CS274496B2 - Method of affinitive-enzymatic compounds preparation for cholesterol's visul indication - Google Patents
Method of affinitive-enzymatic compounds preparation for cholesterol's visul indication Download PDFInfo
- Publication number
- CS274496B2 CS274496B2 CS34889A CS34889A CS274496B2 CS 274496 B2 CS274496 B2 CS 274496B2 CS 34889 A CS34889 A CS 34889A CS 34889 A CS34889 A CS 34889A CS 274496 B2 CS274496 B2 CS 274496B2
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- cholesterol
- agent
- agavoside
- group
- skin
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/60—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving cholesterol
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
Vynález 9Θ týká obla9ti bioorganické chemie a 9ice způsobu výroby afinních enzymatických sloučenin pro vizuální indikaci cholesterolu na povrchu kůže pacientů na bázi indikačního prostředku, který Je afinni 9 cholesterolem a prostředku pro vizuální indikaci .
Nejdůležitějši může být použiti eloučenin podle vynálezu v diagnostice, k tomu patři také včasné rozpoznáni atherosklerozy, ke zpřesněni diagnózy za klinických, ambulantních a domácích podmínek, jakož i ke kontrole průběhu léčby. Uvedené sloučeniny mohou být také použity při fyziologických, histologických a histochemických výzkumech ke stanoveni zvýšeného Obsahu cholesterolu a jeho lokalizaci. Mimoto tyto sloučeniny také umožňují stanoveni sníženého obsahu cholesterolu u pacientů 9e zjištěnými chorobami, zejména onkologického charakteru.
Atheroskleroza a jeji komplikace jako infarkty, inzulty a gangrény, jsou hlavni příčinou úmrtnosti obyvatelstva ve všech zemích světa.
Mnohaleté výzkumy vedly ke zjištěni, že atheroskleroza patří k chorobám, které je třeba zjistit a bojovat proti nim, přičemž hlavním faktorem rizika atherosklerozy ja akumulace cholesterolu v organismu. Profylaxe atherosklerozy u obyvatelstva spočívá v tom, že se zjistí mezi pacienty, kteři patří k nejvíce ohrožené rizikové skupině, tito se individuálně ošetří a postiženi pacienti zrněni svůj způsob života. Stanoveni skupin pacientů se zvýšeným rizikem atherosklerozy na základě množství cholesterolu akumulovaného v organismu je nejobtižnějším problémem profylaxe atherosklerozy. Známé metody diagnostiky atherosklerozy se zakládají na kvantitativním stanoveni celkového cholesterolu v plasmě žilní krve (viz Consensus Conference on Lowering Blood Cholesterol to Prevent Heart Desease,
JAMA, 1985, 253, str. 2080 - 2086; The Lipid Research Clinics Population Studies Data Book; Publication 80 - 152, Bethesda, Ma., National Institutes of Health, 1980, sv. 1;
Lipid Research Clinics Programm, JAMA, 1984, 251, str. 351 - 364). Obsah cholesterolu nad 260 mg je považován za dostatečný pro to, aby pacienti byli počítáni k rizikové skupině. Podrobnější diagnóza se stanoví na základě analýzy lipoproteinů krevni plasmy a stanoví se index atherogenity, který je formulován jako poměr rozdílu celkového obsahu cholesterolu (cHce|) a cholesterolu lipoproteinů vysoké hustoty (Ch^^) k cholesterolu lipoproteinů vysoké hustoty:
Chcel Chlvh
I a » ' ather.
Chlvh
Při hodnotě indexu atherogenity nad 3 je pacient považován za člena rizikové skupiny a při indexu nad 5,6 k atherosklarotickým pacientům (viz Klimov A.N., Fenotipirovanie lipoproteinov, Metodičeskie rekomendacii MZ SSSR, M., Medicina, 1975; Goldfourt V., Holtzmann E., Neufeld H.N., Total and High Density Lipoprotein Cholesterol in the Sérum and Risk of Mortality, British Medical Journal, 1985, 290, str. 1239 - 1243).
Použiti těchto metod vyžaduje odběr krve, což je pro pacienty traumatické a mimoto není zcela bezpečné, vzhledem k možnosti přenosu různých virových onemocněni. Frakcionace plasmových lipoproteinů a analýza cholesterolu představuji drahý a komplikovaný postup. Mimoto znamenaji v jednom ze třech připadů zjištovaný celkový obsah cholesterolu a dokonce i výsledky celkové fenotypizace nejsou v korelaci s obtížemi atherosklerozy (viz Mjaenikov A.L., GipertonlČeskaja bolezň, 1965, M., Medicina, str. 300).
Mimoto pokusy provedené v posledních letech dokázaly, ža krevni plasma v celém rozsahu nemůže úplně zobrazovat procasy akumulace cholesterolu charakteristické pro stěny arterii a další bradytrofni tkáně.
Dalši zlepšeni diagnostických způsobů vyplynulo z řešeni jednotlivých otázek pathogenese atherosklerozy. Je třeba zdůraznit, že tkáňový cholesterol hraje rozhodující úlohu při vzniku atherosklerozy. Mohly by být zjištěny tkáně, které akumulují cholesterol,
CS 274 496 B2
Jako stěny artsrii.
Výzkumy v posledních letech bylo zjištěno, že mezi obsahem cholesterolu ve stěnách arterii a v pokožce existuje těsný vztah. Toto zjištěni umožňuje objev zásadně nových diagnostických způsobů, zejména pro atherosklerozu.
Uvedený vztah mezi obsahem cholesterolu ve stěnách arterii a v pokožce byl zjištěn přimým stanovením cholesterolu v kožnich bioptátech. Vzorky kůže byly zmrazený v kapalném dusíku a lyofylizovány, pak byl cholesterol extrahován Folchovým činidlem a stanoven obvyklými chemickými, popřípadě biochemickými metodami (viz Nikitin Ou.P., Gordienko I.A., Dolgov A.V., Filimonova T.I., Soděržanie choleeterina v kože i ego korreljacia s lipidnym pokazatelem syvorotki krovi u zdorovych ljudej i bolnych išemičeskoj bolezňju serdca, Kardiologia, 1S87, XXVII, č.lO, str. 48-51; Bouisson H·., De Graeve, Solera M.L. a kol. Ann.Biol.Clin., 1982, sv. 40, str. 361 - 407).
Vzhledem ke svému traumatickému charakteru a komplikovanosti provedeni je tato metoda však pro sériová vyšetřeni nevhodná.
US-PS 4458686 popisuje způsob stanoveni glukózy popř. ethanolu v krvi přímo pod kůží a na Jejím povrchu, je uváděná také možnost stanovení cholesterolu za použiti cholesteroloxidázy. Základem způsobů pro stanovení množství těchto látek jsou stechiometrické změny koncentrace kyslíku při použití specifického redoxfermentu pro analyzovaný substrát, výhodně oxidoreduktázy. Provádějí se přitom kvantitativní měřeni změn koncentrace kyslíku elektrochemicky, například polarograficky, speciálními přistrojí a pro tyto postupy zvláště vyvinutými elektrodami. Tyto potřebné komplikované přistroje vyžaduji pro stanovení diagnózy vysoce kvalifikovaný perzonál. Tyto skutečnosti vedou k omezeni použitelnosti těchto způsobů při sériových vyšetřeních.
Z publikované přihlášky PCT/US 84/00888 je znám komplex detekčního prostředku a vizuálně-indikačniho prostředku, ve kterém jsou tyto složky spojeny přímo nebo pomocí zesilovacího prostředku. Tento komplex slouži ke stanoveni malých množství specifických molekul jako například lipidů v biologických tkáních. Tento postup pro stanoveni lipidů je však možno použit jen za laboratorních podmínek a vyžaduje, aby pacientům byla napřed odebrána biologická tekutina nebo tkáň což znamená, že je způsob traumatický, vícestupňový a ve svém provedeni komplikovaný.
Údaje pro korelaci mezi obsahem cholesterolu v kůži a stupněm átherosklerotického poškozeni cév se ziskaji na kožnich bioptátech. Tento způsob je nejen traumatický, ale má Ještě řadu dalších nevýhod, jelikož 1 mm silné bioptáty obsahuji různé vrstvy kůže a sice rohovinovou vrstvu (průměrná tlouštka 0,1 mm) a pojivovou tkáň, to znamená vlastní pokožku (darma), která opět obsahuje dvě vrstvy a sice Stratům papillare a Stratům reticulare. Obě tyto vrstvy jsou dobře zásobovány krví, proto příslušné bioptáty obsahuji také cévy a krev a mimoto ještě potni a mazové žlázy jakož i jejich sekrety. Přimo pod pokožkou se nachází tkáň podkožního tuku, která někdy může patřit k bioptátu. Nehomogennost bioptátů tak může zkreslovat výsledky stanoveni cholesterolu akumulovaného v pokožce. Z tohoto hlediska je nejpřesnějši způsob, který umožňuje stanovení obsahu cholesterolu v povrchu kůže ve vrstvě rohoviny pokožky.
Podstatou vynálezu Je nalézt způsob pro výrobu afinních enzymatických sloučenin pro vizuální indikaci cholesterolu bezprostředně na kůži pacienta, zejména v rohovinové vrstvě pokožky, bez potřeby odebírání krevních a kožnich bioptátů pacientům. Pro diagnózu může být použita jakákoliv kožni oblast. Nejvhodnějši Je povrch ruky, který neobsahuje žádné mazové žlázy, jejichž sekrety stejně Jako rohovinová vrstva pokožky obsahuji cholesterol, což může ovlivňovat výsledky diagnózy.
Tato úloha byla podle vynálezu vyřešena způsobem výroby afinních enzymatických sloučenin, které představuji bifunkční sloučeniny. Tyto se selektivně vážou s volným cholesterolem pokožky pacienta a mohou pak být vizuálně sledovány. Pro výrobu takové sloučeniny
CS 274 496 B2 jsou potřebné nejméně dvě složky a sice diagnostický prostředek A, volený ze skupiny bifunkčnich látek, které při Jejich aplikaci na pokožku vytvářej! s volným cholesterolem pokožky '..'-.tř-ir' pevný komplex, a prostředek umožňující vizuální indikaci B, který umožňuje vizuální zjištěni bifunkčnich sloučenin vázaných s cholesterolem.
Sloučeniny vyrobitelnó podle vynálezu vedou k maximálnímu zjednodušení diagnostiky atherosklerozy, nejsou traumatické a nevyžaduji také žádné zvláštní vybaveni. Použiti těchto sloučenin pro diagnózu atherosklerozy umožňuje sledované osoby rozdělit do tří následujících skupin: osoby nemocné atherosklerovou, rizikové skupiny a zdravé osoby.
Afinní enzymatické sloučeniny pro vizuální indikaci cholesterolu a jejich použitím možné diagnostické způsoby (tříbodové způsoby) Jsou vhodné také pro sériovou diagnostiku. Způsob je velmi jednoduchý a nevyžaduje žádnou zvláštní kvalifikaci ze strany lékařského personálu; může být také prováděn v domácích podmínkách.
Sloučeniny podle vynálezu mohou být také připraveny z diagnostického prostředku A a z prostředku pro vizualizaci B chemickou aktivaci funkčních skupin jednoho z obou prostředků. V tomto případě se po přídavku jednoho činidla k druhému, obsahujícímu aktivované chemické skupiny při definovaných vztazích mezi množstvím činidel A a B se vytvoří pevná chemická vazba, čimž vzniknou vysokomolekulárni bifunkční sloučeniny pro vizuální indikaci na pokožce pacienta.
□ako detekční prostředek A- afinant cholesterolu přicházejí v úvahu následující sloučeniny :
steroidni glykosidy, obsahující jako aglykon cyklopentanoperhydrofenenthrenový fragment furostanolového nebo spirostanolového typu a oligosacharidový zbytek obsahující od 3 do 10 monosacharidů lineární nebo rozvětvené struktury (viz P.K.Kintja, Strojenie i biologiče9kaja aktivnost steroidnych glikozidov rjada spirostana i furostana, Kišinev, Vlg. Stinca, 1987, str. 142/nebo triterpenglykosidy, obsahující aglykon σς- nebo (5-amyryl-, lupán-, hopan-, dammaran-, linostan- nebo holostanové řady a oligosacharid ze 2 až 8 rozvětvených nebo nerozvětvených zbytků (viz G.E.Dekanosidze, V.Oa.Cirva, T.V. Sargienko,
N.I. Uvarova, Issledovanie triterpenových glikozidov, Tbilisi, Mecniereba, 1982) nebo hydrofobni proteiny, které mohou tvořit s cholesterolem selektivní komplexní sloučeninu (viz l.A.N.Klimov, G.V.Titova, K.A.Koževnikova, Biochimija, 1982, ev. 47, č. 2, str. 226- 232,
2. A.N.Klimov, K.A.Koževnikova, N.N.Klujeva a kol. Voprosy med.chimii, 1984, sv. 30, č. 3, str. 86 - 90;
3. G.V.Titova, N.N.Klujeva, K.A.Koževnikova a kol., Biochimija, 1980, sv. 45, č. 1, str.
- 55) nebo bilkovinové toxiny, které jsou schopny tvorby komplexních sloučenin 9 cholesterolem, získané z bakterií, mořských mikroorganismů, hmyzu nebo plazů (viz Μ.V.Dálin, N.G.Fiš, Belkovye toksiny mikrobov, Moskva, vyd. Medicína, 1980) nebo polyenová antibiotika, která j9ou schopna tvořit s cholesterolem selektivně komplexní sloučeninu (viz 1. □.P.Katzenstein A.M.Spiegelvogel, A.W.Norman, O.Antibiot. 27, 12,,1974, str. 943 - 951; Gong Shang-Shyng, Wang Hsi-Hua, Clin.□.Microbiol., 1976,9, (1-2), str. 19 - 30; 3. Reading □o.nephine O. a kol., Biochim.Biophis.Acta, 1982, 685 (2), 9tr. 219 - 224) nebo vysoce afinní enzymy, jejichž substrátem Je cholesterol a které k němu vykazuji vysokou afinitu).
□ako vizualizačni činidlo B přicházejí v úvahu následující enzymy: acstylcholinesteráza, tyrosinasa, glukoso-6-f09fátdehydrogenasa, glukooxidasa, glukoamylasa, galaktosidasa, psroxidasa, alkalické nebo kyselé fosfatázy, c<- chymotrypsin nebo pyrofosfatáza.
Uvedený úkol Je řešen tak, ža se detekční prostředek A- afinant cholesterolu, vybraný ze skupiny stsroidnich glykosidů, obsahujících jako aglykon cyklopsntanopsrhydrofenantrsnový zbytek furostanolové nebo spirostanolové řady a oligosacharidový zbytek, obsahujici od 3 do 10 monosacharidů přimé nebo rozvětvené struktury, nebo ze skupiny triterpenových glykosidů, obsahujících aglykon - nsbo /3 -amyryl, nsbo lupannsbo hopan- nebo dammaran nsbo linostan- nsbo holostanové řady a oligosacharid za 2 až 8
CS 274 496 B2 rozvětvených nebo nerozvětvených zbytků, nebo ze ekupiny hydrofobnich proteinů, které mohou s cholesterolem tvořit komplexní sloučeninu, nebo ze skupiny bilkovinových toxinů, získaných z bakterii, mořských mikroorganismů, hmyzu nebo plazů, které mohou tvořit s cholesterolem komplexní sloučeninu, nebo ze skupiny polyenových antibiotik, která mohou tvořit s cholesterolem selektivně komplexní sloučeninu, nebo ze ekupiny enzymů, které vykazují vysokou afinitu k cholesterolu, aktivuje chemickými metodami ve vodném prostředí v molárnim poměru detekční činidlo A : aktivátor = 1:1 - 1:10 při koncentraci detekčního činidla A 1 až 20 mg/ml při teplotě O až 25 °C, při pH o 4 až 11 po dobu 0,1 až 24 hodin a k připravenému roztoku se přidá vizualizačni činidlo B, zvolené ze skupiny fsrmentů: acetylchr ’ 1nesterasa, tyrosinasa, glukoso-6-fosfátdehydrogenasa, glukooxidasa, glukoamylasa, galaktosidasa, peroxidasa, alkalické nebo kyselé fosfatázy, -chymotrypsin nebo pyrofosfatasa v molárnim poměru A : B 20 : 1 až 1 : 1 a roztok se udržuje při teplotě od O do 25 °C po dobu 1 až 24 hodin do získáni konečného produktu.
Oak je uvedeno dřivé, předběžné chemické aktivaci se mohou podrobit i funkční skupiny vizualizačního činidla B. V takovém případě se chemická aktivace vizualizečniho činidla B provádí ve vodném prostředí při molárnim poměru vizualizačni činidlo B : aktivátor = » 1:1 - 1:10 při koncentraci vizualizačního činidla B 1 až 20 mg/ml při teplotě O až 25 °C, při pH 4 až 11, po dobu 0,1 až 24 hodin a pak se k získanému roztoku přidává detekční činidlo A, kterým je jedna z dřivé uvedených látek, v molárnim poměru A : B = = 20:1 - 1:1 a roztok se inkubuje při teplotě O až 25 °C po dobu 1 až 24 hodin do získáni konečného produktu.
Podle vynálezu se chemická aktivace detekčního prostředku A nebo vizualizačního prostředku B provádí o sobě známými postupy azidovými, karbodiimldovými sukcinimidovými nebo metodou jodistanovó oxidace.
V těch připadech, kdy se jako vizualizačni prostředek B použije vysokomolekulárni sloučenina - enzym, a Jako detekční činidlo A nizkomolekulárni sloučeniny, například glykosidy, nemůže být v molekule konečného produktu vice než jedna molekula vizualizačního činidla B. Při tom molární množství detekčního činidla A, zajištujiciho vazbu s cholesterolem pokožky v konečném produktu, může převyšovat obsah vizualizačního činidla B jen několikrát, v souladu a poětem funkčních skupin v molekule fermentu, schopných spojení s detekčním činidlem A bez 9ouča9né ztráty enzymatické aktivity. V takových sloučeninách je omezen obsah vizualizačního činidla B, jako které se použije enzym. Následkem toho Je relativně nízká citlivost získaných sloučenin a nutnost zvýšeni doby expozice při diagnos tíce.
Mezi steroidni glykosidy, používané Jako detekční činidlo A a mající ve svém složeni Jako aglykon cyklopentanperhydrofenantrenový zbytek furostanolové nebo spirostanolové řady a oligosacharidový fragment, obsahující 3 až 10 monosacharidů přimó nebo rozvětvené struktury zejména patři: agavosld A, agavosid B, agavosid C, agavosid D, agavosid F, agavosid H, agavosid G, trillin, funcosid C, funcosid D, funco3íd F, funcosid G, funcosid I, dioscin, gracillin, protodioscin, cicubasaponin, Juncosid E, juncosid H, lanatigonin, desglukodlgitonin, digitonin, gitonin, rocosid C, rocosid O, rocosid E, funcosid E, alliumosid C, polygonatonin, tigogenintetraosid, tigogeninhexaosid, capsicosid, ammumosid B, ammumosid C, ammumosid D, ammumosid E, desglukodesramnoparillin, desglukoparillin, parillin, sarsaparillosid, asparagosid C, asparagosid D, asparagosid G, asparagosid H, protoyuccosid H, yuccosid B, lanatigosid, monosid, biosid, triosid, purpureagitosid, gekogenin, rocogenin, diogenin, tigogenin, protopolygametosid, tomatonin, laxogeninlycotetraosid, alliogeninlycotetraoeid, karoteosid A, cyclosievorsiosid H, acantofilosid C, alliofusosid A, allio3pirosid A, cyclosieverslosid F, theasaponin, acantofilosid B, tigonín (celkový), glykosld rostliny Calha polypetala nebo cyclosieversiosid G.
CS 274 496 B2
Z uvedených steroidglykosidů jsou zvláště výhodné funcosid C,D,E,F,G nebo I, dioscin, roco9id, lanatigonin, digitonln a tomatonin. Nejvýhodnějšími jeou digitonin a tomatonin.
Výhodnými triterpenglykosidy, použivanými Jako detekční prostředek A, které obsahují aglykon oC- nebo amyrylové, lupanové, hopanové, dammaranové, lanostanové nebo holostanové řady a oligoeacharid se 2 až 8 rozvětvenými nebo nerozvětvenými zbytky. Jsou aescin, avenacln, theasaponin, - hederin, caulosid C, stichinosid A, cyclamin, chinovin eaponiny cukrové řepy, hypsosid i triterpenglykosidy získané z rostliny Fatsia japonica.
Výhodnými hydrofobnimi bílkovinami, které se používají Jako detekční činidlo A a jsou 3chopny tvořit selektivně s cholesterolem komplexní sloučeninu, jsou meilinové bílkoviny podle Folcha, bílkoviny lysozomů a mitochondrií, fibrinogen, immunoglobulíny, cerebron, myoglobin, cytochrom C, cytochrom P-450 nebo apobilkoviny lipoproteinů.
Z bílkovinových toxinů, použitelných jako detekční činidlo A, schopných selektivně tvořit komplexní sloučeninu s cholesterolem a získaných z bakterii, mořských mikroorganismů, hmyzu a plazů, jsou výhodnými streptolysin o, pneumolysin, listerioly3in, Θ-toxín C.I,, získaný z Perfrigens typu A a C, cf-toxin C.I. nový typ A a C, haemolysin C.I. histolyticum, haemolysin C.I, botulinum typ C a D, tetanolysin, cerebrolysin, alveolysin, turingeolysin nebo cytotoxin z aktinie Metridium senile.
Výhodnými polyenantibiotiky, použivanými jako detekční prostředek A, která mohou tvořit s choleterolem komplexní sloučeninu Jsou amphotericin B, philipin nebo nistatin.
Výhodnými vysoce afinními enzymy, které máji vysokou afinitu k cholesterolu a použivaji se jako detekční prostředek A, jsou cholesteroloxidázy, cholesterolhydrogenázy nebo cholesterolesterázy.
Z výše uvedených cholesterolafinnich detekčních prostředků A jako glykosidů, hydrofobnich proteinů, bílkovinových toxinů, polyenových antibiotik a vysoce afinnich enzymů, jsou nejvýhodnějšimi glykosidy jako chemicky nejstálejši a odolné jak vůči organickým rozpouštědlům, tak i vůči vysokým teplotám syntézy, aniž by došlo ke ztrátě Jejich schopnosti tvořit komplex 9 cholesterolem pokožky. Nízká molekulární hmotnost glykosidů umožňuje získat prostředek s vysokým molárnim obsahem detekčního činidla, což zajištuje vysoký počet bodů pro reakci prostředků s cholesterolem pokožky.
Nejvýhodnějšimi z glykosidů jsou steroidní glykosidy, které ve srovnání s triterpenickými glykosidy najúčinněji vytvářej! komplex s cholesterolem.
Hydrofobni bílkoviny, bikovinové toxiny, polyenová antibiotika a vysoce afinní enzymy se také úspěšně používají pro přípravu diagnostického činidla, ale způsob přípravy afinně enzymatické sloučeniny je poněkud omezen z důvodů jejich nizké chemické stability a možnosti jejich inaktivace. Mimo to, vysoká molekulární hmotnost těchto detekujících činidel o něco snižuje citlivost konečné sloučeniny, což zvyšuje pro indikaci cholesterolu na kůži koncentraci prostředku a dobu expozice.
3e samozřejmě snaha provádět reakce za mírných podmínek, tj. při neutrálním pH, níz ké iontové sile, nízkých teplotách a při zkrácené reakční době.
Jako vizualizačni činidlo B se používají enzymy, které reakci s detekčním činidlem A poskytnou afinně enzymatický produkt pro vizuální indikaci cholesterolu na kůži pacienta, které jeou vybrány ze souboru, který tvoři: acetylcholinesteráza, tyrosinázy, glukoso-6-fosfátdehydrogenázy, glukooxidáza, glukosoamyláza, galaktosidáza, peroxidáza, alkalické nebo kyselé fosfatázy,X-chymotrypsin nebo pyrofoefatáza.
Všechny tyto enzymy mohou být použity e libovolným výše uvedeným detekčním činidlem A, výhodnými jsou však steroidní glykosidy,
Nejvýhodnějšimi jsou sloučeniny, ve kterých se Jako afflnně-detekčni činidlo A poCS 274 496 B2 uživaji ateroidni glykosidy, mající Jako aglykon cyklopentanoperhydrofenatrenový zbytek furostanolové nobo splrostanolovó řady a oligosachoridový fragment o sáhující od 3 do 10 nerozvětvených nebo rozvětvených monosacharidů.
Takové steroidni glykosidy vykazuji vysokou chemickou stabilitu a mohou být zmobilizovány na zesítujici polymer za tvrdých podmínek, tj. při vysokých teplotách a je-li to potřebné rozpuštěním v organických rozpouštědlech, což zajištuje jejich vysoký obsah v konečném produktu.
Molárni poměry složek, účastnicích se reakce, se voli podle molekulárních hmotností zvolených činidel A nebo 8, stupně afinity k cholesterolu kůže a aktivity zvoleného enzymu .
Vynález je dále objasněn pomocí příkladů provedeni a obrázků, které představuji: obr. 1 - použité značky obr. 2 - získané sloučeniny a jejich vzájemné reakce 9 cholesterolem na povrchu kůže pacienta .
Přiklad 1
100 mg tomatoninu (A) se smi9i 9 10 ml vody, přidá se 40 mg jodistanu sodného a udržuje ee 4 hodiny při 20 °C. K 1 ml získaného roztoku ss přidá 1 ml roztoku ςΛ-chymotrypsinu (8) (10 mg/ml) v 0,2M fosfátovém pufru Q hodnotě pH 7,5 a směs se udržuje 12 hodin při 4 °C. Získá se tak vodný roztok konečného produktu.
Přiklad 2 mg peroxidázy (B) křenu se rozpust! v 1 ml vody, přidá sa 0,5 mg jodistanu sodného a směs se udržuje 8 hodin při 4 °C. K získanému roztoku se přidá 3 mg chole9terinoxidázy (A) v 1 ml 0,2M fosfátového pufru o hodnotě pH 7,5 a směs se udržuje 12 hodin při 4 °C. Ziská se roztok konečného produktu.
Použiti sloučenin pro vizuální průkaz cholesterolu na kůži pacienta:
Diagnostika prováděná za pomoci sloučenin získaných podle vynálezu neni založena na přesném kvalitativním stanoveni cholesterolu, ale na možnosti zařazeni pacienta do Jedné ze třech skupin: nemocných aterosklerozou, rizikové skupiny a mezi prakticky zdravé lidi. Pro to, aby bylo možno zařadit pacienta do jedné z těchto tři skupin je nutné ohodnotit obsah cholesterolu v rohovinové vrstvě epidermu kůže, který je charakteristický pro každou z těchto uvedených skupin.
Proto js třeba pro každou sloučeninu připravenou podle vynálezu zvolit tři koncentra ce, které 9e dále používají. Tyto tři různé koncentrace afinně-enzymatickóho prostředku se nanášejí ve formě tři bodů na kůži pacienta, výhodně na dlaň. Maximální koncentrace po užité sloučeniny zajištuje zabarveni naneseného bodu nebo skvrny u všech lidi, tedy i u zdravých, majicich minimální obsah cholesterolu v kůži. Tato skvrna se použivá jako kontrolní skvrna pro reakci s cholesterolem. Roztok s minimální koncentraci sloučeniny připravené podle vynálezu zajištuje zabarveni pouze u pacientů, kteří jsou nemocni aterosklerozou v klinickém stupni a kteří máji nejvyšši obsah cholesterolu v kůži. Roztok, obsahující střední koncentraci sloučeniny podle vynálezu zajištuje vývoj zabarveni jak u nemocných lidi, tak i u lidi, kteři patři do rizikové skupiny (zvýšený obsah cholesterolu), ale nezajištujs zabarveni u zdravých lidi.
Na kůži pacienta se tak nanesou tři různé koncentrace sloučeniny získané podle vynálezu. Při přítomnosti Jedné zbarvené skvrny patři pacient ke skupině zdravých lidi, při přítomnosti dvou zabarvených skvrn ke skupině rizikové a při přítomnosti třech zabarvených skvrn k nemocným aterosklerozou v klinickém stadiu.
Pro provedeni diagnostiky postačí několik čtverečních centimetrů kůže, zvolených na
CS 274 496 B2 libovolné části těla. Oako nejvýhodnějši so jevi vnitřní 9trana ruky, která je snadno dostupná a mimoto neobsahuje tukové žlázy.
Sloučenina získaná podle vynálezu se nanáší na povrch kůže ve třech různých koncentracích v množství 10 až 20 /Ul/ a inkubuje se po dobu 1 minuty. Přebytek sloučeniny, který nezreagoval s cholesterolem kůže se smyje. Pro vizualizaci sloučeniny získané podle vynálezu, zreagované s cholesterolem kůže, sa na tyto části povrchu nanáší substrát odpovídajícího enzymu, používaného jako vizualizačni činidlo B, při přípravě uvedené sloučeniny, který reaguje za vzniku zbarveného produktu, vzniklého enzymatickou reakci se sloučeninou připravenou podle vynálezu. /T.T.Ngo a H.M.Lenhoff, Enzyme-mediated Immunoassay, 1985, Plenům Press, New York, v ruském překladu této knihy str. 11 a A.Leninger “Biochemie, nakl. Mir, Moskva 1976, str. 198/.
Podle zvoleného substrátu enzymatické reakce se bezbarvý roztok substrátu barvi na červený, žlutý, modrý, zelený, fialový nebo roztok Jiných barev, nebo se barevný roztok odbarvuje.
Jestliže se například Jako vizualizačni činidlo B použije peroxidáza křenu, pak může být jako substrát tohoto enzymu použit jakýkoliv z dále uvedených roztoků ihned po přípravě :
roztok 1: ABTS (2,2’-azinobis-)3-ethyl-benzthiazolin-6-sulfonová kyselina)) 1 mM, 0,002 % peroxidu vodíku ve fosfátocitrátovém tlumivém roztoku o pH » 4,3, roztok 2: o-fenylendiamin 4 mM, 0,004 % peroxidu vodíku ve fosfátocitrátovém tlumivém roztoku o pH b 5, roztok 3: 3,3', 5,5z-tetramethylenbenzidin 0,4 mM, 0,004 % peroxidu vodíku v acetátovém pufru o pH = 6,0.
□sou však také známy i jiné substráty peroxidázy, používané v imunoenzymatické analýze v širokém rozsahu, které je možno použit při postupu podle vynálezu.
□eetliže se jako vizualizačni činidlo B při výrobě afinně-enzymatické sloučeniny pro vizuální průkaz cholesterolu použije alkalická fosfatóza, může být jako substrát pro tento enzym použit roztok obsahující p-nitrofenolfosfát (2,5 mM) a chlorid hořečnatý (0,5 mM) v diethylaminovém tlumivém roztoku (pH π 9,5), nebo jakýkoliv jiný substrát alkalické fosfatázy používaný v imunoenzymatické analýze.
Výsledky výzkumu zuji vysokou korelaci škozeni cév.
200 lidi s ověřenou diagnózou, které jsou uvedeny v tabulce, dokapředí.ožené diagnostické metody, se stupněm aterosklerotického poTabulka ischemickó
| rodinně | iechemic- | ischemie | srdeční choro- | zdravé | |||
| podmíněná | ischemická | ké 9rdeč- | dolních | ba+hypertonio+ | osoby | ||
| hyperlipi- | srdeční | hyper- | ni choro- | končetin | ischemická cho· | ||
| demie | choroba | tonie | ba+hyper- | roba dolních | |||
| tonie | končetin | ||||||
| počet pacientů | 9 | 7 | 44 | 30 | 8 | 66 | 30 |
| M | 5 | 2 | 13 | 12 | - | - | 15 |
| 2 | 4 | 5 | 31 | 18 | 8 | 66 | 15 |
| průměrný věk | 2-45 M-40 | 2-55 M-47 | 2-50 M-52 | 2-54 M-52 | 48 | 54 | 2-24 M-26 |
| plasmový choleste- rol | 421,4+ 135,6“ | 252,0+54,6 | 238,4+51,4 | 290,5+78,6 | 218,6+ 51,5” | 239,6+ 41,3“ | 188,0+34,1 |
| index atheroge- | 10,0+3,3 | 5,4+1,9 | 5,4+1,7 | 7,6+2,9 | 5,1 + 1 | .,8 5,7+2,6 | 3,6+1,3 |
CS 274 496 B2
Tabulka - pokračováni rodinně podmíněná hyperlipidemie ischemická srdeční choroba hypertonie ischemická srdeční choroba + hypertonie ischemie dolních končetin ischemická zdravé srdeční choro- osoby ba+hypertonie+ ischemická choroba dolních končetin
| zkouška | 3 skvrny | 3 skvrny | 3 | skvrny | 3 | skvrny | 3 | skvrny | 3 skvrny | 1 skvrna |
| na kůži podle | u všech | u 3 | u | 10 | u | 24 | u | 6 | u všech | u všech |
| vynálezu | osob | 2 skvrny | 2 | skvrny | 2 | skvrny | 2 | skvrny | oeob | osob |
u4 u3 u6 u2
Ž - ženy, M - muži
Claims (2)
1. Způsob přípravy afinně enzymatických sloučenin pro vizuální indikaci cholesterolu na povrchu kůže pacienta na bázi detekčního činidla a vizualizačniho činidla, vyznačující se tím, že se afinní detekční činidlo A zvolené ze skupiny, která zahrnuje steroidni glykoeidy majici ve svém složeni jako aglykon cyklopentanperhydofenantrenový zbytek furostanolové nebo spirostanolové řady a oligosacharidový fragment obsahující 3 až 10 monosacharidů přimé nebo rozvětvené řady, .-..•ihrnujicl agavosid A, agavosid 8, agavosid C, agavosid D, agavosid F, agavosid H, agavosid G, trillin, funcoaid C, funcoeid F, funcosid G, funcosid 1, dioscin, gracillln, protodioscin, cicubasaponin, juncoeid E, juncosid H, lanatigonin, deaglukodigitonin, digitonin, gitonin, rocosid C, rocosid D, rocosid E, funcosid E, alliumosid C, polygonatonin, tigogenintetraosid, tigogeninhexaosid, capsicosid, ammunoeid B, ammunosid C, ammunosid D, ammunosid E, dssglukodssramnoparillin, desglukoparillin, parillin, sarsaparillosid, aeparagosid C, asparagosid G, asparogosid H, protoyuoccosid H, yuoccosid B, lanatigosid, monosid, bíosid, triosid, purpureagitosid, gekogenin, rocogenin, diogenin, tigogenin, protopolygametoeid, tomatonin, laxogeninlycotetraosid, alliogeninlycotetraoeid, karoteosid A, cyclosieversiosid H, acantofilosid C, alliofusosid A, alliospirosid A, cyklosieversioeid F, theasaponin, acantofilosid B, tigonin (celkový), glykosid rostliny Calha polypetala nebo cyklosieversiosid G, nebo ze skupiny trlterpenglykosidů, obsahujících aglykon 0<- nsbo /S-amyrylové, lupanové, hopanové, damaranové, lanostanové nabo holostanové řady a oligosacharid se 2 až 8 rozvětvenými nebo nerozvětvenými zbytky, zahrnující následující soubor lótok aescin, avenacin, theasaponin, - hederin, caulosid C, stichino3id A, cyclamin, chinovin, saponiny cukrové řepy, hyposid i triterpenglykosidy ziskané z rostliny Fgtsia japonica, detekční činidlo A Je dále voleno ze skupiny hydrofobnich bílkovin, kterými jsou meilinové bílkoviny podle Folcha, bílkoviny lysozomů a mitochondrii, fibrinogen, lmmunoglobuliny, cerebron, myoglobin, cytochrom C, cytochrom P-450 nebo apoproteiny lipoproteinů, ze skupiny bílkovinných toxinů schopných tvořit komplexní sloučeninu s cholesterolem, které lze získat z bakterii, mořských mikroorganismů, hmyzu a hadů, která zahrnuje streptolysin o-, pneumolysln, listeriolysin, Φ-toxin C.I. získaný z Perfringons typu A a C, ^toxin C.I. nový typ A a C, hasmolysin C.I.histolyticum, haemolysin C.I.botulinum typ C a O, tetanolysin, cerebrolysln, alveolysin, turingsolysin nobo cytotoxin z aktinie Metridium senile,
CS 274 496 B2 za skupiny polyenantibiotik zahrnující amphotaricin B, philipin nebo nistatin, za skupiny enzymů majících vysokou afinitu k cholesterolu, zahrnujici cholesteroloxidázy, cholestarolhydrogenázy nabo cholesterolesterázy, aktivuje ve vodném mediu při molárnim poměru detekční činidlo A : aktivátor = 1:1 až 1:10, při koncentraci detekčního činidla A od 1 do 20 mg/ml při teplotě od O do 25 °C hodnotě pH č až 11, po dobu 1 až 24 hodin, zigkaný roztok sa nechá reagovat s vizualizačnim činidlem B, vybraným ze skupiny enzymů, kterou tvoři acetylcholinesteráza, tyrosináza, glukozo-6-fosfátdehydrogenázy, glukosooxidáza, glukozoamyláza, galaktosidáza, peroxidáza, alkalická nebo kyeelá foafatáza, c<- chymotrypein nebo pyrofo3fatáza, v molárnim poměru A:B = 20:1 až 1:1 a ziekaný roztok se udržuje 1 až 24 hodiny při teplotě od O do 25 °C, přičemž Je možno ve stupni aktivace zaměnit činidle A detekčním činidlem B.
2. Způsob podle bodu 1, vyznačující sa tim, že se vizualízačni činidlo vybrané ze souboru uvedeného v bodě 1 aktivuje ve vodném mediu při poměru vizualizačni činidlo B : ak tivátor 1:1 až 1:10 a při koncentraci vizualizačniho činidla B od 1 do 20 ng/ml při teplotě od O do 25 °C a pří hodnotě pH od 4 do 11 po dobu 1 až 24 hodin a získaný roz tok se nechá reagovat s detekčním činidlem A zvoleným ze souboru uvedeného v bodě 1, v molárnim poměru A:B » 20:1 až 1:1 a roztok se udržuje při O až 25 °C po dobu 1 až 24 hodin.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS503989A CS274504B2 (en) | 1988-01-19 | 1989-08-30 | Preparation of enzymatic compounds for cholesterol optical indication |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU884357046A SU1675769A1 (ru) | 1988-01-19 | 1988-01-19 | Способ получени средства дл визуальной индикации холестерина на поверхности кожи |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS34889A2 CS34889A2 (en) | 1990-08-14 |
| CS274496B2 true CS274496B2 (en) | 1991-04-11 |
Family
ID=21347013
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS34889A CS274496B2 (en) | 1988-01-19 | 1989-01-18 | Method of affinitive-enzymatic compounds preparation for cholesterol's visul indication |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0338189B1 (cs) |
| JP (1) | JPH01289498A (cs) |
| CN (1) | CN1048925A (cs) |
| AT (1) | ATE137336T1 (cs) |
| AU (1) | AU615709B2 (cs) |
| CA (1) | CA1335968C (cs) |
| CS (1) | CS274496B2 (cs) |
| DD (1) | DD289604A5 (cs) |
| DE (1) | DE58909664D1 (cs) |
| FI (1) | FI890266A (cs) |
| HU (1) | HUT56973A (cs) |
| PL (1) | PL277263A1 (cs) |
| SU (2) | SU1675769A1 (cs) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5489510A (en) * | 1988-01-19 | 1996-02-06 | 2860601 Canada Inc. | Method for visual indication of cholesterol on skin surface agents used therefor and methods for producing such agents |
| RU94044169A (ru) | 1994-12-16 | 1996-10-20 | И.А. Кочетов | Многослойный аналитический элемент |
| LT4121B (en) | 1995-06-01 | 1997-03-25 | Akcine Bendrove Biofa | Kit for the cholesterol vizualization on the skin and process for preparing conjugate for use in cholesterol determination |
| RU2130189C1 (ru) * | 1997-02-20 | 1999-05-10 | Александр Сергеевич Парфенов | Способ определения тканевого холестерина кожи |
| CA2465427A1 (en) * | 2004-04-28 | 2005-10-28 | Imi International Medical Innovations Inc. | Direct assay of cholesterol in skin samples removed by tape stripping |
| CN100564539C (zh) * | 2004-12-31 | 2009-12-02 | 浙江伊利康生物技术有限公司 | 高密度脂蛋白中胆固醇的测定试剂及制备方法 |
| CN104181312B (zh) * | 2014-08-08 | 2016-06-01 | 安徽易康达光电科技有限公司 | 一种用于动脉粥样硬化风险评估的皮肤游离胆固醇无创检测装置 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4071020A (en) * | 1976-06-03 | 1978-01-31 | Xienta, Inc. | Apparatus and methods for performing in-vivo measurements of enzyme activity |
| US4458686A (en) * | 1979-08-02 | 1984-07-10 | Children's Hospital Medical Center | Cutaneous methods of measuring body substances |
| US4401122A (en) * | 1979-08-02 | 1983-08-30 | Children's Hospital Medical Center | Cutaneous methods of measuring body substances |
| EP0118543A1 (en) * | 1982-09-01 | 1984-09-19 | University Of Southern California | Substituted n-benzenesulfonyloxyphthalimides |
-
1988
- 1988-01-19 SU SU884357046A patent/SU1675769A1/ru active
- 1988-01-19 SU SU4357046K patent/SU1675770A1/ru active
-
1989
- 1989-01-18 AU AU28578/89A patent/AU615709B2/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-01-18 DD DD89325117A patent/DD289604A5/de not_active IP Right Cessation
- 1989-01-18 CS CS34889A patent/CS274496B2/cs unknown
- 1989-01-18 DE DE58909664T patent/DE58909664D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-01-18 FI FI890266A patent/FI890266A/fi not_active IP Right Cessation
- 1989-01-18 EP EP89100828A patent/EP0338189B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-01-18 AT AT89100828T patent/ATE137336T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-01-19 JP JP1008737A patent/JPH01289498A/ja active Pending
- 1989-01-19 PL PL27726389A patent/PL277263A1/xx unknown
- 1989-01-19 HU HU89212A patent/HUT56973A/hu unknown
- 1989-01-19 CA CA000588652A patent/CA1335968C/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-07-15 CN CN89106704.3A patent/CN1048925A/zh active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0338189A2 (de) | 1989-10-25 |
| HUT56973A (en) | 1991-10-28 |
| CN1048925A (zh) | 1991-01-30 |
| DE58909664D1 (de) | 1996-05-30 |
| CS34889A2 (en) | 1990-08-14 |
| FI890266A (fi) | 1989-07-20 |
| SU1675770A1 (ru) | 1991-09-07 |
| CA1335968C (en) | 1995-06-20 |
| EP0338189A3 (en) | 1990-05-02 |
| ATE137336T1 (de) | 1996-05-15 |
| JPH01289498A (ja) | 1989-11-21 |
| AU615709B2 (en) | 1991-10-10 |
| FI890266A0 (fi) | 1989-01-18 |
| DD289604A5 (de) | 1991-05-02 |
| PL277263A1 (en) | 1989-09-04 |
| EP0338189B1 (de) | 1996-04-24 |
| SU1675769A1 (ru) | 1991-09-07 |
| AU2857889A (en) | 1989-07-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Dahlqvist | A method for the determination of amylase in intestinal content | |
| Price et al. | The demonstration of multiple heat stable forms of N-acetyl--glucosaminidase in normal human serum. | |
| Dalaker et al. | A novel form of factor VII in plasma from men at risk for cardiovascular disease | |
| Sundberg et al. | Immunohistochemical localization of α and φ class glutathione transferases in normal human tissues | |
| US5489510A (en) | Method for visual indication of cholesterol on skin surface agents used therefor and methods for producing such agents | |
| Leoncini et al. | Hyperactivity and increased hydrogen peroxide formation in platelets of NIDDM patients | |
| Elander et al. | Biochemical and morphometric properties of mitochondrial populations in human muscle fibres | |
| Homburger | Evaluation of diagnostic tests for cancer. I. Methodology of evaluation and review of suggested diagnostic procedures | |
| CS274496B2 (en) | Method of affinitive-enzymatic compounds preparation for cholesterol's visul indication | |
| Chen et al. | Increased serum carnitine concentration in renal insufficiency. | |
| Miller | The relationship between catalase and haemoglobin in human blood | |
| Meyer et al. | Rapid laboratory diagnostic of X-linked ichthyosis | |
| Da Silva et al. | Schistosoma mansoni: activation of the alternative pathway of human complement by schistosomula | |
| Kratz | Coumarin-7-hydroxylase activity in microsomes from needle biopsies of normal and diseased human liver | |
| Bouissou et al. | Identifying arteriosclerosis and aortic atheromatosis by skin biopsy | |
| Weaver et al. | Aged amylase: a valuable test for detecting and tracking pancreatic pseudocysts | |
| Chan et al. | Resistance to levamisole (R12456) in heat-stable alkaline phosphatases | |
| CS274504B2 (en) | Preparation of enzymatic compounds for cholesterol optical indication | |
| Baker et al. | The cholesterol of hyaline arteriolosclerosis | |
| Lijnen et al. | Biological significance of active and inactive renin in man | |
| Anderson et al. | Preparation and the Hæmoglobin Content of Red Cell ‘Ghosts’ | |
| Trujillo et al. | Hormonal regulation of the contractile response induced by okadaic acid in the rat uterus | |
| RU2170935C1 (ru) | Способ дифференциальной диагностики деструктивных изменений при остром холецистите | |
| FLESCH et al. | Further studies of epidermal mucopolysaccharides | |
| Leather | Hypertension in adult Africans in Uganda |