KR101927747B1

KR101927747B1 - 여성용 생물 피임제

Info

Publication number: KR101927747B1
Application number: KR1020127031834A
Authority: KR
Inventors: 레이첼 테이텔바움
Original assignee: 허바나 리미티드
Priority date: 2010-05-06
Filing date: 2011-05-04
Publication date: 2018-12-12
Also published as: TR201807468T4; EP2566490A4; EP2566490A2; NZ603450A; JP2017012192A; MX2012012576A; IL208820A0; EA201291177A1; CN107058199A; IL222836A0; AU2015252159A1; AU2015252159B2; CA2797082C; CA2797082A1; EP2566490B1; WO2011138776A2; BR112012028427A2; CO6640222A2; ES2671345T3; AP2012006598A0

Abstract

본 발명은 특히, 정자 운동성 또는 수정을 억제하는 항체 단편을 발현하도록 조작된 공생 유기체 및 이를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 여성에서 효과적인 피임 수단으로서 상기 조작된 공생 유기체 또는 이를 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.

Description

여성용 생물 피임제{BIOLOGIC FEMALE CONTRACEPTIVES}

본 발명은 정자 운동성, 수정 또는 그의 조합을 억제하는 항체 단편을 발현하도록 조작된 공생 유기체, 및 그를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 피임제로서 상기 조작된 공생 유기체 또는 그를 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.

새로운 피임제의 개발은 사회적, 재정적 또는 교육적 제약과 무관하게 모든 개개인에게 접근이 용이한 산아 제한을 제공하기 위해 필수적이다.

많은 다양한 피임제들이 현재 이용가능하지만, 문제가 없는 것은 없다. 지금까지, 가장 보편적으로 사용되는 피임제는 경구용 에스트로겐, 프로게스테론 또는 그의 조합 제형으로, 이들은 효과적이지만, 그럼에도 불구하고 연장 사용에 따라서 및 일부 집단에서 전종양성(proneoplastic)인 것으로 시사되었다.

다이어프램(diaphragm) 또는 자궁내 장치와 같은 차단 피임법은 감소된 효율, 및 다이어프램의 경우 불이행, 및 자궁내 장치의 경우 보다 높은 골반 염증 질환 위험성을 나타낸다. 이와 관련하여 살정제도 또한 보다 떨어지는 효율로 사용되어 왔으며, 더욱이 상기 사용은 성인성 질환에 대한 보다 높은 위험성과 관련된다.

따라서, 상기 제약들과 관련되지 않으면서 사용하기에 용이하고 최소 침습성인 피임제가 요구된다.

한 태양에서, 본 발명은 정자 항원에 대한 항체 단편을 생성하여, 피임제로 작용할 수 있는 유전자 조작된 세포를 제공한다.

한 태양에서, 본 발명은 여성 생식기의 조작된 공생 세균을 제공하며, 이때 상기 세균은 정자 운동성, 정자-난자 융합, 또는 난자의 정자 침투, 또는 이들의 조합을 방지하기에 효과적인, 정자에 대한 항체 또는 그의 단편을 발현하도록 조작된다. 일부 태양에서, 항체 단편은 단일쇄 Fv 분자(ScFv)이다.

일부 태양에서, 정자 항원에 특이적인 항체 단편은 인간-유도되거나 인간화된다. 일부 태양에서, 항체 단편은 정자 상의 첨체(acrosome) 또는 원형질막 편재 항원 또는 그의 단편과 특이적으로 상호작용한다. 일부 태양에서, 항체 단편은 정자 경부(sperm neck) 영역 편재 항원 또는 그의 단편과 특이적으로 상호작용한다. 일부 태양에서, 항체 단편은 조작된 세균으로부터 분비되며, 일부 태양에서, 항체 단편은 세균 세포벽에 부착되거나 결합된다.

일부 태양에서 조작된 세균은 락토바실러스(Lactobacillus)이거나, 또는 일부 태양에서 락토코커스( Lactococcus)이다. 일부 태양에서, 조작된 세균은 에스케 리키아 콜라이 ( Escherichia coli) 니슬(Nissle) 1917 균주이다. 일부 태양에서, 조작된 세균은 스트렙토코커스 고르도니(Streptococcus gordonii)이다. 일부 태양에서, 조작된 세균은 락토바실러스 젠세니 ( jensenii) 또는 락토바실러스 크리스파투스( crispatus)이다.

일부 태양에서, 상기 scFv는 서열번호 1 또는 2와 90% 이상의 동일성을 공유하는 펩티드와 특이적으로 상호작용한다. 일부 태양에서, 상기 scFv는 서열번호 8과 90% 이상의 동일성을 공유하는 서열을 갖는다. 일부 태양에서, 상기 scFv는 서열번호 7과 90% 이상의 동일성을 공유하는 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다.

일부 태양에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같이 조작된 세균을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 태양에서, 상기 조성물은 질내 좌약, 크림 또는 발포제(foam)의 형태이다. 일부 태양에서, 상기 피임제는 질내 고리와 결합되거나 그 위에 삽입된다.

일부 태양에서, 본 발명은 여성 대상자의 생식기 세포를 본원에 기술된 바와 같은 조작된 세균과, 여성 대상자에서 정자 운동성, 정자-난자 융합 또는 난자 침투를 억제하거나 방지하기에 충분한 양으로 접촉시키는 단계를 포함하는 피임 방법을 제공한다. 일부 태양에서, 상기 측면에 따라서, 상기 방법은 조작된 세균을 포함하는 조성물을 그를 필요로 하는 여성 대상자의 생식기에 억제 또는 방지하기에 충분한 양으로 투여하는 것을 포함한다.

일부 태양에서, 본 발명은 여성 대상자의 생식기 세포를 본원에 기술된 바와 같은 조작된 세균과, 여성 대상자에서 정자 운동성, 정자-난자 융합 또는 난자 침투를 손상하거나 억제하거나 방지하기에 충분한 양으로 접촉시켜, 여성에서 임신 발생률을 감소시키고 따라서 여성 인구에서 임신 발생률을 감소시키는 단계를 포함하는, 여성 인구에서 임신 발생률을 감소시키는 방법을 제공한다.

일부 태양에서, 본 발명은 여성 대상자의 생식기 세포를 본원에 기술된 바와 같은 조작된 세균과, 여성 대상자에서 정자 운동성, 정자-난자 융합 또는 난자 침투를 손상하거나 억제하거나 방지하기에 충분한 양으로 접촉시켜, 여성에서 수정 발생 빈도를 감소시키고 따라서 여성 인구에서 수정 발생률을 감소시키는 단계를 포함하는, 여성 인구에서 수정 발생률을 감소시키는 방법을 제공한다.

일부 태양에서, 본 발명은 여성 인구에서 임신 발생률의 감소에 사용하기 위한 약제의 제조에 있어, 본원에 기술된 바와 같은 조작된 세균 또는 조성물의 용도를 제공한다. 일부 태양에서, 본 발명은 여성 인구에서 수정 발생률의 감소에 사용하기 위한 약제의 제조에 있어, 본원에 기술된 바와 같은 조작된 세균 또는 조성물의 용도를 제공한다.

도 1은 ELISA 분석에 의해 측정된 정자 펩티드에 대한 단리되고 클로닝된 파지 디스플레이 scFv의 상대적 친화도를 그래프로 나타낸 것이다. 기둥 1 내지 3은 정자 FA-1 유도 펩티드에 대한 3개 scFv의 결합을 나타내고, 기둥 4 내지 6은 정자 YLP(12)-유도 펩티드에 대한 3개 scFv의 결합을 나타낸다. BSA는 음성 결합 대조군으로 작용하였다.
도 2는 프로브된 정자 펩티드에 대해 단리되고 클로닝된 일부 파지-디스플레이 scFv의 상대 친화도를 나타낸 것이다. 클론들은 OD 값이 BSA 대조군에 대해 또는 펩티드 부재하에 배양된 샘플에서 펩티드와 비교하여 더 높았을 때 높은 친화도를 갖는 것으로 간주하였다. 클론 102, 103, 105 및 106이 특히 상기 펩티드에 대해 높은 친화도를 나타내었고, 클론 102는 시험관내 및 생체내에서 더 특성화하였다.
도 3은 도 2에 나타낸 바와 같이 프로브된 펩티드에 대해 우수한 친화도를 갖는 것으로 밝혀진 클론 102와 비교하여, 대조군으로 사용된 일련의 비-결합 scFv를 동정하는 ELISA 결합 분석의 결과를 그래프로 나타낸 것이다. 이와 관련하여, 하나의 상기 scFv 클론인 J112를 전형적으로 사용하였다. 각각 scFv 파지, 또는 펩티드 및 scFv를 함유하지 않는 샘플인 대조군 A 및 B도 또한 평가하였다. 결합은 항-파지 HRP 표지된 항체(PVIII에 대한 항체)로 프로브된 샘플에서 OD를 측정함으로써 검출하였다.
도 4a는 pSLP111.1 벡터의 플라스미드 지도이다. 도 4b는 플라스미드 NcoI 및 NotI 절단 생성물을 보여주는 사진이다. 상기 플라스미드들은 37 ℃에서 3 시간동안 NcoI- 및 NtoI으로 절단하였다. 플라스미드 삽입물은 여러개의 대표적인 클론에서 분명하게 보여진다.
도 5a는 J102의 핵산 및 아미노산 서열을 각각 나타낸 것이다(서열번호 7 및 8). 도 5b는 J102 scFv 내에서의 각각의 영역을 나타낸 것이다.
도 6은 시험관내에서 뮤린 정자에 대한 J102 발현 락토바실러스의 특이적 결합을 나타낸 것이다. 도 6a는 마우스 정자에 대한 scFv 발현 락토바실러스의 현저한 결합을 보여주는 광학 현미경사진으로, 평가된 각각의 정자 세포가 거의 현저한 염색을 나타낸다. 도 6b는 대조군으로 작용하는 J112 발현 락토바실러스의 광학 현미경사진으로, 여기서 뮤린 정자에 대한 인지할 만한 결합이 없음이 명백하다.
도 7은 J102 발현 락토바실러스의 효능의 생체내 증거를 그래프로 나타낸 것이다. 도 7a는 항-정자 scFv J102 발현 락토바실러스 젠세니, 또는 정자에 결합하지 않는 scFv 발현 대조군 락토바실러스(J112)를 투여한 두 실험에서 암컷 마우스의 임신율을 플로팅한 것이며, 각 실험에서, J112 처리 마우스에 비해 J102에서 효과적인 피임이 입증되었다. 도 7b는 도 7a에 기술된 바와 같이 수행된 두 실험 각각에서 총 새끼 수 및 우리 당 새끼 수를 플롯팅한 것이며, 총 새끼수 및 우리당 새끼수 둘 다 대조군에 비해 J102 발현 락토바실러스 젠세니에서 감소되었다.

한 태양에서, 본 발명은 살정자 화합물의 생성을 위한 미생물을 포함하는 재조합 세포 및 이를 이용하는 방법을 제공한다. 한 태양에서, 상기 방법 및 세포는 효과적인 피임 수단을 제공한다.

한 태양에서, 재조합 세포는 여성 생식기의 공생 유기체이다. 한 태양에서, 공생 유기체는 세균이다.

한 태양에서, 재조합 세포는 정자 운동성, 정자-난자 융합 또는 난자의 정자 침투를 방해하는 화합물을 발현하기에 충분한 시간동안 여성 생식기의 점막에 존속되는 비-포유동물 세포이다. 일부 태양에서, 상기 화합물은, 여성 생식기를 콜로니화시키는 공생 유기체에 의해, 처리된 대상의 여성 생식기에서 발현되는 경우, 상기 대상에서 감소된 수정능력을 야기한다. 일부 태양에서, 상기 화합물은, 처리된 대상의 여성 생식기에서 발현되는 경우, 상기 공생 유기체가 투여된 개체군에서 감소된 임신율을 야기한다.

한 태양에서, 본 발명은 여성 생식기 또는 그의 영역들을 콜로니화시킬 수 있는, 살정자 화합물을 발현하는 조작된 공생 유기체를 제공한다.

한 태양에서, 상기 세포는 암호화 서열 이전(5' 비-암호화 서열) 및 이후(3' 비-암호화 서열)의 조절 서열들을 포함하여, 특정 단백질로서 발현될 수 있는 핵산 단편을 발현하도록 조작된다.

유전자 조작된 세균은 당해 분야에 숙련된 자에게 공지된 바와 같은 임의의 수단에 의해 특정 유전자가 결핍되도록 조작될 수 있거나, 또는 조작된 유기체가 당해 분야에 공지된 방법에 의해 특정 유전자를 과발현하도록 조작될 수 있다.

한 태양에서, 유전자 녹-아웃(knock-out) 절차시 세균에서 상동성 재조합을 위해 선택하는 것이 가능하도록, 본 발명의 세균에 구축물이 도입된다. 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자라면 구축물과 상동성 재조합이 일어난 형질감염 세포를 효과적으로 선택하기 위한 양성 및 음성 선택 유전자 둘 다를 포함하는 녹-아웃 구축물을 용이하게 설계할 수 있다.

또 다른 태양에서, 특히 유전자 발현의 증대, 감소 및 억제를 포함하여, 유전자 발현, 활성 및 기능의 변화가 세포 게놈내에 통합되는 유전자 구축물을 사용하여 달성될 수 있다. 또 다른 태양에서, 유전자 발현, 활성 및 기능의 변화는 염색체외로 존재하고, 한 태양에서는 염색체외로 유지되는 유전자 구축물을 사용하여 달성될 수 있다.

한 태양에서, 용어 구축물 또는 벡터는 벡터내에 서브클로닝된 해당 서열을 함유하는 핵산 비히클을 말한다.

본 발명의 벡터를 제작하기 위해, 해당 폴리뉴클레오티드 암호화 서열을, 원핵 세포를 형질도입/형질전환시키고 형질도입/형질전환된 세포내에서 재조합 생성물의 발현을 유도하기에 적합한 적절한 발현 벡터 시스템내에 접합시킬 수 있다. 상기 적절한 벡터 시스템은, 기존 프로모터 또는 인핸서 서열을 대체, 복사 또는 돌연변이시키고/시키거나, 예를 들면, 추가의 선택 마커를 암호화하는 서열 또는 리포터 유전자를 암호화하는 서열과 같은 임의의 또 다른 폴리뉴클레오티드 서열을 도입하기 위해 통상적으로 사용되는 재조합 기술에 의해 용이하게 변형될 수 있음을 인지할 것이다.

또 다른 태양에 따르면, 상기 벡터는 단리된 핵산의 발현을 조절하기 위한 프로모터와 같은 조절 요소를 추가로 포함한다. 상기 프로모터는 그의 하류에 존재하는 서열들을 전사시키는 DNA 의존성 RNA 폴리머라제를 결합시키는 역할을 하기 때문에 전사에 필요한 시스-작용(cis-acting) 서열 요소인 것으로 알려져 있다. 또 다른 태양에서, 벡터는 유도성 프로모터, 또는 해당 서열을 구성적으로 발현하는 프로모터를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 벡터는 복제 기점을 추가로 포함할 수 있으며, 하나보다 많은 원핵 세포 종에서 증식할 수 있고, 일부 태양에서 상기 벡터는 선택된 유기체의 게놈내에 그의 통합을 촉진하도록 구성될 수 있다. 다른 태양에서, 상기 벡터는, 예를 들면, 숙련된 전문가에 의해 인지되는 바와 같이, 플라스미드, 백미드(bacmid), 파지미드(phagemid) 또는 파지, 또는 임의의 적절한 벡터일 수 있다.

상기 벡터의 한 예를 하기 실시예 부분에서 기술하고 사용한다. 그러나, 숙련된 전문가라면, 본 발명이 임의의 상기 벡터의 사용으로 제한되지 않으며, 벡터가 유전자 전달/조작 비히클로서 작용하는 삽입 또는 혼입된 서열의 이종 발현을 최적화하기 위해 새로운 벡터를 생성하고/하거나 기존 벡터를 변형하는 것이 통상적인 것임을 이해할 것이다.

사용하기에 적합한 벡터의 몇몇 예는 다음을 포함한다: 문헌 [M. Posno et al., Appl Environ Microbiol. 57(6):1822-1828 (1991 June)]; 문헌 [M Shimizu-Kadota et al., Appl Environ Microbiol. 57(11):3292-3300 (1991 November)]; 문헌 [T. Duong, et al., Microbiol Biotechnology Volume 4, Issue 3, pages 357-367 (2011 May)]; 문헌 [V V Aleshin et al., Mikrobiologiia Volume 69, Issue 1, pages 75-80]; 문헌 [X. Liu et al., Antimicrobioal agents and chemotherapy, vol. 50, no. 10, pp. 3250-3259 (2006)]; 제 WO/2005/112567 호; 문헌 [Luca Vangelista et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Vol. 54, No. 7, pp. 2994-3001 (2010 July)]; 미국 특허 제 7,179,458 호; 미국 특허 제 7,754,467 호; 문헌 [Caren J. Chancey et al., The Journal of Immunology, 176:5627-5636 (2006)]; 미국 특허 제 5,733,540 호 등.

세포내 목적 핵산 서열의 혼입은 당해 분야에 공지되어 있는 많은 방법을 통해 달성될 수 있다. 세포를 안정하게 또는 일시적으로 형질감염 또는 형질도입시키기 위해 핵산 구축물이 사용될 수 있다.

본 발명의 세포내에 벡터를 도입하기 위해 당해 분야에 공지된 많은 기술들, 예를 들면, 다음 기술들이 있으나, 이로 한정되지는 않는다: 직접 DNA 흡수 기술, 및 파지, 플라스미드, 선형 DNA 또는 리포좀 매개 형질도입, 수용체-매개 흡수 및 칼슘-포스페이트 매개 및 DEAE-덱스트란 매개 도입 방법을 이용하는 마그네토포레이션(magnetoporation) 방법, 전기천공 또는 리포좀-매개 형질감염(추가의 상세한 설명에 대해서는, 예를 들면, 문헌 ["Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel F.M. et al. (eds.) Greene Publishing Associates (1989)]; 및 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)], 또는 다른 표준 실험실 매뉴얼을 참조함). 핵산 코팅 입자에 의한 충격도 또한 고려된다. 이들 방법중 임의의 방법을 세포내 목적 서열의 도입, 본 발명의 세포의 제조, 및 본 발명 방법의 수행을 위해 사용할 수 있음을 주지해야 한다.

전기천공이 다양한 세포의 형질전환에 성공적으로 사용되었다.

공여체 및 수용체 세포의 직접 접촉에 의존하는 세균 접합도 또한 세균내로의 유전자의 전달에 사용될 수 있다. 세균 접합 과정은 "공여체" 및 "수용체" 세포를 서로 밀착 접촉시켜 함께 혼합시키는 것을 포함할 수 있다. 접합은 공여체와 수용체 세균 사이의 세포질 연락의 형성에 의해, 새로 합성된 공여체 DNA의 수용체 세포내로의 직접 전달하에 일어난다. 접합시 수용체는 공여체 세균으로부터의 수평적 전달을 통해 DNA를 수용한다. 접합성 전달에서 공여체는 접합성 플라스미드, 접합성 트랜스포존(transposon) 또는 이동성 플라스미드를 가질 수 있다.

일부 경우에서는, 공여체 및 수용체만이 접합에 필요하다. 이것은 전달될 플라스미드가 접합성 및 이동성 둘 다인(즉, tra 유전자 및 Mob 단백질을 암호화하는 유전자를 둘 다 갖는) 자가-전달성 플라스미드인 경우이다. 일반적으로, 상기 과정은 다음의 단계들을 포함한다: 1) 이중-가닥 플라스미드 DNA를 oriT 중 특정 부위에 니킹(nicking)하고; 2) 단일-가닥 DNA를 기공 또는 선모 구조를 통해 수용체로 방출시키고; 3) DNA 렐락사제(relaxase) 효소가 이중-가닥 DNA를 oriT에서 절단하고 방출된 5' 말단에 결합시키고(중간 구조로서 렐락소좀(relaxosome) 형성); 4) 이어서, DNA 전달 과정을 촉진하기 위해 보조 단백질의 복합체를 oriT에 구성한다.

"삼친(triparental)" 접합도 또한 수용체로의 공여체 플라스미드의 전달에 필요할 수 있다. 상기 유형의 접합에는, 공여체 세포, 수용체 세포 및 "헬퍼" 플라스미드가 관여한다. 공여체 세포는 이동성 플라스미드 또는 접합성 트랜스포존을 갖는다. 이동성 벡터는 oriT, 니카제(nikase)를 암호화하는 유전자를 함유하며, Mob 단백질을 암호화하는 유전자를 가지나; Mob 단백질 단독으로는 게놈의 전달을 달성하기에 충분하지 않다. 따라서, 이동성 플라스미드는 헬퍼 플라스미드(공여체 내에 또는 "헬퍼" 세포 내에 위치)에 의해 적절한 접합 시스템이 제공되지 않는 한 스스로의 전달을 촉진할 수 없다. 접합성 플라스미는 기공 또는 선모의 형성에 수반되는 전달을 위한 단백질(Tra)을 암호화하기 때문에, 짝을 이룬 쌍 형성 및 DNA 전달에 접합성 플라스미드가 필요하다.

용어 "재조합" 또는 "재조합적으로 변형된"은, 예를 들면, 세포, 또는 핵산, 단백질 또는 벡터에 관하여 사용되는 경우, 상기 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터가 이종 핵산 또는 단백질의 도입에 의해, 또는 천연 핵산 또는 단백질의 변이에 의해 변형되었거나, 또는 세포가 상기와 같이 변형된 세포로부터 유래되는 것을 나타낸다. 따라서, 예를 들면, 재조합 세포는 세포의 천연(비재조합) 형태 내에서 발견되지 않는 유전자들을 발현하거나, 또는 달리 비정상적으로 발현되거나, 저발현(underexpress)되거나 또는 전혀 발현되지 않는 천연 유전자를 발현한다.

용어 "이종"은 핵산 부분과 관련하여 사용되는 경우, 핵산이 천연에서 서로에 대해 동일한 관계로 발견되지 않는 아서열(subsequence)을 2개 이상 포함하는 것을 나타낸다. 예를 들면, 새로운 기능성 핵산, 예를 들면, 한 공급원으로부터 프로모터 및 또 다른 공급원으로부터 암호화 영역을 구성하도록 배열된 미관련 유전자들로부터의 2개 이상의 서열을 갖는 핵산이 전형적으로 재조합적으로 생성된다. 유사하게, 이종 단백질은 상기 단백질이 천연에서 서로에 대해 동일한 관계로 발견되지 않는 2개 이상의 아서열을 포함하는(예를 들면, 융합 단백질) 것을 나타낸다.

"발현 카세트"는 숙주 세포에서 특정 핵산의 전사를 허용하는 일련의 특정 핵산 요소들을 갖는, 재조합적으로 또는 합성적으로 생성된 핵산이다. 발현 카세트는 플라스미드, 바이러스 또는 핵산 단편의 일부일 수 있다. 전형적으로, 발현 벡터는 프로모터에 작동가능하게 연결된, 전사될 핵산을 포함한다.

또 다른 태양에서, 본 발명에 사용되는 핵산은 뉴클레오티드 유사체로부터 제조된 RNA 또는 DNA의 유사체를 포함한다. 상기 용어는 천연 핵염기, 당 및 공유성 뉴클레오시드간(주쇄) 결합으로 이루어진 올리고뉴클레오티드, 및 유사하게 작용하는 비천연 부분들을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 상기 변형되거나 치환된 올리고뉴클레오티드는 종종, 예를 들면, 증대된 세포 흡수율, 핵산 표적에 대한 증대된 친화도, 뉴클레아제의 존재하에서의 증가된 안정성 및/또는 효과적인 유전자 발현 억제(silencing)와 같은 바람직한 성질들로 인해 천연 형태에 비해 바람직하다.

본 발명에서 사용되는 핵산은 당해 분야에 공지되어 있는 바와 같은 임의의 합성 또는 재조합 공정에 의해 생성될 수 있다. 핵산은 또한 당해 분야에 공지된 기술을 사용하여 생리학적 또는 생물학적 성질이 변화되도록 변형될 수 있다. 예를 들면, 핵산은 뉴클레아제에 대한 그의 안정성이 증가되거나(예를 들면, "말단-캡핑"), 또는 그의 친유성, 가용성, 또는 상보성 서열에 대한 결합 친화성이 변화되도록 변형될 수 있다.

본 발명에 따른 DNA는 또한 당해 분야에 공지된 방법에 의해 화학적으로 합성될 수 있다. 예를 들면, DNA는 당해 분야에 공지된 방법에 의해 4개의 뉴클레오티드로부터 전체로 또는 부분적으로 화학적으로 합성될 수 있다. 상기 방법은 카루터스의 문헌 [Caruthers (1985)]에 기술된 것들을 포함한다. DNA는 또한 중복되는 이중-가닥 올리고뉴클레오티드를 제조하고, 틈(gap)을 채우고, 말단을 함께 접합시킴으로써 합성될 수 있다(일반적으로 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); and Glover et al. (1995)] 참조). 단백질의 기능적 동족체를 발현하는 DNA는 부위-지향 돌연변이유발에 의해 야생형 DNA로부터 제조될 수 있다(예를 들면, 졸러 등의 문헌 [Zoller et al. (1982); Zoller (1983); and Zoller (1984)]; 맥퍼슨의 문헌 [McPherson (1991)] 참조). 수득된 DNA는 당해 분야에 공지된 방법에 의해 증폭될 수 있다. 적합한 한 방법은 사이키 등의 문헌 [Saiki et al. (1988)], 멀리스 등(Mullis et al.)의 미국 특허 제 4,683,195 호 및 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]에 기술된 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 방법이다.

또 다른 태양에서, 벡터, 예를 들면, 코스미드, 파지, 플라스미드 또는 BAC(세균 인공 염색체) 벡터 내에 클로닝된 게놈 DNA 상에 시험관내 전위(transposition)를 수행할 수 있다. 유사한 고밀도 돌연변이유발은 대립형질 치환 벡터(예를 들면, 미국 특허 제 6,207,384 호 참조) 내에 클로닝된 게놈 DNA를 사용하여 비-천연 컴피턴트(competent) 유기체에서 수행할 수 있으며, 이 방법들을 이용하여 본원에 기술된 바와 같은 유기체를 조작할 수 있다.

예를 들면, 그의 형질전환 능력, 이종 단백질 발현 능력 및/또는 점막 표면에 대해 적절한 세균 숙주 균주를 선택한다. 세균 숙주는 루비듐 클로라이드 방법 또는 전기 천공과 같은 표준 기술을 이용하여 형질전환에 대해 컴피턴트하게 된다(예를 들면, 문헌 [Wei et al., J. Microbiol. Methods 21:97-109 (1995)] 참조).

전기천공에 의한, 예를 들면, 공생 락토바실러스 젠세니의 형질전환은, 예를 들면, 문헌 [Luchansky et al., J. Dairy Sci. 74:3293-3302 (1991)]에 기술된 바와 같은 표준 방법을 변형시켜 수행할 수 있다. 간략하게, 새로 접종한 락토바실러스 젠세니를 MRS 액체배지 중에서 배양한다(예를 들면, 37 ℃ 및 5% CO₂에서, OD₆₀₀에서 0.6 내지 0.7로). 세균 세포를 수확하고, 세척하고, 슈크로스 및 MgCl₂의 차가운 용액에 재현탁시킨다. 이어서, 컴피턴트 세포를 DNA와 혼합하고 전기천공한다. 그 후에, 세포를 회수한 후 다른 항생물질 선택성 약제를 함유하는 선택성 아가 배지 상에 도말한다. 이어서, 조작된 세포를 대상에게, 예를 들면, 좌약, 크림 또는 발포제 제형으로 투여한다.

선택적으로, 항생물질 전처리를 이용하여, 본 발명의 세균을 질내에 도입하기 전에 상재 세균의 점막 표면을 예비-세정할 수 있다(예를 들면, 문헌 [Freter et al., Infect. Immun., 39:686-703 (1983)] 참조). 항생물질은 경구 제공되거나 또는 질에 직접 적용될 수 있다.

일부 태양에서, 본 발명은 균주가 그에 세균이 적용되는 점막 표면을 콜로니화시키는데 효과적인 본 발명의 방법에 따라 조작하기 위한 세균 균주를 선택하는 비-제한 방법을 제공하며, 상기 방법은 동물 또는 인간 점막층 위에 세균을 신속하게 콜로니화시키기 위해 반복 선택하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들면, 야생 세균 균주를 점막 표면에 적용하고 반복적으로 분리하고 세균을 시험관내에서 배양하여 각 단계에서 점막 표면으로 돌려보낸다. 일부 태양에서, 상기 태양에 따르면, 궁극적으로 증대된 콜로니화 능력을 갖는 세균이 수득된다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 세균이 적용되는 점막 표면을 콜로니화시키는데 효과적인 본 발명의 방법에 따라 세균 균주를 조작하기 위한 비-제한 방법을 제공하며, 상기 방법은 재조합 세균의 표면상에 융합 단백질의 발현을 포함할 수 있다. 융합 단백질은 해당 폴리펩티드에 연결된 숙주-결합 영역으로 이루어진다. 숙주-결합 영역은 세균이 선택된 숙주 점막 표면상의 특정 결정인자(단백질 또는 탄수화물)에 높은 친화도하에 결합하게 하여, 세균에 상재 미생물총(microflora)에 비해 생존 이점을 제공한다.

본 발명의 세균 균주를 조작하기 위한 또 다른 구체적 방법은 박테리오파지에 의해 유전자를 도입함으로써 이종 단백질을 발현하도록 상재 미생물총을 유도하는 것을 포함한다. 많은 박테리오파지 벡터가 상이한 세균에 사용하기 위해 개발되었다. 예를 들면, 잠재성 박테리오파지 adh를 기초로 하는 박테리오파지 벡터를 사용할 수 있다(예를 들면, 문헌 [Raya et al., J. Bacteriol. 174:5584-5592 (1992)]; 및 문헌 [Fremaux et al., Gene 125:61-66 (1993)] 참조). 상기 벡터는 한정된 파지(attP) 및 세균(attB) 부착 부위에서 숙주 염색체내에 부위-특이적 통합이 일어난다. 유사하게, 락토바실러스-특이적 박테리오파지를 사용하여 벡터 또는 다른 폴리뉴클레오티드를 락토바실러스 염색체내에 형질도입할 수 있다. 락토바실러스-특이적 파지로는 mv4(문헌 [Auvray et al., J. Bacteroil., 179:1837-1845 (1997)]), adh(문헌 [Fremaux et al., Gene 126:61-66 (1993)]), gle(문헌 [Kakikawa et al., Gene 175:157-165 (1996)]), 및 질내 락토바실러스 분리균 중 브래들리(Bradley)군 A 또는 B에 속하는 것들(문헌 [Kilic et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 8:31-39 (2001)])이 포함된다.

점막 상피 세포를 자극하지 않는 특정 약제도 콜로니화를 돕기 위해 단위 용량의 세균에 첨가될 수 있다. 점막 표면상의 많은 세균은 응집되어 전체 점막 표면을 덮는 생물막을 형성하는 캡슐 물질을 분비한다. 상기 생물막 물질을 절단하여 보다 성공적인 콜로니화를 위해 조작 세균의 생물막내로의 침투를 촉진하는 효소를 첨가하는 것이 유리할 수 있다. 상기 효소로는 DNase, 펩티다제, 콜라게나제, 히알루로니다제 및 기타 탄수화물 분해 효소가 포함된다. 조작 세균의 효과적인 콜리니화를 촉진하기 위해 점막 표면 상의 상재 세균의 수를 감소시키도록, 조작된 세균 자체가 민감성이 아닌 항생물질도 첨가될 수 있다.

이종 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 발현은 구성적(예를 들면, P59(문헌 [van der Vossen et al., Appl. Environ. Microbiol. 58:3142-3149 (1992)]) 또는 P23(문헌 [Elliot et al., Cell 36:211-219 (1984)]) 프로모터를 사용함)일 수 있다. 또는, 발현은 유도성 프로모터의 제어하에 이루어질 수 있다. 예를 들면, 바실러스 아밀라제(문헌 [Weickert et al., J. Bacteriol. 171:3656-3666 (1989)]) 또는 자일로스(문헌 [Kim et al., Gene 181:71-76 (1996)]) 프로모터 및 락토코커스 니신(Lactococcus nisin) 프로모터(문헌 [Eichenbaum et al., Appl. Environ. Microbiol. 64:2763-2769 (1998)])를 사용하여 유도성 발현을 유도할 수 있다. 또한, 산 또는 알칼리-유도된 프로모터도 사용할 수 있다. 예를 들면, 질의 비교적 산성 조건하에서 활성인 프로모터(예를 들면, 미국 특허 제 6,242,194 호에 기술된 것들)를 사용할 수 있다. 또는, 정액에 반응하여 질에서 변화시 유도되는 프로모터를 사용할 수 있다. 예를 들면, 정액의 도입으로부터 야기되는 질의 증가된 알칼리성 조건에 반응하여 발현을 유도하기 위해 알칼리-유도된 프로모터를 사용한다.

다양한 신호 및 고정(anchor) 서열들이 막, 세포외 공간 또는 세포벽의 발현을 유도(예를 들면, 펩티도글리칸에 대한 공유 결합에 의해)하는 것으로 알려져 있다. 예시적인 신호 서열은 락토바실러스 아밀로보러스(amylovorus)의 α-아밀라제로부터의 신호 서열(문헌 [Giraud & Cuny, Gene 198:149-157 (1997)]) 또는 락토바실러스 크리스파투스의 S-층 유전자(cbsA)로부터의 신호 서열(예를 들면, MKKNLRIVSAAAAALLAVAPVAA(서열번호 3) 또는 MKKNLRIVSAAAAALLAVATVSA(서열번호 4)을 포함한다. 신호 서열은 전형적으로 폴리펩티드의 아미노-말단에 위치한다.

고정 서열은 전형적으로 암호화된 단백질 서열의 카복실 말단에 위치한다. 고정 서열은, 예를 들면, 세포벽 관련 서열; 서열 LPQ(S/A/T)(G/A)(여기서, 괄호안의 잔기들은 그 위치에서 상이한 선택사항을 나타낸다); 및 소수성 서열, 및 선택적으로는 하전된 서열을 포함한다. 일부 태양에서, 고정 서열은 VTRTINVVDPITGKISTSVQTAKFTREDKNSNAGYTDPVTGKTTMNPWTPAKQGLRAVNVEQIKGYVAKVDGNVDAVVVTPDSANMVVTITYQANKPEGQNITNKKDTVPDPADGIKNKDDLPDGTKYTWKEVPDVNSVGEKTGIVTVTFPDGTSVDVKVTVYVDPVVESNRDTLSKEANTGNTNVAKAATVTSSKVESKKTLPQTGSKTEQVGILGLAIATVGSLLGLGVNRKKRQK(서열번호 5); 또는 KKAEEVKNNSNATQKEVDDATNNLKQAQNDLDGQTTDKSKLDEAIKSA DDTKSTDKYNNASDDTKSKFDEALKKAEEVKNNSNATQKEVDDATKNLKQAQNDLDGQTTNKDAINDAIKDANNAKGTDKYNNASDDTKSKFDDALKKAEDVKNDSNANQKEVDDATKNLKNTLNNLKGQPAKKANLIASKDNAKIHKQTLLPQTGTETNPLTAIGIGLMALGAGIFAKKKRKDDEA(서열번호 6), 또는 서열번호 5 또는 서열번호 6에 실질적으로 동일한 서열을 포함한다.

폴리펩티드의 정확한 위치 및 폴딩(folding)은 표준 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들면, 락토바실러스의 세포벽이 풍부한 분획은, 완충액(예를 들면, 25% 슈크로스, 1 mM EDTA, 10 mM 트리스-HCl, pH 8.0)에 세균을 현탁시킨 후, 세포벽 분해 효소(예를 들면, 리소자임 및 뮤타노리신)로 처리한 다음, 수득된 원형질체를 차등 원심분리에 의해 분리함으로써 수득할 수 있다(문헌 [Piard et al., J. Bacteriol. 179:3068-3072 (1997)]). 이어서, 분획들을 웨스턴 블로팅(Western blotting)으로 스크리닝하여 세포벽내 발현을 확인할 수 있다.

발현된 폴리펩티드의 폴딩 및 생물 활성은 또한 표준 방법을 이용하여 측정할 수 있다. 예를 들면, 천연 폴딩 폴리펩티드에 특이적인 항체를 사용하는 ELISA 분석법을 이용하여 폴리펩티드의 폴딩 및 3차원 구조를 확인할 수 있다. 생물 활성 분석은 폴리펩티드의 활성에 따라 달라질 것임은 당연하다. 예를 들면, 정액에 결합하는 폴리펩티드의 경우, 발현된 폴리펩티드는 표준 결합 분석법을 이용하여 검사할 수 있다.

숙주 세포에서 개선된 발현을 위해 유전자를 합성하는 경우, 그의 코돈 사용 빈도가 숙주 세포의 바람직한 코돈 사용 빈도에 근접하도록 유전자를 설계하는 것이 바람직하다. 숙주 세포에 의해 사용되는 코돈 사용 빈도로부터 합성 유전자에 바람직한 코돈 사용 빈도의 편차율은 먼저 숙주 세포의 코돈 사용 빈도로부터 단일 코돈 사용 빈도의 편차율을 측정한 후 모든 코돈에 대한 평균 편차를 구함으로써 산출된다.

특정 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 특정 숙주의 코돈 사용과 일치하도록 변화될 수 있다. 예를 들면, 락토바실러스의 코돈 사용 빈도를 이용하여 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하고 바람직한 락토바실러스 코돈을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 유도할 수 있다. 숙주 세포에 의해 나타난 바람직한 코돈 사용 빈도는 숙주 세포에 의해 발현된 많은 유전자에서 바람직한 코돈 사용 빈도를 평균냄으로써 산출될 수 있다. 상기 분석은 숙주 세포에 의해 고도로 발현되는 유전자로 한정되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 문헌 [Pouwels & Leunissen, Nucleic Acids Res. 22:929-936 (1994)]은 다양한 락토바실러스 종들에 의해 나타난 고도로 발현된 유전자들에 의한 코돈 사용 빈도를 제공한다. 코돈-사용표도 인터넷을 통해 이용가능하다.

또 다른 태양에서, 본 발명에 포함되는 벡터는 또한 마커 폴리펩티드를 암호화하는 이종 핵산 서열의 삽입을 포함한다. 마커 폴리펩티드는, 예를 들면, 녹색 형광 단백질(GFP), DS-레드(적색 형광 단백질), 분비된 알칼라인 포스파타제(SEAP), 베타-갈락토시다제, 루시퍼라제, 또는 당해 분야에 숙련된 자에게 공지되어 있는 많은 다른 리포터 단백질을 포함할 수 있다.

유용한 여기 및 발광 스펙트럼을 갖는 다양한 에쿼리아(Aequorea)-관련 GFP는 에쿼리아 빅토리아( Aequorea victoria)로부터의 천연 GFP의 아미노산 서열을 변형시켜 조작되었다(문헌 [Prasher et al., Gene, 111:229-233 (1992)]; 문헌 [Heim et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91:12501-12504 (1994)]; PCT/US95/14692 호).

한 태양에서, 살정자 화합물을 암호화하는 서열을 갖는 핵산의 이종 유기체내로의 전달은 발현을 야기한다.

발현 산물의 검출 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 한 태양에서, 노던 블롯(Nothern Blot), PCR, HPLC, 질량 분석, ELISA, RIA 또는 웨스턴 블롯 분석법을 포함할 수 있다(문헌 ["Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J.E., ed. (1994)]; 문헌 ["Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994)]; 문헌 [Stities et al.(eds)] 참조).

일부 태양에서, 항생물질 내성 카세트가 본원에 기술된 바와 같은 유기체내에 도입 구축물의 발현을 확인하기 위한 마커로서 도입될 수 있다. 일부 태양에서, 항생물질 민감성 카세트가 대상 내에 도입되는 구축물에 대한 안전성 프로토콜로서, 및 일부 태양에서, 피임 효과의 억제를 위해, 예를 들면, 생물 피임제를 박멸시키는 단기간의 항생물질 치료로서 섭취하는 대상에 의해, 안전한 수정 방법을 촉진하기 위해 유기체에 도입된다.

본 발명은, 일부 태양에서, 살정자 화합물을 발현하는 조작된 세포를 제공한다. 한 태양에서, 살정자 화합물은 정자 운동성, 정자-난자 융합 또는 난자의 정자 침투, 또는 그의 조합을 방지하기에 효과적인, 정자에 대한 항체 또는 그의 단편을 포함할 수 있다.

항체는, 예를 들면, 비손상(intact) 면역글로불린으로서 또는 많은 잘 특성화된 단편으로 존재한다. 일부 태양에서, scFv 단편은 조작된 유기체, 조성물, 키트의 일부로서 및 본 발명의 방법에 따라 사용하기 위해 포함된다. 일부 태양에서, 다른 포함된 단편들로는 F(ab')₂, Fab' 단량체가 포함된다. Fab' 단량체는 필수적으로 힌지 영역(문헌 [Paul (Ed.), Fundamental Immunology, Third Edition, Raven Press, NY (1993)]의 일부 및 나머지를 갖는 Fab이다. 다양한 항체 단편들이 비손상 항체의 분해의 관점에서 정의되지만, 당업자라면 상기 단편들이 화학적으로 또는 재조합 DNA 방법을 이용하여 새로 합성될 수 있음을 인지할 것이다. 따라서, 본원에서 사용된 바와 같은 용어 항체는 또한 전체 항체의 변형에 의해 생성된 항체 단편, 또는 재조합 DNA 방법을 이용하여 새로 합성된 단편(예를 들면, 단일쇄 Fv(scFc))을 포함한다.

포함되는 상기 세포의 제조 방법이 본원에 기술되어 있지만, 숙련된 전문가라면 임의의 살정자 화합물 또는 화합물들의 혼합물이 공생 유기체에서 재조합적으로 생성될 수 있음을 인지할 것이다.

일부 태양에서, 살정자성이거나 그렇지 않으면 다양한 동물 종에서 정자 운동성 또는 정자-난자 융합 능력 또는 정자에 의한 난자 침투를 억제하는 항체 단편이 사용된다. 예를 들면, 일부 태양에서, 항체 단편, 예를 들어, scFv는, 동물 종 및 인간에서 보존되는 고도로 보존된 정자 특이적 에피토프와 특이적으로 상호작용하므로, 생체내 효능 검사가 동물 모델에서 수행될 수 있으며, 동일한 항체 단편, 예를 들면, 인간 scFv 또는 그의 인간화 변이체의 확인이 인간 임상 실험에서 수행될 수 있다.

일부 태양에서, 상기 항체/항체 단편은 당해 분야에 숙련된 자에 의해 인지되는 바와 같이 본원에 예시된 바와 같이, 또는 문헌 [Xu et al., Arch Androl. 33(2):141-144 (1994, Sep-Oct)]; 문헌 [Clarke et al., Arch Androl. 35(1):21-27 (1995, Jul-Aug)]; WO0107083A1 호; 미국 특허 제 5,830,472 호, 제 5,753,231 호, 제 5,227,160 호에 기술된 바와 같이, 또는 임의의 적절한 방법에 의해 생성될 수 있다. 상기 화합물을 발현하도록 공생 유기체를 조작하는 것은 임의의 수단에 의해서, 및 예를 들면, 문헌 [PNAS 102:11993-11998 (2003)]에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다.

완전 인간 항체/항체 단편은 인간 여성에서의 피임에 적용하기에 특히 바람직하다. 인간 항체/항체 단편은 인간 면역글로불린 서열로부터 유도된 항체/항체 단편 라이브리러를 이용하는 본원에 기술된 파지 디스플레이 방법을 포함하여 당해 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다(하기에 제공된 실시예를 포함하여, 각각 본원에 그대로 참고로 인용된 미국 특허 제 4,444,887 호 및 제 4,710,111 호; 및 WO 98/46645 호; WO 99/50433 호; WO 98/24893 호; WO 98/16654 호; WO 96/34096 호; WO 96/33735 호; 및 WO 91/10741 호 참조).

본원에 인용된 임의의 참조는 본원에 그대로 참고로 인용되는 것으로 간주됨을 이해해야 한다.

인간 항체 또는 항체 단편, 예를 들면, scFv는 또한 작용성 내인성 면역글로불린을 발현할 수는 없지만, 인간 면역글로불린 유전자를 발현할 수 있는 유전자전이(transgenic) 마우스를 사용하여 생성될 수 있다. 인간 항체를 생성하기 위한 상기 기술의 개관에 대해서는 론버그(Lonberg) 및 허스자르(Huszar)의 문헌(1995)을 참조한다. 인간 항체 및 인간 단클론성 항체를 생성하기 위한 상기 기술 및 상기 항체 및 그의 단편을 생성하기 위한 프로토콜에 대한 상세한 논의에 대해서는, 예를 들면, 본원에 그대로 참고로 인용된 WO 98/24893 호; WO 92/01047 호; WO 96/34096 호; WO 96/33735 호; EP 0598877 호; 미국 특허 제 5,413,923 호; 제 5,625,126 호; 제 5,633,425 호; 제 5,569,825 호; 제 5,661,016 호; 제 5,545,806 호; 제 5,814,318 호; 제 5,885,793 호; 제 5,916,771 호 및 제 5,939,598 호를 참조한다. 또한, 앱제닉스 인코포레이티드(Abgenix, Inc.)(캘리포니아 프리몬트), 키린 인코포레이티드(Kirin, Inc.)(일본), 메다렉스(Medarex)(뉴저지) 및 젠팜(Genpharm)(캘리포니아 산호세)과 같은 회사들이 전술한 바와 유사한 기술을 이용하여 선택된 항원에 대해 유도된 인간 항체를 제공하는데 관련될 수 있다.

본 발명의 항체는 또한 실질적으로 면역 반응을 유도하지 않는 항체 단편을 생성하기 위해 데이비스(Davis) 등의 미국 특허 제 4,179,337 호에 기술된 방법 및 커플링제에 의해 변형될 수 있다.

일부 태양에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 조작된 세균을 포함하는 조성물을 제공한다.

일부 태양에서, 상기 조성물은 본원에 기술된 바와 같은 조작된 세균을 포함할 수 있으며, 이때 상기 조성물은 상이한 이종 살정자제를 발현하고 여전히 투여된 단위 용량의 일부로서 동일 조성물내에 함유되는 세균을 포함한다. 일부 태양에서, 상이한 이종 살정자제를 발현하는 상기 세균은 특정 항원 또는 에피토프에 대한 특이성의 견지에서 다양할 수 있거나, 또는 단편이 결합하는 항원 또는 에피토프의 견지에서 다양할 수 있거나, 또는 에피토프에 대한 결합활성의 견지에서 다양할 수 있거나, 또는 그로부터 유도되는 이소타입(isotype)의 견지에서 다양할 수 있거나, 또는 이들의 조합에서 다양할 수 있다.

일부 태양에서, 상기 조성물은 또한 같거나 다른 이종 살정자제를 발현하는 상이한 세균 균주를 포함할 수 있으며, 이들은 투여된 단위 용량의 일부로서 동일 조성물내에 또한 함유된다.

일부 태양에서, 조성물은 질내 좌약, 액체, 스프레이, 발포제, 크림, 무스, 또는 질내 전달을 위한 임의의 적절한 비히클의 형태이다.

일부 태양에서, 조작된 세균 또는 이를 포함하는 조성물은 질내 고리 내에 적용되거나 삽입된 후, 여성 대상에게 투여된다. 일부 태양에서, 본 발명은 콘돔의 외부 표면에 적용되고 콘돔 착용자가 조작된 세균을 성관계시에 그의 여성 상대에게 전달할 수 있도록 보존된 조작된 세균 또는 상기 세균을 포함하는 조성물을 함유하는 콘돔을 포함한다.

일부 태양에서, 용어 "포함하다" 또는 그의 문법적 형태는 지시된 활성 약제, 예를 들면, 본 발명의 조작된 공생체 또는 본원에 기술된 바와 같은 파지의 포함, 및 약학 산업에서 공지된 바와 같은 다른 활성 약제 및 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 연화제, 안정화제 등의 포함을 말한다. 일부 태양에서, 용어 "필수적으로 이루어지는"은 유일한 활성 성분이 지시된 활성 성분, 즉 본원에 기술된 바와 같은 조작된 공생 유기체이지만, 제형을 안정시키거나, 보존시키거나 하지만 피임 효과에는 직접 포함되지 않는 다른 약제/성분/화합물이 포함될 수 있는 조성물을 말한다. 일부 태양에서, 용어 "필수적으로 이루어지는"은 피임 효능을 증대시키거나 피임 효능을 연장시키거나 또는 둘 다인 조작된 공생 유기체의 메카니즘과 완전히 다른 메카니즘에 의해 피임 효과를 발휘하는 성분들을 말할 수 있다. 일부 태양에서, 용어 "필수적으로 이루어지는"은 예를 들면, 좌약 제형 또는 다른 제형으로부터 조작 공생 유기체의 방출을 증대시킴으로써 조작 공생 유기체의 방출을 조장하고, 효과적인 콜로니화를 촉진하고, 균일한 콜로니화를 촉진하지만, 조작 공생 유기체의 활성을 조장하는 다른 바람직한 효과는 조작 공생 유기체의 성분이 아닌 성분을 말할 수 있다. 일부 태양에서, 상기 약제들은 암호화된 살정자제의 발현을 유도하거나, 일부 태양에서 암호화된 살정자제의 발현을 증대시키는 약제를 포함할 수 있다. 일부 태양에서, 용어 "이루어지는"은 활성 성분 및 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 함유하는 조성물을 말한다.

목적하는 점막 표면으로의 조작 세균의 전달은 부위의 접근성 및 국소적 조건에 따라 달라진다. 예를 들면, 조작된 세균은 질 점막상으로의 전달을 위해 식염수 용액, 크림, 좌약 또는 발포제 형태로 존재할 수 있다. 발포제는, 예를 들면, 하나 이상의 소수성으로 개질된 폴리사카라이드, 예를 들어, 셀룰로스 및 키토산을 포함할 수 있다. 셀룰로스는, 예를 들면, 하이드록시에틸 셀룰로스, 하이드록시프로필 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필메틸 셀룰로스, 하이드록시에틸 메틸 셀룰로스 등을 포함한다. 키토산은, 예를 들면, 다음의 키토산 염: 키토산 락테이트, 키토산 살리실레이트, 키토산 피롤리돈 카복실레이트, 키토산 이타코네이트, 키토산 니아시네이트, 키토산 포메이트, 키토산 아세테이트, 키토산 갈레이트, 키토산 글루타메이트, 키토산 말리에이트, 키토산 아스파테이트, 키토산 글리콜레이트 및 4급 아민 치환된 키토산 및 그의 염 등을 포함한다. 발포제는 또한 물, 에틸 알콜, 이소프로필 알콜, 글리세린, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 솔비톨과 같은 다른 성분들을 포함할 수 있다. 살정제가 세균 조성물에 선택적으로 포함된다. 발포제 및 발포제 전달 비히클의 또 다른 예는, 예를 들면, 미국 특허 제 5,595,980 호 및 제 4,922,928 호에 기술되어 있다.

일부 태양에서, 세균은 좌약 또는 페서리(pessary)로서 전달될 수 있다(예를 들면, 미국 특허 제 4,322,399 호 참조). 일부 태양에서, 본 발명의 세균은 미국 특허 제 6,468,526 호에 기술된 바와 같은 보존 매트릭스로 제조되고, 용해 성질을 위해 선택된 용해가능한 중합체 물질 및/또는 복합 탄수화물 물질로 이루어진 용해가능한 요소로 전달되어, 상기 요소는 사용전에는 실질적으로 고체 형태로 유지되고 사용시 인체 체온 및 습기로 인해 용해되어 목적하는 시간조절 방출 및 투여량으로 약제 물질을 방출하도록 한다(예를 들면, 미국 특허 제 5,529,782 호). 세균은 또한 미국 특허 제 4,693,705 호에 기술된 바와 같은 스펀지 전달 비히클로 전달될 수 있다.

일부 태양에서, 점막 표면에 조작 세균의 적용은 규칙적 기준으로 반복되어야 할 것이며; 최적 투여 간격은 통상적으로 결정되지만, 상이한 점막 환경 및 세균 균주에 따라 달라질 것이다. 일부 태양에서, 투여 간격은 1일 1회 내지 2-4 주에 1회 또는 그 이상으로 달라질 수 있다. 일부 태양에서, 투여는 여성의 생리 주기에 따를 것이므로, 상기 투여는 치료되는 여성에서 배란전에 콜로니화를 최적화하기 위해 월경의 중지기 또는 대략적인 중지기를 따를 것이다.

일부 태양에서, 박테리오파지가 천연 락토바실러스를 형질전환시키기 위해 도입되는 경우, 이종 유전자가 박테리오파지 외피 단백질을 암호화하는 유전자를 대체하여 박테리오파지 복제-결핍성이 되도록, 선택된 박테리오파지의 핵산을 조작할 수 있다. 상기 재조합 DNA 분자를 기능성 박테리오파지 단백질을 함유하는 세포 용해물내에 첨가하는 것은 이종 유전자를 갖는 기능성 박테리오파지 입자의 구성을 유도한다. 이들 복제-결핍 박테리오파지 입자는 이어서 선택된 식물 세균을 감염시키기 위해 목적하는 점막 표면상에 도입될 수 있다. 전형적인 투여량은 점막 표면에 적용된 10⁸ 내지 10¹² PFU/ml이다. 용액 대 처리된 표면의 비율은 점막 표면의 제곱 센티미터당 0.1 내지 10 ml에 근접해야 한다. 상기 비히클은 세균에 대해 전술한 비히클과 유사하다.

일부 태양에서, 본 발명은 여성 생식기 세포를 본원에 기술된 바와 같은 조작 세균과 접촉시키는 단계를 포함하는 피임 방법을 제공한다. 일부 태양에서, 상기 측면에 따르면, 상기 방법은 일부 태양에서 본원에 기술된 바와 같은 조성물을 포함하여, 조작 세균을 포함하는 조성물을 그를 필요로 하는 여성 대상의 생식기에 투여하는 것을 포함한다. 일부 태양에서, 본 발명은 또한 여성 생식기를 본원에 기술된 바와 같은 박테리오파지와 접촉시키고, 이어서 본원에 기술된 바와 같은 조작 세균을 수득하기 위해 동일반응계내에서 공생 식물군의 조작을 유도하는 것을 제공한다.

일부 태양에서, 용어 "접촉시키는" 또는 "투여하는"은 나타낸 물질에 대한 직접 및 간접 노출 둘 다를 말한다.

일부 태양에서, 여성 생식기에 투여되는 투여량은 10⁵ 내지 10⁹ 재조합 세균의 범위일 수 있다. 일부 태양에서, 투여량은 특정 숙주 또는 개체군에 대해 최적화된다. 일부 태양에서, 상기 최적 투여량은 10⁷ 내지 10⁹ 재조합 세균, 또는 10⁶ 내지 10⁸ 재조합 세균, 또는 10⁸ 내지 10⁹ 재조합 세균의 범위일 수 있다.

효과적인 피임을 입증하는 다양한 방법이 당해 분야에 공지되어 있으며, 이들 모두는 본 발명에 유용한 것으로 간주되며, 그 일부는 본원에 예시된다.

한 태양에서, 본 발명의 생물 피임제의 피임 효과는 본 발명의 피임제가 투여되는 암컷 동물에 의한 번식 주기 당 출산되는 새끼의 수를 평가함으로써 측정된다. 예를 들면, 생물 피임제를, 예를 들어, 마우스에 투여하고 1 내지 3 일후에, 개개의 암컷 마우스를 수컷 마우스와 함께 우리에 둔다. 이어서, 수컷 마우스를 짝짓기 1 내지 7 일후에 꺼낸다. 그 다음, 암컷 마우스를 새끼 출생에 대해 매일 관찰한다. 투여된 피임제의 피임 효과는 투여후 임신의 감소 및/또는 산자수(litter size)의 감소에 의해 측정된다. 예를 들면, 평균 3 마리 이상의 한배 새끼를 출산하는 동물 종의 경우(예를 들면, 하기에서 예시되는 바와 같이, 마우스에서 평균 산자수는 이계교배(outbred) 균주를 사용한 경우 11 마리 이상의 새끼이다), 피임제 단백질은 10 내지 100%, 30 내지 100%, 또는 50 내지 100%, 또는 60 내지 100%, 70 내지 100%, 또는 80 내지 100%, 또는 90 내지 100%, 또는 95 내지 100% 이상만큼 임신율 또는 산자수에 감소가 있는 경우 효과적인 것으로 간주될 수 있다. 본원에 예시된 바와 같이, J102 발현 락토바실러스 젠시니 균주의 피임 효능을 평가하는 경우, 50% 이상의 피임 효능이 관찰되었으며, 또한, 여기서 수행된 콜로니화 연구가 약 50%의 마우스가 락토바실러스로 잘 콜로니화되었음을 나타내었으므로, 락토바실러스 콜로니화에 보다 수용적인 것으로 알려진 다른 동물들이 더 높은 피임 효과를 가질 것으로 예상된다.

피임제는 산자수에 50% 이상의 감소가 나타나는 경우 효과적인 것으로 간주되므로, 도 7은 살정자제를 발현하는 조작된 공생체를 포함하는 효과적인 생물학적 여성 피임제의 생성을 입증한다.

일부 태양에서, 본 발명의 피임제의 효과는 점막 분비물중 발현된 항체의 수준을 측정함으로써 결정될 수 있다. 피임제의 효과는 또한, 예를 들면, 성관계후 수거된 분비물중, 면역조직화학적 기술에 의해 정자에 결합된 항체를 가시화시킴으로써 평가될 수 있다.

본원에 예시된 바와 같이, 마우스를 항-정자 scFv를 발현하는 락토바실러스 젠세니로 콜로니화시키는 경우, 임신율에 50 내지 58%의 감소가 나타났으며, 우리당 및 따라서 마우스당 출산된 새끼의 수의 동시 감소가 또한 명백하였다.

한 태양에서, 살정자제를 발현하는 공생 유기체는 성인성 질환-유발 유기체로 처리된 여성의 감염에 대해 효과적인 약제를 발현하도록 더 조작될 수 있다. 한 태양에서, 성인성 질환-유발 유기체는 숙련된 전문가에 의해 인지되듯이 클라미디아(Chlamydia), HIV, HPV 등이다.

한 태양에서, 성인성 질환-유발 유기체로 처리된 여성의 감염에 대해 효과적인 상기 약제는 유기체에 의한 감염을 방해할 수 있거나, 또는 또 다른 태양에서, 상기 약제는 감염의 발생률 또는 부담을 감소시킬 수 있다. 일부 태양에서, 상기 약제는 유기체에 의한 감염의 발병을 방해할 수 있다. 성인성 질환-유발 유기체로 처리된 여성의 감염에 대해 효과적인 임의 약제의 추가의 혼입도 이와 관련하여 고려되고 본 발명의 일부로 간주된다는 것을 이해해야 한다.

상기 측면에 따라서, 일부 태양에서, 본 발명의 피임제는 병용 피임제-항-STD 치료법으로 여길 수 있다.

본 발명의 조작된 공생체는, 예를 들면, 항-클라미디아 scFv 또는 항-HPV 또는 항-HIV scFv, 또는 다른 항-HIV 약제, 예를 들면, 시아노버린(cyanovirin)을 발현하도록 더 조작될 수 있는 것으로 생각되지만, 여성 생식기의 야생형 락토바실러스 콜로니화의 존재는 STD 감염에 대해 보호적임을 이해해야 한다. 살정자제를 발현하는 본 발명의 조작된 유기체는 야생형 락토바실러스 단독보다 본원에 기술된 바와 같은 상기 유기체를 사용하는 여성 개체군에서 성인성 질환의 발생률을 감소시키는데 효과적이거나, 또는 일부 태양에서는 더 효과적인 것으로 또한 생각된다.

본 발명의 임의의 또는 모든 방법에 적용가능한 바와 같은 본원에 기술된 임의의 태양은 본 발명의 일부로 간주되어야 함을 이해해야 한다. 본 명세서에 인용된 모든 출판물 및 특허 출원은 각각의 개별 출판물 또는 특허 출원이 참고로 인용되는 것으로 특별히 및 개별적으로 나타낸 바와 같이 본원에 참고로 인용된다.

당해 분야에 숙련된 자에 의해 첨부된 특허청구범위에 나타낸 바와 같은 본 발명의 진의 및 범위로부터 벗어나지 않고 그 안의 형태 및 세부사항에 다양한 변화가 이루어질 수 있음이 이해될 것이다. 당해 분야에 숙련된 자라면 단지 통상적인 실험을 이용하여 본원에 기술된 본 발명의 특정 태양들에 많은 등가물을 인지하거나 확인할 수 있을 것이다. 상기 등가물은 특허청구범위의 범주에 포함되는 것이다.

본원에서 단수형 언급은 반대로 나타내지 않는 한 또는 문맥으로부터 달리 명백하지 않는 한 하나 이상의 것을 의미한다. 군의 구성원 사이에 "또는"이나 "및/또는"을 포함하는 특허청구범위 또는 설명은 반대로 나타내지 않는 한 또는 달리 문맥으로부터 명백하지 않는 한 하나 이상, 또는 모든 군 구성원이 해당 생성물 또는 공정에 존재하거나, 사용되거나, 또는 그렇지 않으면 관련되는 경우 만족되는 것으로 간주된다. 본 발명은 군의 정확히 하나의 구성원이 해당 생성물 또는 공정에 존재하거나, 사용되거나, 또는 그렇지 않으면 관련되는 태양을 포함한다. 본 발명은 또한 하나보다 많거나 또는 모든 군 구성원들이 해당 생성물 또는 공정에 존재하거나, 사용되거나 또는 그렇지 않으면 관련되는 태양들을 포함한다. 또한, 본 발명은 다양한 태양으로, 달리 언급되지 않는 한 또는 모순 또는 불일치가 유발되는 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자에게 명백하지 않는 한, 열거된 청구항들 중 하나 이상으로부터 하나 이상의 제한, 요소, 조항, 서술 용어 등이 동일 기준 청구항에 종속되는 또 다른 청구항중에 도입되는 모든 변형, 조합 및 변경을 제공함을 이해해야 한다. 요소들이 목록으로, 예를 들면, 마커시(Markush) 군 포맷 등으로 존재하는 경우, 요소들의 각각의 하위군도 개시되며, 임의의 요소가 군으로부터 제거될 수 있음을 주지해야 한다. 일반적으로, 본 발명 또는 본 발명의 태양들이 특정 요소, 특징 등을 포함하는 것으로 언급되는 경우, 본 발명의 특정 태양 또는 본 발명의 양태들은 상기 요소, 특징 등으로 이루어지거나, 또는 필수적으로 이루어짐을 이해해야 한다. 간단하게, 상기 태양들은 본원에서 모든 경우에 특별히 나타내지 않았다. 특정 청구항은 편의를 위해 종속 형태로 나타내지만, 출원인은 임의의 종속 청구항을, 독립 청구항 및 상기 청구항이 종속되는 임의의 다른 청구항의 요소 또는 제한을 포함하도록 독립 포맷으로 재작성할 권리를 보유하며, 상기 재작성된 청구항은 독립 포맷으로 재작성되기에 앞서 상기 청구항이 취한 어떤 형태이든(개정되거나 비개정된) 종속 청구항에 대해 모든 점에서 동등한 것으로 간주된다.

다음은 본 발명을 실행/실시하는 수단으로서 예시의 목적으로 재료, 방법 및 예를 제공하기 위한 것이며, 제한하기 위한 것이 아니다.

실시예

일반적으로, 본원에 사용된 명명법 및 본 발명에 사용된 실험실 절차는 분자, 생화학, 미생물 및 재조합 DNA 기술을 포함한다. 상기 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들면, 문헌 ["Molecular Cloning: A laboratory Manual", Sambrook et al., (1989)]; 문헌 ["Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R.M., ed. (1994)]; 문헌 [Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989)]; 문헌 [Perval, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988)]; 문헌 [Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York]; 문헌 [Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)]; 미국 특허 제 4,666,838 호; 제 4,683,202 호; 제 4,801,531 호; 제 5,192,659 호 및 제 5,272,057 호에 나타낸 바와 같은 방법; 문헌 ["Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J.E., ed. (1994)]; 문헌 ["Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J.E., ed. (1994)]; 문헌 [Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994)]; 문헌 [Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W.H. Freeman and Co., New York (1980)] 참조하고; 이용가능한 면역분석법은 특히 및 과학 문헌에 광범위하게 기술되어 있고(예를 들면, 미국 특허 제 3,791,932 호; 제 3,839,153 호; 제 3,850,752 호; 제 3,850,578 호; 제 3,853,987 호; 제 3,867,517 호; 제 3,879,262 호; 제 3,901,654 호; 제 3,935,074 호; 제 3,984,533 호; 제 3,996,345 호; 제4,034,074 호; 제 4,098,876 호; 제 4,879,219 호; 제 5,011,771 호 및 제5,281,521 호; 문헌 ["Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984)]; 문헌 ["Nucleic Acid Hybridization" Hames, B.D., and Higgins S.J., eds. (1985)]; 문헌 ["Transcription and Translation" Hames, B.D., and Higgins S.J., Eds. (1984)]; 문헌 ["Animal Cell Culture" Freshney, R.I., ed. (1986)]; 문헌 ["Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press (1986)]; 문헌 ["A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984)]; 및 문헌 ["Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press]; 문헌 ["PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990)]; 문헌 [Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Couse Manual" CSHL Press (1996)] 참조), 이들은 모두 본원에 완전히 나타낸 바와 같이 참고로 인용된다. 다른 일반 참조도 본 명세서 전체에 걸쳐 제공된다. 그 안의 절차들은 당해 분야에 공지되어 있는 것으로 여겨지며 독자의 편의를 위해 제공된다. 그 안에 포함된 모든 정보는 본원에 참고로 인용된다.

실시예 1

항-인간 정자 항체의 제조

P3-X63-Ag8-653 마우스 골수종 세포를 터지톨(Tergitol) NP-40 세제-가용화된 인간 부고환 정자로 면역화된 Balb/c 마우스로부터의 림프구와 융합시켜 인간 정자 항원에 대한 단클론성 항체를 제조하였다. 상기 하이브리도마를 주사한 마우스로부터 얻은 복수액을 메탄올 고정된 정자상에서 양성인 첨체 및 비고정 정자상에서 양성인 원형질막에 대해 간접 면역형광법으로 검사하였다. 뮤린 및 토끼 정자와의 항체 교차-반응성을 확인하였다.

수정 항원, FA-1을 기술된 바와 같이(문헌 [Naz, R.K. et al., Proc Natl Acad Sci USA. 83(15):5713-5717 (1986)]), 단클론성 항체 MA-24를 사용한 면역친화성 크로마토그래피에 의해 데옥시콜레이트- 또는 리튬 다이요오도살리실레이트-가용화된 뮤린 고환으로부터 정제하였다. FA-1에 대한 또 다른 단클론성 항체를 상기와 같이 제조하고, 인간 및 토끼 정자와의 교차-반응성을 또한 확인하였다.

실시예 2

항-인간 정자 항체의 클로닝

RNA 제조

살정자성이거나 감소된 정자세포 운동성을 갖는 항체를 분비하는 하이브리도마 세포를 선택하였다. 상기 세포를 성장시키고, 패스트트랙(FastTrack) 2.0 키트(인비트로겐(Invitrogen))를 사용하여 RNA 회수를 위해 1,000만개의 세포를 처리하였다. 전체 RNA를 세제 용해 및 단백질 분해 완충액을 사용하여 세포로부터 직접 분리하였다. 이어서, 폴리(A)+RNA를 mRNA가 올리고 dT 수지에 결합된 변형된 아비브(Aviv) 및 레더(Leder) 프로토콜을 사용하여 분리하였다. 그 다음, 상기 수지를 저염 완충액으로 세척하여 외래 총 RNA를 제거하고, 폴리(A)+RNA를 수지로부터 용출시켰다. 260 nm 및 280 nm에서의 분광 분석은 폴리(A)+RNA의 최종 농도를 나타내었다.

폴리 (A)+ RNA 의 역전사 및 증폭

항체의 에피토프-인지 영역 또는 상보성 결정 영역(CDR)을 확인하고, Ig 중쇄 및 경쇄(카파) 서브유니트를 프로브하는 올리고뉴클레오티드를 설계하였다.

중쇄 올리고를 Ig-프라임(Prime) 키트(노바겐(Novagen))로부터 수득하고, dH₂O로 1.0 ㎍/㎕의 최종 농도로 희석하였다.

각각의 하이브리도마 폴리(A)+RNA의 역전사 및 폴리머라제 연쇄 반응 증폭을 프로메가(Promega)의 억세스(Access) RT-PCR 시스템을 사용하여 단일 반응으로 수행하였다. 간략하게, 5 ㎍의 하이브리도마 폴리(A)+RNA, 1 ㎍의 각각의 적절한 프라이머(중쇄에 대한 프라이머 1 및 2, 경쇄에 대한 프라이머 3 및 4), 1 ㎕의 10 mM dNTP 혼합물, 10 ㎕의 5xAMV 역전사 완충액, 2 ㎕의 25 mM MgSO₄, 1 ㎕의 AMV 역전사효소, 1 ㎕의 Tfl 폴리머라제 및 30 ㎕의 뉴클레아제-비함유 dH₂O를 0.5 ml의 미세원심분리(microfuge) 관에서 혼합하였다. PCR 반응은 표준 프로토콜에 따라 수행하였으며, 주기 온도 및 시간을 최적화하였다. 증폭된 생성물을 아가로스 겔 상에서 분석하고 겔 정제하였다.

항체 클로닝 및 서열분석

겔 정제된 생성물을 고수율의 생성물을 생성하는 적절한 벡터내에 서브클로닝하였다. 벡터, 완충액, cDNA 및 T4 DNA 리가제를 실온에서 1 시간동안 배양한 후 65 ℃에서 10 분간 가열하였다. 슈퍼컴피턴트(supercompetent) 이. 콜라이(E. coli) 세포를 사용하였으며, DNA를 세포에 첨가하고 얼음위에서 배양한 다음, 42 ℃에서 가열하고 SOC 배지를 첨가하였다. 이어서, 세포를 37 ℃ 진탕 수조에서 1 시간동안 배양하였다. 그런 다음, 이들 세포를 LB 함유 선별 화합물 페트리 접시상에 도말하고 37 ℃에서 밤새 배양하였다. 양성 콜로니를 선택하고 플라스미드 정제를 위해 성장시켰다.

플라스미드를 키아겐-팁(Qiagen-tip) 20 컬럼을 사용하여 제조사의 지시에 따라 정제하였다.

정제된 플라스미드 중 cDNA 삽입물의 존재를 확인하기 위해, 각각의 클론을 적절한 제한 효소로 절단하고, 절단된 생성물을 아가로스 겔 상에서 전기영동하였다. 삽입물을 함유하는 클론을 서열분석하였다.

중쇄 및 경쇄 클론의 서열 분석

피델리티(Fidelity) 키트(온코(Oncor))를 사용하여 제조사의 지시에 따라 양성 클론을 서열분석하였다. 서열분석 반응물은 플라스미드 DNA, 프라이머(예를 들면, pCR-스크립트 벡터 상의 5' 클로닝 부위의 상류에 존재하는 T3 프라이머), 및 dH₂O로 이루어졌으며, 이들을 5 분동안 95 ℃로 가열하고, 어닐링 완충액을 첨가하고, 반응물을 37 ℃에서 15 분간 배양하였다. 반응물을 부가 반응 완충액, ³³PαATP, T4 DNA 폴리머라제 및 dH₂O로 표지하고, 400 ℃에서 15 분간 배양한 후, A, C, G 또는 T 말단화 혼합물을 첨가하고, 40 ℃에서 5 분간 배양하였다. 프로테이나제 K 용액을 가하여 반응을 중단시키고 95 ℃로 가열한 후 아크릴아미드 서열분석 겔 상에 부하시켰다. 이어서, 겔을 2000 볼트에서 2 시간동안 전기영동시키고, 진공하에 와트만(Whatman) 3 MM 여과지 상에서 건조시키고, 실온에서 x-선 필름에 밤새 노출시켰다. 필름을 현상한 후에 겔을 라이트박스 상에서 판독하였다.

서열분석은 또한 자동 DNA 서열분석기(예를 들면, ABI 프리즘 377)를 사용하여 수행할 수 있다. 각각의 클론에 대해, cDNA 및 프라이머를 4개의 염료-표지된 다이데옥시 뉴클레오티드 및 앰플리택(AmpliTaq) 폴리머라제 FS와 혼합하였다. 전체 반응물을 전기영동을 위해 36 cm의 판독하기 좋은 5.0% 아크릴아미드 겔 상에서 단일 레인에 부하시켰다. 전기영동한 개개 단편들의 실시간 검출은 CCD 카메라 영상 제작하에 레이저 스캐닝을 사용하여 달성하였다.

발현 벡터의 제작

문헌 [McCracken A., et al. Arch. Microbial. 173:383-389 (2000)]; 문헌 [Perez-Casal, J., et al. Mol. Microbiol. 8:809-819 (2003)]; 문헌 [Kruger C. et al. Nature Biotechnology 20:702-706 (2002)]; 문헌 [Rao, S. et al., PNAS 102:11993-11998 (2005)]; 문헌 [Liu X. et al. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 50:3250-3259 (2006)]; 문헌 [del Rio B. et al. Clinical and Vaccine Immunology 15:1429-1435 (2008)]; 미국 특허 제 7,312,076 호 또는 유럽 특허 제 1 011 721 B1 호에 기술된 바와 같은 발현 벡터를 수득하거나 또는 당해 분야에 공지된 방법에 의해 그의 변이체를 제조하였다.

또는, 벡터는 다음과 같이 제작된다:

pBluescript로부터 이. 콜라이 복제 기점을 주쇄 벡터내에 서브클로닝하고(문헌 [Fons, M., et al. Plasmid 37, 199-203 (1997)]), 이어서 전장(full-length) M6 암호화 영역(PstI)을 제거함으로써 셔틀 벡터를 제조하였다. 상기 플라스미드를 SmaI로 절단하고, NdeI으로 부분 절단하고, DNA 폴리머라제 I으로 채우고(클레나우(Klenow) 단편), 자가-접합시켰다. 생성된 플라스미드는 락토바실러스-적합성 복제 기점(repA) 및 양성 선택성 마커, 예를 들면, 항생물질 내성 유전자를 함유하며, 다양한 락토바실러스 종에서 이종 단백질의 발현을 위해 사용하였다.

증폭된 항체 단편의 벡터내로의 클로닝

중쇄 및 경쇄에 상응하는 증폭된 생성물을 겔 정제하고 dH₂O에 재현탁시켰다. 항체는 어셈블리(assembly) PCR(문헌 [Stemmer W.P. et al., Gene 164:49-53 (1995)])에 의해 재암호화하여 최적 락토바실러스 코돈 사용빈도에 보다 가깝게 확인할 수 있다.

발현 카세트를 PCR 증폭에 의해 제작하고 벡터의 적절한 부위에 서브클로닝하였다. 상기 카세트는 락토바실러스-적합성 프로모터 요소, 항체 단편, 분비 신호 서열 또는 세포벽 고정 영역을 포함하여 4개의 성분을 함유하였다. 고유의 제한효소 부위를 5' 말단으로부터 3' 말단까지 각 성분 사이에 각각 배치하였다. PCR에 의한 각 성분의 증폭은 Pfu DNA 폴리머라제를 사용하여 수행하였다. 락토코커스 락티스(문헌 [van der Vossen, J.M. et al. Appl. Environ. Micorbiol. 53, 2452-2457 (1987)])로부터의 P23 프로모터는 5'-GTGGAGCTCCCCGAAAAGCCCTGACAACCC-3' 및 5'-GGAAACACGCTAGCACTAACTTCATT-3' 프라이머를 사용하여 증폭시켜 제조하였다. 항체의 분비를 유도하기 위해, 고유의 부위들을 5' 및 3' 말단에 각각 부가한 상태로 추정상의 리보솜 결합 부위로부터 신호 펩티다제 분리 부위까지 락토바실러 스 크리스파투스의 S-층 유전자(cbsA) 서열을 증폭시키기 위해 프라이머를 설계하였다. 이어서, MKKNLRIVSAAAAALLAVAPVAA에 상응하는 증폭된 S-층 신호 뉴클레오티드 서열(CbsAss)을 절단하고 발현 카세트에 클로닝하기 위해 사용하였다.

생성물을 벡터에 접합시키고, 분비를 확실히 하기 위해 TAA 중지 코돈을 N-말단 고정 모티프에 삽입시켰다. 서열 확인을 수행한 후 락토바실러스 균주내에 형질전환시켰다.

락토바실러스 형질전환

세균 균주 및 배양. 락토바실러스 크리스파투스 , 락토바실러스 가세리( gasseri) 및 락토바실러스 젠세니 등의 천연 인간 질 분리균을 건강한 지원자의 질 면봉 시료로부터 수득할 수 있거나, 또는 대안적으로 상업적으로 시판하는 균주를 사용할 수 있으며, 디 맨, 로고사 및 샤페(de Man, Rogosa and Sharpe)(MRS) 액체배지 또는 로고사 SL 액체배지(딥코(Difco)) 중에서 37 ℃(5% CO₂/95% 공기)에서 배양할 수 있다. 단백질 발현 분석을 위해, 배지 199(인비트로겐)도 사용된다. 플라스미드를 전기천공에 의해 에스케리키아 콜라이 DH12S(인비트로겐) 내에 도입하였다. 플라스미드 유지를 위해, 형질전환된 이. 콜라이 DH12S를 37 ℃에서, 에리트로마이신(300 ㎍/ml)으로 보충된 LB 액체배지(딥코)에서 성장시켰다. 플라스미드를 필수적으로 락토바실러스 가세리에 대해 기술된 바와 같이 락토바실러스 젠세니 내에 전기천공에 의해 형질전환시켰다(문헌 [Luchansky, J.B., Tennant, M.C. & Klaenhammer, T.R., J. Dairy Sci. 74, 3293-3302 (1991)]). 형질전환된 락토바실러스 젠세니 세균을 20 ㎍/ml의 에리트로마이신을 함유하는 액체 배지에서 통상적으로 증식시켰다.

조작된 락토바실러스를 하기에 기술하는 바와 같이 항-정자 활성에 대해 프로브하였다.

실시예 3

일련의 항-정자 scFv 의 제조

라이브러리 제작

정자 단백질에 대한 인간 VH-VL 연결 가변 영역을 단리하기 위해 인간 scFv 섬유상 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하였다. 인간 scFv 라이브러리는 V 염기에서 수득된 서열에 따라 설계된 프라이머(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk)를 사용하여, 바바스 앤 러너(Barbas & Lerner)에 의해(문헌 [Barbas, Bain et al. Proc Natl Acad Sci USA 89(10):4457-4461 (1992)]; 문헌 [Gram, Marconi et al. Proc Natl Acad Sci USA 89(8):3576-3580 (1992)]; 문헌 [Zebedee, Barbas et al. Proc Natl Acad Sci USA 89(8):3175-3179 (1992)]; 문헌 [Barbas, Amberg et al. Gene 137(1):57-62 (1993)]), 윈터(Winter)에 의해(문헌 [Hawkins, Russell et al. J Mol Biol 226(3):889-896 (1992)]; 문헌 [Hawkins and Winter, Eur J Immunol 22(3):867-870 (1992)]; 문헌 [Hoogenboom, Marks et al. Immunol Rev 130:41-68 (1992)]; 문헌 [Hoogenboom and Winter, Immunol Rev 130:41-68 (1992)]; 문헌 [Marks, Griffiths et al. Biotechnology (NY) 10(7):779-783 (1992)]; 문헌 [Marks, Hoogenboom et al. J Biol Chem 267(23):16007-16010 (1992)]; 문헌 [Marks and Winter, Behring Inst Mitt (91):6-12 (1992)]; 문헌 [Orlandi, Gussow et al. Biotechnology 24:527-531 (1992)]; 문헌 [Tomlinson, Walter et al. J Mol Biol 227(3):776-798(1992)]), 및 벤하르(Benhar) 연구실에 의해(문헌 [Azriel-Rosenfeld, Valensi et al. J Mol Biol 335(1):177-192 (2004)]) 이미 설명된 기술에 따라 설계하였다. PCR에 의한 항체 유전자의 증폭은 주형으로서 인간 비장 및 말초혈 림프구 cDNA를 사용하여 수행하였다. 상기 라이브러리에서, 인간 중쇄 및 경쇄 영역의 레퍼토리는 조합 방식으로 서로 연결되어, m13 섬유상 파지의 p3 유전자에 융합되는 VH-VL 인공 결합 분자의 모든 가능한 조합을 제공하며, 융합 단백질은 이어서 평균적으로 파지 당 전형적으로 단일 복사체에서 파지 표면상에 디스플레이된다.

정자 항원

정자 항원 FA-1 및 YLP(12) 각각으로부터 펩티드를 설계하였다. 하기의 펩티드 (1)은 항원 FA-1으로부터 설계된 35개 잔기 펩티드이고, 하기의 펩티드 (2)는 YLP(12) 펩티드이다. 하기에 개략된 프로토콜에 대해 마그네틱 비드에 결합하기에 용이하도록 펩티드를 비오티닐화하였다. 펩티드 (2)는 펩티드 서열이 비교적 짧기 때문에 비오틴과 펩티드 사이에 연결부의 부가를 갖는다. 파지 디스플레이 scFv 라이브러리를 하기에 개략한 바와 같은 펩티드 둘 다에 대해 스크리닝하였다.

항체 스크리닝

라이브러리 저장액을 37 ℃에서 LB + Amp(100 ㎍/ml) + 1% 글루코스 중에서 성장시켰다. 헬퍼 파지 M13K07을 첨가하고, 배양물을 100 ㎍/ml Amp + 30 ㎍/ml kan의 존재하에 30 ℃에서 밤새 헬퍼 파지와 함께 배양하였다. 배양물을 4000 rpm에서 10 분간 회전시키고, 0.45 ㎛ 필터 및 1/5 부피 PEG/NaCl을 통해 여과된 상등액을 첨가하고, 여액을 최소 1 시간동안 얼음위에 둔 후, 4000 rpm에서 30 분동안 회전시킨 후, 파지-함유 펠릿을 PBS에 현탁시켰다. 4% BSA를 사용하여 최소 30 분동안 파지 블로킹을 수행하고, 마그네틱-비드 기준 항체 선별을 문헌 [R. Kontermann and S. Dubel(eds.), Antibody Engineering Vol. 1, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, pages 267-287 (2010)]에 기술된 바와 같은 프로토콜에 따라 수행하였다. 블로킹은 2% BSA를 사용하여 최소 30 분간 수행하였다. 블로킹 비드를 블로킹된 파지에 가하고, 비드를 제거하여 스트렙타비딘과 결합한 모든 파지를 제거하였다. 이어서, 블로킹된 파지를 비오틴과 함께 30 분간 배양하고 이어서 비드와 함께 30 분간 배양한 후 비드를 폐기하였다.

이어서, 파지를 하기 펩티드와 함께 1 시간동안 배양하였다:

ACGVSRPVIACSVTIKEGSQLKQQIQSIQQSIERL(서열번호 1) - 비오틴; 및 YLPVGGLRRIGG(서열번호 2) - Ahx -, 이어서 30 분간 비드와 함께 배양하고, 세척하고 용출시켰다. 그런 다음, 중화된 용출액을 37 ℃에서 dh5α F+ 세포와 함께 60 분간 혼합하고, LB + 100 ㎍/ml Amp + 1% 글루코스 플레이트 상에서 밤새 배양하였다. 패닝(panning) 단계를 여러 주기동안 반복하였다.

항체 단편 특이성

프로브로서 펩티드를 사용하여 ELISA 분석을 수행하고, 단편 상대 친화도를 OD로 평가하였다.

패닝 생성 파지(전술한 바와 같은)로 감염된 이. 콜라이 TG-1을 도말하여 개개 콜로니를 수득하였다. 상기 콜로니를 평저 멸균 96-웰 플레이트의 웰중의 100 ㎕ YTAG 배지내에 피킹(picking)하고, 30 ℃ 진탕기에서 150 RPM ON에서 성장시켰다. 10 ㎕의 파지를, 90 ㎕의 YTAG + 2.5 ㎕/ml(5 x 10⁸ CFU)의 M13KO7 헬퍼 파지를 함유하는 새로운 96-웰 플레이트로 옮기고, 150 RPM에서 30 분간 진탕시킨 후 37 ℃에서 30 분간 진탕하지 않고 성장시켰다. 플레이트를 14 ℃에서 4000 RPM에서 5 분간 원심분리하고, 상등액을 폐기하였다. 200 ㎕/웰의 YTAK(카나마이신 함유)를 가하고, 플레이트를 30 ℃ 진탕기에서 150 RPM으로 밤새 성장시켰다. 이어서, 세균 플레이트를 4 ℃에서 4000 RPM으로 5 분간 원심분리하고, 100 ㎕의 PBST와 혼합된 상등액 100 ㎕를 ELISA에 사용하였다.

100 ㎕/웰의 항원 및 대조 항원을 4 ℃에서 ELISA 플레이트에 밤새 플레이팅하여 플레이트를 코팅하였다. ELISA 플레이트를 세척 완충액(300 ㎕/웰의 PBST)으로 1회 세척하고 실온(RT)에서 3% 우유/PBS로 1 시간동안 블로킹하였다. 플레이트를 세척 완충액으로 1회 세척하였다. 이어서, 파지를 플레이트에 첨가하고, 세척 완충액으로 3회 세척한 후 RT에서 1 시간동안 배양하였다. 50 내지 100 ㎕/웰의 HRP 접합된 항-파지 희석된 항-M13 파지 항체를 첨가하고, RT에서 1 시간동안 배양하였다. 세척 완충액으로 3회 세척한 후, 100 ㎕/웰의 OPD 기질 용액을 RT에서 20 분동안 첨가하였다. 이어서, 50 ml의 1 M HCl 용액으로 반응을 중단시키고 플레이트를 450 nm에서 판독하였다. 검출은 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)-표적화 항-파지 항체를 사용하여 달성하였으며, 기질-효소 반응으로부터 수득된 색을 자동 ELISA 판독기로 판독하였다.

실온에서 2 시간동안 PBS 중 2 ㎍/ml의 BSA-비오틴을 포함하는 플레이트를 코팅하는 또 다른 ELISA 프로토콜. 플레이트를 PBST로 세척하고 이어서 PBS 중 2 ㎍/ml의 스트렙타비딘으로 실온에서 2 시간동안 코팅시키고, PBST로 다시 세척하였다. 그런 다음, 플레이트를 PBS 중 2 ㎍/ml의 펩티드로 4 ℃에서 밤새 코팅하고, PBST로 1회 세척하고, 37 ℃에서 1 시간동안 우유/PBS의 3% 용액으로 블로킹하고, 프로토콜의 나머지는, SDDW 중에서 4배 희석시킨 50 ㎕/웰의 TMB(테트라메틸 벤지딘) 정지 시약을 사용하여 플레이트를 전개시키고 5 분후에 50 ㎕/웰의 1M H₂SO₄로 중단시키는 것을 제외하고 상기에서와 동일하였다.

결과

도 1은 단리되고, 프로브된 정자 펩티드에 대해 클로닝된 파지-디스플레이 scFv의 상대 친화도를 그래프로 나타낸 것이다. 기둥 1 내지 3은 FA-1 유도된 펩티드에 대한 3개의 scFv의 결합을 나타낸 것이고, 기둥 4 내지 6은 YLP(12) 유도된 펩티드에 대한 3개 scFv의 결합을 나타낸 것이다. BSA를 음성 결합 대조군으로 사용한다. scFv는 대조군과 비교하여 언급된 펩티드에 대해 상당한 친화도를 나타내었다. 도 2는 단리되고, 프로브된 정자 펩티드에 대해 클로닝된 일부 파지-디스플레이 scFv의 상대 친화도를 나타낸 것이다. 도 3은 일련의 비-결합 scFv를 확인하는 ELISA 결합 분석의 결과를 나타낸 것이며, 상기 scFv는 이어서 대조군으로 사용되었다. 이와 관련하여, 전형적으로 하나의 상기 scFv 클론인 J112를 사용하였다. 클론 J102는 다른 클론, 및 각각 scFv 파지, 또는 펩티드 및 scFv를 함유하지 않는 샘플인 대조군 A 및 B보다 큰 친화도를 나타내었다. 결합은 항-파지 HRP 표지된 항체(PVIII에 대한 항체)로 프로브된 샘플에서 OD를 측정함으로써 검출되었다. 상기 scFv의 일부는 이어서 하기 실시예에서 사용되어 적절하게 대조군 및 피임제로 작용하였다.

실시예 4

scFv 를 발현하는 조작된 락토바실러스

항체 클로닝 및 서열분석

파지 클론중 비손상 scFv 단편을 입증하기 위해, 확립되어 있는 프로토콜에 따라 NcoI 및 NotI 분리에 의해 절단하여 파지미드 게놈으로부터 scFv를 방출시켰다. 겔 정제된 생성물을, 고수율의 생성물을 생성하는, 조스 시저스(Jos Seegers) 박사의 친절한 선물인 pSLP111.1 벡터내에 서브클로닝하였다. 벡터의 지도는 도 4a에 나타내었다. 서브클로닝은 5' 프라이머 상에 NcoI 제한효소 부위 및 3' 프라이머 상에 AscI 부위를 함유한 고유의 프라이머(5'-GCGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGTTG, 3'-GCGGGCGCGCCCCAGCACAGTGAGTTTGGTCCC)를 사용하여 scFv의 PCR 증폭에 의해 수행하였다. 증폭된 DNA를 겔 정제하고, NcoI 및 AscI으로 분리하여 제한효소 부위를 활성화시켰다. 이어서, 제한된 DNA 단편을 두번째로 겔 정제하고, NcoI 및 AscI으로 미리 절단시킨 pSLP111.1 벡터 내에 접합시키고(T4 리가제 사용), 다시 겔 정제하였다. 접합 혼합물을 염화칼슘 기술(매니아티스(Maniatis))에 의해 컴피턴트로 만든 이. 콜라이 DH5α로 형질전환시켰다. 형질전환된 세균을 LB 아가 클로람페니콜 플레이트(10 ㎍/ml) 상에 도말하고, 밤새 배양한 후 콜로니를 피킹하고, 24개 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 제조하였다. 상기 콜로니로부터 키아겐 미니프레프(miniprep) 플라스미드 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 제조하고, NcoI 및 AscI으로 절단하여 적절한 크기의 DNA 삽입물을 함유하는 플라스미드를 확인하였다. 이어서, 양성 클론을 하기에 기술된 바와 같이 락토바실러스 젠세니로 옮겼다.

플라스미드를 키아겐-팁 20 컬럼을 사용하여 제조사의 지시에 따라 정제하였다.

정제된 플라스미드 내에 cDNA 삽입물의 존재를 확인하기 위해 각각의 클론을 NcoI - AscI으로 절단하고, 절단된 생성물을 아가로스 겔 상에서 전기영동하였다. 삽입물을 함유하는 클론을 서열분석하였다.

중쇄 및 경쇄 클론의 서열 분석

제조사의 지시에 따른 모든 조건 및 시약들을 사용하는 ABI 자동 서열분석기를 이용한 와이즈만(Weizman) 기관의 서열분석 서비스에 의해 양성 클론을 서열분석하였다. 사용된 초기 서열분석 프라이머는 다음과 같았다:

정방향: CCATGATTACGCCAAGCTTGGGAGCC(서열번호 9)

역방향: GAATTCAACCTTCAAATTGCC(서열번호 10)

증폭된 항체 단편의 벡터내로의 클로닝

겔 정제된 증폭 생성물을 벡터의 적절한 부위내에 서브클로닝하였다. 카세트는 락토바실러스-적합성 프로모터 요소, 항체 단편, 분비 신호 서열 또는 세포벽 고정 영역을 포함하여 4개의 성분을 함유하였다.

서열 확인을 수행한 후 락토바실러스 균주내에 형질전환시켰다.

락토바실러스 형질전환

락토바실러스 젠세니 균주 번호 25258의 ATCC 인간 질 분리균을 사용하여 MRS 액체배지(딥코) 중에서 37 ℃(5% CO₂/95% 공기)에서 배양하였다. 삽입물을 함유하는 pSLP111.1을 염화칼슘 기술에 의해 락토바실러스 젠세니내에 도입하였다. 형질전환된 락토바실러스 젠세니 세균을 10 ㎍/ml의 클로람페니콜을 함유하는 액체 배지 중에서 통상적으로 증식시켰다.

정자 결합 및 운동성 분석

마우스 정자를 확립되어 있는 프로토콜에 따라 단리하였다(문헌 [Liu Z, et al., Journal of Biological Chemistry 285, 2758-2770 (2010)]). 10⁶ 정자를 원뿔형 관에서 정자 완충액(21 mM HEPES; 4 mM 중탄산나트륨; 0.6% 인간 혈청 알부민; 3.6 ml의 나트륨 락테이트(60% 저장액) 및 젠타마이신으로 보충된 햄(Ham)의 F-10: 10 ㎍/ml)에 현탁시키고, 정자를 관의 상단 부분까지 헤엄쳐가는 그의 능력을 촉진하는 방식으로 유지시켰으며, 이때 운동성 정자의 수거는 소부피(수백 마이크로리터)의 완충액의 제거에 의해 달성하였다. 정자수는 혈구측정계로 확인하였으며, 1:1 또는 1:2의 정자:락토바실러스(cfu)의 비로 배양하였다.

마우스 정자를 단리하고, 파지-디스플레이 scFv를 사용한 결합 분석에 의해 정자에 대한 scFv 결합을 평가하였다. 전술한 바와 같은 스윔 업(swim up) 분석을 운동성 정자를 선택하기 위해 사용하였으며, 상기 운동성 정자를 단리하여 챔버 슬라이드에 넣고 공기건조한 다음, 해당 scFv를 함유하는 파지(10⁸)를 챔버에 적용하고, 1 시간동안 배양하고 세척한 후 정자를 1:200의 희석률로 HRP(엔코(ENCO), 이스라엘)에 연결된 항-cp8 항체로 프로브한 다음, 챔버를 세척하고 DAB 및 퍼옥사이드로 전개시켰다.

결과

도 4b는 플라스미드 NcoI 및 NotI 절단 생성물을 나타낸 것이다. 플라스미드를 37 ℃에서 3 시간동안 NcoI 및 NotI로 절단하였다.

하나의 포함된 scFv, J102는 고도로 보존된 정자 항원에 대해 높은 결합 친화도를 갖는 것으로 밝혀졌다. 클론의 서열분석에 의해 도 5a 및 5b에 나타낸 바와 같은 완전한 DNA 및 단백질 서열(서열번호 7 및 8)이 수득되었다.

scFv J102 등을 인간 및 뮤린 정자 둘 다에 대한 결합에 대해 프로브하였다. scFv J102는 인간-유래 단편이지만, FA-1 항원의 종들 중 높은 보존율은, 시험관내 분석에서 측정된 바와 같이, 뮤린 및 인간 종 둘 다에 대한 J102 결합을 제공하였다. 도 6a는 scFv를 발현하는 락토바실러스의 마우스 정자에 대한 상당한 결합을 나타낸 것으로, 평가된 거의 각각의 정자 세포가 상당한 염색을 나타낸 반면, 비-정자 항원에 대한 scFv 발현 대조군 락토바실러스는 뮤린 정자에 대해 감지할 정도로 결합하지 않았다(도 6b). 인간 정자 결합 연구는 마우스 결과와 일치하였다(데이터 나타내지 않음).

운동성 연구는 상기 방법 부분에서 설명한 바와 같이, 인간 정자를 사용하여 수행하였다. 무관한 대조군을 발현하는 락토바실러스는 시험관내에서 정자 운동성에 대해 중간정도의 효과를 나타낸 반면, 정자-결합 scFv를 발현하는 락토바실러스를 사용한 경우, scFv J102의 효과를 프로브하는 분석을 포함하여 정자 운동성을 손상시키는 현저한 효과가 나타났으며, 운동성은 비교 대조군에서 50% 감소된 것으로 밝혀져 정자-결합 scFv를 발현하는 락토바실러스가 정자 기능을 방해할 가능성을 시사하였다.

실시예 5

조작된 락토바실러스 젠세니 의 항-정자 활성

수정 억제

각각의 종들의 10⁵ 정자를 관련 항체 및 대조군 항체(1:50, 1:5 또는 1:1로 희석), 또는 대조군 및 관련 항체를 생성하는 구축물의 용액중에서 차가운 상태로 밤새 배양하고, 난자를 첨가하고, 이 시점에서 난자에 대한 정자의 결합을 1 시간동안 진행시켰다. 이어서, 난자를 세척하고, 난자당 결합된 정자의 수를 측정하고, 대조군 샘플에 대한 결합된 정자의 백분율로 나타내었다. 최대 억제율(%)을 나타내는 구축물을 추가로 평가하였다.

생체내 수정 억제 연구:

암컷(마우스, 토끼)에 정제된 관련 항체 단편, 정제된 대조군 항체 단편, 관련 항체 단편을 발현하는 조작된 락토바실러스 및 대조군 항체 단편을 발현하는 조작된 락토바실러스를 질내에 주입하였다. 각각의 약제의 암컷 질내 투여후 여러 시점에서 한마리의 수컷과 2 내지 4마리의 암컷을 수용시켰다. 무리로 나눈지 24 시간후에, 암컷을 질전(vaginal plug)의 존재에 대해 매일 육안으로 검사하였다. 암컷들을 그들간에 구별되도록 표시하고(예를 들면, 연속 귀 새김에 의해), 선택적으로 짝짓기 2 주후에, 암컷을 개개 우리에서 꺼내었다. 3 주후에, 한배새끼를 갖는 임신한 암컷 및 새끼를 계수하였다. 이어서, 최대 피임 활성을 갖는 구축물을 선택하고 추가로 평가/최적화하였다.

융합 억제 분석은 다음과 같이 수행하였다. 어린 암컷 마우스(8 내지 10 주령)에 0.9 NaCl 중 5 단위의 임신한 암말의 혈청(PMS)을 복강내 주사하였다. 48 시간후에, 마우스에 0.9% NaCl 중의 5 단위의 hCG(인간 융모막 고나도트로핀)을 복강내 주사하여 과배란을 유발시켰다. hCG 주사한지 14 내지 16 시간 후에, 배란된 난모세포를 수거하고 히알루로니다제로 처리하여 난구 세포를 제거하였다. 프로테아제 혼합물을 사용하여 투명대를 제거하였다. 투명대 제거 난자를 배양 배지 중에서 특정 농도의 펩티드와 함께 30 분간 배양하였다(문헌 [Hogan, B., et al., Manipulating The Mouse Embryo, 91-101 (1986)]). 수컷 마우스의 부고환에서 수거된 정자를 배양에 의해 수정능력을 획득시키고, 문헌 [Fleming and Yanagimachi, Gamete Res. 4, 253-273 (1981)]에 기술된 바와 같이 첨체 반응시키고, 대조군 및 관련 항체, 및 이들을 발현하는 구축물의 존재하에 난자에 첨가하고, 15 분간 배양하였다. 이어서, 난자를 무정자 배양 배지로 옮기고 1 시간 45 분동안 더 배양하였다. 이어서, 난자를 고정시키고 문헌 [Primakoff et al., J. Cell. Biol. 104, 141 (1987)]에 기술된 바와 같이 염색하였다. 팽창된 정자 머리의 전체 수를 계수하였다. 팽창된 정자 머리는 정자 및 난자가 융합되었음을 나타내는 것이다.

다른 관찰을 근거로, 여러 지표가 산출되었다. 수정 지수(fertilization index)(F.I.)는 팽창된 머리의 총수를 난자의 총수로 나누어 결정된다. 수정률(F.R.)은 수정된 난자의 백분율이다. 억제율(%)은 실험 펩티드의 수정 지수를 대조군 펩티드의 수정 지수로 나눔으로써 측정된다. 최대 활성을 갖는 구축물을 선택하였다.

실시예 6

효과적인 피임제로서 조작된 락토바실러스 젠세니

다른 동물 종을 실시예 4에 기술된 방법에 따라 프로브한다. 토끼, 래트, 기니아 피그, 원숭이 및 다른 종들을 평가할 수 있다. 이와 관련하여 여러 구축물을 평가하고, 동물 종 차이를 기록하였다. 효능%는 각 동물 균주에서 각각의 구축물에 대해 측정하였다.

또한, 각각의 종을 생식력이 입증된(이때 정자수 및 운동성을 평가한다) 수컷으로부터 수득된 정액을 갖는 AIF에 적용시켰다. 관련 및 대조군 항체 단편을 발현하는 락토바실러스를 질내에 적용하고, 투여후 다양한 시점에서 AIF를 수행하였다. 인공 수정 시에, 약 100 IU의 hCG의 주사에 의해 배란을 유도하였다. 배란 및 인공 수정후에, 암컷을 잠재적 기형유발(teratogenic) 효과를 평가하기 위해 임신을 완성시켰다.

락토바실러스 대조군 및 관련 항체 단편을 발현하는 락토바실러스를 투여한 암컷을 생식기에서의 지속력에 대해 평가하였다.

이를 위해, 질 입구내에 멸균 PBS를 반복 피페팅하여 질 분비물을 수거하였다. 체액 및 점액을 혼합하여 미세원심분리로 간단히 회전시키고 상등액을 scFv의 존재에 대해 분석하였다. 혈청 및 질 세척물중 항-정자 항체 단편 역가를 ELISA로 측정하였다.

경시적 연구를 수행하였다. 락토바실러스를 투여한 암컷을 반복적으로 수컷과 함께 수용하고, 임신율/피임 효능을 투여후 시간의 함수로서 평가하였다.

실시예 7

정자-결합 scFv 발현 락토바실러스 젠세니 는 마우스에서 효과적인 피임제이다

마우스 투여 및 교배 연구

암컷 ICR 마우스를 케타민(100 mg/ml 농도), 0.5 ml 자일라진(20 mg/ml 농도) 및 8.5 ml 0.9% 생리식염수의 용액 0.1 ml/g 중량으로 마취시켰다. 이어서, 마취된 마우스에 10⁸의 새로 성장시킨 중간-대수기의 조작된 락토바실러스 젠세니(OD로 측정) J102 또는 대조군 J112 균주(N = 군당 12마리 마우스)를 질내 투여하였다. 투여후, 암컷을 30 내지 60 분간 등과 골반을 뒤집은 채 유지시켰다. 락토바실러스를 3 일동안 매일 암컷에게 투여한 다음 연령을 맞춘 ICR 균주 수컷과 교배시켰다. 수컷을 7 일동안 암컷과 함께 수용하고, 이 기간동안 격일로 교대시킨 다음 꺼냈다. 이어서, 암컷을 질전의 존재에 대해 육안으로 평가하고, 우리당 임신한 마우스 및 새끼의 수를 기록하였다.

마우스 콜로니화 연구

1차 질내 투여한 지 12 내지 24 시간 후에, 암컷을 면봉 채취하거나 또는 질 세척하고, 회수된 샘플/체액을 클로람페니콜-함유 MRS 플레이트에 넣고 37 ℃에서 24 시간동안 배양하였다. 세균 덩어리의 존재가 질 콜로니화의 지표 역할을 한다.

결과

마우스 콜로니화 연구는 단일 질내 투여후 50% 이하의 세척액이 세균 덩어리를 생성하여 마우스의 50% 이하에서 콜로니화가 일어남을 시사함을 보여주었다. 투여후 5 일까지 동안 투여된 락토바실러스의 질내 지속성이 면봉 채취에 의해 콜로니화가 입증된 동물에서 나타났다.

암컷에 항-정자 scFv 발현 락토바실러스 젠세니 또는 대조군 균주를 투여하는 두가지 개별 실험을 수행하였으며, 각 실험에서 효과적인 피임이 입증되었다(도 7a). 대조군 암컷의 92%가 각 실험에서 임신한 반면, 항-정자 scFv 발현 락토바실러스 젠세니로 처리한 암컷은 임신율에 상당한 감소를 나타내었다(58% 또는 50%).

총 새끼수 및 우리당 새끼 수도 항-정자 scFv 발현 락토바실러스 젠세니의 투여 결과로 또한 감소되었다(도 7b). 이러한 결과를 근거로, 마우스당 새끼 수도 또한 대조군에 비해 처리된 암컷에서 감소되었다.

실시예 8

생물 피임제의 안전성

조작된 락토바실러스를 질 자극성에 대한 그의 영향에 대해 평가하였다. 마우스와 같은 동물에 연속으로 10 내지 30 일동안 하루 1회 락토바실러스를 질내 처리하였다. 이어서, 동물을 죽이고, 생식기를 총체적으로 및 현미경적으로 검사하였다.

질 조직을 락토바실러스, 및 대조군 및 관련 항체를 발현하는 조작된 락토바실러스 도입의 작용으로서 상피 궤양, 부종, 백혈구 침윤 및 혈관 울혈에 대해 검사하였다. 조작된 락토바실러스로 처리된 암컷을 천연 분리물을 투여한 암컷 및 미처리 동물과 비교하였다. 존재하는 경우 생식기 조직에서의 개선이 주목될 것이다.

실시예 9

피임 가역성

반복 교배에도 불구하고 락토바실러스 투여의 작용으로 임신하지 않은 암컷 동물에 항생물질을 투여하고 교배시켰다. 조작된 락토바실러스의 가역성의 척도로서 임신을 평가하였다. 유사하게, 동물을 생식기에서 락토바실러스의 지속성에 대해 평가하였다. 조작된 락토바실러스에 의해 개체군 감소 또는 부재가 나타날 때, 동물들을 교배시키고 그의 임신을 평가하였다.

일단 적절한 동물 모델에서 안전성 및 효능 연구가, 예를 들어, 전술한 바와 같이 수행되면, 인간 임상 실험도 고려한다.

<110> HERVANA LTD. <120> BIOLOGIC FEMALE CONTRACEPTIVES <130> HERV7227PC <140> PCT/IL2011/000352 <141> 2011-05-04 <150> US 61/331,892 <151> 2010-05-06 <150> IL 208820 <151> 2010-10-19 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 35 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Cys Gly Val Ser Arg Pro Val Ile Ala Cys Ser Val Thr Ile Lys 1 5 10 15 Glu Gly Ser Gln Leu Lys Gln Gln Ile Gln Ser Ile Gln Gln Ser Ile 20 25 30 Glu Arg Leu 35 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Tyr Leu Pro Val Gly Gly Leu Arg Arg Ile Gly Gly 1 5 10 <210> 3 <211> 23 <212> PRT <213> Lactobacillus amylovorus <400> 3 Met Lys Lys Asn Leu Arg Ile Val Ser Ala Ala Ala Ala Ala Leu Leu 1 5 10 15 Ala Val Ala Pro Val Ala Ala 20 <210> 4 <211> 23 <212> PRT <213> Lactobacillus crispatus <400> 4 Met Lys Lys Asn Leu Arg Ile Val Ser Ala Ala Ala Ala Ala Leu Leu 1 5 10 15 Ala Val Ala Thr Val Ser Ala 20 <210> 5 <211> 238 <212> PRT <213> Lactobacillus crispatus <400> 5 Val Thr Arg Thr Ile Asn Val Val Asp Pro Ile Thr Gly Lys Ile Ser 1 5 10 15 Thr Ser Val Gln Thr Ala Lys Phe Thr Arg Glu Asp Lys Asn Ser Asn 20 25 30 Ala Gly Tyr Thr Asp Pro Val Thr Gly Lys Thr Thr Met Asn Pro Trp 35 40 45 Thr Pro Ala Lys Gln Gly Leu Arg Ala Val Asn Val Glu Gln Ile Lys 50 55 60 Gly Tyr Val Ala Lys Val Asp Gly Asn Val Asp Ala Val Val Val Thr 65 70 75 80 Pro Asp Ser Ala Asn Met Val Val Thr Ile Thr Tyr Gln Ala Asn Lys 85 90 95 Pro Glu Gly Gln Asn Ile Thr Asn Lys Lys Asp Thr Val Pro Asp Pro 100 105 110 Ala Asp Gly Ile Lys Asn Lys Asp Asp Leu Pro Asp Gly Thr Lys Tyr 115 120 125 Thr Trp Lys Glu Val Pro Asp Val Asn Ser Val Gly Glu Lys Thr Gly 130 135 140 Ile Val Thr Val Thr Phe Pro Asp Gly Thr Ser Val Asp Val Lys Val 145 150 155 160 Thr Val Tyr Val Asp Pro Val Val Glu Ser Asn Arg Asp Thr Leu Ser 165 170 175 Lys Glu Ala Asn Thr Gly Asn Thr Asn Val Ala Lys Ala Ala Thr Val 180 185 190 Thr Ser Ser Lys Val Glu Ser Lys Lys Thr Leu Pro Gln Thr Gly Ser 195 200 205 Lys Thr Glu Gln Val Gly Ile Leu Gly Leu Ala Ile Ala Thr Val Gly 210 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Leu Ile Ala Ser Lys Asp Asn Ala 180 185 190 Lys Ile His Lys Gln Thr Leu Leu Pro Gln Thr Gly Thr Glu Thr Asn 195 200 205 Pro Leu Thr Ala Ile Gly Ile Gly Leu Met Ala Leu Gly Ala Gly Ile 210 215 220 Phe Ala Lys Lys Lys Arg Lys Asp Asp Glu Ala 225 230 235 <210> 7 <211> 744 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 atggccgagg tgcagctgtt ggagtctggg ggaggcttgg tacagcctgg ggggtccctg 60 agactctcct gtgcagcctc tggattcacc ttcagtgacc acgacatgca ctgggtccgc 120 caggctccag gcaaggggct ggagtgggtc tcaggtatca gttggaaaag tgacagtatg 180 gcctataggg actctgtgaa gggccgattc accatctcca gagacaattc caagaacacg 240 ctgtatctgc aaatgaacag cctgagagcc gaggacacgg ccgtatatta ctgtgcgaga 300 gatcaggagc acttcgactt tgactactgg ggccagggca ccctggtcac agtctcttca 360 ggctcagcag gaggaggagg atccggtggt ggtggttctg gcggcggcgg ctccgatatc 420 gtgctgactc agccaccctc agcgtctggg acccccgggc agagggtcac catctcttgc 480 tctggaagca gctccaacct cggaagtaat actgtaaact ggtaccagca gctcccagga 540 aaagctccca aactcctcat ttatgacaat aatcaacgac cctcaggggt ccctgaccgg 600 ttctctggct ccaagtctgg cacctcagcc tccctggcca tcagtgggct gcggtccgag 660 gatgaggctg attattactg tgcagcatgg gatgacagcc tgagtgggct ggtgttcggg 720 accgggacca aactcactgt gctg 744 <210> 8 <211> 248 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Ala Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 1 5 10 15 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 Asp His Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Val Ser Gly Ile Ser Trp Lys Ser Asp Ser Met Ala Tyr Arg Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Gln Glu His Phe Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln 130 135 140 Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys 145 150 155 160 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Leu Gly Ser Asn Thr Val Asn Trp Tyr Gln 165 170 175 Gln Leu Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Asn Asn Gln 180 185 190 Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr 195 200 205 Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp 210 215 220 Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly Leu Val Phe Gly 225 230 235 240 Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 245 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer <400> 9 ccatgattac gccaagcttg ggagcc 26 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 gaattcaacc ttcaaattgc c 21

Claims

정자에 대한 scFv 항체 단편인 살정자제를 발현하도록 조작된 락토바실러스(Lactobacillus)인, 여성 생식기의 유전자 조작된 공생 세균.
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제 1 항에 있어서,
정자에 대한 scFv 항체 단편이 인간의 것 또는 인간화된 것인 세균.
제 1 항에 있어서,
scFv 항체 단편이 첨체 또는 원형질막과 특이적으로 상호작용하는 세균.
제 1 항에 있어서,
scFv 항체 단편이 정자 경부 영역과 특이적으로 상호작용하는 세균.
제 1 항에 있어서,
scFv 항체 단편이 정자 FA-1 항원 또는 그의 단편과 특이적으로 상호작용하는 세균.
제 1 항에 있어서,
scFv 항체 단편이 서열번호 1 또는 2와 90% 이상의 동일성을 공유하는 펩티드와 특이적으로 상호작용하는 세균.
제 1 항에 있어서,
scFv 항체 단편이 서열번호 8과 90% 이상의 동일성을 공유하는 서열을 갖는 세균.
제 1 항에 있어서,
scFv 항체 단편이 서열번호 7과 90% 이상의 동일성을 공유하는 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 세균.
제 8 항에 있어서,
락토바실러스 젠세니(jensenii), 락토바실러스 크리스파투스(crispatus) 또는 락토바실러스 카세이(caseii)인 세균.
제 1 항의 세균을 포함하는 피임용 조성물.
제 11 항에 있어서,
질내 좌약, 스펀지, 크림 또는 발포제의 형태인 조성물.
제 1 항의 세균을 포함하는 질내 삽입 장치.
제 13 항에 있어서,
질내 삽입 고리인 질내 삽입 장치.
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