CN102812362B - 用于预测心血管事件的外来体生物标志物的确定 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及预测受试者发展心血管事件风险的方法，包括确定来自所述受试者的外来体中指示发展心血管事件风险的生物标志物的存在。所述外来体适合地分离自体液，所述体液选自血清、血浆、血液、尿、羊水、恶性腹水、支气管肺泡灌洗液、关节液、乳汁、唾液，尤其是血清。该生物标志物选自蛋白质玻连蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白F2（Serpin F2）、CD14、胱抑素C、纤溶酶原、巢蛋白2或者这些蛋白质的两种或更多种的任意组合。

Description

用于预测心血管事件的外来体生物标志物的确定
技术领域
本发明涉及风险分层（分级）和/或患者分层（分级）领域，更具体地，涉及心血管事件的风险预后，所述心血管事件如中风、短暂性缺血性发作（TIA）、心肌梗塞（心脏病发作）、脑出血以及在血管中发生的其他主要异常。
本发明尤其涉及预测受试者发展心血管事件风险的方法以及在该方法中使用的试剂盒和生物标志物。
背景技术
已经将包括血脂异常、吸烟、高血压和糖尿病在内的已确立的心血管风险因子引入到心血管风险评估的算法中。然而，对处于发展心血管疾病风险中的患者的鉴别仍是困难的。
预后生物标志物的鉴别在分辨处于经历未来心血管事件风险并因此可以成为侵略性预防措施目标的患者时将具有主要附加价值。对于原发性心血管事件，由于生物标志物仅适度地加入到标准风险因子中，因此这些生物标志物的预后值是非常有限的。对于继发性事件，并不存在预后生物标志物。
寻找生物标志物的理想方法为无偏（unbiased）方法。诸如蛋白质组学的新型分子技术为这一目的开启了新的可能性。
最近，在本发明人的实验室中，该技术被成功用于发现动脉粥样硬化斑块中的心血管疾病的生物标志物。遗憾的是，只能通过侵入性程序获得斑块材料。因此，本发明的目的是提供用于预测受试者发展心血管事件风险的替代方法。
发明内容
在引出本发明的研究中，对人类斑块和血浆样品进行了蛋白质组学分析。然而，该程序受所存在的高丰度血浆蛋白（如白蛋白和免疫球蛋白）阻碍，这使得对潜在关注的低丰度蛋白的检测复杂化。因此，对血浆子部分研究了可能会对心血管事件具有预测价值的蛋白质的存在。
随后，据发现采样后来自经历心血管事件的受试者的血浆外来体样品中的蛋白质组成不同于未经受该心血管事件的患者中的组成，并且这种差异能够用于患者预后。
可以在产生后直接发生蛋白质向细胞外的分泌（组成型途径）或者蛋白质首先储存在细胞中并在触发后释放（调控型途径）。然而，分泌不仅发生在单独的蛋白质中，而且还通过含有大量蛋白质和RNA的囊泡发生。由来自分泌细胞的所选择的脂肪、蛋白质和RNA形成了这些囊泡，并且它们作为完整的囊泡释放。尺寸为50nm-100nm的囊泡被称为外来体（exosome），并且已对多种细胞类型描述了外来体的释放，包括网织红细胞、B淋巴细胞和T淋巴细胞、树突细胞、肥大细胞、血小板、巨噬细胞和肺泡肺细胞。在包括T细胞、血小板、树突细胞和肥大细胞在内的几种细胞类型中，外来体的分泌是通过特定刺激物所调控的。
尽管早期研究关注于它们从不同细胞类型的体外分泌，但现已在体液中鉴别出了外来体，所述体液如尿液、羊水、恶性腹水、支气管肺泡灌洗液、关节液、乳汁、唾液和血液。外来体具有广泛的生物学功能，包括免疫应答、抗原呈递、胞内通讯以及RNA和蛋白质的转移。
本发明人发现由于外来体表达了反映起源宿主细胞的一系列蛋白质，因此它们包含了与人体内发展中的（病理）生理过程有关的有价值信息，包括未来心血管事件的信息。
现在，该出人意料的发现引出了本发明，因此基于对来自所述受试者的血浆外来体样品和/或尺寸较小或较大的其他微囊中具有预后价值的蛋白质（本文随后称之为生物标志物或差异存在的蛋白质）的检测，本发明提供了用于预测患者中心血管事件风险的方法。
根据本发明，原则上可以使用具有预后价值的任何生物标志物。然而，尤其是，在对继发性心血管事件具有预测价值的血浆外来体中鉴别了特定标志物。
在一个实施方式中，本发明因此提供了预测受试者发展心血管事件风险的方法，包括检测来自所述受试者的外来体样品或尺寸较小或较大的其他微囊中的生物标志物，其中所述生物标志物包括选自以下6种蛋白质中的至少一种蛋白质：玻连蛋白（IPI:IPI00298971，SWISSPROT:VTNC_HUMAN）、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白F2（IPI:IPI00879231，SWISSPROT:A2AP_HUMAN）、CD14（IPI:IPI00029260，SWISSPROT:CD14_HUMAN）、胱抑素C（IPI:IPI00032293，SWISSPROT:CYTC_HUMAN）、纤溶酶原（IPI:IPI00019580，SWISSPROT:PLMN_HUMAN）、巢蛋白2（IPI:IPI00028908，SWIS SPROT:NID2_HUMAN）。
如本文所公开的括号内的IPI号是指国际蛋白质索引（InternationalProtein Index，http://www.ebi.ac.uk/IPI），其于2010年12月4日编入索引，随后是Swissprot数据库的录入名，其于2010年11月30日编入索引。如本文所使用的，所参考的索引号（数据库登录号）包括对其片段、同工型（isoform）和修饰物的参考，因此本发明预见了在本发明多个方面的背景中对本文所公开的蛋白质的片段以及蛋白质的修饰物和衍生物作为生物标志物的使用。
根据本发明，生物标志物包括一种蛋白质或者一组多种蛋白质。在本文中，还将这种生物标志物鉴别为谱或蛋白质谱。该谱可以包括以下蛋白质中的1种、2种或2种以上，如3种、4种、5种、6种，所述蛋白质为玻连蛋白（IPI:IPI00298971，SWISSPROT:VTNC_HUMAN）、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白F2（IPI:IPI00879231，SWISSPROT:A2AP_HUMAN）、CD14（IPI:IPI00029260，SWISSPROT:CD14_HUMAN）、胱抑素C（IPI:IPI00032293，SWISSPROT:CYTC_HUMAN）、纤溶酶原（IPI:IPI00019580，SWISSPROT:PLMN_HUMAN）、巢蛋白2（IPI:IPI00028908，SWISSPROT:NID2_HUMAN）。根据本发明，可以使用包含任意数量的这些蛋白质以及这些蛋白质的任意组合的谱。
技术人员将理解可以检测通过其断裂来源于生物标志物蛋白的所述生物标志物蛋白的肽片段，而不检测完整的生物标志物蛋白。如本文所使用的，术语肽片段是指具有5至50个氨基酸的肽。这些肽片段优选地提供了所述蛋白质的独特氨基酸序列，并且它们与如本文所公开的心血管事件有关。
可以任选地作为化学修饰的蛋白质和/或肽检测所述蛋白质和/或肽片段，这样的化学修饰可以例如选自糖基化、氧化、（永久）磷酸化、还原、十四烷基化、硫酸化、酰化、乙酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、羟基化、碘化和甲基化。在网址为http://www.ebi.ac.uk/RESID的RESID数据库（2010年12月2日发布）（Garavelli,J.S.(2004)The RESID Database ofProtein Modifications as a resource and annotation tool;Proteomics 4:1527-1533）中以及在Farriol-Mathis,N.,Garavelli,J.S.,Boeckmann,B.,Duvaud,S.,Gasteiger,E.,Gateau,A.,Veuthey,A.,Bairoch,A.(2004)Annotation of post-translational modifications in the Swiss-Prot knowledgebase.Proteomics 4(6):1537-50中描述了大量可能的蛋白质修饰。技术人员熟知这些修饰。
在本发明的优选实施方式中，检测了优选地存在于诸如血清、血浆或血液的体液中的外来体或尺寸更大或更小一些的其他囊泡中的生物标志物蛋白或其肽片段。作为另外一种选择，可以使用来自如尿液、羊水、恶性腹水、支气管肺泡灌洗液、关节液、乳汁、唾液的其他体液的外来体或这类其他囊泡。
在本申请中，术语“外来体”意在包括小于约50nm或大于100nm但仍在约20nm至约500nm范围内的其他囊泡。
根据本发明，待预测的心血管事件优先选自以下病况：血管性死亡或猝死、致命或非致命性中风、致命或非致命性心肌梗塞、致命或非致命性腹主动脉瘤破裂、通过开腹手术确认的腹主动脉瘤破裂、血管介入、冠状动脉病、短暂性缺血性发作（TIA）、外周动脉病、急性冠脉综合征、心力衰竭，或者颈动脉、冠状动脉、股动脉或其他动脉的再狭窄。
根据本发明所述的方法可以适合地用于风险分层（分级）和/或患者选择（如用于临床试验），用于疾病监控，并且所述标志物可以用作安全和效力研究的临床生物标志物（例如，作为替代终点标记）。
本发明还涉及用于实施所述方法的试剂盒，包括用于检测如上文所定义的生物标志物的存在的介质（器具，means）。用于检测所述生物标志物的存在的介质优选地为抗体、抗体片段或抗体衍生物或者通过质谱法和流式细胞术。基于抗体的检测介质可选地包含可检测的标记。
根据本发明所述的试剂盒设计在通过确定受试者外来体中生物标志物的存在来预测该受试者发展心血管疾病风险的方法中使用。因此，所述试剂盒还可以包含用于在该方法中使用用于检测生物标志物的介质（器具）的试剂和/或说明书。
本发明还涉及用于在受试者发展心血管事件风险的预后中使用的生物标志物，包括选自玻连蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白F2、CD14、胱抑素C、纤溶酶原、巢蛋白2的蛋白质。在其他实施方式中，所述生物标志物包括选自玻连蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白F2、CD14、胱抑素C、纤溶酶原、巢蛋白2的两种或更多种蛋白质的组合。
心血管事件可以是尚未经历心血管事件的受试者中的原发性事件，但特别地为在先前已经历该事件的受试者中发生的继发性事件。根据本发明，有可能区别已发生心血管事件并且处于经历其他事件风险的患者和已发生该事件但不具有经历其他事件的较高风险的患者。
适合地，通过使用外来体作为样品并且优选地使用包括玻连蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白F2、CD14、胱抑素C、纤溶酶原、巢蛋白2或它们的任意组合的生物标志物作为待测蛋白进行预后。
在随后的实施例中将进一步说明本发明，并且这些实施例不意欲以任何方式限制本发明。参考以下附图：
图1：该图示出了CD14的两种ROC分析。黑色实线是CD14+风险因子的ROC分析（AUC=0.778，P=0.001）；黑色虚线是仅风险因子的ROC分析（AUC=0.630，P=0.093）。灰色实线是参比线并且表示0.5的AUC（即无差别）。
图2：该图示出了丝氨酸蛋白酶抑制蛋白F2的两种ROC分析。黑色实线是丝氨酸蛋白酶抑制蛋白F2+风险因子的ROC分析（AUC=0.701，P=0.009）；黑色虚线是仅风险因子的ROC分析（AUC=0.630，P=0.093）。灰色实线是参比线并且表示0.5的AUC（即无差别）。
图3：该图示出了胱抑素C的两种ROC分析。黑色实线是胱抑素C+风险因子的ROC分析（AUC=0.677，P=0.022）；黑色虚线是仅风险因子的ROC分析（AUC=0.630，P=0.093）。灰色实线是参比线并且表示0.5的AUC（即无差别）。
图4：该图示出了玻连蛋白的两种ROC分析。黑色实线是玻连蛋白+风险因子的ROC分析（AUC=0.690，P=0.014）；黑色虚线是仅风险因子的ROC分析（AUC=0.630，P=0.093）。灰色实线是参比线并且表示0.5的AUC（即无差别）。
图5：该图显示了纤溶酶原的两种ROC分析。黑色实线是纤溶酶原+风险因子的ROC分析（AUC=0.654，P=0.046）；黑色虚线是仅风险因子的ROC分析（AUC=0.630，P=0.093）。灰色实线是参比线并且表示0.5的AUC（即无差别）。
图6：该图显示了巢蛋白2的两种ROC分析。黑色实线是巢蛋白2+风险因子的ROC分析（AUC=0.686，P=0.017）；黑色虚线是仅风险因子的ROC分析（AUC=0.630，P=0.093）。灰色实线是参比线并且表示0.5的AUC（即无差别）。
图7：公开的ROC曲线。
实施例
实施例1
人血浆外来体的跟踪定量蛋白质组学
研究人群和设计
Athero-Express是纵向血管生物库（biobank）研究，其包括来自在两家荷兰医院（UMC Utrecht和St.Antonius Hospital Nieuwegein）进行颈动脉内膜剥脱术和股动脉内膜切除术的患者的生物材料。迄今已包括了约2000位患者。在动脉内膜切除术（抽血）前或期间从所有患者中获得血浆和组织样品。
外科手术后1年，对所有患者进行临床随访，并且在术后1年、2年和3年填写邮寄问卷调查表。当患者对问卷调查表未做出回应时，医师会通过电话联系。由对实验室结果一无所知的独立终点事件委员会对终点事件进行评判。由委员会的两名成员独立评价所有终点。在意见不统一的情况下，征求第三份意见。
外来体蛋白质组
分别将来自在随访期间经历冠脉事件的50位患者和来自在随访期间未经历继发性事件的50位年龄和性别相匹配的对照患者的血浆样品混合并通过过滤分离和超速离心法分离外来体。使用定量蛋白质组学鉴别外来体蛋白质含量，并且将来自随访期间经历事件的患者的蛋白质组的表达水平与对照患者的蛋白质组进行比较。
通过过滤分离并随后进行超速离心法从冷冻的人血浆中分离了外来体（参见，Marie-Pierre Caby等人,Exosomal-like vesicles are present inhuman blood plasma;International Immunology,Vol.17,No.7,pp.879–887）。
使用蛋白质印迹检测了外来体小粒中的典型外来体蛋白，如CD9和CD81。对限定尺寸的珠的FACS分析表明该小粒主要包含50nm-100nm的颗粒，其与外来体的尺寸一致。
蛋白质提取与消化
超速离心后，将在Athero-Express生物库血浆中收集的外来体小粒溶解于40μl 6% SDS在HPLC纯水中的溶液中。在将没有任何血液残留的斑块材料研磨成粉后，同样用6%SDS提取斑块蛋白。对于斑块和外来体蛋白，消化以及随后的标记、HPLC分离和质谱分析是相同的。通过2-D Quant试剂盒确定了蛋白质含量。在蛋白质还原并且烷基化后，用50mM的三乙基碳酸氢铵（TEAB）将蛋白质混合物稀释20倍，并通过以1:40的胰蛋白酶比蛋白质的比例加入胰蛋白酶来起始蛋白质消化。使用Sep-PakC18小柱对蛋白质消化液脱盐，并在Speedvac中干燥。
根据生产商的规程，用iTRAQ试剂标记这些消化液。简言之，将消化的蛋白质在30μl解离缓冲液中复原并与70μl乙醇悬浮的iTRAQ试剂混合（每个蛋白质样品一个iTRAQ报告标记，质量标签为114-117道尔顿）。在将所有样品混合到单个试管中并使用Speedvac干燥前，在室温下进行1小时标记反应。
强阳离子交换分离
将合并的iTRAQ标记的样品在200μl缓冲液A（10mM KH2PO4，pH3.0，25%（v/v）的乙腈）中复原，并加载到Shimadzu prominence HPLC系统上的聚磺乙基A柱（PolySULFOETHYLA柱，200mm长×4.6mm ID，孔径粒径5μm）上。使用5分钟100%缓冲液A，40分钟5-30%缓冲液B（10mM KH2PO4，pH 3.0，500mM KCl和25%（v/v）的乙腈），5分钟30-100%缓冲液B和最终5分钟100%缓冲液B的梯度以1ml/min的恒定流速对样品分离总计60分钟。通过UV检测器在214nm波长监测洗脱流分。
以1分钟的时间间隔收集部分，并且合并低峰强度的连续部份。最终，获得了总计20个流分并将它们在Speedvac中干燥。将每个流份在0.1%的三氟乙酸中复原并脱盐。将脱盐样品在Speedvac中干燥，并且在质谱分析前在-20°C保存。
使用Q-STAR的质谱分析
将干燥的流分在100μl 0.1%的甲酸中复原。使用与在线Shimadzuprominence HPLC系统连接的Q-Star Elite质谱仪对每个样品分析两次。对于每次分析，将50μl肽混合物进样并在具有picofrit纳升喷雾尖端（nanospray tip）的实验室装填的nanobored C18柱（75μm ID×15cm，5μm的颗粒）上分离。使用90分钟梯度的分流器以20μl/min的流速进行分离。设置质谱仪以使得所选质量范围在300-2000m/z并且以正离子模式进行数据采集。选择带电状态为+2至+4的肽进行MS/MS，并且将MS/MS事件的合计时间设置为2s。选择高于5次计数阈值的三个带电量最大的肽进行MS/MS，并且以±30mmu的质量公差动态排除30s。
通过将来自2次运行的混合数据对比国际蛋白质索引（IPI）人数据库（于2009年12月19日编入索引）进行搜索，使用v2.0.1版ProteinPilot软件进行肽定量和蛋白质鉴定。在ProteinPilot软件中使用了Paragon算法，其中将胰蛋白酶选择作为消化剂并且对半胱氨酸进行硫代乙磺酸甲酯修饰。
所有报告的蛋白质的期望值小于0.05（未用的分数（unused score）为1.3）。
对来自在随访期间经历冠脉事件的50位患者（组1）和来自在随访期间未经历继发性事件的50位匹配对照患者（组2）的外来体进行定量蛋白质组学。将每组在相同iTraq实验中运行两次，从而示出了2个事件蛋白质组和2个对照蛋白质组的数据。
在样品中鉴别出2148种不同的蛋白质，包括早期在外来体蛋白质组学中鉴别出的大量蛋白质，如CD9、CD81、膜联蛋白、网格蛋白重链、烯醇酶1以及多种其他蛋白质（Olver C,Vidal M.Proteomic analysis ofsecreted exosomes.Subcell Biochem.2007;43:99-131）。
外来体蛋白质组学的结果
然后，使用定量iTRAQ数据对组1和组2进行比较。从2个混合的（pooled）事件样品（组1，运行2次）和2个混合的对照样品（组2，运行2次）可获得定量数据。基于pilots，确定1.2及以上的比值表示事件中蛋白质水平显著更高，而0.8及以下的比值为事件中水平显著更低。首次选择是基于两次运行相同的蛋白质的（均低于0.8，均高于1.2或均在0.8至1.2之间）。
第二次选择是基于在组1相对于组2中具有更低（事件/对照<0.8）或更高（事件/对照>1.2）表达的蛋白质的。这揭示了116种蛋白质的列表。
将该116种蛋白质的列表上传并在Ingenuity Pathway Analysis软件（8.0版）中分析。在所述116种蛋白质中，102种蛋白质处于Ingenuity数据库中。这说明所述102种蛋白质是不同类型的蛋白质，其包括跨膜受体、转运子和转录调节子、血浆中不存在的蛋白质。Ingenuity分析还显示在这102种蛋白质中3条经典途径显著过表达。
1.急性期反应信号（p=3.5*10-11）
2.凝血系统（p=3.6*10-11）
3.动脉粥样硬化信号（p=3*10-4）
随后，将该组102种差异表达的蛋白质与所选的斑块材料来源蛋白互补并且最后将它们缩小至34种所选的外来体和斑块来源蛋白的组合组以用于在个体患者样品的外来体样品中进一步验证。
斑块蛋白的蛋白质组学结果
使用Athero-Express组，选择40位颈动脉内膜剥脱术患者，其中20位患者在随访期间发生了继发性心血管事件，20位对照患者（年龄、性别和随访时间相匹配）在随访期间未经历继发性事件。
如对外来体蛋白质组学所进行的，对斑块样品进行定量蛋白质组学。然而，由于分析了40个个体斑块，因此对通过iTraq试剂（分别为114、115、116、117）分别差异标记的4个斑块提取物同时运行。每次运行包括经历心血管事件的患者和每位患者性别和年龄相匹配的对照患者的两个斑块提取物，因此总计为两对事件和对照中的四个斑块提取物。
搜索后，生成了含有蛋白质ID和对于每个蛋白质ID的两对事件/对照的相对值的excel文件。
运行10次后，实施了包含20对事件和匹配对照（总计40位患者）的分析。使用具有合并表格附加项（Merge TableAdd-in）的Excel 2007，生成了蛋白质ID的总列表。通过总肽区修正（total peptide area correction），在不同运行之间进行归一化。
使用曼-惠特尼检验（Mann-Whitney test）比较事件和对照的统计分析显示斑块中事件和对照之间具有显著差异（p<0.05）的蛋白质有264种。
外来体和斑块来源蛋白的选择
斑块是导致心血管事件的动脉粥样硬化病的起源。由此，很可能的是与未来心血管事件有关的斑块蛋白还可以存在于外来体中，特别是与在心血管事件和对照之间存在差异的外来体蛋白中过表达的途径有关的斑块蛋白。
已建立了在外来体中过表达的3条经典途径（急性期、凝血和动脉粥样硬化），以两种方法研究了具有事件和对照之间差异表达的斑块蛋白的264种蛋白质数据集。
基于与3条动脉粥样硬化相关经典途径有关并且2种抗体和重组蛋白质对其可用的蛋白质的存在进行选择。
另外，从所述112种外来体来源蛋白中，基于3条动脉粥样硬化相关经典途径的过表达以及2种抗体和重组蛋白质的可用性选择标志物。在抗体和重组蛋白质对其可用的所选斑块和外来体蛋白中，选择34种蛋白质开展Luminex珠测定。对于该34种蛋白质中的17种蛋白质，建立了可以用于测量分离自个体血清样品的外来体中蛋白质含量的可重现并且定量的Luminex珠测定。
实施例2
个体Athero-Express患者血液样品的概念验证研究中所选蛋白质的验证
研究目标
本研究的目标是在个体患者的血液样品中鉴别该17种生物标志物中有哪些会在经历继发性冠脉事件的患者和健康对照之间差异表达。
研究设计
本研究中的患者由于原发性脑血管事件（即中风或短暂性缺血性发作（TIA））而进行颈动脉手术并随访三年。在经历继发性冠脉事件（29个样品）的患者以及年龄和性别相匹配的对照（30个样品）的血液样品中测量所述17种标志物。将继发性冠脉事件定义为心肌梗塞（致命和非致命性）、心血管死亡、猝死、冠状动脉成形术和冠状动脉旁路移植术（CABG）。
材料和方法
使用超速离心技术从血浆中分离外来体。在多重Luminex珠测定中测量提取自外来体样品的蛋白质。
统计分析
使用PASW Statistics 17.0.2统计软件包（SPSS Inc，Chicago，Illinois）进行统计分析。最经常通过受试者工作特征（ROC）曲线下的面积测量差别（对模型可以区分事件和对照的良好程度的量度），它是已建立的用于评价生物标志物的方法（Hlatky等人,American Heart Association ExpertPanel on Subclinical Atherosclerotic Diseases and Emerging Risk Factors andthe Stroke Council.Criteria for evaluation of novel markers of cardiovascularrisk:a scientific statement from the American Heart Association.Circulation.2009 May 5;119(17):2408-16）。
实施ROC分析以确定标志物的能力，并结合风险得分以区别发生和未发生未来冠脉事件的患者。
在ROC分析中，通过测试结果的不同截止值给出了特定测试的特异性和灵敏性。图7显示了发表的ROC曲线。具有最佳灵敏度和特异性的理想测试将遵循1-特异性=0（Y轴）并且然后灵敏度=1.0（参见粗线）的曲线。没有任何值的测试将遵循黑色直线。将测试的分辨能力表示为“曲线下的面积”（AUC）。AUC值介于0.5（无差别）至1.0（理想差别）之间。
将统计显著性设置为P=0.05。风险得分基于7种常规心血管风险因子（性别、年龄、胆固醇、收缩压、吸烟状态、外周动脉病史和冠状动脉病史）。
结果
当评价疾病预测的新型测试时，必须将它与已在临床领域中可用的风险预测因子相比较。在这种情况下，这些是常规风险因子（参见以上“统计分析”一节中的内容）。因此，将单独的常规风险因子的AUC与常规风险因子+新型生物标志物的AUC进行比较。因此，通过新型生物标志物解释了AUC的增加。
发现单独的风险得分的AUC为0.630（P=0.093）。结合风险得分所评价的18种标志物中的6种表现出AUC的增加：CD140.778（P=0.001）（图1）；丝氨酸蛋白酶抑制蛋白F20.701（P=0.009）（图2）；胱抑素C 0.677（P=0.022）（图3）；玻连蛋白0.690（P=0.014）（图4）；纤溶酶原0.654（P=0.046）（图5）；和巢蛋白20.686（P=0.017）（图6）。
因此，为了使得能够对经历未来心血管事件的患者进行可靠预后，这六种蛋白质在作为待测样品的外来体中作为生物标志物是特别有用的。

Claims (4)

1.一种用于确定来自受试者的外来体中指示发展心血管事件风险的生物标志物的存在的试剂在制备用于预测受试者发展心血管事件风险的制剂中的应用，其中，所述生物标志物选自玻连蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白F2、CD14、胱抑素C、纤溶酶原、巢蛋白2。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述外来体分离自体液，所述体液选自血清、血浆、血液、尿、羊水、恶性腹水、支气管肺泡灌洗液、关节液、乳汁、唾液。
3.根据权利要求1所述的应用，其中，所述生物标志物为选自玻连蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白F2、CD14、胱抑素C、纤溶酶原、巢蛋白2的两种或更多种蛋白质的任意组合。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其中，所述心血管事件选自血管性死亡或猝死、致命或非致命性中风、致命或非致命性心肌梗塞、致命或非致命性腹主动脉瘤破裂、通过开腹手术确认的腹主动脉瘤破裂、血管介入、冠状动脉病、短暂性缺血性发作(TIA)、外周动脉病、急性冠脉综合征、心力衰竭，或者颈动脉、冠状动脉、股动脉或其他动脉的再狭窄。
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