WO2020076006A1 - 조기폐경 진단을 위한 분석방법 및 키트 - Google Patents

조기폐경 진단을 위한 분석방법 및 키트 Download PDF

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WO2020076006A1
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kit
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백광현
이다혜
송재윤
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차의과학대학교 산학협력단
고려대학교 산학협력단
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    • G01N2800/36—Gynecology or obstetrics
    • G01N2800/362—Menopause

Definitions

  • the present invention relates to an analytical method and kit for diagnosing early menopause to provide information necessary for early menopause diagnosis.
  • reduced estradiol E2 triggers a feedback mechanism to stimulate the pituitary gland of the pituitary gland, resulting in increased follicle stimulating hormone (FSH).
  • FSH follicle stimulating hormone
  • AH anti-Mullerian hormone
  • K. Jankowska Premature ovarian failure, Prz Menopauzalny, 16 ( 2017) 51-56; A. Kruszynska, et al., Anti-Mullerian hormone (AMH) as a good predictor of time of menopause, Prz Menopauzalny, 16 (2017) 47-50; Y. Tokura, et al.
  • AMH serum anti-Mullerian hormone
  • Proteomics can be used to identify biomarkers of disease.
  • the proteomics method is used to discover biomarkers through two-dimensional electrophoresis (2-DE) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS / MS).
  • Methods have been used to identify biomarkers of many reproductive diseases (YS Kim, et al., Proteomic analysis of recurrent spontaneous abortion: Identification of an inadequately expressed set of proteins in human follicular fluid, Proteomics, 6 (2006) 3445-3454; MS Kim, et al., ITI-H4, as a biomarker in the serum of recurrent pregnancy loss (RPL) patients, Mol Biosyst, 7 (2011) 1430-1440; S.
  • the present inventors performed proteomic analysis through 2-DE-MS / MS in order to identify biomarkers capable of diagnosing premenopause, particularly biomarkers capable of diagnosing premenopause using a small amount of blood as a sample. Did. As a result, the present inventors have found that six specific proteins previously unknown in relation to early menopause are overexpressed in the blood of early menopausal patients. Therefore, the overexpression detection of these proteins can be usefully used to diagnose early menopause, and these proteins can be used as biomarkers for early menopause diagnosis.
  • an object of the present invention is to provide an analysis method using the specific protein in order to provide information necessary for early menopause diagnosis.
  • an object of the present invention is to provide a kit for diagnosing early menopause, which includes a molecule capable of measuring the expression level of a gene encoding the specific protein.
  • Complement component 3 Fibrinogen ⁇ , Fibrinogen ⁇ in a subject's blood
  • Overexpression of genes encoding proteins selected from one or more of the group consisting of Fibrinogen ⁇ , Fibrinogen ⁇ , Celluloplasmin, and Sex hormone-binding globulin An analysis method is provided that includes measuring.
  • the gene encoding the protein may be a gene encoding one or more proteins selected from proteins consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1 to 15, for example, of SEQ ID NOs: 16 to 30
  • One or more kinds may be selected from genes consisting of nucleotide sequences.
  • the assay method of the invention is from the group consisting of Complete Component 3, Fibrinogen ⁇ , Fibrinogen ⁇ , Fibrinogen ⁇ , Celluloplasmin, and Sex Hormone-binding Globulin. It can be performed by measuring the over-expression of a gene encoding two or more selected proteins.
  • Measurement of the overexpression of the gene can be performed by measuring the amount of mRNA or protein.
  • the measurement of the amount of protein can be performed by Western blotting.
  • the measurement of the amount of mRNA may be performed through RT-PCR or real-time PCR.
  • kits for diagnosing early menopause comprising a molecule capable of measuring the overexpression of a gene encoding a selected protein, the antibody, substrate, ligand, or cofactor that the molecule specifically binds to the protein;
  • a kit for diagnosing premenopause which is a primer having a complementary sequence specific for a gene encoding the protein, is provided.
  • the gene encoding the protein may be a gene encoding one or more proteins selected from proteins consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 15, for example, SEQ ID NOs: 16 to 30 It may be selected from one or more genes consisting of the base sequence of.
  • the kit for diagnosing premenopause of the present invention comprises Complete Component 3, fibrinogen ⁇ , fibrinogen ⁇ , fibrinogen ⁇ , celluloplasmin, and sex hormone-binding globulin It may include a molecule capable of measuring the overexpression of a gene encoding a protein selected from two or more groups.
  • the molecule may be labeled with a detectable label.
  • the primer may be in the form of a microarray immobilized on a substrate.
  • Certain proteins such as Complete Component 3, Fibrinogen ⁇ , Fibrinogen ⁇ , Fibrinogen ⁇ , Celluloplasmin, and sex hormone-binding globulin, are overexpressed in the blood of premenopausal patients It was revealed by the present invention. Therefore, the analysis methods and kits according to the present invention using these proteins as biomarkers can be usefully used to diagnose premenopause.
  • FIG. 1 shows the results obtained by performing a 2-DE analysis on plasma samples of a normal control group (A) and three early menopausal patients (B-D).
  • A normal control group
  • B-D three early menopausal patients
  • green indicates protein spots expressed in both control and early menopause patients
  • red indicates proteins expressed only in control or early menopause patients.
  • FIG. 2 shows the results of Western blotting analysis for 31 control samples
  • FIG. 3 shows the results of Western blotting for 23 PF risk group samples
  • FIG. 4 shows the results of Western blotting for 12 patient groups.
  • 5 shows the results obtained by calculating the relative expression ratio of each protein based on the results of FIGS. 2 to 4.
  • the present inventors performed 2-DE-LC-MS / MS (two-dimensional electrophoresis-liquid chromatography-mass spectrometry) analysis by separating plasma from the blood of premenopausal patients, and proteins expressing the difference in expression in premenopausal patients and controls Were analyzed.
  • the expression pattern of the protein specifically expressed in the analyzed early menopausal patient is re-verified through Western blot technique, and six proteins, namely, Complement component 3, and fibrinogen ⁇ (Fibrinogen ⁇ ), Fibrinogen ⁇ , Fibrinogen ⁇ , Celluloplasmin, and Sex hormone-binding globulin were identified. .
  • These six proteins can be used as biomarkers for diagnosing premenopause using a small amount of blood, and are expected to be useful in the study of molecular biology mechanisms of premenopause.
  • the present invention in order to provide information necessary for the diagnosis of early menopause, Complement component 3 (Fibrinogen ⁇ ), Fibrinogen ⁇ (Fibrinogen ⁇ ), blood in the subject's blood Measuring the overexpression of a gene encoding one or more selected proteins from the group consisting of fibrinogen ⁇ , celluloplasmin, and sex hormone-binding globulin It provides an analysis method that includes.
  • the term "overexpression” refers to a gene encoding at least about 1.5 times the gene encoding the protein in premenopausal patients compared to normal persons.
  • the gene encoding the complement component 3, fibrinogen ⁇ , fibrinogen ⁇ , fibrinogen ⁇ , celluloplasmin, and sex hormone-binding globulin When expressed about 1.5 times or more compared to normal people, it can be diagnosed as an early menopausal patient.
  • the protein used as a biomarker in the analysis method of the present invention and the gene encoding the same are all known, and thus, a known protein and gene sequence can be used in the analysis method of the present invention.
  • the protein sequence and gene sequence of Complement component 3 are as shown in SEQ ID NOs: 1 and 16, respectively.
  • Fibrinogen ⁇ is known to have two isoforms, and the protein sequence is the same as SEQ ID NOs: 2 and 3, respectively, and its gene sequence is the same as SEQ ID NOs: 17 and 18, respectively.
  • Two isoforms of Fibrinogen ⁇ are also known, and the protein sequences are the same as SEQ ID NOs: 4 and 5, respectively, and their gene sequences are the same as SEQ ID NOs: 19 and 20, respectively.
  • Fibrinogen ⁇ also has two isoforms, the protein sequence is the same as SEQ ID NOs: 6 and 7, respectively, and the gene sequence thereof is the same as SEQ ID NOs: 21 and 22, respectively.
  • Celluloplasmin (Ceruloplasmin) protein sequences and gene sequences are as shown in SEQ ID NOs: 8 and 23, respectively.
  • Sex hormone-binding globulin (Sex hormone-binding globulin) is known to have 7 isoforms, the protein sequence is the same as SEQ ID NO: 9 to 15, respectively, and its gene sequence is the same as SEQ ID NO: 24 to 30. In summary, it is shown in Table 1 below.
  • the gene encoding the protein may be a gene encoding a protein selected from one or more types of proteins consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1 to 15, for example, SEQ ID NOs: 16 to One or more genes may be selected from genes consisting of 30 nucleotide sequences.
  • the analysis method of the present invention can further increase the diagnostic efficiency of early menopause by using a combination of two or more of the six biomarkers.
  • the analytical method of the present invention consists of Complete Component 3, Fibrinogen ⁇ , Fibrinogen ⁇ , Fibrinogen ⁇ , Celluloplasmin, and Sex Hormone-binding Globulin It may be performed by measuring the overexpression of a gene encoding two or more proteins selected from the group, preferably six proteins.
  • Measurement of the overexpression of the gene may be performed by measuring the level of mRNA or protein of the gene (ie, a protein selected from the group consisting of proteins of SEQ ID NOs: 1 to 15) according to a method commonly used in the field of biotechnology. You can.
  • the protein amount can be measured by Western blotting or the like. When the amount of protein is measured by the Western blotting method, it can be determined as an early menopausal risk patient when the measured protein expression level is 1.5 times or 2 times higher than the protein expression level of a normal person.
  • the measurement of the amount of mRNA of the gene encoding the protein is reverse transcription-PCR (Reverse Transcription PCR) or real-time PCR (Real Time PCR). ) And the like.
  • the present invention also encodes a protein selected from one or more of the group consisting of Complement Component 3, Fibrinogen ⁇ , Fibrinogen ⁇ , Fibrinogen ⁇ , Celluloplasmin, and sex hormone-binding globulin.
  • a kit for diagnosing early menopause comprising a molecule capable of measuring the overexpression of a gene, an antibody, substrate, ligand, or cofactor to which the molecule specifically binds to the protein;
  • a kit for diagnosing early menopause which is a primer having a complementary sequence specific for a gene encoding the protein, is provided.
  • Complement component 3 a molecule capable of measuring the expression level of a gene encoding fibrinogen ⁇ , fibrinogen ⁇ , fibrinogen ⁇ , celluloplasmin, and / or sex hormone-binding globulin As, an antibody, substrate, ligand, or cofactor specifically binding to the protein; Or it may be a primer having a complementary sequence specific for the gene encoding the protein.
  • the gene encoding the protein may be a gene encoding a protein selected from one or more types of proteins consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1 to 15, for example, a sequence.
  • One or more genes may be selected from genes consisting of nucleotide sequences of numbers 16 to 30.
  • the kit for diagnosing early menopause of the present invention is 2 from the group consisting of complete component 3, fibrinogen ⁇ , fibrinogen ⁇ , fibrinogen ⁇ , celluloplasmin, and sex hormone-binding globulin. It may include a molecule capable of measuring the overexpression of a gene encoding a protein selected from more than one species, preferably six kinds of proteins.
  • Complement component 3 fibrinogen ⁇ , fibrinogen ⁇ , fibrinogen ⁇ , celluloplasmin, and / or sex hormone-binding globulins are poly according to methods commonly used in the field of biotechnology.
  • a clone antibody or a monoclonal antibody can be prepared, and a diagnostic kit containing the antibody can be prepared.
  • Complement Component 3, fibrinogen ⁇ , fibrinogen ⁇ , fibrinogen ⁇ , celluloplasmin, and / or sex hormone-binding globulin have a known function, and thus substrate, ligand
  • the kit of the present invention may be manufactured to include an auxiliary factor.
  • primers can be prepared according to a method commonly used in the field of biotechnology, and a diagnostic kit including the primers can be prepared.
  • the molecule can be labeled with a detectable label (eg, chromophore, etc.).
  • the diagnostic kit of the present invention may be in the form of a chip such as a DNA chip or a protein chip by having a microarray form in which the primer is immobilized on a substrate.
  • All blood samples (12 early menopausal patients, 23 at risk, and 136 controls) were provided from Korea University Anam Hospital in Seoul, Korea from October 2016 to December 2017. Early menopausal patients were diagnosed based on hormone tests of AMH, FSH, and estrogen. All samples were selected based on AMH levels below 0.01 ng / ml. 2 ml of blood sample was taken from each premenopausal patient. The collected blood samples were centrifuged at 1,500 X g for 15 minutes to separate into plasma and blood cells. Plasma was stored at -80 ° C for testing.
  • a 2-DE analysis was performed using plasma from 3 premenopausal patients. For comparison, three normal samples were randomly mixed and used as a super control. Plasma samples were filtered using a Multiple Affinity Removal Column (MARC) (Agilent, Wilmington, DE, USA) to remove 12 proteins that are highly expressed in plasma. Isoelectric focusing (IEF) was performed with a 3-10 Nonlinear Immobilized pH Gradient (NLIPG) at 80,000 V / hr and visualized using a 9-17% gradient slab gel.
  • MARC Multiple Affinity Removal Column
  • Nano LC-MS / MS analysis was performed using a nano HPLC system (Agilent, Wilmington, DE, USA).
  • a nano chip column 150 mm ⁇ 0.075 mm, Agilent, Wilmington, DE, USA
  • Mobile phase A for LC separation was a 0.1% formic acid solution in deionized water
  • mobile phase B was a 0.1% formic acid solution in acetonitrile.
  • the chromatography gradient was designed to increase linearly from 3% B to 45% B for 70 minutes, 45% B to 95% B for 1 minute, 95% B for 9 minutes, and 3% B for 10 minutes.
  • the flow rate was maintained at 300 nL / min.
  • the ion spectrum of the product was obtained in an information-dependent acquisition (IDA) mode, one full scan TOF MS (TOF MS) from 300-2000 m / z (1.0 sec) and 150-2000 m / z (1.5 sec)
  • TOF MS TOF MS
  • Each product was analyzed with an Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF using a continuous cycle of three product ion scans.
  • the precursor m / z value was selected starting from the strongest ion.
  • a rolling collision energy feature was used to determine the impulse energy based on the precursor value and the state of charge.
  • the dynamic exclusion time for the precursor ion m / z value was 60 seconds.
  • the Mascot algorithm http://www.matrixscience.com, Matrixscience, Boston, MA, USA was used to identify peptide sequences in the protein sequence database.
  • the criteria for the search are: 1. taxonomy, 2. mykiss fixed modification, 3. carboxyamidomethylated at cysteine residues, 4. variable transformation modification, 5. oxidation at methionine residues, 6. maximum allowed missed cleavage, 7. MS tolerance: 100 ppm, 8. MS / MS tolerance: 0.1 Da. Only proteins caused by digestion with trypsin were considered.
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • Mouse anti-C3 (C-4) monoclonal antibody (sc-25298) and anti-fibrinogen ⁇ (sc-133157), rabbit anti-celluloplasmin (H-60) polyclonal antibody (sc-20957) ), Goat anti-fibrinogen ⁇ (sc-18026), and anti-fibrinogen ⁇ (sc-18029) antibodies were purchased from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA).
  • Rabbit anti-SHBG polyclonal antibody (CSB-PA12289A0Rb) was purchased from CUSABIO (Wuhan, China).
  • Densitometric analysis was performed with Image J (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA), and t-test was performed with GraphPad Prism version 5 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). ANOVA was performed by one-way analysis to show significant differences.
  • Menopause was diagnosed by measuring the level of hormones in the blood and is biochemically characterized by high levels of FSH and low levels of AMH. Based on the AMH level, a person who is at least the median of the subject's age group is the control group, a value that is 10% or more greater than the median age group of the subject is the POF risk group, and a value of 10% or less of the age group of the subject is the patient group Was made. A total of 136 controls, 23 risk groups, and 12 patient groups were recruited. Blood was collected and centrifuged at 1,500 X g for 15 minutes to separate into plasma and blood cells.
  • the protein whose expression increased more than 2 times in premenopausal patients is Complement component 3 Fibrinogen ⁇ , Fibrinogen ⁇ , and Fibrinogen ⁇ , and proteins with reduced expression more than 2 times in premenopausal patients compared to the control group were celluloplasmin and the like.
  • the protein specifically expressed in premenopausal patients was sex hormone-binding globulin.
  • FIG. 2 shows the results of Western blotting on 31 control samples
  • FIG. 3 shows the results of Western blotting on 23 risk group (POF risk group) samples
  • FIG. 4 shows 12 patient groups. This is the result of Western Blotting. 3 and 4, "C” is a result of Western blotting performed after mixing a control sample. 5 is a result obtained by calculating the relative expression ratio of each protein based on the results of FIGS. 2 to 4.
  • celluloplasmin was expressed higher in the patient group than in the control group.
  • Other proteins, complete component 3, fibrinogen ⁇ , fibrinogen ⁇ , and fibrinogen ⁇ were each expressed higher in the patient group than in the control group, which is 2-DE-LC-MS / It is consistent with the results of MS analysis.
  • sex hormone-binding globulin SHBG
  • celluloplasmin, completion component 3, fibrinogen ⁇ , fibrinogen ⁇ , fibrinogen ⁇ , and sex hormone-binding globulin are expressed higher in the patient group than in the control group, so these proteins It is possible to use them as biomarkers for early menopause diagnosis.
  • the present inventors analyzed celluloplasmin, complete component 3, fibrinogen ⁇ , fibrinogen ⁇ , and fibrinogen ⁇ in blood of premenopausal patients through 2-DE-LC-MS / MS analysis. And sex hormone-binding globulin was specifically expressed, and Western blot analysis confirmed the specific expression of these proteins in premenopausal patients. As of yet, the results of studies on the direct association of these proteins with early menopause are unknown, but the results of this study confirm that these proteins have the potential to be used as serum biomarkers to diagnose early menopause.

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Abstract

본 발명은 조기폐경 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 대상자의 혈액 중 컴플리멘트 컴포넌트 3, 피브리노오겐 α, 피브리노오겐 β, 피브리노오겐 γ, 셀룰로플라스민, 및 성 호르몬-결합 글로불린으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 단백질을 코딩하는 유전자의 과발현을 측정하는 단계를 포함하는 분석방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 과발현을 측정할 수 있는 분자를 포함하는 조기폐경 진단용 키트를 제공한다.

Description

조기폐경 진단을 위한 분석방법 및 키트
본 발명은 조기폐경 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 분석방법 및 조기폐경 진단용 키트에 관한 것이다.
여성은 50대 이후가 되면 폐경을 겪게 된다. 하지만, 조기폐경(premature ovarian failure, POF)은 40대 이전에 폐경이 일어나는 병적인 상태를 말한다. 조기폐경은 난포가 완전히 고갈된 상태를 의미한다. 조기폐경의 원인으로는 감염, 수술, 항암치료나 방사선 치료에 의한 난소 손상, 자가면역성 질환, 유전적 질환 등으로 알려져 있지만 정확한 원인은 아직 불분명하다(Jankowska, K. (2017). Premature ovarian failure. Prz Menopauzalny , 16(2), 51-56. doi:10.5114/pm.2017.68592).
40세 이전에 6개월 이상 생리가 없고, 혈중 난포자극호르몬(FSH)이 40 IU/liter 이상일 경우 통상 조기폐경으로 진단한다. 그러나, 조기폐경의 진단은 난포자극호르몬(FSH) 수준에만 의존하는 것이 아니며, 다양한 인자가 고려되어야 한다(K. Jankowska, Premature ovarian failure, Prz Menopauzalny, 16 (2017) 51-56; M.B. Bhongade, et al., Effect of psychological stress on fertility hormones and seminal quality in male partners of infertile couples, Andrologia, 47 (2015) 336-342). 예를 들어, 감소된 에스트라디올(estradiol, E2)은 피드백 메커니즘을 작동시켜 뇌하수체 전엽(anterior pituitary gland)을 자극하게 되고, 그 결과 난포자극호르몬(FSH)을 증가시킨다. 또한, 조기폐경 환자에서 항-뮬러관 호르몬(anti-Mullerian hormone, AMH) 수준은 매우 낮은 것으로 알려져 있으며, 따라서 조기폐경의 진단 마커로서 사용되고 있다(K. Jankowska, Premature ovarian failure, Prz Menopauzalny, 16 (2017) 51-56; A. Kruszynska, et al., Anti-Mullerian hormone (AMH) as a good predictor of time of menopause, Prz Menopauzalny, 16 (2017) 47-50; Y. Tokura, et al. The significance of serum anti-Mullerian hormone (AMH) levels in patients over age 40 in first IVF treatment, J Assist Reprod Genet, 30 (2013) 821-825). AMH는 전구 난포(preantral follicle) 및 난포(antral follicle)에 의해 생성되어, 조기폐경 진단을 위한 혈액 바이오마커로서의 활용된다.
프로테오믹스(Proteomics)는 질병의 바이오마커를 동정하는데 사용될 수 있다. 프로테오믹스 분석법은 2차원 전기영동(two-dimensional electrophoresis, 2-DE) 및 액체 크로마토그래피-질량 분석(liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS/MS)을 통하여 바이오마커를 발굴하기 위하여 사용된다. 이러한 프로테오믹스 방법이 많은 생식 질환의 바이오마커를 동정하기 위하여 사용된 바 있으나(Y.S. Kim, et al., Proteomic analysis of recurrent spontaneous abortion: Identification of an inadequately expressed set of proteins in human follicular fluid, Proteomics, 6 (2006) 3445-3454; M.S. Kim, et al., ITI-H4, as a biomarker in the serum of recurrent pregnancy loss (RPL) patients, Mol Biosyst, 7 (2011) 1430-1440; S. Angelucci, et al., Proteome analysis of human follicular fluid, Biochim Biophys Acta, 1764 (2006) 1775-1785), 현재까지 조기폐경에 대한 바이오마커가 구체적으로 동정된 바 없다. 나아가, 적은 양의 혈액으로도 조기폐경의 진단이 가능한 혈액 바이오마커에 대한 동정이 당업계에 요구되고 있다.
본 발명자들은 조기폐경을 진단할 수 있는 바이오마커, 특히 시료로서 적은 양의 혈액을 사용하여 조기폐경을 진단할 수 있는 바이오마커를 동정하기 위하여, 2-DE-MS/MS를 통한 프로테오믹스 분석을 수행하였다. 그 결과, 본 발명자들은 조기폐경과 관련하여 이전에 알려진 바 없는 6종의 특정 단백질들이 조기폐경 환자의 혈액에서 과발현된다는 것을 밝혀냈다. 따라서 이들 단백질의 과발현 검출은 조기폐경을 진단하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 이들 단백질들은 조기폐경 진단을 위한 바이오마커로서 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 조기폐경 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 상기 특정 단백질을 이용한 분석방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 특정 단백질을 코딩하는 유전자의 발현량을 측정할 수 있는 분자를 포함하는 조기폐경의 진단용 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, 조기폐경 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 대상자의 혈액 중 컴플리멘트 컴포넌트 3(Complement component 3), 피브리노오겐 α(Fibrinogen α), 피브리노오겐 β(Fibrinogen β), 피브리노오겐 γ(Fibrinogen γ), 셀룰로플라스민(Ceruloplasmin), 및 성 호르몬-결합 글로불린(Sex hormone-binding globulin)으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 단백질을 코딩하는 유전자의 과발현을 측정하는 단계를 포함하는 분석방법이 제공된다.
본 발명의 분석방법에 있어서, 상기 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1 내지 15의 아미노산 서열로 구성된 단백질로부터 1종 이상 선택된 단백질을 코딩하는 유전자일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 16 내지 30의 염기 서열로 구성된 유전자로부터 1종 이상 선택될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 분석방법은 컴플리멘트 컴포넌트 3, 피브리노오겐 α, 피브리노오겐 β, 피브리노오겐 γ, 셀룰로플라스민, 및 성 호르몬-결합 글로불린으로 이루어진 군으로부터 2종 이상 선택된 단백질을 코딩하는 유전자의 과발현을 측정함으로써 수행될 수 있다.
상기 유전자의 과발현 측정은 mRNA 또는 단백질의 양을 측정함으로써 수행될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 단백질의 양의 측정은 웨스턴 블럿팅에 의하여 수행될 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 mRNA 양의 측정은 RT-PCR 또는 실시간-PCR을 통하여 수행될 수 있다.
본 발명의 다른 태양에 따라, 컴플리멘트 컴포넌트 3, 피브리노오겐 α, 피브리노오겐 β, 피브리노오겐 γ, 셀룰로플라스민, 및 성 호르몬-결합 글로불린으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 단백질을 코딩하는 유전자의 과발현을 측정할 수 있는 분자를 포함하는 조기폐경 진단용 키트로서, 상기 분자가 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 기질, 리간드, 또는 보조인자(cofactor); 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적인 상보적 서열을 갖는 프라이머인 조기폐경 진단용 키트가 제공된다.
본 발명의 조기폐경 진단용 키트에 있어서, 상기 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1 내지 15의 아미노산 서열로 구성된 단백질로부터 1종 이상 선택된 단백질을 코딩하는 유전자일 수 있으며, 예를 들어 서열번호 16 내지 30의 염기 서열로 구성된 유전자로부터 1종 이상 선택될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 조기폐경 진단용 키트는 컴플리멘트 컴포넌트 3, 피브리노오겐 α, 피브리노오겐 β, 피브리노오겐 γ, 셀룰로플라스민, 및 성 호르몬-결합 글로불린으로 이루어진 군으로부터 2종 이상 선택된 단백질을 코딩하는 유전자의 과발현을 측정할 수 있는 분자를 포함할 수 있다.
본 발명의 조기폐경 진단용 키트에 있어서, 상기 분자는 검출가능한 표지로 표지될 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 기판상에 고정화되어 있는 마이크로어레이 형태일 수 있다.
특정 단백질들, 즉 컴플리멘트 컴포넌트 3, 피브리노오겐 α, 피브리노오겐 β, 피브리노오겐 γ, 셀룰로플라스민, 및 성 호르몬-결합 글로불린이 조기폐경 환자의 혈액에서 과발현된다는 것이 본 발명에 의해 밝혀졌다. 따라서, 이들 단백질들을 바이오마커로서 사용하는 본 발명에 따른 분석방법 및 키트는 조기폐경을 진단하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 정상인 대조군(A) 및 3명의 조기폐경 환자(B-D)의 혈장 샘플에 대하여 2-DE 분석을 수행하여 얻어진 결과를 나타낸다. 도 1에서 녹색은 대조군 및 조기폐경 환자 모두에서 발현되는 단백질 스팟을 나타내고, 적색은 대조군 또는 조기폐경 환자에서만 발현되는 단백질을 나타낸다.
도 2는 31명의 대조군 샘플에 대한 웨스턴 블럿팅 분석 결과를 나타내고, 도 3은 23명의 위험군(POF risk group) 샘플에 대한 웨스턴 블럿팅 결과를 나타내고, 도 4는 12명의 환자군에 대한 웨스턴 블럿팅 결과를 나타내고, 도 5는 도 2 내지 도 4의 결과를 근거로, 각 단백질의 상대적인 발현비율을 계산하여 얻어진 결과를 나타낸다.
본 발명자들은 조기폐경 환자의 혈액에서 혈장을 분리하여 2-DE-LC-MS/MS(two-dimensional electrophoresis-liquid chromatography-mass spectrometry) 분석을 수행하였으며, 조기폐경 환자와 대조군에서 발현차이를 나타내는 단백질들을 분석하였다. 분석된 조기폐경 환자에게서 특이적으로 발현하는 단백질의 발현 양상을 웨스턴 블롯(Western blot) 기법을 통해 재검증하여 6종의 단백질들, 즉 컴플리멘트 컴포넌트 3(Complement component 3), 피브리노오겐 α(Fibrinogen α), 피브리노오겐 β(Fibrinogen β), 피브리노오겐 γ(Fibrinogen γ), 셀룰로플라스민(Ceruloplasmin), 및 성 호르몬-결합 글로불린(Sex hormone-binding globulin)을 동정하였다. 이들 6종의 단백질은 적은 양의 혈액을 사용하여 조기폐경을 진단하기 위한 바이오마커로서 활용할 수 있으며, 나아가 조기폐경의 분자생물학적 기전 연구에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명은 조기폐경 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 대상자의 혈액 중 컴플리멘트 컴포넌트 3(Complement component 3), 피브리노오겐 α(Fibrinogen α), 피브리노오겐 β(Fibrinogen β), 피브리노오겐 γ(Fibrinogen γ), 셀룰로플라스민(Ceruloplasmin), 및 성 호르몬-결합 글로불린(Sex hormone-binding globulin)으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 단백질을 코딩하는 유전자의 과발현을 측정하는 단계를 포함하는 분석방법을 제공한다.
본 명세서에서, 상기 "과발현(overexpression)"이라 함은 정상인에 비하여 조기폐경 환자에서 해당 단백질을 코딩하는 유전자가 적어도 약 1.5배 이상 발현되는 것을 말한다. 따라서, 본 발명의 분석방법에 있어서, 컴플리멘트 컴포넌트 3, 피브리노오겐 α, 피브리노오겐 β, 피브리노오겐 γ, 셀룰로플라스민, 및 성 호르몬-결합 글로불린을 코딩하는 유전자가 정상인에 비하여 약 1.5배 이상 발현될 경우, 조기폐경 환자로 진단될 수 있다.
본 발명의 분석방법에 바이오마커로 사용되는 상기 단백질 및 이를 코딩하는 유전자는 모두 공지되어 있으며, 따라서 공지된 단백질 및 유전자 서열을 본 발명의 분석방법에 이용될 수 있다. 컴플리멘트 컴포넌트 3(Complement component 3)의 단백질 서열 및 유전자 서열은 각각 서열번호 1 및 16과 같다. 피브리노오겐 α(Fibrinogen α)는 2개의 동형체가 알려져 있으며, 단백질 서열은 각각 서열번호 2 및 3과 같고, 이의 유전자 서열은 각각 서열번호 17 및 18과 같다. 피브리노오겐 β(Fibrinogen β)도 2개의 동형체가 알려져 있으며, 단백질 서열은 각각 서열번호 4 및 5와 같고, 이의 유전자 서열은 각각 서열번호 19 및 20과 같다. 피브리노오겐 γ(Fibrinogen γ)도 2개의 동형체가 알려져 있으며, 단백질 서열은 각각 서열번호 6 및 7과 같고, 이의 유전자 서열은 각각 서열번호 21 및 22와 같다. 셀룰로플라스민(Ceruloplasmin)의 단백질 서열 및 유전자 서열은 각각 서열번호 8 및 23과 같다. 성 호르몬-결합 글로불린(Sex hormone-binding globulin)은 7개의 동형체가 알려져 있으며, 단백질 서열은 각각 서열번호 9 내지 15와 같고, 이의 유전자 서열은 각각 서열번호 24 내지 30과 같다. 이를 요약하면 하기 표 1과 같다.
Figure PCTKR2019012892-appb-T000001
따라서, 본 발명의 분석방법에 있어서, 상기 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1 내지 15의 아미노산 서열로 구성된 단백질로부터 1종 이상 선택된 단백질을 코딩하는 유전자일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 16 내지 30의 염기 서열로 구성된 유전자로부터 1종 이상 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 분석방법은 상기 6종의 바이오마커의 2종 이상의 조합을 사용함으로써, 조기폐경의 진단 효율을 더욱 높일 수 있다. 즉, 일 구현예에서, 본 발명의 분석방법은 컴플리멘트 컴포넌트 3, 피브리노오겐 α, 피브리노오겐 β, 피브리노오겐 γ, 셀룰로플라스민, 및 성 호르몬-결합 글로불린으로 이루어진 군으로부터 2종 이상 선택된 단백질, 바람직하게는 6종의 단백질을 코딩하는 유전자의 과발현을 측정함으로써 수행될 수 있다.
상기 유전자의 과발현 측정은 해당 유전자의 mRNA 또는 단백질(즉, 서열번호 1 내지 15의 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질)의 수준(level)을 생명공학 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 측정함으로써 수행될 수 있다. 단백질 양의 측정은 웨스턴 블럿팅 등의 방법에 의해 측정할 수 있다. 웨스턴 블럿팅 방법으로 단백질의 양을 측정하는 경우, 측정된 단백질 발현량이 정상인의 단백질 발현량에 비하여 상기한 바와 같이 1.5배 또는 2배 이상 높은 경우 조기폐경 위험 환자로 판정할 수 있다. 또한, 상기 단백질을 코딩하는 유전자(예를 들어, 서열번호 16 내지 30의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자)의 mRNA 양의 측정은 역전사-PCR(Reverse Transcription PCR) 또는 실시간-PCR(Real Time PCR) 등의 방법에 의해 측정할 수 있다.
본 발명은 또한 컴플리멘트 컴포넌트 3, 피브리노오겐 α, 피브리노오겐 β, 피브리노오겐 γ, 셀룰로플라스민, 및 성 호르몬-결합 글로불린으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 단백질을 코딩하는 유전자의 과발현을 측정할 수 있는 분자를 포함하는 조기폐경 진단용 키트로서, 상기 분자가 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 기질, 리간드, 또는 보조인자(cofactor); 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적인 상보적 서열을 갖는 프라이머인 조기폐경 진단용 키트를 제공한다.
컴플리멘트 컴포넌트 3, 피브리노오겐 α, 피브리노오겐 β, 피브리노오겐 γ, 셀룰로플라스민, 및/또는 성 호르몬-결합 글로불린을 코딩하는 유전자의 발현량을 측정할 수 있는 분자로는, 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 기질, 리간드, 또는 보조인자(cofactor); 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적인 상보적 서열을 갖는 프라이머일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조기폐경 진단용 키트에 있어서, 상기 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1 내지 15의 아미노산 서열로 구성된 단백질로부터 1종 이상 선택된 단백질을 코딩하는 유전자일 수 있으며, 예를 들어 서열번호 16 내지 30의 염기 서열로 구성된 유전자로부터 1종 이상 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 조기폐경 진단용 키트는 컴플리멘트 컴포넌트 3, 피브리노오겐 α, 피브리노오겐 β, 피브리노오겐 γ, 셀룰로플라스민, 및 성 호르몬-결합 글로불린으로 이루어진 군으로부터 2종 이상 선택된 단백질, 바람직하게는 6종의 단백질을 코딩하는 유전자의 과발현을 측정할 수 있는 분자를 포함할 수 있다.
컴플리멘트 컴포넌트 3, 피브리노오겐 α, 피브리노오겐 β, 피브리노오겐 γ, 셀룰로플라스민, 및/또는 성 호르몬-결합 글로불린은 생명공학 분야에서 통상적으로 사용되는 방법에 따라 폴리클론 항체 또는 단일클론 항체를 제조할 수 있으며, 해당 항체를 포함하는 진단용 키트를 제조할 수 있다. 또한, 컴플리멘트 컴포넌트 3, 피브리노오겐 α, 피브리노오겐 β, 피브리노오겐 γ, 셀룰로플라스민, 및/또는 성 호르몬-결합 글로불린은 기능이 밝혀져 있으므로, 이에 대한 기질, 리간드, 또는 보조인자를 포함하도록 본 발명의 키트를 제작할 수도 있다. 또한, 컴플리멘트 컴포넌트 3, 피브리노오겐 α, 피브리노오겐 β, 피브리노오겐 γ, 셀룰로플라스민, 및/또는 성 호르몬-결합 글로불린을 코딩하는 유전자에 특이적인 상보적 서열을 갖는 프라이머를 생명공학 분야에서 통상적으로 사용되는 방법에 따라 제조할 수 있으며, 해당 프라이머를 포함한 진단용 키트를 제조할 수도 있다. 또한, 상기 분자는 검출가능한 표지(예를 들어, 발색단 등)로 표지될 수 있다. 또한, 본 발명의 진단용 키트는 상기 프라이머가 기판상에 고정화되어 있는 마이크로어레이 형태를 가짐으로써 DNA 칩 또는 단백질 칩 등의 칩(chip) 형태일 수도 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명이 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예
1. 시험방법
(1) 환자모집
모든 혈액 샘플(조기폐경 환자 12명, 위험군 23명, 대조군 136명)은 2016년 10월부터 2017년 12월 사이에 대한민국 서울에 위치한 고려대학교 안암 병원(Korea University Anam Hospital)으로부터 제공되었다. AMH, FSH, 및 에스트로겐의 호르몬 검사에 근거하여 조기폐경 환자를 진단하였다. 모든 샘플은 0.01 ng/ml 미만의 AMH 수준을 기준으로 선택하였다. 2 ml의 혈액 샘플을 각각의 조기폐경 환자로부터 채취하였다. 채취된 혈액 샘플을 1,500 X g에서 15분 동안 원심분리하여 혈장 및 혈구로 분리하였다. 혈장은 시험을 위하여 -80℃에서 보관하였다.
(2) 2차원 전기영동(Two-dimensional electrophoresis, 2-DE) 분석
조기폐경 환자 3명의 혈장을 사용하여 2-DE 분석을 수행하였다. 비교를 위해 3명의 정상인 샘플을 무작위로 골라 섞어 대조군(Super control)으로 사용하였다. 혈장 샘플을 다중 친화 제거 컬럼(Multiple Affinity Removal Column, MARC)(Agilent, Wilmington, DE, USA)을 사용하여 여과하여 혈장 내에서 많이 발현하는 12종의 단백질을 제거하였다. IEF(isoelectric focusing)은 80,000 V/hr로 3-10 비선형 고정 pH 구배(Nonlinear Immobilized pH Gradient, NLIPG)로 시행하고, 9-17% 구배 슬랩 겔(slab gel)을 사용하여 시각화하였다.
(3) Q-TOF 펩타이드 분석을 위한 LC-MS/MS
나노 HPLC 시스템(nano HPLC system)(Agilent, Wilmington, DE, USA)을 사용하여 나노 LC-MS/MS 분석을 수행하였다. 펩타이드 분리를 위해, 나노 칩 컬럼(nano chip column)(150 mm × 0.075 mm, Agilent, Wilmington, DE, USA)을 사용하였다. LC 분리를 위한 이동상 A는 탈이온수 중의 0.1% 포름산 용액이었으며, 이동상 B는 아세토니트릴 중의 0.1% 포름산 용액이었다. 크로마토그래피 구배는 70분 동안 3% B에서 45% B, 1분 동안 45% B에서 95% B, 9분 동안 95% B, 및 10분 동안 3% B로 선형 증가되도록 디자인하였다. 유속은 300 nL/min로 유지하였다. 생성물의 이온 스펙트럼은 IDA(information-dependent acquisition) 모드로 얻었으며, 300-2000 m/z (1.0 sec)로부터의 완전 스캔 TOF MS(one full scan TOF MS) 및 150-2000 m/z (1.5 sec each)로부터의 3개 산물 이온 스캔(three product ion scans)의 연속 사이클을 사용하여 Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF로 분석하였다. 3 Da의 선택 쿼드러플 레졸루션(selection quadrupole resolution)을 사용하여, 가장 강한 이온으로부터 시작하여 프리커서 m/z 값을 선택하였다. 프리커서 값과 하전 상태에 근거하여 충동 에너지를 결정하는 롤링 충돌 에너지 시스템(rolling collision energy feature)을 사용하였다. 프리커서 이온 m/z 값에 대한 동적 익스클루션 시간(dynamic exclusion time)은 60초였다.
(4) 데이터베이스 검색
단백질 서열 데이터베이스에서 펩타이드 서열을 동정하기 위하여 매스콧 알고리듬(http://www.matrixscience.com, Matrixscience, Boston, MA, USA)을 사용하였다. 검색의 기준은 다음과 같다: 1. 분류(taxonomy), 2. 마이키스 고정 변환(mykiss fixed modification), 3. 시스테인 잔기에서의 카르복시아미도메틸화(carboxyamidomethylated at cysteine residues), 4. 가변 변환(variable modification), 5. 메티오닌 잔기에서의 산화(oxidized at methionine residues), 6. 최대 허용가능 미스 절단(maximum allowed missed cleavage), 7. MS 톨러런스(MS tolerance): 100 ppm, 8. MS/MS 톨러런스: 0.1 Da. 트립신에 의한 소화에 의해 야기되는 단백질만을 고려하였다.
(5) 웨스턴 블럿팅
1,500 X g로 15분 동안 원심분리하여 혈장을 분리하였다. 희석된 혈장단백질을 2X SDS 단백질로딩버퍼와 함께 10분 동안 끓인 후, 샘플을 SDS-PAGE 겔에 로딩하고, 폴리비닐리덴 플루오라아드(polyvinylidene fluoride, PVDF) 미세다공성 막(Millipore, Billerica, MA, USA)에 옮겼다. 1차 항체를 상기 막과 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션한 다음, 세척하고, 2차 항체를 가하고 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. ECL 시약 용액(Young In Frontier, Seoul, Korea)을 사용하여 블롯을 검출하였다.
(6) 항체
마우스 항-C3 (C-4) 단일클론항체(sc-25298) 및 항-피브리노오겐 γ(sc-133157), 래빗 항-셀룰로플라스민 (H-60) 다클론항체(sc-20957), 고우트 항-피브리노오겐 α(sc-18026), 및 항-피브리노오겐 β(sc-18029) 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하였다. 래빗 항-SHBG 다클론항체(CSB-PA12289A0Rb)는 CUSABIO (Wuhan, China)로부터 구입하였다.
(7) 통계분석
덴시토메터 분석(Densitometric analysis)은 Image J (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)로 수행하였고, t-test는 GraphPad Prism version 5 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)로 수행하였다. ANOVA는 유의성 있는 차이를 나타내기 위한 일원 분석(one-way analysis)으로 수행하였다.
2. 시험결과
(1) 혈액 샘플의 분류
프로테오믹스 분석을 사용한 조기폐경과 관련된 단백질을 조사하기 위하여, 조기 폐경으로 의심되는 환자를 스크리닝한 후 호르몬 검사를 실시하였다. 폐경은 혈액 내 호르몬 수준을 측정함으로써 진단하였으며, 생화학적으로는 높은 수준의 FSH 및 낮은 수준의 AMH를 특징으로 한다. AMH 수준에 근거하여, 피검자의 연령층의 중간값 이상의 사람을 대조군으로, 피검자의 연령층의 중간값보다 10% 이상 큰 값은 위험군(POF risk group)으로, 피검자의 연령층의 10% 이하의 값은 환자군으로 하였다. 총 136명의 대조군, 23명의 위험군, 및 12명의 환자군이 모집되었다. 혈액을 채취하고, 1,500 X g로 15분 동안 원심분리하여 혈장과 혈구로 분리하였다.
(2) 2-DE-LC-MS/MS를 통해 발현차이를 나타내는 스팟 분석
조기폐경 환자에서 발현 차이를 나타내는 단백질을 동정하기 위하여, 조기폐경 환자의 혈장을 사용하여 2-DE 분석을 수행하였다. 정상인(대조군) 및 조기폐경 환자의 단백질 발현 수준을 비교하기 위하여 3명의 조기폐경 환자의 혈장 샘플 및 1개의 정상 혈장 샘플(3명의 대조군 샘플을 무작위로 골라 섞어 얻어진 Super control)을 사용하였다. MARC를 사용하여 혈장내에서 많이 발현하는 12종의 단백질을 제거하였다. 2-DE 분리를 수행한 결과, 대조군 샘플에서 301개(A), 조기폐경 환자 샘플에서 각각 340개(B), 375개(C), 339개(D)의 스팟이 검출되었다(도 1). 도 1에서 녹색은 대조군 및 조기폐경 환자 모두에서 발현되는 단백질 스팟을 나타내고, 적색은 대조군 또는 조기폐경 환자에서만 발현되는 단백질을 나타낸다.
대조군 스팟과의 비교를 통하여, 2배 이상 증가 또는 감소된 스팟을 분리하였다. MALD-TOF-MS/MS 분석을 사용하여 분석한 결과, 5개의 단백질이 대조군 또는 조기폐경 환자에서 2배 이상 발현이 증가하였으며, 30개의 스팟은 정상인 또는 조기폐경 환자에서 2배 이상 발현이 증가하거나 감소하였다. 이들 중, 총 11개의 단백질이 유의성을 갖는 것으로 판명되었고, 이중 5개의 단백질은 대조군에 비하여 조기폐경 환자에서 2배 이상 발현이 증가하였고, 5개의 단백질은 대조군에 비하여 조기폐경 환자에서 2배 이상 발현이 감소하였으며, 1개의 단백질은 조기폐경 환자에서 특이적으로 발현되었다(표 2).
Figure PCTKR2019012892-appb-T000002
상기 2-DE-LC-MS/MS 분석 결과로부터, 대조군에 비하여 조기폐경 환자에서 2배 이상 발현이 증가한 단백질은 컴플리멘트 컴포넌트 3(Complement component 3), 피브리노오겐 α(Fibrinogen α), 피브리노오겐 β(Fibrinogen β), 및 피브리노오겐 γ(Fibrinogen γ) 등이었으며, 대조군에 비하여 조기폐경 환자에서 2배 이상 발현이 감소한 단백질은 셀룰로플라스민(Ceruloplasmin) 등이었다. 또한, 조기폐경 환자에서 특이적으로 발현되는 단백질은 성 호르몬-결합 글로불린(Sex hormone-binding globulin)이었다.
(3) 조기폐경 환자의 단백질 검정
2-DE-LC-MS/MS 분석을 통하여 얻어진 단백질을 검정하기 위하여, 웨스턴 블럿팅을 수행하였다. 대조군과 환자군의 비교를 위하여, 도 2는 31명의 대조군 샘플에 대한 웨스턴 블럿팅 결과이며, 도 3은 23명의 위험군(POF risk group) 샘플에 대한 웨스턴 블럿팅 결과이고, 도 4는 12명의 환자군에 대한 웨스턴 블럿팅 결과이다. 도 3 및 도 4에서 "C"는 대조군 샘플을 섞은 후 수행한 웨스턴 블럿팅 결과이다. 도 5는, 도 2 내지 도 4의 결과를 근거로, 각 단백질의 상대적인 발현비율을 계산하여 얻어진 결과이다.
도 2 내지 도 5의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 셀룰로플라스민은 대조군에 비하여 환자군에서 더 높게 발현되었다. 다른 단백질들 즉, 컴플리멘트 컴포넌트 3, 피브리노오겐 α, 피브리노오겐 β, 및 피브리노오겐 γ는 각각 대조군에 비하여 환자군에서 더 높게 발현되었으며, 이는 2-DE-LC-MS/MS 분석 결과와 일치된다. 또한, 환자군에서 특이적으로 발현되는 단백질인 성 호르몬-결합 글로불린(Sex hormone-binding globulin, SHBG)은 모든 환자군 샘플에서 발현되는 것이 확인되었다. 따라서, 셀룰로플라스민, 컴플리멘트 컴포넌트 3, 피브리노오겐 α, 피브리노오겐 β, 피브리노오겐 γ, 및 성 호르몬-결합 글로불린은 대조군에 비하여 환자군에서 더 높게 발현되므로, 이들 단백질들을 조기폐경 진단을 위한 바이오마커로서 사용하는 것이 가능하다.
3. 고찰
본 발명자들은 2-DE-LC-MS/MS 분석을 통해 조기폐경 환자의 혈액에서 셀룰로플라스민, 컴플리멘트 컴포넌트 3, 피브리노오겐 α, 피브리노오겐 β, 피브리노오겐 γ, 및 성 호르몬-결합 글로불린이 특이적으로 발현한다는 것을 확인하였으며, 웨스턴 블롯 분석을 통해 조기폐경 환자에게서 이들 단백질들의 특이적인 발현을 검증하였다. 아직까지 이들 단백질들과 조기폐경과 직접적인 연관성에 관한 연구결과는 알려진 바 없으나, 본 연구결과로 이들 단백질들이 조기폐경을 진단할 수 있는 혈청 바이오마커로서 사용 가능성을 가진다는 것을 확인할 수 있다.

Claims (13)

  1. 조기폐경 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 대상자의 혈액 중 컴플리멘트 컴포넌트 3, 피브리노오겐 α, 피브리노오겐 β, 피브리노오겐 γ, 셀룰로플라스민, 및 성 호르몬-결합 글로불린으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 단백질을 코딩하는 유전자의 과발현을 측정하는 단계를 포함하는 분석방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단백질을 코딩하는 유전자가 서열번호 1 내지 15의 아미노산 서열로 구성된 단백질로부터 1종 이상 선택된 단백질을 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 하는 분석방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 유전자가 서열번호 16 내지 30의 염기 서열로 구성된 유전자로부터 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 분석방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 측정이 컴플리멘트 컴포넌트 3, 피브리노오겐 α, 피브리노오겐 β, 피브리노오겐 γ, 셀룰로플라스민, 및 성 호르몬-결합 글로불린으로 이루어진 군으로부터 2종 이상 선택된 단백질을 코딩하는 유전자의 과발현을 측정함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 분석방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자의 과발현 측정이 mRNA 또는 단백질의 양을 측정하는 것을 특징으로 하는 분석방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 단백질의 양의 측정이 웨스턴 블럿팅에 의하여 수행되는 것을 특징으로 하는 분석방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 mRNA 양의 측정이 RT-PCR 또는 실시간-PCR을 수행하여 측정하는 것을 특징으로 하는 분석방법.
  8. 컴플리멘트 컴포넌트 3, 피브리노오겐 α, 피브리노오겐 β, 피브리노오겐 γ, 셀룰로플라스민, 및 성 호르몬-결합 글로불린으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 단백질을 코딩하는 유전자의 과발현을 측정할 수 있는 분자를 포함하는 조기폐경 진단용 키트로서,
    상기 분자가 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 기질, 리간드, 또는 보조인자(cofactor); 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적인 상보적 서열을 갖는 프라이머인 조기폐경 진단용 키트.
  9. 제8항에 있어서, 상기 단백질을 코딩하는 유전자가 서열번호 1 내지 15의 아미노산 서열로 구성된 단백질로부터 1종 이상 선택된 단백질을 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 하는 조기폐경 진단용 키트.
  10. 제9항에 있어서, 상기 유전자가 서열번호 16 내지 30의 염기 서열로 구성된 유전자로부터 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 조기폐경 진단용 키트.
  11. 제8항에 있어서, 컴플리멘트 컴포넌트 3, 피브리노오겐 α, 피브리노오겐 β, 피브리노오겐 γ, 셀룰로플라스민, 및 성 호르몬-결합 글로불린으로 이루어진 군으로부터 2종 이상 선택된 단백질을 코딩하는 유전자의 과발현을 측정할 수 있는 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 조기폐경 진단용 키트.
  12. 제8항에 있어서, 상기 분자가 검출가능한 표지로 표지된 것임을 특징으로 하는 조기폐경 진단용 키트.
  13. 제8항에 있어서, 상기 프라이머가 기판상에 고정화되어 있는 마이크로어레이 형태인 것을 특징으로 하는 조기폐경 진단용 키트.
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