CN102959392A - 生物传感器 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种能在短时间内测定试样中的葡萄糖、中性脂肪等特定成分的浓度的生物传感器。所述生物传感器具有绝缘性基板、形成在上述绝缘性基板上的至少包含工作电极和对电极的电极系统、以及形成在上述电极系统上的试样供给部，所述试样供给部具备包含第一反应层和第二反应层的反应层，第一反应层形成在上述电极系统上，包含含有作为辅基的吡咯喹啉醌（PQQ）、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、或黄素单核苷酸(FMN)的氧化还原酶；第二反应层是通过在上述第一反应层上涂布包含脂质分解酶的溶液形成的。

Description

生物传感器

技术领域

本发明涉及生物传感器，特别是中性脂肪浓度测定用生物传感器。特别是，本发明涉及能够利用酶反应迅速定量生物试样等特定材料中特定成分的浓度的生物传感器，特别涉及中性脂肪浓度测定用生物传感器。

背景技术

近年，生物传感器被用于医疗等领域。生物传感器的测定对象为从低分子到高分子的各种各样的化学物质，为了应对各种测定对象，正在进行具备各种机能的生物传感器的开发。

目前，不必对生物试样以及食品中所含的特定成分(底物)进行稀释、搅拌等操作就能简单定量的生物传感器已广为人知。例如，已经提出如下生物传感器：在绝缘性基板上形成至少具有工作电极和对电极的电极系统，在该电极系统上设有用亲水性聚合物等固定剂固定氧化还原酶以及电子受体而成的酶反应层，接着在该酶反应层上设置过滤层(血球去除层)，进一步，在该过滤层上包被壳体而一体化。

这个生物传感器按照以下的方法定量试样中的底物浓度。首先，将血液等试样溶液滴加到过滤层，其过滤液渗透到酶反应层。从而氧化还原酶以及电子受体溶解至试样溶液中，底物和酶之间发生酶反应。通过该酶反应底物被氧化，同时电子受体被还原。酶反应终止后，将已被还原的电子受体电化学氧化，通过此时得到的氧化电流值求出试样溶液中的底物浓度。

例如，作为用生物传感器测定中性脂肪的方法，如下定量试样中的中性脂肪的方法已广为人知。首先，试样溶液中包含的中性脂肪被例如脂蛋白脂肪酶(LPL)分解为游离脂肪酸和甘油。此处生成的甘油，可以如下式(1)和下式(2)所示的那样通过使用甘油激酶（GK）和甘油-3-磷酸氧化酶(GPO)或者甘油-3-磷酸脱氢酶(GPDH)来定量。即，可以通过测定如下式所示的、氧化型电子受体的减少、还原型电子受体的增加或者磷酸二羟丙酮的量来定量甘油。特别是，可以通过电化学地测定还原型电子受体的增加量来定量甘油。

[化1]

但是，上述用于中性脂肪测定的脂蛋白脂肪酶(LPL)，甘油激酶(CK)、以及甘油-3-磷酸氧化酶(GPO)这三种酶均很昂贵。

为了解决这类问题，公开了一种生物传感器，其通过使用中性脂质分解酶和甘油脱氢酶（GLDH）这2种酶作为用于中性脂肪分解反应的酶，而降低了酶成本(专利文献1)。但是，专利文献1的生物传感器，测定时间和精度都称不上充分，期望进一步地实现高精度化以及测定的迅速化。

另一方面，作为不受溶解氧的影响且应用1种酶的方法，已知存在如下式(3)所示那样应用NAD⁺依赖性甘油脱氢酶(NAD-GLDH)的方法。

[化2]

但是，该反应需要添加价格昂贵的NAD⁺。

作为更为廉价简便的甘油定量方法，存在使用包含作为辅基的吡咯喹啉醌的多元醇脱氢酶(PQQ-PDH)的方法。

该方法进行下式(4)的反应，因此具有不受溶解氧的影响、反应简便不必使用多种酶、不必添加价格昂贵的NAD⁺等优势。

[化3]

基于上述考虑，报告了一种生物传感器，其为了提供能短时间且高精度地测定中性脂肪的生物传感器，将中性脂肪分解酶和甘油脱氢酶配置在不同的层(专利文献2、3)。这里，专利文献2的生物传感器具有如下结构：在电极上依次层叠包含GLDH以及亲水性聚合物的聚合物层、和在滤纸中负载中性脂肪分解酶的滤纸层这2个反应层的构造。此外，专利文献3的生物传感器，特征在于，具有如下结构：在电极上依次层叠包含GLDH以及亲水性聚合物的聚合物层、和在无纺布中负载中性脂肪分解酶的无纺布层这2个反应层的构造。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2006/104077号小册子

专利文献2：日本特开2009-244013号公报

专利文献3：日本特开2009-244014号公报

发明内容

发明要解决的问题

但是，即便是上述专利文献2、3所述的生物传感器，实施例中记载测定时间为2分钟(专利文献2的段落[0100]以及专利文献3的段落[0100])，依然不能说测定时间足够短，期望得到能够在更短时间内测定的生物传感器。

因此，本发明是为了解决上述课题而进行的，目的在于提供一种能在短时间内测定试样中的中性脂肪等特定成分的浓度的生物传感器。

用于解决问题的方案

本发明人等为了解决上述课题进行了积极的研究。结果获知，不使用滤纸、无纺布等载体，通过将反应层设置为如下的2层结构，则能够提高利用上述2酶的反应速度，所述2层结构为在包含氧化还原酶的层上直接涂布包含脂质分解酶的溶液形成包含脂质分解酶的层。基于上述见解完成本发明。

即，可通过以下生物传感器达成上述目的，所述生物传感器具有绝缘性基板、形成在上述绝缘性基板上的至少包含工作电极和对电极的电极系统、以及形成在上述电极系统上的试样供给部，所述试样供给部具备包含第一反应层和第二反应层的反应层，第一反应层形成在上述电极系统上，包含含有作为辅基的吡咯喹啉醌（PQQ）、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、或黄素单核苷酸(FMN)的氧化还原酶；第二反应层是通过在上述第一反应层上涂布包含脂质分解酶的溶液而形成的。

发明的效果

使用本发明的生物传感器，可以在短时间内测定目的成分的浓度。

附图说明

图1为表示本发明的生物传感器的一个实施方式的分解立体图。

图2为图1的生物传感器的剖面图。

图3为表示本发明的生物传感器的其他实施方式的分解立体图。

图4为图3的生物传感器的剖面图。

图5为表示实施例1~2以及比较例的全血中的中性脂肪浓度的测定结果的图表。

图6为表示实施例3以及4的全血中的中性脂肪浓度的测定结果的图表。

图7为表示实施例5以及6的全血中的中性脂肪浓度的测定结果的图表。

具体实施方式

本发明提供一种生物传感器，所述生物传感器具有绝缘性基板、形成在上述绝缘性基板上的至少包含工作电极和对电极的电极系统、以及形成在上述电极系统上的试样供给部，所述试样供给部具备包含第一反应层（本说明书中，也简称为“第一反应层”）和第二反应层（本说明书中，也简称为“第二反应层”）的反应层，第一反应层形成在上述电极系统上，包含含有作为辅基的吡咯喹啉醌（PQQ）、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、或黄素单核苷酸(FMN)的氧化还原酶；第二反应层是通过在上述第一反应层上涂布包含脂质分解酶的溶液形成的。本发明具有以下特征：将反应层设置为由包含氧化还原酶的第一反应层以及包含脂质分解酶的第二反应层构成的2层构造，这时，第二反应层是通过在第一反应层上直接涂布包含脂质分解酶的溶液形成的。

如上所述，目前已经报道了：如专利文献1所述那样的、将上述2种酶混合而形成单一层的生物传感器，以及如专利文献2和3所述那样的、设置了包含氧化还原酶以及亲水性聚合物的聚合物层和在等载体上另行负载中性脂肪分解酶并将这些滤纸层/无纺布层设置在聚合物层上的2层结构的生物传感器。其中，上述专利文献1的生物传感器的情况下，甘油脱氢酶（GLDH）等氧化还原酶通常比脂质分解酶溶解度低，因此会给脂质分解酶带来影响，通过两种酶催化的反应不能快速进行，产生偏差。结果是，导致传感器整体的酶反应延迟，可以认为测定时间不能充分地缩短。另外，上述专利文献2和3的生物传感器的情况下，脂质分解酶另行负载于滤纸、无纺布，因此虽然氧化还原酶的溶解性良好，但是试样向聚合物层的渗透需要花费时间，结果是，导致整体的酶反应延迟，可以认为测定时间不能充分地缩短。

针对这种情况，本发明中，在包含氧化还原酶的第一反应层上涂布包含脂质分解酶的溶液，直接形成第二反应层。因此，包含中性脂肪等脂肪的试样通过试样供给部时，第二反应层中的脂质分解酶溶解性高，因此一与试样接触就迅速溶解并将试样中的脂肪分解生成游离脂肪酸和甘油。另外，该反应几乎在与脂质分解酶完成溶解所需的时间相同的时间内完成。然后，氧化还原酶作为第一反应层存在于第二反应层和电极之间，因此在第二反应层中的脂质分解酶完成溶解后开始溶解。脂质已被分解的试样迅速渗透到第一反应层中，溶解氧化还原酶，同时由生成的甘油生成还原型电子传递体，用电化学方法对该还原型电子传递体的增加量进行测定。因此，通过本发明的生物传感器，能够在短时间内定量试样中的脂肪。予以说明，上述专利文献1~3的机理以及本发明的机理均为推论，本发明不受上述机理限定。

以下，边参照附图边具体说明本发明的生物传感器的实施方式。予以说明，本发明只要不脱离权利要求书规定的概念则不限于下述实施方式。另外，附图的尺寸比例为便于说明而进行了改变，有时与实际的比率是不一致的。

图1为表示本发明的生物传感器的一个实施方式的分解立体图。图2为图1的生物传感器的剖面图。予以说明，本说明书中，图1以及图2中表示的生物传感器也称为“第1生物传感器”。

如图1和图2所示，在绝缘性基板1(本说明书中，也简称为“基板”)之上形成了包含工作电极2、参比电极3以及对电极4的电极系统。予以说明，上述电极系统只要至少包含工作电极和对电极就行。因此，参比电极3可以省略。另外，粘接剂6设置在绝缘性基板1上的端部。工作电极2、参比电极3以及对电极4作为用于将生物传感器电连接的单元起作用。工作电极2、参比电极3以及对电极4，例如可以适当参照丝网印刷、溅射法等目前公知的知识或者将其组合而形成希望图案的电极。

然后，按照露出电极系统的方式，在形成于绝缘性基板1上的工作电极2、参比电极3以及对电极4之上形成绝缘层5。绝缘层5作为用于防止各电极间的短路的绝缘单元起作用。关于绝缘层的形成方法没有特别的限制，可以通过丝网印刷法、粘接法等目前公知的手法形成。

另外，按照夹持绝缘层5的方式，形成工作电极作用部分2-1、参比电极作用部分3-1以及对电极作用部分4-1。然后，在构成电极系统的工作电极作用部分2-1、参比电极作用部分3-1以及对电极作用部分4-1之上，依次形成第一反应层8和第二反应层9。予以说明，图1中，第一反应层8、第二反应层9和位于上述第二反应层9和壳体7之间的空间部S形成试样供给部。

这里，第一反应层8至少包含含有作为辅基的吡咯喹啉醌(PQQ)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)或者黄素单核苷酸(FMN)的氧化还原酶(以下，也称为“本发明的氧化还原酶”)。

另外，第二反应层9形成在上述第一反应层8上，通过涂布至少包含脂质分解酶的溶液而形成。予以说明，本说明书中，“第二反应层通过涂布包含脂质分解酶的溶液形成”意思是：脂质分解酶并非负载于滤纸、无纺布等载体，而是通过直接在第一反应层上涂布包含脂质分解酶的溶液、干燥而形成涂膜。

这里，上述作用部分(2-1、3-1、4-1)发挥在使用生物传感器时用于对第一反应层8中的试样施加电压的电压施加手段以及用于检测试样中流动的电流的电流检测单元的作用。予以说明，包含作用部位(2-1、3-1、4-1)有时也称为工作电极2、参比电极3以及对电极4。工作电极2和对电极4在使用生物传感器时成为一对，发挥用于测定对第一反应层8中的试样施加电压时流动的氧化电流(响应电流)的电流检测单元的作用。使用生物传感器时，以参比电极3为基准，在对电极4和工作电极2之间施加规定的电压。

本实施方式的生物传感器，以覆盖第一反应层8和第二反应9的方式，介由设置于基板1上的粘接剂(两面胶)6粘结壳体7而构成。予以说明，粘接剂(两面胶)6，既可以设置在电极侧，也可以只设置在壳体7侧，也可以在上述两侧均设置。

本发明中的生物传感器中，优选试样供给部进一步包含电子传递体。这种方式中的电子传递体，可以以任何形态存在于试样供给部。具体而言，可列举出：(a)第一反应层8包含电子传递体(电子传递体配置在第一反应层8)的方式，(b)第二反应层9包含电子传递体(电子传递体配置在第二反应层9)的方式、(c)进一步配置包含电子传递体的第三反应层的方式，等。可以应用上述方式(a)…(c)中的任意一种，或者还可以将上述(a)…(u)中的两种以上组合适用。上述方式中，更优选(i)或者(u)。即，本发明的生物传感器更优选：上述第二反应层具有电子传递体(电子传递体配置在第二反应层)，或者进一步具有包含电子传递体的第三反应层。

前者(第二反应层具有电子传递体)的情况下，优选按照与上述第一反应层8以及第二反应层9分离的方式，在上述试样供给部进一步设置包含表面活性剂的层(以下也称为表面活性剂层)。这时，表面活性剂层的配置没有特别的限制，例如，优选与第一反应层8以及第二反应层9分离地在壳体侧形成表面活性剂层。这时，当在壳体侧形成表面活性剂层时，相比于壳体7直接和试样接触的情形，全血等试样向壳体侧的扩散、润湿性变好，具有能将试样尽快导入到试样供给部的优点。

另外，后者(第三反应层具有电子传递体)的情况下，优选按照与上述第一反应层8以及第二反应层9分离的方式，在上述试样供给部进一步设置具有电子传递体的第三反应层。这时，第三反应层的配置没有特别的限制，例如，优选与第一反应层8以及第二反应层9分离地在壳体侧形成上述第三反应层。通过以这样的配置具有电子传递体，可以得到电子传递体自身或者氧化还原酶在保存中的稳定性提高的效果。这是电子传递体和氧化还原酶相互之间不接触所带来的效果。

即，根据包含上述第三反应层时的本发明的生物传感器的其他实施方式，为如下的生物传感器：具有绝缘性基板、形成在上述绝缘性基板上的至少包含工作电极和对电极的电极系统、以及形成在上述电极系统上的试样供给部，所述试样供给部具备包含第一反应层和第二反应层的反应层，第一反应层形成在上述电极系统上，包含含有作为辅基的吡咯喹啉醌（PQQ）、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、或黄素单核苷酸(FMN)的氧化还原酶；第二反应层是通过在上述第一反应层上涂布包含脂质分解酶的溶液形成的，进而按照与第一反应层和第二反应层分离的方式，配置包含电子传递体的第三反应层。以下，边参照图3和图4边说明基于上述本发明的其他实施方式的生物传感器。

图3为表示本发明的生物传感器的包含上述第三反应层的其他实施方式的分解立体图。图4是图3的生物传感器的剖面图。予以说明，本说明书中，图3和图4所表示的生物传感器也称为“第2生物传感器”。

如图3和图4所示，基本的结构除了进一步设有包含电子传递体的第三反应层10(即，在第一反应层8以及第二反应层9的基础上配置第三反应层10)之外，与图1和图2所表示的生物传感器是同样的。即，将壳体7侧形成的层称为第三反应层10，将电极侧形成的层从电极侧起依次称为第一反应层8以及第二反应层9。这时，第一反应层8、第二反应层9、第三反应层10、以及上述第二反应层9和上述第三反应层10之间配置的空间部S形成试样供给部。上述第一反应层8包含氧化还原酶，上述第二反应层9包含脂质分解酶，而且上述第三反应层10包含电子传递体。换言之，基于该其他实施方式的第2生物传感器中，氧化还原酶、脂质分解酶以及电子传递体不会同时被包含在同一反应层中。予以说明，第三反应层10形成在两端设置有粘接剂(两面胶)6a的壳体7上的两端的间隙中。

第2生物传感器是由粘接在形成有第一反应层8以及第二反应层9的基板1上的粘接剂(两面胶)6b和粘接在形成有第一反应层8的壳体7上的粘接剂(两面胶)6a相互贴合构成的。予以说明，粘接剂6(两面胶)既可以只设置在基板1侧，也可以只设置在壳体7侧。

以下，详细说明各技术特征。予以说明，如上所述，第1生物传感器的结构和第2生物传感器的结构除了第2生物传感器进一步具有第三反应层10以外是相同的，因此只要没有特别声明，下述记载的技术特征的具体说明既适用于第1生物传感器也适用于第2生物传感器。另外，在说明各技术特征的含量时有时会用到叫做“1sensor”的术语，本说明书中的“1sensor”是假定一般生物传感器大小的、由试样供给部供给的试样的量为0.1~20μl(优选为2μl左右)。因此，稍小一些或稍大一些的生物传感器，可以通过适当调整各技术特征的含量而应用本发明。

<绝缘性基板>

本发明中使用的绝缘性基板1没有特别的限制，可以使用目前公知的基板。如果举个例子，可以为塑料、纸、玻璃、陶瓷等。另外，绝缘性基板1的形状、大小没有特别的限制。

作为塑料，没有特别的限制，可以使用目前公知的塑料。如果举个例子，可以使用聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚酯、聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚酰亚胺、丙烯酸类树脂等。

<电极>

本发明的电极至少包含工作电极2和对电极4。

本发明的电极，只要是能够电化学地检测出试样(测定对象物)和本发明的氧化还原酶的反应即可，没有特别的限制，例如可列举出炭电极、金电极、银电极、铂金电极、钯电极等。从耐腐蚀性以及成本的观点出发，优选炭电极。

本发明中，既可以是只有工作电极2以及对电极4的二电极方式，也可以是进一步包含参比电极3的三电极方式。其中，从进行更高敏感度的电压控制的观点出发，相比于二电极方式更优选使用三电极方式。另外，除此之外，为了感知液量也可以包含传感电极等。

另外，与试样供给部接触的部分(作用部分)可以和除此之外的电极部分的构成材料不同。例如，参比电极3由炭组成时，参比电极的作用部分3-1可以由银/氯化银组成。予以说明，因为生物传感器一般为一次性的，作为电极可以使用易于处理的电极。

<绝缘层>

构成绝缘层5的材料没有特别的限制，例如可以由抗蚀油墨、PET或聚乙烯等树脂、玻璃、陶瓷、纸等构成。优选为PET。

<试样供给部>

如上所述，本发明的第1生物传感器中，试样供给部具有包含氧化还原酶的第一反应层8和包含脂质分解酶的第二反应层9。另外，在与第一反应层以及第二反应层分离地在壳体7侧设置表面活性剂层的情况下，试样供给部也具有表面活性剂层。

另一方面，本发明的第2生物传感器中，上述的试样供给部在包含氧化还原酶的第一反应层8和包含脂质分解酶的第二反应层9的基础上，具有与上述第一反应层8以及第二反应层9分离形成的第三反应层10，上述第三反应层9包含电子传递体。如本发明的第2生物传感器那样设置第三反应层，能将氧化还原酶以及电子传递体包含在不同的反应层中，因此能够防止电子传递体和所述氧化还原酶接触所导致的保存中的劣化。

本发明中，第一反应层8以及第二反应层9的厚度没有特别的限制，可以按照成为通常的反应层的厚度的方式适当选择。第一反应层8优选为0.01~25μm、更加优选为0.025~10μm、特别优选为0.05~8μm。另外，第二反应层9的厚度，优选为0.01~25μm、更加优选为0.025~10μm、特别优选为0.05~8μm。进一步，第一反应层8以及第二反应层9的厚度的合计厚度优选为0.02~50μm、更优选为0.05~20μm、特别优选0.1~16μm。这时，作为厚度的控制方法没有特别的限制，例如，可以通过适宜调节包含规定成分的溶液的涂布量(例如，滴加量)来进行控制。

另外，本发明的第一生物传感器中，在与第一反应层8以及第二反应层9分离地在壳体7侧形成表面活性剂层的情况下，其厚度优选为0.01~25μm、更优选为0.025~10μm、进一步优选为0.05~8μm。第二反应层9和表面活性剂层之间的间隔距离，优选为0.05~1.5mm、更优选为0.07~1.25mm、进一步优选为0.09~1mm。只要在上述范围内，容易产生毛细管现象，容易向试样供给部导入试样。这里，第一反应层8、第二反应层9、以及根据需要形成的表面活性剂层的厚度，既可以相同也可以不同。

另外，本发明的第2生物传感器中的第一反应层8、第二反应层9以及第三反应层的厚度，没有特别的限制，可以按照形成通常的反应层的厚度的方式适当选择。第一反应层8优选为0.01~25μm、更加优选为0.025~10μm、特别优选为0.05~8μm。另外，第二反应层9的厚度，优选为0.01~25μm、更加优选为0.025~10μm、特别优选为0.05~8μm。进一步，第一反应层8以及第二反应层9的厚度的合计厚度优选为0.02~50μm、更优选为0.05~20μm、特别优选0.1~16μm。

另外，第三反应层10的厚度优选为0.01~10μm、更优选为0.025~10μm、特别优选0.05~8μm。这里，第一反应层8、第二反应层9以及第三反应层10的厚度，既可以相同也可以不同。作为此时的厚度的控制方法没有特别的限制，例如可以通过适宜调节包含规定成分的溶液的涂布量(例如，滴加量)进行控制。予以说明，第二反应层9和第三反应层10之间的间隔距离没有特别的限制，优选为0.05~1.5mm、更优选为0.075~1.25mm、特别优选为0.1~1mm。只要在上述范围内，保存中氧化还原酶和电子传递体不接触，另外，容易产生毛细管现象，试样容易被吸进反应层中。通过控制粘接剂的厚度可以控制间隔距离。也就是说，粘接剂还发挥着用于隔开第二反应层9和第三反应层10的间隔物的作用。

(氧化还原酶)

本发明中的第一反应层8包含含有作为辅基（也称为辅酶）的吡咯喹啉醌(PQQ)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、或黄素单核苷酸(FMN)的氧化还原酶。特别是，优选包含作为辅基的吡咯喹啉醌(PQQ)的多元醇脱氢酶。予以说明，本发明中，本发明的氧化还原酶可以单独或者以混合物的形式使用。

本发明中，包含作为辅基的吡咯喹啉醌(PQQ)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、或者黄素单核苷酸(FMN)的氧化还原酶没有特别的限制，其取决于试样的种类，包含作为辅基的吡咯喹啉醌(PQQ)的氧化还原酶可以列举出：甘油脱氢酶、山梨醇脱氢酶、甘露醇脱氢酶、阿拉伯糖醇脱氢酶、半乳糖醇脱氢酶、木糖醇脱氢酶、阿东糖醇脱氢酶、赤藓糖醇脱氢酶、核糖醇脱氢酶、丙二醇脱氢酶、果糖脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖酸脱氢酶、2-酮葡萄糖酸脱氢酶、5-酮葡萄糖酸脱氢酶、2,5-二酮葡萄糖酸脱氢酶、醇脱氢酶、环醇脱氢酶、乙醛脱氢酶、胺脱氢酶、莽草酸脱氢酶、半乳糖氧化酶等。

包含作为辅基的黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、或者黄素单核苷酸(FMN)的氧化还原酶可以列举出：葡萄糖氧化酶、葡萄糖脱氢酶、D-氨基酸氧化酶、琥珀酸脱氢酶、单胺氧化酶、肌氨酸脱氢酶、甘油脱氢酶、山梨糖醇脱氢酶、D-乳酸脱氢酶、胆固醇氧化酶等。

其中，优选包含有作为辅基的吡咯喹啉醌(PQQ)或者黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的至少一者的甘油脱氢酶，特别优选包含作为辅基的吡咯喹啉醌(PQQ)的甘油脱氢酶(以下，也称为“PQQ依赖性甘油脱氢酶”)。

上述的本发明的氧化还原酶既可以使用市售的商品，也可以使用自行制备的氧化还原酶。作为自行制备这样的氧化还原酶的手法，例如可列举出在营养培养基中培养产生该氧化还原酶的细菌，从该培养物中提取该氧化还原酶的已知方法(例如、参照日本特开2008-220367号公报)。

具体而言，将PQQ依赖性甘油脱氢酶作为例子列举时，作为产生该甘油脱氢酶的细菌，例如可列举出属于葡萄糖杆菌属、假单胞菌等各属的细菌。特别是优选使用存在于葡萄糖杆菌属细菌的膜成分中的PQQ依赖性甘油脱氢酶。予以说明、从到手的容易程度考虑，可以使用微白葡糖杆菌(Gluconobacteralbidus)NBRC 3250、3273、103509、103510、103516、103520、103521、103524;蜡状葡糖杆菌(Gluconobacter cerinus)NBRC3267、3274、3275、3276;弗氏葡糖杆菌(Gluconobacterfrateurii)NBRC 3171、3251、3253、3262、3264、3265、3268、3270、3285、3286、3290、16669、103413、103421、103427、103428、103429、103437、103438、103439、103440、103441、103446、103453、103454、103456、103457、103458、103459、103461、103462、103465、103466、103467、103468、103469、103470、103471、103472、103473、103474、103475、103476、103477、103482、103487、103488、103490、103491、103493、103494、103499、103500、103501、103502、103503、103504、103506、103507、103515、103517、103518、103519、103523;Gluconobacter japonicus NBRC 3260、3263、3269、3271、3272;Gluconobacter kanchanaburiensis NBRC 103587，103588;Gluconobacter kondonii NBRC 3266;氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)NBRC 3130、3189、3244、3287、3292、3293、3294、3462、12528、14819;Gluconobacter roseus NBRC3990;Gluconobacter sp NBRC 3259、103508;Gluconobactersphaericus NBRC 12467;Gluconobacter thailandicus NBRC 3172、3254、3255、3256、3257、3258、3289、3291、100600、100601等。

培养上述PQQ依赖性甘油脱氢酶的培养基，只要是适量含有使用菌株能同化的碳源、氮源、无机物、其他必要的营养素即可，既可以是合成培养基，也可以是天然培养基。碳源例如可以使用葡萄糖、甘油、山梨糖醇等。氮源例如可以使用蛋白胨类、肉浸膏，酵母浸膏等含氮天然物质、氯化铵、柠檬酸铵等含无机氮的物质。无机物可以使用磷酸钾、磷酸钠、硫酸镁等。此外，可以根据需要使用特定的维生素等。上述碳源、氮源、无机物以及其他必要的营养素，既可以单独使用也可以2种以上合并使用。

培养优选震荡培养或者通气搅拌培养。培养温度优选20℃~50℃、更优选22℃~40℃、最优选25℃~35℃。培养pH优选4~9、更优选5~8。除此之外的条件下，如果使用的菌株也能生长发育也可以实施。培养时间通常优选0.5~5天。通过上述培养，菌体内积蓄氧化还原酶。予以说明，这些氧化还原酶既可以是通过上述培养得到的酶，也可以是将氧化还原酶的基因转导至大肠菌等得到的重组酶。

接着，提取得到的PQQ依赖性甘油脱氢酶。提取方法能够使用一般常用的提取方法，例如超声波破碎法、弗氏细胞压碎法、有机溶剂法、溶菌酶法等。提取出来的氧化还原酶的精制方法没有特别的限制，例如应用使用硫酸铵、芒硝等的盐析法;使用氯化镁、氯化钙的金属凝集法;使用链霉素、聚乙烯亚胺去除核酸;或者使用DEAE(二乙氨基乙基)-琼脂糖凝胶、CM(羧甲基)-琼脂糖凝胶等离子交换色谱法等。

予以说明，通过这些方法得到的部分精制酶和精制酶液，既可以按原样的形式使用，也可以使用其化学修饰后的形式。本发明中，使用化学修饰过的形式的氧化还原酶时，可以按照例如日本特开2006-271257号公报所述的方法等将上述方法得到的培养物来源的氧化还原酶进行适宜的化学修饰后使用。予以说明，化学修饰方法不限于上述公报所述的方法。

关于本发明的氧化还原酶的含量没有特别的限制，可以根据测定试样的种类和试样的添加量、电子传递体的种类和后述的亲水性高分子的量等进行适宜选择。举个例子，例如、使用PQQ依赖性甘油脱氢酶时，每1sensor中，从迅速进行甘油的分解而且不降低反应层的溶解性的酶量(酶活性量)的观点考虑、优选0.01~100U、更优选0.05~50U、特别优选0.1~10U。予以说明，PQQ依赖性甘油脱氢酶的活性单位(U)的定义以及测定方法，根据日本特开2006-271257号公报中记载的方法进行。另外，包含有PQQ依赖性甘油脱氢酶的氧化还原酶，后面还会讲述，例如，优选预先用甘氨酰甘氨酸那样的缓冲液进行制备。

(脂质分解酶)

另外，本发明中的第二反应层9包含对构成脂质的酯键进行水解的脂质分解酶。因此，本发明的生物传感器可以作为中性脂肪传感器使用。作为这样的脂质分解酶没有特别的限制，具体而言可适当列举为脂蛋白脂肪酶(LPL)、脂肪酶、酯酶。特别是，从反应性观点出发，优选脂蛋白脂肪酶(LPL)。

关于脂蛋白脂肪酶(LPL)的含量没有特别的限制，可以根据测定的试样种类和试样添加量、使用的亲水性高分子的量和电子传递体的种类等进行适宜选择。举个例子，能迅速进行中性脂肪的分解而且不降低反应层的溶解性的酶量(酶活性量)的观点出发，每1sensor中、优选0.1~1000活性单位(U)、更优选1~500U、特别优选10~100U。予以说明，LPL的活性单位(U)的定义以及测定方法，根据国际公开第2006/104077号小册子记载的方法进行。另外，脂蛋白脂肪酶(LPL)在后面还会讲述，优选事先用甘氨酰甘氨酸那样的缓冲液制备。

本发明中，上述氧化分解酶和上述脂质分解酶分别各自存在于第一反应层以及第二反应层这样的不同的层中。只要是这样的形式，由脂质分解酶催化的水解反应就能效率良好地进行。

(电子传递体)

本发明的生物传感器优选包含电子传递体。这里，电子传递体也可被包含在第一反应层8或第二反应层9中，但是优选被包含在和这些反应层分离的第三反应层中。这时，包含电子传递体的反应层优选与电极分开存在，更优选与第一反应层8或者第二反应层9、尤其是第二反应层9分开存在。即，本发明提供一种生物传感器(第2生物传感器)，所述生物传感器具有绝缘性基板、形成在上述绝缘性基板上的至少包含工作电极和对电极的电极系统、以及形成在上述电极系统上的试样供给部，所述试样供给部具备包含第一反应层和第二反应层的反应层，第一反应层形成在上述电极系统上，包含含有作为辅基的吡咯喹啉醌（PQQ）、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、或黄素单核苷酸(FMN)的氧化还原酶；第二反应层是通过在上述第一反应层上涂布包含脂质分解酶的溶液形成的，按照与上述第一反应层和第二反应层分离的方式，进一步形成包含电子传递体的第三反应层。

本发明的第2生物传感器当中，第三反应层10包含电子传递体(有时也称为“电子受体”)。这样，通过使电子传递体与电极分开存在，通过类似局部电池的现象能够抑制·防止电子传递体的自动还原。通过这些，能够提供精度更高的生物传感器。

在使用生物传感器时，电子传递体接受通过氧化还原酶的作用生成的电子，即被还原。接着，被还原的电子传递体在酶反应完成以后，通过向电极施加电压被电化学地氧化。根据此时流动的电流(以下，也称作“氧化电流”)的大小算出试样中目标成分的浓度。

作为本发明中所使用的电子传递体，可以使用目前公知的电子传递体、可以根据试样、使用的氧化还原酶适宜决定。予以说明，电子传递体既可以单独使用，也可以组合2种以上使用。

作为电子传递体，更具体而言，可以适当使用铁氰化钾、铁氰化钠、二茂铁及其衍生物，酚嗪硫酸甲酯及其衍生物、对苯醌及其衍生物、2,6-二氯苯酚靛酚、亚甲基蓝、硝基四氮唑蓝、锇络合物、氯化六氨合钌(Ⅲ)等钌络合物等。予以说明，优选的是氯化六氨合钌(Ⅲ)、铁氰化钾，更加优选使用氯化六氨合钌(Ⅲ)。

关于电子传递体的含量没有特别的限制，可以根据试样的添加量等适宜调节。举个例子，每1sensor中，从使其含有相对于底物量为充分量的电子传递体的观点考虑，电子传递体的含有量优选为1~2000μg、更加优选5~1000μg、特别优选10~500μg。另外、后面还会讲述，电子传递体优选事先用类似甘氨酰甘氨酸那样的缓冲溶液进行制备。

(表面活性剂)

本发明的生物传感器中，第一反应层8、第二反应层9或者第三反应层10，可以根据需要具备表面活性剂。另外，本发明的第1生物传感器中，表面活性剂层与第一反应层8以及第二反应层9分离地形成在壳体7侧。

由于氧化还原酶是由蛋白质构成，如果氧化还原酶附着在电极表面，电极表面恐怕会钝化，因此目前的一般生物传感器中，采用酶不直接接触电极的构成。但是，通过使第一反应层8中含有表面活性剂，可以显著抑制防止氧化还原酶在电极上固着，结果，能够提高电极附近的由氧化还原酶催化的氧化型电子传递体向还原型电子传递体的转换效率，换言之，可以进一步提高与试样液中的底物浓度的相关性。另外，如果壳体7的一侧形成有表面活性剂，相比于壳体7直接和试样接触的情况，全血等试样向壳体侧的扩散和润湿性变好，能够尽快将试样导入到试样供给部，因而优选。

作为本发明中使用的表面活性剂，只要不降低本发明中使用的氧化还原酶的活性即可，没有什么特别的限制，例如，可以适宜选择使用非离子表面活性剂、两性表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、天然型表面活性剂等。这些表面活性剂，既可以单独使用，也可以以混合物的形式使用。从不影响本发明的氧化还原酶的酶活性的观点出发，优选非离子表面活性剂以及两性表面活性剂的至少一种。

作为非离子表面活性剂，没有特别的限制，从不影响本发明的氧化还原酶的酶活性的观点出发，优选聚氧乙烯系或者烷基糖苷系。

作为聚氧乙烯系非离子表面活性剂，没有特别的限制，优选聚氧乙烯对叔辛酚(氧亚乙基数=9，10)[(polyoxyethylene-p-t-octylphenol;Triton(注册商标)X-100)]、聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯(Polyoxyethylene SorbitanMonolaurate;Tween 20)、聚氧乙烯失水山梨醇单棕榈酸酯(Polyoxyethylene Sorbitan Monopalmitate;Tween 40)、聚氧乙烯失水山梨醇单硬脂酸酯(Polyoxyethylene SorbitanMonostearate;Tween 60)、聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯(Polyoxyethylene Sorbitan Monooleate;Tween80)、聚氧乙烯聚氧丙烯二醇(EmulgenPP-290(花王株式会社制))等。予以说明，从提高本发明的氧化还原酶的溶解性的观点出发，优选聚氧乙烯对叔辛酚(氧亚乙基数=9，10)[(polyoxyethylene-p-t-octylphenol;Triton(注册商标)X-100)]、聚氧乙烯聚氧丙烯二醇(EmulgenPP-290(花王株式会社制))。

作为烷基糖苷系非离子表面活性剂，没有特别的限制，优选具有碳原子数为7~12个的烷基的烷基糖苷、烷基硫糖苷等。对于相关碳原子数，更优选7~10个，特别优选碳原子数为8个。糖部分，优选葡萄糖、麦芽糖、更优选为葡萄糖。更具体而言，优选正辛基-β-D-葡萄糖苷、正辛基-β-D-硫糖苷。在使用生物传感器时、在制造过程中，烷基糖苷系非离子表面活性剂非常容易涂布、均一。特别是、正辛基-β-D-硫糖苷)包含于反应层10(第一反应层8、第二反应层9)时，在滴加试样溶液时的扩散性非常好，润湿性良好(不易产生表面张力)。因此，从扩散性和润湿性的观点考虑，相比于烷基糖苷，非常优选烷基硫糖苷。还有，它们既可以单独使用也可以以混合物的形式使用。

作为两性表面活性剂没有特别的限制，例如可列举出3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)、3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲氨基]-2-羟基丙磺酸(CHAPSO)、正烷基-N-N-二甲基-3-铵基-1-丙磺酸(Zwittergent(注册商标))等。予以说明，这些既可以单独使用也可以以混合物的形式使用。优选的是，3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸(CHAP S)或者3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲氨基]-2-羟基丙磺酸(CHAPSO)，特别优选CHAPS。这个理由是因为CHAPS是表面活性剂当中的低溶血性物质。

作为阳离子表面活性剂，没有特别的限制，例如可列举出氯化十六烷基吡啶、三甲基溴化铵。这些既可以单独使用也可以以混合物的形式使用。

作为阴离子表面活性剂没有特别的限制，例如可列举出、胆酸钠、脱氧胆酸钠等。这些既可以单独使用也可以以混合物的形式使用。

作为天然型表面活性剂没有特别的限制，例如可列举出磷脂。优选可列举卵黄卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化卵磷脂、高纯度卵磷脂等卵磷脂。这些既可以单独使用也可以以混合物的形式使用。

上述表面活性剂当中，从进一步提高生物传感器的精度的观点出发，在使用全血作为试样的情况下，优选使用低溶血性的表面活性剂。如果举具体的例子，优选上述的CHAPS、Tween、EmulgenPP-290(花王株式会社制)(聚氧乙烯聚氧丙烯二醇)。

另外，本发明的第2生物传感器中，表面活性剂包含在第一反应层8、第二反应层9以及第三反应层10的任意一层都可以，优选第一反应层8或者第三反应层10包含表面活性剂，更优选第一反应层8和第三反应层10都包含表面活性剂。通过此举，能够促进氧化还原酶和电子传递体的溶解。另外，上述3个反应层的2个以上反应层中存在表面活性剂的情况下，这些反应层内包含的各表面活性剂的种类和配合量既可以相同也可以不同。这时，优选考虑与第一反应层8、第二反应层9、第三反应层10中含有的各构成要素之间的相互作用进行选择。

更具体的，首先，如上所述，第一反应层8中包含氧化还原酶，例如，含有PQQ依赖性甘油脱氢酶作为氧化还原酶的情况下，由于其疏水性强，优选至少在第一反应层8中包含表面活性剂。这时，作为表面活性剂的种类，以进一步提高生物传感器的精度的观点，在使用全血作为试样的情况下，优选使用低溶血性的表面活性剂(例如、CHAPS、Tween、EmulgenPP-290等)。一方面，如上所述，第2生物传感器当中，第三反应层10包含电子传递体(例如，氯化六氨合钌(Ⅲ))，这时，以提高扩散性和润湿性，进一步提高生物传感器的精度的观点，优选第三反应层10中也包含表面活性剂。这种情况下还考虑扩散性和润湿性的观点，优选使用低溶血性的表面活性剂(例如CHAPS、Tween、EmulgenPP-290等)。通过实施这样的办法，进一步提高了生物传感器的精度。

关于表面活性剂的含量没有特别的限制，可根据试样的添加量等适宜调节。

在使用两性表面活性剂作为表面活性剂时，为了提高本发明的氧化还原酶的溶解性而且不使酶活性失活，另外从制造工序中容易涂布的观点出发，每1sensor中优选含有0.01~100μg、更优选0.05~50μg、特别优选0.1~10μg。另外，这样的表面活性剂后面还会讲述，优选事先用类似甘氨酰甘氨酸那样的缓冲溶液进行制备。予以说明，1sensor中包含2种以上的表面活性剂时，含量意味着2种以上表面活性剂的总量。

使用非离子表面活性剂作为表面活性剂时，为了提高本发明的氧化还原酶的溶解性而且不使酶活性失活，另外从制造工序中容易涂布的观点出发，每1sensor中优选含有0.01~100μg、更优选0.05~50μg、特别优选0.1~10μg。另外，这样的表面活性剂、优选事先用类似甘氨酰甘氨酸那样的缓冲溶液进行制备。

(亲水性高分子)

本发明中的第一反应层8、第二反应层9或者第三反应层10，可以进一步包含亲水性高分子。

如上所述，由于氧化还原酶是由蛋白质构成，如果在电极表面附着氧化还原酶，电极表面恐怕会钝化，因此目前的一般生物传感器中，采用酶不直接接触电极的构成。但是，通过使第一反应层8中含有亲水性高分子，显著抑制·防止氧化还原酶固着在电极上，结果是，能够提高电极附近的由氧化还原酶催化的氧化型电子传递体向还原型电子传递体的转换效率、换言之，可以进一步提高与试样液中的底物浓度的相关性。

另外，在第1生物传感器时，亲水性高分子含在第一反应层8或者第二反应层9;或者在第2生物传感器时，亲水性高分子可以含在第一反应层8、第二反应层9或者第三反应层10中的任意一者中。亲水性高分子具有将本发明的氧化还原酶或者电子传递体等固化在电极上的机能。因此，第一反应层8、第二反应层9或者第三反应层10、特别是第一反应层8或者第三反应层10包含亲水性高分子，则能够防止这些反应层从基板1以及电极表面上剥离。另外，亲水性高分子具有防止上述第一反应层8、第二反应层9以及第三反应层10表面开裂的效果，对于提高生物传感器的可靠性有效果。进一步，还能够抑制蛋白质等的吸附性成分向电极的吸附。予以说明，第一反应层8、第二反应层9或者第三反应层10包含亲水性高分子时，既可以采用在反应层内包含亲水性高分子的形式，或者也可以采用将第一反应层8、第二反应层9、或者第三反应层10覆盖而形成包含亲水性高分子的亲水性高分子层的形式。

作为能应用于本发明的亲水性高分子，可以使用迄今已知的亲水性高分子。更具体而言作为亲水性高分子可列举出、聚乙二醇、羧甲基纤维素、羟基乙基纤维素、羟基丙基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、乙基羟基乙基纤维素、羧甲基乙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、多聚赖氨酸等聚氨基酸、聚苯乙烯磺酸、明胶以及其衍生物、丙烯酸的聚合物或者其衍生物、顺丁烯二酸酐的聚合物或者其盐、淀粉以及其衍生物等。这些物质当中，从不使本发明的氧化还原酶的酶活性失活，而且溶解性高的观点出发，优选羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇以及聚乙烯醇。予以说明，这些既可以单独使用也可以以混合物的形式使用。

予以说明、从能够固定化酶和电子传递体，而且不降低反应层的溶解性的观点出发，这样的亲水性高分子的配合量为每1sensor中优选0.01~100μg、更优选0.05~50μg、特别优选0.1~10μg。亲水性高分子，后面还会讲述，例如优选事先用类似甘氨酰甘氨酸那样的缓冲溶液进行制备。另外，使上述的第一反应层8、第二反应层9或者第三反应层10中的2个以上反应层中存在亲水性高分子的情况下，这些反应层中包含的各亲水性高分子的种类和配合量既可以相同也可以不同。这时，优选考虑与第一反应层8、第二反应层9、第三反应层10中含有的各构成要素之间的相互作用进行选择。

(糖)

本发明的第一生物传感器以及第二生物传感器中，在第一反应层8、第二反应层9以及第三反应层10中的至少一层中还可以含糖。糖可以适宜选择使用不和测定中相关酶反应且自身不发生反应的糖，有助于各层的固定化和稳定化。糖包含于第一反应层8、第二反应层9以及第三反应层10中的任意一层为宜，优选至少包含于第一反应层8内。

作为可以包含于第一反应层8、第二反应层9以及第三反应层10中的至少一层中的糖，优选不带有游离型醛基和酮基的不具有还原性的非还原糖。作为这样的非还原糖，可列举出还原基之间结合的海藻糖型寡糖类、糖类的还原基与非糖类结合而成的糖苷、对糖类进行加氢还原而得的糖醇等。具体而言可列举出蔗糖、海藻糖、棉子糖等海藻糖型小糖类;烷基糖苷、酚糖苷、芥末油糖苷等糖苷;以及阿拉伯糖醇、木糖醇等糖醇等。这些非还原糖既可以单独使用也可以以2种以上的混合物的形式使用。予以说明优选海藻糖、棉子糖、蔗糖，特别优选海藻糖。

第一反应层8、第二反应层9以及第三反应层10的至少一层中包含的糖的配合量为每1sensor中优选0.1~500μg、更优选0.5~400μg、进一步优选1~300μg。糖只要是混合物的形式，配合量就意味着所有成分的合计。只要在上述的范围内，就没有传感器性能的降低，能够有助于各层的固定化和稳定化。

(蛋白质)

本发明中的第1以及第2生物传感器中、第一反应层8、第二反应层9以及第三反应层10的至少一层还可以进一步包含蛋白质。能够适宜选择使用不与测定中相关的酶反应，或者自身不发生反应、不显示出生理活性的蛋白质，有助于各层的固定化以及稳定化。蛋白质以包含于第一反应层8、第二反应层9以及第三反应层10的任意一层为宜，优选至少包含于第一反应层8中。

作为可以包含于第一反应层8、第二反应层9以及第三反应层10中的至少一层的蛋白质，可列举出牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白、丝胶蛋白、以及这些物质的水解物。这些蛋白质既可以单独使用也可以以两种以上的混合物的形式使用。这些蛋白质中，从入手容易、成本低的角度考虑，优选BSA。优选蛋白质的分子量为10~1000kDa，更优选25~500kDa、进一步优选50~100kDa。这时，分子量采用使用凝胶渗透色谱法测定的值。

第一反应层8、第二反应层9以及第三反应层10中包含的蛋白质的配合量为每1sensor中优选0.1~200μg、更优选0.5~100μg、进一步优选1~50μg。蛋白质只要是2种以上的混合物形式，配合量就意味着所有成分的合计。只要是上述范围内，就不会使传感器的性能低下，有利于各层的固定化以及稳定化。

<生物传感器的制造方法>

本发明的第1以及第2生物传感器中的第一反应层8、第二反应层9以及第三反应层10的形成方法没有特别的限制。以下，说明本发明的第2生物传感器的制作方法的优选实施形式。予以说明，本发明不受下述方法限定。还有，本发明的第1生物传感器的制作也没有特别的限制，例如，下述中除了不形成第三反应层之外，可以同样地实施。

上述第一反应层8以及第三反应层10可以通过任意一种方法形成，第二反应层9通过涂布包含脂质分解酶的溶液而形成在第一反应层8上。这里，涂布方法没有特别的限制，可以通过滴加或者应用下述涂布器具涂布包含脂质分解酶的溶液的方法，涂布器具包括：喷雾装置、棒涂布机、口模涂机、逆向涂布机、逗点涂布机、凹版涂布机、喷雾涂布机、刮刀涂布机等。

另外，上述第一反应层8以及第三反应层10的形成方法没有特别的限制，可以使用和上述第二反应层的形成方法相同的方法。此时，第二反应层9的形成方法、以及前述的第一反应层8和第三反应层10的形成方法既可以相同也可以不同，考虑到制作的容易性和制造成本等，优选使用同样的方法，特别优选通过滴加法涂布包含规定成分的溶液后将涂膜干燥的方法。这样的方法能够简便地制作生物传感器，另外，从能够降低大量生产时的制造成本这一点来看是优选的。

首先，第一反应层按照以下的方法形成。即，将氧化还原酶(例如，PQQ依赖性甘油脱氢酶)和根据必要的表面活性剂(例如，Emulgen)以及甘氨酰甘氨酸缓冲液等所需要的成分混合，制备氧化还原酶溶液。将此氧化还原酶溶液以规定量滴加到电极(作用部分)中。将制备的氧化还原酶溶液滴加后，通过在保持在规定温度的恒温槽内、热板上进行干燥，在电极(作用部分)上形成第一反应层。予以说明，关于表面活性剂，既可以单独包含于第一反应层内，也可以按照将第一反应层覆盖的形式形成含有表面活性剂的层，还可以在电极上形成表面活性剂层，在该层上形成第一反应层8。另外，也可以根据必要添加上述其他成分(例如，亲水性高分子等)。还有，也可以根据必要事先添加乙醇等挥发性有机溶剂。由于事先添加了挥发性有机溶剂，可以实现容易干、结晶化小。还有，也可以预先在基板1上设置粘接剂。

形成表面活性剂层的情况下，将表面活性剂(例如，EmulgenPP-290(花王株式会社制))与甘氨酰甘氨酸缓冲液、挥发性有机溶剂等所希望的成分混合，制备表面活性剂溶液。将此表面活性剂溶液，按规定量滴加到电极和第一反应层上，或者如后面所述，按规定量滴加到第二反应层、第三反应层或者壳体7上。滴加表面活性剂溶液之后，通过在保持在规定温度的恒温槽内和热板上进行干燥形成表面活性剂层。

接着，按照以下方法形成第二反应层。即，将脂质分解酶(例如，脂蛋白脂肪酶(LPL))、甘氨酰甘氨酸缓冲液等所希望的成分混合制备脂质分解酶溶液。将此脂肪酶分解溶液按照规定量滴加到上述制作的氧化还原酶层中。滴加制备的脂质分解酶溶液之后，通过在保持在规定温度的恒温槽内和热板上进行干燥、在第一反应层上形成第二反应层。予以说明，也可以进一步在第二反应层中追加表面活性剂。表面活性剂既可以单独包含于第二反应层内，也可以为了将第二反应层覆盖如上所述形成包含表面活性剂的层。另外，也可以根据必要添加上述其他成分(例如，亲水性高分子等)。还有，也可以根据必要事先添加乙醇等挥发性有机溶剂。由于事先添加了挥发性有机溶剂，可以实现容易干、结晶化小。

另外，第三反应层按照以下方法形成。即，混合电子传递体(例如、氯化六氨合钌(Ⅲ))、以及根据需要的表面活性剂(例如、Emulgen)和甘氨酰甘氨酸缓冲液等所需要的成分制备电子传递体溶液。将此电子传递体溶液按照规定量滴加至壳体7中。滴加制备的电子传递体溶液之后，通过在保持在规定温度的恒温槽内和热板上进行干燥、在壳体上形成第三反应层。此时，关于表面活性剂，既可以单独包含于反应层内，也可以按照将反应层覆盖的方式按照上述方法形成包含表面活性剂的层，还可以在壳体上形成表面活性剂层，在其上形成第三反应层10。还有，也可以预先在壳体7上设置粘接剂。

最后，通过由粘接剂6a、6b将形成有第一反应层8以及第二反应层9的基板1和形成有第三反应层10的壳体7粘合，可以制造第2生物传感器。

<生物传感器的应用>

在本发明中使用的试样优选溶液形式。作为溶液形式的溶剂没有特别的限制，可以适宜参照目前公知的溶剂或者将其组合应用。

作为试样没有特别的限制，例如可列举出全血、血浆、血清、唾液、尿、骨髓等生物试样;果汁等的饮料水、酱油、调味汁等食品类;排水、雨水、泳池用水等。优选的是全血、血浆、血清、唾液、骨髓，更优选的是全血。

予以说明，试样既可以原封不动地使用原液，也可以使用以调节粘度等为目的用适当的溶剂稀释过的溶液。关于试样中包含的底物没有特别的限制，只要是能和本发明的第一反应层以及第二反应层中包含的各酶反应，并能够产生能如后述那样测定的电流的物质即可。

作为试样中所希望的成分(底物)，可列举出葡萄糖等糖类、甘油、山梨糖醇、阿拉伯糖醇等多元醇;中性脂肪、胆固醇等脂质;谷氨酸和乳酸等有机酸;肌酸、肌酐等。出于和上述同样的理由，优选选择中性脂肪和胆固醇等脂质作为底物。

向试样供给部供给试样的形式没有特别的限制，例如可以利用毛细管现象由水平方向对反应层(第一反应层8、第二反应层9、第三反应层10)供给试样。

向反应层(第一反应层8、第二反应层9、第三反应层10)供给试样时，试样中所希望的成分(底物)通过第二反应层9包含的脂质分解酶和第一反应层8包含的氧化还原酶的作用被氧化，自身氧化的同时放出电子。从底物中放出的电子，被从第三反应层10中溶出的电子传递体捕捉，伴随着这个过程电子传递体由氧化型向还原型变化。添加试样后，通过将生物传感器按规定时间放置，在脂质分解酶和氧化还原酶的催化下底物被完全氧化，一定量的电子传递体由氧化型向还原型变换。

通过本发明的生物传感器，显著缩短了底物和酶之间反应完结的反应时间(即，测定时间)。此时，底物和酶之间反应完结的反应时间(测定时间)没有特别的限制，添加试样后、通常为1秒～120秒、优选1秒～90秒、更优选1～60秒、特别优选1～45秒。

其后，以将还原型电子传递体氧化为目的，通过电极向工作电极2和对电极4之间施加规定电压。通过施加电压，还原型电子传递体被电化学地氧化向氧化型转换。从此时测定的电流(以下，也称为“氧化电流”)值，能够算出施加电压前的还原型电子传递体的量，进一步，可以定量与酶反应的底物的量。流动氧化电流时施加的电压值没有特别的限制，可以参照目前公知的知识适宜调节。举个例子，向对电极4和工作电极2之间施加-200～+700mV左右，优选0～+500mV的电压即可。关于用于施加电压的电压施加手段没有特别的限制，可以适宜使用目前公知的电压施加手段。

作为氧化电流值的测定、以及由该电流值向底物浓度换算的手法，既可以使用计时电流法也可以使用计时电位法，计时电流法是测定从施加规定电压开始一定时间后的电流值;计时电位法是测定通过将计时电流法得到的电流应答对时间积分得到的电荷量。从通过简单的装置系统测定的点来看，优选使用计时电流法。

以上，通过测定还原型电子传递体氧化时的电流(氧化电流)算出底物浓度的形式为例进行了说明，根据情形，可以采用通过测定将没有被还原残留的氧化型电子传递体还原时的电流(还原电流)算出底物浓度的形式。

本发明的生物传感器，可以以任意的形式使用没有特别的限制。例如，作为为一次性的用途的一次性类型的生物传感器，至少将电极部分埋入人体连续地测定规定值用途的生物传感器等，在各种各样用途中使用。

本发明的生物传感器，能够应用到中性脂肪传感器、胆固醇传感器等目前公知的传感器中。

以下归纳本发明的效果。

本发明的生物传感器中，氧化还原酶以及脂质分解酶包含在不同的反应层中，因此由脂质分解酶催化的中性脂肪向甘油的分解以及氧化还原酶催化的氧化反应进行迅速。因此，能够在短时间内测定试样中的葡萄糖和中性脂肪的浓度。另外，此时几乎不产生测定值的偏差，生物传感器的测定精度可以得到提高。

实施例

用以下实施例以及比较例说明本发明的效果。但是，本发明的技术范围并不受以下的实施例限制。予以说明，只要没有特别声明，“%”是指“质量%”。

<全血中的中性脂肪浓度的测定>

(实施例1)

电极使用的是DEP Chip EP-N(Bio Device Technology Co.，Ltd.)。DEP Chip EP-N是在绝缘性基板1上分别形成有由炭构成的工作电极2、参比电极3、对电极4，夹着绝缘层5，形成有由炭构成的工作电极作用部分2-1、由银/氯化银构成的参比电极作用部分3-1、由炭各批次的对电极作用部分4-1。

第一反应层(GLDH)按照以下的步骤形成。

每1sensor中(供给的试样“全血”量为2μl)，混合终浓度为1.5U的PQQ依赖性甘油脱氢酶、5mM(0.65μg)的甘氨酰甘氨酸(和光纯药工业工业株式会社制)、0.025%(0.5μg)的EmulgenPP-290(花王株式会社制)，得到溶液(GLDH溶液)。以覆盖EP-N的工作电极作用部分、参比电极作用部分、以及对电极作用部分的方式滴加得到的GLDH溶液，在30℃下使其干燥5分钟，得到第一反应层(GLDH层)。

第二反应层(LPL层)按照以下的步骤形成。

每1sensor(试样液量为2μl)中，混合脂蛋白脂肪酶(LPL、旭化成株式会社制)75U、甘氨酰甘氨酸(和光纯药工业工业制)5mM(0.65μg)，得到溶液(LPL溶液)。以重叠（覆盖）在形成的GLDH层上的方式滴加得到的LPL溶液，30℃下使其干燥5分钟、得到第二反应层(LPL层)。

这样，在作为第一反应层的GLDH层上形成（重叠）了作为第二反应层的LPL层。

第三反应层(电子传递体层)按照以下的步骤形成。

每1sensor(供给的试样“全血”的量为2μl)中，混合终浓度为100mM(65μg)的氯化六氨合钌(Ⅲ)(和光纯药工业工业株式会社制)、25mM(3.25μg)的甘氨酰甘氨酸(和光纯药工业工业株式会社制)、0.1%(2μg)的EmulgenPP-290(花王株式会社制)，得到介质溶液。将得到的介质溶液滴加到由PET形成的壳体中所贴合的粘接剂(两面胶)的间隙中，然后在50℃下干燥5分钟，形成第三反应层(电子传递体层)。

通过将形成有第三反应层的壳体与粘接在形成有第一反应层以及第二反应层的基板上的粘接剂(两面胶)相互贴合，制作中性脂肪传感器，进行特性评价。予以说明，此时第一反应层、第二反应层以及第三反应层的厚度分别为5μm，第二反应层和第三反应层之间的间隔距离为0.15mm。

吸入2μl的试样液(全血，中性脂肪值300mg/dl)，在经过作为反应时间的各秒钟后，以参比电极为基准，在工作电极和对电极之间施加+200mV的电压，5秒钟后测定工作电极和对电极之间流动的电流值。这个电流值与还原的电子传递体的浓度，即全血中被分解的中性脂肪的浓度成比例，由这个电流值可以求出全血中的中性脂肪的浓度。结果在表1以及图5中表示。予以说明，图5中，用空心圆圈(○)表示实施例1的结果。

(实施例2)

和上述实施例1相同，形成第一反应层(GLDH层)。

第二反应层(含有电子传递体的LPL层)按照以下的步骤形成。

每1sensor(试样液量为2μl)中，混合脂蛋白脂肪酶(LPL、旭化成株式会社制)75U、甘氨酰甘氨酸(和光纯药工业工业制)5mM(0.65μg)、氯化六氨合钌(Ⅲ)(和光纯药工业工业株式会社制)100mM(65μg)，得到溶液(含有LPL电子传递体溶液)。将得到的含有电子传递体的LPL溶液按照重叠（覆盖）覆盖所形成的GLDH层上的方式进行滴加，30℃下使其干燥5分钟，得到第二反应层(含有电子传递体的LPL层)。

这样，在作为第一反应层的GLDH层上形成（重叠）作为第二反应层的含有电子传递体的LPL层。

表面活性剂层按照以下的步骤形成。

每1sensor(供给的试样“全血”量为2μl)中，混合终浓度为25mM(3.25μg)的甘氨酰甘氨酸(和光纯药工业工业株式会社制)、0.1%(2μg)的EmulgenPP-290(花王株式会社制)，得到表面活性剂溶液。将得到的表面活性剂溶液滴加到由PET形成的壳体中所贴合的粘接剂(两面胶)的间隙中，之后在50℃下使其干燥5分钟，形成表面活性剂层。

通过将形成有表面活性剂层的壳体和形成有第一反应层以及第二反应层的基板上粘接的粘接剂(两面胶)相互贴合，制作中性脂肪传感器，进行活性评价。予以说明，此时第一反应层、第二反应层以及表面活性剂层的厚度分别为5μm、第二反应层和表面活性剂层之间的距离为0.15mm。

对照这样制作的中性脂肪传感器，与实施例1同样测定电流值。结果在表1和图5中表示。予以说明，图5中，实施例2的结果用空心三角(△)表示。

(比较例)

和上述实施例1同样制备GLDH溶液和LPL溶液。接着，将GLDH溶液和LPL溶液和以每1sensor(供给的试样“全血”的量为2μl)中的各成分量与实施例1相同的方式进行混合，将此混合液以覆盖EP-N的工作电极作用部分、参比电极作用部分、以及对电极作用部分的方式进行滴加，30℃下使其干燥5分钟，除了形成GLDH层和LPL层的混合层以外，通过和实施例1同样的方法制作比较用中性脂肪传感器。

对这样制作的比较用中性脂肪传感器，与实施例1同样测定电流值。结果在表1和图5中表示。予以说明，图5中，比较例1的结果用涂黑的四角(◆)表示。

(实施例3)

所使用的电极是自行设计、制造的3电极系统的电极。该电极是在绝缘性基板1上形成有由炭构成的工作电极2、参比电极3、对电极4，夹着绝缘层5形成有由炭构成的工作电极作用部分2-1、由银/氯化银构成的参比电极作用部分3-1、由炭构成的对电极作用部分4-1。

第一反应层(GLDH)按照以下的步骤形成。

每1sensor(供给的试样“全血”的量为1μl)中，混合终浓度为1.0U的PQQ依赖性甘油脱氢酶、10mM(1.3μg)的甘氨酰甘氨酸(和光纯药工业株式会社制)、0.05%(0.5μg)的EmulgenPP-290(花王株式会社制)、以及0.75%(7.5μg)的作为亲水性高分子聚乙二醇6000(和光纯药工业株式会社制)，得到溶液(GLDH溶液)。将得到的GLDH溶液以覆盖电极的工作电极作用部分、参比电极作用部分、以及对电极作用部分的方式进行滴加，40℃下使其干燥5分钟，得到第一反应层(GLDH层)。

第二反应层(含有电子传递体的LPL层)按照以下的步骤形成。

每1sensor(试样液量为1μl)中，混合脂蛋白脂肪酶(LPL、旭化成株式会社制)80U、甘氨酰甘氨酸(和光纯药工业株式会社制)5mM(0.65μg)、氯化六氨合钌(Ⅲ)(和光纯药工业株式会社制)200mM(61.9μg)，得到溶液(电子传递体含有LPL溶液)。将得到的含有电子传递体的LPL溶液按照重叠（覆盖）所形成的GLDH层的方式进行滴加，40℃下使其干燥5分钟，得到第二反应层(含有电子传递体的LPL层)。

这样，在作为第一反应层的GLDH层上形成（重叠）作为第二反应层的含有电子传递体的LPL层。

表面活性剂层按照以下的步骤形成。

通过将形成有表面活性剂层的壳体和形成有第一反应层以及第二反应层的基板上粘接的粘接剂(两面胶)相互贴合，制作中性脂肪传感器，进行活性评价。予以说明，此时，第一反应层、第二反应层以及表面活性剂层的厚度分别为5μm、第二反应层和表面活性剂层之间的距离为0.1mm。

对这样得到的中性脂肪传感器按照以下的方法进行评价。吸入1μl的试样液(全血，中性脂肪值(183mg/dl)，在经过作为反应时间的各秒钟后，之后以参比电极为基准，在工作电极和对电极之间施加+200mV的电压，1秒钟后测定工作电极和对电极之间流动的电流值。这个电流值与还原的电子传递体的浓度，即全血中被分解的中性脂肪的浓度成比例，由这个电流值可以求出全血中的中性脂肪的浓度。结果在表1和图6中表示。予以说明，图6中，实施例3的结果，用空心圆圈(○)表示。

(实施例4)

除了用同浓度的聚乙烯醇500(和光纯药工业株式会社制)代替实施例3的0.75%(7.5ug)的聚乙二醇6000以外，和实施例3同样测定电流值。这个结果在表1和图6中表示。另外，图6中，实施例4的结果用涂黑圆圈(●)表示。

(实施例5)

除了用10%(100μg)的海藻糖(和光纯药工业株式会社制)代替实施例3的0.75%(7.5μg)的聚乙二醇6000以外，和实施例3同样测定电流值。这个结果在表1和图7中表示。另外，图7中，实施例5的结果用空心四角(□)表示。

(实施例6)

除了用1%(10μg)的BSA(和光纯药工业株式会社制)代替实施例3的0.75%(7.5μg)的聚乙二醇6000以外，和实施例3同样测定电流值。这个结果在表1和图7中表示。另外，图7中，实施例6的结果用空心三角(△)表示。

[表1]

如上述表1、图5、图6以及图7所表示的那样，比较例的比较用中性脂肪传感器中，测定的电流值达到平衡时大约需要120秒；与此相对，可知实施例1～6的中性脂肪传感器，电流值达到平衡时大约需要45秒。这些结果明确地表明：通过使用本发明的生物传感器，可以在与目前相比更短的时间内测定中性脂肪。比较例的结果可以这样考虑：在溶解性方面，相比于作为氧化还原酶的GLDH，作为脂质分解酶的LPL更胜一筹，因此如比较例的比较用中性脂肪传感器那样，使GLDH和LPL以混合状态存在于同一层时，GLDH的低溶解性也影响到了LPL的溶解性，因此结果是整体的溶解性降低。另一方面，本发明的中性脂肪传感器解决了这样的问题，如实施例所示的那样，通过将上述2种酶分别置于不同的层中，LPL可以迅速地溶解、反应，之后GLDH溶解进行反应。结果是，使2种酶分别包含于不同层中的方法，可以使整体的反应性变好，因此可以推知通过本发明实现了反应时间的缩短。

另外，实施例3~6中，反应时间也与实施例1~2相同程度地缩短到45秒。因此，第一反应层、第二反应层以及第三反应层的至少一层中，混入糖、蛋白质或者亲水性高分子时，也可以得到更优异的缩短反应时间的效果。

[附图标记说明]

1    绝缘性基板、

2    工作电极、

2-1  工作电极作用部分、

3    参比电极、

3-1  参比电极作用部分、

4    对电极、

4-1  对电极作用部分、

5    绝缘层、

6    (6a、6b)粘接剂、

7    壳体、

8    第一反应层、

9    第二反应层、

10   第三反应层、

S    空间部。

Claims (7)

1.一种生物传感器，所述生物传感器具有绝缘性基板、形成在上述绝缘性基板上的至少包含工作电极和对电极的电极系统、以及形成在上述电极系统上的试样供给部，

所述试样供给部具备包含第一反应层和第二反应层的反应层，

第一反应层形成在上述电极系统上，至少包含含有作为辅基的吡咯喹啉醌（PQQ）、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、或黄素单核苷酸(FMN)的氧化还原酶；

第二反应层是通过在上述第一反应层上涂布包含脂质分解酶的溶液形成的。

2.根据权利要求1所述的生物传感器，上述试样供给部进一步包含电子传递体。

3.根据权利要求2所述的生物传感器，上述电子传递体配置在第二反应层，或者

按照与上述第一反应层和第二反应层分离的方式，在上述试样供给部进一步设置具有电子传递体的第三反应层。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的生物传感器，上述氧化还原酶为包含作为辅基的吡咯喹啉醌(PQQ)的多元醇脱氢酶。

5.根据权利要求3或4中任一项所述的生物传感器，上述第一反应层、第二反应层或第三反应层进一步包含表面活性剂。

6.根据权利要求3～5中任一项所述的生物传感器，上述第一反应层、第二反应层或第三反应层进一步包含亲水性高分子。

7.根据权利要求3～6中任一项所述的生物传感器，上述第一反应层、第二反应层或第三反应层进一步包含糖和蛋白质中的至少一种。

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