CN102321558B - 一种耐高温木聚糖酶的高产菌株及利用该菌发酵产耐高温木聚糖酶的方法及得到的酶 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种耐高温木聚糖酶的高产菌株及利用该菌株发酵产耐高温木聚糖酶的方法，并阐述了该酶的部分酶学性质。经菌种鉴定，将该菌命名为坎皮纳斯类芽孢杆菌G1-1(Paenibacillus campinasensis G1-1)，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为CGMCC No.5023。该菌种发酵得到的耐高温木聚糖酶，经分离纯化得到单一组分，其相对分子量为41.3KDa，最适作用温度及pH分别为60℃和7.0；在40℃～70℃和pH 5.0～9.0范围内酶活保持相对稳定。本坎皮纳斯类芽孢杆菌木聚糖酶适合造纸、食品和饲料等多个工业领域的应用，具有广阔的应用前景。

Description

一种耐高温木聚糖酶的高产菌株及利用该菌发酵产耐高温木聚糖酶的方法及得到的酶

技术领域

本发明属于生物技术与工程领域，尤其是一种耐高温木聚糖酶的高产菌株及利用该菌发酵产耐高温木聚糖酶的方法及得到的酶。

背景技术

木聚糖酶(1,4-β-D-xylanase;EC3.2.1.8)是一种重要的工业用酶，在造纸工业、食品、能源、饲料以及环境等领域中显示了广阔的应用前景，特别是在纸浆生物漂白中的巨大应用潜力早已引起各界的高度关注。木聚糖酶处理各种浆料的作用是降解浆料中的木聚糖，使浆料中半纤维素的含量降低，并使纤维素细胞壁结构变得松弛，同时使与浆中残余木素连接的半纤维素降解，形成脱木素或有利于脱木素的状态。通过木聚糖酶的预处理，不仅可以提高纸浆的白度，降低打浆的能耗，改善浆料的强度性能，而且，可以减少后继工序漂剂的用量，降低废液的毒性，减轻环境污染。

目前，以无元素氯和全无氯漂白工艺为代表的纸浆绿色清洁漂白已经成为世界各国造纸业纸浆漂白发展的必然趋势，木聚糖酶酶法助漂新工艺已在欧洲和北美的30余家大型纸厂得到应用，成为生物技术在造纸工业应用最成功的一例。其中，加拿大已有约10%的硫酸盐法纸浆厂采用了该项新工艺。丹麦诺维信公司和美国山道斯化学公司等多家酶制剂厂商，纷纷推出了专门用于纸浆处理的木聚糖酶和纤维素酶新产品，但到目前为止，工业上用于纸浆漂白的木聚糖酶大多是中性偏酸的，最适反应温度大多在50℃左右，众所周知，纸浆蒸煮和漂白基本都是在高温和强碱的条件下进行的，使得现有的低温酸性木聚糖酶产品在此领域的应用受到了极大的限制，另外，在饲料和食品领域，木聚糖酶应用在饲料的造粒和食品的焙烤工序中，仍然要求所用的木聚糖酶在高温条件下能够保持较高的酶活，因此，研究开发耐高温的木聚糖酶产品将会带来良好的经济效益和社会效益。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种在高温下有良好的稳定性，适合造纸、食品和饲料等多个工业领域的应用的耐高温木聚糖酶的高产菌株，以及利用该菌发酵产高温木聚糖酶的方法。

本发明实现目的的技术方案如下：

一种耐高温木聚糖酶的高产菌株，分类命名为：坎皮纳斯类芽孢杆菌G1-1PaenibacilluscampinasensisG1-1，菌种保藏号：CGMCCNo.5023，保藏日期：2011年7月1日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

一种耐高温木聚糖酶的高产菌株发酵产耐高温木聚糖酶的方法，按3%的接种量将该菌的液体种子接种于发酵产酶培养基中，37℃，180rpm摇瓶培养48h获得含耐高温木聚糖酶的发酵液；

所述发酵产酶培养基的成分为wt%：NaNO₃0.5,K₂HPO₄0.3、MgSO₄·7H₂O0.03、MnSO₄·H₂O0.002、FeSO₄·7H₂O0.002、CaCl₂·2H₂O0.002、桦木木聚糖0.5，pH7.0。

而且，该耐高温木聚糖酶分离步骤如下：

⑴发酵液4℃下、8000rpm、离心10min，取上清液；

⑵向发酵上清液中缓慢加入硫酸铵，使硫酸铵饱和度达到70%，4℃盐析过夜；

⑶将盐析过夜的发酵上清液4℃下、8000rpm、离心10min，取沉淀，用pH7.0的PBS缓冲液溶解沉淀，得到耐高温木聚糖酶粗酶液，备用；

⑷OctylSepharoseFastFlow疏水相互作用层析：将粗酶液硫酸铵饱和度调到40%，进行疏水相互作用层析，柱型：

平衡液：含40%饱和度硫酸铵的0.02mol/LPBS缓冲液(pH7.0)；流速：2mL/min，上样后用饱和度为40%～0%的硫酸铵线性洗脱，收集活性组分，待下一步分离用；

⑸SephadexG-75凝胶过滤层析：柱型：平衡液：0.02mol/LPBS缓冲液(pH8.0)；流速：0.5mL/min。收集活性组分，待下一步分离用；

⑹Q-Sepherose强阳离子交换层析：柱型：

平衡液：0.02mol/LPBS缓冲液(pH8.0)；流速：2mL/min，上样后用含0～1.0MNaCl的平衡缓冲液进行线性洗脱，收集活性组分，备用；

⑺将上一步得到的耐高温木聚糖酶样品进行透析除盐，然后冷冻抽干，得到耐高温木聚糖酶干粉。

一种耐高温木聚糖酶，由权利要求2或3所述得到的耐高温木聚糖纯酶。

而且，所述耐高温木聚糖酶的相对分子量为41.3KDa。

而且，所述耐高温木聚糖酶的最适作用温度为60℃。

而且，所述耐高温木聚糖酶的最适作用pH7.0。

本发明的优点和积极效果如下：

1、本发明提供了一种耐高温木聚糖酶的高产菌株，经菌种鉴定后，命名为坎皮纳斯类芽孢杆菌G1-1，并对纯化后的木聚糖酶进行了酶学性质研究，发现该酶相对分子量为41.3KDa，最适作用温度及pH分别为60℃和7.0；在40℃～70℃和pH5.0～9.0范围内酶活保持相对稳定。

2、本发明的木聚糖酶在高温下有良好的稳定性，适合造纸、食品和饲料等多个工业领域的应用，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1本发明产木聚糖酶菌种初筛平板；

图2本发明筛选到的P.campinasensis G1-1和与其16srRNA序列最相近的12个菌种构建的系统进化树；

图3本发明中P.campinasensis G1-1的生长及产酶曲线；

图4本发明中木聚糖酶的SDS-PAGE图（a）及其酶谱图（b）

其中a：1、蛋白Marker，2、发酵上清液，3、Octyl-Sepharose疏水相互作用层析后酶液，4、分离纯化后酶液，b：1、发酵上清液，2、分离纯化后酶液；

图5本发明的耐高温木聚糖酶最适作用温度；

图6本发明的耐高温木聚糖酶的温度稳定性。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

本发明提供的产耐高温木聚糖酶的菌种是从天津广聚源造纸厂的棉杆堆料中分离得到的，通过考察其形态特征、生理生化特征和16srRNA序列特征，将其鉴定为坎皮纳斯类芽孢杆菌（Paenibacillus campinasensis），命名为G1-1，保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCCNO.5023。

一、菌种形态、生理生化特征及16srRNA序列比对结果

本菌种细胞呈杆状，有芽孢，革兰氏阳性，属好氧菌，在琼脂平板上形成白色不透明、表面干燥的圆形菌落。其生理生化特征见表1。根据其16srRNA序列比对，选出与其序列最相近的12株已知菌种，构建系统进化树，进一步确定了其进化地位。

表1Paenibacillus campinasensisG1-1的生理生化特征

二、培养基及培养条件（以下培养基的溶液均为水）

富集培养基（wt%）：自制木聚糖1.0，蛋白胨0.5、NaCl0.5、MgSO₄0.03、pH9.0。

选择培养基（wt%）：自制木聚糖1.0，NH₄NO₃0.5、MgSO₄0.03、NaCl0.5、K₂HPO₄0.2、(NH₄)₂SO₄0.1、酵母粉0.03、琼脂1.5、pH9.0。

斜面培养基（wt%）：蛋白胨1.0，酵母粉0.5、NaCl1.0、琼脂1.5，pH7.0。

种子培养基（wt%）：蛋白胨1.0，酵母粉0.5、NaCl1.0，pH7.0。

基本产酶培养基（wt%）：麸皮4.0，蛋白胨0.5，K₂HPO₄0.5，pH7.0。

发酵产酶培养基（wt%）：NaNO₃0.5、K₂HPO₄0.3、MgSO₄·7H₂O0.03、MnSO₄·H₂O0.002、FeSO₄·7H₂O0.002、CaCl₂·2H₂O0.002和桦木木聚糖0.5、pH7.0。

摇瓶培养条件：种龄16h，接种量3%,250mL摇瓶装液量50mL，180rpm，37℃发酵培养48h。

三、耐高温木聚糖酶的分离纯化的路线如下：

本耐高温木聚糖酶经过以上纯化步骤后，应用SDS-PAGE和酶谱分析的方法鉴定该纯化后的蛋白为单一条带并具有木聚糖酶活性，说明经纯化得到的该耐高温木聚糖酶达到了电泳纯，其纯化的总活力回收率为6.2%，总纯化倍数为9.1，结果见表2。

表2P.campinasensis G1-1所产木聚糖酶分离纯化的活力回收表

四、酶学性质

⑴应用SDS-PAGE方法测定该纯化后的耐高温木聚糖酶的相对分子量约为41.3KDa；

⑵本耐高温木聚糖酶的最适作用温度为60℃，在40℃～60℃下保温180min，残余酶活在80.7%以上，在70℃和80℃下保温60min，残余酶活分别为77.1%和42.8%，可见该酶在高温条件下能保持较高活力，是一种耐高温木聚糖酶。

⑶该酶的最适作用pH为7.0，pH5.0～pH9.0范围内放置60min，残余酶活51%～72%。

具体操作如下：

筛选实施例1：产木聚糖酶菌株的筛选及鉴定

(1)富集培养

取0.1g土壤样品，加入到10mL无菌水中振荡混匀，然后吸取1mL菌悬液接入到5mL富集培养基中，37℃水浴振荡培养48h。

(2)透明圈法初筛

将富集培养的培养物10倍逐级稀释，分别取稀释倍数为10^-3,10^-5和10^-7的菌悬液0.5mL涂布于选择培养基平板，37℃培养24h，挑取透明圈相对较大的单菌落进行分离纯化（图1），接入斜面培养基保存原始菌种。

(3)摇瓶发酵复筛

将初筛菌种接于50mL种子培养基，37℃，180rpm过夜培养，取过夜培养后的菌液1mL接于50mL基础产酶培养基中（即接种量为2%），37℃，180rpm发酵培养48h，应用DNS法分别测量发酵液木聚糖酶酶活。

(4)菌种鉴定

应用生理生化试验（见表1），并且根据其16srRNA序列比对，选出与其序列最相近的12株已知菌种，构建系统进化树（图2）。从而鉴定该产木聚糖酶酶活力最高的菌种为坎皮纳斯类芽孢杆菌Paenibacillus campinasensis，并命名为Paenibacillus campinasensisG1-1，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCCNo.5023）。

酶活实施例2：P.campinasensisG1-1的发酵条件及产酶活性的研究

（1）木聚糖酶酶活测定方法为（DNS法）：

吸取0.1mL经适当稀释的酶液到5mL具塞刻度试管中，再加入10g/L的木聚糖底物溶液0.1mL，盖紧试管塞，50℃水浴恒温反应10min，立即向试管中加入0.6mLDNS试剂并混匀终止反应，然后在沸水中煮沸10min，冷却后加水定容至5mL，充分摇匀，根据木糖标准曲线的回归方程计算出反应体系的含糖量。

试验中对木聚糖酶活力单位的定义为:1mL酶液每分钟产生1μmoL的还原糖(以木糖计)为一个活力单位，用IU表示：

IU=N×R/10min×0.1mL

式中:N为酶液稀释倍数；R为回归方程计算出的木糖含量。

（2）P.campinasensisG1-1生长及产酶条件

将单菌落接入50mL种子培养基，37℃，180rpm摇瓶培养16h；然后按3%的接种量将种子培养物分别接种于50mL基本产酶培养基（天然培养基：麸皮4.0%，蛋白胨0.5%，K₂HPO₄0.5%，pH7.0）及发酵产酶培养基（合成培养基：NaNO₃0.5,K₂HPO₄0.3,MgSO₄·7H₂O0.03,MnSO₄·H₂O0.002,FeSO₄·7H₂O0.002,CaCl₂·2H₂O0.002和桦木木聚糖0.5，pH7.0）中，37℃，180rpm摇瓶培养96h，每隔6h取样，测定菌体浓度（OD_600nm）及木聚糖酶酶活（DNS法）。

结果见图3，P.campinasensis G1-1在天然培养基中生长相对较快，发酵24h进入稳定期，OD_600nm最高达到0.7，在合成培养基中生长相对较缓慢，发酵30h才进入平稳期，OD_600nm最高达到0.5，然而，产木聚糖酶的情况却正好相反，在天然培养基中最高酶活只达到68.22IU/mL，在合成培养基中最高酶活可达到143.98IU/mL，另外，在两种培养基中发酵产酶的最高峰都出现在菌体生长的稳定期后期。综上，由于在合成培养基中发酵产酶的周期相对较短，并且合成培养基成分均由无机离子组成，发酵液中的杂蛋白相对较少，有利于耐高温木聚糖酶的分离纯化，因此，选用合成培养基发酵生产该耐高温木聚糖酶用于下一步的分离纯化。

酶分离实施例3：耐高温木聚糖酶的分离纯化

⑴发酵液4℃下、8000rpm、离心10min，取上清液；

⑵向发酵上清液中缓慢加入硫酸铵，使硫酸铵饱和度达到70%，4℃盐析过夜；

⑶将盐析过夜的发酵上清液4℃下、8000rpm、离心10min，取沉淀，用适量体积的pH7.0的PBS缓冲液溶解沉淀，得到耐高温木聚糖酶粗酶液备用；

⑷OctylSepharoseFastFlow疏水相互作用层析：将粗酶液硫酸铵饱和度调到40%，进行疏水相互作用层析，柱型：

平衡液：含40%饱和度硫酸铵的0.02mol/LPBS缓冲液(pH7.0)；流速：2mL/min，上样后用饱和度为40%～0%的硫酸铵线性洗脱，收集活性组分，待下一步分离用；

⑸SephadexG-75凝胶过滤层析：柱型：

平衡液：0.02mol/LPBS缓冲液(pH8.0)；流速：0.5mL/min。收集活性组分，待下一步分离用；

⑹Q-Sepherose强阳离子交换层析：柱型：

平衡液：0.02mol/LPBS缓冲液(pH8.0)；流速：2mL/min，上样后用含0～1.0MNaCl的平衡缓冲液进行线性洗脱，收集活性组分，备用；

⑺将上一步得到的耐高温木聚糖酶样品进行透析除盐，然后冷冻抽干，得到的耐高温木聚糖酶干粉用于SDS-PAGE及酶谱分析。

该木聚糖酶分离纯化各步骤的活力回收及纯化倍数情况见表2，纯化后的木聚糖酶进行SDS-PAGE及酶谱分析，结果见图2，该纯化后的蛋白SDS-PAGE，得到单一条带（图4a），并经酶谱分析确定其具有木聚糖酶活性（图4b），说明经纯化得到的该耐高温木聚糖酶达到了电泳纯。

酶学性质实施例4：耐高温木聚糖酶的酶学性质

1、该耐高温木聚糖酶相对分子量的确定

将发酵得到的粗酶液及纯化后的耐高温木聚糖酶分别进行SDS-PAGE，分析得到其相对分子量约为41.3KDa（图4）。

2、温度对酶活力的影响

⑴该木聚糖酶最适作用温度的测定：在不同温度（40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、80℃），pH7.0条件下测定该纯化后木聚糖酶的酶活力，以最高酶活力为100%，计算不同温度下的相对酶活力。

结果如图5所示，其最适作用温度为60℃。

⑵该木聚糖酶的温度稳定性测定：将该纯化后木聚糖酶酶液分别置于不同温度(30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃)、pH为7.0的条件下，保温180min，每隔30min取样测酶活，计算各自的残余酶活力，将最初酶液的酶活力定为100%。结果如图6，在40℃～60℃下保温180min，残余酶活在80.7%以上，在70℃和80℃下保温60min，残余酶活分别为77.1%和42.8%。

3、pH对酶活力的影响

⑴该木聚糖酶最适作用pH的测定：在不同pH（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0），温度为60℃的条件下测定该纯化后木聚糖酶的酶活力，以最高酶活力为100%，计算不同pH下的相对酶活力，其最适作用pH为7.0。

⑵该木聚糖酶的pH稳定性测定：将该纯化后木聚糖酶酶液分别调至不同pH(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)、温度60℃条件下，保温60min后，测定各自的残余酶活力，将其中最高酶活力定为100%。pH5.0～pH9.0范围内放置60min，残余酶活51%～72%。

Claims (4)

1.一种耐高温木聚糖酶的高产菌株，其特征在于：分类命名为：坎皮纳斯类芽孢杆菌（Paenibacillus campinasensis）G1-1，菌种保藏号：CGMCCNo.5023，保藏日期：2011年7月1日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

2.一种利用如权利要求1所述的耐高温木聚糖酶的高产菌株发酵产耐高温木聚糖酶的方法，其特征在于：按3%的接种量将该菌的液体种子接种于发酵产酶培养基中，37℃，180rpm摇瓶培养48h获得含耐高温木聚糖酶的发酵液；

所述发酵产酶培养基的成分为wt%：NaNO₃0.5,K₂HPO₄0.3、MgSO₄·7H₂O0.03、MnSO₄·H₂O0.002、FeSO₄·7H₂O0.002、CaCl₂·2H₂O0.002、桦木木聚糖0.5，pH7.0。

3.根据权利要求2所述方法得到的耐高温木聚糖酶的分离纯化方法，其特征在于：该耐高温木聚糖酶分离步骤如下：

⑴发酵液4℃下、8000rpm、离心10min，取上清液；

⑵向发酵上清液中缓慢加入硫酸铵，使硫酸铵饱和度达到70%，4℃盐析过夜；

⑶将盐析过夜的发酵上清液4℃下、8000rpm、离心10min，取沉淀，用pH7.0的PBS缓冲液溶解沉淀，得到耐高温木聚糖酶粗酶液，备用；

⑷OctylSepharoseFastFlow疏水相互作用层析：将粗酶液硫酸铵饱和度调到40%，进行疏水相互作用层析，柱型：平衡液：含40%饱和度硫酸铵的0.02mol/LPBS缓冲液pH7.0；流速：2mL/min，上样后用饱和度为40%～0%的硫酸铵线性洗脱，收集活性组分，待下一步分离用；

⑸SephadexG-75凝胶过滤层析：柱型：

平衡液：0.02mol/LPBS缓冲液pH8.0；流速：0.5mL/min，收集活性组分，待下一步分离用；

⑹Q-Sepherose强阳离子交换层析：柱型：

平衡液：0.02mol/LPBS缓冲液pH8.0；流速：2mL/min，上样后用含0～1.0MNaCl的平衡缓冲液进行线性洗脱，收集活性组分，备用；

⑺将上一步得到的耐高温木聚糖酶样品进行透析除盐，然后冷冻抽干，得到耐高温木聚糖酶干粉。

4.一种耐高温木聚糖酶，其特征在于：由权利要求2或3所述方法得到的耐高温木聚糖纯酶，所述耐高温木聚糖酶的相对分子量为41.3KDa。

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