NL8901732A - Werkwijze voor het bereiden van affino-enzymatische verbindingen voor visuele aanduiding van cholesterol op huidoppervlak gebaseerd op een detecterend middel met affiniteit voor cholesterol en visualiserend middel en toepassing daarvan. - Google Patents

Description

Werkwijze voor het bereiden van affino-enzymatische verbindingenvoor visuele aanduiding van cholesterol op huidoppervlak gebaseerd opeen detecterend middel met affiniteit voor cholesterol en visualiserendmiddel en toepassing daarvan._

Aanvraagster noemt als uitvinders:

1. JURY MIKUAILOVICH LOPUKHIN

2. IRINA PAVLOVNA ANDRIANOVA (overleden) (erfgenamen: Lev. Alexandrovich Andrianov (echtgenoot)

Dmitry Borisovich Gudkov (zoon)

Ekaterina Lvovna Andrianova, (dochter)

3. VIKTOR VIKTOROYICH ZUEVSKY

4. ALEXANDR BORISOVICH RABOVSKY.

De voorgestelde uitvinding ligt op het gebied van de bio-organi-sche chemie, deze handelt namelijk over een werkwijze voor het bereidenvan affino-enzymatische verbindingen voor visuele aanduiding van cho¬lesterol op huidoppervlak gebaseerd op een detecterend middel met affi¬niteit voor cholesterol en een visualiserend middel.

De verkregen verbindingen kunnen op zeer efficiënte wijze ge¬bruikt worden in diagnostica, die vroege diagnostica van atherosclero-se, verificatie van de diagnose in klinische en poliklinische omstan¬digheden en controle van behandeling omvatten. Zij kunnen eveneens ge¬bruikt worden in fysiologische, histologische en histochemische onder¬zoeken voor de detectie van hoge cholesterolgehaltes en het localiserendaarvan. Daarnaast maken de voorgeschreven verbindingen het mogelijkeveneens lage cholesterolgehaltes te detecteren, typerend voor pa¬tiënten met bepaalde pathologieën, in het bijzonder van oncologi¬sche oorsprong.

Atheresclerose en de complicaties daarvan, zoals infarcten, apo¬plectische aanvallen en gangrenen, zijn een van de belangrijkste morta-liteitsoorzaken in alle landen van de wereld.

Onderzoeken, die gedurende vele jaren uitgevoerd zijn, hebben ge¬toond, dat atherosclerose een ziekte is, waarvan detectie en het voor¬komen hoge prioriteit geniet, en dat de grootste risicofactor van athe¬rosclerose ophoping van cholesterol in het organisme is. Profylaxe vanatherosclerose bij de bevolking vooronderstelt ten eerste identificatievan de hoogste risicogroep onder de patiënten, gevolgd door gediffe¬ rentieerde behandeling ervan en verandering in levensstijl. Het moei-lijkst bij het voorkomen van atherosclerose is selectie van hoge risi¬cogroepen door middel van de hoeveelheid cholesterol, die opeengehooptis in het organisme. De bestaande werkwijzen van atherosclerosediagnos-tica zijn gebaseerd op kwantisering van het algemene cholesterolgehaltein veneus bloedplasma. (Consensus Conference on Lowering Blood Choles¬terol to Prevent Heart Disease, JAMA, 1985, 253, blz. 2080-286; TheLipid Research Clinies Population Studies Data Book, publicatie 80-152,Bethesda, Ma, National Institute of Health, 1980, vol. I; LipidResearch Clinies Program, JAMA, 1984, 251, blz. 351-364). In sommigegevallen wordt een cholesterolgehalte boven 260 mg% als voldoende be¬schouwd om een patiënt in de risicogroep op te nemen. Een meer pre-ciese diagnose kan gemaakt worden door analyse van bloedplasmalipopro-teïnen en bepaling van de atherogeniteitsindex, die een verhouding isvan verschil tussen totale hoeveelheid en hoeveelheid met hoge dicht¬heid lipoproteine cholesterol tot hoeveelheid met hoge dichtheid li-poproteïne chlolesterol:

Een patiënt wordt beschouwd als behorende tot de risicogroep,wanneer zijn atherogeniteitindex hoger is dan 3, en behorende tot deatherosclerosegroep, wanneer genoemde index boven 5,6 komt. (KlimovA.N. "Phenotyping of lipoproteins", Methodological recommendations ofthe USSR Ministry of Health, M., Medicine, 1975; Goldfourt V., HoltzmanE., Neufeld H.N. "Total and High Density Lipoprotein Cholesterol in theSerum and Risk of Mortality", Britisch Medical Journal, 1985, 290, blz.1239-1243).

Gebruik van deze werkwijzen maakt het afnemen van bloed noodzake¬lijk, hetgeen misschien traumatisch kan zijn voor patiënten en, daar¬naast niet geheel veilig is vanwege de mogelijke virale infecties.Fractionering van plasmalipoproteïnen en cholesterol analyse blijvennog steeds een ingewikkelde en kostbare handeling. Daarbij, correleertkwantisering van totale cholesterol en zelfs een complete fenotypenngin een geval op drie niet met de mate van ernst van atherosclerose(zie: Myasnikov. A.L., "Hypertensive disease", 1965, M., Medicine, blz.300).

Daarbij komt, dat recente onderzoeken getoond hebben, dat hetbloedplasma niet ten volle cholesterolophopingsprocessen weerspiegelt, die typerend zijn voor de bloedvatwanden en andere brady-trofischeweefsels.

Oplossing van sommige fundamentele problemen, betrokken bij athero-sclerose pathogenese, heeft het mogelijk gemaakt diagnostische werkwij¬zen verder te verbeteren. Het is aangetoond, dat weefsel cholesterol eenvooraanstaande rol speelt in de ontwikkeling van atherosclerotischeziekte. Weefsels zijn gmÏdentificeerd, die cholesterol op dezelfdewijze als de bloedvatwand ophopen.

Recente onderzoeken hebben eveneens een nauwe correlatie getoondtussen cholesterolgehalte ibloedvatwand en huid. Dit heeft het ont¬wikkelen van fundamenteel nieuwe diagnostische werkwijzen, in het bij¬zonder voor atherosclerose, mogelijk gemaakt.

De bovengenoemde correlatie tussen cholesterolgehalte in de bloed¬vatwand en huid werd gevonden door direkte kwantisering van cholesterolbij huidbiopsie. Monsters werden ingevroren in vloeibare stikstof engelyofiliseerd; cholesterol werd geëxtraheerd met Folch-reagens engekwantificeerd met gebruik van traditionele chemische of biochemischewerkwijzen. (Zie: Nikitiη Y.P., Gordienko I.A., Dolgov A.V., FilimonovaT.A. "Cholesterol content in the skin and its correlation with lipidquotiënt in the serum in normals and in patients with ischemic cardiacdisease", Cardiology, 1987, XXVII nr. 10, blz. 48-51; Bouisson H., DeGraeve, Solera M.L. et al. Ann.Biol.Clin., 1982. vol. 40, blz.

361-407). Deze werkwijze is echter, wegens de traumaticiteit en inge¬wikkeldheid ervan niet geschikt voor het screenen van de bevolking.

Het Amerikaanse octrooi schrift nr. 4.458.686 beschrijft een werk¬wijze die het mogelijk maakt glucose en ethanol, gelocaliseerd in hetbloed te kwantificeren, direkt onder de huid of op het oppervlak ervan,en duidt aan, dat cholesterol kwantificering onder gebruik van choleste-roloxidase eveneens mogelijk is. De werkwijze is gebaseerd op stoichio-metrische veranderingen in zuurstofconcentratie bij gebruik van radox-enzymen, grotendeels oxidoreductases, die specifiek zijn voor het sub¬straat in kwestie. Volgens deze werkwijze wordt kwantificering van ver¬anderingen in zuurstofconcentratie electrochemisch gemaakt, bijvoor¬beeld polarografie met gebruik van speciale apparatuur en speciaal ont¬wikkelde electrode.

Zulke geraffineerde instrumentatie maakt de diensten van hoogbe-kwaam personeel noodzakelijk voor het stellen van diagnoses. Dit allesbeperkt onvermijdelijk de mogelijkheid de bevolking volgens deze werk¬wijze te screenen.

Aanvrage PCT/US 84/00888 stelt een detectie-visualiseringscomplex voor waar de detecterende en visualiserende elementen direkt of via eenbindmiddel verbonden zijn. Het complex is bedoeld voor detectie vanlage hoeveelheden doelmoleculen, waaronder lipiden in biologische weef¬sels. Deze detecteringswerkwijze van lipiden kan echter alleen onderlaboratoriumomstandigheden gebruikt worden en vereist afname vantevo-ren van biologische vloeistof of weefsel van een patiënt, hetgeen wilzeggen dat de werkwijze traumatisch is, vele stappen bevat en ingewik¬keld uit te voeren is.

Correlatie tussenholesterolgehalte in de huid en de ernst vanatherosclerotische vasculaire lesies wordt verkregen op huidmonsters.Naast traumaticiteit, heeft deze werkwijze verschillende nadelen, omdat1 mm dikke monsters meerdere huidlagen omvatten: hoornlaag (gemiddeldedikte 0,1 mm) en daarmee verbonden weefsel (derma proper) vertegenwoor¬digd door twee lagen - papi11 air en retinale. Beide lagen hebben eengoede bloedtoevoer en, dientengevolge, bevatten de monsters vaten enbloed; daarnaast bevatten zij zweetafscheidingen en vetklieren en af¬scheidingen daarvan. Het subcutane vet is direkt gelocaliseerd onder dederma en kan eveneens in de monsters komen, dat wil zeggen, dat hetero¬geniteit van monsters de waarden over opgehoopte cholesterol in de huidkunnen verstoren. Uit dit oogpunt, dient een werkwijze die de kwantifi¬cering van het cholesterolgehalte op het huidoppervlak in de hoornlaagvan de derma mogelijk maakt, als de meest nauwkeurige beschouwd te wor¬den.

Het doel van de uitvinding was het verschaffen van een werkwijzevoor bereiding van affino-enzymatische verbindingen voor visuele indi¬catie van cholesterol direkt op de huid van een patiënt, in het bij¬zonder in de epidermische hoornlaag zonder bloed- of huidmonsters tenemen van patiënten. Elk deel van de huid kan gebruikt worden voordiagnostica, maar het meest geschikt is het palmoppervlak omdat hetgeen vetklieren bevat waarvan de afscheidingen zowel als de hoornlaag,cholesterol bevatten hetgeen diagnostische resultaten kan beïnvloe¬den.

De uitvinding lost dit probleem op door een werkwijze te verschaf¬fen ter verkrijging van affino-enzymatische verbindingen die bi-functi-oneel zijn van nature. De verbindingen worden selectief gebonden aanvrije cholesterol van de huid, en kunnen vervolgens visueel detecteer¬baar gemaakt worden. Ten minste twee componenten zijn noodzakelijk terverkrijging van zo'n verbinding: detectiemiddel A, gekozen uit eengroep stoffen, die in staat zijn op onderscheidende wijze stabiele com¬plexen met vrije cholesterol van de huid te vormen ten einde de gehele bi-functionele verbinding affiniteit te verlenen voor cholesterol, envisualiserend middel B dat visuele detectie toestaat van de bi-functio¬nele verbinding die gebonden is aan cholesterol.

De verbindingen die volgens de onderhavige uitvinding bereid wor¬den, vereenvoudigen atherosclerosediagnostica het meest, zijn niettraumatisch en vereisen geen bijzondere instrumentatie. Gebruik vandeze verbindingen in diagnostica zal het mogelijk maken te bepalen, inwelke van de drie groepen de onderzochte patiënten thuishoren: athe-rosclerotica, risicogroep of normalen.

De affino-enzymatische verbindingen voor visuele indicatie vancholesterol, verkregen volgens de onderhavige uitvinding, en de diag¬nostische werkwijze gebaseerd op gebruik daarvan, tentitatief "drie-punts werkwijze" genoemd, zijn het meest geschikt voor bevolkings-screening. De werkwijze is zo simpel in uitvoering dat het geen gespe¬cialiseerd personeel vereist en zelfs onder huiselijke omstandighedengebruikt kan worden.

De verbindingen volgens de uitvinding kunnen slechts verkregenworden hetzij van detecterend middel A, hetzij van visualiserend middelB door functionele groepen van een van deze middelen chemisch te acti¬veren. Vervolgens vormen zij, na additie aan een middel, dat geacti¬veerde chemische groepen bevat, van het andere middel, onder bepaaldeomstandigheden een stabiele A-B binding resulterend in een hoogmolecu-laire bi-functionele verbinding voor visuele aanduiding van cholesterolop de huid van patiënten.

De volgende verbindingen worden gebruikt als cholesterol/detecte¬rend middel met affiniteit voor A:

SteroTde glycosiden, die als een aglicoon, een cyclopentaanper-hydrofenetreen fragment van de furostanol- of spirostanolreeks, en oli-gosaccharide fragment met 3 tot 10 monosacchariden met een lineaire ofvertakte structuur bevatten (Kintya P.K. "Structure and biological ac-tivity of steroid glycosides of spirostan and furostan series",Kishinev, Stinza, 1987, blz. 142), of

Triterpeenglycosiden, die een aglicoon van de alfa- of beta-amy-rillupaan-, gopaan-, dammaraan-, linostaan- of holostaanreeks en oli-gosaccharide van 2-8 residuen met vertakte of lineaire structuur bevat¬ten. (Dekanosidze G.E., Chirva V.Y., Sergienko T.V., Uvarova N.I.

"Study on triterpene glycosides", Tbilisi, Mezniereba, 1982), ofHydrofobe proteinen, die in staat zijn op onderscheidende wijzeeen complexe verbinding met cholesterol te vormen (Klimov A.N., TitovaG.V., Kozhevnikov K.A., Biochemistry, 1982, vol. 47, nr. 2, blz.

226-232); Klimov A.N., Kozhevnikoc K.A., Klyueva N.N. et al. VoprosyMed. Khimii, 1984, vol. 30, nr. 3, blz. 86-90; Titova G.V., KlyuevaN.N., Kozhevnikov K.A., et al., Biochemistry, 1980, vol. 45, nr. I,blz. 51-55), of

Proteïne-toxinen, die in staat zijn op onderscheidende wijzecomplexe verbindingen met cholesterol te vormen. Zij worden verkregenuit bacteriën, zee-micro-organismen, insecten of slangen (Dalin M.V.,Fish N.G. "Protein toxins of microorganisms", Moscow, Medicine, 1980),of

Polyeen antibiotica, die in staat zijn op onderscheidende wijzecomplexe verbindingen met cholesterol te vormen (I.J. Katzenstein, A.M.Spielvogel, A.W. Morman, J. Antibiot., 27, 12, 1974, blz. 943-951; JongShang-Shyng, Wang Hsi-Hua. Clin.J. Microbiol., 1976, 9, (1-2), blz.19-30; Readig Josephine D. et al. Biochim.Biophys.Acta, 1982, 685 (2),blz. 219-224), of

Enzymen met hoge affiniteit, waarvan cholesterol het substraat isen die daar een hoge affiniteit mee hebben.

Als een visualiserend middel B, worden de volgende enzymen ge¬bruikt: acetylcholinesterase, tyrosinase, glucose-6-fosfaatdehydrogena-se, gluco-oxidase, glucoamylase, galactosidase, peroxidase, basische ofzure fosfatase, alfa- chymotrypsine of pyrofosfatase.

Het probleem is opgelost, omdat het affinans detecterend middel(A) gekozen wordt uit een groep steroïde glycosidasen, die als eenaglycoon een cyclopentaanperhydrofenantreen-fragment uit de furostanol-of spirostanolreeks bevat, en oligosaccharide fragment met 3 tot10 monosacchariden met een lineaire of vertakte structuur, of uit eengroep triterpeenglycosiden, die een aglycoon bestaande uit alfa- ofbeta-amyraan-, lupaan-, gonaan-, dammaraan-, lanostaan-, of holostaan-reeks en oligosacchariden van 2-8 residuen met een vertakte of lineairestructuur, of uit een groep hydrofobe proteïnen die in staat zijn op onder¬scheidende wijze complexe verbindingen te vormen met cholesterol, ofuit een groep proteïne toxinen, die in staat zijn op onderschei¬dende wijze complexe verbindingen met cholesterol te vormen, en uitbacteriën, zee-micro-organismen, insecten of slangen, of uit een groep polyeen-antibiotica die in staat zijn op onderschei¬dende wijze complexe verbindingen met cholesterol te vormen, of

uit enzymen met een grote affiniteit voor cholesterol, die che¬misch geactiveerd worden in een waterig medium met detecterend middelA/activator in een mol verhouding = 1:1 - 1:10, detecterend middel A

concentratie 1-20 mg/ml, temperatuur 0-25eC, pH = 4-11, gedurende0,1-24 uur.

Aan de verkregen oplossing wordt een visualiserend middel B toege¬voegd, gekozen uit de volgende enzymen: acetylchollnesterase, tyrosina-se, glucose-6-fosfaatdehydrogenase, glucoseoxldase, glucose-amylase,galactosidase, peroxidase, basische of zure fosfatase, alfa-chymotryp-sine of pyrofosfatase in A/B mol verhouding = 20:1 - 1:1. Vervolgenswordt de oplossing gedurende 1-24 uur geïncubeerd bij 0-25eC totdathet eindprodukt verkregen wordt.

Zoals boven genoemd, kunnen de functionele groepen van visualise¬rend middel B ook onderworpen worden aan chemische activering. In ditgeval wordt middel B gedurende 1-24 uur geactiveerd in een waterig me¬dium met B/activator mol verhouding = 1:1 - 1:10, middel B concentratie1-20 mg/ml, bij temperatuur 0-25°C, pH = 4-11. Vervolgens wordt detec¬terend middel A, dat een van de boven opgesomde stoffen Is, aan de op¬lossing toegevoegd, met A/B mol verhouding = 20:1 - 1:1, en wordt de op¬lossing gedurende 1-24 uur bij 0-25°C geïncubeerd totdat het eindpro¬dukt verkregen wordt.

In de onderhavige uitvinding, worden detecterend middel A of visu¬aliserend middel B geactiveerd volgens de welbekende azlde-, carbodi-imide- en succlnlmidewerkwijzen, of de werkwijze van perjodaatoxida-tie.

In gevallen wanneer visualiserend middel B een hoogmoleculaireverbinding is, zoals een enzym, en detecterend middel A een laagmolecu-laire verbinding is, bijvoorbeeld glycosiden, kan een molecuul van heteindprodukt slechts een molecuul visualiserend middel B bevatten. Demolaire hoeveelheid detecterend middel A, verantwoordelijk voor hetbinden van huidcholesterol in het eindprodukt, kan echter het gehaltevisualiserend middel B slechts een paar maal overtreffen, in overeen¬stemming met het aantal functionele groepen in het enzymmolecuul, diein staat zijn detecterend middel A te binden zonder beduidend verliesvan enzymatische activiteit. In zulke verbindingen is het gehalte visu¬aliserend middel B, waarbij een enzym gebruikt werd, beperkt. Het re¬sultaat is een betrekkelijk lage gevoeligheid van de aldus verkregenverbindingen, en de noodzaak de blootstellingstijd in diagnostischewerkwijzen te vergroten.

Het werd ter uitbreiding van technische prestatie van affino-en-zymatische verbindingen voor visuele aanduiding van cholesterol op dehuid, en met het oog op het vergroten van de gevoeligheid ervan voor¬gesteld, bovengenoemd detecterend middel A en visualiserend middel B te JU. M. — __ "t-.> binden onder gebruik van bindmiddel C, genomen uit een serie laagmole-culaire asymmetrische bifunctionele verbindingen, zoals broomcyaan,trichloortriazine of 2-amino-4,6-dichloor-3-triazine. In dit geval kun¬nen verbindingen op twee manieren verkregen worden: hetzij doordat de¬tecterend middel A eerst gebonden wordt aan bindmiddel C en dat vervol¬gens visualiserend middel B toegevoegd wordt aan het tussenprodukt(A+C) ter verkrijging van het eindprodukt, hetzij doordat het tussen¬produkt B+C is, waaraan detecterend middel A toegevoegd wordt.

Bij de eerste optie wordt detecterend middel A opgelost volgens degebruikelijke werkwijze in een waterzoutbuffer met pH - 5-9, met con¬centratie 1:20 mg/ml, vervolgens wordt een laagmoleculair asymmetrischbifunctioneel bindend middel C, gekozen uit de bovengenoemde stoffen,toegevoegd aan de oplossing, met A/C mol verhouding = 1:0,5 - 1:10. Deverkregen oplossing wordt geïncubeerd gedurende 1-20 uur bij 0-20°C;vervolgens wordt visualiserend middel B, gekozen uit de bovengenoemdestoffen, toegevoegd met A/B mol verhouding = 20:1 - 1:1, en wordt de op¬lossing geïncubeerd gedurende 1-48 uur bij 0-20°C ter verkrijging vanhet eindprodukt.

Ter verkrijging van een affino-enzymatische verbinding via hettussenprodukt B+C, wordt visualiserend middel B opgelost volgens eengebruikelijke werkwijze in een waterzoutbuffer met pH 5-9 in een con¬centratie van 1-20 mg/ml. Vervolgens wordt een laagmoleculair asymme¬trisch bifunctioneel bindmiddel C, gekozen uit de bovengenoemde stof¬fen, toegevoegd met B/C mol verhouding = 1:0,5 - 1:10. De verkregen op¬lossing wordt geïncubeerd gedurende 1-20 uur bij 0-20°C; vervolgenswordt detecterend middel A toegevoegd met A/B mol verhouding = 20:1 -1:1 en wordt de oplossing geïncubeerd gedurende 1-48 uur bij 0-20°Cter verkrijging van het eindprodukt.

De beste gevoeligheid van affino-enzymatische verbindingen voorvisuele aanduiding van cholesterol op de huid wordt echter, verkregenbij gebruik van enkele hoogmoleculaire polyfunctionele verbindingen,zoals polysacchariden, proteïnen of synthetische polymeren, dat wilzeggen alle hoogmoleculaire verbindingen die een van de functionelegroepen bevat die gekozen zijn uit de volgende: primaire aminen, car-boxyl, hydroxyl, aldehyde, halogeenanhydride, gemengde anhydriden,iminoesters, azide, hydrazide, maleïmide, isocyanaat of epo*yde alsbindmiddel C. Verder worden zowel detecterend middel A, dat e'en van deverbindingen of mengsels is van de bovengenoemde stoffen als visualise¬rend middel B, eveneens een van de bovengenoemde stoffen, onafhankelijkgeïmmobiliseerd door een van deze verbindingen. Een zodanige affino- enzymatische verbinding maakt het mogelijk de A/B verhoudingen hetmeest te veranderen, afhankelijk van de mate van affiniteit voor huid-cholesterol van gekozen middel A, en dienovereenkomstig afhankelijk vande affiniteit van enzym B dat gebruikt is. Wanneer detecterend middel Abijvoorbeeld gebruikt wordt met lagere affiniteit voor cholesterol, danis het mogelijk het mol ai re gehalte van het eindprodukt beduidend tevergroten.

Zulke affino-enzymatische verbindingen worden als volgt verkregen:detecterend middel A, dat een van de bovengenoemde stoffen of mengselsdaarvan is, en visualiserend middel B, dat eveneens een van bovenge¬noemde is, worden in A/B mol verhouding = 20:1 -1:1 genomen en met con¬centratie van elk van de middelen van 0,1-20 mg/ml opgelost in een wa¬terige zoutoplossing met pH = 5-9. Hoogrnoleculair polyfunctioneel bind¬middel C wordt aan de verkregen oplossing toegevoegd; het wordt uitpolysacchariden, proteïnen of synthetische polymeren volgens het bo¬venstaande gekozen. A+B/C mol ai re verhouding = 1:0,5 -1:10. Vervolgenswordt de oplossing gedurende 1-20 uur bij 0-20°C geïncubeerd terverkrijging van het eindprodukt.

Onder de steroïde glycosiden, die gebruikt worden als detecte¬rend middel A en die als een aglicoon een cyclopentaanperhydrofenan-treen-fragment uit de furostanol- en spirostanolreeks en oligosacchari-de fragment met 3 tot 10 monosacchariden met een lineaire of vertaktestructuur bevatten: agavociden: A, B, C, D, F, H en G, trilline, funco-side I, dioscine, gracilline, photodoscine, cicubasaponine, juncosidenE en H, lanotigonine, desglycodigitonine, digitonine, gitonine, rocko-siden C, D en E, funcoside E, alluminiumoside C, polygonatonine, tigo-genine tetraoside, togigenine hexaoside, capsycoside, ammumosides B, C,D en E, desglycodesramnoparilline, desglycoparilline, parilline, sarma-parilloside, asparagosiden C. D. G en H, juccoside B, protojuccoside H,lanotigoside, monoside, bioside, trioside, purpureagitoside, tomatoni-ne, alliogenine liquotetraoside, karatavioside A, cyclosiversiocide H,acanthofilocide C, alliofusocide A, alliospriroside A, cyclosiversiosi-de F, theesaponine, acanthofiloside B, tigonine (totaal), glycoside uitCalba Polypatala of cyclosiversioside G de meeste voorkeur.

Uit de bovengenoemde groep steroïde glycosiden genieten de fun-cosiden C, D, E. F, G of I, dioscine, rockoside, lanotigonine, digito¬nine en tomatonine meer de voorkeur. De grootste voorkeur genieten di¬gitonine en tomatonine.

Uit de groep triterpeenglycosiden, gebruikt als detecterend middelA en die een aglicoon bevatten uit de alfa- of beta-amyril-, lupaan-, gopaan-, dammaraan-, lanostaan- of holostaanreeks, en oligosaccharidevan 2-8 residuen met een vertakte of lineaire structuur, gaat de mees¬te voorkeur uit naar: escine, avenacine, theesaponine, alfa-gederine,cauloside C, stichinoside A, cyclamine, chinovine, saponine uit suiker¬biet, hyposide en triterpeenglycoside verkregen uit Fatsia Japonica.

Uit de groep hydrofobe proteïnen gebruikt als detecterend middelA en die in staat zijn op onderscheidende wijze complexe verbindingenmet cholesterol te vormen, verdienen: Folch meileïne proteïne,lysosome proteïnen, proteïnen van mytochondria, fibrinogeen, immu-noglobulines, cerebron, myoglobine, tripsine, cytochroom C, cytochroomP-450 of apoproteïne van lipoproteïnen de voorkeur.

Uit de groep proteïne-toxines, die geleverd worden door bacte¬riën, zee-micro-organismen, insecten of slangen, die in staat zijncomplexe verbindingen met cholesterol te vormen die gebruikt worden alsdetecterend middel A genieten streptolysine 0, pneumolysine, listerio-lysine, 0-toxine C.I. verkregen uit Perfrigens van A en C types, if-tox-ine C.I. novyi van A en C types Hemblysine C.I. histolyticum, hemolysi-ne C.I. botulinum van C en D types, tetanolysine, cerebrolysine, alveo-lysine, turingeolysine of cytoxine uit Metridium seniel de meeste voor¬keur.

Uit de groep polyeen-antibiotica, die gebruikt worden als detecte¬rend middel A en die in staat zijn complexe verbindingen met choleste¬rol te vormen genieten amfotericine B, filipine of nistanine de voor¬keur.

Uit de groep enzymen met een hoge affiniteit voor cholesterol, diegebruikt worden als detecterend middel A genieten cholesteroloxidases,cholesteroldehydrogenases of cholesterases de voorkeur.

Onder de boven opgesomde stoffen met affiniteit die als detecte¬rend middel A gebruikt worden, te weten: glycosiden, hydrofobe prote¬ïnen, proteïne toxinen, polyeen-antibiotica en enzymen met hoge affi¬niteit, wordt de meeste voorkeur gegeven aan glycoside, als zijnde hetmeest chemisch stabiel en in staat gedurende de synthese zowel organi¬sche oplosmiddelen als hoge temperaturen te weerstaan naast het instaat blijven complexen met huidcholesterol te vormen. Een laag mole¬cuul gewicht van glycosiden maakt het mogelijk een verbinding te ver¬krijgen met een hoog molair gehalte detecterend middel, aldus meerderepunten leverend voor interactie tussen de verbinding en huidcholeste¬rol .

Onder de glycosiden genieten steroïde glycosiden het meest devoorkeur, daar zij efficiënter zijn vergeleken met triterpeenglycosi- den in het maken van complexen met cholesterol.

Hydrofobe proteïnen, proteïne-toxinen, polyeen-antibiotica enenzymen met hoge affiniteit worden eveneens op succesvolle wijze ge¬bruikt voor het verkrijgen van diagnostische gereedschappen, zij intro¬duceren echter bepaalde beperkingen in de werkwijze voor het bereidenvan affino-enzymatische verbinding, vanwege de lage chemische stabili¬teit ervan en neigingen tot inactivering. Bovendien vermindert een hoogmolecuul gewicht van deze detecterende middelen de gevoeligheid van heteindprodukt ietwat, hetgeen hogere concentraties van de verbinding no¬dig maakt en het langer blootstellen om de cholesterol aanduiding tekrijgen.

Natuurlijk, zou het voordeliger zijn reacties uit te voeren ondermilde omstandigheden, dat wil zeggen neutrale pH, laag ionogene kracht,lage temperaturen en korte reactietijd.

Enzymen, gebruikt als visualiserend middel B, die als resultaatvan reactie met detecterend middel A affino-enzymatische verbindingenleveren voor de visuele indicatie van cholesterol op de huid, wordengekozen uit de volgende lijst: acetylcholinesterase, tyrosinase, glyco-so-B-fosfaatdehydrogenase, glycoso-oxidase, glycosoamylse, galactosida-se, peroxidase, basische of zure fosfatase, alfachymotrypsine of pyro-fosfatase.

Al deze enzymen kunnen gebruikt worden met elk van de boven opge-somde detecterende middelen A, steroïde glycosiden echter verdienende voorkeur.

Gebruik van bindingsmiddel C breidt technische prestatie uit dewerkwijze voor het verkrijgen van de verbinding in kwestie, terwijl hetde functionele activiteit van middelen A en B het meest beschermt.

Verbindingen, die de meeste voorkeur genieten zijn die, welke ste¬roïde glycosiden als een detecterend middel A met affiniteit gebrui¬ken en die een cyclopentaanperhydrofenantreen-fragment uit de furosta-nol- of spirostanolreeks als aglycoon en een oligosaccharide-fragmentmet 3 tot 10 mono-sacchariden met een lineaire of vertakte structuurbevatten.

Zulke steroïde glycosiden bezitten hoge chemische stabiliteit enkunnen geïmmobiliseerd worden op een bindend polymeer onder harde om¬standigheden, dat wil zeggen hoge temperaturen en oplossing in'organi¬sche oplosmiddelen wanneer nodig, waardoor een hoog gehalte ervan inhet eindprodukt verzekerd wordt. Verbindingen voor de visuele indicatievan cholesterol op de huid worden verkregen door middel van achtereen¬volgens immobilisatie van detecterend middel A op bindend middel C on¬ der harde omstandigheden, vervolgens immobilisatie van visualiserendmiddel B op het prödukt, dat zowel A als C bevat onder zachte omstan¬digheden teneinde enzymatische activiteit van middel B te beschermen.

De volgende asymmetrische laagmoleculaire bifunctionele verbindin¬gen als bindmiddel C kunnen gebruikt worden: broomcyaan, trichloortria-zine of 2-amino-4,6-dichloor-3-triazine.

Gebruik van hoogmoleculaire polyfunctionele verbindingen als bind¬middel C maakt het mogelijk verhoudingen van middelen A en B inhet uiteindelijke produkt zeer te variëren, bijvoorbeeld met het doeleen optimale verhouding te verkrijgen tussen het aantal punten dat hetprodukt bindt aan het huidoppervlak (detecterend middel A) en de hoe¬veelheid visualiserend middel B.

Het is mogelijk verscheidene polysacchariden, proteïnen of syn¬thetische polymeren te gebruiken als een hoogmoleculair polyfunctioneelbindmiddel C, dat wil zeggen alle hoogmoleculaire verbindingen die eenvan de volgende functionele groepen bevat; primair amine, carboxyl,hydro-oxyl, aldehyd, halogeenhydride, gemengd anhydride, iminoester,azide, hydrazide, maleïmide, isocyanaat of epoxide.

Met betrekking tot hoogmoleculair polyfunctioneel bindingsmiddelC genieten copolymeren van acryl zuur of maleïnezuuranhydride de voor¬keur.

De grootste voorkeur geniet het copolymeer van N-vinylpyrrolidonen maleïnezuuranhydride. De bovengenoemde middelen C kunnen gebruiktworden met elk detecterend middel A en visualiserend middel B. Het uit¬eindelijke A-C-B produkt wordt altijd verkregen.

Verbindingen waarbij steroïde glycosiden gebruikt worden als de¬tecterend middel A genieten de meeste voorkeur.

Verbindingen, die in staat zijn functionele groepen van middelen Aen B om te zetten in een reaktieve toestand worden als activatoren vandeze middelen gebruikt. Groepen zoals primair amine, carboxyl, alfa-glycol kunnen geactiveerd worden volgens welbekende werkwijzen (azide,carbodiimide, succinimide, perjodaat enz.).

De perjodaat- en carbodiimide-werkwijzen genieten de meeste voor¬keur, omdat zij maximaal milde synthese-omstandigheden verzekeren en deactiviteit van het geïmmobiliseerde enzym beschermen.

Waterzoutbuffers zijn oplossingen van verbindingen die bufferactiebezitten binnen pH = 5-9, en die geen inactivering of inhibitie van en¬zymen veroorzaken. Deze kunnen bijvoorbeeld boraat, citraat, fosfaat enandere bufferoplossingen zijn. In de regel, worden waterzoutoplossingengebruikt, waarin de zoutconcentratie voldoende is om een stabiele pH

tijdens immobilisatie te verzekeren, maar niet te hoog is om denatura-tie van het enzym te veroorzaken.

Sommige detecterende middellen A, zoals steroïde glycosiden,triterpeen-glycosiden en polyeen-antibiotica, lossen onvoldoende of on¬volledig op in water en hebben derhalve organische oplosmiddelen nodig.Voor dit doel kunnen polaire aprotische oplosmiddelen gebruikt worden,bijvoorbeeld dimethylsulfoxide, dimethylformamide, hexamethanol, 2:1dimethylformamide/tolueenmengsel of 2:1 dimethylformamide/hexaanmeng-sel.

Omstandigheden ter verkrijging van verbindingen voor cholesterol-indicatie (temperatuur, incubatietijd) hangen af van de keuze van de A,B en C componenten. Gebruik van enzymen als visualiserend middel B be¬perkt de reactietemperatuur tot 20°C. Bij voorkeur, dient de reactiebij 4°C in een bufferoplossing met pH = 5-9 uitgevoerd te worden. Ge¬bruik van synthetische polymeren als bindmiddel C, en glycosiden alsdetectiemiddel A maakt het mogelijk de reactie in organische oplosmid¬delen uit te voeren zelfs bij hoge temperaturen (tot 120°C) en een re¬actietijd te kiezen die voldoende is om de maximaal mogelijke opbrengstvan eindprodukt te verkrijgen.

Mol ai re verhoudingen van de componenten worden vastgesteld inovereenkomst met moleculaire gewichten van de gekozen middelen A of B,affiniteit tot huidcholesterol en activiteit van het enzym, dat ge¬bruikt wordt.

Hieronder wordt de uitvinding toegeiicht aan de hand van verschil¬lende voorbeelden en tekeningen:

Fig. 1 - symbolen

Fig. 2 - verkregen verbindingen en de interactie ervan met cholesterol op het huidoppervlak van een patiënt volgens vb. 1, 2.

Fig. 3 - verkregen verbindingen en de interactie ervan met choles¬terol op het huidoppervlak van een patiënt volgens vb. 3, 4.

Fig. 4 - verkregen verbindingen en de interacties met cholesterolop het huidoppervlak van de patiënt volgens vb. 5, 18.

Voorbeeld 1 100 mg tomatonine (A) wordt in 10 ml water gebracht, 40 mlnatriumperjodaat wordt toegevoegd, en het mengsel wordt gedurende 4 uurbij 20°C geïncubeerd. 1 ml alfa-chymotrypsine-oplossing (B) (10 mg/ml) in 0,2 M fosfaatbuffer met pH = 7,5 wordt aan de verkregenoplossing toegevoegd en het mengsel wordt gedurende 12 uur bij 4°Cgeïncubeerd. Het resultaat is een waterige oplossing van het uitein¬delijke produkt.

Voorbeeld 2 3 mg peroxidase (B) uit mierikswortel wordt opgelost in 1 mlwater, 0,5 mg natriumperjodaat wordt toegevoegd, en het mengsel wordtgedurende 8 uur bij 4°C gefncubeerd. 3 mg cholesteroloxida (A) in1 ml 0,2 M fosfaatbuffer met pH = 7,5 wordt toegevoegd aan de verkregenoplossing, en het mengsel wordt gedurende 12 uur bij 4°C gefncubeerd.Het resultaat is een waterige oplossing van het eindprodukt.

Voorbeeld 3 10 mg polyacryl zuur (C) wordt opgelost in 10 ml acetaatbuffer met pH = 4,8, en 15 mg P-cyclohexyl-2-(4-morfoline) ethyl-carbodiimide-me- to-p-tolueensulfonaat wordt toegevoegd. Het mengsel wordt gedurende 1,5 uur bij 0°C gefncubeerd. Aan de verkregen oplossing wordt 5 ml buf-I & fer, dat 5 mg O-streptolysine (A) en 5 mg peroxidase (B) uit mieriks¬wortel bevat, toegevoegd. Het mengsel wordt gedurende 2 uur bij 20°Cgefncubeerd. Het resultaat is het eindprodukt.

Voorbeeld 4

Agavoside G (100 mg) (A) werd in 5 ml water gebracht en 100 mgbroomcyaan (C) wordt toegevoegd; pH = 11 wordt gehandhaafd door toevoe¬ging van 1M NaOH oplossing. Het mengsel wordt gedurende 30 minuten bij4°C gefncubeerd, en pH wordt verlaagd tot 8,5 door toevoeging vanfosforzuur. Aan 1 ml van de verkregen oplossing wordt 3 ml 0,5 M fos¬faatbuffer met pH = 8,5 die 6 mg alkalische fosfatase (B) bevatte toe¬gevoegd. Het mengsel wordt gedurende 12 uur bij 4°C gefncubeerd. Hetresultaat is een oplossing van het eindprodukt.

Voorbeeld 5

Nistatine (A) (500 mg) en een copolymeer van etheen met malefne-zuuranhydride (C) (250 mg) worden opgelost in 5 ml dimethylformamide enin een argonstroom bij 50°C gedurende 3 uur gefncubeerd. Het verkre¬gen produkt wordt neergeslagen in 20 ml ester, en in vacuo bij 20°C ge¬droogd. Aan 1 ml beta-galactosidase (B) oplossing (2 mg per ml) wordt6 ml van het verkregen produkt in 0,2 M fosfaatbuffer met pH = 7,5 toe¬gevoegd en het mengsel wordt bij 4°C gedurende 12 uur gefncubeerd.

Het resultaat is een oplossing van het eindprodukt.

Voorbeeld 6

Escine (A) (50 mg) en een copolymeer van N-vinylpyrrolidon met ma-lefnezuuranhydride (C) (100 mg) worden opgelost in 1 ml dimethylsul-foxide en gedurende 2 uur bij 100°C gefncubeerd. Het verkregen pro¬dukt wordt geprecipiteerd in 3 ml aceton, gedroogd in vacuum boven fos-forpentoxide gedurende 4 uur bij 100°C. Aan 1 ml alfa-chymotrypsine-op-lossing (B) (1 mg/ml) in 0,2 M fosfaatbuffer met pH = 7,5 wordt 8 mg van het verkregen produkt toegevoegd en het mengsel werd gedurende 15uur bij 6°C geïncubeerd. Het resultaat is een oplossing van het eind¬produkt.

In het laatste voorbeeld wordt het produkt gekarakteriseerd dooreen hoog mol air gehalte van detecterend middel A, en de stap ter ver¬krijging van tussenprodukt, dat middel A en hoogmoleculair bindend mid¬del C bevat, geeft de grootste bescherming van de enzymatische activi¬teit van visualiserend middel B vanwege de milde omstandigheden van deenzymirnmobilisatie.

Gebruik van de verbindingen voor visuele indicatie van cholesterolop de huid van een patiënt.

Diagnostica die de verbindingen, verkregen volgens de onderhavigeuitvinding, gebruiken worden niet gebaseerd op een nauwkeurige kwanti-sering van cholesterol, maar op een mogelijkheid te bepalen tot welkevan de drie groepen een patiënt behoort: atherosclerotica, risico¬groep en normalen. Ten einde te bepalen tot welke van deze groepen eenpatiënt behoort is het noodzakelijk het cholesterolgehalte te bepalenin de epiderme hoornlaag dat typerend is voor elk van de bovengenoemdegroepen.

Dienovereenkomstig worden drie concentraties gekozen voor elkeverbinding die bereid is volgens de onderhavige uitvinding en die ge¬bruikt wordt in diagnostica. Drie zulke verschillende concentraties vaneen affino-enzymatische verbinding worden als drie punten op de huidvan een patiënt gebracht, bij voorkeur op de palm. De maximale con¬centratie leidt tot het ontwikkelen van een vlek bij alle proefperso¬nen, waaronder normalen, bij wie het huidcholesterolgehalte het laagstis. Deze vlek wordt gebruikt als een soort controle voor het choleste-roleffect. De minimale concentratie van de verbinding geeft alleenvlekken bij patiënten met de klinische vorm van atheroscleroseziekte,bij wie het cholesterolgehalte het grootst is. Een verbindingsoplossingmet de tussenconcentratie geeft ontwikkeling van een vlek bij zowelatherosclerotische patiënten, als bij proefpersonen, die gewoonlijktoebehoren aan de risicogroep (hoog cholesterolgehalte), maar faalt inhet teweeg brengen van een vlek in normale mensen.

Aldus worden drie verschillende concentraties van verbindingen,verkregen volgens de uitvinding, op de huid van een patiënt opge¬bracht. Met een vlek, wordt een patiënt beschouwd als behorende totnormalen, met twee - tot de risicogroep, en in het geval van drie vlek¬ken - tot de klinische toestand van atherosclerotische patiënten.

Verschillende vierkante centimeters huidoppervlak, gekozen op een deel van het lichaam, zijn voldoende voor een diagnostisch proces. Depalm geniet de meeste voorkeur omdat die gemakkelijk toegankelijk is endaarnaast geen vetklieren bevat.

10-20 mcl van een verkregen verbinding wordt in drie verschillendeconcentraties op het huidoppervlak opgebracht en gedurende 1 minuutgeïncubeerd. De overtollige hoeveelheid verbinding, die niet gebondenis aan huidcholesterol, wordt verwijderd door wassen. Vervolgens wordteen substraat van het overeenkomstige enzym, gebruikt als visualiserendmiddel B in de vorming van de onderhavige verbinding, opgebracht ophetzelfde huidoppervlak. Een reactie tussen het enzym en de verbindingresulteert in een produktvlek.

Afhankelijk van het geselecteerde enzymatische substraat wordt eenkleurloze oplossing rood, geel, blauw, groen, violet of anders gekleurdof wordt de gekleurde oplossing ontkleurd.

Wanneer mierikswortelperoxidase bijvoorbeeld gebruikt wordt alsvisualiserend middel B, kunnen elk van de volgende oplossingen onmid¬dellijk na bereiding gebruikt worden als een substraat van het enzym:oplossing I: ABTC (2,2'-azinobis-(3-ethyl-benzthioazoline-6-sulfonzuur)ImM, waterstofperoxide-0,002% in fosfaatcitraatbuffer met pH = 4,3.Oplossing 2: c-fenyleendiamine 4 mM, waterstofperoxide 0,004% in fos-faat-citraatbuffer met pH = 5.

Oplossing 3: 3,3', 5,5'-tetramethyleenbenzidine 0,4 mM, waterstofperox¬ide 0,004% in acetaatbuffer met pH = 6.

of andere peroxidase-substraten die veel gebruikt worden bij immuno-en-zymatische analyse.

Wanneer alkalische fosfatase bijvoorbeeld gebruikt wordt als visu¬aliserend middel B, kan de volgende oplossing als een substraat van ditenzym gebruikt worden: p-nitrofenolfosfaat 2,5 mM, magnesiumchloride0,5 mM in diethylaminebuffer met pH = 9,5.

of elk ander alkalisch fosfatase-substraat dat gebruikt wordt bij im-muno-enzymatische analyse.

200 patiënten met geverifieerde diagnose zijn onderzocht, en deresultaten weergegeven in de tabel geven een hoge correlatie tussen devoorgestelde diagnostische werkwijze en een niveau van atheroscleroti¬sche vasculaire lesie.

TABEL

Claims (22)

1. Werkwijze voor bereiding van affino-enzymatische verbindingenvoor visuele aanduiding van cholesterol op huidoppervlak, gebaseerd opdetecterend middel A*/ en visualiserend middel B, met het kenmerk, datdetecterend middel A gekozen wordt uit een groep steroïde glycosiden,die als een aglycoon een cyclopentaanperhydrofenantreen-fragment van defurostanol- of spirostanolreeks bevat en een oligosaccharide-fragmentmet 3 tot 10 monosacchariden bevat met een lineaire of vertakte struc¬tuur bevatten, of - uit een groep triterpeenglycosiden, die een aglycoon van de alfa-of beta-amyral-, lupaan-, gopaan-, dammaraan-, lanostaan- ofholostaanreeks en een oligosaccharide met 2-8 resten met vertakte oflineaire structuur bevatten, of - uit een groep hydrofobe proteïnen, die in staat zijn op onder¬scheidende wijze complexe verbindingen te vormen met cholesterol, of - uit een groep proteïne toxinen, die in staat zijn op onder¬scheidende wijze complexe verbindingen te vormen met cholesterol en diegeleverd worden door bacteriën, zee-micro-organismen, insecten ofslangen, of - uit een groep polyeen-antibiotica, die in staat zijn op onder¬scheidende wijze complexe verbindingen met cholesterol te vormen, of - uit een groep enzymen met hoge affiniteit voor cholesterol, che¬misch geactiveerd wordt gedurende 0,1-24 uur in een waterig medium bijeen molverhouding van 1:1 - 1:10, middel A tot activator bij een con¬centratie van 1-20 mg/ml, van middel A van 1-20 mg/ml, een temperatuurvan 0-25°C, pH van 4-11 en aan de verkregen oplossing visualiserendmiddel B, gekozen uit de groep enzymen bestaande uit acetylcholineste-rase, tyrosinase, glucose-6-fosfaatdehydrogenase, glucose-oxidase, glu-cose-amylase, galactosidase, peroxidase, alkalische of zure fosfatase,alfa-chymotrypsine of pyrofosfatase, toegevoegd wordt in een mol verhou¬ding van 20:1 - 1:1 van A:B en de oplossing gedurende 1-24 uur geïn-cubeerd wordt bij een temperatuur van 0-25°C.

2. Werkwijze voor het bereiden van affino-enzymatische verbindin¬gen voor visuele aanduiding van cholesterol op huidoppervlak, gebaseerdop detecterend middel A*/ en visualiserend middel B, met het kenmerk, */ dat een stof is met affiniteit voor cholesterol. dat visualiserend middel B gekozen uit de groep enzymen bevattende ace-tylcholinesterase, tyrosinase, glucose-6-fosfaatdehydrogenase, glucoso-oxidase, galactosidase, alkalische of zure fosfatase, alfa-chymotrypsi-ne of pyrofosfatase, chemisch geactiveerd wordt gedurende 1-24 uur ineen waterige oplossing met een mol verhouding van 1:1 - 1:10 van B: ac-tivator bij een concentratie van 1-20 mg/ml van middel B, een tempera¬tuur van 0-25°C, pH van 4-11 en dat detecterend middel A gekozen uit degroep steroïde glycosiden die als aglycoon een cyclopentaanperhydro-fenantreen-fragment uit de furostanol- of spirostanolreeks, en een oli-gosaccharide fragment met 3 tot 10 monosacchariden met een lineaire ofvertakte structuur omvat, of - uit een groep triterpeenglycosiden die een aglycoon uit de alfa-of beta-amyral-, lupaan-, gopaan-, dammaraan-, lanostaan- of holostaan-reeks en oligosaccharide met 2-8 residuen met een vertakte of lineairestructuur omvat, of - uit een groep hydrofobe proteïnen die in staat zijn op onder¬scheidende wijze complexe verbindingen met cholesterol te vormen, of - uit een groep proteïne toxinen die in staat zijn op onder¬scheidende wijze complexe verbindingen met cholesterol te vormen en diegeleverd worden door bacteriën, zee-micro-organismen, insecten ofslangen, of - uit een groep polyeen-antibiotica die in staat zijn op onder¬scheidende wijze complexe verbindingen te vormen met cholesterol, of - uit een groep enzymen met hoge affiniteit voor cholesterol, toe¬gevoegd wordt in een mol verhouding van 20:1 - 1:1 van A:B en dat de op¬lossing gedurende 1-24 uur geïncubeerd wordt bij een temperatuur van0-25°C.

3. Werkwijze voor het leveren van affino-enzymatische verbindingenvoor visuele aanduiding van cholesterol op huidoppervlak gebaseerd opdetecterend middel A*/ en visualiserend middel B, met het kenmerk, datdetecterend middel A gekozen uit de groep die bestaat uit steroïdeglycosiden die als een aglycoon cyclopentaanperhydrofenantreen-fragmentuit de furostanol of spirostanolreeks en een oligosaccharide-fragmentmet 3 tot 10 monosacchariden bevat met een lineaire of vertaktestructuur bevat, of - uit een groep triterpeenglycosiden die een aglycoon uit de alfa-*/ dat een stof is met affiniteit voor cholesterol of beta-aniyral-, lupaan-, gopaan-, dammaraan-, lanostaan-, of hol o-staanreeks en oligosacchariden met 2-8 residuen met een vertakte oflineaire structuur bevat, of - uit een groep hydrofobe proteïnen, die in staat zijn op onder¬scheidende wijze complexe verbindingen met cholesterol te vormen, of - uit een groep proteïne-toxinen, die in staat zijn op onder¬scheidende wijze complexe verbindingen met cholesterol te vormen en diegeleverd worden door bacteriën, zee-micro-organismen, insecten ofslangen, of - uit een groep polyeen-antibiotica, die in staat zijn op onder¬scheidende wijze complexe verbindingen met cholesterol te vormen, of - uit een groep enzymen met hoge affiniteit voor cholesterol, op¬gelost wordt in een waterzoutbufferoplossing met een pH 5-9, bij eenconcentratie van A van 1-20 mg/ml, en dat een laagmoleculair asymme¬trisch bifunctioneel bindingsmiddel C gekozen uit de groep bestaandeuit broomcyaan, trichloortriazine of 2-amino-4,6-dichloor-S-triazine,toegevoegd wordt in een molverhouding van 1:0,5 - 1:10 van A:C, ver¬volgens dat visualiserend middel B toegevoegd wordt gekozen uit degroep enzymen bevattende acetylcholinesterase, tyrosinase, glucoso-oxidase, glucosoamylase, galactosidase, peroxidase, alkalische of zurefosfatase, alfa-chymotrypsine of pyrofosfatase in een molverhouding van20:1 -1:1 van A:B en dat de oplossingen gedurende 1-48 uur geïncu-beerd worden bij een temperatuur van 0-20°C.

4. Werkwijze ter bereiding van affino-enzymatische verbindingenvoor visuele aanduiding van cholesterol op huidoppervlak, gebaseerd opdetecterend middel A*/ en visualiserend middel B, met het kenmerk, datvisualiserend middel B gekozen uit de groep enzymen bevattende acetyl¬cholinesterase, tyrosinase, glucoso-6-fosfaatdehydrogenase, glucoso-oxidase, glucoso-amylase, galactosidase, peroxidase, alkalische en zurefosfatase, alfa-chymotrypsine of pyrofosfatase opgelost wordt in eenwaterzoutbufferoplossing bij een pH van 5-9 en een concentratie vanvan 1-20 mg/ml visualiserend middel B, dat een laagmoleculair asym¬metrisch bifunctioneel bindmiddel C */ dat een stof met affiniteit voor cholesterol is. geselecteerd uit de groep bestaande uit broomcyaan, trichloortriazineof 2-amino-4,6-dichloor-S-triazine toegevoegd wordt in eenmol verhouding van 1:0,5 - 1:1 van B:C, dat de oplossing gedurende 1-20uur geïncubeerd wordt bij een temperatuur van 0-20°C, dat detecterendmiddel A toegevoegd wordt, gekozen uit de groep bestaande uit steroï-de glycosiden die als een aglycoon cyclopentaanperhydrofenantreen-frag-ment uit de furastanol of spirostand reeks omvat, en een oligosacchari-de fragment met 3 tot 10 monosacchariden omvat met een lineaire of ver¬takte structuur omvat, of - uit een groep triterpeenglycosiden die een aglycoon uit de alfa-of beta-anyral-, lupaan-, gopaan-, dammaraan-, lanostaan- ofholostaanreeks, en een oligosaccharide met 2-8 residuen met eenvertakte of lineaire structuur omvat, of - uit een groep hydrofobe proteïnen die in staat zijn oponderscheidende wijze complexe verbindingen met cholesterol te vormen,of - uit een groep proteïne-toxinen die in staat zijn oponderscheidende wijze complexe verbindingen met cholesterol te vormenen die geleverd worden door bacteriën, zee-micro-organismen, insectenof slangen, of - uit een groep polyeen-antibiotica die in staat zijn oponderscheidende wijze complexe verbindingen met cholesterol te vormen, of - uit een groep enzymen met hoge affiniteit voor cholesterol,in een mol verhouding van 20:1 - 1:1 van A:B en dat de oplossinggedurende 1-48 uur geïncubeerd wordt bij een temperatuur van 0-20°C.

5. Werkwijze voor bereiding van affino-enzymatische verbindingenvoor visuele aanduiding van cholesterol op huidoppervlak, gebaseerd opdetecterend middel A*/ en visualiserend middel B, met het kenmerk, datdetecterend middel A gekozen uit de groep bevattende steroïde glyco¬siden die als een aglycoon een cyclopentaanperhydrofenentreen-fragmentuit de furostanol- of spirostanolreeks en een oligosaccharide fragmentmet 3 tot 10 monosacchariden met een vertakte of lineaire structuur om¬vat, of - uit een groep van triterpeenglycosiden die een aglycoon uit dealfa- of beta-amyral-, lupaan-, gopaan-, damaraan-, lanostaan- of */ dat een stof met affiniteit voor cholesterol is holostaanreeks, en een oligosaccharide met 2-8 residuen met een vertak¬te of lineaire structuur omvat, of - uit een groep hydrofobe proteïnen die in staat zijn op onder¬scheidende wijze complexe verbindingen te vormen met cholesterol, of - uit een groep proteïne-toxinen die in staat zijn op onder¬scheidende wijze complexe verbindingen met cholesterol te vormen en diegeleverd worden door bacteriën, zee-micro-organismen, insecten ofslangen, of - uit een groep polyeen-antibiotica die in staat zijn op onder¬scheidende wijze complexe verbindingen met cholesterol te vormen, of - uit een groep enzymen met hoge affiniteit voor cholesterol, ofeen mengsel van genoemde verbindingen en visualiserend middel B selec¬teert uit de groep enzymen bevattende acetylcholinesterase, ryrosinase,glucoso-6-fosfaatdehydrogenase, glucoso-oxidase, glucoso-amylase, ga-lactosidase, peroxidase, alkalische of zure fosfatase,alfa-chymotripsine, opgelost wordt in een mol verhouding van 20:1 - 1:1van A:B in een waterige bufferoplossing bij een pH van 5-9, bij eenconcentratie van 0,1-20 mg/ml van beide middelen A en B en dat eenhoogmoleculair polyfunctioneel bindmiddel C die gekozen wordt uit degroep omvattende polysacchariden, proteïnen en synthestische polyme¬ren die elk functionele groepen bevat gekozen uit de reeks bestaandeuit primaire amine, carboxyl, hydroxyl, aldehyden, halogeenanhydride,gemengde anhydride, azide, hydraziden, maleïmide, isocyanaat ofepoxyde, toegevoegd wordt aan de resulterende oplossing in een mol ver¬houding van 1:0,5 -1:10 van (A+B):C en dat de verkregen oplossing gedu¬rende 1-20 uur geïncubeerd wordt bij een temperatuur van 0-20°C.

6. Werkwijze volgens een van de voorafgaande conclusies 1 tot 5,met het kenmerk, dat agavoside A, B, C, D, F, H en 6*), funcoside I,dioscine, gracilline, protodiscine,. cicubasanine, juncosiden E en H,lanotigonine, desglycodigitonine, digitonine, gitonine, rockosiden C, Den E, funcoside E, alliumoside C, polyganatonine, tigogenine hexaoside,capsycoside, ammunosiden B, C, D en E, desglucodesramnoparilline,desglucoparilline, parilline, sarsaparilloside, asparagosiden C, D, G enH, protojuccoside H, juccoside B, lanotigoside, monoside, bioside, tri-oside, pupureagitoside, gecogenine, rockogenine, diogenine, tigogenine,protopolygamatoside, tomatonine, laxogenine liquotetraoside, alliogeni- *) trilline, funcosiden C, D, F en G ne lactotetraoside, karataioside A, cyclosiversioside H, acanthofilosi-de C, alliofusoside A, alliospiroside A, cyclosiversioside F, thee-sa-ponine, acantofiloside B, tigonine (totaal), glycoside uit Calha Poly-ftala of cyclosiversioside G, steroïde glycosiden zijn die gebruiktworden als detecterend middel A.

7. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat funcosidenC, D, E, F, G of I, dioscine, rockoside, lanotigonine, digitonine oftomatonine gebruikt worden als detecterend middel A.

8. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat digitonineof tomatonine gebruikt worden als detecterend middel A.

9. Werkwijze volgens een van de conclusies 1 tot 5, met het ken¬merk, dat, escine, avenacine, thee-saponine, alfa-gederine, caulosideC, stichionoside A, cyclamine, chinovine, suikerbietsaponine, hyposideof triterpeenglycoside geleverd uit Fatsia Japonica, triterpeenglycosi-den zijn die gebruikt worden als detecterend middel A.

10. Werkwijze volgens een van de conclusies 1 tot 5, met het ken¬merk, dat Folch meïline proteïne, lysosome en mitochondriale prote¬ïnen, fibrinogeen, immunoglobulines, cerebroon, myoglobine, tripsine,cytochroom C, cytochroom R-450, apo-proteïnen van lipoproteïnen hy¬drofobe proteïnen zijn, die gebruikt worden als detecterend middel A.

11. Werkwijze volgens een van de conclusies 1 tot 5, met het ken¬merk, dat A streptolysine 0, pneumolysine, listeriolysine, C.I. 0-toxi-ne geleverd uit type A en C Perfringnens, C.I. <£-toxine, type A of Cnovyi, histolyticum C.I. hemolysine, C en D type botulimum C.I. hemoly-sine, tetanolysine, cereolysine, alveolysine, turingeolysine, Metridiumseniole actinium cytotoxine, proteïne-toxinen zijn, die gebruikt wor¬den als detecterend middel A.

12. Werkwijze volgens een van conclusies 1 tot 5, met het kenmerk,dat amfotericine B, filipine of nistatine, polyeen-antibiotica zijn,die gebruikt worden als detecterend middel A.

13. Werkwijze volgens een van conclusies 1 tot 5, met het kenmerk,dat cholesteroloxidase, cholesteroldehydrogenase of cholesterolestera-se enzymen met hoge affiniteit zijn, die gebruikt worden als detecte¬rend middel A.

14. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat copolyme-ren van acrylinezuur of maleïnezuuranhydride gebruikt worden alshoogmoleculair bindmiddel C.

15. Werkwijze volgens conclusie 14, met het kenmerk, dat een copo-lymeer van N-vinylpyrrolidon en een maleïnezuuranhydride gebruikt worden als hoogmoleculair bindmiddel C.

16. Werkwijze volgens een van conclusies 1 tot 15, met het ken¬merk, dat carbodiimide-, succinimide-, azide-, of perjodaat-oxidatie-technieken, die perse bekend zijn, gebruikt worden voor chemische acti¬vering van detecterend middel A of visualiserend middel B.

17. Werkwijze volgens conclusie 16, met het kenmerk, dat een car¬bodiimide- of perjodaat-oxidatietechniek gebruikt wordt voor chemischeactivering van detectiemiddel A of visualiserend middel B.

18. Werkwijze voor produktie van affino-enzymatische verbindingenvoor visuele aanduiding van cholesterol op de huid *) volgens een iedervan conclusies 1 tot 9, 12 met het kenmerk, dat detecterend middel Agekozen uit de groep omvattende steroïde glycosiden die als een agly-coon een cyclopentaanperhydrofenantreen-fragment uit de furostanol- ofspirostanol reeks en een oligosaccharide fragment met 3 tot 10 monosac-chariden met een vertakte of lineaire structuur bevatten of uit de groepomvattende triterpeenglycosiden die een aglycoon uit de alfa- of be-ta-amyral-, lupaan-, gopaan-, dammaraan-, lanostaan- of halostaanreeksen oligosaccharide met 2-8 resten met een vertakte- of lineaire struc¬tuur bevatten of uit de groep omvattende polyeen-antibiotica die instaat zijn op onderscheidende wijze complexe verbindingen met choleste¬rol te vormen, of uit een mengsel van genoemde verbindingen in eersteinstantie opgelost wordt in een aprotisch polair oplosmiddel en dathoogmoleculair polyfunctioneel bindingsmiddel C gekozen uit de groepomvattende polysacchariden, proteïnen of synthetische polymeren die een van de volgende groepen bevat die gekozen zijn uit de reeks bevat¬tende primaire amine, carboxyl, hydroxyl, aldehyden, haloïdeanhydri-de, gemengde anhydriden, iminoester, azide, hydrazide, maleïmide,isocyanaat, epoxyde, daaraan toegevoegd wordt met een concentratie van1-20 mg/ml van de beide middelen A en C en een verhouding van 1:1 -1:10 van A:C en dat de oplossing geïncubeerd wordt gedurende 0,5-6uur bij een temperatuur van 20-120°C, dat vervolgens het resulterendprodukt (A-C) geprecipiteerd wordt uit het oplosmiddel volgens eenperse bekende werkwijze, dat het verkregen produkt in vacuumboven fosforpentoxide gedurende 4-10 uur gehouden wordt bij 80-120°C,dat het verkregen gedroogde produkt (A-C) met een concentratie van *) gebaseerd op detecterend middel A dat een stof is metaffiniteit voor cholesterol, en visualiserend middel B. 2-20 mg/ml toegevoegd wordt aan een waterige zoutbufferoplossing meteen pH van 5-9 die opgelost visualiserend middel B bevat, gekozen uitde groep enzymen die acetylcholinesterase, tyrosinase, glycoso-6-fos-faatdehydrogenase, glucoso-oxidase, glucoso-amylase, galactosidase,peroxidase, alkalische of zure fosfatase, alfa-chymotrypsine of pyro-fosfatase bevat met een concentratie van 1-10 mg/ml en dat de oplossinggeïncubeerd wordt gedurende 2-12 uur bij een temperatuur van 4-8°C.

19. Werkwijze volgens conclusie 18, met het kenmerk, dat dimethyl-sulfoxide, dimethylformamide, hexamethanol, een mengsel van dimethyl -formamide en tolueen in een verhouding van 2:1 of een mengsel van di¬methyl formami de en hexanol in een verhouding van 2:1 gebruikt wordenals een aprotisch polair oplosmiddel.

20. Werkwijze volgens een van de conclusies 3 tot 5, 18, 19, methet kenmerk, dat de oplossingen gekozen uit de reeks bevattendeboraat-, citraat- of fosfaatoplossingen, die bufferende werking leverenbinnen het pH traject 5-9, gebruikt worden als waterige zoutoplos¬singen.

21. Produkt bereid volgens een der voorgaande conclusies.

22. Toepassing van een enzymsubstraat gekozen als visualiserendmiddel B, welk substraat een produktvlek geeft met de verbinding bereidvolgens een van de voorafgaande conclusies.