CS274504B2 - Preparation of enzymatic compounds for cholesterol optical indication - Google Patents
Preparation of enzymatic compounds for cholesterol optical indication Download PDFInfo
- Publication number
- CS274504B2 CS274504B2 CS503989A CS503989A CS274504B2 CS 274504 B2 CS274504 B2 CS 274504B2 CS 503989 A CS503989 A CS 503989A CS 503989 A CS503989 A CS 503989A CS 274504 B2 CS274504 B2 CS 274504B2
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- cholesterol
- group
- agent
- solution
- compounds
- Prior art date
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
CS 274 504 82
Vynález se týká bioorganické chemie a sice způsobu výroby afinních enzymatických sloučenin pro vizuální indikaci cholesterolu na povrchu kůže pacientů na bázi indikačnirho prostředku, který je afinní s cholesterolem, prostředku pro vizuální indikaci, které jsou spojeny pomocí zesítujiciho činidla.
Nejdůležitější může být použiti sloučenin podle vynálezu v diagnostice, k čemuž patři také včasné rozpoznání atherosklerozy, ke zpřesněni diagnózy za klinických, ambulantních a domácích podmínek, jakož i ke kontrole průběhu léčby. Uvedené sloučeniny mohou být také použity při fyziologických, histologických a histochemických výzkumech ke stanoveni zvýšeného obsahu cholesterolu a jeho lokalizaci. Mimoto tyto sloučeniny také umožňuji stanovení sníženého obsahu cholesterolu u pacientů se'zjištěnými chorobami, zejména onkologického charakteru.
Atheroskleroza a jeji komplikace jako infarkty, inzulty a gangrény, jsou hlavni příčinou úmrtnosti obyvatelstva ve všech zemích světa.
Mnohaleté výzkumy vedly ke zjištěni, že atheroskleroza patři k chorobám, které je třeba zjistit a bojovat proti nim, přičemž hlavním faktorem rizika atherosklerozy je akumulace cholesterolu v organismu. Profylaxe atherosklerozy u obyvatelstva epočivá v tom, že se mezi pacienty zjistí ti, kteři patři k nejvíce ohrožené rizikové ekupině, tito se individuálně ošetři a postiženi pacienti zrněni svůj způsob života. Stanoveni skupin pacientů se zvýšeným rizikem atherosklerozy na základě množství cholesterolu akumulovaného v organismu je nejobtižnějšim problémem profylaxe atherosklerozy. Známé metody diagnostiky athorosklerozy se zakládají na kvantitativním stanoveni celkového cholesterolu v plasmě žilní krve (viz Consensus Conference on Lowering Qlaod Cholesterol to Prsvent Heart Desease, GAMA, 1985, 253, str. 2080 - 2086; The Lipid Research Clinics Population Studios Data Book; Publicatin 00-152, Bethesda, Ma., National Institutes of Health, 1980, sv. 1; Lipid Research Clinics Programm, SAMA, 1984, 251, str. 351 - 364). Obsah cholesterolu nad 260 mg je považován za dostatečný pro to, aby pacienti byli počítáni k rizikové skupině. Podrobnější diagnóza se stanov! na základě analýzy lipoproteinů krevni plasmy a stanoví se index atherogenity, který je formulován jako poměr rozdílu celkového obsahu cholesterolu (CHc el} a cholesterolu lipoproteinů vysoké hustoty (CH^^) k cholesterolu lipoproteinů vysoké hustoty:
Chcel Chlvh Iather. '' 1 L’J cnlvh
Při hodnotě indexu atherogenity nad 3 ja pacient považován za člena rizikové skupiny a při indexu nad 5,6 k atherosklerotickým pacientům (viz Klimov A.N., Fanotipirovanie lipoproteinov”, Metodičeskia rekomendacii MZ SSSR, M., Madicina, 1975i Goldfourt V., Holtzman E., Neufeld H.N., Total and High Density Lipoprotein Cholesterol in the Sérum and Risk of Mortality, British medicinal Journal, 1985, 290, 9tr. 1239 - 1243).
Použiti těchto metod vyžaduje odběr krve, což je pro pacienty traumatické a mimoto neni zcela bezpečné vzhledem k možnosti k přenosu různých virových onemocněni. Frakcionace plasmových lipoproteinů a analýza cholesterolu představuji drahý a komplikovaný postup. Nicméně znamenají v jednom ze třech připadů zjištovaný celkový obsah cholesterolu a dokonce i výsledky celkové fenotypizace nejsou v korelaci s obtížemi atherosklerozy (viz Mjasnikov A.L., Gipertoničeskaja bolezň, 1965, M., Madicina, str. 300).
Mimoto pokusy provedené v posledních letech dokázaly, že krevni plasma v celém rozsahu nemůže úplně zobrazovat procesy akumulace cholesterolu charakteristické pro stěny artsrii a dalši bradytrofni tkáně.
Dalši zlepšeni diagnostických způsobů vyplynulo z řešeni Jednotlivých otázek pathogenese atherosklerozy. Je třeba zdůraznit, že tkáňový cholesterol hraje rozhodujíc! úlohu při
CS 274 504 B2 vzniku atherosklerozy. Mohly by být zjištěny tkáně, ktaré akumuluji cholesterol jako stěny arterií.
Výzkumy v posledních letech bylo zjištěno, že mezi obsahem cholesterolu ve stěnách arterií a v pokožce existuje těsný vztah. Toto zjištěni umožňuje objev zásadně nových diagnostických způsobů, zejména pro atherosklerozu.
Uvedený vztah mezi obsahem cholesterolu ve stěnách arterií a v pokožce byl zjištěn přimým stanovením cholesterolu v kožních bioptátech. Vzorky kůže byly zmrazený v kapalném dusíku a lyofilizovány, pak byl cholesterol extrahován Polohovým činidlem a stanoven obvyklými chemickými, popřípadě biochemickými metodami (viz Nikitin Ou.P., Gordienko I.A., Oolgov A.V., Filimonova T.I., Soděrženie cholesterina v kože i ego korrelacija s lipidnym pokozatelem syvorotki křoví u zdorovych Ijudej i bolnych išemičeskoj bolezňju serdca, Kardialogia, 1907, XXVII, č. 10, str. 48-51; Bouisson H., Oe Graeve, Solera M.L. a kol., Ann. Biol. Clin., 1982, sv. 40, str. 361 - 407).
Vzhledem ke svému traumatickému charakteru a komplikovanosti provedeni je tato metoda však pro sériová vyšetřeni nevhodná.
US-PS č. 4458686 popisuje způsob stanoveni glukózy, popřípadě ethanolu v krvi přímo pod kůži a na jejím povrchu, je uváděna také možnost stanovení cholesterolu za použiti cho lesteroloxidázy. Základem způsobů stanoveni množství těchto látek jsou stechiometrické zrně ny koncentrace kyslíku při použiti specifického redoxfermentu pro analyzovaný substrát, výhodně oxidoreduktázy. Provádějí se přitom kvantitativní měření změn koncentrace kyslíku elektrochemicky, například polarografleky, speciálními přístroji a pro tyto postupy zvláště vyvinutými elektrodami. Tyto potřebné komplikované přístroje vyžaduji pro stanoveni diagnózy vysoce kvalifikovaný personál. Tyto skutečnosti vedou k omezeni použitelnosti těchto způsobů při sériových vyšetřeních.
Z publikované přihlášky PCT/US 84/00888 je znám komplex detekčního prostředku a vizuálně-indikačního prostředku, ve kterém jsou tyto složky spojeny přímo nebo pomoci zesitovaciho prostředku. Tento komplex slouží ke stanoveni malých množství specifických molekul Jako například lipidů v ibologických tkáních. Tento postup pro stanoveni lipidů je však možno použit jen za laboratorních podmínek a vyžaduje, aby pacientům byla napřed odebrána biologická tekutina nebo tkáň, což znamená, že je způsob traumatický, vícestupňový a ve svém provedeni komplikovaný.
Údaje pro korelaci mezi obsahem cholesterolu v kůži a stupněm atherosklerotického poškozeni cév ee získají na kožních bioptátech. Tento způsob je nejen traumatický, ale má ještě řadu dalších nevýhod, jelikož 1 mm silné bioptáty obsahuji různé vrstvy kůže a sice rohovinovou vrstvu (průměrná tlouštka 0,1 mm) a pojivou tkáň, to znamená vlastni pokožku (derma), která opět obsahuje dvě vrstvy a sice Stratům papillare a Stratům reticulare.
Obě tyto vrstvy jsou dobře zásobovány krví, proto příslušné bioptáty obsahují také cévy a krev a mimoto ještě potni a mazové žlázy jakož i jejich sekrety. Přimo pod pokožkou sc nachází tkáň podkožního tuku, která někdy může patřit k dioptátu. Nehomogennost bioptátú tak může zkreslovat výsledky stanoveni cholesterolu akumulovaného v pokožce. Z tohoto hlediska je nejpřesnějši způsob, který umožňuje stanoveni obsahu cholesterolu v povrchu kůže ve vrstvě rohoviny pokožky.
Podstatou vynálezu je nalézt způsob pro výrobu afinních enzymatických sloučenin pro vizuální indikaci cholesterolu bezprostředně na kůži pacienta, zejména v rohovinové vrstvě pokožky, bez odebíráni krevních a kožních bioptátú pacientům. Pro diagnózu může být použita jakákoliv kožni oblast. Nejvýhodnějši je povrch ruky, který neobsahuje žádné mazové žlázy, jejichž sekrety stejně jako rohovinová vrstva pokožky obsahuji cholesterol, což může ovlivňovat výsledky diagnózy.
Tato úloha byla podle vynálezu vyřešena způsobem výroby afinních enzymatických sloučenin, které představuji bifunkčni sloučeniny. Tyto ee selektivně vážou s volným cholesterolem pokožky paciente a mohou pak být vizuálně sledovány. Výroba těchto sloučenin ze dvou
CS 274 504 B2 složek a to diagnostického prostředku A voleného ze skupiny bifunkčnich látek, které při · aplikaci na pokožku vytvářejí s volným cholesterolem pokožky selektivně pevný komplex a prostředku, který umožňuje vizuální indikaci B Je popsán v souvisejícím čs. patentu č. 274495.
Předmětem předloženého vynálezu je způsob afinně enzymatických sloučenin pro vizuální indikaci cholesterolu na pokožce pacienta, který se vyznačuje tím, že se spoji uvedené detekční činidlo Λ a vizualizačni činidlo B pomoci zesitujíciho činidla C zvoleného ze skupiny nizkomolekulárních asymetrických bifunkčnich sloučenin jako je bromkyan, trichlortriazin nebo 2-amino-4,6-dichlor-S-triazin, nebo vysokomolekulárnich polyfunkčních sloučenin jakými jsou polysacharidy, bílkoviny nebo syntetické polymery, tj. jakékoliv vysokomolekulárni sloučeniny, obsahující jakoukoliv z funkčních skupin zvolených ze skupiny zahrnujici primární amin, karboxyl, hydroxyl, aldehyd, hydrohalogenid, směsný anhydrid, iminoether, azid, hydrazid, maleiimid, isokyanát nebo epoxid.
V případě použiti nizkomolekulárních asymetrických bifunkčnich sloučenin je možno sloučeniny připravit dvěma způsoby: buď se nejprve detekční činidlo A spoji se zesitujícím činidlem C a pak se pro získání konečného produktu přidá k meziproduktu (A+C) vizualizační činidlo B, nebo se nejdřive připraví meziprodukt B+C a k němu se přidá detekční činidlo A. V prvním případě se afinně enzymatické sloučeniny připraví rozpuštěním ve vodném solném tlumivém roztoku o pH 5 až 9 detekčního činidla A, zvoleného z dřivé uvedených sloučenin, o koncentraci 1 až 20 mg/ml, pak se k tomuto roztoku přidá nizkomolekulárni bifunkčni zesitujici činidlo C zvolené ze skupiny, kterou tvoři bromkyan, trichlortriazin nebo 2-amino-4,6-dichlor-S-triazin v molárnim poměru A;C =» 1:0,5 - 1:10, získaný roztok se ponechá při teplotě O až 20 °C po dobu 1 až 20 hodin a pak se přidá vizualizačni činidlo B zvolené ze skupiny dřivé uvedených látek v molárnim poměru A:B c 20:1 - 1:1 a roztok se ponechá při teplotě O až 20 °C po dobu 1 až 48 hodin do ziskání konečného produktu.
Při přípravě afinně enzymatické sloučeniny přes meziprodukt B+C sa vizualizačni činidlo 8 zvolené z výše uvedených látek rozpustí ve vodném solném tlumivém roztoku o pH 5 až 9 v koncentraci vizualizačniho činidla B 1 až 20 mg/ml, pak se k roztoku přidá nizkomolekulárni asymetrické bifunkčni zesitujici činidlo C, zvolené ze skupiny zahrnujici bromkyan, trichlortriazin nebo 2-amino-4,6-dichlor-S-triazin v molárnim poměru 3:C 1:0,5 až 1:10, získaný roztok se ponechá při teplotě O až 20 °C po dobu 1 až 20 hodin a pak 3e přidá detekční činidlo A zvolené z dřivé uvedených látek v molárnim poměru A:B 20:1 až 1:1 a roztok se ponechá při teplotě O až 20 °C po dobu 1 až 48 hodin do získáni konečného produktu.
V případě, že se jako zesitujici činidlo C použiji vysokomolekulárni polyfunkční látky postupuje se tak, že se detekční činidlo A a vizualizačni činidlo v poměru A:B 20:1 až 1:1 rozpustí ve vodném solném tlumivém roztoku o pH 5 až 9 při koncentraci každého z činidel A a B 0,1 až 20 mg/ml k k získanému roztoku se přidává vysokomolekulárni polyfunkční zesitujici činidlo C, kterým jsou polysacharidy, bílkoviny nebo syntetické polymery obsahující jakoukoliv z následujících funkčních skupin: primární amin, karboxyl, hydroxyl, aldehyd, hydrohalogenid, směsný anhydrid, azid, hydrazid, maleiimid, isokyanát nebo epoxid v molárnim poměru A+B:C 1:0,5 až 1:10, získaný roztok se ponechá při teplotě O - 20 °C po dobu 1 až 20 hodin pro získáni konečného produktu.
Sloučeniny vyrobitelné podle vynálezu vedou k maximálnímu zjednodušeni diagnostiky atherosklerozy, nejsou traumatické a nevyžaduji také žádné zvláštní vybaveni. Použití těchto sloučenin pro diagnózu atherosklerozy umožňuje sledované osoby rozdělit do tři následujících skupin: osoby nemocné atherosklerozou, rizikové skupiny a zdravé osoby.
Uvedené sloučeniny pro vizuální indikaci cholesterolu a jejich použitím možné diagnostické způsoby (“tříbodové způsoby**) jsou vhodné také pro sériovou diagnostiku. Způsob je velmi Jednoduchý a nevyžaduje žádnou zvláštní kvalifikaci ze strany lékařského personálu; může být také prováděn v domácích podmínkách.
CS 274 504 82
Oako datekčni prostředek A - afinant cholesterolu přicházejí v úvahu násladujici sloučeniny:
steroidni glykosidy mající ve svém složeni jako aglykon cyklopentanperhydrofenantrenový zbytek furostanolové nebo spirostanolové řady a oligosacharidový fragment, obsahující 3 až 10 monosacharidů přimé nebo rozvětvené řady vybrané ze skupiny zahrnující agavosid A, agavosid B, agavosid C, agavosid D, agavosid F, agavosid H, agavosid G, trillin, funcosid C, íuncosid 0,- funcosid F, funcosid G, funcosid X, dioscin, gracillin, pratodioscin, cicubasaponin, juncosid E, juncosid H, lanatigonin, desglukodigitonin, digitonin, gitcnin, rocosid C, rocosid O, rocosid E, funcosid E, alliumosid C, polygonatonin, tigogenintetroasid, tinogeninhexaosid, capsicosid, ammumosid B, ammumosid C, ammumosid 0, ammumosid E, dcsglukodosrarano parillin, desglukoparillin, parillin, sarsaparillosid, asparagosid C, asparagosid D, asparagosid G, asparagosid H, protoyuccosid H, yukkosid B, lanatigosid, monosid, bicsid, triosid, , purpureagitosid, gekogenin, rocogenin, diogenin, tigogenin, protopalygametosid, tomatonin, laxogeninlycotetraosid, alliogeninlycoteraosid, karoteosid A, cyclooieversiosid H, acantofilosid C, alliofusosid A, alliospirosic* A, cyclosievorsiosid F, theasaponin, acantofilosid
B, tigonin (celkový), glykosid rostliny Calha polypetala nebo cyclosieversia3id G.
Z uvedených steroidglykosidů jsou zvláště výhodné funcosid C,D,E,F,G nebo I, dioscin, rocosid, lanatigonin, digitonin a tomatonin. Nejvýhodnějši jsou digitonin a tomatonin.
Dále je možno sloučeniny používané jako detekční prostředek A volit ze skupiny triterpsnglykosidů obsahujících aglykon oC- nebo (5- amyrylové, lupanové, hopanové, damaranové, lanostanové nebo holostanové řady a oligosacharid se 2 až 8 rozvětvenými nebo nerozvětvenými zbytky, zahrnující následující skuoinu látek: aescin, avanacin, theasaponin,cK-hederin, caulosiďC, stichinosid A, cyclamin, chinovin, saponiny cukrové řepy, hypsosid i triterpenglykosidy získané z rostliny Fatsia japonica.
Detekční činidlo je dále možno volit z hydrofobnich bílkovin, kterými jsou meilinové bílkoviny podle Fol.cha, bílkoviny lysozomů a mitochondrii, fibrinogen, immunoglobuliny, cerebron, myoglobxn, cytochrom C, cytochrom P-450 nebo spoproteiny lipoproteinů.
Dalši skupinu, ze které je možno volit detekční činidlo A tvoří bilkovinové toxiny schopné tvořit komplexní sloučeninu s cholesterolem, které lze získat z bakterií, mořských mikroorganismů, hmyzu a plazů, která zahrnuje streptolysin o, pneumolysin, listeriolysin, θ-toxin C.I. získaný z Perfringens typu A a--C, (Γ-toxin C.I. nový typ A a C, haemolysin
C. X. histolyticum, haemolysin C.I. botulinum typ C a D, tetanolysin, cerebrolysin, alveolysin, turingeolysin nebo cytotoxin z aktinie Metridium senile.
Detekčni prostředek A je dále volen ze skupiny polyenantibiotik, která mohou tvořit s cholesterolem komplexní sloučeninu a která zahrnuji amphotericin B, philipin nebo nistatin.
Oalši skupinu, ze které js možno volit detekční prostředek A tvoři enzymy, které máji vysokou afinitu k cholesterolu a které zahrnují cholestaroloxidázy, cholesterolhydrogenázy nebo cholesterolesterázy.
Z výše uvedených detekčních prostředků A Jsou *iejvýhodnějšími glykosidy jako chemicky nejstálejši a odolné vůči organickým rozpouštědlům i vůči vysokým teplotám při syntéze, kdy nedochází ke ztrátě jejich schopnosti tvořit komplex s cholesterolem pokožky. Nízká molekulární hmotnost glykosidů umožňuje získat prostředek s vysokým molárnim obsahem detekčního činidla, což zajištuje vysoký počet bodů pro reakci prostředků s cholesterolem pokožky.
Nejvýhodnějšimi z glykosidů jsou steroidni glykosidy, které ve srovnáni s triterpsnickými glykosidy nsjúčinněji vytvářejí komplex s cholesterolem.
Pro přípravu diagnostického činidla ss také úspěšně používají hydrofobni bílkoviny, bilkovinové toxiny, polyenová antibiotika a vysoce afinni enzymy (tyto sloučeniny jsou uvedeny již dřivé v textu), ale způsob přípravy afinně enzymatické sloučeniny je poněkud
CS 274 504 B2 omezen z důvodů jejich nizké chemické stability a možnosti jejich inaktivace. Mimoto, vysoká molekulární hmotnost těchto detekujících činidel o něco snižuje citlivost konečné sloučeniny, což zvyšuje koncentraci prostředku pro indikaci cholesterolu na kůži pacienta a dobu expozice.
Je samozřejmě snaha provádět reakce za mírných podmínek, tj. při neutrálním pH, nizké iontové síle, nízkých teplotách a krátké reakčni době.
Jako vizualizační činidlo B se používají enzymy, které reakci s detekčním činidlem A poskytnou afinně enzymatický produkt pro vizuální indikaci cholesterolu na kůži pacienta, které jsou vybrány ze souboru, který tvoři: acetylcholinesteráza, tyrosinázy, glukoso-6-fosfátdehydrogenázy, glukooxidáza, glukosoamyláza, galaktosidáza, peroxidáza, alkalické nebo kyselé fosfatázy, Ot-chymotrypsin nebo pyrofosfatáza.
Všechny tyto enzymy mohou být použity s libovolným výše uvedeným činidlem A, výhodnými jsou však steroidni glykosidy.
Použití zesitovacího činidla C rozšiřuje technologické možnosti způsobu přípravy sloučeniny pro vizuální indikaci cholesterolu na povrchu kůže pacienta ffři maximálním zachování funkční aktivity činidel A a B.
Nej výhodnějšími jsou sloučeniny, ve kterých se jako afinně-detekčni činidlo A používají steroidni glykosidy, majici jako aglykon cyklopentanoperhydrofenantrenový zbytek furostanolové nebo spirostanolové řady a oligo3acharidový fragment obsahující od 3 do 10 nerozvětvených nebo rozvětvených monosacharidů.
Takové steroidni glykosidy vykazuji vysokou chemickou stabilitu a mohou být imobilizovány na zesitujici polymer za tvrdých podmínek, tj. při vysokých teplotách a je-li to potřebné rozpuštěním v organických rozpouštědlech, což zajištuje Jejich vysoký obsah v konečném produktu. Sloučenina pro vizuální indikaci cholesterolu na povrchu kůže pacienta se připraví imobilizaúi detekčního činidla A na zesitujici činidlo C za tvrdých podmínek S následující imobilizací vizualizačniho enzymu B na produkt, obsahující zesitovaci činidlo C a detekční činidlo A za šetrných podmínek pro zachováni jeho enzymatické aktivity.
Jako zesitujici činidlo C mohou být použity asymetrické nizkomolekulárni bifunkčni sloučeniny jako například bromkyan, trichlortriazin nebo 2-amino-4,6-dichlor-S-triazin.
Použiti vysokomolekulárních polyfunkčních sloučenin jako zesitujici činidlo C umožňuje v širokém rozsahu měnit poměr detekčního činidla A a vizualizačniho činidla B ve sloučenině pro vizuální indikaci cholesterolu, například za účelem získání optimálního poměru mezi počtem center spojení sloučeniny s povrchem kůže (detekční činidlo A) a množství vizualizačniho činidla B.
Jako vysokomolekulárni polyfunkční zesitujici činidlo C sa používají polysacharidy, bílkoviny nebo syntetické polymery, tj. libovolné vysokomolekulárni sloučeniny, obsahující jakoukoliv z funkčních skupin, zvolených ze souboru, který zahrnuje: primární amin, karboxyl, hydroxyl, aldehyd, hydrohalogenid, smíšený anhydrid, iminoether, azid, hydrazid, maleimid, isokyanát nebo epoxid.
Výhodnými vysokomolekulárnimi polyfunkčními zesitujicimi činidly C jsou kopolymery akrylové kyseliny nebo maleianhydridu.
Nejvýhodnějšim vysokomolekulárnlm polyfunkčním činidlem C Je kopolymer N-vinylpyrrolidonu s maleinanhydridem. Výše uvedená zesitujici činidla C se používají s jakýmkoliv detekčním činidlem A a jakýmkoliv vizualizačnim činidlem B. Vždy se při tom ziská konečný produkt A-C-B.
Jako aktivátory detekčního činidla A a vizualizačniho činidla B sa používají sloučeniny, které převádějí funkční skupiny těchto činidel na formu schopnou reakce. Takové skupiny jako primární aminová, karboxylové nebo «(-glykolová mohou být aktivovány o sobě známými azidovými, karbodiimidovými, sukcinimidovými nebo Jodistanovými a jinými metodami.
CS 274 504 R2
Nejvýhodnějšimi jaou jodistanová a karbodiimidová metoda, jelikož tyto metody zajištují nejšetrnějši podmínky syntézy a umožňuji maximálně zachovat.^aktivitu imobilizovaného enzymu.
Pokud jde o činidlo B, jsou výhodné alkalická fosfatáza a peroxidáza. Zvláště výhodná je peroxidáza křenu.
Jako vodné solné tlumivé roztoky se používají roztoky získané ze sloučenin, které zajištuji tlumivý účinek v intervalu pH 5 až 9 a které nevyvolávají inaktivaci nebo inhibici enzymů. Takovými roztoky mohou být například borátový, citrátový, fosfátový a dalši tlumivé roztoky. Obvykle se používají vodné solné roztoky n koncentraci soli, která zajištuje stabilní hodnotu pH roztoku po dobu imobilizace, ale koncentrace přitom nesmi přestoupit hodnoty, při kterých dochází k denaturaci enzymu.
Některá z detekčních činidel A, jako steroidni glykosidy a polyenová antibiotika se špatně nebo neúplně rozpouštějí ve vodě, proto se pro Jejich rozpuštění používají organická rozpouštědla. Oako taková rozpouštědla mohou být použita polární aprotická rozpouštědla jako například dimethylsulfoxid, dimethylformamid, hexamethanol, směs dimethylformaldehydu s toluenem v poměru 2:1 nebo směs dimethylformamidu s hexanem v poměru 2:1.
Podmínky způsobu přípravy sloučeniny pro indikaci cholesterolu (teplota, doba inkubace) závis! na volbě složek A, B a C. Použiti enzymů jako vizualizačního Činidla B omezuje reakčnl teplotu do 20 °C. Reakce se výhodně provádí při 4 °C v tlumivých roztocích o pH 5 až 9. Použiti syntetických polymerů jako zesilujícího činidla C a glykosidů jako detečniho činidla A umožňuje provádět reakci v organických rozpouštědlech a při vysokých teplotách (do 120 °C) a volit reakčnl dobu tak, aby byla dostatečná pro maximální výtěžek konečného produktu.
Molárni poměry složek účastnicích se reakce, se voli podle molekulárních hmotností zvolených činidel A nebo B, stupně afinity k cholesterolu kůže a aktivity zvoleného enzymu.
Vynález je dále objasněn pomoci příkladů provedeni.
Přiklad 1 mg polyakrylové kyseliny (C) se rozpustí v 10 ml acetátového pufru o hodnotě pH 4,8 a přidá se 15 mg n-cyklohexyl-N -/2-morfclinyl-/4-ethyl/-karbodiimid-m-p-toluensulfonátu. Směs se udržuje 1,5 hodiny při O °C. I< získanému roztoku se přidá 5 ml pufru, který obsahuje 5 mg O-streptolysinu (A) a 5 mg peroxidázy (B) z křenu. Roztok se udržuje 2 hodiny při 20 °C, ziská se tak konečný produkt.
Přiklad 2
100 mg agavoeidu G (A) se smísí s 5 ml vody a přidá se 100 mg bromkyanu (C), hodnota pH se udržuje na 11 přidáváním 1M roztoku hydroxidu sodného. Směs se udržuje 30 minut při 4 °C, hodnota pH se uprav! na 8,5 přidáním kyseliny fosforečně. K 1 ml takto připraveného roztoku se přidají 3 ml roztoku fosfátového pufru (0,5M) o hodnotě pH 0,5, obsahujícího G mg alkalické fosfatázy (B). Směs se udržuje 12 hodin při 4 °C, získá se roztok konečného produktu.
Přiklad 3
500 mg nistatinu (A) a 250 mg kopolymerizátu ethylenu a anhydridu kyseliny maleinové se rozpustí v 5 ml dimethylformamidu a udržuje se 3 hodiny při 50 °C v proudu argonu. Produkt se vyloučí 20 ml etheru a suši se ve vakuu při 20 °C. Přidá se 1 ml roztoku /1-galakto sidázy (B) (2 mg/ml) v 0,2M fosfátovém pufru o hodnotě pH 7,5 k G ml získaného produktu a udržuje ss 12 hodin při 4 °C. Ziská ss tak roztok konečného produktu.
CS 274 504 B2
Příklad 4 mg aescinu (A) a 100 mg kopolymerizátu N-vinylpyrrolidonu a anhydridu kyseliny maleinové (C) se rozpustivv 1 ml OMSO a udržuje se 2 hodiny při 100 °C. Získaný produkt se vyloučí 3 ml acetonu a suší se nad oxidem fosforečným 4 hodiny při 100 °C ve vakuu.
K 1 ml roztoku tA-chymotrypsinu (B) (1 mg/ml) v 0,2M fosfátovém pufru o hodnotě pH = 7,5 se přidá 8 mg získaného produktu a směs se udržuje při 6 °C po dobu 15 hodin. Získá se roztok konečného produktu.
Použiti sloučenin pro vizuální průkaz cholesterolu na kůži pacienta:
Diagnostika prováděná za pomoci sloučenin získaných .podle vynálezu není založena na přesném kvalitativním stanoveni cholesterolu, ale na možnosti zařazení pacienta do jedné ze třech skupin: nemocných aterosklerozou, rizikové skupiny a mezi prakticky zdravé lidi. Pro to, aby bylo možno zařadit pacienta do jedné z těchto tři skupin je nutné ohodnotit obsah cholesterolu v rohovinové vrstvě epidermu kůže, který je charakteristický pro každou z těchto uvedených skupin.
Proto je třeba pro každou sloučeninu připravenou-podle vynálezu zvolit tři koncentrace, které se dále používají. Tyto tři různé koncentrace afinně-enzymatického prostředku se nanášejí ve formě tři bodů na kůži pacienta, výhodně na dlaň. Maximální koncentrace použité sloučeniny zajišťuje zabarveni naneseného bodu nebo skvrny u všech lidi, tedy i u zdravých, majících minimální obsah cholesterolu v kůži. Tato skvrna ss použivá jako kontrolní skvrna pro reakci s cholesterolem. Roztok s minimální koncentraci sloučeniny připravené podle vynálezu zajištuje zabarvení pouze u pacinetů, kteři jsou nemocni aterosklerozou v klinickém stupni a kteři mají nejvyšši obsah cholesterolu v kůži. Roztok obsahující střední koncentraci sloučeniny podle vynálezu, zajištuje vývoj zabarveni jak u nemocných lidi, tak i u lidi, kteři patři do rizikové skupiny (zvýšený obsah cholesterolu), ale nezajišťuje zabarveni u zdravých lidi.
Na kůži pacienta se tak nanesou tři různé koncentrace sloučeniny získané podle vynálezu. Při přítomnosti jedné zabarvené skupiny patři pacient ke skupině zdravých lidi. při přítomnosti dvou zabarvených skvrn ke skupině rizikové a při přítomnosti tři zabarvených skvrn k nemocným aterosklerozou v klinickém stadiu.
Pro provedeni diagnostiky postačí několik čtverečních centimetrů kůže, zvolených na libovolné části těla. Dako nejvýhodnějši se jevi vnitřní strana ruky, která je snadno dostupná a mimoto neobsahuje tukové žlázy.
Sloučenina získaná podle vynálezu se nanáši na povrch kůže ve -třech různých koncentracích v množstvi 10 až 20 ^ul/ a inkubuje so po dobu 1 minuty. Přebytek sloučeniny, který nezreagoval s cholesterolem kůže se smyje. Pro vizualizaci .sloučeniny získané podle vynálezu, zreagované s cholesterolem kůže, se na tyto části povrchu nanáší substrát odpovídajícího enzymu, používaného jako vizualizačni činidlo při přípravě uvedené sloučeniny, který reaguje za vzniku zbarveného produktu, vzniklého enzymatickou reakcí se sloučeninou připravenou podle vynálezu (T.T.Ngo a H.M.Lenhoff, Enzyme-mediated Immunoassay. 1985, Plenům Press, New York, v ruském překladu této knihy str. 11 a A. Leninger Biochemie, nakl. Mir, Moskva 197B, str. 198).
Podle zvoleného substrátu enzymatické reakce se bezbarvý roztok substrátu barvi na červený, žlutý, modrý, zelený, fialový nebo roztok jiných barev, nebo ae barevný roztok odbarvuje.
Jestliže se například jako vizualizačni činidlo 8 použije peroxidáza křenu, pak může být jako substrát tohoto enzymu použit Jakýkoliv z dále uvedených roztoků ihned po přípravě:
roztok 1: ABTS /2,2'-azinobis-(3-athyl-benzthiazolin-6-aulfonová kyselina)/ lmM, 0,002 % peroxidu vodiku ve fosfátocitrátovém tlumivém roztoku o pH 4,3,
CS 274 504 B2 roztok 2: o-fenylendiamin 4 mM, 0,004 % peroxidu vodiku ve fosfátocitrátovém tlumivém roztoku o pH = 5, roztok 3: 3,3*, 5,5*-tetramethylenbenzidin 0,4 mM, 0,004 % peroxidu vodiku v acetátovém pufru o pH » 6,0,
Osou však taká známy i jiné substráty peroxidázy, používané v imunoenzymatické analýze v širokém rozsahu, které je možno použit při postupu podle vynálezu, □estliže se jako vizualični činidle B při výrobš afinně-enzymatické sloučeniny pro vizuální průkaz cholesterolu použije alkalická fosfatáza, může být jako substrát pro tento enzam použit roztok obsahující p-nitrofenolfosfát (2,5 mM) a chlorid horečnatý (0,5 mM) v diethylaminovém tlumivém roztoku (pH = 9,5), nebo jakýkoliv jiný substrát alkalické fosfatázy používaný v imunoenzymatické analýze.
Výsledky výzkumu 200 lidi s ověřenou diagnózou, které jsou uvedeny v tabulce, dokazují vysokou korelaci předložené diagnostické metody, se stupněm aterosklerotického poškození cév.
Tabulka rodinně podmíněná ischemickó hypertonie ischemická ischemie ischemická zdravé hyperlipidemie srdeční cho- srdeční cho- dolních srdeční osoby roba roba+hyper- končetin choroba* tonie hypertonie +ischemická choroba dolních končetin počet
pacientů 9 7 44 30 8 66 30 M 5 2 13 12 - - 15 Ž 4 5 31 18 8 66 15 průměrný věk 2-45 M-40 2-55 M-47 Ž-50 M-52 2-54 M-52 48 54 Ž-24 M-26 plasmový cholesterol 421,4+135,6 252,0+54,6 238,4.+51,4 290,5+78,6 218,6+51,5 239,6+ 41,3” 188,0+ 34,0” index athorogenity 10,0+3,3 5,4+1,9 5,4+1,7 7,6+2,9 5,1+1,8 5,7+2,6 3,6+1,3 zkouška naCS 274 504 82
The invention relates to bioorganic chemistry, namely to a method for producing affinity enzymatic compounds for the visual indication of cholesterol on the skin surface of patients based on an indicator composition that is affinity with cholesterol, a visual indicating means which are linked by a crosslinking agent.
Most important may be the use of the compounds of the invention in diagnostics, including early recognition of atherosclerosis, to refine the diagnosis under clinical, outpatient and home conditions, as well as to control the course of treatment. The compounds may also be used in physiological, histological and histochemical investigations to determine elevated cholesterol content and localization. In addition, these compounds also allow the determination of the reduced cholesterol content in patients with established diseases, in particular of oncological nature.
Atherosclerosis and its complications such as heart attacks, insults and gangrene are the main cause of population mortality in all countries of the world.
Many years of research have found that atherosclerosis is one of the diseases that need to be identified and combated, with the accumulation of cholesterol in the body as a major risk factor for atherosclerosis. The prophylaxis of atherosclerosis in the population is that patients who are among the most vulnerable at risk are identified among the patients, who are individually treated and affected by their lifestyle. Determining groups of patients at increased risk of atherosclerosis based on the amount of cholesterol accumulated in the body is the most difficult problem in the prophylaxis of atherosclerosis. Known methods for diagnosing athorosclerosis are based on quantitative determination of total cholesterol in venous blood plasma (see Consensus Conference on Lowering Qlaod Cholesterol's Prsvent Heart Desease, GAMA, 1985, 253, pp. 2080-2086; The Lipid Research Clinics Population Studios Data Book; 00-152, Bethesda, Ma., National Institutes of Health, 1980, Vol 1; Lipid Research Clinics Program, SAMA, 1984, 251, pp. 351-364). Cholesterol levels above 260 mg are considered sufficient for patients to be counted at risk. A more detailed diagnosis with the statutes! based on analysis of lipoprotein blood plasma determined atherogenity index, which is formulated as a ratio of the difference of total cholesterol (CH} c power and high density lipoprotein cholesterol (CH ^^) cholesterol to high density lipoprotein:
Ch cel Ch lvh I ather. ' 1 L ' J cn lvh
At an index of atherogenicity above 3, the patient is considered to be a member of the risk group and at an index above 5.6 to atherosclerotic patients (see Klimov AN, Fanotipirovanie lipoproteinov ”, Metodičeskia rekomendacii MZ USSR, M., Madicina, 1975i Goldfourt V., Holtzman E. , Neufeld HN, Total and High Density Lipoprotein Cholesterol in the Serum and Risk of Mortality, British Medical Journal, 1985, 290, 9, pp. 1239-1243).
The use of these methods requires blood collection, which is traumatic for patients and is not entirely safe due to the possibility of transmitting various viral diseases. Plasma lipoprotein fractionation and cholesterol analysis are an expensive and complicated procedure. However, in one of the three cases they indicate the total cholesterol content and even the results of total phenotyping are not correlated with the atherosclerosis difficulties (see Myasnikov AL, Gipertonicheskaya bolezn, 1965, M., Madicina, p. 300).
In addition, experiments conducted in recent years have shown that blood plasma cannot fully depict the processes of cholesterol accumulation characteristic of the walls of arts and other bradytrophic tissues.
Further improvement of diagnostic methods resulted from the solution of individual issues of pathogenesis of atherosclerosis. It should be emphasized that tissue cholesterol plays a decisive role! role in
CS 274 504 B2 atherosclerosis. Tissues that accumulate cholesterol as arterial walls could be detected.
Research in recent years has shown that there is a close relationship between cholesterol content in arterial walls and skin. This finding allows the discovery of fundamentally new diagnostic methods, particularly for atherosclerosis.
This relationship between cholesterol content in arterial walls and skin was established by a direct determination of cholesterol in skin biopsies. Skin samples were frozen in liquid nitrogen and lyophilized, then the cholesterol was extracted with the Positioning Reagent and determined by conventional chemical or biochemical methods (see Nikitin Ou.P., Gordienko IA, Oolgov AV, Filimonova TI, Sodium Cholesterin Sodium, and ego correlation with lipid. by the epidemiologist of the bushes in the heath and bolus ischemia serdca, Cardialogia, 1907, XXVII, No. 10, pp. 48-51, Bouisson H., Oe Graeve, Solera ML et al., Ann. Biol. Clin., 1982, 40, pp. 361-407).
However, due to its traumatic nature and complexity, this method is unsuitable for serial examinations.
US-PS No. 4458686 discloses a method for the determination of glucose or ethanol in blood directly under and on the skin, and the possibility of determining cholesterol using cholesterol oxidase. The methods of determining the amounts of these compounds are based on stoichiometric grains of oxygen concentration using a specific redoxferment for the substrate to be analyzed, preferably an oxidoreductase. Quantitative measurements of changes in oxygen concentration are performed electrochemically, for example by means of polarographs, by means of special devices and electrodes specially developed for these processes. These complicated instruments require highly qualified personnel for diagnosis. This leads to a limitation of the applicability of these methods in serial examinations.
PCT / US 84/00888 discloses a complex of a detecting agent and a visual-indicating agent in which these components are combined directly or by means of a crosslinking agent. This complex serves to determine small amounts of specific molecules such as lipids in ibological tissues. However, this lipid assay procedure can only be used under laboratory conditions and requires biological fluid or tissue to be removed from patients first, which means that the method is traumatic, multi-stage and complicated in its performance.
Data for the correlation between skin cholesterol content and the degree of atherosclerotic vascular damage are obtained on skin biopsy. This method is not only traumatic, but also has a number of other disadvantages, since the 1 mm thick biopsy comprises different layers of skin, namely a horn layer (average thickness of 0.1 mm) and connective tissue, i.e. the skin itself (derma), which again contains two layers, namely Stratum papillare and Stratum reticulare.
Both of these layers are well supplied with blood, therefore the respective biopsies also contain blood vessels and blood, as well as sweat and sebaceous glands as well as their secretions. Directly under the skin sc finds tissue of subcutaneous fat, which may sometimes belong to a dioptate. Thus, the inhomogeneity of the biopsy may bias the results of the skin cholesterol accumulation assay. In this regard, the method that allows the determination of the cholesterol content of the skin surface in the skin horn layer is most accurate.
It is an object of the present invention to provide a method for producing affinity enzymatic compounds for the visual indication of cholesterol immediately on the skin of a patient, particularly in the corneal layer of the skin, without removing blood and skin biopsies from the patient. Any skin area can be used for diagnosis. Most preferably, the surface of the hand is free of any sebaceous glands whose secretions as well as the corneal layer of the skin contain cholesterol, which may affect the outcome of the diagnosis.
According to the invention, this object has been achieved by a process for the production of affinity enzyme compounds which are bifunctional compounds. These ee selectively bind the patient's free cholesterol and can then be visually monitored. Production of these compounds from two
CS 274 504 B2 components, namely diagnostic agent A selected from the group of bifunctional substances which, when applied to the skin, form a selectively solid complex with the free cholesterol of the skin and a device which allows visual indication B. No. 274495.
The present invention provides a method of affinity enzymatic compounds for the visual indication of cholesterol on a patient's skin, characterized in that said detecting agent Λ and visualizing agent B are combined with a crosslinking agent C selected from low molecular weight asymmetric bifunctional compounds such as cyanogen bromide, trichlortriazine or 2 -amino-4,6-dichloro-S-triazine, or high molecular weight polyfunctional compounds such as polysaccharides, proteins, or synthetic polymers, i.e., any high molecular weight compound containing any of a functional group selected from the group consisting of a primary amine, carboxyl, hydroxyl, aldehyde, a hydrohalide, mixed anhydride, iminoether, azide, hydrazide, maleimide, isocyanate or epoxide.
When using low molecular weight asymmetric bifunctional compounds, the compounds can be prepared in two ways: either detection reagent A is first coupled with crosslinking agent C and then visualizing agent B is added to intermediate (A + C) to obtain the final product, or intermediate B is prepared first + C and Detection Reagent A is added thereto. In the first case, the affinity enzyme compounds are prepared by dissolving in an aqueous salt buffer at pH 5-9 of Detection Reagent A selected from the former compounds at a concentration of 1-20 mg / ml, to this solution is added a low molecular weight bifunctional crosslinking agent C selected from the group consisting of cyanogen bromide, trichlortriazine or 2-amino-4,6-dichloro-S-triazine in molar ratio A; C = 1: 0.5 - 1:10, the solution obtained is left at 0 to 20 ° C for 1 to 20 hours and then visualizing agent B selected from the group consisting of 20: 1 - 1: 1 molar ratio and the solution is left at 0 to 20 ° C for 1 to 48 hours until the final product is obtained.
To prepare the affine enzyme compound via intermediate B + C, visualization reagent 8 selected from the above is dissolved in an aqueous salt buffer at pH 5-9 at a visualization reagent concentration B of 1-20 mg / ml, then a low molecular weight asymmetric bifunctional solution is added. crosslinking agent C selected from the group consisting of cyanogen bromide, trichlortriazine or 2-amino-4,6-dichloro-S-triazine in a molar ratio of 3: C of 1: 0.5 to 1:10, leaving the solution obtained at a temperature of 0 to 20 ° C for 1 to 20 hours and then 3e add Detection A selected from the former in a 20: 1 to 1: 1 molar ratio of A: B and leave the solution at 0 to 20 ° C for 1 to 48 hours to obtain the final product.
If high molecular polyfunctional agents are used as crosslinking agent C, the detection reagent A and the visualization agent in a ratio of A: B of 20: 1 to 1: 1 are dissolved in an aqueous salt buffer at a pH of 5 to 9 at a concentration of A high molecular weight polyfunctional crosslinking agent C, which is a polysaccharide, a protein or a synthetic polymer containing any of the following functional groups is added to each of the reagents A and B 0.1 to 20 mg / ml in the obtained solution: primary amine, carboxyl, hydroxyl, aldehyde, hydrohalide , mixed anhydride, azide, hydrazide, maleimide, isocyanate or epoxide in A + B: C molar ratio of 1: 0.5 to 1:10, the solution obtained is kept at 0-20 ° C for 1 to 20 hours to obtain end product.
The compounds obtainable according to the invention lead to a maximum simplification of the diagnosis of atherosclerosis, are not traumatic and do not require any particular equipment. The use of these compounds for the diagnosis of atherosclerosis allows the subjects to be divided into three groups: atherosclerosis patients, at-risk groups, and healthy subjects.
Said compounds for visual indication of cholesterol and their possible diagnostic methods ("three-point methods **") are also suitable for serial diagnostics. The method is very simple and does not require any special qualification by medical personnel; it can also be carried out at home.
CS 274 504 82
The following compounds are suitable for the Oako Cholesterol Affinity A:
steroid glycosides having, as an aglycone, a cyclopentane perhydrophenanthrene residue of a furostanol or spirostanol row and an oligosaccharide fragment comprising 3 to 10 monosaccharides of a straight or branched chain selected from the group consisting of agavoside A, agavoside B, agavoside C, agavosid D, agavosid D, G, trillin, funcoside C, immuncoside 0, - funcoside F, funcoside G, funcoside X, dioscin, gracillin, pratodioscin, cicubasaponin, juncoside E, juncoside H, lanatigonin, desglucodigitonin, digitonin, gitcnin, rocoside C, rocoside C, rocoside C, rocoside C , funcoside E, alliumoside C, polygonatonin, tigogenintetroaside, tinogeninhexaoside, capsicoside, ammumoside B, ammumoside C, ammumoside 0, ammumoside E, dcsglucodosrarano parillin, desglucoparillin, parillin, parparin, sarsaparilloside, asars, asparamides, asars, , yucoside B, lanatigoside, monoside, bicside, trioside,, purpureagitoside, gecogenin, rocogenin, diogenin, tigogenin, protop alygametoside, tomatonin, laxogeninlycotetraoside, alliogeninlycoteraoside, caroteoside A, cyclooieversioside H, acantophiloside C, alliofusoside A, alliospirosic * A, cyclosievorsioside F, theasaponin, acantophiloside
B, tigonin (total), Calha polypetala glycoside or cyclosieversia3id G.
Of these steroid glycosides, funcosides C, D, E, F, G or I, dioscin, rocoside, lanatigonin, digitonin and tomatonin are particularly preferred. Most preferred are digitonin and tomatonin.
Further, the compounds used as detection means A can be selected from the group of triterpsnglycosides containing aglycone oC- or (5-amyryl, lupan, hopane, damaran, lanostane or holostane series) and an oligosaccharide with 2 to 8 branched or unbranched residues, including the following group of substances: aescin , avanacin, theasaponin, cK-hederin, cauloside C, stichinoside A, cyclamin, quinines, sugar beet saponins, hypsoside and triterpenglycosides derived from Fatsia japonica.
Further, the detection reagent may be selected from hydrophobic proteins such as the Me.alpha.cha protein, lysosome and mitochondria protein, fibrinogen, immunoglobulins, cerebron, myoglobin, cytochrome C, cytochrome P-450, or lipoprotein spoproteins.
Another group from which Detection A is selected is protein toxins capable of forming a complex compound with cholesterol obtainable from bacteria, marine microorganisms, insects and reptiles, which include streptolysin o, pneumolysin, listeriolysin, θ-toxin CI obtained from Perfringens type A and - C, (Γ-toxin CI new type A and C, haemolysin
CX histolyticum, haemolysin CI botulinum type C and D, tetanolysin, cerebrolysin, alveolysin, turingeolysin or cytotoxin from actinia Metridium senile.
Detection composition A is further selected from the group of polyenantibiotics which may form a complex compound with cholesterol and which include amphotericin B, philipin or nistatin.
Another group from which Detection A can be selected consists of enzymes having a high affinity for cholesterol and which include cholestarol oxidases, cholesterol hydrogenases or cholesterol esterases.
Among the aforementioned detection means, they are the most preferred glycosides as chemically stable and resistant to organic solvents as well as to high temperatures during synthesis, without losing their ability to complex with the cholesterol of the skin. The low molecular weight of the glycosides makes it possible to obtain a composition with a high molar content of the detection agent, which provides a high number of points for the reaction of the compositions with the skin cholesterol.
Most preferred of the glycosides are steroid glycosides which, in comparison with triterpsic glycosides, most effectively form a complex with cholesterol.
They also successfully use hydrophobic proteins, protein toxins, polyene antibiotics, and high affinity enzymes (these compounds are mentioned earlier) for the preparation of the diagnostic reagent, but the method of preparing the affinity enzyme compound is somewhat
CS 274 504 B2 due to their low chemical stability and the possibility of their inactivation. In addition, the high molecular weight of these detecting agents slightly decreases the sensitivity of the final compound, increasing the concentration of the cholesterol indicating agent on the skin of the patient and the duration of exposure.
It is of course an attempt to perform the reactions under mild conditions, i.e., at neutral pH, low ionic strength, low temperatures, and short reaction times.
As visualization reagent B, enzymes are used which react with Detection Reagent A to provide an affine enzymatic product for visual indication of cholesterol on the skin of a patient selected from the group consisting of: acetylcholinesterase, tyrosinases, glucose-6-phosphate dehydrogenases, glucooxidase, glucosoamylase, galactosidase , peroxidase, alkaline or acidic phosphatases, α-chymotrypsin or pyrophosphatase.
All these enzymes can be used with any of the above reagent A, but steroid glycosides are preferred.
The use of crosslinking agent C extends the technological possibilities of the method for preparing the compound for the visual indication of cholesterol on the skin surface of the patient while maximally maintaining the functional activity of reagents A and B.
Most preferred are compounds in which steroid glycosides having a cyclopentane perhydrophenanthrene radical of the furostanol or spirostanol series and an oligo-3-carbohydrate fragment containing from 3 to 10 unbranched or branched monosaccharides are used as affinity-detecting agent A.
Such steroid glycosides exhibit high chemical stability and can be immobilized to the crosslinking polymer under harsh conditions, i.e. at high temperatures and, if necessary, by dissolution in organic solvents, ensuring their high content in the final product. A compound for the visual indication of cholesterol on the skin surface of a patient is prepared by immobilizing detection agent A to crosslinking agent C under harsh conditions followed by immobilizing the visualization enzyme B to a product comprising crosslinking agent C and detection agent A under gentle conditions to maintain its enzymatic activity.
Asymmetric low molecular weight bifunctional compounds such as cyanogen bromide, trichlortriazine or 2-amino-4,6-dichloro-S-triazine can be used as crosslinking agent C.
The use of high molecular weight polyfunctional compounds as crosslinking agent C makes it possible to vary widely the ratio of detection agent A and visualization agent B in the compound for the visual indication of cholesterol, for example to obtain an optimal ratio between the number of centers of the compound and skin surface (detection agent A). Reagent B.
As the high molecular weight polyfunctional crosslinking agent C used are polysaccharides, proteins or synthetic polymers, i.e. any high molecular weight compounds containing any of the functional groups selected from the group consisting of: primary amine, carboxyl, hydroxyl, aldehyde, hydrohalide, mixed anhydride, iminoether, azide, hydrazide, maleimide, isocyanate or epoxide.
Preferred high molecular weight polyfunctional crosslinking agents C are acrylic acid or maleic anhydride copolymers.
The most preferred high molecular weight polyfunctional agent C is a copolymer of N-vinylpyrrolidone with maleic anhydride. The above crosslinking agents C are used with any detection reagent A and any visualization reagent B. In this case, the final ACB product is obtained.
As activators of detection reagent A and visualization reagent B, compounds are used which convert the functional groups of these reagents into a reaction-capable form. Such groups as primary amine, carboxylic or N-glycolic groups can be activated by per se known azide, carbodiimide, succinimide or periodate and other methods.
CS 274 504 R2
Most preferred are the periodate and carbodiimide methods, as these methods provide the most gentle synthesis conditions and allow the activity of the immobilized enzyme to be maximally maintained.
As for agent B, alkaline phosphatase and peroxidase are preferred. Horseradish peroxidase is particularly preferred.
Aqueous salt buffer solutions used are those obtained from compounds which provide a buffering effect in the pH range of 5-9 and which do not cause inactivation or inhibition of enzymes. Such solutions may be, for example, borate, citrate, phosphate and other buffer solutions. Typically, aqueous saline solutions are used at a salt concentration that provides a stable pH of the solution for the duration of immobilization, but the concentrations must not exceed those at which the enzyme is denatured.
Some of the detection agents A, such as steroid glycosides and polyene antibiotics are poorly or incompletely dissolved in water, therefore organic solvents are used to dissolve them. Oako such solvents can be used polar aprotic solvents such as dimethylsulfoxide, dimethylformamide, hexamethanol, dimethylformaldehyde / toluene 2: 1 or dimethylformamide / hexane 2: 1.
The process conditions for the preparation of the cholesterol indication compound (temperature, incubation time) are dependent upon the process. The use of enzymes as visualization reagent B limits the reaction temperature to 20 ° C. The reaction is preferably carried out at 4 ° C in buffer solutions of pH 5-9. The use of synthetic polymers as crosslinking agent C and glycosides as detecting agent A allows the reaction to be carried out in organic solvents and at high temperatures (up to 120 ° C) and to select reaction times. so as to be sufficient to maximize the yield of the final product.
The molar ratios of the components involved in the reaction are selected according to the molecular weights of the selected reagents A or B, the degree of affinity for skin cholesterol and the activity of the selected enzyme.
The invention is further illustrated by means of examples.
Example 1 mg of polyacrylic acid (C) is dissolved in 10 ml of acetate buffer pH 4.8 and 15 mg of n-cyclohexyl-N- (2-morpholinyl- [4-ethyl] -carbodiimide-mp-toluenesulfonate) are added. The mixture was kept at 0 ° C for 1.5 hours. To the solution obtained, 5 ml of a buffer containing 5 mg of O-streptolysin (A) and 5 mg of horseradish peroxidase (B) are added. The solution was kept at 20 ° C for 2 hours to give the final product.
Example 2
100 mg of agavoeid G (A) is mixed with 5 ml of water and 100 mg of cyanogen bromide (C) is added, maintaining the pH at 11 by addition of 1M sodium hydroxide solution. The mixture was kept at 4 ° C for 30 minutes, the pH adjusted. to 8.5 by adding phosphoric acid. To 1 ml of the solution thus prepared is added 3 ml of a pH 0.5 phosphate buffer solution (0.5 M) containing G mg of alkaline phosphatase (B). The mixture was kept at 4 ° C for 12 hours to give a solution of the final product.
Example 3
500 mg of nistatin (A) and 250 mg of ethylene-maleic anhydride copolymer are dissolved in 5 ml of dimethylformamide and kept at 50 DEG C. for 3 hours in a stream of argon. The product is precipitated with 20 ml of ether and dried under vacuum at 20 ° C. Add 1 ml of a solution of [beta] -galactosidase (B) (2 mg / ml) in 0.2 M phosphate buffer pH 7.5 to G ml of the obtained product and keep it at 12 DEG C. for 12 hours. Thus, the final product solution is obtained.
CS 274 504 B2
Example 4 mg of aescine (A) and 100 mg of a copolymer of N-vinylpyrrolidone and maleic anhydride (C) were dissolved in 1 ml of OMSO and kept at 100 ° C for 2 hours. The product obtained is precipitated with 3 ml of acetone and dried over phosphorus pentoxide for 4 hours at 100 ° C under vacuum.
To 1 ml of 1 mg / ml solution of A-chymotrypsin (B) in 0.2 M phosphate buffer pH 7.5 was added 8 mg of the obtained product and the mixture was kept at 6 ° C for 15 hours. A solution of the final product is obtained.
Use of compounds for visual detection of cholesterol on the patient's skin:
The diagnosis performed with the compounds obtained according to the invention is not based on a precise qualitative determination of cholesterol, but on the possibility of classifying the patient into one of three groups: atherosclerosis patients, at risk groups and practically healthy people. In order to classify a patient into one of these three groups, it is necessary to evaluate the cholesterol content of the horn layer of the epidermis of the skin that is characteristic of each of these groups.
Therefore, it is necessary for each compound prepared - according to the invention to select three levels, which are further used. These three different concentrations of the affinity-enzymatic composition are applied in the form of three spots to the skin of the patient, preferably the palm. The maximum concentration of the compound used ensures coloration of the spot or spot in all humans, including healthy ones, having a minimum cholesterol content in the skin. This spot is used as a control spot for reaction with cholesterol. A solution with a minimum concentration of the compound prepared according to the invention provides coloration only in patients who are at clinical stage of atherosclerosis and who have the highest cholesterol content in the skin. A solution containing a moderate concentration of a compound of the invention provides for color development in both sick people and those belonging to the risk group (increased cholesterol content), but does not provide coloration in healthy people.
Thus, three different concentrations of the compound obtained according to the invention are applied to the patient's skin. In the presence of one colored group, the patient belongs to a group of healthy people. in the presence of two stained spots per group at risk and in the presence of three stained spots for atherosclerosis patients at clinical stage.
A few square centimeters of skin, selected on any part of the body, is sufficient for diagnosis. Most preferably, the inner side of the hand appears to be easily accessible and, moreover, free of fatty glands.
The compound obtained according to the invention is applied to the skin surface at three different concentrations (10-20 µl) and incubated for 1 minute. Excess compound that did not react with skin cholesterol was washed away. To visualize the skin cholesterol-reacted compound obtained according to the invention, a substrate of the corresponding enzyme used as a visualizing agent in the preparation of the compound is reacted to form a colored product formed by enzymatic reaction with the compound prepared according to the invention (TTNgo and HMLenhoff, Enzyme-mediated Immunoassay, 1985, Plenum Press, New York, in the Russian translation of this book p. 11 and A. Leninger Biochemie, ed. Mir, Moscow 197B, p. 198).
Depending on the selected substrate of the enzymatic reaction, the colorless substrate solution is colored red, yellow, blue, green, violet or a solution of other colors, or the color solution is discolored.
For example, if horseradish peroxidase is used as the visualizing agent 8, then any of the following solutions can be used immediately after preparation:
solution 1: ABTS / 2,2'-azinobis- (3-ethylbenzthiazoline-6-aulfonic acid) / 1 mM, 0.002% hydrogen peroxide in phosphate citrate buffer pH 4.3,
CS 274 504 B2 solution 2: o-phenylenediamine 4 mM, 0.004% hydrogen peroxide in phosphate citrate buffer pH = 5, solution 3: 3.3 *, 5.5 * -tetramethylenebenzidine 0.4 mM, 0.004% hydrogen peroxide in acetate buffer pH 6.0
However, other peroxidase substrates used in a wide range of immunoenzymatic assays that are useful in the process of the invention are also known, although alkaline phosphatase may be used as the visual agent B in the production of the affinity-enzymatic compound for the visual detection of cholesterol. substrate for this enzyme used a solution containing p-nitrophenol phosphate (2.5 mM) and magnesium chloride (0.5 mM) in diethylamine buffer (pH = 9.5), or any other alkaline phosphatase substrate used in immunoenzymatic analysis.
The results of the research of 200 people with verified diagnosis listed in the table show a high correlation of the present diagnostic method with the degree of atherosclerotic vascular damage.
Table of family-related ischemic hypertonia ischemic ischemia ischemic healthy hyperlipidemia of cardiac heart disease of the heart roba roba + hyper-limb disease * hypertonia + ischemic lower limb disease count
patients 9 7 44 30 8 66 30 M 5 2 13 12 - - 15 F 4 5 31 18 8 66 15 average age 2-45 M-40 2-55 M-47 F-50 M-52 2-54 M-52 48 54 Ž-24 M-26 plasma cholesterol 421.4 + 135.6 252.0 + 54.6 238.4. + 51.4 290.5 + 78.6 218.6 + 51.5 239.6+ 41.3 ”188.0+ 34.0” athorogenicity index 10.0 + 3.3 5.4 + 1.9 5.4 + 1.7 7.6 + 2.9 5.1 + 1.8 5 , 7 + 2.6 3.6 + 1.3 exam forClaims (5)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS503989A CS274504B2 (en) | 1988-01-19 | 1989-08-30 | Preparation of enzymatic compounds for cholesterol optical indication |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU884357046A SU1675769A1 (en) | 1988-01-19 | 1988-01-19 | Method for preparation of agent, used for visual detection of cholesterol on the skin surface |
| CS34889A CS274496B2 (en) | 1988-01-19 | 1989-01-18 | Method of affinitive-enzymatic compounds preparation for cholesterol's visul indication |
| CS503989A CS274504B2 (en) | 1988-01-19 | 1989-08-30 | Preparation of enzymatic compounds for cholesterol optical indication |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS503989A2 CS503989A2 (en) | 1990-08-14 |
| CS274504B2 true CS274504B2 (en) | 1991-04-11 |
Family
ID=25745276
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS503989A CS274504B2 (en) | 1988-01-19 | 1989-08-30 | Preparation of enzymatic compounds for cholesterol optical indication |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS274504B2 (en) |
-
1989
- 1989-08-30 CS CS503989A patent/CS274504B2/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CS503989A2 (en) | 1990-08-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Dahlqvist | A method for the determination of amylase in intestinal content | |
| EP0050733B1 (en) | Diagnostic device for fecal occult blood | |
| Herriott | Acetylation of tyrosine in pepsin | |
| Hino et al. | Glycylprolyl β-naphthylamidase activity in human serum | |
| Porembska et al. | Early diagnosis of myocardial infarction by arginase activity determination | |
| US5587295A (en) | Method for producing affino-enzymatic compounds and visualizing agent and application thereof | |
| CN106399460B (en) | Kit and method for determining triglycerides | |
| Homburger | Evaluation of diagnostic tests for cancer. I. Methodology of evaluation and review of suggested diagnostic procedures | |
| CS274496B2 (en) | Method of affinitive-enzymatic compounds preparation for cholesterol's visul indication | |
| Hill et al. | Probable genetic linkage between human serum amylase (Amy 2) and Duffy blood group | |
| Belfiore et al. | Increased activity of some enzymes in serum in cases of severely decompensated diabetes, with and without ketoacidosis | |
| CS274504B2 (en) | Preparation of enzymatic compounds for cholesterol optical indication | |
| KR100811726B1 (en) | Method of screening prediabetic state and screening reagent | |
| Ziegler et al. | Oxidative metabolism of tertiary amine drugs by human liver tissue | |
| Weaver et al. | Aged amylase: a valuable test for detecting and tracking pancreatic pseudocysts | |
| Lojda et al. | Histochemical demonstration of the intestinal hetero-β-galactosidase (glucosidase) | |
| NL8901732A (en) | METHOD FOR PREPARING AFFINO-ENZYMATIC COMPOUNDS FOR VISUAL INDICATION OF SKIN SURFACE CHOLESTEROL BASED ON A DETECTIVE WITH CHOLESTEROL AND VISUALIZING AGENT AND USE THEREOF | |
| Lijnen et al. | Biological significance of active and inactive renin in man | |
| Hospattankar et al. | Elevation of serum polyamines in malignant lymphomas and acute myeloid leukemia | |
| US3715188A (en) | Cholesterol assay and reagents therefor | |
| FLESCH et al. | Further studies of epidermal mucopolysaccharides | |
| RU2009509C1 (en) | Method for prognostication of tendency of psoriasis | |
| RU2170935C1 (en) | Differential diagnosis method for determining destructive changes in the cases of acute cholecystitis | |
| JPS592700A (en) | Method for measuring total polyamine | |
| Lojda et al. | Indigogenic methods for glycosidases |