CN102787080B - 一株曲霉菌株及其在制备木聚糖酶中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株曲霉菌株及其在制备木聚糖酶中的应用。本发明提供的曲霉（Aspergillus sp.）菌株FC2-2，其保藏编号为CGMCC No.6049。本发明还提供了生产木聚糖酶的方法，包括如下步骤：将上述的曲霉（Aspergillus sp.）菌株FC2-2进行液体发酵，收集发酵产物，离心去除菌体后得到的发酵上清液可作为木聚糖酶制剂，该木聚糖酶制剂含有的木聚糖酶的最适pH值为5.5、最适温度为60℃，其在50℃条件下具有较好的稳定性，且其水解甘蔗渣木聚糖的主要产物是木二糖。该木聚糖酶制剂在保健品木二糖的生产中具有应用潜力。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一株曲霉菌株及其在制备木聚糖酶中的应用。
背景技术
在自然界中，木质纤维素主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。半纤维素是除纤维素之外地球上含量第二大的生物质资源，其主要成分为木聚糖，木聚糖是由β-D-吡喃型木糖单元通过β-1，4-糖苷键相连的直链高聚物。木聚糖的完全降解需要木聚糖水解酶系中各种酶组分相互之间协同作用完成，包括内切-1，4-β-D-木聚糖酶（endo-1，4-β-D-xylanase，EC 3.2.1.8；又叫内切木聚糖酶endoxylanase）、β-木糖苷酶(β-xylosidase,EC 3.2.1.37)、阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)等，其中内切木聚糖酶是最关键的水解木聚糖的酶（Beg QK,Kapoor M.Microbial xylanases and theirindustrial applications:a review.Applied Microbiology andBiotechnology,2001,56:326-338；Soundari SG,Sashi V.Microbial xylanase:itsimportant role in various industries.Asian Journal of Environmental Science,2009，3:191-195）。内切木聚糖酶水解木聚糖生成木二糖、木三糖等木寡糖。木寡糖具有很高的商业价值。人们研究发现，木寡糖特别是木二糖能够作为益生元刺激人体肠道内的益生菌双歧杆菌的生长，可以应用到保健品行业中去（Rastall RA.Functional oligosaccharides:application and manufacture.Annual Review ofFood Science and Technology，2010，1:305-339）。因为工业生产的需要，人们对热稳定性好的木聚糖酶比较感兴趣（Dhiman SS,Sharma J,Battana B.Industrialapplications and future prospects of microbial xylanases:a review.BioResourecs,2008,3:1377-1402）。
丝状真菌具有较强的产生木聚糖酶的能力，目前报道的产生木聚糖酶的真菌大多数集中在曲霉属（Aspergillus）和木霉属（Trichoderma），已报道的曲霉属真菌所产木聚糖酶水解木聚糖的主要产物多为木二糖以外的木寡糖，未见以木二糖为主要产物且温度稳定性较好的烟曲霉产木聚糖酶的报道（Techapun C,Poosaran N.Thermostableand alkaline-tolerant microbial cellulase-free xylanases produced fromagricultural wastes and the properties required for use in pulp bleachingbioprocesses:a review.Process Biochemistry,2003,38:1327-1340；Sedlmeyer FB.Xylan as by-product of biorefineries:Characteristics and potential.FoodHydrocolloids,2011,25:1891-1898）。
广西作为中国蔗糖的主要产区，拥有大量的甘蔗渣资源，利用甘蔗渣木聚糖生产木寡糖，对于利用农业废弃物、减轻环境压力都有着重要的意义。
发明内容
本发明的一个目的是提供一株烟曲霉（Aspergillus fumigatus）菌株FC2-2。
本发明提供的烟曲霉（Aspergillus fumigatus）菌株FC2-2，其保藏编号为CGMCC No.6049。
上述的烟曲霉（Aspergillus fumigatus）菌株FC2-2在制备木聚糖酶或木聚糖酶制剂中的应用也是本发明保护的范围。
本发明的第二个目的是提供一种生产木聚糖酶的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：发酵上述的烟曲霉（Aspergillus fumigatus）菌株FC2-2，收集发酵产物，即得到木聚糖酶。
上述方法中，所述发酵的条件为在26-32℃、180rpm培养4-7天。在本发明的实施例中，发酵的条件具体为在28℃、180rpm培养4天；
上述方法中，所述发酵采用的发酵培养基的组分如下：每L所述发酵培养基由10g酵母粉、10g蛋白胨、40g玉米芯、0.5g MgSO4·7H2O、0.3g CaCl2、2g KH2PO4、2g吐温80和水组成，用水补足体积；
所述发酵培养基的pH值为pH4.0-6.0；本发明的实施例中，发酵培养基的pH值具体为5.5。
上述方法中，上述发酵为将上述的烟曲霉（Aspergillus fumigatus）菌株FC2-2的孢子溶液接种至所述发酵培养基中培养；
上述孢子溶液为将上述的烟曲霉（Aspergillus fumigatus）菌株FC2-2的孢子悬浮在无菌去离子水中得到的溶液。
上述方法中，在所述收集发酵产物后还包括如下步骤：将所述发酵产物离心，收集上清液，得到木聚糖酶；上述离心具体为12000rpm，离心5min，离心半径为5.5cm。
由上述的方法制备得到的木聚糖酶也是本发明保护的范围。
本发明的第三个目的是提供一种木聚糖酶制剂。
本发明提供的木聚糖酶制剂，其活性成分为上述的烟曲霉（Aspergillusfumigatus）菌株FC2-2或上述木聚糖酶。
上述木聚糖酶最适作用pH为pH5.5，最适反应温度为60℃，且在50℃下有较好的稳定性。
上述木聚糖酶或上述的木聚糖酶制剂在以甘蔗渣木聚糖为原料生产木二糖中的应用也是本发明保护的范围；在此应用中，所述木聚糖酶或所述木聚糖酶制剂与所述甘蔗渣木聚糖的配比具体均为500U：1g；具体为烟曲霉FC2-2发酵液（木聚糖酶）的最优量为每g甘蔗渣木聚糖加入500U木聚糖酶，底物甘蔗渣木聚糖浓度最优为50g/L。
上述菌株FC2-2已于2012年04月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为CGMCC No.6049，分类命名为烟曲霉Aspergillus fumigatus。
本发明的实验证明，本发明发现了一株烟曲霉（Aspergillus fumigatus）FC2-2，对其进行发酵培养，发酵液可作为木聚糖酶，该木聚糖酶可以甘蔗渣木聚糖为原料生产木二糖，在对甘蔗渣的转化利用中具有应用潜力。
附图说明
图1为烟曲霉菌株FC2-2分生孢子梗的显微镜照片。
图2为烟曲霉菌株FC2-2液态木聚糖酶制剂最适作用pH曲线。
图3为烟曲霉菌株FC2-2液态木聚糖酶制剂最适作用温度曲线。
图4为烟曲霉菌株FC2-2液态木聚糖酶制剂的温度稳定性曲线。
图5为烟曲霉菌株FC2-2液态木聚糖酶制剂水解甘蔗渣木聚糖所得产物的HPLC图谱。
图6为烟曲霉菌株FC2-2液态木聚糖酶制剂水解甘蔗渣木聚糖时不同底物浓度对木二糖得率的影响。
图7为烟曲霉菌株FC2-2液态木聚糖酶制剂水解甘蔗渣木聚糖时不同酶用量对木二糖得率的影响。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的%，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。以下实施例中的转速，均为在半径为5.5cm的离心半径下的转速。
pH5.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配制：将11.35mL 0.2M Na2HPO4水溶液和8.65mL 0.1M柠檬酸水溶液混合。
实施例1、实施例2、实施例3中，木聚糖酶活力测定采用3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylate,DNS）法(Miller GL.Use of dinitrosalicyclic acidreagent for determination of reducing sugar.Analytical Chemistry,1959,31:426-428)，具体步骤如下：
1、将木糖溶于无菌去离子水中，制成不同浓度的木糖标准液（0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL）；在500μL木糖标准液中加入1mL DNS,沸水浴5min显色，冷却至室温（25℃），540nm处测定光吸收值；得到光吸收值和木糖浓度的标准曲线。标准曲线的函数式为y=3.0549x+0.0008(R2=0.9990)(y为光吸收值，x为木糖浓度)。
2、向2mL EP管中加入250μL 1%桦木木聚糖(Sigma公司)溶液，然后加入250μL液态木聚糖酶制剂，60℃下反应10min,期间不断振荡，使酶与底物充分接触，反应结束后加入1mL DNS,沸水浴5min显色，冷却至室温，1,200rpm离心1min,取出上清液200μL，540nm处测定上清液的光吸收值，根据标准曲线和光吸收值计算木聚糖酶活力。木聚糖酶活力定义：在指定条件下水解木聚糖，每min释放出1μmol还原糖（相当于等量的木糖）所需的酶量为一个酶活力单位（U）。
实施例1、烟曲霉菌株FC2-2的分离鉴定
一、菌株的获得
1、土壤样品的采集
采集中国广西防城港市某淀粉厂附近8-20cm浅土层的土壤。
2、菌株的分离筛选
（1）用蒸馏水配制分离培养基；每升分离培养基中含有:桦木木聚糖2g，NaNO32g，KH2PO41g，FeSO4·7H2O 0.001g，MgSO4·7H2O 0.5g，琼脂15g；pH5.5；121℃湿热灭菌20min，混匀，倒平板。
（2）取1g土样放入150mL锥形瓶，加入19mL无菌水，于磁力搅拌器上搅拌30min,取悬浊液做梯度稀释（10-1、10-2、10-3、10-4和10-5），各取100μL涂布在分离培养基平板上，28℃培养。
（3）5天后，观察菌落生长情况，选择菌落数适量的稀释样品大量涂布在8块分离平板上，28℃培养。
（4）3天后，挑选分离平板上生长旺盛的真菌，转接至新的分离平板，纯化为单菌落。
（5）配制pH 5.5的液体的基本发酵培养基（又称为发酵培养基）：每升基本发酵培养基中含有:酵母粉10g，蛋白胨10g,玉米芯40g,MgSO4·7H2O 0.5g,CaCl20.3g,KH2PO42g,吐温802g。加水定容到1L，121℃湿热灭菌20min。
（6）将步骤（4）得到的目的菌株接种至液体的基本发酵培养基中，28℃、180rpm培养6天，取上清液进行木聚糖酶活力测定，从中筛选出酶活力最高的菌株FC2-2。
二、菌株的鉴定
菌株FC2-2的分生孢子梗的光学显微镜照片见图1，光学显微镜下观察可见分生孢子梗顶端膨大呈球形，小梗双层轮生，分生孢子为圆形。
菌株FC2-2的分子鉴定；具体鉴定步骤如下：提取菌株FC2-2的总DNA并作为模板，应用通用引物ITS1（5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3′）和ITS4（5′TCCTCCGCTTATTGATATG 3′），PCR扩增得到其ITS，经测序获得一条550bp的核苷酸序列（序列表中的序列1），同源性比对分析表明：其与烟曲霉（Aspergillusfumigatus）的同源性最高。
根据该菌株的形态特征，参照《真菌鉴定手册》（魏景超，上海:上海科学技术出版社，1979），并结合分子鉴定结果，将菌株FC2-2初步鉴定为烟曲霉（Aspergillusfumigatus）。
上述菌株FC2-2已于2012年04月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为CGMCC No.6049，分类命名为烟曲霉Aspergillus fumigatus。
实施例2、利用烟曲霉菌株FC2-2制备木聚糖酶
一、发酵液的获得
1、配制发酵培养基
配制pH 5.5的液体的基本发酵培养基（配方同上）。
2、孢子液的制备
（1）配制PDA固体培养基并将其121℃灭菌20min。
（2）把在PDA固体培养基平板上传代活化5天由实施例1得到的烟曲霉菌株FC2-2的孢子用无菌水洗下后制成孢子悬液，其中孢子浓度为1×107个/mL。
3、发酵液的获得
（1）将50mL液体的基本发酵培养基置于250mL摇瓶中。121℃湿热灭菌20min。
（2）将实施例1得到的烟曲霉菌株FC2-2的孢子悬液按1%的接种量（体积百分含量）接种至发酵培养基中，28℃、180rpm培养4天。
（3）12,000rpm离心5min培养物，去除菌体，收集上清液即为烟曲霉FC2-2发酵液。
将上清液作为待测溶液，进行木聚糖酶活力测定（检测方法同前），结果该上清液（烟曲霉FC2-2发酵液）的木聚糖酶活力为130U/mL，证明该发酵液为木聚糖酶，也称为液态木聚糖酶制剂。
二、发酵液的木聚糖酶酶学特性
1、发酵液的木聚糖酶的最适作用pH值和最适作用温度
1）、最适作用pH值
检测不同pH条件下烟曲霉FC2-2发酵液酶活力的差异：分别用不同pH的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5或7.0）配制1%的桦木木聚糖溶液，37℃下测定各pH值下该发酵液的酶活力。木聚糖酶活力定义为：37℃条件下水解桦木木聚糖，每min释放出1μmol还原糖（相当于等量的木糖）所需的酶量为一个酶活力单位（U）。
木聚糖酶活力在不同pH值下的测定结果如下：9.2U/mL（pH 3.0）、14.9U/mL（pH3.5）、26.7U/mL（pH4.0）、46.5U/mL（pH4.5）、58.9U/mL（pH5.0）、64.7U/mL（pH5.5）、51.2U/mL（pH6.0）、49.2U/mL（pH6.5）、38.1U/mL（pH 7.0）。以最高酶活力为100%，其它pH下的酶活力与最高酶活力的比值为相对酶活力，以pH值为横坐标，相对酶活力为纵坐标作图，见图2。结果表明，烟曲霉FC2-2发酵液作为木聚糖酶最适作用pH为pH5.5。
2、最适作用温度
检测不同温度条件下烟曲霉FC2-2发酵液酶活力的差异：分别在不同的反应温度（30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃）以及pH5.5条件下测定烟曲霉FC2-2发酵液的酶活力，酶活力定义为：pH5.5条件下水解桦木木聚糖，每min释放出1μmol还原糖（相当于等量的木糖）所需的酶量为一个酶活力单位（U）。
木聚糖酶活力在不同温度下的测定结果如下：25.8U/mL（30℃）、37.9U/mL（35℃）、53.2U/mL（40℃）、76.0U/mL（45℃）、94.9U/mL（50℃）、118.1U/mL（55℃）、130U/mL（60℃）、114.5U/mL（65℃）、87.9U/mL（70℃）、31.1U/mL（75℃）、14.2U/mL（80℃）。以最高酶活力作为100%，其它温度下的酶活力与最高酶活力的比值为相对酶活力，以温度为横坐标，相对酶活力为纵坐标作图，见图3。结果表明，烟曲霉FC2-2发酵液作为木聚糖酶最适反应温度为60℃。
3、温度稳定性
将烟曲霉FC2-2发酵液分别置于50℃、55℃、60℃水浴锅中保温一定时间（1h、2h、4h、6h）,然后在pH 5.5、60℃的条件下测定保温后酶液的木聚糖酶活力，以4℃下保存的酶液的酶活力为100%，经保温后酶液的酶活力与最高酶活力比值为相对酶活力，以保温时间为横坐标，相对酶活力为纵坐标作图，见图4。结果表明，烟曲霉FC2-2发酵液作为木聚糖酶在50℃下有较好的稳定性。
三、烟曲霉FC2-2发酵液水解甘蔗渣木聚糖
1、烟曲霉FC2-2发酵液水解甘蔗渣木聚糖产物分析
1）、制备甘蔗渣木聚糖溶液
（1）利用碱法从甘蔗渣中提取木聚糖：将粉碎后的甘蔗渣置于10%的KOH溶液里(固液比1:10），70℃下放置2h后,8000rpm离心10min，取上清液，加入4倍体积的乙醇，充分混匀后，8000rpm离心10min，收集沉淀块，将沉淀块置于60℃烘箱烘干至恒重即为甘蔗渣木聚糖(Hromadkova Z,Kovacikova J,Ebringerova A.Study of theclassical and ultrasound-assisted extraction of the corn cob xylan.IndustrialCrops and Products,1999,9:101-109）。
（2）将0.1g甘蔗渣木聚糖悬于10mL pH5.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，得到浓度为1%的甘蔗渣木聚糖溶液。
2）、产物分析
在指形瓶中加入2mL 1%甘蔗渣木聚糖悬液，然后加入2mL烟曲霉FC2-2发酵液，放置50℃摇床中，150rpm震荡96h后取样，沸水煮5min灭活木聚糖酶，冷却；12,000rpm离心5min，取上清液，HPLC检测上清液中的糖组分（色谱仪器为岛津CBM-10A系统，色谱柱型号为Aminex HPX-87P，检测器型号为RID-10A，柱温保持在80℃，流动相为水，体积流量为0.6mL/min)。标准样品为木糖、木二糖和木三糖。
结果见图5所示，A为标准品；B为样品；表明烟曲霉菌株FC2-2所产生的木聚糖酶水解甘蔗渣木聚糖的主要产物为木二糖，以及少量木糖。
2、利用烟曲霉FC2-2发酵液水解甘蔗渣木聚糖生产木二糖
1）、不同底物浓度时木二糖的生产
在指形瓶中加入甘蔗渣木聚糖、烟曲霉FC2-2发酵液、pH 5.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液（各组分比例见表1），得到反应体系，放置50℃摇床中，150rpm震荡，每隔24h（1d）取样，HPLC检测（方法同上）木二糖的生成量。木聚糖酶（烟曲霉FC2-2发酵液）的用量为100U/g甘蔗渣木聚糖。
表1为液态木聚糖酶制剂水解不同浓度的甘蔗渣木聚糖反应体系各组分比例
木二糖生产率=木二糖生成量(g)*100%/初始甘蔗渣木聚糖量(g)
以木二糖生产率为纵坐标，以时间为横坐标作图，见图6，结果表明，最高木二糖生产率出现在第三天，生产率为31%，底物甘蔗渣木聚糖浓度为50g/L。
2）、不同烟曲霉FC2-2发酵液用量时木二糖的生产
在指形瓶中加入甘蔗渣木聚糖、烟曲霉FC2-2发酵液（木聚糖酶）、pH 5.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液（各组分比例见表2），得到反应体系，放置50℃摇床中，150rpm震荡，每隔24h（1d）取样，HPLC检测（方法同上）木二糖的生成量。甘蔗渣木聚糖的浓度为30g/L。
表2为不同用量的烟曲霉FC2-2发酵液水解甘蔗渣木聚糖反应体系各组分比例
木二糖生产率=木二糖生成量(g)*100%/甘蔗渣木聚糖量(g)
以木二糖生产率为纵坐标，以时间为横坐标作图，见图7，结果表明，在100～500U/g甘蔗渣木聚糖的酶用量的情况下，至反应结束的第五天时，木二糖的生产率均能达到25%以上，其中每g甘蔗渣木聚糖加入500U木聚糖酶时，木二糖的生产率最高，为34%。
从上述可以看出，以甘蔗渣木聚糖为原料，用烟曲霉FC2-2发酵液（木聚糖酶）生产木二糖中，底物甘蔗渣木聚糖浓度最优为50g/L，烟曲霉FC2-2发酵液（木聚糖酶）的最优量为每g甘蔗渣木聚糖加入500U木聚糖酶。
Claims (7)
1.烟曲霉（Aspergillus fumigatus）菌株FC2-2，其保藏编号为CGMCC No.6049。
2.权利要求1所述的烟曲霉（Aspergillus fumigatus）菌株FC2-2在制备木聚糖酶或木聚糖酶制剂中的应用。
3.一种生产木聚糖酶的方法，是发酵权利要求1所述的烟曲霉（Aspergillus fumigatus）菌株FC2-2，收集发酵产物，即得到木聚糖酶。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述发酵的条件为在26-32℃、180rpm培养4-7天。
5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述发酵的条件为在28℃、180rpm培养4天。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：
所述发酵采用的发酵培养基的组分如下：每L所述发酵培养基由10g酵母粉、10g蛋白胨、40g玉米芯、0.5g MgSO4·7H2O、0.3g CaCl2、2g KH2PO4、2g吐温80和水组成，用水补足体积；
所述发酵培养基的pH值为pH4.0-6.0。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：
所述发酵为将权利要求1所述的烟曲霉（Aspergillus fumigatus）菌株FC2-2的孢子溶液接种至所述发酵培养基中培养；
所述孢子溶液为将权利要求1所述的烟曲霉（Aspergillus fumigatus）菌株FC2-2的孢子悬浮在无菌去离子水中得到的溶液；
在所述收集发酵产物后还具体包括如下步骤：将所述发酵产物离心，收集上清液，得到木聚糖酶。
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