CN102776267A - 直接分析通过胶带剥离获得的皮肤样品中的皮肤胆固醇 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及皮肤胆固醇的测定，将粘胶带放到皮肤的指定区域并使胶带粘贴到指定的皮肤区域，然后将胶带从选择的皮肤区域剥离下来，得到代表皮肤外角质层的样品，粘附在胶带上的样品含有暴露的皮肤组分。利用能与胆固醇特异性结合的检测试剂和能定量检测暴露皮肤组分中胆固醇含量的指示剂组分分析样品。

Description

直接分析通过胶带剥离获得的皮肤样品中的皮肤胆固醇
本申请是2005.04.28提交的CN200580013893.2，题为“直接分析通过胶带剥离获得的皮肤样品中的皮肤胆固醇”的分案申请。
发明领域
本发明涉及测定皮肤胆固醇的方法。更具体地说，本发明涉及直接测定通过胶带剥离获得的皮肤样品中皮肤胆固醇的方法，用于判断个体是否患有动脉硬化、以及是否具有发展成动脉硬化及与高胆固醇相关的和由高胆固醇引起的类似疾病的风险。
发明背景
许多研究表明，动脉硬化及其并发症，如心脏病发作和休克，在几乎所有的国家都是发病和死亡的主要原因。
要想有效地预防动脉硬化就需要确定一个人是否有患动脉硬化的风险，从而采取适当的治疗措施并改变其生活方式。确定哪些人属于高风险人群虽然是我们所期望的，但是，要找出确定一个人是否有患病风险的最佳方法却是有困难的。
一种确定一个人是否有患动脉硬化风险的被广泛使用的方法是测定静脉血浆中的总胆固醇水平(Consensus Conference on Lowering Blood Cholesterol to Prevent HeartDisease，JAMA，1985，253，pg.2080)。如果患者的胆固醇水平超过240mg/dL，那么这个患者就被认为是高风险人群，最近有人提议将此阈值降低到更低的水平。
然而，单纯凭一个总胆固醇指标无法精确地预测患者的患病风险。更好的预测方法是分析血浆脂蛋白；尤其是测定低密度脂蛋白和高密度脂蛋白(HDL)胆固醇水平(Total and High Density Lipoprotein Cholesterol in the Serum and Risk of Mortality，British Medical Journal，1985，290，pg.1239-1243)。
利用上述方法虽然有其优点，但是这种方法需要在禁食一段时间后采集血液样本。而且，采血令人不舒服，有感染的风险，分析血浆脂蛋白和胆固醇水平复杂而昂贵。另外，研究表明，血浆分析并不能完整反映胆固醇在动脉壁和其他组织内的累积过程。在许多情况下，血浆胆固醇水平甚至完整的脂质检测与动脉硬化的严重程度并不完全相关。
胆固醇水平的升高既发生在组织内，也发生在血浆中，研究表明组织胆固醇在动脉硬化的发展中起主导作用。现已证实，组织，其中包括皮肤，以与动脉壁相同的方式累积胆固醇，研究表明动脉壁和皮肤内的胆固醇含量呈密切相关关系。例如，从冷冻的皮肤样本中提取胆固醇，利用传统的化学和生物化学方法测定(Nikitin Y.P.，Gordienko I.A.，Dolgov A.V.，Filimonova T.A.″Cholesterol content in the skin andits correlation with lipid quotient in the serum in normals and in patients with ischemiccardiac disease″，Cardiology，1987，II，No.10，P.48-51)。这种方法虽然有用，但是很复杂，用于大规模的人群筛选时是很痛苦的。
美国专利No.4,458,686描述了一种在皮肤之下或其表面直接测定血液中各种组分的方法。该方法的根据是利用电化学方法，如通过极谱分析法，测定氧浓度的变化。如果使用的是不会透过皮肤扩散的非挥发性物质，就需要在皮肤下植入酶以影响皮肤表面氧的变化。该专利还公开了使用胆固醇氧化酶通过该方法定量测定胆固醇含量的用途。由于该方法需要复杂的设备和操作过程，因而需要高技能的人员来完成测定，从而限制了该方法用于筛选大量的人群。
皮肤胆固醇含量的测定可用于确定动脉硬化的严重程度，通过标准的实验室分析方法分析皮肤活检样品就可以完成。但是，在采集皮肤样品时是很痛苦的，并且采样点有感染的风险。另外，该方法还有一个缺点，那就是较厚的皮肤标本包括几层皮肤，有最外面的角质层、表皮和真皮。由于真皮层是高度血管化的，因此皮肤活检样品含有血管和血管成分。还可能含有汗腺和皮脂腺及其所包含的分泌物。另外，真皮下就是皮下脂肪，皮下脂肪也可能包含在标本内。因此，皮肤活检标本成分复杂，在分析皮肤的胆固醇含量时会得到不真实的数据。
美国专利No.5,489,510描述了一种视觉判断皮肤胆固醇含量的非侵入性方法，该方法使用了一种含有特异性胆固醇结合组分的试剂和一种含有指示剂组分的试剂，后者可根据是否存在与皮肤胆固醇结合的组分来显示可见的颜色变化。该方法克服了以前方法的许多缺点，满足了大样本筛选以鉴定个体是否具有动脉硬化风险的目标。该方法可在手掌皮肤上直接测定，虽然简单而快捷，但是需要所有接受检测的人都要到进行检测的医生办公室或诊所去检测。这也会限制进行大规模筛选。
现在已经有方法可以测定皮肤的溶剂直接提取物中角质层的脂质摩尔比例，其中包括胆固醇(Norlen L等，J.Invest.Dermatology 72-77，112，1999)。高效液相色谱(HPLC)和气液色谱与质谱连用可用于分离和分析脂质。这种分析方法很复杂，而且更重要的是，使用有腐蚀性且刺激的有机溶剂系统提取人皮肤对于常规的测定方法来说是不切实际的。
利用胶带剥离方法来确定皮肤角质层的脂质组成见A.Weerheim和M.Ponec(Arch.Dermatol.Res.，191-199，293，2001)的描述。在该研究中，在用胶带粘贴皮肤再剥离后用溶剂从角质层提取脂质，其中包括胆固醇。所得到的脂质提取物通过高效薄层色谱分离。该方法是很费力的。需要三种连续的溶剂系统来完成脂质的分离，需要用染色和焦化方法使组分显色，还需要通过密度测定来确定脂质的相对含量。该方法不是一种适于大样本的胆固醇简单快速测定方法。
发明概述
因而，本发明的一个目的是克服上述缺点，并提供一种简单的非侵入性皮肤胆固醇测定方法，可用于大规模的筛选。提供一种用于获得皮肤样品的胶带剥离装置也是本发明的一个目的。
根据本发明的第一方面，本发明提供了一种测定皮肤胆固醇的方法，该方法包括如下步骤：
a)提供一包括背衬件的胶带，其中至少有一面涂有医用胶粘剂；
b)将胶带放置到皮肤的指定区域并使其粘贴到该区域；
c)从皮肤的指定区域剥离下胶带，得到皮肤外角质层样品，粘附到胶带上的样品带有暴露的皮肤组分；
d)提供具有结构式A-C-B的亲和-酶催化(affinity-enzymatic)化合物来源，其中的A是对胆固醇有亲和力的检测试剂，B是酶催化可视化试剂(enzymatic visualizingagent)，C是将检测试剂与可视化试剂彼此连接的结合试剂；
e)将预定量的亲和-酶催化化合物加到样品的预定表面区域上，使化合物与样品接触一段时间，该段时间足以使检测试剂与暴露的皮肤组分内的胆固醇结合；以及
f)将预定量的显色剂加到样品的预定表面区域上，使其与酶催化可视化试剂反应生成有色产物，该产物的颜色能指示胆固醇水平。
上述方法中的检测试剂选自如下一组：甾类糖苷、三萜糖苷、疏水性蛋白质、多烯抗生素和抗胆固醇抗体。在本发明的一个方面，检测试剂是甾类糖苷，其中甾类糖苷是毛地黄皂苷。
另外，在上述方法中，酶催化可视化试剂是选自如下一组的酶：过氧化物酶、碱性磷酸酶、脲酶、半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶和乙酰胆碱酯酶。在本发明的一个方面，酶是过氧化物酶，其中过氧化物酶是辣根过氧化物酶。
在本发明的另一方面，在步骤(e)后用过氧化氢活化过氧化物酶形成活化的过氧化物酶，其中步骤(f)中所用的显色剂与活化的过氧化物反应生成有色产物。
在本发明的另一方面，步骤(f)中预定量的含过氧化氢酶和显色剂的水溶液被加到样品的预定表面区域上。
显色剂选自如下一组：2，2′-连氮基-二-(3-乙基苯并噻唑啉(benzthiazoline)-6-磺酸)和3，3′，5，5′-四甲基联苯胺。在本发明的一个特定方面，显色剂是3，3′5，5′-四甲基联苯胺。
结合试剂是马来酸酐和N-乙烯吡咯烷酮的共聚物。
另外，胶带的背衬件是由聚酯形成的。医用胶粘剂是压敏的胶粘剂。在本发明的一个方面，医用胶粘剂是丙烯酸基胶粘剂。在本发明的另一方面，医用胶粘剂是合成橡胶弹性体胶粘剂。在本发明的另一方面，医用胶粘剂是硅氧烷基胶粘剂。在本发明的另一方面，医用胶粘剂包含由苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯或苯乙烯-丁二烯-苯乙烯嵌段聚合物形成的弹性体。
按照本发明的第二方面，本发明提供了测定皮肤胆固醇的方法，该方法包括如下步骤：
a)提供一包括背衬件的胶带，其至少有一面涂有医用胶粘剂；
b)将胶带放置到皮肤的指定区域并使其粘贴到该区域；
c)从皮肤的指定区域剥离下胶带，得到皮肤外角质层样品，粘附到胶带上的样品带有暴露的皮肤组分；
d)提供具有结构式A-C-B’的亲和信号产生化合物来源，其中的A是对胆固醇有亲和力的检测试剂，B’是信号产生指示剂，C是将检测试剂与指示剂彼此连接的结合试剂；
e)将预定量的亲和信号产生化合物加到样品的预定表面区域上，使化合物与样品接触一段时间，该段时间足以使检测试剂与暴露的皮肤组分中存在的胆固醇结合；以及
f)测定指示剂产生的信号以提供指示胆固醇含量的值。
上述方法中的检测试剂选自如下一组：甾类糖苷、三萜糖苷、疏水性蛋白质、多烯抗生素和抗胆固醇抗体。在本发明的一个方面，检测试剂是甾类糖苷，其中甾类糖苷是毛地黄皂苷。
上述方法中的指示剂选自如下一组：染料、荧光团、放射性同位素、金属溶胶化合物和化学发光化合物。在本发明的一个方面，指示剂是染料。在本发明的另一个方面，指示剂是荧光团。在本发明的另一个方面，指示剂是放射性同位素。在本发明的另一个方面，指示剂是金属溶胶化合物。在本发明的另一个方面，指示剂是化学发光化合物。
另外，在本发明的一个方面，步骤(f)通过分光光度法完成。在本发明的另一个方面，步骤(f)通过比色法完成。在本发明的另一个方面，步骤(f)通过荧光测定法完成。在本发明的另一个方面，步骤(f)借助放射活性传感器来进行。在本发明的另一个方面，步骤(f)通过辉度测定法完成。
在上述方法中，结合试剂是马来酸酐和N-乙烯吡咯烷酮的共聚物。
另外，胶带的背衬件是由聚酯形成的。医用胶粘剂是压敏的胶粘剂。在本发明的一个方面，医用胶粘剂是丙烯酸基胶粘剂。在本发明的另一方面，医用胶粘剂是合成橡胶弹性体胶粘剂。在本发明的另一方面，医用胶粘剂是硅氧烷基胶粘剂。在本发明的另一方面，医用胶粘剂包含由苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯或苯乙烯-丁二烯-苯乙烯嵌段聚合物形成的弹性体。
按照本发明的第三方面，本发明提供了测定皮肤胆固醇的方法，该方法包括如下步骤：
a)提供一包括背衬件的胶带，其至少有一面涂有医用胶粘剂；
b)将胶带放置到皮肤的指定区域并使其粘贴到该区域；
c)从皮肤的指定区域剥离下胶带，得到皮肤外角质层样品，粘附到胶带上的样品带有暴露的皮肤组分；
d)提供对胆固醇有亲和力的胆固醇氧化酶来源作为检测试剂；
e)将预定量的胆固醇氧化酶加到样品的预定表面区域上，使胆固醇氧化酶与样品接触一段时间，该段时间足以导致胆固醇被氧化并产生过氧化氢；以及
f)测定步骤(e)中所产生的过氧化氢，所测定的过氧化氢的量可指示胆固醇水平。
在本发明的一个方面，步骤(f)通过电化学传感器的方式完成。在本发明的另一个方面，步骤(f)通过带电极的电流计完成。在本发明的另一个方面，步骤(f)在加入过氧化物酶和比色指示剂后通过分光光度法完成。在一个方面，过氧化物酶是辣根过氧化物酶。在另一方面，比色指示剂是2，2′-连氮基-二-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)。在另一方面，指示剂是3，3′，5，5′-四甲基联苯胺。在另一方面，指示剂是Trinder或Ngo-Lenhoff型的多组分氧化偶联剂。
另外，胶带的背衬件是由聚酯形成的。医用胶粘剂是压敏的胶粘剂。在本发明的一个方面，医用胶粘剂是丙烯酸基胶粘剂。在本发明的另一方面，医用胶粘剂是合成橡胶弹性体胶粘剂。在本发明的另一方面，医用胶粘剂是硅氧烷基胶粘剂。在本发明的另一方面，医用胶粘剂包含由苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯或苯乙烯-丁二烯-苯乙烯嵌段聚合物形成的弹性体。
在本发明的第四方面，本发明还提供了用于实现第一方面所描述的方法的试剂盒，该试剂盒包含：
-上述胶带；
-上述具有结构式A-C-B的亲和-酶催化化合物来源，其中的A、B和C如上所定义；以及
-上述显色试剂来源。
上述试剂盒中的检测试剂选自如下一组：甾类糖苷、三萜糖苷、疏水性蛋白质、多烯抗生素和抗胆固醇抗体。在本发明的一个方面，检测试剂是甾类糖苷，其中甾类糖苷是毛地黄皂苷。
另外，在上述试剂盒中，酶催化可视化试剂是选自如下一组的酶：过氧化物酶、碱性磷酸酶、脲酶、半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶和乙酰胆碱酯酶。在本发明的一个方面，酶是过氧化物酶，其中过氧化物酶是辣根过氧化物酶。
另外，上述试剂盒还包括含过氧化氢的水溶液，显色试剂存在于所述溶液中。显色剂选自如下一组：2，2′-连氮基-二-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)和3，3′，5，5′-四甲基联苯胺。在本发明的一个方面，显色剂是3，3′5，5′-四甲基联苯胺。
另外，在上述试剂盒中，结合试剂是马来酸酐和N-乙烯吡咯烷酮的共聚物。
另外，胶带的背衬件是由聚酯形成的。医用胶粘剂是压敏的胶粘剂。在本发明的一个方面，医用胶粘剂是丙烯酸基胶粘剂。在本发明的另一方面，医用胶粘剂是合成橡胶弹性体胶粘剂。在本发明的另一方面，医用胶粘剂是硅氧烷基胶粘剂。在本发明的另一方面，医用胶粘剂包含由苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯或苯乙烯-丁二烯-苯乙烯嵌段聚合物形成的弹性体。
在本发明的第五方面，本发明还提供了用于实现第二方面所描述的方法的试剂盒，该试剂盒包含：
-上述胶带；以及
-上述具有结构式A-C-B’的亲和信号产生化合物来源，其中的A、B’和C如上所定义。
上述试剂盒中的检测试剂选自如下一组：甾类糖苷、三萜糖苷、疏水性蛋白质、多烯抗生素和抗胆固醇抗体。在本发明的一个方面，检测试剂是甾类糖苷，其中甾类糖苷是毛地黄皂苷。
上述试剂盒中的指示剂选自如下一组：染料、荧光团、放射性同位素、金属溶胶化合物和化学发光化合物。在本发明的一个方面，指示剂是染料。在本发明的另一个方面，指示剂是荧光团。在本发明的另一个方面，指示剂是放射性同位素。在本发明的另一个方面，指示剂是金属溶胶化合物。在本发明的另一个方面，指示剂是化学发光化合物。
在上述试剂盒中，结合试剂是马来酸酐和N-乙烯吡咯烷酮的共聚物。
另外，胶带的背衬件是由聚酯形成的。医用胶粘剂是压敏的胶粘剂。在本发明的一个方面，医用胶粘剂是丙烯酸基胶粘剂。在本发明的另一方面，医用胶粘剂是合成橡胶弹性体胶粘剂。在本发明的另一方面，医用胶粘剂是硅氧烷基胶粘剂。在本发明的另一方面，医用胶粘剂包含由苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯或苯乙烯-丁二烯-苯乙烯嵌段聚合物形成的弹性体。
在本发明的第六方面，本发明还提供了用于实现第三方面所描述的方法的试剂盒，该试剂盒包含：
-上述胶带；以及
-上述胆固醇氧化酶来源。
在上述试剂盒中，过氧化物酶是辣根过氧化物酶。在本发明的一个方面，比色指示剂是2，2’-连氮基-二-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)。在本发明的另一方面，指示剂是3，3′，5，5′-四甲基联苯胺。
另外，胶带的背衬件是由聚酯形成的。医用胶粘剂是压敏的胶粘剂。在本发明的一个方面，医用胶粘剂是丙烯酸基胶粘剂。在本发明的另一方面，医用胶粘剂是合成橡胶弹性体胶粘剂。在本发明的另一方面，医用胶粘剂是硅氧烷基胶粘剂。在本发明的另一方面，医用胶粘剂包含由苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯或苯乙烯-丁二烯-苯乙烯嵌段聚合物形成的弹性体。
另外，在上述所有试剂盒中，胶带由一个可闭合的装置携带，可闭合的装置包括一个携带胶带的采样件和一个能与采样件啮合并使胶带保持在装置内的闭合件。优选的是，当闭合件与采样件啮合时胶带被密封在装置内。在一个方面，至少闭合件带有边框，采样件带有容纳边框的边槽，或者采样件带有边框，而闭合件带有容纳边框的边槽，这样就可以将胶带密封在装置内。闭合件通过绞链连接采样件。
在本发明的一个方面，至少一部分采样件能从可闭合装置上切下形成检测片(dipstick)，检测片的第一端上没有胶带，而第二端上有胶带。
在本发明的第二方面，至少一部分采样件能从可闭合装置上切下形成圆片，圆片的一面上有胶带。
另外，上述试剂盒还包含用于将圆片从装置上切下来的切割工具。为了显示切割工具在何处切割，可在可闭合装置的一个外表面上贴上标记。
另外，切割工具可包含活塞，以便于在切下圆片后将其从切割工具的一端顶出。
本发明还提供了用于获得皮肤样品的胶带剥离装置，该装置包括：
a)具有一表面的采样件；
b)位于至少部分采样件表面上的胶带，胶带上涂有与采样件表面不接触的医用胶粘剂；以及
c)能够啮合采样件从而将胶带密封在装置内的闭合件。
优选的是，当闭合件与采样件啮合时胶带被密封在装置内。在一个方面，至少闭合件带有边框，采样件带有容纳边框的边槽，或者采样件带有边框，而闭合件带有容纳边框的边槽，这样就可以将胶带密封在装置内。闭合件和采样件通过绞链连接采样件。
在本发明的一个方面，至少一部分采样件能从可闭合装置上切下形成检测片，检测片的第一端上没有胶带，而第二端上有胶带。
在本发明的第二方面，至少一部分采样件能从可闭合装置上切下形成圆片，圆片的一面上有胶带。
申请人惊奇地发现，直接用粘附到上述胶带上的皮肤样品就可以测定皮肤的胆固醇含量。从剥离自供者的胶带上取下的皮肤样品可送到远处或者集中起来分析，这种方法也使同时分析大量人群成为可能。因此，本发明的方法适于大规模筛选人群以评价其是否有发生心血管疾病的风险。
附图简述
为了更好地了解本发明，并且更清楚地说明本发明是如何实现的，以实施例的方式给出参考实施方式，并且用附图说明本发明的优选实施方式，其中：
图1是实施例2所使用的采样装置的俯视图；
图2是图1所述采样装置的局部图，显示的是其采样件的细节；
图3是从本发明的采样装置上切下的检测片的透视图；
图4是以另一种方式从本发明的采样装置上切下的圆片的透视图；
图5是位于微孔板的孔内的图4所示圆片的横断层面图；
图6是用切割工具从采样装置上切下图4所示圆片的透视图；
图7是用切割工具从采样装置上切下图4所示圆片的横断层面图；以及
图8是显示切割工具将圆片置于微孔板的孔内的横断层面图。
发明详述
使用含有由聚酯形成的背衬件的胶带。胶带的至少一个面上涂有医用胶粘剂。本文所用的术语“医用胶粘剂”是指用于皮肤时过敏性较低且安全的胶粘剂。这种胶粘剂优选压敏胶粘剂，例如，包含由苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯或苯乙烯-丁二烯-苯乙烯嵌段聚合物形成的弹性体的胶粘剂。
正如大家所清楚的，现在有多种类和类型的胶粘剂。总之，适用于本发明的胶粘剂是上面所定义的、在用于皮肤采样时一般不会发生过敏反应的医用胶粘剂。发明人试验了几种类型的胶粘剂来采集皮肤样品；其中的大多数是丙烯酸基压敏胶粘剂，但是也试验了几种合成橡胶类型的弹性体胶粘剂和基于硅氧烷的胶粘剂。
发明人发现，由苯乙烯和丁二酸或苯乙烯和异戊二烯嵌段聚合物制成的合成橡胶胶粘剂可用于很好地实现本发明。合成橡胶胶粘剂的一个例子是基于苯乙烯和丁二酸嵌段聚合物的合成KratonTM型胶粘剂(不含胶乳)。这种胶粘剂具有良好的皮肤样品稳定性，有利于样品的运输以便于随后的分析。
可用于本发明方法中的另一类优选粘胶带是双涂层的压敏医用级胶带。这种医用级胶带的例子有3M(产品编号为#9877)和Adhesive Research，Inc.(产品编号为#8570)所出售的胶带。
发明人所试验的其他类型的一些胶带显示在附表中。一个不变的要求是使用过敏性较低的医用级胶带。
表1
Figure BSA00000677042600091
Figure BSA00000677042600101
应当理解的是，表1所列的粘胶带并不是穷尽性的，仅仅描述了现有的适用于本发明的几种不同粘胶带，以及本发明所属领域技术人员所熟知的其他粘胶带。
双涂层的压敏胶带通常都带有易于去掉的保护衬里。衬里可保护胶带在衬里被去掉前不会粘贴，并且可防止胶粘剂受到污染。衬里可放置在双涂层胶带的任何一面，或者胶带只有一个衬里，衬里自身对折，这样就可以保护两个表面。
可以使用具有不同撕离特性的衬里，这样在第一面胶粘剂暴露时第二面胶粘剂还可以得到保护。具有不同衬里的双涂层胶带特别适用于皮肤采样。去掉第一衬里后将胶带粘贴到采样装置的背衬上，同时胶带的皮肤采样面还被第二衬里覆盖。这个第二衬里可保护皮肤采样的胶粘剂区域在其被使用前不会粘贴和被污染。当需要进行皮肤采样时将第二衬里去掉。
胶带可以用到任何部位的皮肤上，但是最合适的部位是手掌的皮肤，因为手掌没有皮脂腺，后者的分泌物含有胆固醇，可影响检测的结果。另外，手掌的皮肤易于采样。
能够获得均一量的皮肤样品用于分析是我们所期望的。使用粘胶带采样一般只在皮肤上粘贴一次胶带。在皮肤上多次粘贴胶带可以得到更多的角质层材料。在皮肤上多粘贴一次胶带就能使胶带多粘附一些皮肤样品。不断重复这个过程直到胶带上沾满皮肤样品，然后胶带就变成没有粘性的了。使胶带沾满皮肤样品所需要的粘贴次数因所使用的胶粘剂类型不同而不同，但是对于最常用的粘胶带来说，胶带沾满皮肤样品所需的粘贴次数都少于10次，其中包括而不限于3到7次。在每次将胶带从皮肤上剥离下来并从新粘贴时最好将胶带粘贴到新的皮肤区域，这样可以使胶带更好更快地沾满皮肤样品。因此，为了达到均一而良好的采样目的，最好用胶带粘贴皮肤10次，每次都粘贴到新的区域。
粘胶带上的皮肤样品内所存在的胆固醇的量与所得到的皮肤样品的大小有关。另外，需要得到大小均匀的皮肤样品，这样就可以比较不同个体之间皮肤胆固醇的相对水平。
通过下列步骤可以从不同个体上(或者从同一个体上重复采样)得到大小均匀的皮肤样品。首先，如上所述，通过将粘胶带重复粘贴到皮肤上获得皮肤样品，这样胶带就会沾满皮肤样品并且变得没有粘性。胶带在皮肤上粘贴约3到7次后就会沾满皮肤样品，一般来说要重复粘贴10次以确保胶带沾满皮肤样品。其次，为了获得用于检测的恒定面积的皮肤样品，从皮肤采样装置上切下一个固定大小的面积(如下文实施例2和3所描述的)，将其浸到标准体积的检测试剂和指示剂中，如下文所描述的。
皮肤采样后，闭合采样装置并送到中心实验室进行胆固醇分析。
如果使用具有结构式A-C-B或A-C-B’的化合物分析皮肤样品中的胆固醇，检测试剂A可以是甾类糖苷、三萜糖苷、疏水性蛋白质、多烯抗生素和抗胆固醇抗体。优选的是甾类糖苷，如毛地黄皂苷。另外，结合试剂C优选马来酸酐和N-乙烯基吡咯烷酮的共聚物。
在使用具有结构式A-C-B的化合物的情况下，优选的酶催化可视化试剂B来自由如下酶组成的一组酶：过氧化物酶、碱性磷酸酶、脲酶、半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶和乙酰胆碱酯酶。过氧化物酶如辣根过氧化物酶是优选的。在这种特殊的例子中，步骤(e)后过氧化物酶用过氧化氢活化使其变成活化的过氧化物酶，步骤(f)中所用的显色剂与活化的过氧化物反应生成上述的有色产物。为达到此目的，在步骤(f)中将预定量的含过氧化氢和显色剂的水溶液加到预定面积的样品上。可用于步骤(f)中的适宜显色剂的例子包括2，2’-连氮基-二-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)和3，3′，5，5′-四甲基联苯胺。3，3′，5，5′-四甲基联苯胺是优选的。
在使用具有结构式A-C-B’的化合物的情况下，指示剂B’可以是染料、荧光团、放射性同位素、金属溶胶化合物或化学发光化合物。当指示剂是染料时，步骤(f)通过分光光度法完成，如比色法。当指示剂是荧光团时，步骤(f)通过荧光测定法完成。当指示剂是放射性同位素时，步骤(f)借助放射活性传感器来进行。当指示剂是金属溶胶化合物时，步骤(f)通过比色法完成。当指示剂是化学发光化合物时，步骤(f)通过辉度测定法完成。
在使用胆固醇氧化酶作为与胆固醇有亲和性的检测试剂的情况下，步骤(f)优选通过电化学传感器的方式完成，如带电极的电流计。步骤(f)还可以在加入过氧化物酶和比色指示剂后通过分光光度法来完成。所用的过氧化物酶优选辣根过氧化物酶。可用的适宜比色指示剂的例子包括2，2’-连氮基-二-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)和3，3′，5，5′-四甲基联苯胺。由多组分的Trinder或Ngo-Lenhoff型氧化偶联剂组成的比色指示剂也可以使用。在使用过氧化物酶和比色指示剂时，上述用于实现本发明第三方面所述方法的试剂盒还包括过氧化物酶和比色指示剂。
利用本发明的方法可实现简单且高通量的皮肤胆固醇分析。
实施例1
本发明使用了Adhesive Research，Inc.出售的双涂层压敏医用胶带，该胶带的上采样面覆盖有保护性剥离衬里。切下一片1平方英寸的胶带，利用胶带暴露在外的下粘附面将这片胶带粘贴到1英寸×3英寸的塑料(白色聚苯乙烯塑料)件的一端，留下1英寸×2英寸的未覆盖塑料作为将胶带粘贴到皮肤和标记样品的手柄。
为获得皮肤样品，去掉保护性衬里，将暴露出的胶粘剂区粘贴到清洁干燥的皮肤上。对粘附区上方的塑料件的背面施压以使胶粘剂与皮肤充分接触。然后从皮肤上撕下带粘胶带和角质层样品的塑料件。
将样品切成大小相同的4片，以微英寸×微英寸的方式测量每片的面积。将其中一片放置到12孔组织培养板的一个孔内，或者类似的容器内，使皮肤采样面朝上。然后将一份A-C-B型试剂加到预定面积的皮肤样品上。所用的A-C-B试剂是毛地黄皂苷(A)通过马来酸酐-N-乙烯基吡咯烷酮共聚物(C)连接到辣根过氧化物酶(B)上的连接物(conjugate)。在室温下使试剂与皮肤样品接触15分钟，然后通过抽吸将试剂去掉。再用三份洗涤溶液洗涤样品以去除非特异结合的试剂。然后将片放置到12孔培养板的一个新的干净孔或类似的容器中，皮肤采样面朝上。将一份底物溶液加到样品上，在室温下使其与皮肤样品接触约15分钟。所用的底物溶液是购自NeogenCorp.(Lexington，KY1USA)的Enhanced K-Blue试剂，含有过氧化氢和作为显色剂的四甲基联苯胺。从孔中吸出一份已发生反应的底物溶液，加到含有一份1N硫酸的96孔微孔板的孔内。在微孔板阅读分光光度计上测定所得溶液在约450nm处的光密度值，该值代表了皮肤样品中的胆固醇含量。
实施例2
采用图1所示的采样装置。采样装置一般用参考数字10表示，它是由塑料(聚苯乙烯)制成的，包括通过整合绞链16连接到闭合件14的采样件12。闭合件14带有边框18和四个钉20，分别锁定到采样件12的边槽22和四个孔24内。折叠绞链16使边框18和边槽22啮合、钉20与孔24啮合，从而保证装置10的两个部分闭合密封，防止内表面染上灰尘而被污染。闭合件14的外表面(图1和图2中未显示)有平坦区用于粘贴标记和条形码，以便于样品识别。采样件12和闭合件14分别带有用于打开装置10手柄26和28。
双涂层压敏医用胶带30带有牛皮纸制成的保护性剥离衬里32，是3M的产品，产品编号为#9877，胶带30被粘贴到采样件12的中央区域。剥离衬里32比粘胶带30宽，这样在衬里32的一边就形成一个不与胶带粘贴的条带32’，衬里的这个条带32’悬垂在装置的边上形成易于将衬里剥离的手柄。在使用前，捏住悬垂的手柄32’将衬里32撕下，暴露出胶带30上的胶粘剂，进行皮肤采样。
清洗供采样的手掌皮肤并使其干燥。将有暴露粘附面的胶带30粘贴到手掌上。在采样件12的背面粘贴区域施加压力将胶带30按压到皮肤上，使其与角质层粘贴在一起。然后将装置10撕下，再粘贴到手掌的另一个区域，再次按压到皮肤上。以这种方式重复撕下装置然后粘贴到皮肤上，总共进行10次。
在完成皮肤粘贴过程以后从装置10上切下至少2个约4mm宽的小检测片40(见图3)。如图2所示，沿边槽22将采样件12连接在手柄26上的一端切下。沿采样件12上模压的指导线36(如图2所示)切割三次得到4mm的检测片，切割从边上开始直到刚刚越过中心线。沿着件12上模压的指导线38跨过件12的中央进行第三次切割就可以从采样件12上切下2个4mm宽的条。检测片40包括无胶带的第一端42和带有胶带的第二端44，后者有皮肤样品粘附其上。
将检测片放置到96孔微孔板的孔中(未显示)，每孔约含100μL A-C-B试剂的溶液。该试剂是毛地黄皂苷(A)通过马来酸酐-N-乙烯基吡咯烷酮共聚物(C)连接到辣根过氧化物酶(B)上的连接物，浓度约为1μg/mL。在室温下使检测片在溶液中浸泡约15分钟，然后将其取出放置到微孔板的新孔中，每孔约含200μL洗涤溶液。振荡微孔板以提高洗涤效果，约1分钟后将检测片取出放置到微孔板的新孔中，每孔约含200μL新鲜洗涤溶液，再振荡约1分钟。振荡洗涤3次，然后将检测片取出放置到约100μL底物溶液(Enhanced K-Blue试剂)中。室温下在暗处使检测片与底物溶液孵育约15分钟。在此期间不断摇动微孔板。
检测片孵育好以后取出。在孔中加入约100μL 1N的硫酸与底物溶液混合终止反应，在微孔板阅读分光光度计上测定所得溶液在约450nm处的光密度值，该值代表了皮肤样品中的胆固醇含量。
实施例3
为了使实施例2中的许多样品可以被一起处理，需要将检测片40切成与标准96孔(8×12)微孔板的孔相匹配的统一形状。现有的设备可用于将试剂加入到微孔板的孔中，并且可以洗涤这些孔，有一个要求是要避免各步骤之间有试剂残留。利用现有的分光光度计在试验的最后一步可以直接阅读孔内的有色溶液。但是，在这个过程中，检测片在孔外的突出部分以及固定它们的固定物都会妨碍仪器向孔中加样以及洗涤孔。这就导致做检测片测定需要另外定制设备，和/或比常规微孔板分析需要更多的人工操作步骤。
批量处理大量样品可通过如下步骤完成：从采样装置的一个面52上切下小圆片50(见，图4)，圆片50在其一个面52上带有粘附到采样装置粘胶带30上的皮肤样品70(为了描述地比较清楚，皮肤样品70和粘胶带30在图中通常指示为粘胶带30，但是，应当理解的是，采样装置粘贴到人手掌上以后，粘胶带30上就会带有皮肤样品70)，然后在微孔板56的孔54内处理这些圆片，如图5所示。以这种方式处理在孔外就没有突出部分，因而便于使用自动化的液体分散和洗涤设备来添加胆固醇分析试验所需的试剂。圆片的尺寸要与微孔板的孔相匹配，但是还不能嵌到或陷到孔内。例如，但是并不局限于，直径小于6.0mm的圆片适于放置到常见的微孔板的孔内。但应当理解的是，太小的圆片所带的皮肤量太少，达不到试验所要求的灵敏度和重复性。现已证实，直径5-6mm的圆片最适合在96孔微孔板上分析。但应当理解的是，本发明并不局限于这些尺寸，对不同的孔和微孔板来说还可以考虑其他尺寸的圆片，这是本领域技术人员所熟知的。
另外，当圆片放到孔内时不应该是皮肤面朝上漂浮，因为在洗涤步骤中这会使皮肤面接触到插入到孔内的加样管和吸液管。因此，如果采样装置是由比水密度低的材料制成的，圆片应当以皮肤面朝下放入孔内。如果采样装置是由比水密度高的材料制成的，那么圆片应当以皮肤面朝上放入孔内，同时调节加样管和吸液管的高度使其不会接触到皮肤面。
用定制的切割工具或3/16英寸(4.76mm)的单孔纸张打孔器可从采样装置上切下圆片。圆片必须从采样装置上切下来，因此用于将圆片从打孔器或切割工具上取下来的任何铁砧型部分就不会接触皮肤。因此，用纸张打孔器切割和推出圆片时，铁砧应当接触采样装置的背面(非皮肤面)。
参照图6和图7，当装置10处于如图所示的折叠状态(闭合)时，用切割工具60从图1的装置10上切下圆片。将闭合的装置放置到坚硬的表面上(图中未显示)，采样件12的外表面62朝上。将切割工具60插到圆形凹陷64上，64位于装置10的采样件12的外表面62上，然后压下切割工具60，切过塑料层和胶带30/皮肤样品70。但是不要将切割工具60压得太厉害，以免切过装置10闭合件14的塑料层。
一旦从采样装置10上切下所需的圆片50，就将带圆片50的切割工具60的末端66放到微孔板56的指定孔54上(见图8)，推出切割工具60的活塞68将圆片放入孔54内，圆片包含带有皮肤样品的粘胶带。
当微孔板的所有指定孔都放入了圆片后，将微孔板放在自动化的微孔板阅读/洗涤仪上，每孔加约100μL检测试剂，在室温(20-24℃)下孵育圆片约15分钟。试剂是实施例2所定义的A-C-B试剂溶液。
然后吸出检测试剂，在孔中加入约250μL洗涤缓冲液。加入洗涤缓冲液后振荡微孔板约30秒，以去掉过量的检测试剂，然后放置约90秒。如有必要，洗涤步骤可重复2次或多数。试验发现洗涤3次就可以达到满意的效果。
洗涤孔以后，加入约100μL Enhanced K-Blue底物，在室温(如上所定义)下孵育洗涤过的圆片约15分钟。在此步骤中可振荡微孔板，如实施例2所述，在暗处孵育。
在孔内加入约100μL 1N的硫酸终止反应，振荡微孔板使溶液混合。然后吸出约100μL终止反应的底物转移到新微孔板的孔内，按照上述方法将微孔板放到微孔板阅读分光光度计上在约450nm处阅读和分析以确定每个供者皮肤胆固醇的相对水平。
在上面的实施例中，应当理解的是，本发明并不有意限定于实施例中特定的精确数值，只要不影响本发明的范围，本领域的技术人员可以调整体积、时间、温度、波长等数值，因此，本文使用术语“约”。
下面的描述只是为了说明，并不意味着限定。通过阅读本说明书，本领域的技术人员就可以理解本发明的其他实施方式。
虽然本文所描述的本发明的实施方式在目前被认为是优选的，但是，只要不偏离本发明的范围，可以作出各种改变和修改。公开的内容是为了说明的目的，但并不是穷尽性的。本说明书鼓励本领域的技术人员对本发明作出各种修改和替代。所有这些替代和修改都包含在本发明权利要求的范围之内。熟悉本领域的技术人员将会认识到与本文所描述的实施方式等价的其他实施方式也包含在权利要求的范围之内。

Claims (10)

1.一种测定皮肤胆固醇的方法，该方法包括：
a)提供一包括背衬件的胶带，胶带至少有一面涂有医用胶粘剂；
b)将胶带放置到皮肤的指定区域并使其粘贴到该区域；
c)从皮肤的指定区域剥离下胶带，得到皮肤外角质层样品，粘附到胶带上的样品带有暴露的皮肤组分；
d)提供具有结构式A-C-B的亲和-酶催化化合物来源，其中的A是对胆固醇有亲和力的检测试剂，B是酶催化可视化试剂，C是将所述检测试剂与所述可视化试剂彼此连接的结合试剂；
e)将预定量的所述亲和-酶催化化合物加到所述样品的预定表面区域上，使所述化合物与样品接触一段时间，该段时间足以使所述检测试剂与所述暴露的皮肤组分中存在的胆固醇结合；以及
f)将预定量的显色剂加到所述样品的预定表面区域上，使所述显色剂与所述酶催化可视化试剂反应生成有色产物，该产物的颜色能指示胆固醇水平。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测试剂选自如下一组：甾类糖苷、三萜糖苷、疏水性蛋白质、多烯抗生素和抗胆固醇抗体。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述检测试剂是甾类糖苷。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述甾类糖苷是毛地黄皂苷。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶催化可视化试剂是选自如下一组的酶：过氧化物酶、碱性磷酸酶、脲酶、半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶和乙酰胆碱酯酶。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述酶是过氧化物酶。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述过氧化物酶是辣根过氧化物酶。
8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，在步骤(e)后用过氧化氢活化所述过氧化物酶形成活化的过氧化物酶，其中步骤(f)中所用的显色剂与所述活化的过氧化物酶反应生成所述有色产物。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，在步骤(f)中预定量的含过氧化氢酶和所述显色剂的水溶液被加到所述样品的所述预定表面区域上。
10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述显色剂选自如下一组：2，2’-连氮基-二-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)和3，3′，5，5′-四甲基联苯胺。
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