HUT56973A

HUT56973A - Method for obtaining affin-enzyme compounds for the purpose of visual cholesterine detection on human skin surface

Info

Publication number: HUT56973A
Application number: HU89212A
Authority: HU
Inventors: Jurijj Mikhajjlovich Lopukhin; Irina Pavlovna Andrianova; Viktor Viktorovich Zuevskijj; Aleksandr Borisovic Rabovskijj
Original assignee: Nii Fiz Khim Mediciny
Priority date: 1988-01-19
Filing date: 1989-01-19
Publication date: 1991-10-28
Also published as: SU1675769A1; DE58909664D1; EP0338189B1; EP0338189A2; PL277263A1; SU1675770A1; FI890266A; CA1335968C; EP0338189A3; CS274496B2; DD289604A5; JPH01289498A; AU615709B2; CS34889A2; CN1048925A; AU2857889A; FI890266A0; ATE137336T1

Description

A találmány a biokémia területére vonatkozik és tárgya: eljárás páciensek bőrfelületén koleszterin vizuális kimutatására szolgáló affin-enzimatikus vegyületek előállítására koleszterin affinis kimutató szerből és észlelést elősegítő anyagból.

A találmány szerinti vegyületeket leghatásosabban a diagnosztikában lehet alkalmazni; többek között az érelmeszesedés korai felismerésére, klinikai, ambuláns és házi körülmények között a diagnózis pontosítására, valamint a kezelés hatásosságának ellenőrzésére. Ezen kívül a találmány szerinti vegyületek alkalmazhatók a fiziológiai, szövettani és hisztokémiai kutatásoknál a normálisnál nagyobb koleszterin-tartalom megállapítására és lokalizálására. Meghatározott, különösen onkológiai jellegű betegségben szenvedő pácienseknél a normálisnál kisebb koleszterin-tartalom megállapítására szintén alkalmasak a találmány szerinti vegyületek.

Az érelmeszesedés és komplikációi, például az infarktus, az érelzáródás, az üszkösödés a népesség halálozásának fő okai közé tartoznak a világ sok országában.

Többéves kutatások eredményeként megállapítható, hogy az érelmeszesedés azon betegségek közé tartozik, amelyeket elsősorban fel kell ismerni és meg kell előzni, és emellett az érelmeszesedés fő rizifaktora a koleszterin felszaporodása a a szervezetben. Az érelmeszesedés tömeges megelőzésénél elsődleges feltétel a legjobban veszélyeztetett rizikócsoportba tartozó páciensek felismerése, hogy ezt követően differenciáltan lehessen kezelni őket és szükség esetén megváltoztathassák életmódjukat. A nagyobb érelmeszesedési kockázatú pácienscsoport felismerése a szervezetben felszaporodott koleszterin mennyisége alapján az érelemeszesedés megelőző kezelésének legnagyobb problémája. Az érelmeszesedés diagnosztikájának ismert módszerei a vénás vérplazma összes koleszterin-tartalmának mennyiségi meghatározásán alapulnak az alábbi irodalmi közleményekben leírtak szerint:

Consensus Conference on Lowerning Blood Cholesterol to Prevent Heart Desease: JAMA 253, (1985) 2080-2086. P.;

The Lipid Research Clinics Population Studies Data Book, Publication 80-152, Bethesda, Ma., National Institutes of Health, 1980, 1. kötet;

Lipid Research Clinics Programm: JAMA, 251, (1984) 351-364. P. A 260 mg fölötti koleszterintartalom adott esetben elegendő ahhoz, hogy a pácienst a rizikócsoportba soroljuk. Részleteseb diagnózist a vérplazma-lipoproteinek analízise és az atherogenitási index alapján állíthatunk fel. Az atherogenitási index: az összes koleszterin (Ch.. ) és a nagy sűrűségű lipoproteinek koleszterinjének (Ch_ns-^) különbsége, vonatkoztatva a nagy sűrűségű lipoproteinek koleszterinjére:

C^össz

^ather.

Ha az atherogenitási index 3-nál nagyobb, akkor a pácienst a rizikócsoportba soroljuk, ha 5,6-nál is nagyobb, akkor a pácienst érelmeszesedésben szenvedő betegnek nyilvánítjuk.

Az előzőekre vonatkoznak az alábbi irodalmi közlemények:

Klimov, A.N.: Fenotipirovanyie lipoproteinov, Metodicseszkie rekomendacii MZ SZSZSZR, (M., Medicina, 1975);

Goldfourt, V., Holtzman, E., Neufeld, Η. N.: Totál and High Density Lipoprotein Cholesterol in the serum and risk of Mortality, British Medical Journal, 290 (1985), 1239-1243, P..

Az előzőekben ismertetett módszerek hátránya, hogy a pácienstől vért kell venni, ami nem minden esetben jár trauma nélkül és fennáll a fertőzés veszélye is. A vérplazma-lipoproteinek frakcionálása és a koleszterin-analízis egyaaránt komplikált és költséges eljárás. További hátrány, hogy az esetek harmadában a meghatározott összes koleszterin és ugyanígy a teljes fenotipizálás eredménye nincs korrelációban az érelmeszesedés súlyosságával a Mjasnyikov, A. Gipertonicseszkaja bolezny (M. Medicina, 1965) 300. P. irodalmi közleményben leírtak szerint.

Az utóbbi években végzett kutatások alapján megállapították, hogy a vérplazma nem úgy tükrözi a koleszterin-akkumuláció folyamatát, mint ahogy az az artériafalban és más bradytroph szövetben jellemzően végbemegy.

Az érelmeszesedés patogenézise néhány alapvető kérdésének megoldásából adódott a diagnosztika további tökéletesítése. Megállapították, hogy a szövetekben lévő koleszterin döntő szerepet játszik az érelmeszesedés kifejlődésében. Találtak olyan szöveteket, amelyek az artériafallal analóg módon akkumulálják a koleszterint.

Az utóbbi évek kutatási eredményei szerint az artériafal és a bőr koleszterin-tartalma között szűk korreláció van. Ennek alapján lehetővé vált egy alapvetően uj diagnosztikai eljárás kifejlesztése, főleg az érelmeszesedés megállapítására.

Az artériafal és a bőr koleszterin-tartalma közötti említett korrelációt a koleszterin kivett bőrmintából történő közvetlen meghatározásával állapították meg. A bőrmintát folyékony nitrogénben lefagyasztották és liofilizálták, majd a koleszterint Folch-reagenssel extrahálták és konvencionális kémiai, illetve biokémiai módszerekkel meghatározták. erre vonatkozó információkat az alábbi irodalmi közlemények tartalmaznak:

Nyikitin, Ju. P., Gordienko, I. A. Dolgov, A. V., Filimonova, T. I. Szogyorzsanyie koleszterina v kozse i evő korreljacija sz lipidinüm Pokazatyelem szüvorotki krovi u zdorovüh ljugyej i bolnüh iszemicseszkoj boleznyju szerdca. Kardiologija 27, (1987) 10 sz., 48-51. oldal.

Bouisson, H., De Graeve, Sóiéra, M. L. és munkatársaik: Ann. Bioi. Clin., 40, (1982) 361-407. oldal.

Ennek a módszernek az a hátránya, hogy traumatikus jellege és bonyolultsága következtében sorozat vizsgálatra nem alkalmas.

A 4458686 sz. amerikai egyesült államok-beli szabadalmi iratban leírnak egy eljárást a vérben lokalizált glükóz illetve etanol közvetlenül a bőr alatt és a bőrfelületen történő meghatározására. Ennél az eljárásnál koleszterin-oxidáz alkalmazásával adott a koleszterin meghatározásának lehetősége is. Az eljárás alapja a kimutatandó szubsztrátumra specifikus redox ferment, előnyösen oxidoreduktáz hatására bekövetkező sztöchiometrikus oxigénkoncentráció-változás. A kvantitatív oxigénkoncentráció-változást elektrokémiai módszerrel, például polarográfiásan mérik. A módszer speciális készüléket, egyedi, erre a célra kifejlesztett elekródát és a komplikált készülék következtében a diagnózis kivitelezéséhez magasan kvalifikált személyzetet igényel. Mindebből az következik, hogy az eljárás csak korlátozottan alkalmazható sorozat vizsgálatoknál.

A nyilvánosságra hozott PCT/US 84.00888 sz. szabadalmi bejelentésben leírtak szerint ismert olyan kimutató- és észlelést elősegítő anyagból álló komplex, amelynél a kimutató- és észlelést elősegítő anyag közvetlenül vagy térhálósitó vegyület közvetítésével kapcsolódik egymáshoz. Ezzel a komplexszel lehet meghatározni olyan kis mennyiségű specifikus molekulákat, mint amilyenek például a biológiai szövetben lévő lipidek. A lipidek meghatározásának ez az eljárása viszont csak laboratóriumi körülmények között alkalmazható, és a páciensektől előzetesen biológiai folyadék- vagy szövetmintát kell venni, igy az eljárás traumatikus, kivitelezése pedig több fokozatú és komplikált.

A bőr koleszterin-tartalma és a véredények atheroszklerotikus károsodásának foka közötti korrelációt kivett bőrminták vizsgálatával állapították meg. Ez az eljárás nemcsak traumatikus, hanem még más hátrányokkal is jár, mivel az 1 mm vastag bőrmintában különböző bőrrétegek vannak; a szaruréteg (átlagos vastagsága 0.1 mm) és a kötőszövet - ez a tulajdonképpeni bőr (derma) -, amely ismét két rétegre oszlik, ezek a Stratum Papillare és a Stratum reticulare. A két utóbbi réteg vérellátása jó, igy a kivett bőrminta hajszálereket és vért is tartalmaz, valamint a mintában vannak még természetszerűleg izzadság- és faggyumirigyek és szék-

rétumaik. Közvetlenül a derma alatt található a bőr alatti zsírszövet, amely adott esetben szintén bekerülhet a kivett mintába. A minta inhomogenitása viszont a bőrben akkumulálódott koleszterin meghatározásának eredményét meghamisítgallyén szempontból az az eljárás a legpontosabb, amely a koleszterin-tartalom mérését a bőrfelületen, a szarurétegben teszi lehetővé.

A találmány célja, hogy eljárást dolgozzunk ki olyan affin-enzimatikus vegyületek előállítására, amelyek lehetővé teszik közvetlenül a páciensek bőrfelületén, különösen az epidermisz szarurétegében koleszterin vizuális kimutatását anélkül, hogy a páciensektől vér- vagy bőrmintát kelljen venni. A diagnózis céljára minden tetszőleges bőrfelület alkalmas, de legalkalmasabb a tenyér felülete, mivel itt nincsenek faggyúmirigyek, amelyek váladéka a bőr szarurétegéhez hasonlóan koleszterint tartalmaz, és ezzel a diagnózis eredményét befolyásolhatja.

A találmány céljának elérésére olyan affin-enzimatikus vegyületeket állítunk elő, amelyek bifunkciós vegyületek. A páciensek bőrében lévő szabad koleszterinhez szelektíven kötődnek és ezt követően vizuálisan érzékelhetővé tehetők. Az ilyen vegyületek előállításához legalább két komponens szükséges: az A jelű kimutató szer, amelyet az anyagok azon csoportjából választunk, amelyek az egész bifunkcionális vegyületet a bőr szabad koleszterinjéhez kötve azzal szelektíven szilárd komplexet képeznek; és a B jelű észlelést elősegítő anyag, amely a koleszterinhez kötött bifunkcionális vegyületet vizuálisan érzékelhetővé teszi.

A találmány szerint előállított vegyületek az érelmeszesedés diagnosztikájának maximális egyszerűsítéséhez vezetnek, a vizsgálat nem traumatikus, nem szükséges hozzá speciális felszerelés. A találmány szerint előállított vegyületek alkalmazása az érelmeszesedés diagnosztikájában lehetővé teszi a vizsgált személyeknek a következő három csoportba sorolását: érelm,eszesedésben szenvedő betegek, kockázati csoport és egészséges személyek.

A találmány szerint előállított és a koleszterin vizuális kimutatására szolgáló affin-enzimatikus vegyületek és a felhasználásukra alapozott diagnosztikai eljárás (az úgynevezett hárompontos eljárás) sorozatvizsgálatokra is alkalmas. A vizsgálat egyszerűen kivitelezhető, nem igényli az egészségügyi személyzet speciális képzettségét, akár házilag is elvégezhető.

A találmány szerinti vegyületeket az A jelű kimutató- és a B jelű észlelést elősegítő anyagból állíthatjuk elő a tetszőlegesen választott egyik anyag funkciós csoportjainak kémiai aktivitásával. Ha az aktivált funkciós csoportokat tartalmazó egyik anygaghoz az adott választásnak megfelelő másik anyagot hozzáadjuk, akkor az A és B jelű anyagok meghatározott tömegaránya esetén szilárd kémiai kötés jön létre a két anyag molekulái között, és igy a páciensek bőrfelületén koleszterin vizuális kimutatására szolgáló, nagyobb molekulájú, bifunkcionális vegyületeket kapunk.

Koleszterinre affinis, A jelű kimutató szerként alkalmasak a következő vegyületek:

···· • · ·· • · • · ······

- 9 szteroid-glikozidok, amelyekben az ágiikon a furosztán- és spirosztán sor ciklopentán-perhidro-fenantrén-fragmense és a szénhidrátkomponens 3-10 elágazó vagy nem elágazó monoszacharid csoportból álló oligoszacharid-fragmens (lásd a Kintja, P.K.: Sztroenyie i biologicseszkaja aktivnoszty szteroidnüh glikozidov rjada spirosztana i furosztana (Kisinyev, Stinca kiadó, 1987), 142. p. irodalmi közleményt) vagy triterpén-glikozidok, amelyekben az ágiikon az oC- vagy β -amiril-, a lupán-, hopán-, dammarán-, linosztán- vagy holosztán sor egy vegyülete és a szénhidrátkomponens 2-8 elágazó vagy nem elágazó gyökből álló oligoszacharid (lásd a Dekanoszidze, G.E., Csirva, V. Ja., Szergyienko, T. V., Uvarova, N. I.: Isszledovanyie triterpenivüh glikozidov (Tbiliszi Mechniereba kiadó, 1982) irodalmi közleményt), vagy hidrofób proteinek, amelyek szelektíven tudnak a koleszterinnel komplex vegyületet képezni (irodalmi hivatkozások:

1. Klimov A. N., Tyitova G. V., Kozsevnyikova L. A.: Biochimija, 47 , (1982) 2. sz. 226-232. P.;

2. Klimov, A. N ., Kozsevnyikova, K.A., Kljueva, N.N. és munkatársai: Voproszu med. himii, 22? (1984) 3. sz. 86-90. P.;

3. Tyitova, G. V., Klujeva, N.N., Kozsevnyikova K. A. és munkatársai: Biohimija, 45 , (1980) 1. sz. 51-55. P.) vagy fehérjeszerü toxinok, amelyeket baktériumokból, tengeri mikroorganizmusokból, rovaroktól és kígyóktól nyernek, és amelyek szelektíven tudnak a koleszterinnel komplex vegyületet képezni- (lásd a dalin, Μ. V., Fis, N. G.: Belkovüje tokszinü mikrobov (Moszkva, Medicina kiadó, 1980) irodalmi közleményt) vagy polién-antibiotikumok, amelyek szelektíven tudnak a koleszterinnel komplex vegyületet képezni (irodalmi hivatkozások:

1. Katzenstein, 0. P., Spielvogel, A. M., Norman, A. W.,:

3. Atibiot., 27, (1974) 12. sz. 943-951. P.;

2. Jong Shang-Shing, Wang Hsi-Hua: Clin. 3. Microbiol., 2, (1976) 19-30. P.;

3. Reading 3osephine D. és munkatársai: Biochim. Biophis. Acta, 685 (1982) 219-224. p.) vagy nagy affinitásu enzimek, amelyeknek a koleszterin szubsztrátuma.

B jelű észlelést elősegítő anyagként alkalmasak a következő enzimek: acetil-kolin-észtergáz, tirozináz, glükózo-6-foszfát-dehidrogengáz, glükózooxidáz, glükozóamiláz, galaktozidáz, peroxidáz, lúgos vagy savas foszfatáz, οά-kimotripszin vagy pirofoszfatáz.

A találmány szerinti eljárásnál tehát az aglikonként a furosztán- és spirosztán sor ciklopentán-perhidro-fenantrén-fragmensét és szénhidrátkomponensként 3-10 elágazó vagy nem elágazó monoszacharid csoportból álló oligoszacharid-fragments tartalmazó szteroid-glikozidok; az aglikonként az vagy β-amiril-, a lupán-, hopán-, dammarán-, linosztán- vagy holosztán sor egy vegyületét és szénhidrogénkomponensként 2-8 elágazó vagy nem elágazó gyökből álló oligoszacharidot tartalmazó triterpén11

-glikozidok; a koleszterinnel szelektíven komplex vegyületet alkotni képes hidrofób proteinek; a baktériumokból, tengeri mikroorganizmusokból, rovaroktól és kígyóktól nyert és a koleszterinnel szelektíven komplex vegyületet alkotni képes fehérjeszerü toxinok; a koleszterinnel szelektíven komplex vegyületet alkotni képes polién-antibiotikumok vagy a koleszterinhez nagy affinitást mutató enzimek csoportjából kiválasztott, koleszterinre affinis, A jelű kimutató szert kémiai módszerrel, vizes közegben, az A jelű kimutató szer és az aktiváló vegyület 1:1-től 1:10-ig terjedő mólaránya valamint a kimutató szer 1-20 mg/ml közötti koncentrációja és a pH 4-00 határok közötti értéke mellett, 0-25 °C hőmérsékleten, 1-24 órán keresztül aktiváljuk, majd az igy kapott oldathoz hozzáadjuk az acetil-kolin-észtergáz, tirozináz, glükózo-6-foszfát-dehidrogenáz, glükózooxidáz, glükózoamiláz, galaktozidáz, peroxidáz, lúgos vagy savas f oszf atáz , «^Á-kimotripszin vagy pirof oszf atáz enzimek közül kiválasztott B jelű észlelést elősegítő anyagot oly módon, hogy az A:B mólarány 20:1 és 1:1 határok között legyen, végül az oldatot 0-25 °C hőmérsékleten, 1-24 órán keresztül, a végtermék képződéséig állni hagyjuk.

Már az előzőekben is irtuk, hogy a B jelű észlelést elősegítő anyag funkcionális csoportjait is lehet előzetesen, kémiai utón aktiválni. Ebben az esetben a B jelű észlelést elősegítő anyag kémiai aktiválását vizes közegben, a B jelű észlelést elősegítő anyg és az aktiváló vegyület 1:1-től 1:10-ig terjedő mólaránya valamint az észlelést elősegítő anyag 1-20 mg/ml közötti koncentrációja és a pH 4-11 határok közötti értéke mellett, 0-25 °C hőmérsékleten, 1-24 órán keresztül végezzük, majd az igy kapott oldathoz hozzáadjuk az előzőekben felsorolt vegyületek közül kiválasztott A jelű kimutató szert olymódon, hogy az A:B mólarány 20:1 és 1:1 határok között legyen, végül az oldatot 0-25 °C hőmérsékleten, 1-24 órán keresztül, a végtermék képződéséig állni hagyjuk.

A találmány szerint az A jelű kimutató szert illetve a B jelű észlelést elősegítő anyagot kémiai utón az önmagában ismert azid-, karbo-diimid- vagy szukcin-imid-módszerrel, ill. a perjodát oxidációs módszerrel aktiváljuk.

Azokban az esetekben, amelyekben a B jelű észlelést elősegítő anyag nagyobb molekulájú enzim és az A jelű kimutató szer kismolekuláju vegyület, például glikozid, a végtermék molekulája a B jelű észlelést elősegítő anyagnak csak egy molekuláját tartalmazhatja. Emellett a végtermékben a bőr koleszterinjével kötést létesíteni tudó A jelű kimutató szer moláris mennyisége csak néhányszorosa lehet a B jelű észlelést elősegítő anyag moláris mennyiségének, éspedig az enzimmolekula azon funkciós csoportjai számának megfelelően, amelyek az enzimatikus aktivitás jelentékenyebb csökkenése nélkül az A jelű kimutató szer molekuláihoz való kapcsolódáshoz rendelkezésre állnak. Az ilyen végtermékben tehát a B jelű észlelést elősegítő anyagként alkalmazott enzim mennyisége korlátozott. Ebből következik az igy előállított vegyületek^ viszonylag csekély érzékenysége, ezért a diagnózis megállapításánál a bőrt hosszabb ideig kell exponálni.

A páciensek bőrfelületén koleszterin vizuális kimutatására szolgáló affin-enzimatikus vegyületek alkalmazásának • « • *

- 13 technikai lehetőségeit szélesítendő és érzékenységüket növelendő az A jelű kimutató szert és a B jelű észlelést elősegítő anyagot a kismolekuláju, aszimmetrikus, bifunkcionális vegyületek - például bróm-cián, triklór-triazin vagy 2-amino-4,6-diklór-5-triazin - közül választott, C jelű térhálósitószerrel kapcsoljuk egymáshoz. A végterméket kétféleképpen állíthatjuk elő: vagy az A jelű kimutató szer és a C jelű térhálósitó szer vegyítésével először az (A+C) jelű közbülső terméket állítjuk elő, majd ehhez adjuk a B jelű észlelést elősegítő anyagot; vagy először a (B+C) jelű intermediert állítjuk elő, és ehhez adjuk az A jelű kimutató szert. Az első esetben az affin-enzimatikus vegyületeket úgy állítjuk elő, hogy az előzőekben felsorolt vegyületek közül kiválasztott A jelű kimutató szert feloldjuk a szokásos módon 5-9 pH-értékü vizes sópuffer oldatban úgy, hogy az A jelű kimutató szer koncentrációja 1-20 mg/ml határok között legyen, az igy kapott oldathoz hozzáadjuk a bróm-cián, triklór-triazin vagy 2-amino-4,6-dkilór-S-triazin vegyületek közül kiválasztott, kismolekuláju, aszimmetrikus, bifunkcionális, C jelű tárhálósitó szert olymódon, hogy az A:C mólarány 1:0,5 és 1:10 között legyen, majd az oldatot 0-20 °C hőmérsékleten, 1-20 órán keresztül állni hagyjuk, ezt követően az előzőekben felsorolt vegyületek közül kiválaszott B jelű észlelést elősegítő anyagot adunk hozzá úgy, hogy az A:B mólarány 20:1 és 1:1 között legyen, végül az oldatot 0-20 °C hőmérsékleten, 1-48 órán keresztül, a végtermék képződéséig állni hagyjuk.

Az affin-enzimatikus vegyületeket a (B+C) jelű intermedieren keresztül úgy állítjuk elő, hogy az előzőekben fel• · • *··· ·« ·· • · ···«··· * · · · · ··· *· ·· ♦ · * · ·

- 14 sorolt vegyületek közül kiválasztott B jelű észlelést elősegítő anyagot feloldjuk a szokásos módon 5-9 pH értékű vizes sópuffer oldatban úgy, hogy a B jelű észlelést elősegítő anyag koncentrációja 1-20 mg/ml határok között legyen, az igy kapott oldathoz hozzáadjuk a bróm-cián, triklór-triazin vagy 2-amino-4,6-diklór-S-triazin vegyületek közül kiválasztott, kismolekuláju, aszimmetrikus, bifunkcionális, C jelű térhálósitő szert olymódon, hogy a B:C mólarány 1:0,5 és 1:10 között legyen, majd az oldatot 0-20 °C hőmérsékleten, 1-20 órán keresztül állni hagyjuk, ezt követően az előzőekben felsorolt vegyületek közül kiválasztott A jelű kimutató szert adjuk hozzá úgy, hogy az A:B mólarány 20:1 és 1:1 között legyen, végül az oldatot 0-20 °C hőmérsékleten, 1-48 órán keresztül, a végtermék képződéséig állni hagyjuk.

A páciensek bőrfelületén koleszterin vizuális kimutatására szolgáló affin-enzimatikus vegyületek maximális érzékenységét természetesen csak akkor érjük el, ha térhálósitó szerként nagymolekuláju polifunkcionális vegyületeket, például poliszacharidokat, proteineket vagy szintetikus polimereket, azaz primer amin, karboxil, hidroxil, aldehid, hidro-halogenid, keverék anhidrid, iminoéter, azid, hidrazid, maleinsavimid, izocianát vagy epoxi funkciós csoportot tartalmazó, tetszőleges nagymolekuláju vegyületeket alkalmazunk. Ezekhez a vegyületekhez egymástól függetlenül kötődhet az előzőekben felsorolt anyagok és kombinációik közül kiválasztott A jelű kimutató szer és szintén az előzőekben felsorolt vegyületek közül kiválasztott B ejlü észlelést elősegítő anyag. A páciensek bőrfelületén koleszterin vizuális kimutatására szolgáló, ilyen jellegű • »>·· ·« »« »· »· ····*·» • · ·····« ·· ·· · · * · ·

- 15 affin-enzimatikus vegyületek lehetővé teszik, hogy a választott A jelű kimutató szer bőr koleszterinjével szembeni affinitásának ill. az alkalmazott B jelű enzim aktivitásának megfelelően az A jelű kimutató szer és a B jelű észlelést elősegítő anyag arányát széles határok között változtassuk. így például, ha az A jelű kimutató szer affinitása a bőr koleszterinjéhez gyengébb, akkor a végtermékben a mólarányát jelentősen megnövelhetjük .

A nagymolekuláju térhálósitó szert tartalmazó affin-enzimatikus vegyületeket úgy állítjuk elő, hogy az előzőekben felsorolt anyagok és kombinációik közül kiválasztott A jelű kimutató szert és a szintén az előzőekben felsorolt vegyületek közül kiválasztott B jelű észlelést elősegítő anyagot - az A:B mólarány 20:1 és 1:1 határok között választott értéke melett - 5-9 pH értékű vizes sópuffer oldatban feloldjuk úgy, hogy az A és B jelű anyag koncentrációja egyaránt 0,1-20 mg/ml határok között legyen, ezután hozzáadjuk az oldathoz a poliszacharidők, proteinek vagy szintetikus polimerek, azaz primer amin, karboxil, hidroxil, aldehid, hidro-halogenid, keverék anhidrid, iminoéter, azid, hidrazid, maleinsavimid, izocianát vagy epoxi funkciós csoportot tartalmazó, tetszőleges nagymolekuláju vegyületek csoportjából kiválasztott C jelű, nagymolekuláju, polifunkcionális térhálósitó szert olymódon, hogy az (A+B) mólarány 1:0,5 és 1:10 arányok között legyen, végül az oldatot 0-20 °C hőmérsékleten, 1-20 órán keresztül, a végtermék képződéséig állni hagyjuk.

Az aglikonként a furosztán- és spirosztán sor ciklopentán-perhidro-fenantrén-fragmensét és szénhidrátkomponens16 ···* *· ·· ·« • · e · » « » • ···*·· ként 3-10 elágazó vagy nem elágazó monoszacharid csoportból álló oligoszacharid-fragmenst tartalmazó, a találmány szempontjából A jelű kimutató szerként előnyösen alkalmazható szteroid-glikozidok a következők lehetnek: Agavosid A,

Agavosid

B,

Agavosid

C, Agavosid

D, Agavosid F, Agavosid H,

Agavosid

G,

TrIliin,

Funcosid C,

Funcosid D, Funcosid F,

Funcosid

G,

Funcosid

I, Dioscin,

Gracillin, Protodioscin,

Cicubasaponin, Duncosid E, Ouncosid H, Lanatigonin,

Desglukodigitonin, Digitonin, Gitonin, Rocosid C, Rocosid 0, Rocosid E, Funcosid E, Alliumosid C, Polygonatonin, Tigogenintetraosid, Tigogeninhexaosid, Capsicosid, Ammunosid B, Ammumosid C, Ammumosid D, Ammumosid E, Desglukodesramnoparillin, Desglukoparillin, Parilli, Sarsaparillosid, Asparagosid C, Asparagosid □, Asparagosid G, Asparagosid H, Protoyuccosid H, Yukkosid B, Lanatigosid, Monosid, Biosid, Triosid, Purpureagitosid, Gekogenin, Rocogenin, Diogenin, Tigogenin, Protopolygametosid, Tomatonin, Laxogeninlycotetraosid , Alliogeninlycotetraosid, Karoteosid A, Cyclosieversiosid H, Acantofilosid C, Alliofuspsid A, Alliospirosid A, Cyclosieversiosid F, Theasaponin, Acantofilosid B, Tigonin (az összes) a Calha Polypetala növény glikozidja vagy Cyclosieversiosid G.

Az előzőekben felsorolt szteroid-glikozidok közül különösen előnyös a Funcoside C, D, E, F, G vagy I, a Dioscin, Rocosid, Lanatigonin, Digitonin és Tomatonin. A leginkább előnyös a Digitonin és a Tomatonin.

Az aglikonként az vagy £>-amiril-, a lupán-, hopán-, dammarán-, linosztán- vagy holosztán sor egy vegyületét és szénhidrátkomponensként 2-8 elágazó vagy nem elágazó gyökből *··· ·· ·· ·♦ » · · · · · · • ·· .· · ·« álló oligoszacharidot tartalmazó, a találmány szempontjából A jelű kimutató szerként előnyösen alkalmazható triterpén-glikozidok a következők lehetnek: Aescin, Avenacin, Theasaponin, '<-Hederin, Caulosid C, Stichinosid A, Cyclamin, Chinovin, a cukorrépából nyert szaponin, Hyposid vagy a Fatsia japonica növényből nyert triterpén-glikozid.

A koleszterinnel szelektíven komplex vegyületet alkotni képes, a találmány szempontjából A jelű kimutató szerként előnyösen alkalmazható hidrofób proteinek a következők lehetnek: Folch-féle meilin-protein, a lizoszóma és a mitokondrium proteinjei, fibrinogén, immunglobulin, cerebron, mioglobin, tripszin, Cytochrom C, Cytochrom P-450 vagy a lipoproteinek apofehérjéje .

A baktériumokból, tengeri mikroorganizmusokból, rovaroktól és kígyóktól nyert és a koleszterinnel szelektíven komplex vegyületet alkotni képes, a találmány szempontjából A jelű kimutató szerként előnyösen alkalmazható fehérjeszerű toxinok a következők lehetnek: sztreptolizin o, pneumolizin, liszteriolizin, A és C tipusu perfrigénből nyert <T-toxin C. I., A és C uj tipusu 3-toxin C. I., Haemolysin C. I. histolyticum, C és D tipusu Haemolysin C. I. botulinum, tetanolizin, cerebrolizin, alveolizin, tűringeolizin vagy az Actinie Metridium senile-ből nyert citotoxin.

A koleszterinnel komplex vegyületet alkotni képes, a találmá./y szempontjából A jelű kimutató szerként előnyösen alkalmazható polién-antibiotikumok a következők lehetnek: Amphotericin B, Philipin vagy Nistatin.

A koleszterinhez nagy affinitást mutató, a találmány • ♦··· ·· ·· ·· ·· ······* • · ·····» • · · · · · · · 4 szempontjából A jelű kimutató szerként előnyösen alkalmazható enzimek a következők lehetnek: koleszterin-oxidáz, koleszterin-dehidrogenáz, koleszterin-észtergáz.

Az A jelű kimutató szerként alkalmazható glikozidok, hidrofób proteinek, fehérjeszerü toxinok, polién-antibiotikumok és nagy affinitásu enzimek csoportjából a glikozidokat részesítjük előnyben, mivel ezek kémiai stabilitása a legjobb és szerves oldószeres vagy magasabb hőmérsékletű szintéziseknél is megőrzik a bőr koleszterinjével való komplexképző képességüket. A glikozidok kis molekulatömege lehetővé teszi, hogy nagy mólarányu kimutatószert tartalmazó anyagokat állítsunk elő, és igy a bőr koleszterinje és az ilyen anyag között nagy számú kölcsönhatási pont jöjjön létre.

A glikozidok közül különösen előnyben részesítjük a szteroid-glikozidokat, mivel a koleszterinnel a triterpén-glikozidoknál hatásosabban tudnak komplex vegyületet alkotni.

A hidrofób proteinek, a fehérjeszerü toxinok, a polién-antibiotikumok és a nagy affinitásu enzimek is siekerrel alkalmazhatók a diagnosztizáló anyag előállítására, de csekélyebb kémiai stabilitásuk és inaktiválódásuk lehetősége következtében jelentősen behatárolják az affin-enzimatikus vegyületek előállításának eljárását. Ezen kívül az ilyen kimutató szerek nagy molekulatömege valamilyen mértékben mindenképpen csökkenti a végtermék érzékenységét, igy a bőrfelületi koleszterin-kimutatásnál a diagnosztizáló anyagot nagyobb koncentrációban és hosszabb behatási idővel kell alkalmazni.

Magától értetődően arra törekszünk, hogy a reakciók enyhe körülmények között menjenek végbe, azaz semleges pH-nál, • ···· ·· ·· ·· · · · · « · ·· · ·· gyenge ionerősség mellett, alacsony hőmérsékleten és rövid reakcióidővel.

B jelű észlelést elősegítő anyagként olyan enzimeket alkalmazunk, amelyek az A jelű kimutató szerrel reagálva páciensek bőrfelületén koleszterin vizuális kimutatására szolgáló affin-enzimatikus terméket eredményeznek. A B jelű észlelést elősegítő anyagot az acetil-kolin-észtergáz, tirozináz, glükózo-6-foszfát-dehidrogenáz , glükózooxidáz, glükózoamiláz , galaktozidáz, peroxidáz, lúgos vagy savas foszfatáz, -_<-kimotripszin vagy pirofoszfatáz enzimek közül választjuk.

Mindegyik ilyen enzimet párosíthatjuk a korábbiakban felsorolt A jelű kimutató szerek közül bármelyikkel, de előnyben a szteroid-glikozidokat részesítjük.

A c jelű térhálósitó szer alkalmazása kiszélesíti a páciensek bőrfelületén koleszterin vizuális kimutatására szolgáló vegyületek előállítási eljárásának technológiai lehetőségeit, miközben az A és B jelű vegyületek funkciós csoportjainak aktivitása maximális marad.

Ebben az esetben is előnyben részesítjük azokat a vegyületeket, amelyek előállításához olyan koleszterinre affinis A jelű kimutató szert használunk, amelyet az aglikonként a furosztán- és spirosztán sor ciklopentán-perhidro. -fenantrén-fragmensét és szénhidrátkomponensként 3-10 elágazó vagy nem elágazó monoszacharid csoportból álló oligoszacharid-fragmenst tartalmazó szteroid-glikozidok közül választunk.

Az előbbiekben említett szteroid-glikozidok kémiai stabilitása jó, és keményebb reakció-feltételek mellett, azaz magasabb hőmérsékleten és adott esetben szerves oldószerben oldva köthetők a térhálósitó polimerhez, ez a lehetőség biztosítja nagy mólarányu előfordulásukat a végtermékben. A páciensek bőrfelületén koleszterin vizuális kimutatására szolgáló vegyületeket tehát úgy állítunk elő, hogy keményebb reakció-feltételek mellett a C térhálósitó szerhez kötjük az A jelű kimutató szert, majd kímélő reakció-feltételek mellett az A jelű kimutató szert és a C jelű térhálósitó szert tartalmazó termékhez a B jelű észlelést elősegítő anyagot, igy ennek enzimatikus aktivitása megmarad.

A c jelű térhálósitó szer lehet kismolekuláju, aszimmetrikus, bifunkcionális vegyület; például bróm-cián, triklór-triazin vagy 2-amino-4,6-diklór-S-triazin.

A nagymolekuláju, polifunkcionális vegyületek C jelű térhálósitó szerként történő felhasználása lehetővé teszi, hogy a koleszterin vizuális kimutatására szolgáló vegyületben az A jelű kimutató szer és a B jelű észlelést elősegítő anyag arányát széles határok között változtassuk, igy például beállíthatjuk a vegyület bőrfelülethez kötődő kapcsolási centrumai számának (A jelű kimutató szer) és a B jelű észlelést elősegítő anyag mennyiségének optimális arányát.

Nagymolekuláju, polifunkcionális, C jelű térhálósitó szerként poliszacharidokat, proteineket vagy szintetikus polimereket, azaz primer amin, karboxil, hidroxil, aldehid, hidro-halogenid, keverék anhidrid, iminoéter, azid, hidrazid, izocianát vagy epoxi funkciós csoportot tartalmazó, tetszőleges nagymolekuláju vegyületeket alkalmazunk.

Előnyös nagymolekuláju, polifunkcionális, C jelű

- 21 térhálósitó szerek például az akrilsav és a maleinsav-anhidrid kopolimerek.

Különösen előnyös nagymolekuláju, polifunkcionális, C jelű térhálósitó szer az N-vinil-pirrolidon-maleinsav-anhidrid kopolimer. A felsorolt C jelű térhálósitó szereket bármelyik A jelű kimutató szerrel és bármelyik B jelű észlelést elősegítő anyaggal kombinálni lehet. Ekkor mindig az A-C-B jelű végterméjet kapjuk.

Különösen előnyösek azok a vegyületek, amelyeknél A jelű kimutató szerként szteroid-glikozidokat alkalmazunk.

B jelű anyagként itt a lúgos foszfatázokat és a peroxidázokat részesítjük előnyben. Különösen előnyös a tormából nyert peroxidáz.

Az A jelű kimutató szer és a B jelű észlelést elősegítő anyag aktiválására olyan vegyületeket használunk, amelyek a funkciós csoportjaikat reakcióképes formába alakítják át. Például a primer amin, a karboxil és az b4-glikol funkciós csoportokat az önmagában ismert azid-, karbo-diimid-, szukcin-imid- vagy perjodát-módszerrel aktiválhatjuk.

Különösen előnyben részesítjük a perjodát- és karbo-diimid-módszert, mivel a leginkább kímélő szintézis-körülmények ezekkel a módszerekkel érhetők el és igy a vegyületbe bevitt enzim aktivitása is maximális marad.

A találmány szerinti eljárásban felhasznált vizes sópuffer oldatokat olyan vegyületekből készítjük, amelyek pufferhatása az 5-9 pH-tartományban érvényesül, és az enzimekre inaktiváló vagy inhibiáló hatást nem gyakorolnak. A borát-, citrát- és foszfát-pufferek lehetnek például ilyen oldatok.

• ♦ · · • ·

- 22 Olyan sókoncentrációt alkalmazunk, amely a találmány szerinti reakciónál konstans pH-értéket biztosit az oldatban, de nem lépi túl azt a határt, amelynél az enzim denaturálódása bekövetkezik.

Az A jelű kimutató szerek közül néhány, például egyes szteroid-glikozidok, triterpén-glikozidok és polién-antibiotikumok vízben csak nehezen vagy egyáltalán nem oldhatók, ezért ezek feloldásához szerves oldószereket kell használni. Ilyen poláris, szerves oldószerek lehetnek például a dimetil-szulfoxid, dimetil-formamid, hexametanol, dimetil-formamid és toluol 2:1 arányú elegye, dimetil-formamid és hexán 2:1 arányú elegye.

A koleszterin-kimutatásra szolgáló, találmány szerinti vegyületek előállítási eljárásának körülményei (a hőmérséklet és a tartózkodási idő a termosztátban) a kiválasztott A, B és C jelű komponensektől függnek. Ha a B jelű észlelést elősegítő anyag enzim, akkor a reakció hőmérsékletének 20 °C alatt kell lennie. A reakciót előnyösen 4 °C hőmérsékleten, 5-9 pH-értékü pufferoldatban hajtjuk végre. Ha a C jelű térhálósitó szer szintetikus polimer és az A jelű kimutató szer glikozid, akkor a reakciót szerves oldószerben és magasabb hőmérsékleten (120 °C-ig) is megvalósíthatjuk, továbbá a reakcióidőt is úgy választhatjuk meg, hogy a végtermék kitermelése maximális legyen.

A reakció komponenseinek mólarányát az A és B jelű anyag molekulatömegének, a bőr koleszterinjéhez való affinitás és az alkalmazott enzim aktivitása mértékének megfelelően választjuk meg.

• ·

- 23 A továbbiakban a találmány lényegét közelebbről pél dákkal és ábrákkal világítjuk meg. Az ábrák címei:

1. ábra

2. ábra

3. ábra

4. ábra

Alap ábra

A találmány szerinti vegyület és kölcsönhatása a páciensek bőrfelületén a koleszterinnel az 1. és 2. szabadalmi igénypontnak megfelelően

A találmány szerinti vegyület és kölcsönhatása a páciensek bőrfelületén a koleszterinnel a 3. és 4. szabadalmi igénypontnak megfelelően

A találmány szerinti vegyület és kölcsönhatása a páciensek bőrfelületén koleszterinnel az 5. és 18. szabadalmi igénypontnak megfelelően.

A találmány szerinti eljárást a következő példákkal szemléltetjük közelebbről a korlátozás szándéka nélkül.

1. példa

100 mg Tomatonint (A) adunk 10 ml vízhez, majd 40 mg nátrium-perjodátot adunk még hozzá és 20 °C hőmérsékleten, 4 órűn keresztül állni hagyjuk. Az igy készített oldatból 1 ml-t és a 0,2 M koncentrációjú, 7,5 pH-értékü foszfát-pufferben oldott '/-kimotripszin (B) 10 mg/ml-es oldatából 1 ml-t összeöntünk, az elegyet 12 órán keresztül 4 °C hőmérsékleten tartjuk, ezzel megkapjuk a végtermék vizes oldatát.

• «

2. példa mg tormából nyert peroxidázt (Β) 1 ml vízben oldunk, és 0,5 mg nátrium-perjodádot adunk hozzá, majd 4 °C hőmérsékleten, 8 órán keresztül állni hagyjuk. Az igy készített oldathoz 3 mg koleszterin-oxidázt (A) és 1 ml 0,2 M koncentrációjú, 7,5 pH-értékü foszfát-puffért adunk, az elegyet 12 órán keresztül 4 °C hőmérsékleten tartjuk, ezzel megkapjuk a végtermék vizes oldatát.

3. példa mg poliakrilsavat (C) 10 ml, 4,8 pH-értékü acetát-pufferben oldunk és 15 mg n-ciklohexil-N'-(2-morfolinil-4-etil)-karbodiimid-m-p-toluol-szulfonátot adunk hozzá. Az elegyet 1,5 órán keresztül 0 °C hőmérsékleten állni hagyjuk. Az igy készített oldathoz 5 mg o-sztreptolizint (A) és 5 mg tormából nyert peroxidázt (B) tartalmazó 5 ml puffer-oldatot adunk. Az oldatot 2 órán keresztül 20 °C hőmérsékleten tartjuk. így megkapjuk a végterméket.

4. példa

100 mg Agavosid G-t (A) adunk 5 ml vízhez és 100 mg brómciánt (C) adunk még hozzá, majd 1 mol-os NaOH-oldattal beállítjuk a pH-értéket 11-re. Az elegyet 30 percig 4 °C hőmérsékleten tartjuk, ezután a pH-értéket foszforsav-adagolással 8,5-re csökkentjük. Az igy készített oldatból 1 ml-t és a 6 mg lúgos foszfatázt (B) tartalmazó 0,5 mol-os, 8,5 pH-értékü foszfát-puffer oldatából 3 ml-t összeöntünk. Az elegyet 12 órán keresztül 4 °C hőmérsékleten tartjuk, ezzel megkapjuk a végtermék oldatát.

5. példa

500 mg Nistatint (A) és 250 mg etilén-maleinsav-anhidrid kopolimert (C) 5 ml dimetil-formamidban oldunk, és 3 órán keresztül argon atmoszférában, 50 °C hőmérsékleten tartjuk.A terméket 20 ml éterrel kicsapatjuk és vákuumban 20 °C hőmérsékleten szárítjuk. Az igy kapott termékből 6 ml-t és a 0,2 M koncentrációjú, 7,5 pH-értékü foszfát-pufferben oldott £-galaktozidáz (B) 2 mg/ml-es oldatából 1 ml-t összeöntünk, az elegyet 12 órán keresztül 4 °C hőmérsékleten tartjuk, ezzel megkapjuk a végtermék oldatát.

6. példa mg Aescint (A) és 100 mg N-vinil-pirrolidon-maleinsav-anhidrid kopolimert (C) 1 ml DMSO-ban oldunk, és 2 órán keresztül 100 °C hőmérsékleten tartjuk. A terméket 3 ml acetonnal kicsapatjuk és foszfor-pentoxid fölött, vákuumban 4 órán keresztül 100 °C hőmérsékleten szárítjuk. Az igy kapott termékből 8 mg-ot adunk a 0,2 M koncentrációjú, 7,5 pH-értékü foszfát-pufferben oldott 3-kimotripszin (Β) 1 mg/ml-es oldatának 1 ml-éhez, az elegyet 15 órán keresztül 6 °C hőmérsékleten tartjuk, ezzel megkapjuk a végtermék oldatát.

Az előző példákban leírtak szerint előállított terméket az A jelű kimutató szer mólaránya jellemzi. Az A jelű kimutató szert és a C jelű térhálósitó szert tartalmazó közbülső termék elkülönített előállítási lépése lehetővé teszi a B jelű észlelést elősegítő anyag maximális enzimatikus aktivitásának megtartását,

- 26 mivel az enzim megkötése kíméletes reakció-feltételek mellett történik.

A találmány tárgya továbbá eljárás a páciensek bőrfelületén koleszterin kimutatására a találmány szerinti affin-enzimatikus vegyületek alkalmazásával.

A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek segítségével történő diagnosztizáló eljárásnál nem kell a koleszterin mennyiségét pontosan mérni, csak azt kell megállapítani, hogy a páciens érelmeszesedésben szenvedő beteg, vagy a kockázati csoporthoz tartozik-e, vagy gyakorlatilag egészséges, Ahhoz, hogy a pácienseket ezekbe a csoportokba be tudjuk sorolni, a bőr epidermiszének szarurétegében meg kell állapítani az egyes csoportokra jellemző koleszterin-tartalmat.

Erre a célra a találmány szerint előállított minden egyes vegyület esetében három különböző koncentrációjú affin-enzimatikus anyagot készítünk. Ezeket három pont formájában felvisszük a páciensek bőrére, előnyösen a tenyér felületére. Az adott vegyület maximális koncentrációja az összes kezelt személynél, a bőrükben a legkevesebb koleszterinnel rendelkező egészségeseknél is, a továbbiakban a felvitt pontok ill. foltok elszíneződéséhez vezet. Ezek a foltok tehát bizonyos mértékben a koleszterinnel végbemenő reakció kontrollpontjainak tekinthetők. A találmány szerint előállított vegyületek minimális koncentrációjú oldata csak a bőrükben maximális mennyiségű koleszterinnel rendelkező, klinikai stádiumban lévő érelmeszesedéses betegeknél vezet a foltok elszíneződéséhez. A találmány szerint előállított vegyületek közepes koncentrációjú oldata az érelmeszesedésben megbetegedetteknél és a kockázati csoportba sorolható személyeknél (a normálisnál nagyobb koleszterin-tartalom) is elszíneződéshez vezet, de az egészségeseknél nem.

A páciensek bőrére tehát a találmány szerint előállított vegyületek három különböző koncentrációjú oldatát visszük föl. Ha csak egy folt szineződik el, akkor az adott személyt egészségesnek nyilvánítjuk, két elszineződött foltnál a pácienst a kockázati csoportba soroljuk, három színes foltnál pedig a klinikai stádiumban lévé érelmeszesedéses betegek csoportjába.

A diagnózis megállapítására elegendő a testfelület tetszőleges részén néhány négyzetcentiméter bőrfelület. Különösen előnyös azonban a tenyér felületét erre a célra használni, mivel könnyen hozzáférhető és faggyumirigyek itt nem találhatók.

A találmány szerint előállított vegyületeket tehát három különböző koncentrációjú oldat formájában, 10-20 μΐ-nyi mennyiségben felvisszük a bőrfelületre és 1 percig termosztóljuk. A bőr koleszterinjéhez nem kötődő, felesleges vegyület-mennyiséget leöblítjük. A bőr koleszterinjéhez kötődött, találmány szerint előállított vegyületek láthatóvá tétele céljából ugyanarra a bőrfelületre felvisszük a vegyületek előállításakor B jelű észlelést elősegítő anyagként alkalmazott enzimnek megfelelő szubsztrátumot, amely a találmány szerint előállított vegyületekkel végbemenő enzimreakció során színes terméket képez. Erre vonatkozóan a következő irodalmi közleményekre hivatkozunk: Ngo, T. T. és Lenhoff, Η. M.: Enzymemendiated Immunoassay, Plenum Press, New York, 1985., az orosz nyelvű fordításban 11.

p. és Leninger, A.: Biochemie, Mir kiadó, Moszkva, 1976.,

198 p. :

• ·

- 28 Az enzimreakció szubsztrátumának megfelelően a színtelen szubsztrát-oldat vörösre, sárgára, sötétkékre, zöldre, ibolyára szineződik, vagy a színes oldat elszintelenedik.

Ha a B jelű észlelést elősegítő anyag például a tormából nyert peroxidáz, akkor ennek az enzimnek a szubsztrátuma közvetlenül az elkészítés után felhasználva az alább felsorolt oldatok bármelyike lehet:

1. oldat: 1 mM (2,2'-azino-bisz(3-etil-benztiazolin-6-

-szulfonsav), 0,002 % hidrogén-peroxid , foszfát-citrát puffer-oldatban oldva, pH = 4,3;

2. oldat: 4 mM o-fenilén-diamin, 0,004 % hidrogén-peroxid, foszfát-citrát puffer-oldatban oldva, pH = 5;

3. oldat: 0,4 mM 3,3',5,5'-tetrametilén-benzidin , 0,004 % hidrogén-peroxid, acetát puffer-oldatban oldva, pH = 6,0.

A felsoroltakon kívül az immunenzim-analizisben széles körben alkalmazott más peroxidáz-szubsztrátumokat is használhatunk .

Ha a koleszterin vizuális kimutatására szolgáló affin-enzimatikus vegyületben a B jelű észlelést elősegítő anyag például a lúgos foszfatáz, akkor ennek az enzimnek a szubsztrátuma olyan oldat lehet, amely dietil-amin puffer-oldatban (pH = 9,5) 2,5 mM P-nitro-fenol-foszfátot és

0,5 mM magnézium-kloridot tartalmaz, vagy használhatjuk a lúgos foszfatáz egyéb, az immunenzim-analizisben alkalmazott szubsztrátumait is.

200 személy vizsgálatának ellenőrzött diagnózisát foglaltuk össze a következő táblázatban. Látható, hogy erős a korreláció a találmány szerinti diagnosztikus eljárás és a vérerek atheroszklerotikus károsodása között.

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Eljárás páciensek bőrfelületén koleszterin vizuális kimutatására szolgáló affin-enzimatikus vegyületek előállítására koleszterinre affinis, A jelű kimutató szerből és B jelű, észlelést elősegítő anyagból, azzal jellemezve , hogy aglikonként a furosztán- és spirosztán sor ciklopentán-perhidro-fenantrén-fragmensét és szénhidrátkomponensként

3-10 elágazó vagy nem elágazó monoszacharid csoportból álló oligoszacharid-fragmenst tartalmazó szteroid-glikozidok;

aglikonként az vagy ,^-amiril-, a lupán-, hopán-, dammarán-, linosztán- vagy holosztán sor egy vegyületét és szénhidrátkomponensként 2-8 elágazó vagy nem elágazó gyökből álló oligoszacharidot tartalmazó triterpén-glikozidok; a koleszterinnel szelektíven komplex vegyületet alkotni képes hidrofób proteinek;

a baktériumokból, tengeri mikroorganizmusokból, rovaroktól és kígyóktól nyert és a koleszterinnel szelektíven komplex vegyületet alkotni képes fehérjeszerü toxinok;

a koleszterinnel szelektiven komplex vegyületet alkotni képes polién-antibiotikumok vagy a koleszterinhez nagy affinitást mutató enzimek csoportjából kiválasztott, A jelű kimuatót szert kémiai módszerrel, vizes közegben, az A jelű kimutató szer és az aktiváló vegyület 1:1-től 1:10-ig terjedő mólaránya, valamint az A jelű kimutató szer 1-20 mg/ml közötti koncentrációja és a pH 4-11 határok közötti értéke melett, 0-25 °C ···· ·· «· ·· * · · · · · · • «····· hőmérsékleten, 1-24 órán keresztül aktiváljuk, majd az igy kapott oldathoz hozzáadjuk az acetil-kolin-észteráz, tirozináz, glükóz--6-foszfát-dehidrogenáz, glükóz-oxidáz , glükóz--amiláz, galaktozidáz, peroxidáz, lúgos vagy savas foszfatáz, 'g-kimotripszin vagy pirofoszfatáz enzimek közül kiválasztott B jelű, észlelést elősegítő anyagot, az A:B mólarányt 20:1 és 1:1 határok közötti értékre állítjuk, az oldatot 0-25 °C hőmérsékleten, 1-24 órán keresztül állni hagyjuk.
2. Eljárás páciensek bőrfelületén koleszterin vizuális kimutatására szolgáló affin-enzimatikus vegyületek előállítására koleszterinre affinis, A jelű kimuató szerből és B jelű, észlelést elősegítő anyagból, azzal jellemezve , hogy az acetil-kolin-észteráz, tirozináz, glükóz—6-foszfát-dehidorgenáz, glükóz-oxidáz , glükóz-amiláz , galaktozidáz, peroxidáz, lúgos vagy savas foszfatáz, c<-kimotripszin vagy pirofoszfatáz enzimek közül kiválasztott B jelű, észlelést elősegítő anyagot kémiai módszerrel, vizes köz egben, a B jelű, észlelést elősegítő anyag és az aktiváló vegyület 1:1 -tői 1:10-ig terjedő mólaránya, valamint a B jelű, észlelést elősegítő anyag 1-20 mg/ml közötti koncentrációja és a pH

4-11 határok közötti értéke mellett, 0-25 °C hőmérsékleten, 1-24 órán keresztül aktiváljuk, majd az igy kapott oldathoz hozzáadjuk az aglikonként a furosztán- és spirosztán sor ciklopentán-perhidro-fentantrén-fragmensét és szénhidrátkomponensként 3-10 elágazó vagy nem elágazó monoszacharid csoportból álló oligoszacharid-fragmenst tartalmazó szteroid-glikozidok;

♦· ·« ί··· ·· • · • ·· • ·<» az aglikonként az ,-χ- vagy ^-amiril-, a lupán-, hopán-, dammarán-, linosztán- vagy holosztán sor egy vegyületét és szénhidrátkomponensként 2-8 elágazó vagy nem elágazó gyökből álló oligoszacharidot tartalmazó triterpén-glikozidok, a koleszterinnel szelektíven komplex vegyületet alkotni képes hidrofób proteinek;

a baktériumokból, tengeri mikroorganizmusokból, rovaroktól és kígyóktól nyert és a koleszterinnel szelektíven komplex vegyületet alkotni képes fehérjeszerü toxinok;

a koleszterinnel szelektíven komplex vegyületet alkotni képes polién-antibiotikumok vagy a koleszterinhez nagy affinitást mutató enzimek csoportjából kiválasztott A jelű kimutató szer, az A:B mólarányt 20:1 és 1:1 határok közötti értékre állitjuk, végül az oldatot 0-25 °C hőmérsékleten, 1-24 órán keresztül állni hagyjuk.
3. Eljárás páciensek bőrfelületén koleszterin vizuális kimutatására szolgáló affin-enzimatikus vegyületek előállítására koleszterinre affinis, A jelű kimutató szerből és B jelű, észlelést elősegítő anyagból, azzal jellemezve , hogy az aglikonként a furosztán- és spirosztán sor ciklopentán-perhidro-fenantrén-fragmensét és szénhidrátkomponensként 3-10 elágazó vagy nem elágazó monoszacharid csoportból álló oligoszacharid-fragmenst tartalmazó szteroid-glikozidok ;

az aglikonként az ,>j- vagy β-amiril-, a lupán-, hopán-,

- 34 dammarán-, linosztán- vagy holosztán sor egy vegyiiletét és szénhidrátkomponensként 2-8 elágazó vagy nem elágazó gyökből álló oligoszacharidot tartalmazó triterpén-glikozidok;

a koleszterinnel szelektíven komplex vegyületet alkotni képes hidrofób proteinek;

a baktériumokból, tengeri mikroorganizmusokból, rovaroktól és kígyóktól nyert és a koleszterinnel szelektíven komplex vegyületet alkotni képes fehérjeszerü toxinok;

a koleszterinnel szelektíven komplex vegyületet alkotni képes polién-antibiotikumok vagy a koleszterinhez nagy affinitást mutató enzimek csoportjából kiválasztott, A jelű kimutató szert feloldjuk

5-9 pH értékű vizes sópuffer oldatban úgy, hogy az A jelű kimutató szer koncentrációja 1-20 mg/ml határok között legyen, az igy kapott oldathoz hozzáadjuk a bróm-cián, triklór-triazin vagy 2-amino-4,6-diklór-S-triazin vegyületek közül kiválasztott, kismolekuláju, aszimmetrikus, bifunkcionális, C jelű térhálósitó szert olymódon, hogy az A:C mólarány 1:0,5 és 1:10 között legyen, majd az oldatot 0-20 °C hőmérsékleten 1-20 órán keresztül állni hagyjuk, ezt követően az acetil-kolin-észteráz, tirozináz, glükózo-6-foszfát-dehidrogenáz, glükózooxidáz, glükózoamiláz, galaktozidáz , peroxidáz, lúgos vagy savas foszfatáz, cxZ-kimotripszin vagy pirofoszfatáz enzimek közül kiválasztott, B jelű, észlelést elősegítő anyagot adjuk hozzá, az A:B mólarányt 20:1 és 1:1 közötti értékre állítjuk, végül az oldatot 0-20 °C hőmérsékleten, 1-48 órán keresztül állni hagyjuk.

··
4. Eljárás páciensek bőrfelületén koleszterin vizuális kimutatására szolgáló affin-enzimatikus vegyületek előállí tására koleszterinre affinis, A jelű kimutató szerből és B jelű, észlelést elősegítő anyagból, azzal jellemezve , hogy az acetil-kolin--észteráz, tirozináz, glükózo-6-foszfát-dehidrogenáz, glükózooxidáz, glükózoamiláz , galaktozidáz , peroxidáz, lúgos vagy savas foszfatáz, '^-kimotripszin vagy pirofoszfatáz enzimek közül kiválasztott B jelű, észlelést elősegítő anyagot feloldjuk
5-9 pH-értékü vizes sópuffer oldatban úgy, hogy a B jelű, észlelést elősegítő anyag koncentrációja 1-20 mg/ml határok között legyen, az igy kapott oldathoz hozzáadjuk a bróm-cián, triklór-triazin vagy 2-amino-4,6-diklór-S-triazin vegyületek közül kiválasztott, kismolekuláju, aszimmetrikus, bifunkcionális, C jelű tráhálósitó szert, a B:C mólarányt 1:0,5 és 1:10 közötti értékre állítjuk, majd az oldatot 0-20 °C hőmérsékleten,

1-20 órán keresztül állni hagyjuk, ezt követően az aglikonként a furosztán- és spirosztán sor ciklopentán-perhidro-fenantrén-fragmensét és szénhidrátkomponensként 3-10 elágazó vagy nem elágazó monoszacharid csoportból álló oligoszacharid-fragmenst tartalmazó szteroid-glikozidok;

az aglikonként az oC- vagy jd-amiril-, a lupán-, hopán-, dammarán-, linosztán- vagy holosztán sor egy vegyületét és szénhidrátkomponensként 2-8 elágazó vagy nem elágazó gyökből álló oligoszacharidot tartalmazó triterpén-glikozidok;

a koleszterinnel szelektíven komplex vegyületet alkotni képes hidrofób proteinek;

a baktériumokból, tengeri mikroorganizmusokból, rovaroktól és kígyóktól nyert és a koleszterinnel szelektíven komplex vegyületet alkotni képes fehérjeszerü toxinok;

• e · • ··

- 36 a koleszterinnel szelektíven komplex vegyületet alkotni képes polién-antibiotikumok vagy a kolszterinhez nagy affinitást mutató enzimek csoportjából kiválasztott, A jelű kimutató szert adjuk hozzá, az A:B mólarányt 20:1 és 1:1 közötti értékre állítjuk, végül az oldatot 0-20 °C hőmérsékleten, 1-48 órán keresztül állni hagyjuk .

5. Eljárás páciensek bőrfelületén koleszterin vizuális kimutatására szolgáló affin-enzimatikus vegyületek előállítására koleszterinre affinis, A jelű kimtató szerből és B jelű, észlelést elősegítő anyagból, azzal jellemezve , hogy az aglikonként a furosztán- és spirosztán sor ciklopentán-perhidro-fenantrén-fragmensét és szénhidrátkomponensként 3-10 elágazó vagy nem elágazó monoszacharid csoportból álló oligoszacharid-fragmenst tartalmazó szteroid-glikozidok;

az aglikonként az vagy £>-amiril-, a lupán-, hopán-, dammarán-, linosztán- vagy holosztán sor egy vegyületét és szénhidrátkomponensként 2-8 elágazó vagy nem elágazó gyökből álló oligoszacharidot tartalmazó triterpén-glikozidok;

a koleszterinnel szelektíven komplex vegyületet alkotni képes hidrofób proteinek;

a baktériumokból, tengeri mikroorganizmusokból, rovaroktól és kígyóktól nyert és a koleszterinnel szelektíven komplex vegyületet alkotni képes fehérjeszerü toxinok;

a koleszterinnel szelektíven komplex vegyületet alkotni képes polién-antibiotikumok vagy a koleszterinhez nagy affinitást mutató enzimek csoportjából vagy a felsorolt anyagok kombinációjából kiválasztott, A jelű kimutató szert és az acetil-kolin-észteráz, tirozináz, glükózo-6-foszfát-dehidrogenáz , glükózooxidáz , glükózoamiláz, galaktozidáz, peroxidáz, lúgos vagy savas foszfatáz,οό-kimotripszin vagy pirofoszfatáz enzimek közül kiválasztott B jelű, észlelést elősegítő anyagot - az A:B mólarány 20:1 és 1:1 határok között megválasztott értéke melett - 5-9 pH-értékü vizes sópuffer oldatban feloldjuk úgy, hogy az A és B jelű anyag koncentrációja egyaránt 0,1-20 mg/ml határok között legyen, ezután hozzáadjuk az oldathoz a poliszacharidok, proteinek vagy szintetikus polimerek, azaz primer amin, karboxil, hidroxil, aldehid, hidro-halogenid, keverék anhidrid, iminoéter, azid, hidrazid, maleinsavimid, izocianát vagy epoxi funkciós csoportot tartalmazó, tetszőleges nagymolekuláju vegyületek csoportjából kiválasztott C jelű, nagymolekuláju, polifunkcionális térhálósitó szert az (A+B) mólarányt 1:0,5 és 1:10 közötti értékre állítjuk, végül az oldatot 0-20 °C hőmérsékleten, 1-20 órán keresztül, a végtermék képződéséig állni hagyjuk.
6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy nagymolekuláju, C jelű térhálósitó szerként akrilsav vagy maleinsav-anhidrid kopolimert használunk.
7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy nagymolekuláju, C jelű térhálósitó szerként N-vinil-pirrolidon-maleinsav-anhidrid kopolimert használunk.
8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az eljáráshoz A jelű kimutató szerként felhasznált szteroid-glikozidokat a következő vegyületek közül választjuk ki:

Agavosid A, Agavosid B • ·»'*· «k* «· ++ ·· ·«»·«»· • · ·· · · ··

Agavosid C, Agavosid D, Agavosid F,

Agavosid G, Agavosid H, Trillin

Funcosid C, Funcosid D,

Funcosid F

Funcosid G, Funcosid I, Dioscin

Gracillin, Protodioscin, Cicubasaponin

Juncosid E, Juncosid H, Lanatigonin,

Desglukodigitonin, Digitonin, Gitonin, Rocosid C, Rocosid

D, Rocosid E, Funcosid E, Alliumosid C, Polygonatonin,

Tigogenintetraosid, Tigogeninhexaosid, Capsicosid, Ammumosid B,

Ammumosid C, Ammumosid D, Ammumosid D, Desglukodesgramnoparillin,

Desglukoparillin, Parillin,sarsaparillosid, Asparagosid C,

Asparagosid D, Asparagosid G, Asparagosid H, Protoyuccosid H, Yuccosid B, Lanatigosid, Monosid, Biosid, Triosid, Purpureagitosid, Gekogenin, Rocogenin, Diogenin, Tigonenin, Protopolygametosid, Tomatonin, Laxogeninlycotetraosid, Alliogeninlycotetraosid, Karoteosid A, Cyclosieversiosid H, Acantofilosic

C, Alliofusosid A, Alliospirosid A, Cyclosieversiosid F,

Theasaponin, Acantofilosid B, Tigonin (az összes), a Calha Polypetala növény glikozidja vagy Cyclosieversiosid G.
9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy A jelű kimutató szerként Funcosid C-t, D-t, E-t, F-t, G-t vagy I-t, Dioscint, Rocosidot, Lanatigonint, Digitonint vagy Tomatonint használunk.
10. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy A jelű kimutató szerként Digitonint vagy Tomatonint használunk.
11. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy az eljáráshoz A jelű kimutató ···* «· • * • · ·· · · «« · • * ·« 9 · «·

- 39 szerként felhasznált triterpén-glikozidokat a következő vegyületek közül választjuk ki: Aescin, Avenacin, Theasaponin, 3-Hederin, Caulosid C, Stichinosid A, Cyclamin, Chinovin, a cukorrépából nyert szaponin, Hyposid vagy a Fatsia japonica növényből nyert triterpén-glikozid.
12. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy az eljáráshoz A jelű kimutató szerként felhasznált hidrofób proteineket a következő vegyületek közül választjuk ki: Folch-féle meilin-protein, a lizoszóma és a mitkondrium proteinjei, fibrinogén, immunoglobulin, cerebron, mioglobin, tripszin, cytochrom C, cytochrom P-450 vagy a lipoproteinek apofehérjéje.
13. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy az eljáráshoz A jelű kimutató szerként felhasznált fehérjeszerü toxinokat a következő vegyületek közül választjuk ki: sztreptolizin o, pneumolizin, liszteriolizin, A és C tipusu perfrigénből nyert <3-toxin C. I., A. és C uj tipusu <£-toxin C. I., Haemolysin C. I.

hystolyticum, C és D tipusu Haemolysin C. I. botukinum, tetanolizjn, cerebrolizin, alveolizin, türingeolizin vagy az Actinie Metridium senile-ből nyert citotoxin.
14. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy az eljáráshoz A jelű kimutató szerként felhasznált polién-antibiotikumokat a következő vegyületek közül választjuk ki: Amphotericin B, Pholipin vagy Nistatin.
15. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve , hog az eljáráshoz A jelű kimutató ♦ · · · · « *· · * ··

- 40 szerként felhasznált nagy affinitásu enzimeket a következő vegyületek közül választjuk ki: koleszterin-oxidáz, koleszterin -dehidrogenáz, koleszterin-észteráz.
16. Az 1-15. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy az A jelű kimutató szer ill.

a B jelű, észlelést elősegítő anyag kémiai aktiválására az önmagában ismert azid-, karbo-diimid-, szukcin_imid-módszert vagy a perjodátos oxidáció módszerét alkalmazzuk.
17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy az A jelű kimutató szer illetve a B jelű, észlelést elősegítő anyag kémiai aktiválására a karbo-diimid-módszert vagy a perjodátos oxidáció módszerét alkalmazzuk.
18. Eljárás páciensek bőfelületén koleszterin vizuális kimutatására szolgáló affin-enzimatikus vegyületek előállítására koleszterinre affinis, A jelű kimutató szerből és

B jelű, észlelést elősegítő anyagból az 1.-től az 5.-ig terjedő és a 8., 9. és 14. igénypontok szerint azzal jellemezve , hogy az aglikonként a furosztán- és spirosztán sor ciklopentán-perhidro-fenantrén-fragmensét és szénhidrátkomponensként 3-10 elágazó vagy nem elágazó monoszacharid csoportból álló oligoszacharid-fragmenst tartalmazó szteroid-glikozidok;

az aglikonként az «Ζ- vagy /b-amiril-, a lupán-, hopán-, dammarán-, linosztán- vagy holosztán sor egy vegyületét és szénhidrátkomponensként 2-8 elágazó vagy nem elágazó gyökből • »··· ·· ·· ·« ·· ······« • · ··«··· álló oligoszacharidot tartalmazó triterpén-glikozidok vagy a koleszterinnel szelektíven komplex vegyületet alkotni képse polién-antibiotikumok csoportjából vagy a felsorolt anyagok kombinációjából kiválasztott, A jelű kimutató szert poláris, szerves oldószerben feloldjuk, majd hozzáadjuk a poliszacharidok, proteinek vagy szintetikus polimerek, azaz primer amin, karboxil, hidroxil, aldehid, hidro-halogenid, keverék anhidrid, iminoéter, azid, hidrazid, maleinsavimid, izocianát vagy epoxi funkciós csoportot tartalmazó, tetszőleges nagymolekuláju vegyületek csoportjából kiválasztott C jelű, nagymolekuláju, polifunkcionális térhálósitó szer úgy, hogy az A és C jelű anyagok koncntrációja egyaránt 1-20 mg/ml között és az A:C mólarány 1:1 és 1:10 határok között legyen, az igy készített oldatot 0,5-6 órán keresztül 20-120 °C hőmérsékleten tartjuk, majd a közbülső terméket (A-C) önmagában ismert módon oldószerrel kicsapatjuk, 4-10 órán keresztül 80-120 °C hőmérsékleten, vákuumban, foszfor-pentoxid fölött szárítjuk, ezután az 5-9 pH-értékü vizes sopuffer-oldatban oldott acetil-kolin-észteráz, tirozináz, glükózo-6-foszfát-dehidrogenáz, glükózooxidáz, glükózoamiláz, galaktozidáz, peroxidáz, lúgos vagy savas foszfatáz, •<-kimotripszin vagy pirofoszfatáz enzimek közül kiválasztott B jelű, észlelést elősegítő anyag

1- 10 mg/ml koncentrációjú oldatát hozzáadjuk a száraz közbülső termékhez (A-C) úgy, hogy ennek koncentrációja

2- 20 mg/ml legyen, végül az oldatot 2-12 órán keresztül 4-8 °C hőmérsékleten tartjuk.
19. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jelle - ···· «· ·· • · · · · · • ······ mezve , hogy poláris szerves oldószerként dimetil-szulfoxidot, dimetil-formamidot, hexametanolt, dimetil-formamid és toluol 2:1 arányú elegyét, dimetil-formamid és hexán 2:1 arányú elegyét használjuk.
20. A 3., 4., 5., 18. vagy 19. igénypontok szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy vizes sóoldatként az 5-9 közötti pH-tartományban pufferhatást kifejteni képes borát-, citrát- vagy foszfát-oldatot használunk.
21. Eljárás az 1-20. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított vegyületek vizuálisan érzékelhetővé tételére, azzal jellemezve , hogy a B jelű, észlelést elősegítő anyagként felhasznált enzim egy szubsztrátumának alkalmazásával és a z 1-20. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított vegyületekkel színes teméket képezünk .