JP2019017389A - 生物学上のメスの避妊薬 - Google Patents

Abstract

【課題】抗体断片を発現するために改変された共生生物、当該共生生物を含む組成物、及び当該共生生物を含む組成物の使用の提供。【解決手段】精子運動性、又は受精を阻害する抗体断片を発現するために改変された共生生物、及び当該共生生物を含む組成物。【選択図】なし

Description

発明の分野
本発明は、抗体断片を発現するための改変共生生物を提供し、そしてそれは、精子の運動性、受精又はそれらの組合せを阻害し、及び同じ生物を含む組成物を提供する。本発明は、避妊薬として、そのような改変共生生物又は同じ生物を含む組成物の使用を提供する。

発明の背景
新しい避妊薬の開発は、社会学上、金銭上、又は教育制限に関わらず、すべての個人に利用できる避妊を提供するために必要である。

多くの異なる避妊薬が、現在入手できる一方で、問題がないものは一つもない。圧倒的に最も一般的に使用される避妊薬は、経口エストロゲン、プロゲステロン、又はそれらを組み合わせた製剤であり、そしてそれらは、効果的であるとはいえ、いくつかの集団において、長期使用で、新生物発生前の状態になることが示唆されている。

ペッサリー、又は子宮内器具などのバリア方法は、前者では不順守、後者の使用では骨盤内炎症を有するより大きなリスクのため、低減された効果を示す。殺精子剤は、この状況において、より少ない効果を有し、及び更に、性感染症のより高いリスクが、そのような使用に関連する。従って、上記制限に関連しない、容易に使用でき、低侵襲避妊薬の必要がある。

発明の概要
本発明は、１つの実施態様では、精子抗原に対する抗体断片を生産し、及びそれにより避妊薬として働く遺伝子組換え細胞を提供する。

一つの実施態様では、本発明は、メスの生殖管の改変共生細菌を提供し、ここで、細菌が、精子の運動性、精子‐卵子融合、又は卵子への精子の侵入、又はそれらの組合せを防止するために効果的である精子の抗体、又はその断片を発現するように改変されている。いくつかの実施態様では、抗体断片は、一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）である。

いくつかの実施態様では、精子抗原特異的な抗体断片は、ヒト由来又はヒト化である。いくつかの実施態様では、抗体断片は、精子又はその断片上で抗原が局在するアクロソーム又は細胞膜と特に相互作用する。いくつかの実施態様では、抗体断片は、抗原又はその断片が局在する精子頚部領域と特に相互作用する。いくつかの実施態様では、抗体断片は、改変細菌から分泌され、及びいくつかの実施態様では、抗体断片は、細菌の細胞壁と一体となるか、又は結合する。

いくつかの実施態様では、改変細菌が、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）であり、又はいくつかの実施態様では、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）である。いくつかの実施態様では、改変細菌は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｎｉｓｓｌｅ１９１７株である。いくつかの実施態様では、改変細菌は、Ｓ．ゴルドニ（ｇｏｒｄｏｎｉｉ）である。いくつかの実施態様では、改変細菌は、Ｌ．ジョンソニ（ｊｅｎｓｅｎｉｉ）、又はＬ．クリスパタス（ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）である。

いくつかの実施態様では、ｓｃＦｖは、配列番号１又は２と少なくとも９０％の相同性を共有するペプチドと相互作用する。いくつかの実施態様では、ｓｃＦｖは、配列番号８と少なくとも９０％の相同性を共有する配列を有する。いくつかの実施態様では、ｓｃＦＶは、配列番号７と少なくとも９０％を共有する配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる。

いくつかの実施態様では、本発明は、本明細書中で記載されたような改変細菌を含む組成物を提供する。いくつかの実施態様では、膣座薬、クリーム、又は泡の形態である。いくつかの実施態様では、避妊薬は、膣リング上で一体となるか、又は取り込まれる。

いくつかの実施態様では、本発明は、避妊方法を提供し、前記方法は、メス対象中で、精子の運動性、精子‐卵子融合、又は卵子への侵入を防止することを阻害するのに十分な量の本明細書中に記載された改変細菌とメス対象の生殖管の細胞を接触する工程を含む。いくつかの実施態様では、この態様に従って、本方法は、改変細菌を含む組成物を、それを必要とするメス対象の生殖管に、阻害又は防止するために十分な量で投与することを含む。

いくつかの実施態様では、本発明は、メス集団において、妊娠発生率を低減するための方法を提供し、前記方法は、メス対象中で、精子の運動性、精子‐卵子融合、又は卵子への侵入を改悪し、阻害し、又は防止するのに十分な量で本明細書中に記載されたような改変細菌とメス対象の生殖管の細胞とを接触する工程を含む方法であり、それによりメスにおいて妊娠発生率を低減し、及びメス集団において妊娠発生率を低減する。

いくつかの実施態様では、本発明は、メス集団において受精発生率を低減するための方法を提供し、前記方法は、メス対象中で、精子の運動性、精子‐卵子融合、又は卵子への侵入を改悪し、阻害し、又は防止するのに十分な量で本明細書中に記載されたような改変細菌とメス対象の生殖管の細胞とを接触する工程を含む方法であり、それによりメスにおいて受精発生の発生率を低減し、及びそれによりメス集団において受精発生率を低減する。

いくつかの実施態様では、本発明は、メス集団において妊娠発生率の低減で使用するための薬剤の製造について本明細書中で記載したような改変細菌、又は組成物の使用を提供する。いくつかの実施態様では、本発明は、メス集団において受精発生率の低減で使用するための薬剤の製造について本明細書中で記載したような改変細菌、又は組成物の使用を提供する。

図１は、ＥＬＩＳＡアッセイにより決定した精子ペプチドに対する単離され及びクローン化されたファージディスプレイｓｃＦｖの相対的親和性を図示する。１‐３列は、３つのｓｃＦＶと精子ＦＡ‐１由来ペプチドの結合を示し、及び４‐６列は、３つのｓｃＦｖと精子ＹＬＰ（１２）由来ペプチドの結合を示す。ＢＳＡを陰性結合対照として用いた。 図２は、プローブ精子ペプチドのために単離され及びクローン化されたいくつかのファージディスプレイｓｃＦｖの相対的親和性を示す。クローンは、ＯＤ値が、ペプチド対ＢＳＡ対照、又はペプチドなしでインキュベートしたサンプルに関して、より高い場合、高い親和性を有すると考えられた。クローン１０２、１０３、１０５及び１０６は、特に、ペプチドに対する比較的高い親和性を示し、及びクローン１０２を、インビトロ及びインビボで更に特徴付けた。 図３は、一連の非結合ｓｃＦｖを同定するためのＥＬＩＳＡ結合アッセイの結果を図示し、そしてそれは、その後クローン１０２と比較した対照として利用し、図２で示されたように、プローブペプチドに対する良好な親和性を有することを見出した。一つのそのようなｓｃＦｖクローン、Ｊ１１２を、主としてこの文脈において使用した。対照Ａ及びＢは、非ｓｃＦｖファージ、又は非ペプチド及び非ｓｃＦｖをそれぞれ含むサンプルであり、同様に評価した。結合は、抗ファージＨＲＰ標識抗体（ＰＶＩＩＩ抗体）をプローブとしたサンプルについてＯＤを測定することにより検出した。 図４Ａは、ｐＳＬＰ１１１．１ベクターのプラスミドマップである。 図４Ｂは、プラスミドのＮｃｏＩ及びＮｏｔＩ消化産物の写真を示す。プラスミドは、ＮｃｏＩ及びＮｏｔＩで、３７℃、３時間消化した。プラスミドインサートを、いくつかの代表的なクローンについて明確に示す。 図５Ａは、Ｊ１０２ｓｃＦｖの核酸及びアミノ酸配列を、それぞれ示す（配列番号７‐８）。 図５Ｂは、Ｊ１０２ｓｃＦｖ内のそれぞれのドメインを示す。 図６は、インビトロで、ネズミ精子に対するＪ１０２を発現しているラクトバチルスの特異的な結合を示す。図６Ａは、マウス精子に対するｓｃＦｖを発現しているラクトバチルスの顕著な結合を示す光学顕微鏡写真であり、評価されたほとんどそれぞれの精子細胞が、顕著な染色を有する。 図６Ｂは、Ｊ１１２を発現しているラクトバチルスの顕微鏡写真であり、対照として用いられ、ここでネズミ精子に対する検出できる結合がないのは明白である。 図７は、Ｊ１０２を発現しているラクトバチルスの有効性のインビボでの証拠の図示である。図７Ａは、抗精子ｓｃＦｖ Ｊ１０２を発現しているＬ．ジョンソニ又は精子と結合しないｓｃＦｖ（Ｊ１１２）を発現している対照ラクトバチルスを投与した２つの実験において、メスマウスの妊娠率のプロットであり、及びそれぞれの実験において、効果的な避妊が、Ｊ１０２対Ｊ１１２処置マウスで証明された。 図７Ｂは、図７Ａにおいて記載されたように行われた２つの実験のそれぞれについて全子孫及びケージあたりの子孫の数のプロットであり、及び全子孫及びケージあたりの子孫の数は、対照と比較して、Ｊ１０２を発現しているＬ．ジョンソニにおいて低減した。

発明の詳細な説明
本発明は、一つの実施態様では、組換え細胞を提供し、一つの実施態様では、微生物を含み、及び同じものを使用するための方法を提供し、殺精子化合物の製造方法を提供する。本方法及び細胞は、一つの実施態様では、避妊の効果的な方法を提供する。

一つの実施態様では、組換え細胞は、メスの生殖器官の共生生物である。一つの実施態様では、共生生物は、細菌である。

一つの実施態様では、組換え細胞は、非哺乳類細胞であり、そしてそれは、化合物を発現するのに十分な期間、メスの生殖管の粘膜で生き残り、そしてそれは、精子の運動性、精子‐卵子融合、又は卵子への侵入を干渉する。いくつかの実施態様では、化合物は、同じように定着する共生生物により処置された対象のメスの生殖管で発現する場合、対象について低減した受精率を生じる。いくつかの実施態様では、化合物は、処置された対象のメスの生殖管で発現する場合、そのような共生生物を投与した集団で低減した妊娠率を生じる。

一つの実施態様では、本発明は、殺精子化合物を発現する改変共生生物を提供し、そしてその生物は、メスの生殖器官又はその領域で定着することができる。

一つの実施態様では、細胞は、（５’非コード配列）前の調節配列、及び（３’非コード配列）後のコード配列を含む、特異的なタンパク質として発現できる核酸断片を発現するために改変される。

遺伝子組換え細菌は、当業者に知られるであろう任意の方法を介して、特定の遺伝子について欠損するように改変してもよく、又は改変生物は、当該技術分野において公知の方法により、特定の遺伝子を過剰発現するために改変されてもよい。

一つの実施態様では、コンストラクトは、遺伝子ノックアウト手順のための細菌における相同組換え事象を選択することができるように、本発明の細菌中に導入される。当業者は、コンストラクトで相同組換え事象を受けるトランスフェクト細胞を効率的に選択するために正及び負の両方の選択遺伝子を導入するノックアウトコンストラクトを容易に設計できる。

他の実施態様では、とりわけ亢進され、減少され、及び無効にされた遺伝子発現を含む、遺伝子発現、活性及び機能の変化は、細胞のゲノム内に統合した遺伝子のコンストラクトを使用して遂行されてもよい。他の実施態様では、遺伝子発現、活性及び機能の変化は、染色体外である遺伝子のコンストラクトを使用して遂行されてもよく、及び一つの実施態様では、染色体外を維持してもよい。

一つの実施態様では、コンストラクト及びベクターという用語は、ベクター内にサブクローニングされた目的の配列を含む核酸ビヒクルを指す。

本発明のベクターを作製するために、目的の配列をコードするポリヌクレオチドを、真核細胞を形質導入／形質転換するため、及び形質導入／形質転換細胞内で組換産物の発現を指示するために適当である適切な発現ベクターシステム内に連結できる。そのような適切なベクターシステムは、既存のプロモーター又はエンハンサー配列を置換し、複製し又は突然変異し、及び／又は更なる選択マーカーをコードする配列又はレポーター遺伝子をコードする配列などの任意の更なるポリヌクレオチド配列を導入するために、一般的に使用される組換え技術を介して、容易に修飾できることが認識されるであろう。

他の実施態様によれば、ベクターは更に、単離された核酸の発現を調節するためのプロモーターなどの調節エレメントを含む。そのようなプロモーターは、それらが、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを結合するのに役立つような、転写に必要とされるシス配列エレメントとして知られ、そしてそれは、その下流存在する配列を転写する。ベクターは、他の実施態様では、誘導性プロモーター、又は構造的に目的の配列を発現するものを含んでもよい。

本発明によるベクターは、更に複製起点を含んでもよく、及び真核細胞の２以上の種において伝播してもよく、及びいくつかの実施態様では、ベクターは、選択生物のゲノム内でその統合を容易にするように構築されてもよい。ベクターは、他の実施態様では、プラスミド、バクミド（ｂａｃｍｉｄ）、ファージミド、又はファージなどでもよく、又は当業者により理解されるような任意の適当なベクターでもよい。

そのようなベクターの例は、本明細書中の実施例の項で記載され、及び使用される。しかしながら、本発明が、任意のそのようなベクターの使用に制限されず、及びベクターが遺伝子伝播／改変ビヒクルとして働き、挿入又は組み込まれた配列の相同発現を最適化する目的のために、新たなベクターを作製し及び／又は既存のベクターを修飾することが、当該技術分野において定法であることは、当業者により理解されるであろう。

使用に適したベクターのいくつかの例は、Ｍ．Ｐｏｓｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９１ Ｊｕｎｅ；５７（６）：１８２２‐１８２８；Ｍ Ｓｈｉｍｉｚｕ‐Ｋａｄｏｔａ，ｅｔ．ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９１ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ；５７（１１）：３２９２‐３３００；Ｔ．Ｄｕｏｎｇ，ｅｔ．ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ４，Ｉｓｓｕｅ３，ｐａｇｅｓ３５７‐３６７，Ｍａｙ ２０１１；Ｖ Ｖ Ａｌｅｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌｏｇｉｉａ Ｖｏｌｕｍｅ：６９，Ｉｓｓｕｅ：１，Ｐａｇｅｓ：７５‐８０；Ｘ．Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ２００６，ｖｏｌ．５０，ｎｏ１０，ｐｐ．３２５０‐３２５９；ＷＯ／２００５／１１２５６７；Ｌｕｃａ Ｖａｎｇｅｌｉｓｔａ ｅｔ． ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｊｕｌｙ ２０１０，ｐ．２９９４‐３００１，Ｖｏｌ．５４，Ｎｏ．７；米国特許第７，１７９，４５８号；米国特許第７，７５４，４６７号；Ｃａｒｅｎ Ｊ．Ｃｈａｎｃｅｙ，ｅｔ． ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００６，１７６：５６２７‐５６３６；米国特許第５，７３３，５４０号、及び他が挙げられる。

細胞内に所望する核酸配列の組み込みは、多くの当該技術分野における周知の方法を通じて遂行できる。核酸コンストラクトは、細胞を安定又は一過性トランスフェクションし又は形質導入するために利用できる。

本発明の細胞内にベクターを導入するための当該技術分野で公知の多くの技術は、これらに限定されないが、直接ＤＮＡ取り込み技術、及びファージ、プラスミド、直鎖ＤＮＡ又はリポソームを介した形質導入、レセプターを介した取り込み、及びリン酸マグネシウムを介し及びＤＥＡＥ‐デキストランを介した導入方法を使用するマグネットポレーション方法、エレクトロポレーション又はリポソームを介したトランスフェクション（更に詳細については、例えば、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」 Ｖｏｌ．１‐３１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９） ａｎｄ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）又は他の標準実験マニュアルを参照）が挙げられる。核酸で覆った粒子での衝突が、また想定される。これらの方法のいずれかが、本発明の細胞の作製のために、及び本発明の方法を達成するために、細胞内への所望する配列の導入に使用されてもよい。エレクトロポレーションは、様々な細胞の形質転換のためにうまく使用されている。

ドナー及びレシピエントの直接接触に依存する細菌の接合が、細菌内への遺伝子の伝達のために使用されてもよい。細菌接合過程は、お互い密接な接触で、「ドナー」及び「レシピエント」細胞を一緒に混合することを含んでもよい。接合は、ドナー及びレシピエントの間の細胞質の結合の形成により起こり、レシピエント細胞内に新たに合成されたドナーＤＮＡの直接伝達を伴う。接合におけるレシピエントは、ドナー細菌から水平伝達を介してＤＮＡを受け入れる。接合伝達におけるドナーは、接合性プラスミド、接合性トランスポゾン、又は可動化プラスミドを有してもよい。

いくつかの場合では、接合のためにドナーとレシピエントのみが必要である。伝達されるプラスミドが、接合性及び可動性の両方（すなわち、tｒａ遺伝子及びＭｏｂタンパク質をコードする遺伝子の両方を運ぶ）である自己伝達性プラスミドである場合、これは起こる。一般的に、過程は以下の工程：１）二本鎖ＤＮＡが、ｏｒｉＴにおける特定部位でニックが入り；２）一本鎖ＤＮＡが、細孔又は線毛構造を通じてレシピエントに放出され；３）ＤＮＡ弛緩酵素（ｒｅｌａｘａｓｅ ｅｎｚｙｍｅ）は、ｏｒｉＴで二本鎖ＤＮＡを切断し、及び放出された５’末端に結合し（中間構造として、リラクソソームを形成）；及び４）その後、補助タンパク質の複合体がｏｒｉＴに集合してＤＮＡ伝達の過程を亢進する。

「三親（ｔｒｉｐａｒｅｎｔａｌ）」接合は、ドナープラスミドからレシピエントの伝達をまた必要としてもよい。この種の接合は、ドナー細胞、レシピエント細胞、及び「ヘルパー」プラスミドが関与している。ドナー細胞は、可動性プラスミド又は接合性トランスポゾンを保有する。可動性ベクターは、ニッカーゼをコードする遺伝子であるｏｒｉＴを含み、Ｍｏｂタンパク質をコードする遺伝子を有するが、Ｍｏｂタンパク質単独ではゲノムの移動を達成するのに十分ではない。従って、可動性プラスミドは、ヘルパープラスミド（ドナー内又は「ヘルパー」細胞内に位置する）によって適当な接合システムが与えられるまでは、自身の移動を亢進することができない。接合性プラスミドは、接合対の形成及びＤＮＡ伝達に必要とされている。というのも、このプラスミドは、細孔又は線毛の形成に関与する、移動のためのタンパク質（Ｔｒａ）をコードするからである。

用語「組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）」又は「組換え改変された（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｌｙ ａｌｔｅｒｅｄ）」は、細胞、又は核酸、タンパク質、又はベクターに関して使用される場合、細胞、核酸、タンパク質又はベクターが、異種核酸又はタンパク質の導入により、又は天然核酸又はタンパク質の改変により修飾されること、又は細胞が、そのように修飾された細胞に由来することを示す。従って、例えば、組換え細胞は、天然型（非組換え）細胞内では見出せない遺伝子を発現し、又は他方では、異常に発現し、低発現し、又は全く発現しない天然遺伝子を発現する。

用語「異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）」は、核酸部分に関して使用する場合、核酸が、本来お互いに同じ関係で見出せない２又は３以上の部分配列を含む核酸を示す。例えば、当該核酸は、典型的に組換えで生成され、そしてそれは、あるソースからプロモーター及び他のソースからコード領域など、新しい機能の核酸を作るために用意された無関係の遺伝子由来の２又は３以上の配列を有する。同様に、異種タンパク質は、タンパク質が、本来お互いに同じ関係で見出せない２又は３以上の部分配列を含むことを示す（例えば、融合タンパク質）。

「発現カセット」は、宿主細胞における特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸エレメントで、組換えで又は合成的に生成された核酸である。発現カセットは、プラスミド、ウィルス、又は核酸断片の一部でもよい。典型的に、発現ベクターは、プロモーターに作動式に連結され転写される核酸を含む。

他の実施態様では、本発明で使用される核酸は、ヌクレオチドアナログから作られるＲＮＡ又はＤＮＡのいずれかのアナログを含む。この用語は、天然核酸塩基、糖類及び共有ヌクレオシド間（バックボーン）結合だけでなく、機能的に同様な、非天然部分を有するオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含む。そのような修飾又は置換ヌクレオチドは、改良された細胞取り込み、改良された核酸標的のための親和性、ヌクレアーゼの存在下における増加した安定性及び／又は効果的な遺伝子サイレンシングなどの望ましい特徴のため、しばしば天然型よりも好ましい。

本発明で使用される核酸は、例えば当該技術分野で周知である、任意の合成又は組換え方法により生成できる。核酸は、当該技術分野で公知の技術により、生物物理学的又は生物学的特長を変化するために更に修飾できる。例えば、核酸は、そのヌクレアーゼに対する安定性を増加するために修飾でき（例えば、「エンドキャッピング」）、又はその脂溶性、溶解性、又は相補配列に対する結合親和性を改良するために修飾できる。

本発明によるＤＮＡは、当該技術分野において公知の方法により、化学的にまた合成できる。例えば、当該ＤＮＡは、当該技術分野において公知の方法により全部又は一部について４つのヌクレオチドから化学的に合成できる。そのような方法は、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ（１９８５）に記載されたものを含む。ＤＮＡは、オーバーラップする二本鎖オリゴヌクレオチドを調製し、ギャップを埋め、及び末端を一緒に連結することによりまた合成できる（一般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｒｔ ａｌ．（１９８９）及びＧｌｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９５）を参照）。タンパク質の機能的ホモログを発現するＤＮＡは、部位特異的突然変異により野生型ＤＮＡから調製できる（例えば、Ｚｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８２）；Ｚｏｌｌｅｒ（１９８３）；及びＺｏｌｌｅｒ（１９８４）；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ（１９９１）を参照）。得られたＤＮＡは、当該技術分野における公知の方法により増幅できる。一つの適当な方法は、Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８８），Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，６８３，１９５号、及びＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）で記載されたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法である。

他の実施態様では、インビボ転位は、ベクター、例えばコスミド、ファージ、プラスミド、又はＢＡＣ（バクテリア人工染色体）ベクター内にクローン化されたゲノムＤＮＡ上に行ってもよい。同様の高密度（ｈｉｇｈ‐ｄｅｎｓｉｔｙ）突然変異は、対立遺伝子置換ベクター内にクローン化されたゲノムＤＮＡを使用する非天然コンピテント生物において行え（例えば、米国特許第６，２０７，３８４号を参照）、そしてその方法は、本明細書中に記載した生物を改変するために利用されてもよい。

適当な細菌宿主株は、形質転換能力、異種タンパク質発現のための能力、及び／又は粘膜表面のために選択される。細菌宿主は、塩化ルビジウム方法又はエレクトロポレーションなどの標準方法を使用して、形質転換のための能力を付与されるであろう（例えば、Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２１：９７‐１０９（１９９５））。

エレクトロポレーションによるＬ．ジョンソニなどの共生生物の形質転換は、例えば、Ｌｕｃｈａｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．７４：３２９３‐３３０２（１９９１））において記載されたような標準方法を改良することにより行うことができる。簡潔には、新しく接種されたＬ．ジョンソニを、ＭＲＳ培地で培養する（例えば、３７℃及び５％ＣＯ₂で、ＯＤ₆₀₀が０．６‐０．７まで）。細菌細胞を回収し、洗浄し、及びスクロース及びＭｇＣｌ₂の冷溶液中に再懸濁する。コンピテントセルを、その後ＤＮＡと混合し、及びエレクトロポレーションを行った。その後、細胞を抗生物質の他の選択剤を含む選択的寒天プレート上に播く前に、回復させてもよい。改変細胞を、その後、座薬、クリーム又は泡の形態などで、対象に投与される。

場合により、抗生物質の前処理が、膣内に本発明の細菌を導入する前に、内在細菌の粘膜表面を前もって洗浄するために使用できる（例えば、Ｆｒｅｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，３９：６８６‐７０３（１９８３））。抗生物質は、経口投与でき、膣に直接適用できる。

いくつかの実施態様では、本発明は、本発明の方法に従って改変するための細菌株の選択のための非限定的な方法を提供し、そしてその株は、細菌が適用される粘膜表面への定着の点で効率的であり、そしてその方法は、動物又はヒト粘膜層上に細菌をすばやく定着するために繰り返し選択することを含んでもよい。例えば、粘膜表面にそれぞれの工程で返すことにより、粘膜表面に野生型細菌株を適用し、及び繰り返し単離し及びインビトロで細菌を培養する。いくつかの実施態様では、この態様により、改良された定着能力を有する細菌が得られる。

他の実施態様では、本発明は、本発明の方法に従って細菌株を改変するための非限定的な方法を提供し、そしてその株は、細菌が適用される粘膜表面に定着するために効率的であり、組換え細菌の表面上に融合タンパク質の発現を含んでもよい。組換えタンパク質は、目的のポリペプチドに結合する宿主結合ドメインからなる。宿主結合ドメインは、高い親和性で選択された宿主粘膜表面上に特定の決定因子（タンパク質又は炭水化物）に結合する細菌を可能にし、従って、内在の細菌叢を超える生存効果を細菌に与える。

本発明の改変細菌株のための他の具体的な方法は、バクテリオファージを介して遺伝子を導入することにより、異種タンパク質を発現するために内在細菌叢の誘導を含む。多くのバクテリオファージベクターは、異なる細菌について使用するために開発されている。例えば、テンプレートバクテリオファージａｄｈに基づくバクテリオファージベクターが使用できる（例えば、Ｒａｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４：５５８４‐５５９２（１９９２）及びＦｒｅｍａｕｘ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ １２５：６１‐６６（１９９３）を参照）。このベクターは、確定したファージ（ａｔｔＰ）及び細菌（ａｔｔＢ）付着部位で、宿主染色体内に部位特異的統合を受ける。同様に、ラクトバチルス特異的バクテリオファージは、ラクトバチルス染色体内にベクター又は他のポリヌクレオチドを形質導入するために使用できる。ラクトバチルス特異的ファージは、ｍｖ４（Ａｕｖｒａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７９：１８３７‐１８４５（１９９７））、ａｄｈ（Ｆｒｅｍａｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １２６：６１‐６６（１９９３））、ｇｌｅ（Ｋａｋｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １７５：１５７‐１６５（１９９６）、及び膣ラクトバチルス分離株中のＢｒａｄｌｅｙのグループＡ又はＢに属するもの（Ｋｉｌｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：３１‐３９（２０１１））を含む。

粘膜上皮細胞を刺激しない特定の薬剤は、定着を助けるために細菌の単位用量に添加してもよい。粘膜表面上の多くの細菌は、粘膜表面全体を覆うバイオフィルムを融合して形成する莢膜物質を分泌する。より成功した定着のためにバイオフィルム内に改変細菌の侵入を亢進するために、このバイオフィルム材料を消化する酵素を追加することは有用であるかもしれない。当該酵素は、ＤＮＡｓｅ、ペプチダーゼ、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、及び他の炭水化物分解酵素を含む。改変細菌自体が影響を受けない抗生物質は、改変細菌の効果的な定着を容易にするために、粘膜表面上の内在細菌の数を低減するためにまた添加してもよい。

異種ポリヌクレオチド又はポリペプチドの発現は、Ｐ５９（ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５８：３１４２‐３１４９（１９９２））又はＰ２３（Ｅｌｌｉｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ３６：２１１‐２１９（１９８４））プロモーターを使用して構成できる。あるいは、発現は、誘導性プロモーターの調節下でもよい。例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アミラーゼ（Ｗｅｉｃｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：３６５６‐６６（１９８９））又はキシロース（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ １８１：７１‐７６（１９９６））プロモーター同様にラクトコッカスナイシンプロモーター（Ｅｉｃｈｅｎｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：２７６３‐２７６９（１９９８））が、誘導発現を亢進するために使用できる。更に、酸又はアルカリ誘導プロモーターが、使用できる。例えば、膣の比較的酸性の条件下で活性であるプロモーター（例えば、米国特許第６，２４２，１９４号で記載されるもの）が、使用できる。あるいは、プロモーターは、精液に反応して膣中で変化が誘導されることを使用できる。例えば、アルカリ誘導プロモーターは、精液の導入に起因する膣のアルカリ条件の増加に反応して発現を誘導するために使用される。

様々なシグナル及びアンカー配列が、膜、細胞外空間又は細胞壁にポリペプチドの発現を誘導することが知られている（例えば、ペプチドグリカンに対する共有結合）。典型的なシグナル配列は、Ｌ．アミロボラス（ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）（Ｇｉｒａｕｄ＆Ｃｕｎｙ，Ｇｅｎｅ １９８：１４９‐１５７（１９９７））のα‐アミラーゼ由来のシグナル配列、又はＬ．クリスパタスのＳ‐ｌａｙｅｒ遺伝子（ｃｂｓＡ）由来のシグナル配列（例えば、ＭＫＫＮＬＲＩＶＳＡＡＡＡＡＬＬＡＶＡＰＶＡＡ（配列番号３）又はＭＫＫＮＬＲＩＶＳＡＡＡＡＡＬＬＡＶＡＴＶＳＡ（配列番号４））を含む。シグナル配列は、典型的にポリペプチドのアミノ末端に位置する。

アンカー配列は、典型的にコードされたタンパク質配列のカルボキシ末端に位置する。アンカー配列は、例えば、細胞壁関連配列；配列ＬＰＱ（Ｓ／Ａ／Ｔ）（Ｇ／Ａ）、ここで括弧中の残基が、その位置で異なるオプションを示し；及び疎水性配列、及び場合により荷電配列を含む。いくつかの実施態様では、アンカー配列は、以下：
ＶＴＲＴＩＮＶＶＤＰＩＴＧＫＩＳＴＳＶＱＴＡＫＦＴＲＥＤＫＮＳＮＡＧＹＴＤＰＶＴＧＫＴＴＭＮＰＷＴＰＡＫＱＧＬＲＡＶＮＶＥＱＩＫＧＹＶＡＫＶＤＧＮＶＤＡＶＶＶＴＰＤＳＡＮＭＶＶＴＩＴＹＱＡＮＫＰＥＧＱＮＩＴＮＫＫＤＴＶＰＤＰＡＤＧＩＫＮＫＤＤＬＰＤＧＴＫＹＴＷＫＥＶＰＤＶＮＳＶＧＥＫＴＧＩＶＴＶＴＦＰＤＧＴＳＶＤＶＫＶＴＶＹＶＤＰＶＶＥＳＮＲＤＴＬＳＫＥＡＮＴＧＮＴＮＶＡＫＡＡＴＶＴＳＳＫＶＥＳＫＫＴＬＰＱＴＧＳＫＴＥＱＶＧＩＬＧＬＡＩＡＴＶＧＳＬＬＧＬＧＶＮＲＫＫＲＱＫ（配列番号５）；又は
ＫＫＡＥＥＶＫＮＮＳＮＡＴＱＫＥＶＤＤＡＴＮＮＬＫＱＡＱＮＤＬＤＧＱＴＴＤＫＳＫＬＤＥＡＩＫＳＡＤＤＴＫＳＴＤＫＹＮＮＡＳＤＤＴＫＳＫＦＤＥＡＬＫＫＡＥＥＶＫＮＮＳＮＡＴＱＫＥＶＤＤＡＴＫＮＬＫＱＡＱＮＤＬＤＧＱＴＴＮＫＤＡＩＮＤＡＩＫＤＡＮＮＡＫＧＴＤＫＹＮＮＡＳＤＤＴＫＳＫＤＤＡＬＫＫＡＥＤＶＫＮＤＳＮＡＮＱＫＥＶＤＤＡＴＫＮＬＫＮＴＬＮＮＬＫＧＱＰＡＫＫＡＮＬＩＡＳＫＤＮＡＫＩＨＫＱＴＬＬＰＱＴＧＴＥＴＮＰＬＴＡＩＧＩＧＬＭＡＬＧＡＧＩＦＡＫＫＫＲＫＤＤＥＡ（配列番号６）、又は配列番号５又は配列番号６と実質的に同一の配列
を含む。

ポリペプチドの正確な局在及びフォールディングは、標準方法を使用して決定できる。例えば、ラクトバチルスの細胞壁濃縮分画は、細菌を緩衝溶液（例えば、２５％スクロース、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ、ｐＨ８．０）中に懸濁し、その後細胞壁分解酵素（例えば、リゾチーム及びムタノリシン）で処理し、及びその後、分画遠心分離（Ｐｉａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：３０６８‐３０７２（１９９７））により生じたプロトプラストを分離することにより、得ることができる。分画は、その後、細胞壁内での発現を確認するために、ウェスタンブロットによりスクリーニングできる。

発現したポリペプチドのフォールディング及び生理活性は、標準方法を使用してまた決定できる。例えば、自然に折り畳まれたポリペプチド特異的な抗体を使用するＥＬＩＳＡアッセイは、ポリペプチドのフォールディング及び３次元構造を確認するために使用できる。生理活性アッセイは、もちろんポリペプチドの活性に依拠して、変化するであろう。例えば、精子と結合するポリペプチドのために、発現したポリペプチドは、標準結合アッセイを使用して試験できる。

宿主細胞での改良された発現のために遺伝子を合成する場合、そのコドン使用頻度を、宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近づくように設計することが望ましい。宿主細胞により使用されることから合成遺伝子のための好ましいコドン使用頻度のパーセント偏差は、最初に宿主細胞のものからシングルコドンの使用頻度のパーセント偏差を決定することにより、続いてコドン全体にわたって平均偏差を得ることにより計算した。

特定のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、特定の宿主のコドン使用頻度に合わせて変更できる。例えば、ラクトバチルスのコドン使用頻度は、本発明のポリペプチドをコードし、及び好ましいラクトバチルスコドンを含むポリヌクレオチドを得るために使用できる。宿主細胞により示される好ましいコドン使用頻度は、宿主細胞により発現された多くの遺伝子について好ましいコドン使用頻度を平均化することにより計算できる。この分析は、好ましくは、宿主細胞により高度に発現された遺伝子に限定される。Ｐｏｕｗｅｌｓ＆Ｌｅｕｎｉｓｓｅｎ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：９２９‐９３６（１９９４））は、例えば様々なラクトバチルス種により示された高度に発現された遺伝子によりコドン使用頻度を提供する。コドン使用頻度表は、インターネットを通じてまた入手できる。

他の実施態様では、本発明により企図されるベクターは、マーカーポリペプチドをコードする異種核酸配列の挿入を更に含む。マーカーポリペプチドは、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＤＳ‐Ｒｅｄ（赤色蛍光タンパク質）、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、ベータ‐ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、又は当業者に公知の任意の他のレポータータンパク質を含んでもよい。

有益な励起及び蛍光スペクトルを有する様々なオワンクラゲ関連ＧＦＰ（複数）は、オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）由来の天然ＧＦＰのアミノ酸配列を修飾することにより改変されてきた（Ｐｒａｓｈｅｒ ｅｔ ａｉ．，１９９２，Ｇｅｎｅ，１１１：２２９‐２３３；Ｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９１：１２５０１‐１２５０４；ＰＣＴ／ＵＳ９５／１４６９２）。

発現の結果、異種生物内に殺精子化合物をコードする配列を有する核酸の伝達は、一つの実施態様である。

発現産物の検出のための方法は、当該技術分野において周知であり、及び、一つの実施態様では、ノーザンブロット、ＰＣＲ、ＨＰＬＣ、質量分析法、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ又はウェスタンブロット分析を含んでもよい（「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」，ＶｏｌｕｍｅＩ−ＩＩＩ Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」ＶｏｌｕｍｅＩ−ＩＩＩ Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓ ｅｔ ａｌ（ｅｄｓ）を参照）。

いくつかの実施態様では、抗生物質耐性カセットは、導入されたコンストラクトの発現を確認するためのマーカーとして本明細書中に記載されたように生物中に導入されてもよい。いくつかの実施態様では、抗生物質感受性カセットは、対象内に導入されたコンストラクトのための安全プロトコルとして、生物中に導入され、及びいくつかの実施態様では、避妊効果の解消のために、例えば、短期抗生物質治療として対象に注射することにより、生物学的避妊を除去し、受胎のための安全な方法を容易にする。

本発明は、いくつかの実施態様では、殺精子化合物を発現する改変細胞を提供する。一つの実施態様では、殺精子化合物は、精子の運動性、精子‐卵子融合又は精子の卵子に対する侵入、又はそれらの組合せを効果的に防止する、精子の抗体、又はその断片を含む。

抗体は、例えば、完全な（ｉｎｔａｃｔ）イムノグロブリンとして、又は多数の十分特徴付けられた断片として存在する。いくつかの実施態様では、ｓｃＦｖ断片は、改変生物、組成物、キットの一部として及び本発明の方法に従って使用するために企図される。いくつかの実施態様では、他の企図された断片は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’モノマーを含む。Ｆａｂ’モノマーは、本質的にヒンジ領域の一部を有するＦａｂである（Ｐａｕｌ（Ｅｄ．）Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９３）及び他を参照）。様々な抗体断片が、完全な抗体の消化の観点から定義される一方で、当業者は、そのような断片が、化学的又は組換えＤＮＡ手法を利用することのいずれかにより、デノボ合成されてもよいことを理解するであろう。従って、抗体という用語は、本明細書中で使用する場合、抗体全体の修飾により生成されるか、又は組換えＤＮＡ手法（例えば、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ））を使用してデノボ合成されたもののいずれかの抗体断片をまた含む。

そのような細胞の調製の具体的な方法は、本明細書中で記載されるが、しかしながら、当業者は、任意の殺精子化合物、又は化合物の組合せが、共生生物中で、組換えで生成されてもよいことが理解されるであろう。

いくつかの実施態様では、殺精子又はその他では、様々な動物種について、精子の運動性、又は精子‐卵子融合能力、又は精子による卵子侵入を阻害する抗体断片が使用される。例えば、及びいくつかの実施態様では、抗体断片、例えばｓｃＦｖは、特に高度に保存された精子特異的エピトープと相互作用し、そしてそれはインビボ効率試験が、動物モデルについて行われてもよいように、動物種及びヒトにおいて保存されており、及び同じ抗体断片、例えば、ヒトｓｃＦｖ又はそのヒト化バージョンの検証は、ヒト臨床試験において実施されてもよい。

いくつかの実施態様では、そのような抗体／抗原断片は、本明細書中で例示されているように生成されるか、又はＸｕ，ｅｔ ａｌ．ＡｒｃｈＡｎｄｒｏｌ．１９９４ Ｓｅｐ‐Ｏｃｔ；３３（２）：１４１‐４；Ｃｌａｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ａｎｄｒｏｌ．１９９５ Ｊｕｌ‐Ａｕｇ；３５（１）：２１−７；ＷＯ０１０７０８３Ａ１；米国特許第５，８３０，４７２号、第５，７５３，２３１号、第５，２２７，１６０号に記載されているように生成されるか、又は当業者により理解されるような任意の適当な方法により生成される。そのような化合物を発現するための共生生物の改変は、任意の方法、同様に、例えばＰＮＡＳ １０２：１１９９３‐１１９９８（２００３）で記載されるように遂行されてもよい。

完全なヒト抗体（複数）／抗体断片は、ヒト女性での避妊における応用のために特に望ましい。ヒト抗体（複数）／抗体断片は、ヒト免疫グロブリン配列由来の抗体（複数）／抗体断片ライブラリーを使用して本明細書中に記載されたファージディスプレイ方法を含む当該技術分野において公知の様々な方法により生成できる。米国特許第４，４４４，８８７号及び第４，７１０，１１１号；及びＷＯ９８／４６６４５；ＷＯ９９／５０４３３；ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９８／１６６５４；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；及びＷＯ９１／１０７４１を参照し、そしてそれぞれ、その全体について引用により本明細書中に取り込まれ、及び本明細書の以下で提供される実施例を含む。本明細書中で記載される任意の引用は、引用によりそこへ全体について取り込まれるために企図されることが理解されるべきである。

ヒト抗体又は抗体断片、例えばｓｃＦｖは、機能的内因性免疫グロブリンを発現することができないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現できるトランスジェニックマウスを使用してまた生産できる。ヒト抗体を生産するためのこの技術の概要は、Ｌｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ，１９９５を参照する。ヒト抗体及びヒトモノクローナル抗体を生産するための、この技術の詳細な説明並びにそのような抗体及びそれらの断片を生産するためのプロトコルは、ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；ＥＰ０５９８８７７；米国特許第５，４１３，９２３号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，５６９，８２５号；第５，６６１，０１６号；第５，５４５，８０６号；第５，８１４，３１８号；第５，８８５，７９３号；第５，９１６，７７１号；及び第５，９３９，５９８号を参照し、そしてそれらは、それらの全体について本明細書中に引用により取り込まれる。更に、Ａｂｇｅｎｉｘ社（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｋｉｒｉｎ株式会社（Ｊａｐａｎ）、Ｍｅｄａｒｅｘ（ＮＪ）及びＧｅｎｐｈａｒｍ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ．）などの企業が、上記と同じような技術を使用して選択された抗原に対するヒト抗体を提供するために従事できる。

本発明の抗体は、本方法及び抗体断片を生産するためにＤａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（米国特許第４，１７９，３３７号）により記載されたカップリング剤によりまた修飾してもよく、そしてそれは実質的に全く免疫原性反応を誘導しない。

いくつかの実施態様では、本発明は、本明細書中で記載したような改変細菌を含む組成物を提供する。

いくつかの実施態様では、本組成物は、本明細書中で記載したような改変細菌を含んでもよく、ここで本組成物は、異なる異種抗精子剤を発現する細菌を含み、及び更に投与単位用量の一部として同じ組成物内に含まれる。いくつかの実施態様では、異なる異種抗精子剤を発現するそのような細菌は、断片が結合する抗原又はエピトープに関して変化してもよく、又はエピトープに対する親和性に関して変化してもよく、又はそれが由来するアイソタイプ、又はそれらの組合せに関して変化してもよい。

いくつかの実施態様では、そのような組成物は、同じ又は異なる異種抗精子剤を発現する異なる細菌株をまた含んでもよく、そしてそれらは、投与単位用量の一部同様に、同じ組成物内に含まれる。

いくつかの実施態様では、組成物は、膣座薬、液体、スプレー、泡、クリーム、ムース、又は膣送達用の任意の好適なビヒクルの形態である。

いくつかの実施態様では、改変細菌又は同じ細菌を含む組成物は、膣リング内に適用し又は取り込まれ、そしてそれは、その後、女性対象に投与される。いくつかの実施態様では、本発明は、コンドームの装着者が、性交の間、彼の女性パートナーに改変細菌を伝達してもよいように、コンドームの外表面に適用され及び保存された改変細菌又は同じ細菌を含む組成物を含むコンドームを企図する。

いくつかの実施態様では、用語「含む（Ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」又はその文法形式は、本発明の改変共生生物又は本明細書中に記載されたファージなどの示された活性剤の包含、同様に他の活性剤、及び医薬品産業で公知であるような医薬的に許容された担体、賦形剤、エモリエント、安定剤などの包含を指す。いくつかの実施態様では、用語「本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、活性成分のみが、示された活性成分である、すなわち、本明細書中で記載されたような改変共生生物のような組成物を指すが、しかしながら他の薬剤／構成成分／化合物が、避妊効果について直接的に関与しないが、製剤を安定、保存するために含んでもよい。いくつかの実施態様では、用語「本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、避妊有効性若しくは避妊有効性の延長、又は両方を強化する、改変共生生物のものと異なる機序を介して避妊効果を発揮する成分を指してもよい。いくつかの実施態様では、用語「本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、例えば座薬製剤又は他の製剤から、改変共生生物の放出を亢進することにより、その放出を容易にし、効果的な定着を亢進し、均一の定着を亢進し、及び改変共生生物の活性を容易にする他の望ましい効果を亢進し、更に改変共生生物ではない成分を指してもよい。いくつかの実施態様では、そのような薬剤は、コードされた抗精子剤の発現を誘導する薬剤を含んでもよく、又はいくつかの実施態様では、コードされた抗精子剤の発現を亢進する薬剤を含んでもよい。いくつかの実施態様では、用語「なる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」は、活性成分及び医薬的に許容された担体又は賦形剤を含む組成物を指す。

所望する粘膜表面に対する細菌の送達は、領域の接近可能性及び局所の状況に依拠する。例えば、改変細菌は、膣粘膜の上に送達するために食塩水中、クリーム、座薬又は泡中に入れられてもよい。泡は、セルロース誘導体及びキトサンなどの１又は２以上の疎水的に修飾されたポリサッカライドを含んでもよい。セルロース誘導体は、例えば、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロースなどを含む。キトサンは、例えば、以下のキトサン塩；キトサンラクテート、キトサンサリチレート、キトサンピロリドンカルボキシレート、キトサンイタコネート、キトサンナイアシネート（ｎｉａｃｉｎａｔｅ）、キトサンホルメート、キトサンアセテート、キトサンガレート、キトサングルタメート、キトサンマレエート、キトサンアスパルテート、キトサングリコレート及び第四級アミン置換キトサン及びその塩などを含む。泡は、水、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、グリセリン、グリセロール、プロピレングリコール、及びソルビトールなどの他の成分をまた含んでもよい。殺精子剤は、場合により細菌組成物中に含まれる。更に、泡及び泡送達ビヒクルの例は、例えば、米国特許第５，５９５，９８０号及び第４，９２２，９２８号中に記載される。

いくつかの実施態様では、細菌は、座薬又はペッサリーとして送達できる。米国特許第４，３２２，３９９号を参照。いくつかの実施態様では、本発明の細菌は、米国特許第６，４６８，５２６号に記載されるような保存マトリックス中に調製され、及び使用前に実質的に固体形態で維持し、及び所望する放出時間及び用量で薬剤材料を放出するために使用の間、体温及び水分により溶解するような、溶解特性のために選択された可溶性ポリマー材料及び／又は複合炭水化物材料からなる可溶性エレメント中に送達される。例えば、米国特許第５，５２９，７８２号を参照。細菌は、米国特許第４，６９３，７０５号中に記載されたようなスポンジ送達ビヒクルについてまた送達できる。

いくつかの実施態様では、粘膜表面に対する改変バクテリアの適用は、定期的に繰り返す必要があり、最適な投与間隔を決定することが通常であるが、異なる粘膜環境及び細菌株で変化するであろう。投与間隔は、いくつかの実施態様では、１日１回から２‐４週毎に１回又はそれ以上、変化できる。いくつかの実施態様では、投与が、それにより処置されるメスにおいて排卵前に定着を最適化するために、生理の休止又はほぼ休止に続くように、投与は、メスの生理周期に従うであろう。

いくつかの実施態様では、ここでバクテリオファージが、天然ラクトバチルスを形質転換するために導入され、選択されたバクテリオファージの核酸は、異種遺伝子（複数）が、バクテリオファージコートタンパク質をコードする遺伝子を置換するように、改変されてもよく、このことはバクテリオファージ複製欠損をもたらす。機能的バクテリオファージタンパク質を含む細胞溶解物内に、これらの組換えＤＮＡ分子を添加することは、異種遺伝子（複数）を運ぶ機能的バクテリオファージ粒子の集合につながるであろう。これらの複製欠損バクテリオファージ粒子は、その後、選択された細菌叢を感染させるために所望する粘膜表面上に導入できる。典型的な用量は、粘膜表面に１０⁸‐１０¹²ＰＦＵ／ｍｌで適用されるであろう。処置される表面に対する溶液の割合は、粘膜表面１ｃｍ²あたり、約０．１‐１．０ｍｌであるべきである。ビヒクルは、細菌用に上記したビヒクルと同じであろう。

いくつかの実施態様では、本発明は、避妊方法を提供し、前記方法は、本明細書中で記載したような改変細菌とメス生殖管の細胞と接触する工程を含む。いくつかの実施態様では、本態様によれば、本方法は、それを必要とするメス対象の生殖管に対して、改変された細菌を含む組成物を投与することを含み、いくつかの実施態様では、本明細書中で記載されたような組成物を含む。いくつかの実施態様では、本発明は、また本明細書中で記載したようなバクテリオファージでメス生殖管と接触することをまた提供し、そしてそれは、順に、本明細書中で記載したような改変細菌を得るために、インサイチュで共生細菌叢の改変につながる。

いくつかの実施態様では、用語「接触すること（ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ）又は投与すること（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」は、示された材料に直接及び間接両方で曝露することを指す。

いくつかの実施態様では、メス生殖管に対する投与単位用量は、１０⁵‐１０⁹の範囲の組換え細菌であってもよい。いくつかの実施態様では、そのような最適な用量は、１０⁷‐１０⁹の範囲の組換え細菌、又は１０⁶‐１０⁸組換え細菌、又は１０⁸‐１０⁹組換え細菌であってもよい。

効果的な避妊を実証するための様々な方法が、当該技術分野で公知であり、そしてそれらのすべてが、本発明において有用であることが考慮されるべきであり、そしてそれらのいくつかが、本明細書中で例示される。

いくつかの実施態様では、本発明の生物避妊薬の避妊効果は、本発明の避妊薬を投与されたメス動物により、繁殖周期あたり生まれた子孫の数を評価することにより決定される。例えば、マウスに対して生物避妊薬の投与１‐３日後、個々のメスマウスを、オスマウスと一緒にケージ中に入れる。オスマウスは、交配後、１‐７日後に取り除く。その後、メスマウスが、子を出産するのを毎日観察する。投与された避妊薬の避妊効果を、投与後の子孫の低減及び／又は一腹産仔数の低減により決定する。例えば、平均一腹から3又は4以上の子孫（例えば、非近交系の血統を使用した場合、本明細書下で例示されたように、マウスにおいて、平均一腹産仔数は、１１又は１２以上の子孫である）を生む動物種のために、避妊タンパク質は、１０％‐１００％、３０％‐１００％、又は５０％‐１００％、又は６０％‐１００％、７０％‐１００％、又は８０％‐１００％、又は９０％‐１００％、又は９５％‐１００％、又はそれ以上で、妊娠率又は一腹産仔数について低減する場合、効果的であると考えられる。本明細書中で例示されるように、Ｊ１０２を発現するＬ．ジョンソニ株の避妊効果を評価する場合、少なくとも５０％の避妊の有効性が見られ、及び更に、本明細書中で行われる定着試験では、マウスの約５０％が、ラクトバチルスでよく定着したので、従って、ラクトバチルス定着に対してより受容可能であることが公知である他の動物では、より高い避妊の効果を有することが期待される。

避妊薬は、仮に少なくとも５０％まで一腹産仔数について低減があれば、有効と考えられ、図７は、抗精子剤を発現する改変共生生物を含む、効果的な生物メス避妊薬の生産を示す。

いくつかの実施態様では、本発明の避妊薬の有効性は、粘膜分泌物について発現した抗体のレベルを測定することにより決定してもよい。避妊薬の有効性は、例えば、性交後採取された分泌物について、免疫組織化学的手法により、精子と結合した抗体を可視化することで、また評価してもよい。

本明細書中で例示したように、マウスを、抗精子ｓｃＦｖを発現するＬ．ジョンソニで定着する場合、５０‐５８％の間の低減が妊娠率に見られ、及びケージあたり生まれる子孫の数について一致した低減が見られ、それにより、同様に、マウスあたりも歴然としていた。

一つの実施態様では、抗精子剤を発現する共生生物は、更に薬剤を発現するために改変してもよく、そしてその薬剤は、性感染症の原因となる生物で処置されたメスの感染に対して有効である。一つの実施態様では、性感染症の原因となる生物は、クラミジア、ＨＩＶ、ＨＰＶ、及び当業者により理解されるような他の生物である。

一つの実施態様では、性感染症の原因となる生物で処置されたメスの感染に効果的であるそのような薬剤は、生物による感染を干渉してもよく、又は他の実施態様では、そのような薬剤は、感染の発生又は負荷を低減してもよい。いくつかの実施態様では、そのような薬剤は、生物による感染の発症を干渉してもよい。性感染症の原因となる生物で処置されたメスの感染に対して有効である任意の薬剤の更なる組み込みが、本文脈において予想され、及び本発明の一部として考慮されることが理解されるべきである。

本態様に従って、及びいくつかの実施態様では、本発明の避妊薬は、コンビナトリアル避妊薬‐抗ＳＴＤ治療として見なされてもよい。

本発明の改変共生生物が、例えば、抗クラミジアｓｃＦｖ、又は抗ＨＰＶ若しくは抗ＨＩＶ ｓｃＦｖ、又はシアノビリンなどの他の抗ＨＩＶ剤を発現するために、更に改変されてもよいことが企図される一方で、女性生殖器官の野生型ラクトバチルスの定着の存在が、ＳＴＤ感染症に対しての防御であることが理解される。抗精子剤を発現する本発明の改変された生物が、本明細書中で記載したようなそのような生物を使用する女性集団において性感染症の発生を低減するために、野生型ラクトバチルス単独と同程度有効であり、いくつかの実施態様では、野生型ラクトバチルス単独よりも、本明細書中で記載したようなそのような生物を使用する女性集団において性感染症の発生を低減するためにより効果的であることがまた考慮される。

本発明の任意の及びすべての方法に適用できるような、本明細書中に記載された任意の実施態様が、本発明の一部として考慮されるべきことが理解されるであろう。本明細書中に記載されたすべての刊行物及び特許出願は、それぞれ個々の刊行物及び特許出願が、引用により取り込まれるために具体的かつ個別的に示されるように、引用により本明細書中に取り込まれる。

形態及び詳細についての様々な変化が、添付された請求項に記載されるような発明の主旨及び範囲から逸脱することなくその中になされてもよいことが当業者により理解されるであろう。当業者は、ただのありふれた実験を使用して、本明細書中で記載された発明の特定の実施態様に対する多くの均等物を認識し、及び解明できるであろう。そのような均等物は、請求項の範囲に包含されることが意図される。

「一つの（ａ）」、「一つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」などの本明細書中の物品に対する言及は、文脈から反対、又は他に明確に示されない限り、１又は２以上を意味することが理解されるであろう。群のメンバーの間で「又は（ｏｒ）」又は「及び／又は（ａｎｄ／ｏｒ）」を含む請求項又は明細書は、文脈から反対、又は他に明確に示されない限り、仮に１、１超、又は群のメンバーのすべてが存在し、使用され、又はその他の面では、与えられた産物又は方法に関係があるならば、考慮され、充足される。本発明は、群の正確に１のメンバーが、存在し、使用され、又はその他の面では、与えられた産物又は方法に関係がある実施態様を含む。本発明は、２以上又は群のメンバーのすべてが、存在し、使用され、又はその他の面では、与えられた産物又は方法に関係がある実施態様をまた含む。更に、本発明は、そのほかの面では、示されない限り、又は矛盾又は不一致が生じるであろうことが当業者に明確である場合を除いて、様々な実施態様において、１又は２以上の列挙された請求項からの１又は２以上の制限、要素、条項、記述的な用語などが、同じ基本請求項に従属する他の請求項内に取り込まれるすべてのバリエーション、組合せ、及び置換を提供することが理解されるべきである。要素がリスト、例えばマーカッシュ形式などのように存在する場合、要素のそれぞれの下位集団（ｓｕｂｇｒｏｕｐ）がまた開示され、及び任意の要素（複数）が、群から削除できることを理解すべきである。一般的に、本発明、又は本発明の態様が、特定の要素、特徴などを含むように言及される場合、本発明のある実施態様又は本発明の態様は、そのような要素、特徴などからなり、又は本質的になる。簡単にする目的のために、それらの実施態様は、ある程度の事例について、本明細書中で、これらの言葉で具体的に説明される。特定の請求項は、便宜上、従属形式で提示するが、出願人は、独立請求項及びそのような請求項が従属する任意の他の請求項（複数）の要素又は制限を含む独立形式について、任意の従属請求項を書き換える権利を留保し、及びそのような書き換えられた請求項は、独立形式に書き換えられる前に、たとえどのような形式であっても（補正又は未補正のいずれか）従属請求項に関してすべて均等物を考慮すべきでる。

以下は、本発明を実施／実行するための方法として、例示目的のために材料、方法、及び例を提供することを意図し、及び限定することを意図しない。

一般的に、本明細書中で使用される命名及び本発明で使用される実験手順は、分子、生化学、微生物学及び組換えＤＮＡ技術を含む。そのような技術は、文献中に十分に説明されている。例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」 Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」 Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ‐ＩＩＩ Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ，「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ」，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）「Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ」，Ｖｏｌｓ．１‐４，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号；第４，６８３，２０２号；第４，８０１，５３１号；第５，１９２，６５９号、及び第５，２７２，０５７号で説明されるような方法論；「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」 Ｖｐｌｕｍｅｓ Ｉ‐ＩＩＩ Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），「Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）；Ｍｉｓｈｅｌｌ ａｎｄ Ｓｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ），「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）を参照し；利用可能な免疫アッセイは、特許及び具体的な文献中に広範に記載され、例えば、米国特許第３，７９１，９３２号；第３，８３９，１５３号；第３，８５０，７５２号；第３，８５０，５７８号；第３，８５３，９８７号；第３，８６７，５１７号；第３，８７９，２６２号；第３，９０１，６５４号；第３，９３５，０７４号；第３，９８４，５３３号；第３，９９６，３４５号；第４，０３４，０７４号；第４，０９８，８７６号；第４，８７９，２１９号；第５，０１１，７７１号、及び第５，２８１，５２１号を参照し；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」 Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．，ｅｄ．（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」 Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ．（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」 Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｓ． Ｊ．， Ｅｄｓ．（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」 Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，ｅｄ．（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」 ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）；「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」 Ｐｅｒｂａｌ， Ｂ．，（１９８４）ａｎｄ 「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」 Ｖｏｌ．１‐３１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋ ｅｔ ａｌ．，「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ‐Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ」ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ （１９９６）を参照し、本明細書中で十分に記載されているように、引用によりそれらのすべてが取り込まれる。他の一般的な引用は、本文書全体を通して提供される。本明細書中の手順は、当該技術分野で周知と考えられ、及び読者の便宜のために提供される。その中に含まれるすべての情報は、引用により本明細書中に取り込まれる。

実施例１：抗ヒト精子抗体の調製
タージトール（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ）ＮＰ‐４０界面活性剤可溶化ヒト精巣上体精子の免疫を持つＢａｌｂ／ｃマウス由来のリンパ球とＰ３‐Ｘ６３‐Ａｇ８‐６５３マウス骨髄腫細胞を融合することにより、ヒト精子抗原に対するモノクローナル抗体を調製する。これらのハイブリドーマを注射したマウス由来の腹水を、間接蛍光抗体法について、メタノール固定精子が陽性であるアクロソーム及び非固定精子が陽性である形質膜用に試験する。ネズミ及びウサギ精子と交差反応性の抗体を検証する。

受精抗原、ＦＡ‐１を、記載されたようなモノクローナル抗体、ＭＡ‐２４（Ｎａｚ，Ｒ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．（１９８６）８３（１５）：５７１３‐７）を使用して、免疫アフィニティークロマトグラフィーにより試験されたデオキシコレート可溶化又はリチウムジヨードサリチレート可溶化ネズミから精製する。ＦＡ‐１に対する更なるモノクローナル抗体を、上記のように調製し、及びヒト及びウサギ精子との交差反応を、同様に検証する。

実施例２：抗ヒト精子抗体のクローニング
ＲＮＡ調製
殺精子又は精子運動性を低減するハイブリドーマ細胞分泌抗体を選択する。１０百万細胞を、ＦａｓｔＴｒａｃｋ２．０ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＲＮＡ回収のために処理するように、細胞を増殖し及びカウントする。全ＲＮＡを、界面活性剤溶解及びタンパク質分解緩衝液を使用して細胞から直接単離する。Ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを、その後、ｍＲＮＡがオリゴｄＴ樹脂と結合する改変Ａｖｉｖ及びＬｅｄｅｒプロトコルを使用して単離する。樹脂を、その後、外来の全ＲＮＡを除去するために、低塩緩衝液で洗浄し、及びｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを、樹脂から溶出する。２６０ｎｍ及び２８０ｎｍでの分光光度分析は、ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡの最終濃度を示す。

Ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡの逆転写及び増幅
抗体のエピトープ認識領域又は相補性決定領域（ＣＤＲｓ）を同定し、及びＩｇ重鎖及び軽（カッパ）鎖サブユニットをプローブするオリゴヌクレオチドを設計する。

重鎖オリゴを、Ｉｇ‐Ｐｒｉｍｅ ｋｉｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）から得、及び１．０μｇ／μｌの最終濃度にｄＨ₂Ｏで、希釈した。

それぞれのｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡハイブリドーマの逆転写及びポリメラーゼ連鎖反応増幅を、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＡｃｃｅｓｓ ＲＴ‐ＰＣＲシステムを使用して、単一の反応で実行した。簡単には、ハイブリドーマｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ ５μｇ、それぞれの適当なプライマー（重鎖用としてプライマー１及び２、軽鎖用としてプライマー３及び４）１μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰミックス １μｌ、５×ＡＭＶ逆転写緩衝液１０μｌ、２５ｍＭ ＭｇＳＯ₄ ２μｌ、ＡＭＶ逆転写酵素 １μｌ、Ｔｆｌポリメラーゼ １μｌ、及びヌクレアーゼ不含ｄＨ₂０ ３０μ１を、０．５ｍｌマイクロチューブ中で混合する。ＰＣＲ反応を、標準方法に従って行い、及びサイクル温度及び時間を最適化する。増幅産物を、アガロースゲルで分析し、及びゲル精製する。

抗体クローニング及び配列決定
ゲル精製産物を、適当なベクター内にサブクローニングし、そしてそれは、産物の高収率を産生する。ベクター、緩衝液、ｃＤＮＡ及びＴ４ＤＮＡライゲースを、室温で１時間インキュベートし、及びその後６５℃で１０分間加熱する。大腸菌スーパーコンピテントセルを使用し、及びＤＮＡを細胞に添加し、及び氷上でインキュベートし、その後４２℃で加熱し、及びＳＯＣ培地を添加する。細胞を、その後３７℃で、１時間、振とうウォーターバス中で、インキュベートする。こられの細胞を、その後、選択化合物を含むＬＢ培地のペトリ皿上に播き、及び３７℃で終夜インキュベートする。陽性クローンを選び、及びプラスミド精製のために生育した。

プラスミドを、メーカーの説明書に従って、Ｑｉａｇｅｎ‐ｔｉｐ ２０ カラムを使用して精製した。

精製したプラスミド中にｃＤＮＡインサートの存在を確認するために、それぞれのクローンを適当な制限酵素で消化し、及び消化プロトコルを、アガロースゲル上で泳動する。インサートを含むクローンを、配列決定した。

重及び軽鎖クローンの配列分析
陽性クローンを、メーカーの説明書に従って、Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ｋｉｔ（Ｏｎｃｏｒ）を使用して配列決定する。プラスミドＤＮＡ、プライマー（例えば、ｐＣＲ‐Ｓｃｒｉｐｔベクター上の５’クローニング部位の上流に位置するＴ３プライマー）、及びｄＨ₂Ｏからなる配列決定反応物（ｒｅａｃｔｉｏｎ）、そしてそれを、アニーリング緩衝液を添加して、９５℃で５分間加熱し、及び反応物を、３７℃で１５分間インキュベートする。反応物を付加反応緩衝液、３３ＰαＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、及びｄＨ₂Ｏにより標識し、及び４００℃で１５分間インキュベートし、その後、Ａ、Ｃ、Ｇ、又はＴ終止（ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）ミックスを添加し、及び４０℃で５分間インキュベートする。反応を、プロテイナーゼＫ溶液の添加により停止し、及びアクリルアミド配列決定ゲルにロードする前に、９５℃で加熱する。ゲルを、その後２０００ボルトで２時間泳動し、真空下、Ｗｈａｔｍａｎ ３ＭＭ濾紙上で乾燥し、及び室温で終夜、Ｘ線フィルムに曝露する。フィルムの現像後、ゲルをライトボックス上で読み込んだ。

配列決定は、自動化ＤＮＡシーケンサー（例えば、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３３７）を使用して、また行ってもよい。それぞれのクローンについて、ｃＤＮＡ及びプライマーを、４色素標識ジデオキシヌクレオチド及びＡｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼＦＳと結合する。反応物全体を、３６ｃｍ ｗｅｌｌ‐ｔｏ‐ｒｅａｄ ５．０％アクリルアミドゲル上で、電気泳動のために単一のレーンについてロードする。泳動された個々の断片のリアルタイム検出を、産物を画像化するためにＣＣＤカメラで、レーザースキャニングで達成する。

ＭｃＣｒａｃｋｅｎ Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．１７３：３８３−３８９；Ｐｅｒｅｚ‐Ｃａｓａｌ，ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８：８０９‐８１９；Ｋｒｕｇｅｒ C．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０：７０２‐７０６；Ｒａｏ，Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，（２００５）ＰＮＡＳ １０２：１１９９３‐１１９９８；Ｌｉｕ Ｘ．ｅｔ．ａｌ．（２００６）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ５０：３２５０−３２５９；ｄｅｌ Ｒｉｏ Ｂ．ｅｔ．ａｌ．（２００８）Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１５：１４２９−１４３５；米国特許第７，３１２，０７６号、又はＥｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．１ ０１１ ７２１ Ｂｌにおいて記載されるような発現ベクターを得、又はそれらのバリエーションを、当該技術分野において公知の方法により調製する。

あるいは、ベクターを以下のように構築できる。シャトルベクターを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ由来の大腸菌の複製起点をバックボーンにサブクローニングすることにより作製し（Ｆｏｎｓ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｌａｓｍｉｄ ３７，１９９‐２０３）、及びその後Ｍ６コード領域の全長（ＰｓｔＩ）を除去する。このプラスミドを、ＳｍａＩで消化し、ＮｄｅＩで部分消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩにより生め（クレノウ断片）、及び自己連結する。生じるプラスミドを、ラクトバチルス適合性複製起点（ｒｅｐＡ）及び正の選択マーカー、例えば、抗生物質耐性遺伝子を含み、及び様々な乳酸菌種において異種タンパク質の発現のために使用する。

ベクター内への増幅抗体断片のクローニング
重及び軽鎖に対応する増幅産物を、ゲル精製し、及びｄＨ₂Ｏに再懸濁する。抗体は、最適なラクトバチルスコドン使用頻度により密接に一致するようにアセンブリＰＣＲ（Ｓｔｅｍｍｅｒ Ｗ．Ｐ．ｅｔ ａｌ，（１９９５）Ｇｅｎｅ １６４：４９‐５３）により再コードしてもよい。

発現カセットを、ＰＣＲ増幅により構築し、及びベクターの適当な部位内にサブクローニングする。カセットは、ラクトバチルス適合性プロモーターエレメント、抗体断片、分泌のためのシグナル配列、又は細胞壁アンカードメインを含む、４つのコンポーネントを含む。固有の制限部位が、５’から３’末端までのそれぞれのコンポーネントの間に、それぞれ位置する。ＰＣＲによるそれぞれのコンポーネントの増幅を、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを使用して行った。ラクトコッカスラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｃｅ）由来のＰ２３プロモーター（ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｏｓｓｅｎ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５３，２４５２‐２４５７）を、５’‐ＧＴＧＧＡＧＣＴＣＣＣＣＧＡＡＡＡＧＣＣＣＴＧＡＣＡＡＣＣＣ‐３’及び５’‐ＧＧＡＡＡＣＡＣＧＣＴＡＧＣＡＣＴＡＡＣＴＴＣＡＴＴ‐３’プライマーでの増幅により生成する。抗体の分泌を指示するために、プライマーを、５’及び３’末端それぞれに追加された固有の部位で、推定リボソーム結合部位からシグナルペプチド切断部位まで、Ｌ．クリスパタスのＳ‐ｌａｙｅｒ遺伝子（ｃｂｓＡ）を増幅するために設計する。ＭＫＫＮＬＲＩＶＳＡＡＡＡＡＬＬＡＶＡＰＶＡＡと一致する増幅されたＳ‐ｌａｙｅｒシグナルヌクレオチド配列（ＣｂｓＡｓｓ）を、その後、消化し、及び発現カセット中でクローニングするために使用する。

産物を、ベクター内に連結し、及びＴＡＡ終止コドンを、分泌を保証するためにＮ‐末端アンカーモチーフに挿入する。配列検証を、ラクトバチルス株に形質転換する前に、行う。

ラクトバチルス形質転換
細菌株及び培地。天然ヒト膣単離Ｌ．クリスパタス、Ｌ．ガセリ（ｇａｓｓｅｒｉ）、及びＬ．ジョンソニ、及び他を、健康なボランティアの膣スワブから得、又は代替的に、市販の株を、使用してもよく、及びｄｅ Ｍａｎ，Ｒｏｇｏｓａ，ａｎｄ Ｓｈａｒｐｅ（ＭＲＳ）培地又はＲｏｇｏｓａ ＳＬ培地（Ｄｉｆｃｏ）のいずれか中で、３７℃（５％ＣＯ₂／９５％空気）で培養する。タンパク質発現分析のために、Ｍｅｄｉｕｍ１９９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をまた使用する。プラスミドを、エレクトロポレーションにより、大腸菌ＤＨ１２Ｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内に導入する。プラスミド保持のために、形質転換大腸菌ＤＨ１２Ｓを、エリスロマイシン（３００μｇ／ｍｌ）を添加し、３７℃で、ＬＢ培地（Ｄｉｆｃｏ）中で生育する。プラスミドを、本質的にＬ．ｇａｓｓｅｒｉについて記載したように（Ｌｕｃｈａｎｓｋｙ，Ｊ．Ｂ．，Ｔｅｎｎａｎｔ，Ｍ．Ｃ．＆Ｋｌａｅｎｈａｍｍｅｒ，Ｔ．Ｒ．（１９９１）Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．７４，３２９３‐３３０２）、Ｌ．ジョンソニ内に、エレクトロポレーションにより形質転換した。形質転換Ｌ．ジョンソニ細菌を、エリスロマイシン２０μｇ／ｍｌを含む液体培地中で、定法で増殖する。改変ラクトバチルスを、後述のように、抗精子活性のために、プローブする。

実施例３：一連の抗精子ｓｃＦｖの生成
ライブラリーコンストラクション
精子タンパク質に対するヒトＶＨ‐ＶＬ係留可変ドメインを単離するためのヒトｓｃＦｖフィラメント状ファージディスプレイライブラリーを、使用した。ヒトｓｃＦＶライブラリーを、Ｖ Ｂａｓｅ（Ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ）で得た配列に従って、及びＢａｒｂａｓ ＆ Ｌｅｒｎｅｒ（Ｂａｒｂａｓ，Ｂａｉｎ ｅｔ ａｌ．１９９２ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９（１０）：４４５７‐６１；Ｇｒａｍ，Ｍａｒｃｏｎｉ ｅｔ ａｌ．１９９２ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９（８）：３５７６‐８０；Ｚｅｂｅｄｅｅ，Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．１９９２ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９（８）：３１７５‐９；Ｂａｒｂａｓ， Ａｍｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．１９９３ Ｇｅｎｅ １３７（１）： ５７−６２），Ｗｉｎｔｅｒ（Ｈａｗｋｉｎｓ，Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．１９９２ Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２６（３）：８８９−９６；Ｈａｗｋｉｎｓ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ １９９２ Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２２（３）：８６７−７０；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．１９９２ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ１３０：４１‐６８；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ １９９２ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ １３０：４１−６８；Ｍａｒｋｓ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．１９９２ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎ Ｙ）１０（７）：７７９‐８３；Ｍａｒｋｓ，Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．１９９２ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ２６７（２３）：１６００７‐１０；Ｍａｒｋｓ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ １９９２ Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓｔ Ｍｉｔｔ（９１）： ６‐１２；Ｏｒｌａｎｄｉ，Ｇｕｓｓｏｗ ｅｔ ａｌ．１９９２ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４：５２７‐３１；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｗａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９２ Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２７（３）：７７６−９８）により、及びＢｅｎｈａｒ研究所（Ａｚｒｉｅｌ‐Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｖａｌｅｎｓｉ ｅｔ ａｌ．２００４ Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３３５（１）：１７７‐９２）により、以前に記載された技術に従って、設計したプライマーを使用して調製した。ＰＣＲによる抗体遺伝子の増幅は、テンプレートとして、ヒト脾臓及び末梢血リンパ球ｃＤＮＡを使用して行った。本ライブラリーについて、ヒト重及び軽鎖可変ドメインのレパートリーを、ｍ１３繊維状ファージのｐ３遺伝子と融合するＶＨ‐ＶＬ人工結合分子のすべての可能な組合せを作製するために、コンビナトリアル様式で、一緒に係留し、及び融合タンパク質を、その後、典型的に平均してファージあたり単一のコピーについて、ファージ表面上に提示する。

精子抗原
ペプチドを、精子抗原ＦＡ‐１及びＹＬＰ（１２）から、それぞれ設計した。以下のペプチド１は、ＦＡ‐１から設計した３５残基ペプチドであり、及び以下のペプチド２は、ＹＬＰ（１２）ペプチドである。ペプチドを、以下に概説するプロトコルのための磁気ビーズと結合することを容易にするためにビオチン化した。ペプチド２は、ペプチド配列が、比較的短いながら、ビオチン及びペプチドの間にテザーを有する。ファージディスプレイｓｃＦｖライブラリーを、以下に概説するように両ペプチドに対してスクリーニングした。

抗体スクリーニング
ライブラリーストックを、３７℃、ＬＢ＋ＡｍＰ（１００μｇ／ｍｌ）＋１％グルコース中で生育した。ヘルパーファージＭ１３ＫＯ７を添加し、及び培養物を、１００μｇ／ｍｌ Ａｍｐ＋３０μｇ／ｍｌ ｋａｎ存在下、３０℃で終夜、ヘルパーファージと一緒にインキュベートした。培養物を４０００ＲＰＭで１０分間遠心し、及び上清を、０．４５ミクロンフィルターを通じてろ過し、及び１／５量のＰＥＧ／ＮａＣｌを、添加し、及びろ液を、最低１時間氷上に置き、その後、４０００ＲＰＭで３０分間遠心し、その後ファージ含有ペレットをＰＢＳ中に懸濁した。最低で３０分間、４％ＢＳＡでファージブロッキングを行い、及び磁気ビーズに基づく抗体選択を、Ｒ．Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｓ．Ｄｕｂｅｌ（ｅｄｓ），Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｖｏｌ．１，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ‐Ｖｅｒｌａｇ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ ２０１０，ｐａｇｅｓ ２６７‐２８７で記載されるようなプロトコルに従って、遂行した。ブロッキングを、２％ＢＳＡで最低３０分間行った。ブロッキングされたビーズを、ブロッキングされたファージに添加し、及びビーズ除去、そしてそれにより、ストレプトアビジンに結合するすべてのファージを除去する。ブロッキングされたファージを、その後３０分間ビオチンでインキュベートし、続いて３０分間、ビーズと一緒にインキュベートし、その後ビーズを捨てた。

ファージを、その後以下のペプチド：ＡＣＧＶＳＲＰＶＩＡＣＳＶＴＩＫＥＧＳＱＬＫＱＱＩＱＳＩＱＱＳＩＥＲＬ（配列番号１）‐ビオチン、及びＹＬＰＶＧＧＬＲＲＩＧＧ（配列番号２）‐ＡＨＸ‐で、１時間インキュベートし、及びその後ビーズと一緒に３０分間インキュベートし、洗浄及び溶出した。中和された溶出液を、その後ｄｈ５αＦ＋細胞で、３７℃で６０分間混合し、及びＬＢ＋１００μｇ／ｍｌ Ａｍｐ＋１％グルコースプレート上で、終夜培養した。パニング工程を、いくつかのサイクル繰り返した。

抗体断片の特異性
プローブとしてペプチドを使用して、ＥＬＩＳＡアッセイを行い、及び断片相対親和性を、Ｏ．Ｄによりアッセイした。

パニング産物ファージ（上記のように）を感染させた大腸菌ＴＧ‐１を、個々のクローンを回収するために播種した。これらのコロニーを、滅菌平底９６ウェルプレートのウェル中の１００μｌ ＹＴＡＧ培地内に入れ、及び振とう器で、１５０ＰＲＭ、３０℃で生育した。ファージ １０μｌを、ＹＴＡＧ ９０μｌ＋Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージ２．５μｌ／ｍｌ（５×１０⁸ＣＦＵ）を含む新しい９６ウェルプレート内に移し、及び振とうせずに３７℃で３０分間生育し、続いて１５０ＲＰＭで３０分間振とうした。プレートを、１４℃、４０００ＲＰＭで５分間遠心し、及び上清を捨てた。ＹＴＡＫ ２００μｌ／ウェル（カナマイシン含有）を、添加し、及びプレートを、振とう器で、３０℃、１５０ＲＰＭで終夜生育した。細菌プレートを、その後、４℃、４０００ＲＰＭで５分間遠心分離し、及びＰＢＳＴ１００μｌと混合した上清１００μｌをＥＬＩＳＡに使用した。

抗原 １００μｌ／ウェル及び対照抗原を、プレートをコートするために４℃で終夜、ＥＬＩＳＡプレート中に播種した。ＥＬＩＳＡプレートを、洗浄緩衝液（ＰＢＳＴ ３００μｌ／ウェル）で１回洗浄し、及び室温（ＲＴ）で、１時間、３％ミルク／ＰＢＳでブロックした。プレートを、洗浄緩衝液で１回洗浄した。ファージをその後プレートに添加し、及びＲＴで１時間、インキュベートし、続いて洗浄緩衝液で３回洗浄した。抗Ｍ１３ファージ抗体希釈ＨＲＰ接合抗ファージ ５０‐１００μｌ／ウェルを、添加し、及びＲＴで１時間、インキュベートした。洗浄緩衝液で３回洗浄後、ＯＰＤ基質溶液 １００μｌ／ウェルを、ＲＴで２０分間添加した。反応を、その後、１Ｍ ＨＣｌ溶液５０ｍｌで停止し、プレートを４５０ｎＭで読んだ。検出を、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）タグ化抗ファージ抗体を使用して行い、及び基質‐酵素反応で生じる色を、自動化ＥＬＩＳＡリーダーで読んだ。

室温で２時間、ＢＳＡ‐ビオチン ２μｇ／ｍｌを有するＰＢＳで、プレートをコートするための他のＥＬＩＳＡプロトコル。プレートを、ＰＢＳＴで洗浄し、続いてストレプトアビジン ２μｇ／ｍｌを有するＰＢＳで、室温で２時間、コートし、及びＰＢＳＴで再度洗浄した。プレートを、その後ペプチド ２μｇ／ｍｌを有するＰＢＳで、４℃で終夜コートし、ＰＢＳＴで１回洗浄し、及び３％ミルク／ＰＢＳ溶液で、３７℃１時間ブロッキングし、プレートをＳＤＤＷ中に４倍に希釈したＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）停止試薬 ５０μｌ／ウェルで染色し、及び５分間後、１Ｍ Ｈ₂ＳＯ₄ ５０μｌ／ウェルで停止した。

結果
図１は、プローブされた精子ペプチドのために単離され及びクローン化されたファージディスプレイｓｃＦｖの相対親和性を図示する。列１‐３は、ＦＡ‐１由来ペプチドに対する３つのｓｃＦｖの結合を示し、及び列４‐６は、ＹＬＰ（１２）由来ペプチドに対する３つのｓｃＦｖの結合を示す。ＢＳＡを、陰性結合対照として使用する。ｓｃＦＶは、対照と比較して、示されたペプチドについて、顕著な親和性を示した。図２は、プローブされた精子ペプチドのために単離され及びクローン化されたいくつかのファージディスプレイｓｃＦｖの相対親和性を示す。図３は、一連の非結合ｓｃＦｖを同定するためのＥＬＩＳＡ結合アッセイの結果を示し、そしてそれを、対照として使用した。１つのそのようなｓｃＦｖクローン、Ｊ１１２を、典型的に本文脈において使用した。クローンＪ１０２は、他のクローン並びに対照Ａ及びＢよりも大きな親和性を示し、そしてそれらは、それぞれｓｃＦｖファージ不含有、又はペプチド及びｓｃＦｖ不含有サンプルであった。結合を、抗ファージＨＲＰ標識抗体（ＰＶＩＩＩに対する抗体）でプローブされたサンプルについて、ＯＤを測定することにより検出した。これらのいくつかのｓｃＦｖを、その後、必要に応じて、対照及び避妊薬として、以下の実施例において使用した。

実施例４：ｓｃＦｖ発現改変ラクトバチルス
抗体クローニング及び配列決定
ｓｃＦｖを、ファージクローン中の完全なｓｃＦｖ断片を明らかにするために確立されたプロトコルに従ってＮｃｏＩ及びＮｏｔＩ切断で消化によりプラスミドゲノムから取り出した。ゲル精製産物を、Ｄｒ．Ｊｏｓ Ｓｅｅｇｅｒｓから贈られたｐＳＬＰ１１１．１ベクター内にサブクローニングし、そしてそれは、高収率で産物を生成する。ベクターマップを、図４Ａで提供する。サブクローニングを、５’プライマー上にＮｃｏＩ制限部位、及び３’プライマー上にＡｓｃＩ部位（５’‐ＧＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧ、３’‐ＧＣＧＧＧＣＧＣＧＣＣＣＣＡＧＣＡＣＡＧＴＧＡＧＴＴＴＧＧＴＣＣＣ）を含む固有のプライマーで、ｓｃＦｖのＰＣＲ増幅により行った。増幅ＤＮＡを、ゲル精製し、及び制限部位をＮｃｏＩ及びＡｓｃＩで切断により活性化した。制限酵素切断ＤＮＡ断片を、その後もう１回ゲル精製し、及び以前にＮｃｏＩ及びＡｓｃＩで切断し、及びゲル精製したＰＳＬＰ１１１．１ベクター内に連結（Ｔ４ライゲースで）した。連結混合物を、塩化カルシウム方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ）により、コンピテントセルにした大腸菌ＤＨ５ａｌｐｈａで形質転換した。形質転換細菌を、ＬＢアガークロラムフェニコール（１０μｇ／ｍｌ）プレート上に播種し、クローンを、終夜インキュベーション後選択し、及びプラスミドＤＮＡを、２４クローンから調製した。プラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｐｌａｓｍｉｄ ｋｉｔを使用してこれらのクローンから調製し、及び適当なサイズのＤＮＡインサートを含むものを同定するために、ＮｃｏＩ及びＡｓｃＩで切断した。陽性クローンを、その後、後述のようにラクトバチルスジョンソニ内に移した。

プラスミドを、メーカーの説明書に従って、Ｑｉａｇｅｎ‐ｔｉｐ２０カラムを使用して精製した。精製したプラスミド中のｃＤＮＡインサートの存在を確認するために、それぞれのクローンを、ＮｃｏＩ‐ＡｓｃＩで消化し、及び消化産物を、アガロースゲル上で泳動した。インサートを含むクローンを配列決定した。

重及び軽鎖クローンの配列分析
陽性クローンを、Ｗｅｉｚｍａｎ ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの配列決定サービスにより配列決定し、そしてそれは、メーカーの説明書に従って、すべての条件及び試薬で、ＡＢＩ自動化シーケンサーを使用した。最初の配列決定プライマーは、以下：
フォワード ＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＧＡＧＣＣ（配列番号９）
リバース ＧＡＡＴＴＣＡＡＣＣＴＴＣＡＡＡＴＴＧＣＣ（配列番号１０）
を使用した。

ベクターへの増幅抗体断片のクローニング
ゲル精製増幅産物を、ベクターの適当な部位にサブクローニングした。カセットは、ラクトバチルス適合性プロモーターエレメント、抗体断片、分泌のためのシグナル配列、又は細胞壁アンカードメインを含む４つのコンポーネントを含む。配列検証を、ラクトバチルス株内に形質転換する前に行った。

ラクトバチルス形質転換
ＡＴＣＣヒト膣単離Ｌ．ジョンソニ株番号２５２５８を使用し、及びｄｅ Ｍａｎ，Ｒｏｇｏｓａ，ａｎｄ ｓｈａｒｐｅ（ＭＲＳ）培地（Ｄｉｆｃｏ）中で、３７℃（５％ＣＯ２／９５％空気）で、培養した。インサートを含むｐＳＬＰ１１１．１を、Ｌ．ジョンソニ内へ塩化カルシウム方法により導入した。形質転換Ｌ．ジョンソニ細菌を、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含む液体培地において定法で増殖した。

精子結合及び運動性アッセイ
マウス精子を、確立された方法（Ｌｕｉ Ｚ，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０１０）２８５，２７５８‐２７７０）に従って単離した。１０⁶精子を、コニカルチューブにおいて精子緩衝液（２１ｍＭ ＨＥＰＥＳ；４ｍＭ 炭酸水素ナトリウム；０．６％ヒト血清アルブミン；３．６ｍｌ 乳酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍｕ ｌａｃｔａｔｅ）（６０％ストック）及びゲンタマイシン １０μｇ／ｍｌを補ったＨａｍ’ｓ Ｆ‐１０）で懸濁し、精子をチューブの上部に泳ぎ上がるそれらの能力を亢進するための態様で保持し、ここで、運動性の精子の回収を、少量の緩衝液（数百μｌ）の除去により達成した。精子カウントを、ヘマサイトメーターを介して検証し、及び精子：ラクトバチルス（ｃｆｕ）１：１又は１：２の比率でインキュベートした。

マウス精子を分離し、及び精子に対するｓｃＦｖの結合を、ファージディスプレイｓｃＦｖを使用して結合アッセイによりアッセイした。上記のようにスイムアップ（ｓｗｉｍ ｕｐ）アッセイを、運動性精子を選択するために使用し、そしてそれらを単離し、及びチャンバースライド中に置き、空気乾燥し、及びその後、目的のｓｃＦｖを含むファージ（１０⁸）を、チャンバーに適用し、１時間インキュベートし、洗浄し、その後精子を、１：２００の希釈で、ＨＲＰに結合した抗ｃｐ８（ＥＮＣＯ、Ｉｓｒａｅｌ）でプローブし、チャンバーをその後、洗浄し、及びＤＡＢ及びペルオキシドで染色した。

結果
図４Ｂは、プラスミドのＮｃｏＩ及びＮｏｔＩ消化産物を示す。プラスミドを、ＮｃｏＩ及びＮｏｔＩで、３７℃、３時間切断した。

１つの具体的なｓｃＦｖ、Ｊ１０２について、高度に保存された精子抗原に対して高い結合親和性を有することを見出した。クローンの配列決定では、図５Ａ‐５Ｂで示すように（配列番号７‐８）、完全なＤＮＡ及びタンパク質を得た。

ｓｃＦｖ Ｊ１０２、及び他を、ヒト及びネズミ精子両方と結合するためにプローブした。ｓｃＦｖ Ｊ１０２は、ヒト由来断片であるが、ＦＡ‐１抗原の種間での高い保存が、インビトロアッセイにおいて決定したように、ネズミ及びヒト精子両方に対するＪ１０２結合を生じた。図６Ａは、マウス精子とラクトバチルス発現ｓｃＦｖの顕著な結合を示し、そして評価したほとんどそれぞれの精子細胞が、顕著な染色を示すのに対し、非精子抗原に対するｓｃＦｖを発現する対照ラクトバチルスは、ネズミ精子と検出できる程度に結合しなかった。ヒト精子結合試験は、マウスの知見と一致していた（データ未記載）。

運動性試験を、上述した方法の項で記載したように、ヒト精子で行った。無関係の対照を発現するラクトバチルスは、インビボで精子の運動性への少ない影響を示すのに対して、精子結合ｓｃＦｖを発現するラクトバチルスを使用する場合、ｓｃＦｖ Ｊ１０２の効果のためのプローブアッセイについて含む、精子の運動性を改悪する明白な効果が見られ、及び運動性を、対照と比較して５０％まで低減することを見出し、そしてそれは、精子機能を妨げるための精子結合ｓｃＦｖを発現するラクトバチルスの能力を示す。

実施例５：改変Ｌ．ジョンソニの抗精子活性
受精の阻害
それぞれの種の１０⁵の精子を、関連のある及び対照抗体（１：５０、１：５又は１：１で希釈）溶液中で、低温で終夜、インキュベートし、又は対照及び関連のある抗体を生成するためのコンストラクト、及び卵子を添加し、そしてその時点で、卵子に対する精子の結合を、１時間行ってもよい。卵子をその後、洗浄し、及び卵子あたりの結合精子の数を決定し、及び対照サンプルに結合するものとのパーセンテージとして表す。最大阻害割合を有するコンストラクトを、更に評価する。

インビボ受精阻害試験
メス（マウス、ウサギ）に、精製した関連のある抗体断片、精製した対照抗体断片、関連のある抗体断片を発現する改変ラクトバチルス、及び対照抗体断片を発現する改変ラクトバチルスを、膣内に注射する。１のオス及び２‐４のメスを、それぞれの薬剤のメスに対する膣内への投与後、複数の時点で、飼育する。群分け２４時間後、メスを、膣栓の有無について毎日目視で確認する。メスを、それらの間に識別するために印を付け（例えば、連続的な耳パンチにより）、及び場合により、交配開始２週間後、メスを、個々のケージに移動する。３週間後、一腹の子を有する妊娠したメス及び子孫をカウントする。最大避妊活性を有するコンストラクトを、その後選択し、及び更に評価／最適化してもよい。

融合阻害アッセイを、以下のように行う。若いメスマウス（８‐１０週齢）に、０．９％ Ｎａｃｌ 妊馬血清（ＰＭＳ）５単位を腹腔内に注射する。４８時間後、過剰排卵を引き起こすために、マウスに、０．９％ Ｎａｃｌ ｈＣＧ（ヒト絨毛性ゴナドトロピン）５単位をＩＰで注射する。ｈＣＧ注射１４‐１６時間後、排卵した卵母細胞を採取し、及び卵丘細胞を除去するために、ヒアルロニダーゼで処理する。透明帯をプロテアーゼの混合物で除去する。透明帯を有しない卵子を、特定の濃度で、ペプチドを有する培地中で、３０分間インキュベートする（Ｈｏｇａｎ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ Ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，９１‐１０１，（１９８６））。オスマウスの精巣上体から採取した精子を、インキュベーションにより受精能を付与し、及びアクロソームを、Ｆｌｅｍｉｎｇ ａｎｄ Ｙａｎａｇｉｍａｃｈｉ（Ｇａｍｅｔｅ Ｒｅｓ．４，２５３‐２７３（１９８１））により記載されたように反応し、及び卵子を添加し、対照及び関連のある抗体、及び同じ抗体を発現するコンストラクトの存在下、１５分間インキュベートする。卵子を、その後、精子不含有培地に移し、及び更に１時間４５分の間インキュベートする。卵子を、その後、Ｐｒｉｍａｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０４，１４１（１９８７））により記載されたように、固定及び染色する。膨化精子頂部の総数を、その後カウントする。膨化精子頂部は、精子及び卵子が融合したことの表れである。

これらの観察に基づいて、いくつかの指標を計算する。受精指標（Ｆ．Ｉ．）を、膨化頂部の総数を卵子の総数で割ることにより決定する。受精率（Ｆ．Ｒ．）は、受精した卵子のパーセントである。パーセント阻害を、実験用のペプチドの受精指標を対照ペプチドの受精指標で割ることにより決定する。最大活性を有するコンストラクトを選択する。

実施例６：有効な避妊薬としての改変Ｌ．ジョンソニ
他の動物種を、実施例４に記載した方法に従ってプローブする。ウサギ、ラット、モルモット、ミニブタ、サル及び他の種を、評価してもよい。本文脈において、いくつかのコンストラクトを評価し、及び動物種の差異に留意する。パーセント有効性を、それぞれの動物種について、それぞれのコンストラクトのために決定する。

更に、それぞれの種を、精子数及び運動性を評価する、証明された受精率のオスから得た精子を、ＡＩＦに曝す。関連のある及び対照抗体断片を発現するラクトバチルス膣内に適用し、及びＡＩＦを投与後、様々な時間で実行する。人工授精時に、排卵を、例えばｈＣＧ １００ＩＵの注射により誘導する。排卵及び人工授精後、潜在的な催奇形効果を評価するために、それらの妊娠を完了してもよい。

ラクトバチルス対照及び関連のある抗体断片を発現するラクトバチルスを投与したメスを、生殖管中の持続性について評価する。このような目的で、膣分泌物を、膣口に繰り返し滅菌ＰＢＳをピペッティングすることで、採取する。体液及び粘液を、微量遠心管中で、簡単に混合遠心沈殿し、及び上清液を、ｓｃＦｖの有無のためにアッセイする。血清及び膣洗浄液中の抗精子抗体断片価を、ＥＬＩＳＡにより決定する。

経時的研究を、実行する。ラクトバチルスを投与したメスを、繰り返しオスと飼育し、及び妊娠率／避妊有効性を、投与後時間の関数として評価する。

実施例７：精子結合ｓｃＦｖ発現Ｌ．ジョンソニは、マウスにおいて効果的な避妊薬である
マウス投与及び交配試験
メスＩＣＲマウスを、ケタミン溶液重量 ０．１ｍｌ／ｇｍ（濃度１００ｍｇ／ｍｌ）、キシラジン ０．５ｍｌ（濃度２０ｍｇ／ｍｌ）、及び０．９％生理食塩水 ８．５ｍｌで麻酔した。麻酔したマウスを、その後、１０⁸の新たに生育した対数増殖期中期（ｍｉｄ‐ｌｏｇ ｐｈａｓｅ）改変Ｌ．ジョンソニ（ＯＤ決定済）Ｊ１０２又は対照Ｊ１１２株を膣内に投与した（１群あたりＮ＝１２マウス）。投与後、３０‐６０分、メスをそれらの背骨を保持し、骨盤を上に傾けた。ラクトバチルスを、３日間、毎日メスに投与し、及びその後、週齢を一致させたオスＩＣＲ血統と交配した。オスを、７日間、メスと飼育し、この期間の間、１日おきに交代し、及びその後取り除いた。メスを、その後、膣栓の有無を目視で評価し、及びケージごとに、妊娠マウス及び生まれた子孫の数を記録した。

マウス定着試験
第一膣内投与後１２時間から２４時間の間、メスの膣内を拭き取り又は洗浄し、及び回収したサンプル／体液を、クロラムフェニコール含有ＭＲＳプレート上に播種し、及び３７℃で２４時間培養した。細菌叢の存在は、膣の定着の指標として役立つ。

結果
マウス定着試験は、単回膣内投与後、洗浄体液の５０％までが、マウスの５０％までにおいて定着が起こったことを示す叢を回収したことを明らかにした。拭き取りにより定着を明らかにした動物において、投与後５日までの間の投与されたラクトバチルスの膣持続性を見出した。

メスに抗精子ｓｃＦｖ発現Ｌ．ジョンソニ又は対照株を投与した、２つの個々の試験を行い、及びそれぞれの実験において、効果的な避妊を明らかにした（図７Ａ）。対照のメスの９２％がそれぞれの試験で妊娠していたのに対し、抗精子ｓｃＦｖ発現Ｌ．ジョンソニで処置したメスでは、妊娠率の顕著な低減（５８％又は５０％）を示した。

抗精子ｓｃＦｖ発現Ｌ．ジョンソニの投与の結果として、同様に、総子孫数及びケージあたりの子孫数が、対照と比較して減少した（図７Ｂ）。これらの知見に基づいて、マウスあたりの子孫数は、また対照と比較して処置したメスで減少した。

実施例８：生物避妊薬の安全性
改変ラクトバチルスを、膣の過敏性へのそれらの影響のために評価する。マウスなどの動物を、１日あたり１回、連続して１０−３０日間、ラクトバチルスで膣内に処置した。動物をその後、屠殺し、及び生殖器官を肉眼及び顕微鏡で観察する。

膣組織を、ラクトバチルス、及び対照及び関連のある抗体を発現する改変ラクトバチルスの導入に応じて、上皮潰瘍、浮腫、白血球浸潤、及び血管のうっ血について調べる。改変ラクトバチルスで処置した動物を、天然分離株を投与したものと比較し、同様に非処置動物とも比較する。仮に存在するなら、生殖管組織学について、改善に気付くであろう。

実施例９：避妊可逆性
ラクトバチルス投与に応じて、反復交配にもかかわらず、妊娠していないメス動物について、抗生物質を投与し及び交配する。妊娠を、改変バチルスの可逆性の測定として評価する。同様に、動物について、生殖管におけるラクトバチルスの持続性を評価する。改変ラクトバチルスを有する集団の減少又は不存在の指標で、動物を交配し、及びそれらの妊娠を決定する。安全性及び有効性試験を適当な動物モデルで行ってきたが、例えば、上述したように、その後ヒト臨床試験を同様に検討している。

Claims (10)

1. メス生殖管における遺伝子改変共生細菌であって、ここで前記遺伝子改変共生細菌が、遺伝子改変ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）であり、前記遺伝子改変により抗精子剤を発現しており、前記抗精子剤が、精子運動性、精子‐卵子融合、又は卵子への侵入を阻害又は防止する機能を有する、又はそれらの組み合わせの機能を有する、精子に対する抗体又はその断片である、遺伝子改変共生細菌。
2. 前記抗精子剤が、精子に対するｓｃＦｖ抗体断片である、請求項１に記載の改変細菌。
3. 前記精子に対するｓｃＦｖ抗体断片が、ヒトの又はヒト化であり、前記ｓｃＦｖ抗体断片が、特異的にアクロソーム又は細胞膜と相互作用し、前記ｓｃＦｖ抗体断片が、特異的に精子頚部領域と相互作用し、前記ｓｃＦｖ抗体断片が、特異的に精子ＦＡ‐１抗原又はその断片と相互作用し、前記ｓｃＦｖ抗体断片が、特異的に配列番号１又は２と少なくとも９０％の同一性を共有するペプチドと相互作用し、前記ｓｃＦｖ抗体断片が、配列番号８と少なくとも９０％の同一性を共有する配列を有し、又は前記ｓｃＦｖ抗体断片が、配列番号７と少なくとも９０％の同一性を共有する配列を有するポリヌクレオチドによりコードされる、請求項２に記載の改変細菌。
4. 前記共生細菌が、ラクトバチルス ジョンソニ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｅｎｓｅｎｉｉ）、ラクトバチルス クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）又はラクトバチルス カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｓｅｉｉ）である、請求項１に記載の改変細菌。
5. 請求項１に記載の改変細菌を含む組成物。
6. 前記組成物が、膣座薬、スポンジ、クリーム又は泡の形態である、請求項５に記載の組成物。
7. メスの避妊のための、請求項５に記載の組成物の使用。
8. メス集団における妊娠発生率の低減のための、又はメス集団における受精発生率の低減のための、請求項５に記載の組成物の使用。
9. 請求項１に記載の改変細菌を含む、膣内挿入器具。
10. 前記器具が膣内挿入リングである、請求項９に記載の膣内挿入器具。