CN102749300A - 一种油菜花粉及其制剂的质量控制方法 - Google Patents

一种油菜花粉及其制剂的质量控制方法 Download PDF

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Abstract

一种油菜花粉及其制剂的质量控制方法。本发明涉及一种普乐安片质量控制方法,属于中药现代化领域。一种普乐安片的质量控制方法,包括(1)普乐安片供试品溶液的制备;(2)显色反应;(3)采用紫外-可见分光光度法测定。经分析方法验证,其精密度、重现性、稳定性和回收率符合中国药典2010版一部附录《中药质量标准分析方法验证指导原则》的要求。本发明的优点是:通过使用紫外-可见分光光度法,对普乐安片中所含总甾醇进行了定量测定,测试精密度高,可靠性好。通过对普乐安片中总甾醇的监控,可有效控制产品的内在质量。

Description

一种油菜花粉及其制剂的质量控制方法
(一)技术领域:本发明涉及一种油菜花粉及其制剂的质量控制方法,更具体的说是测定油菜花粉及其制剂中总甾醇含量的方法。
(二)背景技术:油菜花粉为蜜蜂科昆虫中华蜂蜜Apis cerana Fabricius等工蜂所采集的十字花科植物油菜Brassica campestis Linn.的干燥花粉,目前国内的普乐安片与普乐安胶囊是采用油菜花粉为主要原料制备而成的。
花粉是被子植物雄蕊花药和孢子植物小孢叶上的小孢子囊内的小颗粒状物,是植物的雄性生殖细胞。花粉内含各种丰富的营养物质,具有多种的生物学活性,在治疗前列腺疾病方面有独到的效果。目前市场上已经有“前列康”、“舍尼通”等花粉制品,表现出良好的疗效。这些药物在临床长期使用,已被证明能有效地改善良性前列腺增生症状及并发症,长期使用无毒副作用,同时花粉促进机体代谢及造血、免疫功能,因此适合老年人长期使用。
前列康牌普乐安制剂由浙江康恩贝公司生产,是纯油菜花粉制剂,临床用于肾气不固,腰膝酸软,尿后余沥或失禁,及慢性前列腺炎、前列腺增生具有上述症候者。浙江医院谢海宝等用前列康治疗前列腺增生100例的观察结果,减轻症状有效率93.0%,用药后51例经B超测定前列腺体积有明显缩小,总有效率95.0%。浙江兰溪市中医院俞大毛用前列康治疗40例前列腺增生患者,总有效率90%。
油菜花粉中含多种甾体化合物,其中甾醇类物质已被证实与抗前列腺增生活性药效有相关性,甾醇类物质的含量直接影响到产品的治疗效果。但在目前国内油菜花粉及其制剂质量标准中均无总甾醇的含量测定,无法有效的评判产品的质量,保证产品的疗效。
从国内外研究看,总甾醇的含量测定一般紫外-可见分光光度法,通过显色反应测定总甾醇的含量,常用Liebennann-Burchard比色法或改进的Liebennann-Burchard比色法,根据甾醇类化合物能与醋酐、浓硫酸发生特征颜色反应(Lieberman反应)的性质测定甾醇含量。但由于花粉中并非单一成份,其它成份会影响其检测,用常规的检测方法存在缺陷,不能保证方法的专一性,同时检测准确性差。任玉翠等在《十二种蜂花粉的黄酮甙及甾醇类成分的含量测定》的研究中(中国医院药学杂志,1990,10(4):147-148)),采用薄层色谱展开后,显色确定薄层上甾醇色斑,然后吸取甾醇色斑再处理后用Liebennann-Burchard显色反应进行含量测定,处理过程复杂,操作繁琐,而且采用薄层色谱测量非常不准确,误差很大;同时我们对正对油菜花粉中总甾醇含量测定采用Liebennann-Burchard显色反应及采用改进的Liebennann-Burchard显色反应时发现,样品吸光度变化快,几分钟内吸光度达到最大值,然后迅速下降,显色极不稳定,造成了测定准确率下降,。由于无稳定的显色时间段,故油菜花粉及其制剂的总甾醇含量测定不宜简单的采用Liebennann-Burchard显色反应或改进的Liebennann-Burchard显色反应进行测定;董素哲等在《松花粉质量的初步研究》(第九届全国药用植物及植物药学术研讨会,297-298)中,用浓硫酸直接显色测定总甾醇含量,采用本法显色不完全,显色反应同样会随时间长短有所变化,同时由于浓硫酸本身会对检测有影响,由此含量测定值不够准确,含量检测值偏高。
(三)发明内容:本发明提供了一种油菜花粉及其制剂中总甾醇含量的检测方法,通过对总甾醇含量的检定,可用于控制油菜花粉及其制剂的内在质量。
本发明对供试样品进行前处理后,进行显色反应,然后采用紫外-可见分光光度法测定油菜花粉及其制剂中的总甾醇含量,以控制其质量。为实现上述目的,本发明具体步骤如下:
(1)供试品溶液处理
取供试样品并进行前处理,称取处理后样品,加入有机溶剂多次提取样品中脂溶性成分,直至提取完全,过滤后将滤液蒸干,加入10%氢氧化钠-乙醇溶液进行皂化,直至皂化完全,用有机溶剂萃取皂化液,分离萃取液即得供试品溶液。
(2)显色反应
取上述供试品溶液,制于具塞玻璃试管中,水浴加热挥尽其中的有机溶剂,加入香草醛-冰醋酸溶液和高氯酸溶液,混匀,密塞,60℃-80℃水浴保温10-30分钟,取出,冷却至室温,加入冰醋酸,摇匀,使得吸光度在0.3-0.7之间。
根据β-谷甾醇对照试验,其中香草醛加入量为样品中总甾醇含量的100-1000倍,高氯酸加入量为样品中总甾醇含量的1000-10000倍。
(3)测定方法:随行试剂作空白,以甾醇类物质为对照,在542nm测定供试品和对照品的吸光度,按外标法计算总甾醇含量,即得样品总甾醇含量。
本发明中对油菜花粉及其制剂的前处理方法为,取油菜花粉及其制剂,去包衣或外包装后余纯油菜花粉,用70℃减压干燥2小时,并研磨成粉,过筛。具体如下:
(1)油菜花粉原料,取油菜花粉原料,用70℃减压干燥2小时,置研钵中研磨成粉,过80目筛即得。
(2)普乐安片,取普乐安片若干,用润湿的洁净纱布小心擦去表面薄膜衣层,70℃减压干燥2小时,置研钵中研磨成粉,过80目筛即得。
(3)普乐安胶囊,取普乐安胶囊若干,去胶囊壳,取出胶囊内容物,将内容物70℃减压干燥2小时,置研钵中研磨成粉,过80目筛即得。
本发明中提取样品中脂溶性成分的有机溶剂可采用无水乙醇、石油醚、正己烷、乙醚、氯仿中的一种或几种等,为达到更好的脂溶性成分提取效果,可采用搅拌提取、回流提取、索氏提取、超声提取、超临界二氧化碳提取中的一种。
为达到最好的皂化效果,加入氢氧化钠-乙醇溶液后,可置于80-95℃水浴中加热回流2小时。
甾醇类物质对照品可选用β-谷甾醇、胆甾醇等。
本发明中显色反应最佳反应条件试验如下:
β-谷甾醇对照品(上海中药标准化研究中心,纯度≥98%),高氯酸溶液(70%,密度1.76g/ml)、香草醛、冰醋酸、氯仿等试剂均为分析纯。
1、对照品溶液的制备
精密称取β-谷甾醇对照品10.13mg于10mL量瓶中,加三氯甲烷适量使溶解,并稀释至刻度,摇匀,精密移取1.0mL于10mL量瓶中,用三氯甲烷稀释至刻度,摇匀,即得,浓度为0.1013mg/mL。
2、测定波长的选择
分别精密移取0.5mLβ-谷甾醇对照品溶液、1.0mL上述发明制备的供试品溶液于10mL具塞玻璃管中,85℃水浴挥尽溶剂,加入0.6mL 5%香草醛-冰醋酸溶液,0.8mL高氯酸,混匀,密塞,70℃水浴保温30min,取出,流水迅速冷却至室温,精密加入冰醋酸4.6mL,摇匀,随行试剂作空白,在900-190nm进行波长扫描,对照品和供试品溶液均在在542nm有最大吸收峰,故选择542nm为总甾醇含量测定的检测波长。
3、显色条件的选择
采用四因素三水平L9(34)正交试验优选显色条件,正交设计因素水平表设计如下:
表1显色条件正交设计因素水平表
Figure BDA00001903173900031
精密移取0.5mLβ-谷甾醇对照品溶液于10mL具塞玻璃试管中,85℃水浴挥尽溶剂,加入不同用量5%香草醛-冰醋酸溶液,0.8mL高氯酸,混匀,密塞,70℃水浴保温30min,取出,流水迅速冷却至室温,精密加入不同用量冰醋酸,使溶液体积为6.0mL,摇匀,随行试剂作空白,在542nm处测定吸光度值,结果表2:
表2显色反应正交设计试验结果
Figure BDA00001903173900032
表3方差分析
Figure BDA00001903173900033
由表2可见,直观分析显示各因素对显色反应吸光度的作用主次为A>C>B,最佳显色条件为A3B3C3;方差分析结果表明A因素有显著性意义,而B、C因素无显著性意义;由于显色温度对吸光度无显著影响,考虑供试品稳定性,显色温度70℃为佳。
4、高氯酸用量的选择
精密移取0.5mLβ-谷甾醇对照品溶液于10mL具塞玻璃试管中,85℃水浴挥尽溶剂,加入0.6mL5%香草醛-冰醋酸溶液,分别精密加入不同用量高氯酸溶液,混匀,密塞,70℃水浴保温30min,取出,流水迅速冷却至室温,精密加入不同用量冰醋酸,使溶液体积为6.0mL,摇匀,随行试剂作空白,在542nm处测定吸光度值,结果见表4:
表4高氯酸用量对吸光度影响
随着高氯酸用量增加,吸光度增加,当用量为1.2mL时,吸光度出现下降;用量为0.4mL时,吸光度为0.347,用量为0.8mL时,吸光度达到最大为0.496,用量为1.0mL时,吸光度达到最大为0.501,因考虑对照品和供试品的稳定性,最终高氯酸最佳用量定为0.8mL。
综上所述,本发明最佳方法具体步骤如下:
1、供试品溶液的制备
取油菜花粉或其制剂,进行前处理后,70℃减压干燥2小时,置研钵中研磨成粉,过80目筛,称取0.5g样品,置具塞锥形瓶中,加入50ml有机溶剂,密塞称定重量,超声处理60min,摇匀,过滤,移取过滤液10.0ml于烧瓶中,减压蒸干后加入20ml10%氢氧化钠-乙醇溶液,95℃水浴回流2小时,放冷,用正己烷萃取3次,每次20ml,合并正己烷萃取液,减压浓缩正己烷液至50ml。
2、显色反应
移取1ml供试品溶液于10ml具塞玻璃试管中,85℃水浴挥尽溶剂,加入0.6ml5%香草醛-冰醋酸溶液,0.8ml70%高氯酸,混匀,密塞,70℃水浴保温30min,取出,流水迅速冷却至室温,用冰醋酸定容至6ml,摇匀,即得。
3、测定
用上述同样方法对甾醇对照品显色反应,采用紫外-可见分光光度法,随行试剂作空白,于542nm测定吸光度,并制定标准曲线,按外标法计算样品总甾醇含量,即得。
本发明对油菜花粉及其制剂中总甾醇含量的检测方法简便,测试精密度高,同时显色稳定性很好,准确度高,可靠性好。通过对油菜花粉及其制剂中总甾醇的检测,可有效控制产品的内在质量。
对于本领域技术人员而言,根据本发明所公开的技术内容,本领域的技术人员将很清楚本发明的其他实施方案,本发明实施例仅作为示例。在不违反本发明主旨和范围的情况下,可对本发明进行各种改变和改进。例如使用不同紫外检测器所获得的结果可能有所不同,但只要使用本发明所述的质量控制方法,均在本发明保护范围之内。
(五)具体实施方式:
下面列举的实施例为进一步说明本发明,对本发明并不构成限制。
以下实施例使用的仪器和试剂:
仪器:UV-2201紫外可见分光光度计(日本岛津公司);BS210S电子天平(北京赛多利斯天平有限公司);AX205DR电子天平(METTLER TOLEDO公司);DK-S26型恒温水浴锅(上海精密实验设备有限公司);KQ-250DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);R系列旋转蒸发器(上海申生科技有限公司)
试剂:β-谷甾醇对照品(中国药品生物制品检定所,供鉴别用);胆甾醇(批号:090309,纯度≥98%,上海思吉生物制品有限公司);香草醛、冰醋酸、高氯酸溶液(70%,密度1.76g/ml)、氯仿等试剂均为分析纯。
实施例1:普乐安片含量测定
(1)、供试品制备
取普乐安片20片(浙江康恩贝制药股份有限公司生产,批号:20090402),用润湿的洁净纱布小心擦去表面薄膜衣层,70℃减压干燥2小时,置研钵中研磨成粉,过80目筛。称取本品0.5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入50ml氯仿,密塞称定重量,超声处理60min,放冷,再称定重量,用氯仿补足失重,摇匀,滤过。精密移取续滤液10.0ml于烧瓶中,减压蒸干。加入20ml10%氢氧化钠-乙醇溶液,95℃水浴回流2小时,放冷,加入40ml蒸馏水,振摇,混匀,转移至分液漏斗中,用正己烷萃取3次,每次20ml,合并正己烷萃取液,用蒸馏水洗涤正己烷液2次,每次40ml,弃去水层,减压浓缩正己烷液至小体积后,转移正己烷液于50ml量瓶中,用正己烷定容,摇匀,即得供试品溶液。
(2)、对照品制备
精密称取β-谷甾醇对照品10.13mg于10mL量瓶中,加三氯甲烷适量使溶解,并稀释至刻度,摇匀,精密移取1.0mL于10mL量瓶中,用三氯甲烷稀释至刻度,摇匀,即得,浓度为0.1013mg/mL。
(3)、标准曲线
分别精密移取0.1013mg/mL的β-谷甾醇对照品溶液0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8mL于10mL具塞玻璃试管中,85℃水浴挥尽溶剂,加入0.6ml5%香草醛-冰醋酸溶液,0.8ml高氯酸,混匀,密塞,70℃水浴保温30min,取出,流水迅速冷却至室温,精密加入冰醋酸4.6ml,摇匀后采用紫外-可见分光光度法,随行试剂作空白,于542nm测定吸光度。以对照品质量和吸收值进行回归计算,得回归方程Y=-0.06208+11.0337X,R=0.9988,表明β-谷甾醇在0.03039mg-0.08104mg线性关系良好。
(4)、样品显色反应
精密移取1ml供试样品溶液于10ml具塞玻璃试管中,85℃水浴挥尽溶剂,加入0.6ml5%香草醛-冰醋酸溶液,0.8ml高氯酸,混匀,密塞,70℃水浴保温30min,取出,流水迅速冷却至室温,精密加入冰醋酸4.6ml,摇匀,即得。
(5)、结果测定
采用紫外-可见分光光度法,随行试剂作空白,于542nm测定吸光度。按外标法计算总甾醇含量,得结果如下:
Figure BDA00001903173900051
实施例2显色稳定性试验
分别精密移取上述实施例1制备的β-谷甾醇对照品溶液0.5ml和供试品溶液1.0ml于10mL具塞玻璃试管中,85℃水浴挥尽溶剂,加入0.6ml5%香草醛-冰醋酸溶液,0.8ml高氯酸,混匀,密塞,70℃水浴保温30min,取出,流水迅速冷却至室温,精密加入冰醋酸4.6ml,摇匀,即完成显色反应。
在显色结束后10min、15min、20min、25min、30min时分别测定对照品和供试品吸光度变化,结果如表5,说明对照品和供试品在30min内显色稳定。
表5对照品及供试品显色稳定性试验结果
从测试具体结果看,随时间的延长,吸光度略有下降,但经对照品与供试品的RSD值分析,RSD均在2%以内,说明在半小时之间,对照品与供试品的吸光度精密度良好,显色非常稳定。
实施例3供试品溶液稳定性试验
按实施例1制备的供试品溶液,分别于制备后0h、2h、4h、6h、8h各精密移取1.0mL于10mL具塞玻璃试管中,按样品显色反应进行显色和测定,测得不同时间供试品溶液中总甾醇含量如表6,RSD=2.33%,说明供试品溶液在8小时内稳定。
表6供试品溶液稳定性试验
Figure BDA00001903173900061
实施例4精密度试验
按实施例1方法,取同批号的普乐安片适量,在一天内分别测定6次,总甾醇的平均含量为2.68%,RSD=2.36%,说明日内精密度良好。
另取同批号普乐安片适量,按实施例1含量测定方法,于数天内测定总甾醇含量,平均含量2.64%,RSD=2.64%,日间精密度良好。
实施例5加样回收试验
取普乐安片适量(批号:090220)后进行样品前处理,并称取6份,每份0.25g,称定后精密加入β-谷甾醇对照品溶液(含β-谷甾醇6.626mg),然后按实施例1中的持续样品处理方法,进行皂化、显色和测定,计算加样回收率,结果见表7,表明本法回收率符合要求。
表7总甾醇加样回收试验结果
实施例6油菜花粉中总甾醇含量测定
取油菜花粉适量,70℃减压干燥2小时,置研钵中研磨成粉,过80目筛。称取本品0.5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入50ml石油醚,在80℃左右充分搅拌2小时,放冷,摇匀,滤过。精密移取续滤液10.0ml于烧瓶中,减压蒸干。加入20ml 10%氢氧化钠-乙醇溶液,95℃下反应2小时,放冷,加入40ml蒸馏水,振摇,混匀,转移至分液漏斗中,用正己烷萃取3次,每次20ml,合并正己烷萃取液,减压浓缩正己烷液至50ml摇匀,即得供试品溶液。
按实施例1后续2-5步骤进行后续处理与检测,结果每克油菜供花粉中总甾醇含量为2.42%
实施例7普乐安胶囊中总甾醇含量测定
取普乐安胶囊若干粒(浙江康恩贝制药股份有限公司生产,批号:20100203),去胶囊壳,取出胶囊内容物,将内容物于70℃减压干燥2小时,置研钵中研磨成粉,过80目筛。称取本品0.5g,精密称定,置烧瓶中,精密加入50ml无水乙醇和乙醚(按重量1:1混合),密塞称定重量,回流提取60min,放冷,滤过。精密移取滤液10.0ml于烧瓶中,减压蒸干。加入20ml 10%氢氧化钠-乙醇溶液,95℃水浴回流2小时,放冷,加入40ml蒸馏水,振摇,混匀,转移至分液漏斗中,用正己烷萃取3次,每次20ml,合并正己烷萃取液并浓缩至50ml,即得供试品溶液。
精密称取胆甾醇对照品9.98mg于10mL量瓶中,加三氯甲烷适量使溶解,并稀释至刻度,摇匀,精密移取1.0mL于10mL量瓶中,用三氯甲烷稀释至刻度,摇匀,即得对照品溶液,浓度为0.0998mg/mL。
按实施例1后续方法进行处理,得到回归方程为Y=-0.06314+10.1011X,R=0.9965,表明胆甾醇在0.02994mg-0.07984mg线性关系良好。测得样品中总甾醇含量为2.32%
实施例8对比试验:样品Liebennann-Burchard显色反应稳定性
(1)取普乐安片20片(批号:20090112),用润湿的洁净纱布小心擦去表面薄膜衣层,70℃减压干燥2小时,置研钵中研磨成粉,过80目筛。称取本品0.5g,精密称定,置烧瓶中,精密加入50ml石油醚(60-90℃),密塞称定重量,回流提取60min,放冷,再称定重量,用石油醚补足失重,摇匀,滤过。精密移取续滤液10.0ml于烧瓶中,减压蒸干。加入20ml10%氢氧化钾-甲醇溶液,95℃水浴回流2小时,放冷,加入40ml蒸馏水,振摇,混匀,转移至分液漏斗中,用正己烷萃取3次,每次20ml,合并正己烷萃取液,用蒸馏水洗涤正己烷液2次,每次40ml,弃去水层,减压浓缩正己烷液至小体积后,转移正己烷液于50ml量瓶中,用正己烷定容,摇匀,即得供试品溶液。
(2)精密移取1.0ml供试品溶液于10ml量瓶中,精密加入2.0ml乙酸酐,乙酸酐定容,摇匀,分别精密加入硫酸0.1ml,摇匀,以随行试剂为空白,在900-190nm进行波长扫描,记录最大吸收波长λmax下吸光度值,结果分别见下表:
表8 0.1ml硫酸用量
λmax稳定在682nm,但吸光度变化快,5分钟达到峰值后迅速下降,5-20min测定吸光度RSD=7.90%,显色不稳定,影响含量测定
实施例9:对比试验:胆甾醇对照品改良Liebennann-Burchard显色反应稳定性
精密移取1.0ml胆甾醇对照品溶液于具塞玻璃试管中,85℃挥尽溶剂,精密加入5.0ml改良的Liebermann-Burchard试剂,摇匀,以随行试剂为空白,在900-190nm进行波长扫描,记录最大吸收波长λmax下吸光度值,结果见下表:
表9 5.0ml改良的Liebermann-Burchard试剂
Figure BDA00001903173900072
可见λmax不稳定,吸光度值15分钟达到峰值后迅速下降;λmax与同样显色条件下的供试品溶液的λmax相差甚远,故用改良Liebennann-Burchard显色反应检测油菜花粉及其制剂存在缺陷,会明显影响含量检测的准确度和精确度。

Claims (8)

1.一种油菜花粉及其制剂中的总甾醇含量的检测方法,包括以下步骤:
1)供试品溶液处理:
取供试样品并进行前处理,称取处理后样品,加入有机溶剂多次提取样品中脂溶性成分,直至提取完全,过滤后将滤液蒸干,加入10%氢氧化钠-乙醇溶液进行皂化,直至皂化完全,用有机溶剂萃取皂化液,分离萃取液即得供试品溶液;
2)显色反应:
取上述供试品溶液,制于具塞玻璃试管中,水浴加热挥尽其中的有机溶剂,加入香草醛-冰醋酸溶液和高氯酸溶液,混匀,密塞,60℃-80℃水浴保温10-30分钟,取出,冷却至室温,加入冰醋酸,摇匀,使得吸光度在0.3-0.7之间;
3)测定方法:随行试剂作空白,以甾醇类物质为对照,在542nm测定供试品和对照品的吸光度,按外标法计算总甾醇含量,即得样品总甾醇含量。
2.根据权利要求1所述的检测方法,对油菜花粉及其制剂的前处理方法为,取油菜花粉及其制剂,去包衣或外包装后余纯油菜花粉,用70℃减压干燥2小时,并研磨成粉,过筛。
3.根据权利要求1所述的检测方法,样品脂溶性成分的提取步骤中有机溶剂可采用无水乙醇、石油醚、正己烷、乙醚、氯仿中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的检测方法,为达到更好的脂溶性成分提取效果,可采用搅拌提取、回流提取、索氏提取、超声提取、超临界二氧化碳提取中的一种。
5.根据权利要求1所述的检测方法,显色反应中香草醛加入量为样品中总甾醇含量的100-1000倍,高氯酸加入量为样品中总甾醇含量的1000-10000倍。
6.根据权利要求1所述的检测方法,皂化步骤中加入氢氧化钠-乙醇溶液后,可置于80-95℃水浴中加热回流2小时。
7.根据权利要求1所述的检测方法,甾醇类物质对照品可选用β-谷甾醇、胆甾醇。
8.根据权利要求1所述的检测方法,本发明具体步骤如下:
1)供试品溶液的制备
取油菜花粉或其制剂,进行前处理后,70℃减压干燥2小时,置研钵中研磨成粉,过80目筛,称取0.5g样品,置具塞锥形瓶中,加入50ml有机溶剂,密塞称定重量,超声处理60min,摇匀,过滤,移取过滤液10.0ml于烧瓶中,减压蒸干后加入20ml 10%氢氧化钠-乙醇溶液,95℃水浴回流2小时,放冷,用正己烷萃取3次,每次20ml,合并正己烷萃取液,减压浓缩正己烷液至50ml;
2)显色反应
移取1ml供试品溶液于10ml具塞玻璃试管中,85℃水浴挥尽溶剂,加入0.6ml 5%香草醛-冰醋酸溶液,0.8ml 70%高氯酸,混匀,密塞,70℃水浴保温30min,取出,流水迅速冷却至室温,用冰醋酸定容至6ml,摇匀,即得;
3)测定
用上述同样方法对甾醇对照品显色反应,采用紫外-可见分光光度法,随行试剂作空白,于542nm测定吸光度,并制定标准曲线,按外标法计算样品总甾醇含量,即得。
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