es eficaz, no obstante, se ha sugerido que es preneoplásica, con el uso prolongado, y en algunas poblaciones.

Los métodos de barrera, tal como el diafragma, o el dispositivo intrauterino, muestran una eficacia reducida, e incumplimiento con el anterior, y mayor riesgo de enfermedad inflamatoria pélvica con el uso de este último. Los espermicidas también se han utilizado en este contexto, con menos eficacia, y por lo tanto, . se asocia con dicho uso un mayor riesgo para enfermedad de transmisión sexual.

De esta manera, se necesita anticonceptivos mínimamente invasivos, de forma fácil de usar, que no estén asociados con las limitaciones anteriores.

SUMARIO DE IA INVENCIÓN La invención proporciona, en una modalidad, una célula preparada por ingeniería genética que produce un fragmento de anticuerpo contra un antígeno de esperma, y por ello puede servir como un anticonceptivo.

En una modalidad, la invención proporciona una bacteria comensal preparada por ingeniería del tracto genital femenino, en donde la bacteria está preparada por ingeniería para expresar un anticuerpo para el esperma, o un fragmento del mismo, efectivo para prevenir la motilidad del esperma, fusión del esperma-óvulo o la penetración del esperma del óvulo, o una combinación de los mismos. En algunas modalidades, el fragmento de anticuerpo es una molécula Fv de cadena sencilla (scFv).

En algunas modalidades, el fragmento de anticuerpo especifico para un antigeno de esperma es derivado de humano o humanizado. En algunas modalidades, el fragmento de anticuerpo interactúa específicamente con un acrosoma o antígeno localizado en la membrana de plasma en el esperma o un fragmento del mismo. En algunas modalidades, el fragmento de anticuerpo interactúa específicamente con un antígeno localizado en la región del cuello del esperma o un fragmento del mismo. En algunas modalidades, el fragmento de anticuerpo se secreta de la bacteria preparada por ingeniería, y en algunas modalidades, el fragmento de anticuerpo está asociado con o unido a la pared 'de la célula bacteriana.

En algunas modalidades, la bacteria preparada por ingeniería es Lactobacillus, o en algunas modalidades Lactococcus . En algunas modalidades, la bacteria preparada por ingeniería es la cepa Escherichia coli Nissle 1917. En algunas modalidades, la bacteria preparada por ingeniería es S. gordonii.- En algunas modalidades, la bacteria preparada por ingeniería es L. jensenii o L. crispatus .

En algunas modalidades, el scFv interactúa específicamente con un péptido que comparte al menos 90% de identidad con la SEQ ID NO: 1 o 2. En algunas modalidades, el scFv tiene una secuencia que comparte al menos 90% de identidad con la SEQ ID NO: ' 8. En algunas formas de modalidad, el scFv está codificado por un polinucleótido que tiene una secuencia que comparte al menos 90% de identidad con la SEQ ID NO: 7.

En algunas modalidades, la invención proporciona una composición que comprende la bacteria preparada por ingeniería como se describe en la presente. En algunas modalidades, la composición está en la forma de un supositorio, crema o espuma vaginal. En algunas modalidades, el anticonceptivo se asocia con o se incorpora en un anillo vaginal.

En algunas modalidades, la invención proporciona un método de anticoncepción, dicho método comprende las etapas de poner en contacto células del tracto genital de un sujeto del sexo femenino con bacterias preparadas por ingeniería como se describe en la presente en una cantidad suficiente para inhibir o prevenir la motilidad del esperma, fusión del esperma-óvulo o penetración del óvulo en el sujeto del sexo femenino. En algunas modalidades, de acuerdo con este aspecto, el método comprende administrar una composición que comprende la bacteria preparada por ingeniería al tracto genital de un sujeto del sexo femenino que necesita de la misma en una cantidad suficiente para inhibir o prevenir.

En algunas modalidades, la invención proporciona un método para reducir la incidencia de embarazo en una población femenina, el método comprende las etapas de poner en contacto células del tracto genital de un sujeto del sexo femenino con bacterias preparadas por ingeniería como se describe en la presente . en una cantidad suficiente para afectar, inhibir o prevenir la motilidad del esperma, fusión del esperma-óvulo o penetración del óvulo en el sujeto del sexo femenino, por ello se reduce la incidencia de embarazo en un sujeto del sexo femenino y por ello se reduce la incidencia de embarazo en una población femenina.

En algunas modalidades, la invención proporciona un método para reducir la incidencia de la fertilización en una población femenina, dicho método comprende las etapas de poner en contacto células del tracto genital de un sujeto del sexo femenino con bacterias preparadas por ingeniería como se describe en la presente en una cantidad suficiente para afectar, inhibir o prevenir la motilidad del esperma, fusión del esperma-óvulo o penetración del óvulo en el sujeto del sexo femenino, por ello se reduce la incidencia de ocurrencia de fertilización en un sujeto del sexo femenino y por ello se reduce la incidencia de la fertilización en una población femenina .

En algunas modalidades, la invención se proporciona para el uso de una bacteria preparada por ingeniería o una composición como se describe en la presente en la fabricación de un medicamento para uso en la reducción de la incidencia de embarazo en una población femenina. En algunas modalidades, la invención se proporciona para el uso de una bacteria preparada por ingeniería o una composición como se describe en la presente en la fabricación de un medicamento para uso en la reducción de la incidencia de la fertilización en una población femenina.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 representa gráficamente las afinidades relativas de scFv que muestran fago aislados y clonados contra péptidos de esperma determinados por el ensayo ELISA. Las columnas 1-3 representan el enlace de tres scFvs al péptido derivado de FA-1 de esperma y las columnas 4-6 representan el enlace de tres scFvs al péptido derivado de YLP(12) de esperma. BSA ' sirve como un control de enlace negativo.

La Figura 2 representa las afinidades relativas de algunos scFv que muestran fago aislados y clonados para los péptidos de esperma probados. Los clones se consideraron que tienen alta afinidad cuando el valor OD fue mayor en relación a los controles de péptido contra BSA, o en muestras incubadas sin péptidos. Los clones 102, 103, 105 y 106 en particular, muestran afinidad relativamente alta para el péptido y el clon 102 se caracterizó además in vitro e in vivo .

La Figura 3 representa gráficamente los resultados de los ensayos de enlace ELISA que identifican una serie de scFv no enlazada, que luego se ¦ utilizaron como controles, en comparación con el Clon 102, que como se muestra en la Figura 2 se encontró que tienen buena afinidad para los péptidos probados. Uno de tal clon scFv, J112, se utilizó típicamente en este contexto. Los controles A y B, que fueron muestras que no contienen fago scFv, o sin péptido ni scFv, respectivamente, se evaluaron, también. Se detectó el enlace al medir el OD en muestras probadas con anticuerpo etiquetado HRP anti-fago (anticuerpo de PVIII).

La Figura 4A es un mapa del plásmido del vector pSLPlll.l. La Figura 4B es una fotografía que representa los productos de digestión Ncol y Notl del plásmido. Los plásmidos se cortaron con Ncol y Notl, a 37 °C durante tres horas. El inserto del plásmido se muestra claramente en varios clones representativos.

La Figura 5A representa el ácido nucleico y la secuencia de aminoácidos de J102, respectivamente (SEQ ID NO: 7-8). La Figura 5B representa los dominios respectivos dentro del scFv J102.

Las Figuras 6A-6B representan el enlace especifico de los lactobacilos que expresan J102 al esperma de murino, in vitro. La Figura 6A es una micrografia de luz que muestra el enlace significativo del scFv que expresa lactobacilos al esperma de ratón, con casi cada célula de esperma evaluada que muestra tinción significativa. La Figura 6B es una micrografia de luz de un lactobacilo que expresa J112, que sirve como un control, donde no es evidente el enlace apreciable al esperma de murino.

Las Figuras 7A-7B representan gráficamente la demostración in vivo de la eficacia de lactobacilos que expresan J102. La Figura 7A traza las tasas de embarazo de ratones hembra en dos . experimentos que administran los lactobacilos de control o L. jensenii que expresan J102 scFv anti-esperma que expresan un scFv que no enlaza al esperma (J112), y en cada experimento, se demostró la anticoncepción eficaz en ratones tratados con J102 contra J112. La Figura 7B traza el número de la progenie total y el número de la progenie por jaula en cada uno de los dos experimentos conducidos como se describe en la Figura 7A, y tanto el número de progenie total como progenie por jaula se redujeron en J102 que expresa L. ' jensenii, en comparación con los controles.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Esta invención proporciona, en una modalidad, células recombinantes , que incluyen, en una modalidad, microorganismos y métodos para utilizar los mismos, para la producción de compuestos espermicidas . Los métodos y células, en una modalidad, proporcionan un medio efectivo de anticoncepción .

En una modalidad, la célula recombinante es un organismo comensal del tracto reproductivo femenino. En una modalidad, el organismo comensal es una bact.eria.

En una modalidad, la célula recombinante es una célula no de mamífero, que persiste en la mucosa del tracto genital femenino durante un periodo de tiempo suficiente para expresar un compuesto, que interfiere con la motilidad del esperma, la fusión esperma-óvulo o penetración de esperma del óvulo. En algunas modalidades, el compuesto, cuando se expresa en el tracto genital femenino del sujeto tratado por el organismo comensal coloniza los mismos resultados en fertilidad reducida en el sujeto. En algunas modalidades, el compuesto, cuando se expresa en el tracto genital femenino de los sujetos tratados resulta en una tasa de embarazo reducida en una población administrada con tal organismo comensal.

En una modalidad, la invención se proporciona para un organismo comensal preparado por ingeniería que expresa un compuesto espermicida, cuyo organismo es capaz de colonizar el tracto reproductor femenino o regiones del mismo.

En una modalidad, la célula está preparada por ingeniería para expresar un fragmento de ácido nucleico que es capaz de ser expresado como una proteína específica, incluyendo secuencias reguladoras que preceden (secuencias no codificadas 5' ) y siguen (secuencias no codificadas 3' ) la secuencia de codificación-.

Las bacterias preparadas por ingeniería genética pueden ser preparadas por ingeniería para ser deficientes en genes específicos a través de cualquier medio como se conocerá por alguien experimentado en la técnica, o los organismos preparados por ingeniería pueden prepararse por ingeniería para sobreexpresar ciertos genes, por métodos conocidos en la técnica.

En una modalidad, se introduce un constructo en las bacterias de esta invención, de manera que es posible seleccionar eventos de recombinación homologa en la bacteria para procedimientos para desactivar los genes. Alguien de experiencia ordinaria en la técnica puede fácilmente diseñar un constructo de desactivación que incluye tanto genes de selección positivos como . negativos para seleccionar eficientemente células transfectadas que se someten a un evento de recombinación homologa con el constructo.

En otra modalidad, los cambios en la expresión, actividad y función ' del gen, incluyendo, entre otros, expresión del gen mejorada, disminuida, y abolida pueden realizarse utilizando un constructo genético que se integra en el genoma de la célula. En otra modalidad, los cambios en la expresión, actividad y función del gen pueden realizarse utilizando un constructo genético que es extra-cromosomal, y en una modalidad, sigue siendo extra-cromosomal.

En una modalidad, el término constructo o vector se refiere a vehículo de . ácido nucleico que contiene una secuencia de interés que se ha subclonado dentro del vector.

Para generar los vectores de la presente invención, los polinucleótidos que codifican las secuencias de interés se pueden ligar en los sistemas del vector de expresión adecuados para tran'sducir/transformar células procariotas y para dirigir la expresión de productos recombinantes dentro de las células transducidas/transformadas . Se apreciará que tales sistemas de vectores adecuados se pueden modificar fácilmente a través de técnicas recombinantes comúnmente utilizadas con el fin de reemplazar, duplicar o mutar secuencias potenciadoras o promotoras existentes y/o introducir cualquiera de las secuencias de polinucleótidos adicionales tales como por ejemplo, secuencias que codifican marcadores de selección adicionales o secuencias que codifican genes reporteros.

De acuerdo a otra modalidad, los vectores comprenden además un elemento regulador, tal como un promotor para regular la expresión del ácido nucleico aislado. Tales promotores son conocidos por ser elementos de secuencia que actúan por cis requeridos para la transcripción ya que sirven para enlazar la polimerasa de ARN dependiente de ADN, que transcribe las secuencias presentes corriente descendente del mismo. El vector puede, en otra modalidad, comprender un promotor inducible, o. uno que expresa las secuencias de interés constitutivamente.

Un vector de acuerdo con la presente invención, puede incluir además un origen de replicación, y puede propagarse en más de una especie de célula procariota, y en algunas modalidades, el vector puede ser construido para facilitar su integración dentro del genoma de un organismo de elección. El vector, en otras modalidades puede ser, por ejemplo, un plásmido, un bácmido, un fagémido o un fago, o cualquier vector apropiado, como se apreciará por el técnico experimentado.

Un ejemplo de dicho vector se describe y utiliza en la sección de Ejemplos, más adelante. Se entenderá por el técnico experimentado, sin embargo, que la invención no se limita al uso de cualquiera de tal vector, y que es de rutina en la técnica crear nuevos vectores, y/o modificar vectores existentes, para el objetivo de optimizar la expresión heteróloga de la secuencia insertada o incorporada, para la cual el vector sirve como el vehículo de suministro/preparado por ingeniería genética.

Algunos ejemplos de vectores adecuados para el uso incluyen: M . Posno et al, Appl Environ Microbiol. Junio 1991, 57 (6): 1822-1828; ' M Shimizu-Kadota, et al., Appl Environ Microbiol. Noviembre 1991; 57(11): 3292-3300; T. - Duong, et.al., Microbial Biotechnology Volumen 4, Número 3, páginas 357-367, Mayo 2011; V V Aleshin et al., Mikrobiologiia Volume: . 69, Número: 1, Páginas: 75-80; X. Liu et al., Antimicrobial agents and¦ chemotherapy 2006, vol. 50, no 10, pp 3250-3259; WO/2005/112567 ; Luca Vangelista et. al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Julio 2010, p. 2994-3001, Vol. 54, No 7; Patente de E.U.A. Patente No 7,179,458, Patente de E.U.A. Patente No. 7,754,467; Caren J. Chancey, et . al., The Journal of Immunology, 2006, 176: 5627-5636; Número de Patente de E.U.A. 5,733,540 y otros.

La incorporación de secuencias de ácido nucleico deseadas dentro de las células se puede lograr a través de un número de métodos bien conocidos en la técnica. Los constructos de ácido nucleico pueden ser utilizados para transfectar o transducir establemente o transitoriamente las células.

Hay un número de técnicas conocidas en el arte para introducir vectores en células de la presente invención, tales como, pero no limitados a: técnicas de absorción de ADN directas, y métodos de magnetoporacion y absorción mediados por el receptor, de transduccion mediados por liposoma o ADN lineal, de plásmido, fago que emplean métodos mediados por DEAE-dextrano y mediados por calcio-fosfato de introducción, electroporación o transfección mediada por liposoma, (para detalles adicionales ver,' por. ejemplo, "Methods in Enzymology", vol. 1-317, Academic Press, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel F.M. et al. (Eds.) Greene Publishing Associates,- (1989) y en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989), u otros manuales de laboratorio estándares) . También se prevé el bombardeo con partículas recubiertas de ácido nucleico. Es para entenderse que cualquiera de estos métodos puede ser utilizado para la introducción de las secuencias deseadas en las células, para la producción de las células de esta invención, y para efectuar los métodos de esta invención.

La electroporación s.e ha utilizado con éxito para la transformación de varias células.

La conjugación bacteriana, basándose en el. contacto directo de las células donantes y receptoras, también se puede utilizar para la transferencia de genes en bacterias. Los procesos de conjugación bacterianos pueden involucrar mezclar juntas las células "donantes" y "receptoras" en contacto cercano uno con el otro. La conjugación ocurre por formación de conexione.s citoplasmáticas entre las bacterias donantes y receptoras, con transferencia directa de ADN donante recién sintetizado en las células receptoras. El receptor en una conjugación acepta el ADN a través de la transferencia horizontal de una bacteria donante. El donante en la transferencia conjugativa puede tener un plásmido conjugativo, transposón conjugativo, o plásmido movilizable.

En algunos casos, sólo se requiere un donante y un receptor para la conjugación. Esto ocurre cuando el plásmido a transferirse es un plásmido auto-transmisible que es tanto conjugativo como movilizable (es decir, portando tanto los genes tra como los genes que codifican las proteínas Mob) . En general, el proceso involucra las siguientes etapas: 1) el ADN de plásmido de hebra doble se fragmenta en un sitio específico en oriT; 2) un ADN de hebra sencilla es liberado al receptor a través de un poro o estructura del pilus; 3) una enzima relaxasa de ADN escinde el ADN de hebra doble en oriT y enlaza a una extremo 5' liberado (formando una relaxosoma como la estructura intermedia); y 4) Posteriormente, un complejo de proteínas auxiliares se ensamblan en oriT para facilitar el proceso de transferencia de ADN.

Una conjugación "triprecursora" también puede ser requerida para la transferencia del plásmido donante al receptor. En este tipo de conjugación, participan células donantes, células receptoras, y un plásmido "auxiliar". Las células donantes portan un plásmido movilizable o transposón conjugativo. Los vectores movilizables contienen un oriT, un gen que codifica una nickasa, y tienen genes que codifican las proteínas Mob,. sin embargo, las proteínas Mob solas no son suficientes para lograr la transferencia del genoma. De esta manera, los plásmidos movilizables no son capaces de promover su propia transferencia a menos que un sistema de conjugación apropiado se proporcione por un plásmido auxiliar (ubicado dentro del donante o dentro de una célula "auxiliar") . El plásmido conjugativo es necesario para la formación del par de acoplamiento y la transferencia de ADN, ya que el plásmido codifica las proteínas para transferencia (Tra) que están involucradas en la formación del poro o pilus.

El término "recombinante" o "alterado recombinantemente" cuando se usa con referencia, por ejemplo, a una célula, o ácido nucleico, proteína, o vector, indica que la célula, ácido nucleico, proteina .o vector, ha sido modificado por la introducción de un ácido nucleico heterólogo o proteina o la alteración de un ácido' nucleico o proteina nativa, o que la célula se deriva de una célula asi modificada. De esta manera, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran dentro de la forma nativa (no recombinante ) de la célula o expresan genes nativos que de otra manera se expresan anormalmente, subexpresados o no expresados en absoluto.

El término "heterólogo" cuando se usa con referencia a porciones de un ácido nucleico indica que el ácido nucleico comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación entre si en la naturaleza. Por ejemplo, el ácido nucleico es típicamente producido de forma recombinante, que tiene dos o más secuencias de genes no relacionados configurados para hacer una nueva funcionalidad de ácido nucleico, por ejemplo, un promotor de una fuente y una región de codificación de otra fuente. De manera similar, una proteína heteróloga indica que la proteína comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza (por ejemplo, una proteína de fusión) .

Un "cásete de expresión" es un ácido nucleico, generado recombinante o sintéticamente, con una serie de elementos de ácido nucleico especificados .que permiten la transcripción de un ácido nucleico particular en una célula hospedera. El cásete de expresión puede ser parte de un plásmido, virus, o fragmento de ácido nucleico. Típicamente, el vector de expresión incluye un ácido nucleico para transcribirse ligado operativamente a un promotor.

En otra modalidad, los ácidos nucleicos utilizados en esta invención comprenden análogos de ya sea ARN o ADN hechos de análogos de nucleótidos. Este término incluye oligonucleótidos compuestos de nucleobases que se presentan naturalmente, azúcares y .ligaduras de internucleósidos covalentes (columna vertebral) así como oligonucleótidos que tienen porciones que no se presentan naturalmente, que funcionan de manera similar. Tales oligonucleótidos modificados o sustituidos a menudo se prefieren sobre las formas nativas debido a propiedades deseables tales como, por ejemplo, absorción celular potenciada, afinidad potenciada por el objetivo de ácido nucleico, estabilidad incrementada en presencia de nucleasas y/o silenciamiento de genes eficiente .

Los ácidos nucleicos utilizados en esta invención pueden ser producidos por cualquier proceso sintético o recombinante tal como es bien conocido en la técnica. Los ácidos nucleicos pueden además ser modificados para alterar las propiedades biofísicas o biológicas por medio de técnicas conocidas en el arte. Por ejemplo, .el ácido nucleico puede ser modificado para incrementar su estabilidad contra nucleasas (por ejemplo, "cierre en el extremo") , o para modificar su lipofilia, solubilidad o- afinidad de enlace a secuencias complementarias .

El ADN de acuerdo con la invención también puede ser sintetizado químicamente por métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el ADN puede sintetizarse químicamente a partir de los cuatro nucleótidos en todo o en parte por métodos conocidos en la técnica. Tales métodos incluyen aquellos descritos en Caruthers (1985) . El ADN también puede ser sintetizado al preparar oligonucleótidos de hebra doble traslapados, rellenado en los espacios, y ligando los extremos juntos (ver, generalmente, Sambrook et al. (1989) y Glover et al. (1995)). El ADN que expresa homólogos funcionales de la proteína se puede preparar a partir de ADN de tipo natural por mutagénesis dirigida al sitio (ver, por ejemplo, Zoller et al. (1982); Zoller (1983), y Zoller (1984); McPherson (1991)). El ADN obtenido puede ser amplificado por métodos conocidos en la técnica. Un método adecuado es el método de reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) descrito en Saiki et al. (1988), Mullís et al., Patente de E.U.A. No. 4,683,195, y Sambrook et al. (1989) .

En otra modalidad, la transposición in vitro puede conducirse sobre ADN genómico clonado en un vector, por ejemplo, un cósmido, fago, plásmido o vector BAC (cromosoma artificial bacteriano) . Puede realizarse mutagénesis de alta densidad similar en organismos no naturalmente competentes utilizando ADN genómico clonado- en un vector de reemplazo alélico (ver, por ejemplo, la Patente de E.U.A. Número 6,207,384, cuyos métodos se pueden utilizar para preparar por ingeniería el organismo como se describe en la presente.

Las cepas hospederas bacterianas apropiadas se seleccionan por, por ejemplo, su capacidad de transformación, capacidad para expresión de la proteína heteróloga, y/o superficie mucosal. El hospedero bacteriano se volverá competente para transformación usando técnicas estándares, tales como el método de cloruro de rubidio o electroporación (ver, por ejemplo, Wei et al., J. Microbiol. Methods 21:97-109 (1995) .

La transformación de un comensal, por ejemplo, L. jensenii por electroporación puede realizarse al modificar métodos estándares como se describe en, por ejemplo, Luchansky et al.. (J. Dairy Sci . 74: 3293-3302 (1991). Brevemente, recién inoculado L. jensenii se cultivan en caldo MRS (por ejemplo, hasta 0.6-0.7 en OD600 a 37°C y C02 al 5%).

Las células bacterianas se cosechan, lavan y vuelven a suspender en una solución fría de sacarosa y MgCl2. Las células competentes se mezclan luego con ADN y se electroporan . Después, las células se les permiten recuperarse antes de que se coloquen en placa de agar selectivo que contiene un antibiótico de otro agente selectivo. Las células preparadas por ingeniería luego se administran al sujeto, por ejemplo, en una formulación de supositorio, crema o espuma.

Opcionalmente, el pretratamiento antibiótico puede ser utilizado para quitar la superficie mucosal de las bacterias residentes antes de la introducción de las bacterias de la invención en la vagina (ver, por ejemplo, Freter et al., Infect. Immun., 39:686-703 (1983)). Los antibióticos se pueden proporcionar oralmente o se pueden aplicar directamente a la vagina.

En algunas modalidades, la invención se proporciona para un método no limitativo para selección de una cepa bacteriana para prepararse por ingeniería de acuerdo con los métodos de esta invención, cuya cepa es eficiente para colonizar la superficie mucosal a la que las bacterias se aplica cuyo método puede involucrar repetidamente seleccionar las bacterias colonizantes rápidas en capas mucosas de animales o humanos. Por ejemplo, se aplica una cepa bacteriana de tipo natural a una superficie mucosa y repetitivamente se aisla y los cultivos in vitro de las bacterias, regresan a cada etapa para la superficie mucosal. En algunas modalidades, de acuerdo con este aspecto, en última instancia, se obtiene una bacteria con una capacidad colonizadora mejorada.

En otra modalidad, la invención proporciona un método no limitativo para preparar por ingeniería una cepa bacteriana de acuerdo con los métodos de esta invención, cuya cepa es eficiente al colonizar la superficie mucosal a la que se aplica la bacteria, puede involucrar expresión de proteínas de fusión en la superficie de las bacterias recombinantes . La proteína de fusión consiste en un dominio enlazado al hospedero ligado a un polipéptido de interés. El dominio enlazado al hospedero permitirá que las bacterias se enlacen a ciertos determinantes (proteína o carbohidrato) en una superficie mucosal hospedera seleccionada con alta afinidad, de esta manera confiere a las bacterias a una ventaja de supervivencia sobre la microflora residente.

Otro método abarcado para preparar por ingeniería cepas bacterianas de la invención involucra la inducción de microflora residente para expresar una proteína heterologa al introducir el gen a través de bacteriófago. Un número de vectores de bacteriófago se han desarrollado para uso en diferentes bacterias. Por ejemplo, se puede utilizar un vector de bacteriófago basado en el adh de bacteriófago templado (ver, por ejemplo, Raya et al., J. Bacteriol 174:5584-5592 (1992) y Fremaux et al, Gene 125:61-66 (1993)). Este vector experimenta integración especifica del sitio en el cromosoma hospedero en el fago definido (attP) y sitios de unión bacterianos (attB) . De manera similar, puede usarse el bacteriófago especifico de Lactobacillus para transducir vectores u otros polinucleótidos en el cromosoma de Lactobacillus. El fago específico de Lactobacillus incluye mv4 (Auvray et al., J. Bacteriol., .179:1837-1845 (1997)), adh (Fremaux et al., Gene 126:61-66 (1993)), gle (Kakikawa et al., Gene 175:157-165 (1996), y aquellos que pertenecen a los grupos A o B de Bradley en aislados de lactobacilos vaginales (Kilic et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol . 8:31-39 (2001)).

Ciertos agentes que no irritan las células epiteliales de la mucosa también se pueden agregar a una dosis unitaria de las bacterias para ayudar en la colonización. Muchas de las bacterias en las superficies de la mucosa secretan materiales capsulares se fusionan para formar una biopelicula que recubre la superficie mucosal completa. Puede ser benéfico agregar una enzima que digiere este material de biopelicula para promover la penetración de las bacterias preparadas por ingeniería en la biopelicula para colonización más exitosa. Las enzimas incluyen ADNsas, peptidasas, colagenasas, hialurónidasas, y otras enzimas degradantes de carbohidratos. Los antibióticos para los cuales las bacterias preparadas por ingeniería por si mismas no son susceptibles también se pueden agregar para disminuir el número de bacterias residentes en la superficie mucosal con el fin de facilitar la colonización efectiva de las bacterias preparadas por ingeniería.

La expresión de ' los polinucleótidos o polipéptidos heterólogos puede ser constitutiva (por ejemplo, utilizando promotores P59 (van der Vossen et al., Appl . Environ. Microbiol. 58:3142-3149 (1992)) o P23 (Elliot et al., Cell 36:211-219 (1984))). Alternativamente, la expresión puede estar bajo el control de un promotor inducible. Por ejemplo, los promotores amilasa Bacillus · (Weickert et al., J. Bacteriol. 171:3656-66 (1989)) o xilosa (Kim et al. Gene 181:71-76 (1996)) así como el promotor de Lactococcus nisin (Eichenbaum et al., Appl. Environ. Microbiol. 64:2763-2769 (1998)) se puede utilizar para dirigir la expresión inducible. Además, pueden ser utilizados promotores inducidos por ácido o alcalino. Por ejemplo, se pueden utilizar promotores que son activos bajo las condiciones relativamente ácidas de la vagina (por ejemplo, aquellas descritas en la patente de E.U.A. No. 6.242.194). Alternativamente, se pueden utilizar promotores que se inducen sobre cambios en la vagina en respuesta al semen: Por ejemplo, se utilizan promotores inducidos por alcalino para inducir la expresión en respuesta a las condiciones alcalinas incrementadas de la vagina que resultan de la introducción de semen.

Una variedad de secuencias de señal y anclaje son conocidas para dirigir la expresión de polipéptidos a la membrana, espacio extracelular o la pared celular (por ejemplo, por unión covalente a peptidoglicano) . Los ejemplos de secuencias de señal incluyen la secuencia de señal de a-amilasa de L. amylovorus (Giraud y Cuny, Gene 198:149-157 (1997) ) o la secuencia' señal del gen de capa S (cbsA) de L. crispatus (por ejemplo, MKKNLRIVSAAAAALLAVAPVAA (SEQ ID NO: 3) o MKKNLRIVSAAAAALLAVATVSA (SEQ ID NO: 4)). Las secuencias señal se ubican típicamente en la terminal amino de un polipéptido.

Las secuencias de anclaje están típicamente ubicadas en la terminal carboxilo de una . secuencia de proteína codificada. Las secuencias de anclaje incluyen, por ejemplo, una secuencia asociada a la pared celular; la secuencia LPQ(S/A/T) (G/A) , donde los residuos en los paréntesis indican las diferentes opcionés en tal posición; y una secuencia hidrofóbica, y, opcionalmente , un secuencia cargada. En algunas modalidades, la secuencia de anclaje comprende VTRTINVVDPITGKISTSVQTAKFTREDKNSNAGYTDPVTGKTTMNPWTPAKQGLRA VNVEQIKGYVAKVDGNVDAVVVTPDSAN VVTITYQANKPEGQNITNKKDTVPDP ADGIKNKDDLPDGTKYTWKEVPDVNSVGEKTGIVTVTFPDGTSVDVKVTVYVDPVV ESNRDTLSKEANTGNTNVAKAATVTSSKVESKKTLPQTGSKTEQVGILGLAIATVGS LLGLGVNRKKRQK (SEQ ID NO: 5), o KKAEEVKNNSNATQKEVDDATNNLKQAQNDLDGQTTDKSKLDEAIKSADDTKSTD KYNNASDDTKSKFDEALKKAEEVKNNSNATQKEVDDATKNLKQAQNDLDGQTTN KDAINDAIKDANNAKGTDKYNNASDDTKSKDDAL KAEDVKNDSNANQKEVDD ATKNLKNTLNNLKGQPAKKANLIASKDNAKIHKQTLLPQTGTETNPLTAIGIGLMAL GAGIFAKKKRKDDEA (SEQ ID NO: 6), o secuencias sustancialmente idénticas a la SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6.

La localización correcta y el plegado de un polipéptido se puede determinar utilizando métodos estándares. Por ejemplo, las fracciones enriquecidas con pared celular de Lactobacillus puede obtenerse al suspender las bacterias en una solución amortiguadora (por ejemplo, sacarosa al 25%, EDTA 1 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8.0) seguido por tratamiento con enzimas que degradan la pared celular (por ejemplo, lisozima y mutanolisina) y luego separar los protoplastos resultantes por centrifugación diferencial (Piard et al., J. Bacteriol. 179:3068-3072 (1997)). Las fracciones luego pueden seleccionarse por Western blotting para confirmar la expresión dentro de la pared celular.

La actividad plegable y biológica de un polipéptido expresado también puede determinarse utilizando métodos estándares. Por ejemplo, se pueden utilizar los ensayos de ELISA utilizando anticuerpos específicos para el polipéptido de forma nativa plegable para confirmar la estructura plegable y tridimensional del polipéptido. Los ensayos de actividad biológica variarán por supuesto dependiendo de la actividad del polipéptido. Por ejemplo, para los polipéptidos que se enlazan al esperma, el polipéptido expresado se puede probar usando ensayos de enlace estándares.

Cuando se sintetiza un gen para expresión mejorada en una célula hospedera, es deseable .diseñar el gen de manera que su frecuencia de uso de codón enfoca la frecuencia de uso de codón preferida de la- célula hospedera. El porcentaje de desviación de la frecuencia de uso de codón preferido para un gen sintético de la empleada por una célula hospedera se calcula primero al determinar del porcentaje de desviación de la frecuencia de uso de un codón sencillo de la de la célula hospedera seguido por la obtención de la desviación promedio sobre todos los codones.

La secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido particular puede ser alterada para coincidir con el uso del codón de un hospedero particular. Por ejemplo, el uso de codón de Lactobacillus puede ser utilizada para derivar un polinucleótido que codifica un polipéptido de la invención y comprende codones preferidos de Lactobacillus. La frecuencia de uso de codón preferida exhibida por una célula hospedera puede calcularse al promediar la frecuencia de uso del codón preferido en un gran número de genes expresados por la célula hospedera. Este análisis está limitado preferiblemente a genes que están altamente expresados por la célula hospedera. Pouwels y Leunissen (Nucleic Acids Res. 22:929-936. (1994)), por ejemplo, proporciona la frecuencia de uso de codones por genes altamente expresados exhibidos por diversas especies de Lactobacillus . Las tablas del uso de codones están también disponibles- a través de Internet.

En otra modalidad, . el vector contemplado por esta invención comprende además una inserción de una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido marcador. El polipéptido marcador puede comprender, por ejemplo, proteina fluorescente verde (GFP) , DS-Rojo (proteina fluorescente roja) , fosfatasa alcalina secretada (SEAP) , beta-galactosidasa, luciferasa, o cualquier número de otras proteínas reporteras conocidas para alguien experimentado en la técnica.

Una variedad de GFPs relacionados con Aequorea que tienen excitación útil y espectros de emisión han sido preparados por ingeniería al modificar la secuencia de aminoácidos de una GFP que se presenta naturalmente de Aequorea victoria (Prasher et al, 1992, Gene, 111:229-233; Heim et al., 1994, Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A., 91:12501- 12504; PCT/US95/14692) .

La transferencia de ácidos. nucleicos que tienen secuencias que codifican compuestos espermicidas en organismos heterólogos resulta en la expresión, en una modalidad .

Los métodos para la detección del producto expresado son bien conocidos en la técnica, y pueden comprender, en una modalidad, análisis Northern Blot, PCR, HPLC, Espectroscopia de Masa, ELISA, RIA o Western blot [ver "Cell Biology: A Laboratorio Handbook", Volúmenes I-III Cellis, J. E., ed . (1994); "Current Protocols in Immunology" Volúmenes I-III •Coligan J. E . , ed. (1994); Stites et al. (Eds) ] .

En algunas modalidades, los casetes de resistencia a antibióticos se pueden introducir en los organismos como se describe en la presente como marcadores para confirmar la expresión de la construcción introducida. En algunas modalidades, los casetes de susceptibilidad a los antibióticos se introducirán en los organismos, como un protocolo de seguridad para constructos introducidos en los sujetos, y en algunas modalidades, para la supresión del efecto anticonceptivo, para facilitar un medio seguro para la concepción, por ejemplo, por el sujeto que ingiere el curso tan corto de terapia antibiótica, que erradica el anticonceptivo biológico.

Esta invención proporciona, en algunas modalidades, una célula preparada por ingeniería que expresa un compuesto espermicida. En una modalidad, el compuesto espermicida puede comprender un anticuerpo para el esperma, o un fragmento del mismo, efectivo para prevenir la motilidad del esperma, fusión del esperma-óvulo o la penetración del esperma del óvulo, o una combinación de los mismos.

Los anticuerpos existen, por ejemplo, como inmunoglobulinas intactas o como un número de fragmentos bien caracterizados. En algunas modalidades, los fragmentos scFv se contemplan como parte de los organismos preparados por ingeniería, composiciones, kits y para uso de acuerdo con los métodos de. esta invención. En algunas modalidades, otros fragmentos contemplados incluyen un F(ab')2, un monómero Fab' . El monómero Fab' es' esencialmente un Fab con parte de la región de bisagra (ver, Paul (Ed.) Fundamental Immunology, Tercera Edición, Raven Press, Nueva York (1993)) y otros. Mientras que diversos fragmentos de anticuerpo se definen en términos de la digestión de un anticuerpo intacto, alguien de experiencia apreciará que tales fragmentos pueden sintetizarse de novo ya sea químicamente o al utilizar metodología de ADN recombinante. De esta manera, el término anticuerpo, como se usa en la presente, también incluye fragmentos de anticuerpos ya sea producidos por la modificación de anticuerpos completos o aquellos sintetizados de novo utilizando metodologías de ADN recombinante (por ejemplo, Fv de cadena sencilla (scFv) ) .

Los métodos abarcados de preparación de tales células se describen en la presente, sin embargo el técnico experimentado apreciará que cualquier compuesto espermicida, o combinaciones de compuestos se pueden producir de forma recombinante en un organismo comensal.

En algunas modalidades, se utilizan fragmentos de anticuerpo, los cuales son espermicidas o de otro modo inhiben la motilidad del esperma o capacidad de fusión del esperma-óvulo o penetración del óvulo por el esperma en diversas especies animales. Por ejemplo, y en algunas modalidades, el fragmento de anticuerpo, por ejemplo scFv, interactúa específicamente con un epítopo específico de esperma altamente conservado, que se conserva en especies animales y humanos, de manera que la prueba de eficacia in vivo puede conducirse en modelos animales, y la validación del mismo fragmento de anticuerpo, por ejemplo scFv humano o una versión humanizada del mismo puede realizarse en ensayos clínicos humanos.

En algunas modalidades, tales anticuerpos/fragmentos de anticuerpo pueden ser generados como se ejemplifica en la presente, o como se describe en Xu, et al. Arch Androl . Sep-Oct 1994; 33(2): 141-4; Clarke et al, Arch Androl. Jul-Ago 1995; 35(l):21-7; WQ0107083A1; Patente de E.U.A. No. 5,830,472, 5,753,231, 5,227,160 o por cualquier método apropiado, como se apreciará por los expertos en la técnica. La preparación por ingeniería de un organismo comensal para expresar tal compuesto puede realizarse por cualquier medio, también, por ejemplo como se describe en PNAS 102:11993-11998 (2003).

Los anticuerpos completamente humanos/fragmentos de anticuerpo son particularmente deseables para aplicaciones en la anticoncepción en hembras humanas. Los anticuerpos humanos/fragmentos de . anticuerpo se pueden hacer por una variedad de métodos conocidos en la técnica incluyendo métodos de exhibición de fago descritos en la presente usando colecciones de anticuerpos/fragmentos de anticuerpos derivados de secuencias de inmunoglobulina humana. Ver Patente de E.U.A. Nos. , 44 , 887 ' y . , 710 , 111 ; y WO 98/46645; WO 99/50433; WO 98/24893; WO 98/16654; WO 96/34096; WO 96/33735; y WO 91/10741, cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad e incluyen los Ejemplos proporcionados de aquí en adelante.

Se entiende que . cualquier referencia citada en la presente es para ser considerada para ser incorporada en totalidad como referencia a esto.

Los anticuerpos humanos o fragmentos de anticuerpo, por ejemplo scFv también se pueden producir utilizando ratones transgénicos que son incapaces de expresar inmunoglobulinas endógenas funcionales, pero que pueden expresar genes de inmunoglobulina humana. Para una visión general de esta tecnología para producir anticuerpos humanos, ver Lonberg y Huszar, 1995. Para una discusión detallada de esta tecnología para producir anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos y protocolos para producir tales anticuerpos y fragmentos de los mismos, ver, por' ejemplo, WO 98/24893; O 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; EP 0598877; Patentes de E.U.A. Nos. 5,413,923; ' 5,625,126; 5,633,425; 5,569,825; 5,661,016; 5,545,806; 5,814,318; 5,885,793; 5,916,771; y 5,939,598; que se incorporan en la presente como referencia en su totalidad. Además, las compañías tales como Abgenix, Inc. (Freemont, CA) . Kirin, Inc. (Japón) , Medarex (NJ) y Genpharm (San José, CA). pueden comprometerse para proporcionar anticuerpos humanos dirigidos contra un antígeno seleccionado usando tecnología similar a la descrita anteriormente.

Los anticuerpos de la invención también pueden ser modificadas por los métodos y agentes de acoplamiento descritos por Davis et al. (Patente de E.U.A. No. 4,179,337) con objeto de producir fragmentos de anticuerpo, que inducen sustancialmente ninguna respuesta inmunogénica .

En algunas modalidades, la invención proporciona una composición que comprende la bacteria preparada por ingeniería como se describe en la presente.

En algunas modalidades, la composición puede comprender bacterias preparadas por ingeniería como se describe en la presente, donde la composición comprende bacterias que expresan agentes anti-esperma heterólogos diferentes, y aún están contenidas dentro de la misma composición como parte de la dosis unitaria administrada. En algunas modalidades, tales bacterias que expresan ' diferentes agentes anti-esperma heterólogos pueden variar en términos de la especificidad para un antígeno o epítopo particular, o pueden variar en términos del antígeno o epítopo al cual se enlaza el fragmento, o puede variar en términos de avidez para el epítopo, o variar en término del isotipo de la cual se deriva, o combinaciones de los mismos.

En algunas modalidades, tal composición también puede comprender diferentes cepas bacterianas que expresan los mismos o diferentes agentes anti-esperma heterólogos, que están contenidos dentro de la misma composición como parte de la dosis unitaria administrada, también.

En algunas modalidades, la composición está en la forma de un supositorio, liquido, aerosol, espuma, crema, otro tipo de espuma (mousse) vaginal, o cualquier vehículo adecuado para el suministro vaginal.

En algunas modalidades, las bacterias preparadas por ingeniería o composiciones que comprenden las mismas se aplican o se incorporan dentro de un anillo vaginal, que luego se administra a un sujeto del sexo femenino. En algunas modalidades, la invención contempla un condón que contiene una bacteria preparada por ingeniería o composiciones que comprenden la misma aplicada a la superficie exterior del condón y conservarse de tal forma que el usuario del condón puede transferir las bacterias preparadas por ingeniería a su pareja femenina durante el coito.

En algunas modalidades, el término "comprende" o formas gramaticales del mismo, se refiere a la inclusión del agente activo indicado, tal como el comensal preparado por ingeniería de esta invención o fago como se describe en la presente, así como inclusión de otros agentes activos, y portadores farmacéuticamente aceptables, excipientes, emolientes, estabilizadores, etc., como se conocen en la industria farmacéutica. En algunas modalidades, el término "que consta esencialmente de" se refiere a una composición, cuyo único ingrediente activo s el ingrediente activo indicado, es decir, el organismo comensal preparado por ingeniería como se describe en la presente sin embargo, otros agentes/componentes/compuestos se pueden incluir que son para estabilizar, conservar, etc. la formulación, pero no están involucrados directamente en el efecto anticonceptivo. En algunas modalidades,, el término "que consiste esencialmente de" puede referirse a los componentes, que ejercen un efecto anticonceptivo a través de un mecanismo diferente de aquel del organismo comensal preparado por ingeniería, que mejora la eficacia anticonceptiva o prolonga la eficacia anticonceptiva o ambos. En algunas modalidades, el término "que consiste esencialmente de" puede referirse a componentes que facilitan la liberación del organismo comensal preparado por ingeniería, por ejemplo, al mejorar su liberación de la formulación de supositorio u otra formulación, promover la colonización efectiva, promover la colonización uniforme, y otros efectos deseable, que facilitan la actividad del organismo comensal preparado por ' ingeniería, aún no son componentes del organismo comensal preparado por ingeniería. En algunas modalidades, tales agentes pueden incluir agentes que inducen la expresión · del agente anti-esperma codificado, o en algunas modalidades, aumentar la expresión del agente anti-esperma codificado. En algunas modalidades, el término "que consiste de" se refiere a una composición, que contiene el ingrediente activo y- un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.

El suministro de -bacterias preparadas por ingeniería a una superficie mucosal deseada depende de la accesibilidad del área y las condiciones locales. Por ejemplo, las bacterias preparadas por ingeniería pueden ser colocadas en una solución salina, crema, supositorio o en una espuma para suministro en la mucosa vaginal. Las espumas pueden incluir, por ejemplo, uno o más polisacáridos hidrofóbicamente modificados tales como celulosas y quitosanos. Los celulósicos incluyen, por ejemplo, hidroxietil celulosa, hidroxipropil celulosa, metil celulosa, hidroxipropilmetil celulosa, hidroxietil- metil celulosa, y similares. Los quitosanos incluyen, por ejemplo, las siguientes sales de quitosano; lactato de quitosano, salicilato de quitosano, pirrolidon carboxilato de quitosano, itaconato de quitosano, niacinato de quitosano, formiato de quitosano, acetato de quitosano, galato de quitosano, glutamato de quitosano, maleato de quitosano, áspartato quitosano, glicolato de quitosano y quitosano sustituido con amina cuaternaria y sales de los mismos, y similares. La espuma también puede incluir otros componentes tales como agua, alcohol etílico, alcohol isopropílico, glicerina, glicerol, propilenglicol y sorbitol. Los espermicidas se incluyen opcionalmente en la composición bacteriana. Los ejemplos adicionales de espumas y vehículos que suministran espuma se describen en, por ejemplo, Patente de E.U.A. Nos. 5,595,980 y 4,922,928.

En algunas modalidades, las bacterias pueden suministrarse como un supositorio o pesario. Ver, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 4,322,399. En algunas modalidades, las bacterias de la invención se preparan en una matriz de conservación tal como se describe en la Patente de E.U.A. No. 6,468,526 y se suministran en un elemento disoluble hecho de material de polímero disoluble y/o material de carbohidrato complejo seleccionado para propiedades de disolución, de manera que se mantiene en forma sustancialmente sólida antes de su uso, y se disuelve debido a las temperaturas del cuerpo humano y la humedad durante el uso para liberar el material de agente en un tiempo de liberación y la dosificación deseada. Ver, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 5,529,782. Las bacterias también pueden ser entregadas en un vehículo de suministro de esponja tal como se describe en la Patente de. E.U.A. No. 4,693,705.

En algunas modalidades, las aplicaciones de bacterias preparadas por ingeniería a una superficie mucosal necesitarán repetirse sobre una base regular; los intervalos de dosificación óptimos son de rutina para determinar, pero variarán con diferentes ambientes mucosales y cepa bacteriana. Los intervalos de dosificación, en algunas modalidades, pueden variar desde una vez al dia a una vez cada 2-4 semanas, o más. En algunas modalidades, la administración seguirá un ciclo menstrual femenino, de manera que la administración seguirá el cese o cesación aproximada de menstruación para optimizar la colonización antes de la ovulación en el sujeto del sexo femenino se está tratando con ello.

En algunas modalidades donde se introducen bacteriófagos para transformar Lactobacillus nativo, el ácido nucleico del bacteriófago seleccionado puede ser manipulado de tal manera que los genes heterólogos reemplazan los genes codificados para proteínas recubiertos por bacteriófagos, haciendo al bacteriófago defectuoso a la replicación. Agregar estas moléculas de ADN recombinante en los lisados celulares que contienen proteínas de bacteriófago funcionales llevarán a ensamble de partículas de bacteriófago funcionales que portan los genes heterólogos. Estas partículas de bacteriófago defectuosas a la replicación pueden luego ser introducidas en una superficie mucosal deseada para infectar bacterias florales seleccionadas. La dosificación típica sería 108 hasta 1012 PFU/ml .aplicada a la superficie mucosal. La proporción de solución a la superficie tratada debe ser aproximadamente 0.1 hasta 1.0 mi por centímetro cuadrado de superficie mucosal. El vehículo sería similar al vehículo descrito arriba para las bacterias.

En algunas modalidades, la invención proporciona un método de anticoncepción, dicho método · comprende las etapas de poner en contacto células del tracto genital femenino con bacterias preparadas por ingeniería como se describe en la presente. En algunas modalidades, de acuerdo con este aspecto, el método comprende administrar una composición que comprende las bacterias preparadas por ingeniería al tracto genital de un sujeto del sexo femenino que necesita del mismo, incluyendo en algunas modalidades, una composición como se describe en la presente. En algunas modalidades, la invención también se proporciona para poner en contacto el tracto genital femenino con un bacteriófago como se describe en la presente, que a su vez lleva a la preparación por ingeniería de la flora comensal in situ, con objeto de obtener las bacterias preparadas por ingeniería como se describe en la presente.

En algunas modalidades, el término "poner en contacto" o "administrar" se refiere a tanto la exposición directa como indirecta para el material indicado.

En algunas modalidades, la dosificación administrada al tracto genital femenino puede estar en el intervalo desde 105 - 109 bacterias recombinantes . En algunas modalidades, la dosificación está optimizada para un hospedero particular o población. En algunas modalidades, tal dosificación óptima puede estar en el intervalo desde 107 - 109 bacterias recombinantes , o 106 - 108 bacterias recombinantes, o 108 -109 bacterias recombinantes.

Se conocen en la técnica varios medios para demostrar anticoncepción efectiva, todos de los cuales son para ser considerados útiles en esta invención, algunos de las cuales se ejemplifican en la presente.

En una modalidad, el efecto anticonceptivo del anticonceptivo biológico de la presente invención se determina al evaluar el número de crias producidas por ciclo de reproducción por un animal' hembra a la que se administró un anticonceptivo de la presente invención. Por ejemplo, después de 1 hasta 3 días de la administración del anticonceptivo biológico a, por ejemplo, un ratón, ratones hembra individuales se colocan en' jaulas con un ratón macho. Los ratones machos luego se retiran después de entre 1 y 7 días después de apareamiento. Los ratones hembra luego se observan diariamente para el nacimiento de las crias. El efecto anticonceptivo del anticonceptivo administrado se determina por la reducción en el embarazo y/o en la reducción en tamaño de la carnada después de la administración. Por ejemplo, para las especies animales que producen carnadas promedio de 3 crias o más (por ejemplo, como se ejemplifica a continuación, en ratones el tamaño de carnada promedio es 11 o más crias, cuando se utilizaron cepas no consanguínea), la proteína anticonceptiva puede considerarse efectiva si hay una reducción en la tasa de embarazo o tamaño de carnada por 10% - 100%, 30% - 100%, o 50% hasta 100%, o 60% - 100%, 70% -100%, o 80% hasta 100%, o 90% - 100%, o 95% - 100%, o más. Como se ejemplifica en la presente, cuando se evalúa la eficacia anticonceptiva de una cepa L. jensenii que expresa J102, se observó una eficacia anticonceptiva de al menos 50%, y por lo tanto, ya que los estudios de colonización conducidos en la presente indican que aproximadamente 50% de los ratones se colonizaron bien con los lactobacilos, se espera por lo tanto, que otros animales conocidos para ser más receptivos a la colonización de lactobacilos tendría un efecto anticonceptivo superior.

Un anticonceptivo se considera efectivo si existe una reducción en el tamaño de carnada por al menos un 50%, y por lo tanto, la Figura 7 demuestra la producción de un anticonceptivo femenino biológico efectivo, que comprende un comensal preparado por ingeniería, que expresa un agente anti-esperma .

En algunas modalidades, la eficacia de los anticonceptivos de la presente invención puede ser determinada al medir los niveles de anticuerpos expresados en secreciones mucosales. La eficacia del anticonceptivo también puede ser evaluada al visualizar anticuerpos enlazados al esperma por técnicas de inmunohistoquimica, por ejemplo en secreciones recolectadas después del coito.

Como se ejemplifica en la presente, cuando los ratones se colonizaron con L. jensenii que expresa un scFv anti-esperma, una reducción de entre el 50-58% se observó en la tasa de embarazo y una reducción concurrente en el número de la progenie producida por jaula y por ello por ratón fue evidente, también.

En una modalidad, el- organismo comensal que expresa un agente anti-esperma puede ser preparado por ingeniería además para expresar un agente, cuyo agente es efectivo contra la infección del sujeto del sexo femenino tratado con una organismo que causa la .enfermedad transmitida sexualmente. En una modalidad, el organismo que causa la enfermedad transmitida sexualmente es Clamidia, VIH, VPH, y otros, como se apreciará por el técnico experimentado.

En una modalidad, tal agente, cuyo agente es efectivo contra la infección del sujeto del sexo femenino tratado con un organismo que causa la' enfermedad transmitida sexualmente puede interferir con la infección por el organismo, o en otra modalidad, tal agente puede reducir la incidencia o carga de infección. En algunas modalidades, tal agente puede interferir con la ' patogénesis . de la infección por el organismo. Es para entenderse que la incorporación adicional de cualquier agente que es efectivo contra la infección del sujeto del sexo femenino tratado con un organismo que causa la enfermedad transmitida sexualmente se prevé en esta conexión y es para considerarse como parte de esta invención.

De acuerdo con este aspecto, y en algunas modalidades, los anticonceptivos de esta invención pueden ser vistos como una terapia anticonceptiva-anti-ETS combinatoria.

Aunque se contempla qué los comensales preparados por ingeniería de esta invención .pueden ser preparados por ingeniería además, por ejemplo para expresar un scFv anti-clamidia, o un scFv anti-HPV o anti-VIH, u otros agentes anti-VIH, por ejemplo, cianovirina, se entiende que la presencia de colonización de lactobacilos tipo natural del tracto reproductor femenino es protectora contra la infección por ETS. Se contempla también, que los organismos preparados por ingeniería de esta invención que expresan un agente anti-esperma son tan efectivos, o en algunas modalidades, más efectivos al reducir la incidencia de una enfermedad transmitida sexualmente en una población de sujetos del sexo femenino que hacen uso de. tales organismos como se describe en la presente que los lactobacilos de tipo natural solos.

Se entiende que cualquier modalidad descrita en la presente, como sea aplicable a cualquiera o todos los métodos de esta invención, es para considerarse como parte de esta invención. Todas las publicaciones y solicitudes de patente citadas en esta especificación se incorporan en la presente como referencia como si cada publicación individual o solicitud de patente se indicaron especifica e individualmente para ser incorporadas por referencia.

Se entenderá por aquellos experimentados en la técnica que varios cambios en forma y detalles pueden hacerse en la misma sin alejarse del espíritu y alcance de la invención tal como se establece en las reivindicaciones adjuntas. Aquellos experimentados en la técnica reconocerán, o serán capaces de determinar usando no más de una experimentación de rutina, muchos equivalentes a las modalidades específicas de la invención descrita en la presente. Tales equivalentes se pretenden para abarcarse en el alcance de las reivindicaciones.

Se apreciará que la referencia a los artículos en la presente tales como "un", "uno/una" y "el/la" significa que uno o más de uno a menos que se indique lo contrario o de otro modo evidente por el contexto. Las reivindicaciones o descripciones que incluyen "o" o "y/o" entre los miembros de un grupo se consideran satisfechos si uno, más de uno, o todos los miembros del grupo están presentes en, empleados en, o de otra manera relevantes para un producto o proceso dado a menos que se indique lo contrario o de otro modo evidente por el contexto. La invención incluye modalidades en las cuales exactamente un miembro del grupo está presente en, empleado en, o de otra manera ' relevante a un producto o proceso dado. La invención también incluye modalidades en las cuales más de uno, o todos los miembros del grupo están presentes en, empleados en, o de otra manera relevantes a un producto o proceso dado. Además, es para entenderse que la invención proporciona,, en varias modalidades, todas las variaciones, combinaciones, y permutaciones en las cuales una o más limitaciones, elementos, cláusulas, términos descriptivos, etc., a partir de una o más de las reivindicaciones enlistadas se introduce en otra reivindicación dependiente en la ' misma reivindicación base a menos que se indique otra cosa o a menos que sea evidente para alguien de experiencia ordinaria en la técnica que una contradicción o incompatibilidad surgiría. Cuando los elementos se presentan como listas, por ejemplo, en formato de grupo Markush o similares, es para entenderse que cada subgrupo del elemento también se describe, y cualquiera de los elementos puede ser removido del grupo. Se debe entender que, en general, cuando la invención, o aspectos de la invención, se refieren como que comprende elementos, características particulares, etc., ciertas modalidades de la invención o aspectos de la invención consisten de, o consisten esencialmente de, tales elementos, características, etc. Para propósitos de simplicidad aquellas modalidades no han sido en todos los casos, específicamente establecidos en estas palabras en la presente. Ciertas reivindicaciones se presentan en forma dependiente para el bien de conveniencia, pero el Solicitante se reserva el derecho de volver a escribir cualquier reivindicación dependiente en formato independiente para incluir los elementos o limitaciones de la reivindicación independiente. y cualquiera de otras reivindicaciones en las cuales tal reivindicación depende, y tal reivindicación reescrita es para considerarse equivalente en todos los aspectos para la reivindicación dependiente en cualquier forma que se encontraba (ya sea modificada o enmendada) antes de ser reescrita en formato independiente.

Los siguientes están destinados para proporcionar materiales, métodos y ejemplos para propósitos ilustrativos como un medio de practicar/ejecutar la presente invención, y no se pretende que sean limitantes.

EJEMPLOS Generalmente, la nomenclatura utilizada aquí y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente invención incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y de ADN recombinante . Tales técnicas se explican detalladamente en la literatura. Ver, por ejemplo, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Sambrook et al., (1989) ; "Current Protocols in Molecular Biology" Volúmenes I-III Ausubel, R. M. , ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989) ; Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John' Wiley & Sons, New York (1988); atson et al, "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York;. Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Volúmenes 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1998); metodologías como se establece en la Patente de E.U.A. Nos. 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 y 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volúmenes I-III Cellis, J. E . , ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volúmenes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8a Edición), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds) , "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., . New York (1980); inmunoensayos disponibles se describen extensamente en la literatura de patentes y científica,' ver, por ejemplo, Patente de E.U.A. Nos. 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867, 517; 3, 879, 262;· 3,901,654; 3, 935, 074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 y 5,281,521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J. , ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D. y Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Traslation" Hames, B. D., and Higgins S. J. , Eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) y "Methods in Enzymology", Vol . 1-317, Academic Press; "PCR Prptocols : A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); todas de las cuales se incorporan por referencia como si se establecieran en la presente. Otras referencias generales se proporcionan a lo largo de este documento. Los procedimientos que en él se consideran para ser bien conocidos en la técnica y se proporcionan para la conveniencia del lector. Toda la- información contenida en el mismo se incorpora en la presente como referencia.

EJEMPLO 1 Preparación de Anticuerpos Anti-Esperma Humano Se preparan anticuerpos monoclonales contra antigenos de esperma humano al fusionar células de mieloma de ratón P3-X63-Ag8-653 con linfocitos de ratones Balb/c inmunizados con esperma epididimo humano solubilizado por detergente Tergitol NP-40. El fluido de ascitis de ratones inyectados con estos hibridomas se prueba para ser acrosoma positivo en esperma fijado con metanol y la membrana de plasma positiva en esperma no fijado en inmunofluorescencia indirecta. Se verifica la reactividad cruzada de anticuerpo con esperma de murino y conejo.

Un antigeno de fertilización, FA-1, se purifica a partir de ya sea testículos de murino solubilizadas por desoxicolato o diyodosalicilato de litio por cromatografía de inmunoafinidad utilizando' un anticuerpo monoclonal, A-24, como se describe (Naz, R. K. et al., Proc Nati Acad Sci E.U.A. (1986) 83 ( 15 ): 5713-7 ) . Los anticuerpos monoclonales para FA-1 se preparan como arriba, y se verifica también la reactividad cruzada con esperma humano y de conejo.

EJEMPLO 2 : Clonación de Anticuerpos Anti-Esperma Humano Preparación de ABN Se seleccionan células de hibridoma que secretan anticuerpos que son espermicida o de motilidad espermatida disminuida. Las células se hicieron crecer y contaron de manera que 10 millones de células se procesan para la recolección de ARN utilizando el kit FastTrack 2.0 (Invitrogen) . El ARN total se . aisló directamente de las células utilizando una solución amortiguadora de degradación de proteina y lisis de detergente . Poly(A)+ARN luego se aisló utilizando un protocolo Aviv y Leder modificado en el cual el mARN se enlaza a resina oligo dT . La resina luego se lava con una solución amortiguadora de' sal baja para remover el ARN total extraño, y el poli (A) +ARN se eluye de la resina. El análisis espectrofotométrico a 260 nm y 280 nm indica la concentración final de poli(A)+ARN.

Transcripción Inversa y Amplif cación de Poli (A) +ARN Las regiones que reconocen epitopos o regiones que determinan la complementariedad (CDR) del anticuerpo se identifican y las subunidades de cadena ligera (kappa) y cadena pesada Ig probadas por sonda de oligonucleótidos se diseñan.

Los oligos de cadena pesada se obtienen a partir del kit de Ig-Prime (Novagen) , y se diluyen a una concentración final de 1.0 µ?/µ? con dH20.

La transcripción inversa y amplificación por reacción en cadena de polimerasa de hibridoma poli (A) +ARN respectivo se realizan en una reacción sencilla utilizando el sistema Acces RT-PCR de Promega . Brevemente, 5 de hibridoma poli(A)+ARN, 1 µ? de cada cebador apropiado (cebadores 1 y 2 para la cadena pesada, los cebadores 3 y 4 para la cadena ligera), 1 µ? de mezcla dNTP 10 mM, 10 µ? de solución amortiguadora de transcripción inversa 5xAMV, 2 µ? de MgS04 25 mM, 1 µ? de transcriptasa inversa AMV, 1 µ? de polimerasa Tfl, y 30 µ? de dH20 libre de nucleasa se combinan en un tubo de microcentrífuga de 0.5 mi. Se condujo la reacción de PCR de acuerdo con protocolos estándares y las temperaturas y tiempos de ciclo son optimizados. Los productos amplificados se analizaron en un gel de agarosa, y se purificó en gel .

Clonación y Procesado por Secuencia del Anticuerpo: Los productos purificados de gel se subclonaron en un vector apropiado, que produce altos rendimientos de los productos. El vector, solución amortiguadora, cADN y ligasa de ADN T4 se incuban a temperatura ambiente durante 1 hora, y luego se calentó a 65°C durante 10 minutos. Se utilizan células Supercometent E. coli,. y ADN se agrega a las células e incuban en hielo, luego se calientan a 42°C, y se agrega el medio SOC. Las células luego se incuban en un baño de agua con agitación a 37 °C durante 1 hora. Estas células luego se extienden en LB que contiene .placas de Petri con el compuesto de selección e incuban durante la noche a 37 °C. Las colonias positivas se eligen y 'hacer crecer para la purificación del plásmido .

Los plásmidos se purificaron usando columnas QIAGEN-tip 20 de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Para confirmar la presencia de un inserto de ADNc en los plásmidos purificados cada clon se digiere con las enzimas de restricción apropiadas, y los productos digeridos se corren en un gel de agarosa. Los clones que contienen el inserto se procesan por secuencia.

Análisis de la Secuencia, de los Clones de Cadena Pesada y Ligera Los clones positivos se procesaron por secuencia utilizando el kit ' Fidelity (Oncor) , de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las reacciones procesadas- por secuencia consisten de ADN de plásmido, cebador (por ejemplo, cebador T3, que se encuentra corriente arriba del sitio de clonación 5' en el vector pCR-Script) , y dH20, que se calientan a 95°C durante 5 minutos, se agrega solución amortiguadora alineada en sus parece base, y las reacciones se incuban a 37 °C durante 15 minutos. Las reacciones se etiquetan por la solución amortiguadora de reacción de adición, 33PaATP, polimerasa de ADN T4, y dH20 y se incuban a 400°C durante 15 minutos, luego A, C, G, T o mezcla de terminación se agrega e incuba a 40°C durante 5 minutos. Las reacciones se detienen por la adición de solución de proteinasa K y se calienta a 95°C antes de cargarla en un gel procesado por secuencia de acrilamida. El gel luego se corre durante 2 horas a 2000 voltios, se seca sobre papel filtro hatman 3 MM bajo vacio, y se expone a película de rayos x durante una' noche a temperatura ambiente. Después del desarrollo de la película de los geles se leen en una caja de luz .

El procesado por secuencia también puede conducirse usando un Secuenciador de ADN Automático (por ejemplo, ABI Prism 377) . Para cada clon, el ADNc y cebador se combinan con cuatro nucleótidos de didesoxi etiquetado con pigmento y polimerasa FS AmpliTaq. La reacción completa se carga en un carril sencillo para electroforesis en un gel de acrilamida al 5.0% bien leído a 36 cm. La detección en tiempo real de los fragmentos individuales colocados en electroforesis se consigue con exploración láser con producción de imágenes de cámara CCD.

Construcción del Vector de Expresión Los vectores de expresión como se describe en cCracken A., et al. (2000) Arch. Microbiana. 173: 383-389; Perez-Casal, J, et al. (2003) Mol. Microbiol. 8: 809-819; Kruger C. et al. (2002) Nature Biotechnology .20 : 702-706; Rao, S. et . al., (2005) PNAS 102: 11993-11998; Liu X. et . al . (2006) Antimicrobial Agents and Chemotherapy 50: 3250-3259; del Rio, B. et. al. (2008) Clinical and Vaccine Immunology 15: 1429-1435; Patente de E.U.A: No. 7,312,076, o Patente Europea No. 1 011 721 Bl se obtendrá o variaciones de los mismos se prepararán por métodos conocidos en la técnica.

Alternativamente, un vector se construirá como sigue: Un vector transportador se crea al subclonar el origen E. coli de de replicación a partir de pBluescript en el vector de la columna vertebral (Fons, M., et al. (1997) Plasmid 37, 199-203), y luego se remueve la región de codificación M6 de longitud completa (PstI). Este plásmido se digiere con Smal, parcialmente digerido con Ndel, rellenado por la polimerasa I de ADN (fragmento Klenow) y se auto-liga. El plásmido resultante contiene un origen compatible con lactobacillus de replicación (repA) y un marcador seleccionable positivo, por ejemplo, un gen de resistencia antibiótico, y se ha utilizado para la expresión de proteínas heterólogas en una variedad de especies de Lactobacillus.

Clonación de loa Fragmentos de Anticuerpo Amplificados en un Vector Los productos amplificados correspondientes a la cadena pesada y ligera se purifican en gel y se vuelven a suspender en dH20. El anticuerpo puede ser recodificada por PCR de ensamble (Stemmer W.P. et al, (1995) Gene 164 : 49-53) para ajustarse más estrechamente al uso del codón de lactobacillus óptimo .

Un cásete de expresión se construye por amplificación PCR y se subclona en los sitios apropiados del vector. El cásete contiene cuatro componentes, incluyendo elementos promotores compatibles con lactobacillus, fragmento de anticuerpo, secuencia de señal para secreción o dominio de anclaje de la pared celular. Los sitios de restricción únicos se colocan entre cada componente de los extremos 5' hasta 3' , respectivamente. La amplificación de cada componente por PCR se realiza usando polimerasa Pfu de ADN. El promotor P23 de Lactococcus lactis (van der Vossen, J. ., et al. (1987) Appl . Environ. Microbiol. 53, 2452-2457) se crea por amplificación con cebadores 5 ' -GTGGAGCTCCCCGAAAAGCCCTGACAACCC-3 ' y 5'-GGAAACACGCTAGCACTAACTTCATT-3' . Para dirigir la secreción del anticuerpo, los cebadores se diseñan para amplificar la secuencia del gen de capa S (cBSA) de L. crispatus del sitio enlazado a ribosoma supuesto para el sitio de escisión de peptidasa de señal, con sitios únicos añadidos a los extremos 5' y 3', respectivamente. La secuencia de nucleótidos de señal de capa S amplificada (CbsAss) correspondiente a MKKNLRIVSAAAAALLAVAPVAA luego se digiere y usa para la clonación en el cásete de expresión.

Los productos se ligan en el vector, y un codón de paro TAA se inserta a la porción de anclaje de terminal N para asegurar la secreción. La verificación de la secuencia se conduce antes de la transformación en cepas de lactobacilos .

Transformación de lactobacilos: Cepas bacterianas y de Cultivo. Los aislados vaginales humanos que se presentan naturalmente de L. crispatus, L. gasseri , y . j ensenii , y otros pueden ser obtenidos a partir de hisopos vaginales de voluntarios saludables o alternativamente, las cepas comercialmente disponibles pueden ser utilizados y cultivados a 37°C (C02 al 5%/aire al 95%) en cualquiera de caldo Man, Rogosa y Sharpe ( RS) o caldo Rogosa SL (Difco) . Para el análisis de expresión de proteínas, también se utiliza el Medio 199 (Invitrogen) . Los plásmidos se introdujeron por electroporacion en Escherichia coli DH12S (Invitrogen). Para el mantenimiento de plásmido, las DH12S de E. coli transformadas se hacen crecer en caldo LB (Difco) a 37°C, complementado con eritromicina (300 µg/ml). Los plásmidos se transforman por electroporacion en L. j ensenii esencialmente como se describe por L. gasseri (Luchansky, JB, Tennant, M.C. y Klaenhammer, T.R. (1991) J. Dairy Sci . 74, 3.293-3.302). Las bacterias L. jensenii transformadas se propagan de forma rutinaria en medio liquido que contiene 20 pg/ml de eritromicina .

Los lactobacilos preparados por ingeniería se prueban para actividad anti-esperma como . se describe de aquí en adelante .

EJEMPLO 3 Generación de una Serie de scFv Anti-Esperma Construcción de la colección Se utilizó una colección que muestra el fago filamentoso scFv humano para aislar dominios variables unidos VH-VL humanos contra las proteínas de esperma. La colección de scFv humana se preparó usando cebadores diseñados de acuerdo a las secuencias obtenidas en Base- V (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk) y de acuerdo a las técnicas descritas previamente por Barbas y Lerner (Barbas, Bain et al. 1992 Proc Nati Acad Sci E.U.A, 89 (10): 4457-61; Gram, arconi et al. 1992 Proc Nati Acad Sci E.U.A. 89(8): 3576-80; Zebedeo, Barbas et al. 1992 Proc Nati Acad Sci E.U.A. 89(8): 3175-9; Barbas, Amberg et al. 1993 Gene 137(1): 57-62), Winter (Hawkins, Russell et al. 1992 J Mol Biol 226(3): 889-96; Hawkins and Winter 1992 Eur J Immunol 22(3): 867-70; Hoogenboom, Marks et al. 1992 Immunol Rev 130: 41-68; Hoogenboom and Winter 1992 Rev. Immunol 130: 41-68; Marks, Griffiths et al. 1992 Biotechnology (N Y) 10(7): 779-83; arks, Hoogenboom et al. 1992 J Biol Chem. 267(23): 16007-10; Marks and Winter 1992 Behring Inst. Mitt (91) : 6-12; Orlandi, Gussow et al. 1992 Biotechnology 24: 527-31; Tomlinson, Walter et al. 1992 J Mol Biol 227(3): 776-98) y por el laboratorio Benhar (Azriel-Rosenfeld, Valensi et al. 2004 J Mol Biol 335 (1): 177-92)'. La amplificación de los genes de anticuerpo por PCR se realizó usando bazo humano y cADN de linfocitos de sangre periférica como plantillas. En esta colección, el repertorio de dominios variables cadena pesada y ligera humanos, están unidos juntos en forma combinatoria para crear todas las combinaciones posibles de moléculas artificiales de enlace artificiales VH-VL que se fusionan con el gen p3 del fago filamentoso ml3, y la proteina de fusión luego se muestra en la superficie del fago en típicamente una copia sencillas por fago en promedio.

Antígenos de Esperma Los péptidos se diseñaron a partir de antígenos de esperma FA-1 e YLP(12) respectivamente. El péptido 1 de abajo es un péptido de 35 residuos diseñado a partir del antígeno FA-1 y péptido 2 de abajo es el péptido YLP(12). Los péptidos se biotinilaron para la facilidad de enlazar a perlas magnéticas para el protocolo descrito a continuación. El péptido 2 tiene la adición de una unión entre la biotina y el péptido ya que la secuencia del péptido es relativamente corta. La colección scFv que muestra el fago se seleccionó contra ambos péptidos como se indica a continuación.

Selección de Anticuerpo La solución madre de colección se hizo crecer en LB+Amp (100 ug\ml) de glucosa +1% a 37°C. Se agregó fago auxiliar M13K07, y los cultivos se incubaron con el fago auxiliar en presencia de 100 ug\ml de Amp +30 ug\ml durante la noche a 30°C. Los cultivos se giraron a 4000 rpm durante 10 minutos, y el sobrenadante se filtra a través de un filtro de 0.45 micrón y se agregó 1\5 volúmenes de PEG\NaCl, y el filtrado se colocó en hielo durante un mínimo de una hora, luego se giraron durante 30 minutos a 4000 RPM, después de lo cual el peletizado que contiene fago se suspendió en PBS. Se condujo el bloqueo de fago con BSA al 4% durante 30 minutos a un mínimo, y la selección de anticuerpo basado en perla magnética se realizó de acuerdo al protocolo como se describe en R. Kontermann y. S. Du"bel (eds.), Antibody Engineering vol. 1, Springer-Verlag Berlín Heidelberg 2010, páginas 267-287. Ei bloqueo se condujo durante un mínimo de 30 minutos con BSA al 2%. Las perlas bloqueadas se agregaron al fago bloqueado, y la eliminación de la perla, que por ello remueve todo el fago que se enlaza a la estreptavidina . El fago bloqueado luego se incubó con biotina durante 30 minutos posteriormente se incubó con las perlas durante 30 minutos, después de lo cual las perlas se descartaron.

Los fagos luego se incubaron con los siguientes péptidos durante una hora: ACGVSRPVIACSVTIKEGSQLKQQIQSIQQSIERL (SEQ ID NO: 1) biotina; y YLPVGGLRRIGG (SEQ ID NO: 2) Ahx y luego se incubaron con las perlas durante 30 minutos, lavaron y eluyeron. El eluido neutralizado luego se mezcló con dh5a F + células durante 60 minutos a 37 °C y se cultivaron en LB + 100 ug\ml de Amp+ placas de glucosa al 1% durante la noche. Las etapas de separación en sus pares base se repitieron por un número de ciclos.

Especificidad del Fragmento de Anticuerpo Un ensayo ELISA se condujo utilizando los péptidos como sondas y la afinidad relativa con el fragmento se evaluó por 0. D.

E. coli TG-1 infectado con los fagos de salida separados por sus pares base (como se describe arriba) se colocaron en placas para proporcionar colonias individuales. Estas colonias se seleccionaron en 100 µ? de medio YTAG en pozos de una placa de 96 pozos estéril de fondo plano y se hicieron crecer a 30°C en un agitador a 150 RPM ON . Se transfirieron 10 µ? de fago en una placa de 96 pozos fresca que contiene 90 µ? de YTAG + 2.5 µ?/ml (5X 108 CFU) de fago auxiliar 13K07 y se hicieron crecer 37 °C sin agitación durante 30 min después de agitación a 150 RPM durante 30 minutos. Las placas se centrifugaron a 4000 .RPM durante 5 minutos a 14 °C y se descartó el sobrenadante. Se agregó 200 µ?/???? de YTAK (con Kanamicina) y la placa se dejó crecer a 30°C en un agitador a 150 RPM durante la noche. La placa de bacterias luego se centrifugó a 4000 rpm durante 5 minutos a 4°C y 100 µ? del sobrenadante mezclado con 100 µ? de PBST se utilizó para ELISA. 100 µ?/???? de antigeno y antigeno de control se colocaron en placas de ELISA a. 4°C durante la noche para recubrir las placas. Las placas ELISA se lavaron una vez con solución amortiguadora · de lavado (300 µ?/???? de PBST) y se bloquearon con leche/PBS al 3% durante 1 hora a temperatura ambiente (TA) . Las placas se lavaron una vez con solución amortiguadora de lavado. Los fagos luego se agregaron a las placas e incubaron durante 1 hora a TA seguido de 3 lavados con solución amortiguadora de lavado. 50-100 µ?/???? de anticuerpo de fago anti-M13 diluido con anti fago conjugado por HRP se agregaron e incubaron durante 1 hora a TA. Después de 3 lavados con solución amortiguadora de lavado 100 µ?/???? de solución de sustrato OPD se agregaron durante 20 minutos a TA. La reacción luego se detuvo con 50 mi de placas de solución de HC1 1 M se leyeron las placas a 450 nm. La detección se alcanzó usando un anticuerpo anti-fago etiquetado con peroxidasa de raíz de rábano (HRP) y el color resultante de la reacción sustrato-enzima se leyó con un lector ELISA automatizado.

Otro protocolo ELISA recubre de las placas con 2 \xq/ml de BSA-biotina en PBS durante 2 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavaron con PBST y posteriormente recubrieron con 2 µ?/p\1 de estreptavidina en PBS durante 2 horas a temperatura ambiente, y se lavaron de nuevo con PBST. Las placas luego se recubrieron con 2 µ?/??? de un péptido en PBS durante la noche a 4°C, se lavaron una vez con PBST y bloquearon con una solución al 3% de leche/PBS durante 1 hora a 37 °C, con el resto del protocolo siendo el mismo como arriba excepto que las placas se desarrollaron con 50 µ?/???? Reactivo de Paro TMB (tetrametil bencidina) diluido cuatro veces en SDD y se detuvieron después de 5 minutos con 50 µ?/???? de H2S04 1 .

Resultados La Figura 1 representa gráficamente las afinidades relativas de los scFv que muestran fagos aislados y clonados para los péptidos de esperma probados. Las columnas 1-3 representan el enlace de tres scFvs al péptido derivado de FA-1 y las columnas 4-6 representan el enlace de tres scFvs al péptido derivado de YLP(12). BSA se utilizó como un control de enlace negativo. Los scFv exhiben afinidad significativa para los péptidos indicados en comparación con los controles. La. figura 2 representa las afinidades relativas de algunos scFv que muestran fagos aislados y clonados para los péptidos de esperma probados. La Figura 3 muestra los resultados de los ensayos de enlace ELISA que identifican una serie de scFv no de enlace, que luego se utilizaron a como controles. Uno de tal clon scFv, J112, se utilizó típicamente en este contexto. El clon J102 muestra mayor afinidad que otros clones y controles A y B, que fueron muestras que no contienen fago scFv, o sin péptido ni scFv, respectivamente. Se detectó el enlace al medir el OD en muestras probadas con anticuerpo etiquetado HRP anti-fago (anticuerpo para PVIII) . Algunos de estos scFv se utilizaron posteriormente en los Ejemplos de aquí en adelante, sirviendo como controles y anticonceptivos, como sea apropiado.

EJEMPLO 4 Lactobacilos Preparados por Ingeniería que Expresan scFv Clonación y Procesamiento por Secuencia del Anticuerpo: Los scFv se liberaron del genoma fagémido por digestión con escisión Ncol y Notl de acuerdo a protocolos establecidos para demostrar fragmentos scFv intactos en los clones de fago. Los productos purificados de gel se subclonaron en el vector pSLPlll.l, una especie de regalo del Dr. Jos Seegers, que produce altos rendimientos de los productos. Un mapa del vector se proporciona en la Figura 4A. La subclonación se realizó por amplificación PCR del scFv con cebadores únicos que contienen en el cebador 5' un sitio de restricción Ncol y en el cebador 3' un sitio AscI (5'- GCGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGTTG., 3 ' -GCGGGCGCGCCCCAGCACAGTGAGTTTGGTCCC).. El ADN amplificado se purificó en gel y los sitios de restricción activados por escisión con Ncol y AscI. El fragmento de ADN restringido luego se purificó en gel por segunda vez y se ligó en (con ligasa T4) el vector PSLPlll.l que se cortó previamente con Ncol y AscI y se purificó en gel también. La mezcla de ligación se transformó con DH5alpha de E. coli que se hicieron competentes por la técnica de cloruro de calcio (Maniatis) . Las bacterias transformadas se colocaron en placas de LB agar cloranfenicol (10 microgramos/ml) , se seleccionaron colonias después de la incubación durante la noche y el ADN de plásmido se preparó a partir de dos docenas de colonias. El ADN del plásmido se preparó a partir de estas colonias utilizando un kit de plásmido Qiagen miniprep y se cortó con Ncol y AscI para identificar aquellas que contienen el inserto de ADN de tamaño apropiado. Los clones positivos luego se trasladaron en Lactobacillus jensenii como se describe a continuación. .

Los plásmidos se purificaron usando columnas Qiagen-tip 20 de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Para confirmar la presencia de un inserto de cADN en los plásmidos purificados se digirió cada clon con Ncol - AscI, y los productos digeridos se corrieron en un gel de agarosa. Se procesaron por secuencia los clones que contienen el inserto.

Análisis de Secuencia de Clones de Cadena Pesada y Ligera Los clones positivos se procesaron por secuencia por el servicio de procesamiento- de secuencia del Instituto Weizman, que usa un secuenciador automatizado ABI con todas las condiciones y reactivos de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Los cebadores procesados por secuencia iniciales utilizados fueron: Delantero CCATGATTACGCCAAGCTTGGGAGCC (SEQ ID NO: 9]) Inverso GAATTCAACCTTCAAATTGCC (SEQ ID NO: 10) Clonación de los Fragmentos de Anticuerpo Amplificado en un Vector Los productos amplificados purificados por gel se subclonaron en los sitios apropiados del vector. El cásete contiene cuatro componentes, incluyendo elementos promotores compatibles lactobacillus , fragmento de anticuerpo, secuencia señal para secreción o .dominio de anclaje de la pared celular.

La verificación de secuencia se condujo antes de la transformación en cepas de lactobacilos .

Transformación de Lactobacilos: El aislado vaginal humano ATCC de la cepa de L. jensenii número 25258 se utilizó y cultivó a 37°C (CO2 al 5%/aire al 95%) en caldo Man, Rogosa y Sharpe (MRS) (Difco). pSLPlll.l que contienen el inserto se introdujeron por la técnica de cloruro de calcio en L. jensenii. Las bacterias L. jensenii transformadas se propagaron de forma rutinaria en medios líquidos que contienen 10 pg/ml de clormafenicol .

Ensayos de Motilidad y Enlace del Esperma : El esperma de ratón se aisló de acuerdo con protocolos establecidos [Liu Z, et al., Journal of Biological Chemistry (2010) 285, 2758-2770.]. 106 espermas se suspendieron en solución amortiguadora de esperma (Ham F-10 suplementado con HEPES 21 mm; bicarbonato de sodio 4 mM; albúmina de suero humana al 0.6%, 3.6 mi de lactato de sodio (solución madre al 60%) y Gentamicina: 10 microgramos /mi ) en tubos cónicos, los espermas se mantuvieron en una manera para facilitar su capacidad para nadar hasta la parte superior del tubo, donde se realizó la recolección de espermas móviles por eliminación de un volumen pequeño (unos pocos cientos de microlitros) de la solución amortiguadora. Se verificó el conteo de espermas por medio de hemactometro e incubaron en una relación de 1:1 o 1:2, esperma: Lactobacilos (cfu) .

El esperma de ratón se aisló y scFv enlazado al esperma se evaluó por ensayos de enlace utilizando scFv que muestran fago. Un ensayo de nado como se describe arriba se utilizó para seleccionar los espermas móviles, que se aislaron y colocaron en portaobjetos de cámara, secados al aire, y luego el fago que contiene los scFv de . interés (108) se aplicaron a las cámaras, e incubaron durante 1 hora, lavaron, luego el esperma se probó con anticuerpo anti-cp8 ligado a HRP (ENCO, Israel), en una dilución de 1:200, las cámaras luego se lavaron, y desarrollaron con DAB y peróxido.

RESULTADOS La Figura 4B muestra los productos de digestión Ncol y Notl de plásmido. Los plásmidos se cortaron con Ncol y Notl, a 37°C durante tres horas.

Un scFv expresado, J102, se encontró que tienen una alta afinidad de enlace al antigeno de esperma altamente conservado. El procesado por secuencia del clon proporciona un ADN completo y secuencia de proteina como se muestra en las Figuras 5A-5B (SEQ ID NO: 7-8) .

El scFv J102, y otros, se probaron para el enlace a tanto experma humano como de murino. Aunque el scFv J102 es un fragmento derivado de humano, la alta conservación entre las especies de antigeno de FA-1 resulta en el J102 enlazado a tanto el esperma humano como de murino, como se determina en ensayos in vi tro. .La Figura 6A muestra un enlace significativo de los lactobacilos que expresan scFv para el esperma de ratón, con casi cada célula de esperma evaluada que muestra tinción significativa, mientras que los lactobacilos de control que expresan scFv para antigeno no de esperma no apreciablemente se enlazan al esperma de murino (Figura 6B) . Los estudios de enlace al esperma humano fueron consistentes con los hallazgos de ratón (datos no mostrados) .

Los estudios de la motilidad se condujeron con esperma humano, como se describe en la sección de métodos anteriormente. Mientras que los lactobacilos que expresan un control irrelevante muestran un efecto modesto en la motilidad del esperma in vitro, cuando los lactobacilos que expresan scFv enlazados al esperma se utilizaron, un efecto pronunciado se observó afectando la motilidad del esperma, incluyendo en ensayos para probar el efecto de scFv J102, y la motilidad se encontró para disminuirse al 50% en comparación con los controles, que indican un potencial para los lactobacilos que expresan scFv enlazado al esperma para interferir con la función del esperma.

EJEMPLO 5 Actividad Anti-Esperma de L. jensenii Preparado por Ingeniería Inhibición de 2a Fertilización: 105 esperma de las " especies respectivas se incubaron durante la noche en el frió en las soluciones de anticuerpo relevantes y de control (diluido 1:50, 1:5 o 1:1), o constructos que producen anticuerpo de control y relevante, y se agregan óvulos, en cuyo punto el enlace del esperma al óvulo se permite para proceder durante una hora. Los óvulos luego se lavan, y el número de esperma enlazado por el óvulo se determina, y se expresa como un porcentaje de tal enlace para las muestras de control. Los constructos con mayor porcentaje de inhibición se evalúan además.

Estudios de Inhibición de Fertilización in vivo: Los sujetos del sexo femenino (ratones, conejos) se inyectan intravaginalmente con fragmentos de anticuerpo relevantes purificados, fragmentos de anticuerpo de control purificados, lactobacilos preparados por ingeniería que expresan los fragmentos de anticuerpo relevantes, y lactobacilos preparados por ingeniería que expresan los fragmentos de anticuerpo de control. Un sujeto del sexo masculino y 2-4 sujetos del sexo femenino se alojan en múltiples puntos después de la administración intravaginal a sujetos del sexo femenino de los agentes respectivos. 24 horas después de la agrupación, los sujetos del sexo femenino se verificaron¦ visualmente diariamente para detectar la presencia de tapones vaginales. Los sujetos del sexo femenino se marcan para distinguirse entre las mismas (por ejemplo, por golpes del oído sucesivos) y, opcionalmente, dos semanas después del inicio del apareamiento, los sujetos del sexo femenino se remueven en jaulas individuales. Después de tres semanas, los sujetos del sexo femenino embarazadas que tienen carnadas y progenie se cuentan. Los constructos con la mayor actividad anticonceptiva luego pueden ser seleccionados y evaluados/optimizados además.

Los ensayos de inhibición de fusión se llevan a cabo como sigue. Ratones hembra jóvenes (8-10 semanas de edad) se inyectan con 5 unidades de suero de yegua preñada (PMS) en 0.9 NaCl por vía intraperitoneal . 48 horas más tarde, los ratones se inyectan IP con 5 unidades de hCG (gonadotropina coriónica humana) en NaCl al 0.9% para desencadenar la súper ovulación. 14-16 horas después de la inyección de hCG, los ovocitos . ovulados se recolectan y tratan con hialuronidasa para removerlas células del cúmulo. La zona pelúcida se remueve con una mezcla de proteasas. Los óvulos libres de zona pelúcida se incuban en medio de cultivo con péptido a una concentración especificada durante 30 minutos [Hogan, B. , et al., Manipulating The Mouse Embryo, 91-101, (1986)]. El esperma recolectado del epididimo de ratones machos se capacita por incubación y el acrosoma se hace reaccionar como se describe por Fleming y Yanagimachi [Gamete Res. 4, 253-273 (1981)] y se agrega a los óvulos, en presencia de anticuerpo de control y relevante, y los constructos que expresan los mismos, y se incuban durante 15 minutos. Los óvulos luego se transfieren a un medio de cultivo libre de esperma y se incuban durante 1 hora y 45 minutos adicional. Los óvulos luego se fijan y se tiñen como se describe por Primakoff et al., [J. Cell. Biol. 104, 141 (1987)]. El número total de cabezas de esperma hinchadas luego se cuentan. Las cabezas de esperma hinchadas son una indicación de que el esperma y el óvulo se han fusionado.

Sobre la base de estas observaciones, varios índices se calculan. El índice de fertilización (FI) se determina dividiendo el número total de cabezas hinchadas por el número total de óvulos. La tasa de fertilización (FR) es el porcentaje de óvulos fertilizados. El porcentaje de inhibición se determina al dividir el índice de fertilización del péptido experimental por el índice de fertilización del péptido de control. Los constructos con la mayor actividad se seleccionan.

EJEMPLO 6 L. jensenli preparado por ingeniería como anticonceptivos efectivos Otras especies animales se probaron de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 4. Conejos, ratas, conejillos de Indias, mini-cerdos, monos y otras especies pueden ser evaluados. Varios constructos serán evaluados en este contexto, y tomó nota ¦ de las diferencias de especies animales. Un porcentaje de eficacia se determinará para cada construcción, en cada cepa animal.

Además, cada especie se someterá a AIF con semen obtenido de machos de fertilidad probada, donde se evalúan la motilidad y conteo de esperma. Los lactobacilos que expresan fragmentos de anticuerpo de control y relevante se aplican intravaginalmente, y la AIF se realiza varias veces después de la administración. En el momento de la inseminación artificial, la ovulación es inducida por una inyección de por ejemplo 100 IU de hCG. Después de la ovulación y la inseminación artificial, los sujetos del sexo femenino se les permite completar su embarazo para evaluar los efectos teratogénicos potenciales.

Los sujetos del sexo . femenino administrados con control de lactobacilos y lactobacilos que expresan fragmentos de anticuerpo relevante se evaluarán para persistencia en el tracto genital.

Con este fin, las secreciones vaginales se recolectaron al pipetear repetidamente PBS estéril en la abertura vaginal. El fluido y moco se mezclan girando brevemente en una microcentrifuga, y el fluido sobrenadante se coloca en ensayo para presencia del scFv. Las titulaciones del fragmento de anticuerpo anti-esperma en el suero y los lavados vaginales se determinan por un ELISA.

Se conducen los estudios en curso de tiempo. Los sujetos del sexo femenino administrados con lactobacilos, se alojaron repetidamente con sujetos del sexo masculino, y la tasa de embarazo/eficacia anticonceptiva se evalúa, como una función del tiempo después de la administración.

EJEMPLO 7 L. jensenii que expresa scFv enlazado al espexma son anticonceptivos eficaces en ratones Administración a ratones y estudios de apareamiento: Los ratones ICR hembra se anestesiaron con 0.1 ml/gm en peso de una solución de quetamina (conc. 100 mg / mi) 0.5 mi de xilazina (conc. 20 mg/ml) y 8.5 mi de solución salina normal al 0.9%. Los ratones anestesiados luego se administraron intravaginalmente 108 de fase mid-log recién crecido de L. jensenii preparado por ingeniería (determinado por OD) J102 o cepas J112 de control. (N = 12 ratones por grupo) . Después de la administ ación, los sujetos del sexo femenino se mantuvieron en sus espaldas, la pelvis inclinada hacia arriba durante 30-60 minutos. Los lactobacilos se administraron a los sujetos del sexo femenino diariamente durante 3 días y luego se aparearon con machos con cepa ICR emparejados por edad. Los machos realojaron con las hembras durante 7 días, rotaron cada. dos días durante este período y luego se removieron. Las hembras luego se evaluaron visualmente por la presencia de tapones, y el número de ratones preñados y progenie producida por jaula se registró.

Estudios de colonización en ratones: Entre 12 y 24 horas después de una primera administración intravaginal, las hembras se limpiaron o lavaron vaginalmente y la muestra/fluido recuperada se colocó en placa en cloranfenico'l que contienen placas MRS y se cultivó a 37°C durante 24 horas. La presencia de los céspedes bacterianos sirve como indicadores de colonización vaginal.

RESULTADOS : Los estudios de colonización de ratones demuestran que hasta el 50% de los fluidos de lavado proporciona céspedes que indican que la colonización ocurre en hasta el 50% de los ratones, después de una administración intravaginal sencilla. Se encontró persistencia vaginal de los lactobacilos administrados por hasta 5 días después de la administración, en animales para los cuales la colonización se demostró por exudado.

Dos experimentos individuales se condujeron donde las hembras se les administró el scFv anti-esperma que expresa L. jensenii o cepa de control, y en cada experimento, se demostró anticoncepción eficaz (Figura 7A) . Mientras que el 92% de las hembras de control estaban embarazadas en cada experimento, las hembras tratadas con el scFv anti-esperma que expresa L. jensenii muestran una reducción significativa en la tasa de embarazo (58% o 50%).

El número de progenie total y el número de progenie por jaula se redujo en comparación con los controles, como una consecuencia de la administración de un scFv anti-esperma que expresa L. jensenii, también (Figura 7B) . Con base en estos hallazgos, el número de progenie por ratón también se redujo en los sujetos del sexo femenino tratados en comparación con los controles.

EJEMPLO .8 Seguridad de los Anticonceptivos Biológicos Los lactobacilos preparados por ingeniería son evaluados por su efecto sobre la irritabilidad vaginal. Los animales, tales como los ratones son tratados intra-vaginalmente con los lactobacilos, una vez por día durante 10-30 días consecutivos. Los animales luego son asesinados y el tracto reproductor se examina extremadamente y microscópicamente .

Los tejidos vaginales se examinan para ulceración epitelial, edema, infiltración de leucocitos, y congestión vascular, como una función de introducción de los lactobacilos, y lactobacilos preparados por ingeniería que expresan anticuerpos relevantes y de control. Los animales tratados con lactobacilos preparados por ingeniería se comparan con aquellos aislados naturales administrados, así como los animales no tratados. La mejora en la histología del tracto genital se puede observar, si existe .

EJEMPLO 9 Reversibilidad de Anticonceptivos Los animales hembra que a pesar de apareamientos repetidos no son preñadas, como una función de la administración de lactobacilos , se administrarán antibióticos y aparearán. El embarazo se evaluará como una medida de la reversibilidad de los lactobacilos preparados por ingeniería. De manera similar, los animales se evaluarán para persistencia de los lactobacilos en el tracto genital. En la indicación de la población disminuida o ausente con los lactobacilos preparados por ingeniería, los animales se aparearán, y su gravidez se determina.

Una vez que los estudios de seguridad y eficacia se han conducido en modelos animales apropiados, por ejemplo, como se describe anteriormente, entonces los ensayos clínicos humanos se contemplan, también.

Claims (25)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Una bacteria comensal, preparada por ingeniería genética del tracto genital femenino, caracterizada porque la bacteria preparada por ingeniería genética se prepara por ingeniería para expresar un agente anti-esperma .

2. La bacteria preparada por ingeniería de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el agente anti-esperma es un fragmento de anticuerpo scFv contra el esperma.

3. La bacteria preparada por ingeniería de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el fragmento de anticuerpo scFv contra el esperma es humano o humanizado.

4. La bacteria preparada por ingeniería de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el fragmento de anticuerpo scFv específicamente 'interactúa con el acrosoma o membrana de plasma.

5. La bacteria preparada por ingeniería de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el fragmento de anticuerpo scFv específicamente interactúa con la región de cuello del esperma.

6. La bacteria preparada por ingeniería de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el fragmento de anticuerpo scFv interactua específicamente con un antígeno FA-1 de esperma o un fragmento del mismo.

7. La bacteria preparada por ingeniería de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el fragmento de anticuerpo scFv interactúa específicamente con un péptido que comparte al menos 90% de identidad con SEQ ID NO: 1 o 2.

8. La bacteria preparada por ingeniería de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el fragmento de anticuerpo scFv tiene una secuencia que comparte al menos 90% de identidad con SEQ ID NO: 8.

9. La bacteria preparada por ingeniería de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el fragmento de anticuerpo scFv se codifica por un polinucleótido que tiene una secuencia que comparte al menos 90% de identidad con SEQ ID NO: 7.

10. La bacteria preparada por ingeniería de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la bacteria comensal es Lactobacillus .

11. La bacteria preparada por ingeniería de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la bacteria comensal es L. jenseníi , L. crispatus o L. caseii.

12. La bacteria preparada por ingeniería de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la bacteria comensal es Lactococcus.

13. La bacteria preparada por ingeniería de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la bacteria comensal es la cepa Escherichia coli Nissle 1917.

14. La bacteria preparada por ingeniería de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la bacteria comensal es S. gordonii.

15. Una composición, caracterizada porque comprende la bacteria preparada por ingeniería de conformidad con la reivindicación 1.

16. La composición de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la composición está en la forma de un supositorio, esponja, crema o espuma vaginal.

17. El uso de una composición de conformidad con la reivindicación 15, en un método de anticoncepción femenina.

18. El uso de una composición de conformidad con la reivindicación 15, en la fabricación de un medicamento para uso en la reducción de la incidencia de embarazo en una población femenina.

19. El uso de una composición de conformidad con la reivindicación 15, en la fabricación de un medicamento para uso en la reducción. de la incidencia de fertilización en una población femenina.

20. El uso de la bacteria preparada por ingeniería de conformidad con la reivindicación 1, en la fabricación de un medicamento para uso en la reducción de la incidencia de embarazo en una población femenina.

21. El uso de la bacteria preparada por ingeniería de conformidad con la reivindicación 1, en la fabricación de un medicamento para uso en la reducción de la incidencia de fertilización en una población femenina.

22. Un dispositivo insertado intravaginalmente, caracterizado porque comprende la bacteria preparada por ingeniería de conformidad con la reivindicación 1.

23. El dispositivo insertado intravaginalmente de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el dispositivo es un anillo insertado intravaginalmente.

24. Un método de anticoncepción, el método caracterizado porque comprende la etapa de poner en contacto las células del tracto genital de un sujeto del sexo femenino con la bacteria preparada por ingeniería de conformidad con la reivindicación 1 en una cantidad efectiva para inhibir o prevenir la motilidad del- esperma, fusión del esperma-óvulo o penetración del óvulo en el sujeto del sexo femenino.

25. El método de anticoncepción de conformidad con la reivindicación 24, el método caracterizado porque comprende la etapa de poner en contacto células del tracto genital de un sujeto del sexo femenino con la composición de conformidad con la reivindicación 15 en una cantidad efectiva para inhibir o prevenir la motilidad del esperma, fusión del esperma-ovulo o penetración del óvulo en el sujeto del sexo femenino .