CN101482543B - 一种谷维素的高效液相色谱分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种谷维素的高效液相分析方法，属于分析化学领域。应用本发明的液相方法，可以迅速、准确的分析出谷维素、谷维素提取分离纯化产物、谷维素药品中有效成分环木菠萝烯醇阿魏酸酯和24-亚甲基环木菠萝醇阿魏酸酯的含量，同时得到其他多种杂质成分的含量。同时本发明公开的液相方法也可以应用于谷维素药品稳定性、破坏等谷维素药品质量研究。

Description

一种谷维素的高效液相色谱分析方法

技术领域

本发明公开了一种谷维素的高效液相色谱分析方法，属于分析化学领域。

背景技术

谷维素是以环木菠萝醇类为主体的阿魏酸酯和甾醇类的阿魏酸酯所组成的一种天然混合物，外观为白色至淡黄色晶体粉末、无味。谷维素主要存在于毛糠油及其油脚中，在米糠油谷维素中，环木菠萝醇类阿魏酸酯含量约为70～80％。经过长期研究，研究人员发现谷维素具有多种生理功能。主要包括：降低血脂、抵抗胆固醇的吸收、降低血清胆固醇、防止脂质氧化和预防心血管疾病。除此之外，谷维素还可以缓和女性进入更年期之后的各种身体障碍状态和自律神经失调症，改善间脑视床底部功能失调。

现有的提纯谷维素的方法主要包括吸附法、弱酸取代法、非极性溶剂萃取法、溶剂分提法等。在谷维素提纯成分中，环木菠萝烯醇阿魏酸酯和24-亚甲基环木菠萝醇阿魏酸酯是其功效的主要成分，其余的成分还包括2，4-甲基环木菠萝醇阿魏酸酯、2，4-甲基环木菠萝烯醇阿魏酸酯、2，4-乙基环木菠萝醇阿魏酸酯、2，5-羟基环木菠萝醇阿魏酸酯、β-谷甾醇阿魏酸酯、豆甾醇阿魏酸酯等。以结构而言，这些成分符合如下通式。

上述化学式为阿魏酸酯类物质分子通式，R1，R2为各种修饰基团。

上述结构为植物甾醇类物质结构通式。

在谷维素应用中，环木菠萝烯醇阿魏酸酯和24-亚甲基环木菠萝醇阿魏酸酯两种成分的含量和其余杂质成分的控制对谷维素应用效果具有巨大影响，因此检测这两种物质的纯度成为影响谷维素应用的一个重要因素。现有的技术在检测分析谷维素组分含量方面存在一定的缺陷，往往只能检测四五种成分，并且分离度不高，影响了谷维素的品质。比如在综述性文献：毛米糠油精炼对谷维素含量的影响(四川粮油科技：2002.76：13-16)一文中给出了现有的高效液相分析方法所得到的谷维素液相分析图谱，其只能分辨出约为五种物质，后三种分离度明显较差。

发明内容

本发明的目的是提供一种谷维素的高效液相色谱分析方法，利用本发明公开的方法，不仅可以准确的测定谷维素中主要有效成分环木菠萝烯醇阿魏酸酯和24-亚甲基环木菠萝醇阿魏酸酯的含量还可以同时得到谷维素中其它多种成分的含量，可以同时检测到十余种成分的含量，相较于现有的液相分析方法，在分析的范围和检出效果上有明显改进。

本发明的技术方案如下：

一种谷维素的高效液相色谱分析方法，液相条件为

色谱柱：C18柱(250mm×4.6mm，5μm)

洗脱方式：梯度洗脱

柱温：30℃～50℃，优选35℃～45℃

检测波长：325nm

进样量：10μl

本发明进行梯度洗脱所用流动相分别记为流动相A，流动相B.所用流动相A可以是甲醇、四氢呋喃混合溶液，甲醇、异丙醇的混合溶液，甲醇∶四氢呋喃，甲醇∶异丙醇体积比可以是10∶10～10∶30；所用流动相B为乙腈的水溶液，乙腈∶水体积比可以是40∶15～60∶15。

在依据上述比例配制好流动相以后后，依据下列时间进行梯度洗脱，表格中所示百分比例代表在不同的时间段内，可供选择的洗脱相配比。

表1洗脱相的洗择

优选为

表2洗脱相的优化

将待检测样品配成溶液，进样，进行分析检测。

应用本发明的高效液相色谱方法，不仅可以准确得知样品中有效成分环木菠萝烯醇阿魏酸酯和24-亚甲基环木菠萝醇阿魏酸酯的含量，还可以同时检出其余八种杂质成分的含量，从而为谷维素或者其提纯分离的单一组分或多组分复合物的品质控制提供良好的基础。

根据本发明内容，本领域技术人员可以将本发明方法应用于多种涉及谷维素质量研究和控制的领域，这主要包括谷维素提取分离纯化后所得产物的质量研究及杂质分析、药品研究生产中的谷维素药品的质量研究及杂质分析等(现有的谷维素药品往往是以市售谷维素为原料经过一定的制剂工艺而得的谷维素制剂，如谷维素片、谷维素注射液等)，这依旧是本发明方法的使用范围，是落在本发明范围之内的。

本发明申请人在前期研究中，通过对谷维素提取分离纯化获得了一种环木菠萝烯醇阿魏酸酯和24-亚甲基环木菠萝醇阿魏酸酯的含量不低于90％的产物，并对此产物申请了专利(中国专利申请200810097493.x)。本发明的液相方法可以应用于该产物。

进一步的，本发明方法适用于谷维素分离纯化所得到的单一成分或若干单一成分的复合物。

同样的，在谷维素药品研究过程中，涉及到的谷维素检测均可以应用本发明方法，比如稳定性研究中研究有关物质、破坏性实验研究等。因此本发明高效液相色谱方法还可以应用于谷维素药品稳定性、破坏等谷维素药品质量研究。

附图说明：

附图1、2、3为紫外扫描谷维素样品、对照品的吸收波长曲线，图1为谷维素样品的紫外扫描图谱；图2为环木菠萝烯醇阿魏酸酯对照品紫外扫描图谱；图3是24-亚甲基环木菠萝醇阿魏酸酯对照品紫外扫描图谱。

附图4为环木菠萝烯醇阿魏酸酯的标准曲线。

附图5为24-亚甲基环木菠萝醇阿魏酸酯的标准曲线。

附图6为提取纯化产物样品的HPLC曲线。

附图7为市售谷维素原料的HPLC曲线。

附图8为市售谷维素药品的HPLC曲线，谷维素提纯后的样品酸破坏三天后的HPLC分析。

具体实施方式

在以下实施例中，提取纯化产物指环木菠萝烯醇阿魏酸酯和24-亚甲基环木菠萝醇阿魏酸酯的含量不低于90％的产物。

试验仪器和色谱条件

LC-20AT VP，SPD-20A VP(日本岛津公司)高效液相色谱仪、TU-1810紫外可见分光光度计(北京普希通用仪器有限责任公司)

色谱柱选用Kromasil C18柱，规格为250mm×4.6mm，5μm。流动相A采用甲醇∶四氢呋喃10∶20，流动相B采用乙腈∶水45∶15，流动相A，B的比例依据发明内容的表2进行设置。流速设为1.0ml/min，柱温采用35℃，检测波长325nm。

实验药品：

谷维素原料

提取纯化产物样品

环木菠萝烯醇阿魏酸酯对照品(自制，纯度＞99.0％)

24-亚甲基环木菠萝醇阿魏酸酯对照品(自制，纯度＞99.0％)

甲醇、四氢呋喃、乙腈为HPLC级

水为二次蒸馏水

实施例1色谱条件的选择

1.1检测吸收波长

用紫外分光光度仪在400nm-200nm波长内对谷维素原料样品、环木菠萝烯醇阿魏酸酯对照品、24-亚甲基环木菠萝醇阿魏酸酯对照品进行连续扫描，观察附图1、2、3可以发现其最大吸收波长为325nm，因此本发明选择检测波长为325nm。

1.2样品浓度

为了兼顾主成分与杂质含量的测定，必须选择一个合适的样品浓度。浓度太小不利于杂质出峰，太大会影响主峰超出蜂线范围。经过综合衡量，并参考已有的实验数据，样品溶液选择为2mg/ml.最终的分析结果(表5)证实该浓度是合适的。

1.3洗脱方式

发明人进行的实验研究证实，采用梯度洗脱能够有效地缩短液相分析时间。同时，等度洗脱也是可以应用的，只是消耗时间非常长。在本领域范围内改变洗脱方式是落在本发明范围之内的。

实施例2对照品溶液的配置

精密称取环木菠萝烯醇阿魏酸酯对照品及24-亚甲基环木菠萝烯醇阿魏酸酯对照品适量，加流动相A液制成每ml含环木菠萝烯醇阿魏酸酯对照品及24-亚甲基环木菠萝烯醇阿魏酸酯各0.5mg的溶液，精密量取该溶液适量，加流动相A液制成每ml含环木菠萝烯醇阿魏酸酯对照品及24-亚甲基环木菠萝烯醇阿魏酸酯各25、50、125、250、500μg的溶液，分别取各溶液10μl注入液相色谱仪，记录各个浓度下的峰面积，并以峰面积A对浓度C(μg/ml)作线性回归。

实施例3标准曲线的测定

在实施例2的基础上进行实验，以峰面积对浓度进行作图。

环木菠萝烯醇阿魏酸酯对照品所获的试验数据如下

表3环木菠萝烯醇阿魏酸酯液相分析数据

24-亚甲基环木菠萝烯醇阿魏酸酯对照品所获的试验数据如下

表424-亚甲基环木菠萝烯醇阿魏酸酯液相分析数据

由以上结果可以看出环木菠萝烯醇阿魏酸酯在26.3～525.0μg/ml的浓度范围内峰面积A与浓度C呈线性关系，24-亚甲基环木菠萝烯醇阿魏酸酯在21.3～475.0μg/ml的浓度范围内峰面积A与浓度C呈线性关系线性图即可得附图4、5。

综合上述结果可知，当信噪比为1/3时，测得环木菠萝烯醇阿魏酸酯、24-亚甲基环木菠萝醇阿魏酸酯最低检测限为2.3ng及3.2ng.

实施例4提取纯化产物样品溶液的HPLC测定

在谷维素提取分离纯化所得的产物样品中，任选五个批号，参考实施例2配置成2mg/ml的样品溶液。进行HPLC分析，进样量为10ul，得到包含主成分、杂质成分成分的HPLC曲线，附图6。在仪器控制系统中，可以直接读出这些图谱对应的面积数据，将这些数据制作为表格5。

附图6显示，本发明的HPLC条件下可以区分出样品中的13种成分，其中包括环木菠萝烯醇阿魏酸酯(8峰)、24-亚甲基环木菠萝醇阿魏酸酯(9峰)、菜油甾醇阿魏酸酯(11峰)、B-谷甾醇阿魏酸酯(12峰)、二氢菜油甾醇阿魏酸酯(13峰)，还包括八种目前尚未确定的杂质成分。从结果来看这些成分含量极低，但是本发明液相方法依然可以将它们有效分开。尽管对这五种杂质成分尚不知其具体的结构等信息，但数据已经证实本发明可以对谷维素样品种的有效成分和杂质进行区分控制。

表5提取纯化产物样品检测结果

实施例5市售谷维素原料的HPLC测定

在市售谷维素中，任选五份，参考实施例2配置成2mg/ml的谷维素原料溶液。进行HPLC分析，进样量为10ul，得到包含主成分、杂质成分成分的HPLC曲线，附图7。在仪器控制系统中，可以直接读出这些图谱对应的面积数据，将这些数据制作为表格6。

附图7显示，本发明的HPLC条件下可以区分出谷维素样品中的13种成分，其中包括环木菠萝烯醇阿魏酸酯(30峰)、24-亚甲基环木菠萝醇阿魏酸酯(31峰)、菜油甾醇阿魏酸酯(34峰)、B-谷甾醇阿魏酸酯(35峰)、二氢菜油甾醇阿魏酸酯(36峰)，还包括八种目前尚未确定的杂质成分。从结果来看这些成分含量极低，但是本发明液相方法依然可以将它们有效分开。尽管对这八种杂质成分尚不知其具体的结构等信息，但数据已经证实本发明可以对谷维素样品种的有效成分和杂质进行区分控制。

表6谷维素原料检测结果

实施例6谷维素药品破坏性研究中的HPLC测定

本发明申请人用谷维素提纯分离纯化得到的复合物样品进行了破坏研究，破坏方式为酸破坏三天。任选五份破坏后的样品，参考实施例2配置成2mg/ml的破坏样品溶液。进行HPLC分析，进样量为10ul，得到包含主成分、杂质成分成分的HPLC曲线，附图8。在仪器控制系统中，可以直接读出这些图谱对应的面积数据，将这些数据制作为表格7。

附图8显示，本发明的HPLC条件下可以区分出样品中的13种成分，其中包括环木菠萝烯醇阿魏酸酯(12峰)、24-亚甲基环木菠萝醇阿魏酸酯(13峰)、菜油甾醇阿魏酸酯(15峰)、B-谷甾醇阿魏酸酯(17峰)、二氢菜油甾醇阿魏酸酯(18峰)，还包括八种目前尚未确定的杂质成分。从结果来看这些成分含量极低，但是本发明液相方法依然可以将它们有效分开。尽管对这八种杂质成分尚不知其具体的结构等信息，但数据已经证实本发明可以对样品的有效成分和杂质进行区分控制。

表7破坏研究检测结果

由以上实施例可知，本发明的用于检测谷维素、谷维素提取分离纯化产物组分含量的方法灵敏度高，方法稳定，可以检出的成分更加明确。

Claims (4)

1.一种谷维素的高效液相色谱分离方法，其特征在于步骤如下：

(1)高效液相色谱条件为：

色谱柱：C18柱，规格为250mm×4.6mm，5μm；

流动相A采用甲醇∶四氢呋喃＝10∶20，流动相B采用乙腈∶水＝45∶15，流动相A和B的比例依据下表进行设置；

流速设为1.0ml/min；

柱温采用35℃；

检测波长325nm；

进样量：10μl；

(2)配制样品溶液，其中样品是市售谷维素原料、谷维素制剂、谷维素提取分离纯化后所得产物；

(3)测定峰面积，计算各组分含量。

2.权利要求1的高效液相色谱方法在谷维素质量研究中的应用。

3.权利要求1的高效液相色谱方法在谷维素提取分离纯化所得产物的质量研究中的应用。

4.根据权利要求3的应用，所述产物中环木菠萝烯醇阿魏酸酯和24-亚甲基环木菠萝醇阿魏酸酯的质量含量之和不低于90％。

Images