CN102887914A - 含芳基硼酸香豆素类化合物及其在糖检测中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种含芳基硼酸香豆素类化合物及其在糖检测中的应用，新型的荧光分子探针利用芳基硼酸与多元醇特异性结合的性质，其与糖反应前后化合物的光谱发生明显变化，对D-果糖和D-山梨醇具有较高的检测灵敏度，发射波长达620nm、位于红光区，适用于生物体内糖含量的检测。

Description

含芳基硼酸香豆素类化合物及其在糖检测中的应用

【技术领域】

本发明涉及糖检测技术领域，具体地说，是一种含芳基硼酸香豆素类化合物及其在糖检测中的应用。

【背景技术】

哺乳动物细胞表面的糖主要以糖蛋白和糖脂的形式存在。这些糖基化的生物分子与许多生理和病理过程密切相关，如细胞间的信息交流、胚胎早期发育、细胞凋亡、炎症反应以及某些癌症转移等。通过在细胞上标记对糖类化合物有特异性响应的探针分子可以帮助研究上述生理或病理过程。硼酸因可与单糖分子中的二醇发生特异性共价键合常被用作糖识别单元。利用硼酸共价键合不同的发色团对糖进行特异性识别的荧光探针已诸见报道，但已有探针的发射波长大多较短，限制了它们在生物试样中的应用，因此发展具有长发射波长、高灵敏的糖探针具有较高的应用价值。

香豆素因其荧光量子产率高、稳定性好、Stokes位移较大，是荧光探针分子设计时常用的发色团。如果扩大该荧光团的共轭体系、增加分子的电子推-拉作用，可以使得最大吸收和发射波长红移，基于此本发明设计了新型的香豆素类荧光分子探针，通过将α，β-不饱和酮共轭连接在香豆素分子上以延长共轭体系，分子上吸电子的乙烯基酮基和给电子的N，N-二乙基氨基组成的电子推拉体系也有利于发射和激发波长的红移。将苯硼酸通过共价键连接至发色团上作为糖分子受体，与糖结合后探针分子的电子和能量状态的改变将导致其光谱性质的变化，从而实现对糖类化合物的检测。

【发明内容】

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种含芳基硼酸香豆素类化合物及其在糖检测中的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种含芳基硼酸香豆素类化合物，其结构通式：

式中：R为N，N-二烷基氨基、羟基或者烷氧基。

一种含芳基硼酸香豆素类化合物的合成方法，其具体步骤为：

(1)4-溴苯乙酮，双(频哪醇合)二硼，醋酸钾以及1，1′-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯和溶剂加入到反应器中，其中，4-溴苯乙酮与双(频哪醇合)二硼的摩尔比为1.0∶1.0～1.8；4-溴苯乙酮与醋酸钾的摩尔比为1.0∶2.0～3.0；[1，1′-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯与4-溴苯乙酮的摩尔量之比为1～3∶100；4-溴苯乙酮，双(频哪醇合)二硼，醋酸钾以及1，1′-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯的混合物与溶剂的固液比为1∶3～5(g/mL)；加热回流，TLC点板跟踪反应至原料消失；除去溶剂，硅胶柱提纯，得淡黄色粘稠状产物1，产率92.5％；

所述的溶剂为二氧六环；

(2)4-R基取代水杨醛，丙二酸二乙酯和溶剂加入到反应器中，其中4-R基取代水杨醛与丙二酸二乙酯的摩尔比为1∶2～3；4-R基取代水杨醛与溶剂的固液比为1∶5～7(g/mL)，加热回流13h；旋转蒸发除去溶剂后向烧瓶中加入1∶1的浓盐酸和冰醋酸的混合酸，4-R基取代水杨醛与混合酸的固液比为1∶6～8(g/mL)，继续搅拌回流7h；将反应液冷却至室温后倒入去离子水中，用NaOH溶液调节溶液的pH至5左右，析出沉淀，抽滤，得茶绿色固体；粗产物经硅胶柱分离，得米黄色固体2，产率81.4％；所述的溶剂为乙醇与二氧六环，体积比为30∶1；R基为N，N-二烷基氨基、羟基或者烷氧基；

(3)在N₂保护下，向装有POCl₃的反应器中滴加DMF，将由步骤2所得的米黄色固体2的DMF溶液缓慢滴加到上述试样中，溶液颜色逐渐由橙黄色变为深红色；加热搅拌，在60～70℃反应15～25h；将反应液倒入冰水中，用NaOH溶液调节pH至5左右，抽滤，得红褐色固体，干燥；粗产物经硅胶柱分离，旋蒸去溶剂，得橙红色结晶物3，产率61.0％；

(4)将由步骤3得到的橙红色结晶物3，步骤1得到的淡黄色粘稠状产物1以及溶剂加入到反应器中，然后向反应液中滴加几滴吡咯烷，其中橙红色结晶物3与淡黄色粘稠状产物1的摩尔比为1∶1.5～2.5，橙红色结晶物3和淡黄色粘稠状产物1的混合物与二氯甲烷与无水乙醇混合溶剂的固液比为1∶10～20(g/mL)，室温反应4天；旋干溶剂后产物用石油醚/乙酸乙酯的固液比为1∶100～200(g/mL)的混合溶液洗涤，抽滤，得鲜红色固体4，产率22.0％；

所述溶剂为二氯甲烷与无水乙醇的混合液，体积比1∶1；

(5)在由步骤4得到的鲜红色固体4和20％的盐酸水溶液加入到反应器中，固液比为1∶100(g/mL)，室温搅拌，TLC点板跟踪至原料消失；将反应液倒入去离子水中，用NaOH溶液调节pH至2～3，有大量红色沉淀析出，静置、过滤，滤饼用水洗至中性后干燥，得红色结晶物，粗产率77.9％；用硅胶柱对产物进一步提纯得到纯品目标产物含芳基硼酸香豆素类化合物。

一种含芳基硼酸香豆素化合物在糖检测中的应用，其具体步骤为：

(1)制备含芳基硼酸香豆素化合物的二甲基亚砜(DMSO)溶液，为储备液1；

(2)制备葡萄糖、果糖、山梨醇糖、半乳糖和甘露糖的水溶液，分别为储备液2、储备液3、储备液4、储备液5和储备液6；

(3)准确移取100μL储备液1至10mL容量瓶中，用pH＝7.4的0.05M磷酸缓冲溶液稀释至刻度，再滴加储备液2至上述溶液，使得糖的最终浓度为1～300mM，测定溶液在不同浓度糖存在时的紫外和荧光光谱，即为葡萄糖对芳基硼酸化合物的滴定曲线；以储备液3、储备液4、储备液5或储备液6代替储备液2，重复上述操作，即为果糖、山梨醇糖、半乳糖和甘露糖对芳基硼酸化合物的滴定曲线。

与现有技术相比，本发明的积极效果是：

新型的荧光分子探针具有良好的水溶性，较大的Stokes位移，其发射波长616nm位于红光区，有利于消除生物背景的干扰。在生理pH条件下(pH＝7.4)，该探针对D-果糖和D-山梨醇具有较高的检测灵敏度，对它们的检测限分别为0.05mM和0.1mM。

【附图说明】

图1D-果糖对探针CSP吸收(a)与发射(b)光谱的影响；1％DMSO-50mM磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)，[CSP]＝10μM，荧光激发波长为465nm。

图2糖浓度对探针CSP荧光强度的影响；1％DMSO-50mM磷酸缓冲溶液，pH＝7.4，[CSP]＝10μM，激发波长为465nm，荧光发射波长为616nm。

图3一种含芳基硼酸香豆素类化合物的结构式。

【具体实施方式】

以下提供本发明一种含芳基硼酸香豆素类化合物及其在糖检测中的应用的具体实施方式。

实施例1

化合物CSP的合成

(1)化合物1的合成

在100mL三口圆底烧瓶中加入1.0g4-溴苯乙酮(5.05mmol)，1.53g双(频哪醇合)二硼(6.03mmol)，1.48g醋酸钾(15.11mmol)，44.11mg[1，1′-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(0.06mmol)和15mL二氧六环，加热回流，TLC点板跟踪反应至原料消失。除去溶剂，硅胶柱提纯，展开剂为石油醚∶乙酸乙酯＝50∶1(v/v)，得1.15g淡黄色粘稠状产物1，产率92.5％。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ：7.84(d，J＝8.2Hz，2H)，7.80(d，J＝7.7Hz，2H)，2.51(s，3H)，1.26(s，12H).

(2)7-二乙氨基香豆素(化合物2)的合成

在250mL三口烧瓶中加入6.0g4-二乙氨基水杨醛(28.69mmol)，10.84g丙二酸二乙酯(67.75mmol)，90mL无水乙醇和3mL哌啶，溶液呈暗红色，加热回流13h。旋转蒸发除去乙醇后向烧瓶中加入60mL浓盐酸和60mL冰醋酸，继续搅拌回流7h。将反应液冷却至室温后倒入300mL去离子水中。逐滴加入40％的NaOH溶液，调节溶液的pH至5左右，析出沉淀，抽滤，得茶绿色固体。粗产物经硅胶柱分离[石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1(v/v)]，得5.5g米黄色固体2(25.33mmol)，产率81.4％。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ：7.54(d，J＝9.3Hz，1H)，7.25(d，J＝8.8Hz，1H)，6.56(dd，J＝2.4，8.8Hz，1H)，6.49(s，1H)，6.03(d，J＝9.3Hz，1H)，3.41(q，J＝7.1Hz，4H)，1.21(t，J＝7.1Hz，6H).

(3)3-甲醛-7-二乙氨基香豆素(化合物3)的合成

在100mL三口烧瓶中加入2mL POCl₃，N₂保护下用针管吸取2mL DMF滴加至上述烧瓶中，再将含有1.5g化合物2(6.91mmol)的10mL DMF溶液缓慢滴加到上述试样中，溶液颜色逐渐由橙黄色变为深红色。加热搅拌，在60～70℃反应19h。将反应液倒入100mL冰水中，用NaOH溶液调节pH至5左右，抽滤，得红褐色固体，干燥。粗产物经硅胶柱分离[石油醚∶乙酸乙酯＝5∶1(v/v)]，旋蒸去溶剂，得橙红色结晶物1.1g(4.21mmol)，产率61.0％。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ：10.12(s，1H)，8.26(s，1H)，7.42(d，J＝9.0Hz，1H)，6.64(dd，J＝2.5，9.0Hz，1H)，6.49(d，J＝2.3Hz，1H)，3.48(q，J＝7.1Hz，4H)，1.26(t，J＝7.1Hz，6H).

(4)化合物4的合成

在100mL三口烧瓶中加入500mg化合物3(1.91mmol)、903mg化合物1(3.67mmol)以及20mL二氯甲烷与无水乙醇的混合液(v∶v＝1∶1)，然后向反应液中滴加10滴吡咯烷，溶液呈红色，室温反应4天。旋干溶剂后产物用40mL石油醚/乙酸乙酯(v∶v＝1∶1)的混合液洗涤，抽滤，得鲜红色固体200mg(0.42mmol)，产率22.0％。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ：8.24(d，J＝15.3Hz，1H)，8.08(d，J＝8.2Hz，2H)，7.94(d，J＝8.2Hz，2H)，7.82(s，1H)，7.67(d，J＝15.3Hz，1H)，7.36(d，J＝8.9Hz，1H)，6.64(dd，J＝2.4，8.9Hz，1H)，6.54(d，J＝2.3Hz，1H)，3.48(q，J＝7.1Hz，4H)，1.39(s，12H)，1.27(t，J＝7.1Hz，6H).

(5)探针CSP的合成

在100mL单口烧瓶中加入100mg化合物4(0.21mmol)和10mL20％的盐酸水溶液，溶液呈淡黄色，室温搅拌，TLC点板跟踪至原料消失。将反应液倒入200mL去离子水中，用NaOH溶液调节pH至2～3，有大量红色沉淀析出，静置、过滤，滤饼用水洗至中性后于100℃干燥，得64mg(0.16mmol)红色结晶物，粗产率77.9％。用硅胶柱对产物进一步纯化，先用二氯甲烷∶甲醇＝100∶1(v/v)的洗脱液除去微量杂质，然后逐渐增大极性至体积比5∶1洗脱出目标产物CSP。¹H NMR(400MHz，DMSO)δ：8.51(s，1H)，8.31(s，2H)，8.03(d，J＝15.5Hz，1H)，8.01～7.94(m，4H)，7.67(d，J＝15.4Hz，1H)，7.51(d，J＝9.0Hz，1H)，6.81(dd，J＝2.3，9.0Hz，1H)，6.61(d，J＝2.2Hz，1H)，3.49(q，J＝6.9Hz，4H)，1.15(t，J＝7.0Hz，6H).ESI-MS m/z：392.7(M+1)+.

缓冲溶液体系测定糖：

准确称取一定量的化合物CSP溶于10mL二甲基亚砜中制得1mM的储备液避光保存；准确称取一定量的D-果糖溶于10mL水中，制得1M的D-果糖储备液。准确移取100μL化合物CSP的储备液至10mL容量瓶中，用0.05M的磷酸缓冲溶液(PBS，pH＝7.4)稀释至刻度，得10μM CSP的缓冲溶液。向该溶液中滴加不同体积(10～300μL)的D-果糖储备液，测定不同浓度D-果糖对探针溶液荧光和紫外光谱的影响，经数据处理可得探针CSP在缓冲溶液体系对D-果糖的浓度响应曲线；同法得到探针CSP在1％DMSO-50mM PBS(pH＝7.4)中对D-山梨醇、D-葡萄糖、D-甘露糖和D-半乳糖的浓度响应曲线。

探针CSP对不同糖的检测限是根据3∶1的信噪比，由工作曲线计算而得。探针CSP与各种糖的结合常数及检测限结果如下：

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.一种含芳基硼酸香豆素类化合物，其特征在于，其结构通式：

式中：R为N，N-二烷基氨基、羟基或者烷氧基。

2.一种含芳基硼酸香豆素类化合物的合成方法，其特征在于，其具体步骤为：

(1)4-溴苯乙酮，双(频哪醇合)二硼，醋酸钾以及1，1′-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯和溶剂加入到反应器中；加热回流，TLC点板跟踪反应至原料消失；除去溶剂，硅胶柱提纯，得淡黄色粘稠状产物1；

(2)4-R基取代水杨醛，丙二酸二乙酯和溶剂加入到反应器中，其中4-R基取代水杨醛与丙二酸二乙酯的摩尔比为1∶2～3；4-R基取代水杨醛与溶剂的固液比为1∶5～7(g/mL)，加热回流13h；旋转蒸发除去溶剂后向烧瓶中加入1∶1的浓盐酸和冰醋酸的混合酸，4-R基取代水杨醛与混合酸的固液比为1∶6～8(g/mL)，继续搅拌回流7h；将反应液冷却至室温后倒入去离子水中，用NaOH溶液调节溶液的pH至5左右，析出沉淀，抽滤，得茶绿色固体；粗产物经硅胶柱分离，得米黄色固体2；R基为N，N-二烷基氨基、羟基或者烷氧基；

(3)在N₂保护下，向装有POCl₃的反应器中滴加DMF，将由步骤2所得的米黄色固体2的DMF溶液缓慢滴加到上述试样中，溶液颜色逐渐由橙黄色变为深红色；加热搅拌，在60～70℃反应15～25h；将反应液倒入冰水中，用NaOH溶液调节pH至5左右，抽滤，得红褐色固体，干燥；粗产物经硅胶柱分离，旋蒸去溶剂，得橙红色结晶物3；

(4)将由步骤3得到的橙红色结晶物3，步骤1得到的淡黄色粘稠状产物1以及溶剂加入到反应器中，然后向反应液中滴加吡咯烷，其中橙红色结晶物3与淡黄色粘稠状产物1的摩尔比为1∶1.5～2.5，橙红色结晶物3和淡黄色粘稠状产物1的混合物与二氯甲烷与无水乙醇混合溶剂的固液比为1∶10～20(g/mL)，室温反应4天；旋干溶剂后产物用石油醚/乙酸乙酯的固液比为1∶100～200(g/mL)的混合溶液洗涤，抽滤，得鲜红色固体4；

(5)在由步骤4得到的鲜红色固体4和盐酸水溶液加入到反应器中，室温搅拌，TLC点板跟踪至原料消失；将反应液倒入去离子水中，用NaOH溶液调节pH至2～3，有红色沉淀析出，静置、过滤，滤饼用水洗至中性后干燥，得红色结晶物；用硅胶柱对产物进一步提纯得到纯品目标产物含芳基硼酸香豆素类化合物。

3.如权利要求2所述的一种含芳基硼酸香豆素类化合物的合成方法，其特征在于，在所述的步骤(1)中，4-溴苯乙酮与双(频哪醇合)二硼的摩尔比为1.0∶1.0～1.8；4-溴苯乙酮与醋酸钾的摩尔比为1.0∶2.0～3.0；[1，1′-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯与4-溴苯乙酮的摩尔量之比为1～3∶100；4-溴苯乙酮，双(频哪醇合)二硼，醋酸钾以及1，1′-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯的混合物与溶剂的固液比为1∶3～5(g/mL)。

4.如权利要求2所述的一种含芳基硼酸香豆素类化合物的合成方法，其特征在于，在所述的步骤(1)中，所述的溶剂为二氧六环。

5.如权利要求2所述的一种含芳基硼酸香豆素类化合物的合成方法，其特征在于，在所述的步骤(2)中，所述的溶剂为乙醇与二氧六环，体积比为30∶1。

6.一种含芳基硼酸香豆素化合物在糖检测中的应用，其特征在于，其具体步骤为：

(1)制备含芳基硼酸香豆素化合物的二甲基亚砜(DMSO)溶液，为储备液1；

(2)制备葡萄糖、果糖、山梨醇糖、半乳糖和甘露糖的水溶液，分别为储备液2、储备液3、储备液4、储备液5和储备液6；

(3)准确移取100μL储备液1至10mL容量瓶中，用pH＝7.4的0.05M磷酸缓冲溶液稀释至刻度，再滴加储备液2至上述溶液，使得糖的最终浓度为1～300mM，测定溶液在不同浓度糖存在时的紫外和荧光光谱，即为葡萄糖对芳基硼酸化合物的滴定曲线；以储备液3、储备液4、储备液5或储备液6代替储备液2，重复上述操作，即为果糖、山梨醇糖、半乳糖和甘露糖对芳基硼酸化合物的滴定曲线。

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