CN1048925A - 制取以检测剂(胆固醇的亲合物)和目视显示剂为基础用于在患者皮肤表面目视显示胆固醇的亲合酶化合物的方法及该化合物的应用 - Google Patents

制取以检测剂(胆固醇的亲合物)和目视显示剂为基础用于在患者皮肤表面目视显示胆固醇的亲合酶化合物的方法及该化合物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及制取亲合物酶化合物的方法，该化合 物以检测剂A(胆固醇的亲合物)和目视显示剂B为 基础，用于在患者皮肤表面上目视显示胆固醇。使用 亲合胆固醇的甾类糖苷、三萜烯糖苷、疏水蛋白质、蛋 白质毒素或多烯抗菌素作为检测剂A，而使用酶作 为目视显示剂B。为了提高所制取的化合物的敏感 性，将检测剂A和目视显示剂B固定在交联剂C 上，使用低分子或高分子化合物作为交联剂C。

Description

本发明涉及生物有机化学领域，即涉及制取亲合酶化合物的方法，该化合物以检测剂（它是胆固醇的亲合物）和目视显示剂为基础，用于在患者皮肤表面目视显示胆固醇。
所制取的这种化合物可以最有效地用于诊断，其中包括对动脉粥样硬化的早期诊断，在临床和诊疗所条件下的确诊，并可用于控制疗法。上述化合物还可用于生理学、组织学和组织化学的研究，以查明胆固醇含量的升高及其定位。此外，所提供的化合物还能够查明具有一定病状，尤其是肿瘤病状的患者所特有的低胆固醇含量。
动脉粥样硬化及其并发症-心肌梗塞、中风和坏疽是世界各国人口死亡的主要原因之一。
多年的研究表明，动脉粥样硬化属于首先应当被查明并预防的疾病，而造成动脉粥样硬化危险的主要因素则是机体中的胆固醇积聚。在群体中对动脉粥样硬化的预防要求首先在一批最危险的患者中查明危险性，随后对他们区别治疗并改变生活方式。按照机体中积聚的胆固醇量，在患者中选择危险性高的一组人，这在预防动脉粥样硬化的课题中是最困难的。诊断动脉粥样硬化的公知方法是基于定量确定静脉血血浆中的总胆固醇含量（Consensus  Conference  on  Lowering  Blood  Cholesterol  to  Prevent  HeartDesease，JAMA，1985，253，P.2080-2086;The  Lipid  Research  Clinics  Population  Studies  Data  Book;Publication  80-152，Bethesda，Ma，National  Institutes  of  Health，1980，Vol.1;Lipid  Research  Clinics  Programm，JAMA，1984，251，P.351-364）。在某些情况下，对将患者列入危险组而言，胆固醇含量大于260毫克%被认为是足够了。可以通过分析血浆血脂蛋白和测定动脉粥样性指标提供更详细的诊断，该指标是总胆固醇与高密度脂蛋白胆固醇之差同高密度脂蛋白胆固醇之比：
IaTep.= (Xc obⅡ.-XC JIBⅡ.)/(Xc JIBⅡ.)
在动脉粥样性指标大于3时，患者属于危险组，而当动脉粥样性指标大于5.6时，则属于动脉粥样硬化患者（Климов  A.H.“ФенотипироВание  липопротеинов”，Методические  рекомендации  МЗ  СССР，M。，медицина，1975，Goldfourt  V.，Holtzman  E.，Neufeld  H.N.Total  and  High  Density  Lipoprotein  Cholesterol  in  the  Serum  and  Risk  of  Morality  British  Medical  Jounal，1985，290，P.1239-1243）。
使用这些方法与取血相联系，结果会造成患者外伤，而且除了不安全之外，同时还要考虑传递病毒感染的可能性。分离血浆脂蛋白和分析胆固醇仍然是复杂而昂贵的方法。此外，在三种测定总胆固醇中的一种情况下，甚至完全表现不出与动脉粥样硬化严重程度的关系（CM.Мясников  A.Л.“Гипертоницеская  Болезнь”，1965，M.Медицина，с.300）。
另外，最近几年的研究指出，血浆血不能充分反映动脉壁和其他营养作用徐缓组织所特有的胆固醇积聚过程。
随着动脉粥样硬化病因的某些原理性问题的解决，使进一步改进诊断方法成为可能。已证明，在动脉粥样硬化病的发展过程中，起主要作用的是组织中的胆固醇。已经成功地查明了这种组织，它类似于动脉壁也积聚胆固醇。
最近几年的研究指出，在动脉壁和皮肤中的胆固醇含量之间有密切的相互关系。这使有可能原理上建立新的诊断方法，特别是诊断动脉粥样硬化的方法。
上面所指出的在动脉壁和皮肤中的胆固醇含量之间的相互关系，可用直接测定皮肤的活组织（Биоптат）中胆固醇的方法而确定。将皮肤样品在液态氮中冻结，然后冷冻干燥，用弗尔奇（Фолч）试剂分离胆固醇并用传统化学或生物化学方法测定胆固醇（CM.Никитин  Ю.П.，Гордиенко  И.A.，Долгов  A.B.，Филимонва  T.A.“Содержание  холестерина  В  кожеи  его  корреляция  с  дпидным  поКазателем  сыворотки  крови  у  здорвых  людей  и  ьольных  ишемической  ьолезнью  сердца”Кардиология，1987，XXyⅡ  No  10，C.48-51。但是，显然这种方法不适合于对居民进行普查，由于它会造成外伤和实施的复杂性。
在美国专利No4458686中描述了直接在皮肤下及其表面上测定限制在血液中的葡萄糖和乙醇的方法，并指出利用胆固醇氧化酶测定胆固醇的可能性，在使用对于待查明的被作用物是特殊氧化-还原酶，主要是氧化脱氢酶时，氧浓度化学当量的变化是测量这些物质数量的方法的基础。此时，用电化学方法定量测量氧浓度变化，例如，使用采用专门设备和为此目的而特制电极的极谱分析法。
为了保证复杂仪器进行工作，还需要高度技术熟练人员。所有这些必然限制了将该方法用于对居民普查的可能性。
由PCT/84/00888申请得知一种检测-目视显示的复合物，在该复合物中，检测元素和目视显示元素直接或通过交联剂交联。上述复合物被指定用于测定小量的目标分子，也包括生物组织中的脂类。但是，上述测定脂类的方法仅在试验室条件下应用，并且需要由患者身上预先取出生物液体或组织，也就是说，该方法本身在实施当中是有损伤性的，多步骤和复杂的。
在皮肤的活组织上获得皮肤中胆固醇含量和动脉血管粥样硬化病患程度相互关系的结果。这种方法除外伤性外，还有许多缺点，因为厚度1毫米的活组织包括不同的皮肤组成：皮肤角质层（厚度平均为0.1毫米）和结缔组织（本身为真皮），后者又由两层-乳头层和网状层构成。这两层能良好地供血，并因而血管和血液进入活组织。此外，它们还带有汗腺和脂肪腺及其分泌物。皮下的多脂肪组织直接处于真皮之下，它们也可以进入活组织。因此，活组织的不均质性使积聚在皮肤内的胆固醇含量的数据出现误差。从这个观点来看，最精确的方法应当是能够在真皮角质层的皮肤表面上测定胆固醇的含量。
本发明的任务是建立制取亲合酶化合物的方法，这种化合物用于直接在患者皮肤上，特别是在皮肤表皮的角质层内目视显示胆固醇，而不必由患者身上取血和取皮肤的活组织。可以使用人皮肤的任何部分用于诊断，但最合适的是手心表面，因为它不含脂肪腺和分泌物，脂肪腺、分泌物和皮肤角质层一样含有胆固醇，这些胆固醇可能影响诊断指标的结果。
按照本发明，这一任务是通过建立制取亲合酶化合物的方法而得到解决的。该化合物是双功能化合物。所制取的化合物有选择地与患者皮肤的自由胆固醇相结合，而随后可以用作目视鉴别。为制取这种化合物，必须使用至少两个组成部分：检测剂A，它选自能够有选择地并牢固地与皮肤的自由胆固醇形成复合物的物组，这是为了保证让全部双功能化合物找到胆固醇;目视显示剂B，它使与胆固醇结合的双功能化合物能够用作目视鉴别。
按照本发明制取的化合物极大地简化了动脉粥样硬化的诊断，而且是非外伤性的，并且不必提供特殊仪器。为诊断动脉粥样硬化而使用这些化合物使能够把每一个被调查的患者归入以下三组中的一组：动脉粥样硬化患者，危险组，健康人。
按照本发明制取的用于目视显示胆固醇的亲合酶化合物以及以其应用为基础的诊断方法即有条件地称之为“三点法”的方法，适合于对居民普查，而且该方法在使用中是如此之简单，以致于不需要专业技术操作人员，而甚至在家庭条件下也可以进行。
本发明的化合物或者可以仅由检测剂A和目视显示剂B制取，其方法是化学活化这两种试剂中之一的官能团。当在一定条件下，将另一种试剂加入一种含有活化的活化基团的试剂后，试剂A和B之间形成牢固的化学结合，因而获得用于在患者皮肤上目视显示胆固醇的高分子双功能化合物。
下列物质作为胆固醇的亲合物-检测A而使用：
甾类糖苷，在其结构中具有作为配基的呋甾烷醇或螺甾烷醇系的甾环碎片，以及具有含3-10个线状或分支结构单糖的低聚糖碎片（П.К.Кинтя“Строение  и  ьиологическая  активность  стероидных  гликозидов  ряда  спиростана  и  Фуростана”，Кишинев，изд.Штица，1987，C.142），或者
三萜烯糖苷，在其结构中具有α-或β-爱留米脂醇（амирил）、羽扇豆烷、胡椒烷、达玛烷、羊毛脂甾烷或哥洛斯烷（голостан）系的配基，以及具有2-8个分支或线状结构基的低聚糖（Г.Е.Деканосидзе，В.Я.чирва，Т.В.Сергиенко，Н.И.уварова“Исследование  Тритерпеновых  гликозидов”，Тбилиси，изд.Мецниереьа，1982г.），或者
疏水蛋白质，能够有选择地与胆固醇形成复合物（1.Климов  A.H.，Титова Г.В.，Кожевникова  К.А.，Биохимия，1982，T.47，No  2，CTP.226-232，2.Климов  А.Н.，Кожевникова  К.А.，Клюева Н.Н.И ДР.Вопросы  мед.химии，1984，T.30，No  3，CTP.86-90，3.Титова  Г.В.，Клюева  Н.Н.，Кожевникова  К.А.И ДР.БИОХИМИЯ，1980，T.45，No  I，CTP.51-55），或者
蛋白质毒素，由细菌、海洋微生物、昆虫或蛇获得，能够有选择地与胆固醇形成复合物（Далин  М.В.，Фиш  Н.Г.“Белковыетоксины  микроъов”，Москва，изд.“Медицина”，1980  г.），或者
多烯抗菌素，能够有选择地与胆固醇形成复合物（1.J.P.Katzenstein，A.M.Spielvogel，A.W.Norman“J.Antibiot.”27，12，1974，P.943-951，2.Jong  Shang-Shyng，Wang  Hsi-Hua“Clin.J.Microbiol.”，1976，9，（1-2），P.19-30，3.Reading  Josephine  D.et  al“Biochim  Biophis  Acta”，1982，685（2），P.219-224），或者
亲合酶，它们的被作用物是胆固醇，并且它们对胆固醇具有高亲合性。
使用选自以下系列的酶作为目视显示剂-B：乙酰胆碱酯酶、酪氨酸酶、葡糖磷酸脱氢酶、葡糖氧化酶、葡萄糖淀粉酶、半乳糖甙酶、过氧化物酶、碱性或酸性磷酸酶、α-胰凝乳朊酶或者焦磷酸酶。
所提出任务的解决是由于亲合物-检测剂A，选自甾类糖苷，在其结构中具有作为配基的呋甾烷醇或螺甾烷醇系的甾环碎片，以及具有含3-10个线状或分支结构单糖的低聚糖碎片;或者选自三萜烯糖苷，在其结构中具有α-或β-爱留米脂醇、羽扇豆烷、胡椒烷、达玛烷、羊毛脂甾烷或哥洛斯烷系的配基，以及具有2-8个分支或线状结构的低聚糖;或者选自疏水蛋白质，它能够有选择地与胆固醇形成复合物;或者选自蛋白质毒素，它能够有选择地与胆固醇形成复合物，并可由细菌、海洋微生物、昆虫或蛇获得;或者选自多烯抗菌素，它能够有选择地与胆固醇形成复合物;或者选自酶，它对胆固醇具有高亲合性。亲合物-检测A在水介质中用化学方法活化，活化条件为：检测剂A与活化剂的摩尔比＝1∶1-1∶10，检测A的浓度1-20毫克/毫升，温度0-25℃，PH＝4-11，时间0.1-24小时。然后以A∶B（摩尔比）＝20∶1-1∶1向所得溶液中加入目视显示剂B。目视显示剂B选自下列酶：乙酰胆碱酯酶、酪氨酸酶、葡萄糖磷酸脱氢酶、葡糖氧化酶、葡萄糖淀粉酶、半乳糖甙酶、过氧化物酶、碱性或酸性磷酸酶、α-胰凝乳朊酶或焦磷酸酶，在0-25℃下将该溶液孕育1-24小时，直至获得最终产物。
如上所述，目视显示剂B的官能团也可以预先经过化学活化。此时，目视显示剂B的化学活化在水介质中、在目视显示剂B与活化剂的摩尔比＝1∶1-1∶10、温度0-25℃、PH＝4-11下进行0.1-24小时。然后以A∶B（摩尔比）＝20∶1-1∶1向所得溶液中加入来自上列物质之一的检测剂A，再将该溶液在0-25℃下孕育1-24小时，直至获得最终产物。
按照本发明，检测剂A或目视显示剂B的化学活化是单独使用公知的叠氮法、碳化二亚胺法、丁二酰亚胺法或高碘酸盐氧化法进行。
此时，当使用高分子化合物-酶作为目视显示剂B，而使用低分子化合物例如糖苷作为检测剂A时，在最终产物的分子中不多于一种目视显示剂B的分子。此时在最终产物中保证与皮肤胆固醇相结合的检测剂A的摩尔数，仅仅可以超出目视显示剂B含量的几倍，这要按照酶分子中适合于与检测剂A结合的官能团数，而不使酶的活性有重大损失而定。在这些化合物中，当使用酶作为目视显示剂B时，目视显示剂B的含量受到限制。所得的化合物敏感性不太高，或多或少是这种结果造成的，因而必须增加检查时的暴露时间。
为了扩大用于在患者皮肤上目视显示胆固醇的亲合酶化物的技术操作可能性及提高其敏感性，借助交联剂C将上述检测剂A和目视显示剂B交联，交联剂C选自低分子非对称双功能化合物系，象溴化氰、三氯三嗪或2-氨基-4，6-二氯-均三嗪。在这种情况下，该化合物可通过两种途径获得：或是先将检测剂A和交联剂C交联，然后为了获得最终产物向中间产物（A+C）加入目视显示剂B，或者先制取中间产物（B+C），再向它加入检测剂A。
在第一种情况下，获得亲合酶化合物的方法是，先用普通方法将检测剂A以1-20毫克/毫升溶于PH＝5-9的水-盐缓冲液中，检测剂A选自上述物质，然后向这种溶液中以A∶C（摩尔比）＝1∶0.5-1∶10加入低分子非对称双功能交联剂C，交联剂C选自下列物质组：溴化氰、三氯三嗪或2-氨基-4，6-二氯-均三嗪，将所得的溶液在0-20℃下孕育1-20小时，然后以A∶B（摩尔比）＝20∶1-1∶1加入目视显示剂B，目视显示剂B选自上述物质，再将此溶液在0-20℃下孕育1-48小时，直至获得最终产物。
在通过中间产物B+C制取亲合酶化合物时，先将选自上述物质的目视显示剂B用普通方法，以其浓度等于1-20毫克/毫升溶于pH＝5-9的水-盐缓冲液中，然后向该溶液以B∶C（摩尔比）＝1∶0.5-1∶10加入低分子非对称双功能交联剂C，该交联剂C选自以下物质组：溴化氰、三氯三嗪或2-氨基-4，6-二氯-均三嗪。将所得溶液在0-20℃下孕育1-20小时，然后以A∶B（摩尔比）＝20∶1-1∶1加入选自上述物质的检测剂A，再将该溶液在0-20℃下孕育1-48小时，直至获得最终产物。
但是，用于在患者皮肤上目视显示胆固醇的亲合酶的最高敏感性是在使用高分子多功能化合物作为交联剂C时获得的，如使用多聚糖、蛋白质或合成聚合物，即任何含有选自任一官能团的高分子化合物，该官能团选自以下系列：伯胺、羧基、羟基、醛、酰基卤、混合酐、亚氨醚、叠氮化物、酰肼、顺丁烯二酰亚胺、异氰酸酯或环氧化物。并且在这些化合物中的一种上独立地固定着检测剂A，检测剂A是上述物质中的一种或其混合物，且还固定着同样选自上述物质的目视显示剂B。这样的用于在患者皮肤表面上目视显示胆固醇的亲合酶化合物，根据所选的检测剂A对皮肤胆固醇的亲合性程度和所用酶B的相应活性，能够在本身的大范围内改变检测剂A和目视显示剂B的比例。这样，例如在使用对皮肤胆固醇具有较弱亲合性的检测剂A时，它在最终产物中的相对摩尔含量可以显著提高。
这些亲合酶化合物是通过以下方法制取的：检测剂A（是上述物质之一或其混合物）和目视显示剂B（同样是上述物质之一）以A∶B（摩尔比）＝20∶1-1∶1溶于PH＝5-9的水-盐缓冲液中，试剂A和B的每一种浓度各为0.1-20毫克/毫升。向所得溶液中以A+B∶C（摩尔比）＝1∶0.5-1∶10加入高分子多功能交联剂C，该交联剂C是多聚糖、蛋白质或合成聚合物，即任何含有选自任一官能团的高分子化合物，该官能团选自以下系列：伯胺、羧基、羟基、醛、酰基卤、混合酐、亚氨醚、叠氮化物、酰肼、顺丁烯二酰亚胺、异氰酸酯或环氧化物。将所得溶液在0-20℃温度下孕育1-20小时，直至获得最终产物。
用作检测剂A的甾类糖苷在其结构中具有作为配基的呋甾烷醇或螺甾烷醇系的甾环酶，并具有含3-10个线状或分支结构单糖的低聚糖酶。在甾类糖苷中优选的是：龙舌兰苷A、龙舌兰苷B、龙舌兰苷C、龙舌兰苷Д、龙舌兰苷F、龙舌兰苷H、龙舌兰苷G、延令草素（Триллин）、风克苷（Функозид）C、风克苷Д、风克苷F、风克苷G、风克苷I、薯蓣皂苷、格拉契林（Грациллин）、普洛托多琴（протодосцин）、切古巴萨波宁（кикуьасапонин）、云克苷（юнкозид）E、云克苷H、拉诺吉戈宁（ланотигонин）、脱糖毛地黄皂苷、毛地黄皂苷、芰皂苷、若可皂苷（рокозид）c、若可皂苷Д、若可皂苷E、风克苷E、葱属苷（аллиумозид）C、波里戈纳托宁（полигонатонин）、提果皂苷元（тигогенин）的四苷、提果皂苷元的六苷、辣椒苷、阿姆苷（аммумозид）B、阿姆苷C、阿姆苷Д、阿姆苷E、脱糖脱鼠李糖副菝葜皂苷、脱糖副菝葜苷、副菝葜苷、沙尔玛副菝葜皂苷（сармапариллозид）、天门冬苷C、细辛苷Д、天门冬苷G、天门冬苷H、原丝兰苷H、丝兰苷B、羊毛蜡苷（ланотигозид）、单苷、二苷、三苷、红紫苷、己精宁（гекогенин）、若可皂苷元（рокогенин）、吉沃吉宁（диоегинин）、提果皂苷元、原多血苷（протополигамат-озид）、蕃茄苷（томатонин）、拉告吉宁的石蒜四苷（ликотетраозид  лакогенина）、阿里沃吉宁的石蒜四苷（ликотетраозид  аллиогенина）、卡拉塔维苷（каратавиозид）A、环希维尔苷（циклосиверсиозид）H、阿卡托费尔苷（акантофилозид）、岩藻苷A、阿里欧斯皮尔苷（аллиоспирозид）A、环希维尔苷F、茶皂苷、阿卡托费尔苷B、提果皂苷（简易的）、由Culha  Polypatala制取的苷以及环希维尔苷G。
在上述甾类糖苷中更优选的是风克苷C、D、E、F、G或I、薯蓣皂苷、若可皂苷、羊毛蜡苷、毛地黄皂苷和蕃茄苷。最优选的是毛地黄皂苷和蕃茄苷。
被用作检测剂A的三萜烯糖苷在其结构中具有α-或β-爱留米脂醇（амирил）、羽扇豆烷、胡椒烷、达玛烷、羊毛脂甾烷或哥洛斯烷系的配基，以及具有由2-8个分支或线状结构基构成的低聚糖，其中优选的是：七叶皂苷、燕麦根皂苷、茶皂苷、α-常春藤素、威严仙苷、斯吉海苷（стихинозид）、仙客来苷、奎诺温（хиновин）、由制糖甜菜制取的皂草苷、丝石竹苷、由Fatsia  Japonica制取的三萜烯糖苷。
在被用作检测剂A并能够有选择地与胆固醇形成复合物的疏水蛋白质中，优选的是：Фолч的米里诺蛋白质（Меилиновый  Велок  Фолча）、溶酶体蛋白质、线粒体、血纤维蛋白原、免疫球蛋白、脑酮、肌红蛋白、胰蛋白酶、细胞色素C、细胞色素P-450或脂蛋白的脱水蛋白质。
在被用检测剂A的能够有选择地与胆固醇形成复合物并由细菌、海洋微生物、昆虫或蛇获得的蛋白质毒素中，优选的是：链球菌溶血素O、气生溶细胞素、李氏杆菌溶细胞素、由产气荚膜杆菌（Perfrigens）型A和C制取的Q-毒素C.I、诺维氏杆菌（novyi）型A和C的δ-毒素CI、组织溶解（histolyticum）的溶血素C.I、肉毒杆菌（botulinum）型C和Д的溶血素C.I、破伤风菌溶血素、脑酮溶细胞素、肺泡溶细胞素、丘林格沃溶细胞素（тюрингеолизин）或由老年细指葵属（Metridiumsenile）海葵提取的细胞毒素。
在被用作检测剂A、能够有选择地与胆固醇形成复合物的多烯抗菌素中，优选的是两性霉素B、菲律宾菌（Филипин）或尼斯塔金（нистатин）。
在用作检测剂A、对胆固醇有高亲合性的高亲合酶中，优选的是胆固醇氧化酶、胆固醇脱氢酶或胆固醇酯酶。
在以上所列的全部亲合物-检测剂A中，例如糖苷、疏水蛋白质、蛋白质毒素、多烯抗菌素和高亲合性酶中，无论是从作为有机溶剂的最佳化学稳定性和贮存性、还是在高温合成时不损失与皮肤胆固醇形成复合物的能力来考虑，糖苷是最优选的。低分子量的糖苷使能够获得具有高摩尔含量检测剂试剂，从而保证了该试剂与皮肤胆固醇相互作用点的相重性。
在糖苷中最优先的是甾类糖苷，与三萜烯糖苷相比，它能够最有效地与胆固醇形成复合物。
疏水蛋白质、蛋白质毒素、多烯抗菌素以及高亲合性酶也能成功地用于制取检测剂试剂，但是因为它们的化学稳定性低以及失活性，所以在制取亲合酶化合物中受到某些限制。此外，这些检测剂的高分子量有些降低最终化合物的敏感性，因而为在皮肤上显示胆固醇就需要增加试剂的浓度和暴露时间。
十分显然，希望在弱条件下，即在中性PH值、低离子势、低温下及较短反应时间内进行反应。
使用酶作为目视显示剂B，由于酶与检测剂A反应而得到用于在患者皮肤上目视显示胆固醇的亲合酶产物，酶选自以下系列：乙酰胆碱酯酶、酪氨酸酶、葡糖磷酸脱氢酶、葡糖氧化酶、葡萄糖淀粉酶、半乳糖甙酶、过氧化物酶、碱性或酸性磷酸酶、α-胰凝乳朊酶或焦磷酸酶。
所有这些酶均可与上述任何检测剂A一起使用，但是优选的是甾类糖苷。
在最大保持试剂A和B的官能活性的情况下，交联剂C的使用解决了制取用于在患者皮肤表面目视显示胆固醇的化合物方法的工艺可行性。
最优选的是这样的化合物，在该化合物中使用甾类糖苷作为亲合物-检测剂A，在该甾类糖苷的结构中具有作为配基的呋甾烷醇或螺甾烷醇系的甾环酶，以及具有含3-10个线状或分支结构单糖的低聚糖酶。
这种甾类糖苷具有高的化学稳定性，并且在强条件下，即在高温下以及必须借助在有机溶剂中溶解时，都可以被固定在交联聚合物上，这就保证了它们在最终产物中的高含量。用于在患者皮肤表面目视显示胆固醇的化合物是通过以下方法制备的：在强条件下连续将检测剂A固定在交联剂C上，然后在减弱条件下目视显示剂B固定在含交联剂C和检测剂A的所得产物上，以保持它的酶活性。
可以使用非对称低分子双功能化合物作为交联剂C、例如溴化氰、三氯三嗪或2-氨基-4，6-二氯-均三嗪。
使用高分子多功能化合物作为交联剂C，使能够在用于目视显示胆固醇化合物中大范围地变化检测剂A和目视显示剂B的比例，例如为了在与皮肤表面结合的化合物的核心数（检测剂A）与目视显示剂B的数量之间获得最佳比例。
使用多聚糖、蛋白质或合成聚合物作为高分子多功能交联剂C，即任何含有选自任一官能团的高分子化合物，该官能团选自以下系列：伯胺、羧基、羟基、醛、酰基卤、混合酐、亚氨醚、叠氮化物、酰肼、顺丁烯二酰亚胺、异氰酸酯或环氧化物。
作为高分子多功能交联剂C，优选的是丙烯酸或马来酸酐的共聚物。
最佳的高分子多功能交联剂C是N-乙烯基吡咯烷酮与马来酸酐的共聚物。上述交联剂C与任何检测剂A和任何目视显示剂B一起使用。此时总是获得产物A-C-B。
最佳的是这样的化合物，其中使用甾类糖苷作为检测剂A。
作为检测剂A和目视显示剂B的活化剂，使用以可起反应的方式改变这些试剂官能团的化合物。这些官能团如伯胺、羧基、α-乙二醇，能够用公知的方法活化，这些方法是叠氮法、碳化二亚胺法、丁二酸亚胺法、高碘酸盐法及其他方法。
最佳的是高碘酸盐法和碳化二亚胺法，因为这些方法提供了最减轻负担的合成作用条件，并且能够最大地保持被固定酶的活性。
作为水-盐缓冲液，使用由能在PH＝5-9的范围内保证缓冲作用的不会引起酶失活或酶抑制的化合物所制备的溶液。这样的溶液例如可以是硼酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐缓冲液或其他缓冲液。通常使用具有一定盐浓度的水-盐溶液，该盐浓度在固定期内保证溶液有稳定的PH值，但此时该浓度不应超过酶开始变性的数值。
某些检测剂A，如甾类糖苷、三萜烯糖苷或多烯抗菌素极少或不完全溶于水，因此，为使它们溶解使用有机溶剂。作为这种溶剂，可以使用极性的不给出质子的溶剂，例如，二甲亚砜、甲酰替二甲胺、六甲醇、比例为2∶1的甲酰替二甲胺与甲苯的混合物，或者比例为2∶1的甲酰替二甲胺与己烷的混合物。
用于制取目视显示胆固醇的化合物方法的规程（温度、孕育时间）由所选择的组成A、B和C来确定。使用酶作为目视显示剂B限定反应温度最高为20℃。该反应优选在4℃于PH＝5-9的缓冲液中进行。用合成聚合物作为交联剂C，以及用糖苷作为检测剂A，使反应能在有机溶剂中及在高温（最高达120℃）下进行，并能够选择为获得最终产物的最大产量的足够反应时间。
按照所选择的试剂A或B的分子量、对皮肤胆固醇的亲合性程度以及所选用酶的活性选择反应组分的摩尔比。
以下借助于所完成的实施例和附图解释本发明，在附图中表示的是：
图1-规定的符号
图2-按照权利要求1、2所制取的化合物及它们在患者皮肤表面与胆固醇的相互作用
图3-按照权利要求3、4所制取的化合物及它们在患者皮肤表面与胆固醇的相互作用
图4-按照权利要求5、18所制取的化合物及它们在患者皮肤表面与胆固醇的相互作用
实施例1
将100毫克蕃茄苷（A）加入10毫升水中，添加40毫克高碘酸钠并在20℃孕育4小时。将1毫升α-胰凝乳朊酶（B）（10毫克/毫升）在0.2摩尔PH＝7.5的磷酸盐缓冲液中的溶液加入1毫升所得到的溶液中，并在4℃孕育12小时，结果得到最终产物的溶液。
实施例2
将3毫克由洋姜制取的过氧化物酶（B）溶于1毫升水中，再加入0.5毫克高碘酸钠并在4℃孕育8小时。向所得的溶液中加入3毫克胆固醇氧化酶（A）在1毫升0.2摩尔PH＝7.5的磷酸盐缓冲液中的溶液，然后在4℃孕育12小时。结果得到最终产物的溶液。
实施例3
将10毫克聚丙烯酸（C）溶于10毫升PH＝4.8的乙酸盐缓冲液中，再加入15毫克对环己基-2-（4-吗啉（мофолин））乙基-碳化二亚胺-甲基-对甲苯磺酸盐。在0℃孕育1.5小时。向所得溶液中加入5毫升缓冲液，该缓冲液含有5毫克邻链球菌溶血素（A）和5毫克由洋姜制取的过氧化物酶（B）。将该溶液在20℃孕育2小时，结果获得最终产物。
实施例4
将龙舌兰苷Г（100毫克）（A）加入5毫升水中并加入100毫克溴化氰（C），通过加入1摩尔的NaOH溶液保持PH＝11。将该混合物在4℃孕育30分钟，通过加入磷酸使PH降至8.5。向1毫升所得的溶液中加入3毫升0.5摩尔PH＝8.5的磷酸盐缓冲液，该缓冲液含有6毫克碱性磷酸酶（B），然后在4℃孕育12小时。结果获得最终产物的溶液。
实施例5
将尼斯塔琴（нистатин）（A）（500毫克），乙烯和马来酸酐（C）（250毫克）的共聚物溶于5毫升甲酰替二甲胺中，并于50℃在氩气流中孕育3小时。用20毫升乙醚沉淀所得的产物，再在20℃下真空中烘干。向1毫升β-半乳糖甙酶（B）（2毫克/毫升）在0.2摩尔PH＝7.5的磷酸盐缓冲液中的溶液加入6毫升所得的产物，并在4℃孕育12小时。结果获得最终产物的溶液。
实施例6
将七叶皂苷（A）（50毫克），N-乙烯基吡咯烷酮和马来酸酐（C）（100毫克）的共聚物溶于1毫升甲酰替二甲胺中，并在100℃孕育2小时，用3毫升丙酮沉淀所得产物，然后在真空中置于五氧化二磷上方、于100℃烘干4小时。
向1毫升α-胰凝乳朊酶（B）（1毫克/毫升）在0.2摩尔PH＝7.5的磷酸盐缓冲液中的溶液加入8毫克所得产物，并在6℃孕育15小时。结果获得最终产物的溶液。
在该聚合物中，所获得的产物的特征是具有高摩尔含量的检测剂A，而预先制备含检测剂A和高分子交联剂C的产物的阶段，使能够依靠固定酶的有利条件最大地保持目视显示剂B的酶活性。
用该化合物在患者皮肤上目视显示胆固醇：
借助本发明所制取的化合物进行的检验，不是基于定量测定胆固醇，而是基于这样一种可能性，即将患者划归于动脉粥样硬化病人、危险组和实际上是健康人这样三个组中的一组。为了将患者划归于这些组中的一个组，必须估计上述每个组所特有的皮肤表皮角质层中胆固醇的含量。
与此相应，对于按本发明制取的每种化合物都选三种浓度以备后用。将这三种不同浓度的亲合酶试剂以三点形式涂敷在患者皮肤上，最好是手心上。在此情况下，具有最大浓度的该化合物供用于以后观察在所有人上涂敷斑点的色泽发展，也包括皮肤中具有低胆固醇含量的健康人。这个斑点好象以检查胆固醇作用的形式被利用。按照本发明所制取的具有最小浓度的化合物溶液仅供用于观察临床阶段的皮肤具有最大胆固醇含量的动脉粥样硬化患者的斑点色泽发展。按本发明所制取的具有中间浓度的化合物溶液既供用于观察患病的人，也供用于观察属于危险组的人（胆固醇含量升高者）的斑点色泽发展，但不用于观察健康人的斑点色泽发展。
象这样，将按本发明制取的不同浓度的化合物涂敷在患者皮肤上。在出现一个有色斑点时，该患者属于健康人，在出现两个有色斑点时，属于危险组人，而出现三个有色斑点时，属于临床阶段的动脉粥样硬化患者。
对了进行诊断，在患者任何部位选择几平方厘米的皮肤块就足够了。最优选的是手掌内面，该处易于接近，且还不含脂肪腺。
将按本发明制取的化合物用三种不同浓度以10-20微升的量涂敷在患者皮肤表面上并孕育1分钟。未与皮肤胆固醇化合的剩余化合物经洗涤除去。为了目视观察与皮肤胆固醇结合的按本发明制取的化合物，在同一皮肤块表面上涂敷适合于酶的被作用物，这种酶在所制取的该化合物中被用作目视显示剂B。由于酶反应的结果，该被酶作用物与本发明的化合物形成有色产物（T.T.Ngo  et  H.M.Lenhoff“Enzime-mediated  immunoessei”，1985，Plemum  Press，New  York;A.Leninger“Biochemie”，Verlag“Mir”，Moskan，1976，S.198）。
根据所选择的酶反应的被作用物，无色的被作用物溶液被染成红、黄、兰、绿、紫或其他颜色，或者也使有色溶液褪色。
例如，如果使用由洋姜制取的过氧化物酶作为目视显示剂B，那末这种被酶作用物可以使用制备后立刻使用的下列任何溶液：
溶液1：ABTC（2，2′-连氮基二-（3-乙基-苯并噻唑啉（Бензтиоазолин）-6-磺酸）1毫摩尔，过氧化氢0.002%在PH＝4.3的磷酸-柠檬酸缓冲液中的溶液。
溶液2：邻苯二胺4毫摩尔，过氧化氢0.004%在PH＝5的磷酸-柠檬酸缓冲液中的溶液。
溶液3：3，3′，5，5′-环丁烷联苯胺0.4毫摩尔，过氧化氢0.004%在PH＝6的乙酸缓冲液中的溶液，或者被广泛用于免疫酶分析的其他过氧化物酶的被作用物。
例如，如果在制取用于目视显示的亲合酶化合物的方法中使用碱性磷酸酶作为目视显示剂B，那么作为这种酶的被作用物可以使用含对硝基苯酚磷酸盐1.5毫摩尔、氯化镁0.05毫摩尔在PH＝9.5的二乙胺缓冲液中的溶液，或者被用于免疫酶分析的其他碱性磷酸酶的被作用物。
验证诊断的200人的观察结果列于附表中，它们表明上述诊断方法与动脉血管粥样硬化疾患程度之间具有高的相关性。
Figure 891067043_IMG1

Claims (22)

1、制取亲合酶化合物的方法，该化合物以检测剂A和目视显示剂B为基础，用于在患者皮肤表面目视显示胆固醇，其特征在于，
检测剂A选自甾类糖苷。该甾类糖苷在其结构中具有作为配基的呋甾烷醇或螺甾烷醇系的甾环酶，以及具有含3-10个线状或分支结构单糖的低聚糖酶，或者选自三萜烯糖苷，该三萜烯糖苷在其结构中具有α-或β-爱留米脂醇、羽扇豆烷、胡椒烷、达玛烷、羊毛脂甾烷或哥洛斯烷系的配基，以及具有由2-8个分支或线状结构基组成的低聚糖，或者选自能够有选择地与胆固醇形成复合物的疏水蛋白质，或者选自能够有选择地与胆固醇形成复合物的蛋白质毒素，它可由细菌、海洋微生物，昆虫或蛇获得，或者选自能够有选择地与胆固醇形成复合物的多烯抗菌素，或者选自对胆固醇有高亲合性的酶，
检测剂A先在水介质中用化学方法活化，活化在A与活化剂的比为1∶1-1∶10、检测剂A的浓度为1-20毫克/毫升、温度0-25℃、PH=4下进行0.1-24小时，然后向所得溶液适当加入目视显示剂B。
目视显示剂B选自下列酶：乙酰胆碱酯酶、酪氨酸酶、葡糖磷酸脱氢酶、葡糖氧化酶、葡萄糖淀粉酶、半乳糖甙酶、过氧化物酶、碱性或酸性磷酸酶、α-胰凝乳朊酶或焦磷酸酶，A∶B(摩尔比)=20∶1-1∶1，该溶液在0-25℃温度下孕育1-24小时。
2、制取亲合酶化合物的方法，该化合物以检测剂A和目视显示剂B为基础，用于在患者皮肤表面目视显示胆固醇，其特征在于，
目视显示剂B选自下列酶：乙酰胆碱酯酶、酪氨酸酶、葡糖磷酸脱氢酶、葡糖氧化酶、葡萄糖淀粉酶、半乳糖甙酶、过氧化物酶、碱性或酸性磷酸酶、α-胰凝乳朊酶或焦磷酸酶，
目视显示剂B先在水介质中用化学方法活化，活化在B与活化剂的摩尔比为1∶1-1∶10、目视显示剂B的浓度为1-20毫克/毫升、温度0-25℃、PH＝4-11下进行1-24小时，然后向所得溶液适当加入检测剂A，
检测剂A选自甾类糖苷，该甾类糖苷在其结构中具有作为配基的呋甾烷醇或螺甾烷醇系的甾环酶，以及具有含3-10个线状或分支结构单糖的低聚糖酶，或者选自三萜烯糖苷，该三萜烯糖苷在其结构中具有α-或β-受留米脂醇、羽扇豆烷、胡椒烷、达玛烷、羊毛脂甾烷或哥洛斯烷系的配基，以及具有由2-8个支状或线状结构基组成的低聚糖，或者选自能够有选择地与胆固醇形成复合物的疏水蛋白质，或者选自能够有选择地与胆固醇形成复合物的蛋白质毒素，它可由细菌、海洋微生物、昆虫或蛇获得，或者选自能够有选择地与胆固醇形成复合物的多烯抗菌素，或者选自对胆固醇有高亲合性的酶，A∶B（摩尔比）＝20∶1-1∶1，将该溶液在0-25℃温度下孕育1-24小时。
3、制取亲合酶化合物的方法，该化合物以检测剂A和目视显示剂B为基础，用于在患者皮肤表面目视显示胆固醇，其特征在于，
检测剂A选自甾类糖苷，该甾类糖苷在其结构中具有作为配基的呋甾烷醇或螺甾烷醇系的甾环酶，以及具有含3-10个线状或支状结构单糖的低聚糖酶，或者选自三萜烯糖苷，该三萜烯糖苷在其结构中具有α-或β-爱留米脂醇、羽扇豆烷、胡椒烷、达玛烷、羊毛脂甾烷或哥洛斯烷系的配基，以及具有由2-8个分支或线状结构基构成的低聚糖，或者选自能够有选择地与胆固醇形成复合物的疏水蛋白质，或者选自能够有选择地与胆固醇形成复合物的蛋白质毒素，它可由细菌、海洋微生物、昆虫或蛇获得，或者选自能够有选择地与胆固醇形成复合物的多烯抗菌素，或者选自对胆固醇有高亲合性的高亲合酶。
将检测剂A溶于PH＝5-9的水-盐缓冲液中，A的浓度为1-20毫克/毫升，然后加入低分子非对称双功能交联剂C，交联剂C选自下列物组：溴化氰、三氯三嗪或2-氨基-4，6-二氯-均三嗪，A∶C（摩尔比）＝1∶0.5-1∶10，将该溶液在0-20℃温度下孕育1-20小时，然后加入目视显示剂B，
目视显示剂B选自下列酶：乙酰胆碱酯酶、酪氨酸酶、葡糖磷酸脱氢酶、葡糖氧化物、葡萄糖淀粉酶、半乳糖甙酶、过氧化物酶、碱性或酸性磷酸酶、α-胰凝乳朊酶或焦磷酸酶，A∶B（摩尔比）＝20∶1-1∶1，然后将该溶液在0-20℃温度下孕育1-48小时。
4、制取亲合酶化合物的方法，该化合物以检测剂A和目视显示剂B为基础，用于在患者皮肤表面目视显示胆固醇，其特征在于，
目视显示剂B选自下列酶：乙酰胆碱酯酶、酪氨酸酶、葡糖磷酸脱氢酶、葡糖氧化酶、葡萄糖淀粉酶、半乳糖甙酶、过氧化物酶、碱性或酸性磷酸酶、α-胰凝乳朊酶或焦磷酸酶，将目视显示剂B溶于PH＝5-9的水-盐缓冲液中，目视显示剂B的浓度为1-20毫克/毫升，然后以A∶B（摩尔比）＝1∶0.5-1∶10加入低分子非对称双功能交联剂C，交联剂C选自下列物组：溴化氰、三氯三嗪或2-氨基-4，6-二氯-均三嗪，将该溶液在0-20℃温度下孕育1-20小时，再适当加入检测剂A，
检测剂A选自甾类糖苷，该甾类糖苷在其结构中具有作为配基的呋甾烷醇或螺甾烷醇系的甾环酶，以及具有含3-10个线状或分支结构单糖的低聚糖酶，或者选自三萜烯糖苷，该三萜烯糖苷在其结构中具有α-或β-爱留米脂醇、羽扇豆烷、胡椒烷、达玛烷、羊毛脂甾烷或哥洛斯烷系的配基，以及具有由2-8个分支或线状结构基构成的低聚糖，或者选自能够有选择地与胆固醇形成复合物的疏水蛋白质，或者选自能够有选择地与胆固醇形成复合物的蛋白质毒素，它可由细菌、海洋微生物、昆虫或蛇获得，或者选自能够有选择地与胆固醇形成复合物的多烯抗菌素，或者选自对胆固醇有高亲合性的高亲合酶，A∶B（摩尔比）＝20∶1-1∶1，将该溶液在0-20℃温度下孕育1-48小时。
5、制取亲合酶化合物的方法，该化合物以检测剂A和目视显示剂B为基础，用于在患者皮肤表面目视显示胆固醇，其特征在于，
检测剂A选自甾类糖苷，该甾类糖苷在其结构中具有作为配基的呋甾烷醇或螺甾烷醇系的甾环酶，以及具有含3-10个线状或分支结构单糖的低聚糖酶，或者选自三萜烯糖苷，该三萜烯糖苷在其结构中具有α-或β-爱留米脂醇、羽扇豆烷、胡椒烷、达玛烷、羊毛脂甾烷或哥洛斯烷系的配基，以及具有由2-8个分支或线状结构基构成的低聚糖，或者选自能够有选择地与胆固醇形成复合物的疏水蛋白质，或者选自能够有选择地与胆固醇形成复合物的蛋白质毒素，它可由细菌、海洋微生物、昆虫或蛇获得，或者选自能够有选择地与胆固醇形成复合物的多烯抗菌素，或者选自对胆固醇有高亲合性的高亲合酶，或者上述物质的混合物，
目视显示剂B选自下列酶：乙酰胆碱酯酶、酪氨酸酶、葡糖磷酸脱氢酶、葡糖氧化酶、葡萄糖淀粉酶、半乳糖甙酶、过氧化物酶、碱性或酸性磷酸酶、α-胰凝乳朊酶或焦磷酸酶，
以A∶B（摩尔比）＝20∶1-1∶1将检测剂A和目视显示剂B溶于PH＝5-9的水-盐缓冲液中，试剂A和B的每一种浓度为0.1-20毫克/毫升，然后向所得溶液中加入高分子多功能交联剂C、使用含有选自任一官能团的多聚糖、蛋白质或合成聚合物作为交联剂C，该官能团选自伯胺、羧基、羟基、醛、叠氮化物、酰肼、顺丁烯二酰亚胺、异氰酸酯或环氧化物系列，
（A+B）∶C（摩尔比）＝1∶0.5-1∶10，将所得溶液在0-20℃温度下孕育1-20小时。
6、根据权利要求1-5之一的方法，其特征在于，作为用作检测剂A的甾类糖苷，使用龙舌兰苷A、龙舌兰苷B、龙舌兰苷C、龙舌兰苷Д、龙舌兰苷F、龙舌兰苷H、龙舌兰苷G、风克苷I、薯蓣皂苷、格拉契林（грациллин）、普洛托多琴（протодосцин）、切古巴萨宁（кикуъасанин）、云克苷E、云克苷H、拉诺吉戈宁（ланотигонин）、脱糖毛地黄皂苷、毛地黄皂苷、芰皂苷、若可皂苷C、若可皂苷Д、若可皂苷E、风克苷E、葱属苷C、波里戈纳托宁（полиганатонин）、提果皂苷元四苷、提果皂苷元六苷、辣椒苷、阿姆苷B、阿姆苷C、阿姆苷Д、阿姆苷E、脱糖脱鼠李副菝葜苷、脱糖副菝葜皂苷、副菝葜皂苷、沙尔玛副菝葜皂苷、天门冬苷C、天门冬苷Д、天门冬苷G、天门冬苷H、原丝兰苷H、丝兰苷B、羊毛蜡苷、单苷、三苷、红紫苷、己精宁、若可皂苷元、吉活吉宁、提果皂苷元、原多血苷、蕃茄苷、拉告吉宁的石蒜四苷、阿里沃吉宁的石蒜四苷、卡拉塔维苷A、环烯维尔希苷H、阿卡托费尔苷C、岩藻苷A、延令草素、风克苷C、风克苷Д、风克苷F、风克苷G、阿里欧斯皮尔苷A、环希维希尔苷F、茶皂苷、阿卡托费尔苷B、提果皂苷（简易的），由Calha  Polypatala制取的苷或环希维尔希苷G。
7、根据权利要求6的方法，其特征在于，使用风克苷C、Д、E、F、G或I，薯蓣皂苷、若可皂苷、羊毛蜡苷、毛地黄皂苷和蕃茄苷作为检测剂A。
8、根据权利要求6的方法，其特征在于，使用毛地黄皂苷和蕃茄苷作为检测剂A。
9、根据权利要求1-5之一的方法，其特征在于，作为以检测剂A的形式被使用的三萜烯糖苷，使用七叶素（зсцин）、燕麦根皂苷、茶皂苷、α-常春藤素、威严仙苷C、斯吉海苷A、仙客来苷、奎诺温、由制糖甜菜制取的皂草苷、丝石竹苷和由Fatsia  Japonica制取的三萜烯糖苷。
10、根据权利要求1-5之一的方法，其特征在于，作为检测剂A的疏水蛋白质，使用Фоли的米里诺蛋白质（меилчновый  δелок  Фолча）、溶酶体的蛋白质和线粒体、血纤维蛋白原、免疫球蛋白、脑酮、肌红蛋白、胰蛋白酶、细胞色素C、细胞色素P-450、脂蛋白的脱水蛋白质。
11、根据权利要求1-5之一的方法，其特征在于，作为检测剂A的蛋白质毒素，使用链球菌溶血素O、气生溶细胞素、李氏杆菌溶细胞素、由产气荚膜杆菌型A和C制取的Q-毒素C.I、诺维氏杆菌型A和C的δ-毒素CI、组织溶解的溶血素C.I、肉毒杆菌型C和д的溶血素C.I、破伤风菌溶血素、脑酮溶细胞素、肺泡溶细胞素、丘林格活溶细胞素或由老年细指葵属海葵提取的细胞毒素。
12、根据权利要求1-5之一的方法，其特征在于，作为检测剂A的多烯抗菌素，使用两性霉素B、菲律宾菌或尼斯塔金。
13、根据权利要求1-5之一的方法，其特征在于，作为检测剂A的高亲合性酶，使用胆固醇氧化酶、胆固醇脱氢酶或胆固醇酯酶。
14、根据权利要求5的方法，其特征在于，使用丙醛烯酸或马来酸酐的共聚物作为高分子交联剂C。
15、根据权利要求14的方法，其特征在于，使用N-乙烯基吡咯烷酮与马来酸酐的共聚物作为高分子交联剂C。
16、根据权利要求1-15之一的方法，其特征在于，为使检测剂A或目视显示剂B化学活化，单独使用公知的碳化二亚胺法、丁二酰亚胺法、叠氮法或高碘酸盐氧化法。
17、根据权利要求16的方法，其特征在于，为使检测剂A和目视显示剂B化学活化，使用碳化二亚胺法或高碘酸盐氧化法。
18、根据权利要求1-9、12之一的制取用于在患者皮肤表面上目视显示胆固醇的亲合酶化合物的方法，其特征在于，检测剂A选自甾类糖苷，该甾类糖苷在其结构中具有作为配基的呋甾烷醇或螺甾烷醇系的甾环酶，以及具有含3-10个线状或分支结构单糖的低聚糖酶，或者选自三萜烯糖苷，该三萜烯糖苷在其结构中具有α-或β-爱留米脂醇、羽扇豆烷、胡椒烷、达玛烷、羊毛脂甾烷或哥洛斯烷系的配基，以及具有由2-8个分支或线状结构基构成的低聚糖，或者选自能够有选择地与胆固醇形成复合物的多烯抗菌素，或者选自上述物质的混合物，
将检测剂A预先溶于不给出质子的极性溶液中，然后加入高分子多功能交联剂C，交联剂C选自下列物质组：含有任何选自下列官能团的多聚糖、蛋白质或合成聚合物，该官能团选自以下系列的伯胺、羧基、羟基、醛、酰基卤、混合酐、亚氨醚、叠氮化物、酰肼、顺丁烯二酰亚胺、异氰酸酯、环氧化物，试剂A和C中每一种的浓度均为1-20毫克/毫升，A∶C＝1∶1-1∶10，将该溶液在20-120℃孕育0.5-6小时，然后用一种本身公知的方法由该溶液中沉淀出所制取的产物（A-C），将所得产物在80-120℃下、在真空中置于五氧化二磷上方保持4-10小时，然后向溶有浓度为1-10毫克/毫升目视显示剂B的、PH＝5-9的水-盐缓冲液中加入所得的干燥产物（A-C），其浓度为2-20毫克/毫升，将该溶液在4-8℃温度下孕育2-12小时，目视显示剂B选自下列酶：乙酰胆碱酯酶、酪氨酸酶、葡糖磷酸脱氢酶、葡糖氧化酶、葡萄糖淀粉酶、半乳糖甙酶、过氧化物酶、碱性或酸性磷酸酶、α-胰凝乳朊酶或焦磷酸酶。
19、根据权利要求18的方法，其特征在于，作为不给出质子的极性溶剂使用二甲亚砜、甲酰替二甲胺、六甲醇、比例为2∶1的甲酰替二甲胺与甲苯的混合物或比例为2∶1的甲酰替二甲胺与乙醇的混合物。
20、根据权利要求3-5、18、19之一的方法，其特征在于，使用在PH＝5-9范围内保证缓冲作用的溶液作为水-盐缓冲液，它选自硼酸盐溶液、柠檬酸盐溶液或磷酸盐溶液。
21、根据权利要求1-20之一所制取的产物。
22、为了目视显示根据权利要求1-20之一所制取的化合物，使用被选择作为目视显示剂B的酶的被作用物，该被作用物与所制取的化合物形成有色产物。
CN89106704.3A 1988-01-19 1989-07-15 制取以检测剂(胆固醇的亲合物)和目视显示剂为基础用于在患者皮肤表面目视显示胆固醇的亲合酶化合物的方法及该化合物的应用 Pending CN1048925A (zh)

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