CN107669728A - 一种治疗前列腺增生的油菜花粉总甾醇及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种从油菜花粉中制备的治疗前列腺增生的总甾醇及其制备方法，油菜花粉总甾醇含量为75‑90%(wt%)，具体的甾醇成份及重量百分比为β‑谷甾醇10‑15%、菜油甾醇15‑20%、豆甾醇60‑70%和环阿屯醇2‑10%；其制备方法：以油菜花粉为原料，经超临界液体萃取、皂化和分子蒸馏纯化工艺制备而成。所制备的油菜花粉总甾醇成分确切，含量高，相关药效试验显示，该总甾醇明显降低前列腺增生大鼠的前列腺及背叶、腹叶的重量和体积，且疗效均优于前列康等现有技术产品，具有统计学意义；且其给药剂量明显降低，具有统计学意义。

Description

一种治疗前列腺增生的油菜花粉总甾醇及其制备方法
(一)技术领域：本发明涉及一种中药提取方法，具体为一种从油菜花粉中制备高纯度甾醇提取物的方法。
(二)背景技术：前列腺是男性体内比较小的一个器官，成人仅类似栗子大小，但是几乎所有的成年男性一生中都会受其影响，最常见的前列腺疾病为前列腺炎和良性前列腺增生。其中，儿童较少发生前列腺疾病，青壮年和老年人发病率则较高，且随着年龄的不同，发生病种也不同；如前列腺炎好发于青壮年，35岁以上男子的发病率可达35％-40％；良性前列腺增生是常见的老年男性多发病，60-69岁的老年人发病率可达50-60％，70-80岁的老年人发病率则高达80％以上。
油菜蜂花粉(Brassica campestris L.bee pollen)是一种由蜜蜂采集花粉混合蜜蜂特殊的分泌物混合而成的一种天然物质，是我国来源最多的蜜源蜂花粉，年销售油菜蜂花粉上千吨，在药品、保健品中应用广泛。油菜蜂花粉主要成分为甾醇，还含有多糖、黄酮类化合物、脂类等多种成分，提取时需破壁且还需除去脂质杂质影响。
良性前列腺增生(Benign Prostatic Hyperplasia，BPH)是一种老年男性常见的生理病变，发病率日趋渐长，对老年男性的身体和心理健康构成了威胁。近年来国内外研究证明油菜花粉中的甾醇类物质具有较好的抗前列腺增生的功效，目前国内临床上已有普乐安、普适泰等多种花粉制剂(主要有效成分为甾醇)用于治疗前列腺疾病，虽具有临床治疗价值，但由于花粉中总甾醇等有效成分含量低，尤其是β-谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和环阿屯醇等的含量几乎检测不到，导致患者日服量大，临床应用不方便。
故高效提取用于良性前列腺增生的油菜蜂花粉中总甾醇是目前研究的热点，已有诸多文献报道。如CN101569630A和CN101570560A分别公开了油菜花粉经超临界CO2萃取后过硅胶柱层析，有机溶剂洗脱得到24-亚甲基胆甾醇、花粉烷甾醇两个甾醇化合物和环按烯醇，两者的区别主要在于洗脱溶剂不同。上述两个专利采用了石油醚、乙酸乙酯、氯仿等有机溶剂，存在污染产品和环境的难题，而且由于总甾醇属于不皂化物，其萃取后直接进行硅胶柱层析不利于甾醇类物质的快速制备纯化，故制得的总甾醇种类少，得率低。CN1660225A和CN103417597A分别公开了两种有机溶剂提取制备油菜蜂花粉有效部分及其制备方法，在柱层析有机溶剂洗脱基础上，再使用有机溶剂提取，不仅溶剂消耗量更大，初级萃取物杂质多，后续分离难度大和成本高，而且较多有机溶剂残留更难去除，增加溶剂去除成本的同时也给终端产品带来更多潜在安全风险。
也有文献报道采用超临界萃取、皂化提取总甾醇，如CN102411036A公开了松花粉超临界萃取、皂化提纯甾醇的方法，于95℃皂化回流3h，后经无水乙醚提取，得到的甾醇中主要成分为β-谷甾醇，占总含量的74％。该专利虽然采用超临界萃取+皂化提纯，但皂化温度高，回流时间长，效率低成本高，使用乙醚增加了潜在安全及环境污染风险，且仅对β-谷甾醇进行定量，并未明确总甾醇的其他有效成分及其含量。
陆柏益(竹笋中甾醇类化合物的研究——竹笋甾醇化学、工艺学及生物学功能[M].浙江大学，2007.60-88)通过采用超临界CO2萃取竹笋甾醇，萃取压力为26.2MPa，萃取温度为43.4℃，CO2流量为25.4L/h，萃取时间为2.5h，甾醇萃取率为(93.4±4.5)％，短程分子蒸馏后，总甾醇纯度约69％。油菜花粉中主要成分为甾醇，而竹笋中除含有甾醇外，还含有大量多糖、氨基酸和多肽。该工艺中未去除脂质成分的干扰，分离效率低，影响甾醇得率及纯度，不能大规模应用。
可见，目前虽然已有文献报道采用超临界CO2萃取松花粉、竹笋中的甾醇成分，但是这些文献都未考虑待提取物中脂质成分的影响，而且提取的总甾醇主要药效成分与油菜蜂花粉区别较大，高效环保提取油菜蜂花粉中总甾醇仍然是目前急需解决的技术难点。
(三)发明内容：本发明提供了一种治疗前列腺增生的油菜花粉总甾醇，油菜花粉总甾醇重量含量为75-90％(wt％)，总甾醇成分明确，为β-谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和环阿屯醇4种，且各组分含量稳定，其重量百分比为β-谷甾醇10-15％、菜油甾醇15-20％、豆甾醇60-70％和环阿屯醇2-10％。相关药效试验显示，本发明制备的油菜花粉总甾醇可以明显降低小鼠前列腺各叶的重量、体积，且显著降低了给药剂量。
本发明还提供一种治疗前列腺增生的油菜花粉总甾醇的制备方法，其提取目标是油菜蜂花粉中治疗前列腺增生的药效成分β-谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和环阿屯醇等总甾醇，以油菜花粉为原料，采用安全性高的超临界CO2萃取技术，收集分离釜中棕色油膏状萃取物，将提取的棕色油膏状萃取物经皂化工艺处理后，再进行分子蒸馏分离纯化，制备得到用于治疗前列腺增生的高纯度油菜花粉总甾醇，油菜花粉总甾醇含量为75-90％(wt％)，其制备方法和步骤如下：
1、超临界CO2流体萃取：
取油菜花粉放入萃取釜，CO2超临界萃取(超临界萃取仪：美国Thar超临界流体超细微造粒系统SFP，美国Thar科技公司有限公司)，萃取压力为28～35MPa，时间1～3h，温度45～70℃，CO2流速为10～20g/min；收集分离釜中棕色油膏状萃取物，称重，备用；
2、油菜花粉甾醇分离纯化方法：
2.1皂化工艺：按1g:5～10mL比例取棕色油膏状萃取物、5～10％氢氧化钠乙醇溶液(m/V)混合，加入到反应容器中，在70～90℃水浴中回流加热20～40min后，加入4～6倍氢氧化钠乙醇溶液体积量的饱和NaCl溶液，转入分液漏斗中，用4～6倍氢氧化钠乙醇溶液体积量的正己烷有机溶剂萃取1-3次，其目的是除去羧酸盐、乙醇和水，合并萃取液，水洗至pH中性后用无水硫酸钠脱水，于旋转蒸发器上40-60℃蒸干，其目的是进一步除去乙醇、水和正己烷，待分子蒸馏纯化用；
2.2分子蒸馏纯化：进料温度40～60℃，蒸发面温度80～200℃，系统压力5～20Pa，刮膜器转速为150～250r/min，进料速度2～6ml/min的条件下进行分离纯化；此时冷凝管通入冷凝水，冷阱充满液氮，在旋转蒸发时未完全脱除的水分、小分子烃类物质和部分轻脂肪酸，在冷阱壁面上冷凝下来，靠重力作用逐渐从馏出物口流出，而甾醇类较重分子从残余液出口收集即得到油菜花粉甾醇。
其中，步骤1超临界CO2流体萃取之前，对油菜花粉进行干燥，干燥时间1～2h，温度40～60℃，然后采用聚乙烯(PE)袋双层包装，4℃冷藏，备用。
所述的步骤1中萃取压力30-35MPa，时间1.5-2.5h，温度为50-60℃，CO2流速为15～18g/min。
所述的步骤2.1皂化工艺中加入的氢氧化钠乙醇溶液(m/V)浓度为8％，棕色油膏状萃取物与氢氧化钠乙醇溶液的重量体积比为1g:7.5ml；水浴温度为80℃，水浴时间为30min。
本发明以油菜花粉为原料，采用原料前处理、超临界萃取、皂化后分子蒸馏纯化工艺方法制备高纯度油菜花粉总甾醇，用于治疗前列腺增生，本发明运用了与现有不同的工艺方法和不同的有机溶剂，从油菜花粉中提取制备了治疗前列腺增生的总甾醇，获得了意想不到的效果，其突出的有益效果如下：
1.本发明制备的油菜花粉总甾醇主要成分为β-谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和环阿屯醇4种，以总甾醇含量总和100％计，分别为β-谷甾醇10-15％、菜油甾醇15-20％、豆甾醇60-70％和环阿屯醇2-10％，成分明确，各组分含量稳定，如表1。
表1油菜花粉中甾醇的保留时间、成分、含量
2.本发明制备的油菜花粉总甾醇成分确切，含量高，相关药效试验显示，该总甾醇明显降低前列腺增生大鼠的前列腺及背叶、腹叶的重量和体积，且疗效均优于前列康等现有技术，具有统计学意义；且其给药剂量明显降低，具有统计学意义。
3.本发明制备方法中在油菜花粉CO2超临界萃取压力、温度及时间的协同控制，再运用特定的皂化工艺和正己烷有机溶剂萃取，去除脂质成分干扰，再通过分子蒸馏进一步萃取，蒸发面温度低(80-200℃)，分离效率高，杂质少，有效成分更明确，经检测，本发明制备的油菜花粉总甾醇纯度达到75-90％(wt％)，且得率达到1.0-2.0％。见表2。
表2油菜花粉甾醇萃取物纯化效果
4.本发明不需要进行破壁处理，采用乙醇、正己烷两种有机溶剂，未引入其他有毒有害试剂，预防了目标产物的二次污染，环保友好，适合大规模生产；而且皂化温度低(70-90℃)，回流时间短(20-40min)，易控制，提取效率高，降低提取成本。
因此，本发明提供了一种治疗前列腺增生的油菜花粉总甾醇及其制备方法，其不仅甾醇成份确切、含量高，效果显著，而且其制备方法环保、安全、经济。
(四)附图说明：
图1为油菜花粉甾醇提取工艺流程
图2为总甾醇的紫外吸收曲线，如图为分子蒸馏纯化后油菜花粉总甾醇溶液与β-谷甾醇标准溶液的紫外扫描，β-谷甾醇标准溶液的最大吸收峰为204nm，油菜花粉溶液为205nm，与文献的研究结果(菜籽甾醇，205nm，菜籽脱臭馏出物中甾醇，206nm)接近。
图3为油菜花粉植物甾醇的红外光谱结果分析，3345.6cm-1为甾醇分子中羟基的伸缩振动γ-OH，1054.9cm-1则为甾醇分子中羟基的弯曲振动γ-OH；波数为2934.9，2868.8cm-1的峰则为饱和碳氢键的伸缩振动γ-CH，1461.0，1381.0cm-1为饱和碳氢键的弯曲振动γ-CH；1666.5cm-1为碳-碳双键的伸缩振动γ-C＝C；指纹区970.3cm-1为反式二取代烯烃的δ＝CH；800.4cm-1为三取代烯烃的δ＝CH。
图4为油菜花粉纯化样品GC-MS总离子色谱图，保留时间为37.71min、38.26min、39.21min和39.79min时，根据质谱库检索分别为β-谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和环阿屯醇。
图5为油菜花粉总甾醇中β-谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和环阿屯醇4种的质谱图及其结构式。图5-1为β-谷甾醇(β-sitosterol)，图5-2为菜油甾醇(Campesterol)，图5-3为豆甾醇(Stigmasterol)，图5-4为环阿屯醇(Cycloartenol)。
(五)具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
实施例1：油菜花粉总甾醇的制备
将油菜花粉→50℃真空干燥(德国宾德binderVD23真空干燥箱)，1h→称取180g→放入萃取釜；CO2超临界萃取(美国Thar超临界流体超细微造粒系统SFP，美国Thar科技公司有限公司；萃取压力为30MPa，时间2h，温度60℃，CO2流速为18g/min→收集分离釜中棕色油状萃取物；取上述收集分离釜中棕色油状萃取物20g加至2L的三角瓶→加浓度8％氢氧化钠乙醇溶液(m/V)150ml→80℃水浴皂化30min→加入800ml饱和NaCl溶液，转入分液漏斗中→正己烷800ml萃取2次，合并萃取液，水洗至pH中性后用无水硫酸钠脱水蒸干→真空蒸馏(旋转蒸发仪，R5003K2B，配循环水泵，上海申生科技有限公司)，50℃，真空度0.1MPa→分子蒸馏(2#刮膜式分子蒸馏仪，美国POPE公司，配置冷却水循环系统及石墨刮板)；进料温度50℃，蒸发面温度120℃，系统压力10Pa，刮膜器转速为200r/min，进料速度5ml/min)→从残余液出口收集油菜花粉总甾醇提取物。经检测，该实施例的得率1.86％，制备的总甾醇纯度89.3％，油菜花粉总甾醇中各甾醇名称及其比例见表3。
表3实施例一油菜花粉中甾醇的成分、含量
出峰序号 保留时间/min 甾醇类型 相对百分比/％
1 37.78 β-谷甾醇 12.2
2 38.32 菜油甾醇 18.4
3 39.22 豆甾醇 64.5
4 39.80 环阿屯醇 4.9
实施例2：油菜花粉总甾醇的制备
取油菜花粉→60℃真空干燥(德国宾德binderVD23真空干燥箱)，2h→称取200g→放入萃取釜，CO2超临界萃取(美国Thar超临界流体超细微造粒系统SFP，美国Thar科技公司有限公司；萃取压力为35MPa，时间3h，温度70℃，CO2流速为20g/min→收集分离釜中棕色油状萃取物36g加至2L的三角瓶→加10％氢氧化钠乙醇溶液(m/V)180ml→90℃水浴皂化40min→加入1000ml饱和NaCl溶液，转入分液漏斗中→正己烷1000ml萃取1次，合并萃取液，水洗至pH中性后用无水硫酸钠脱水蒸干→真空蒸馏(旋转蒸发仪，R5003K2B，配循环水泵，上海申生科技有限公司)，60℃，真空度0.05Mpa→分子蒸馏(2#刮膜式分子蒸馏仪，美国POPE公司，配置冷却水循环系统及石墨刮板；进料温度60℃，蒸发面温度150℃，系统压力5Pa，刮膜器转速为250r/min，进料速度2ml/min)→从残余液出口收集油菜花粉甾醇提取物。经检测，该实施例的得率1.33％，甾醇纯度83.9％，油菜花粉总甾醇中各甾醇名称及其比例见表4。
表4实施例二油菜花粉中甾醇的成分、含量
出峰序号 保留时间/min 甾醇类型 相对百分比/％
1 37.70 β-谷甾醇 14.7
2 38.21 菜油甾醇 19.2
3 39.23 豆甾醇 61.8
4 39.72 环阿屯醇 4.3
实施例3：油菜花粉总甾醇的制备
取油菜花粉→40℃真空干燥(德国宾德binderVD23真空干燥箱)，1h→称取150g→放入萃取釜，CO2超临界萃取(美国Thar超临界流体超细微造粒系统SFP，美国Thar科技公司有限公司；萃取压力为25MPa，时间1h，温度40℃，CO2流速为10g/min→收集分离釜中棕色油状萃取物15g至2L的三角瓶→加5％氢氧化钠乙醇溶液(m/V)150ml→70℃水浴皂化20min→加入600ml饱和NaCl溶液，转入分液漏斗中→正己烷600ml萃取3次，合并萃取液，水洗至pH中性后用无水硫酸钠脱水蒸干→真空蒸馏(旋转蒸发仪，R5003K2B，配循环水泵，上海申生科技有限公司)，40℃，真空度0.1Mpa→分子蒸馏(2#刮膜式分子蒸馏仪，美国POPE公司，配置冷却水循环系统及石墨刮板；进料温度40℃，蒸发面温度80℃，系统压力5Pa，刮膜器转速为150r/min，进料速度2ml/min)→从残余液出口收集油菜花粉甾醇提取物。经检测，该实施例的得率1.08％，甾醇纯度81.5％。
实施例4：油菜花粉总甾醇的定量和定性分析：
(1)油菜花粉中总甾醇含量的测定方法：采用醋酐-浓硫酸显色法(Lieberman-Burchard法)，以β-谷甾醇为标准品，分光光度计520nm波长测定甾醇含量。
总甾醇纯度＝(测定的甾醇含量/萃取物质量)*100％
总甾醇萃取物得率＝(萃取物质量/油菜花粉原料质量)*100％
(2)紫外可见吸收光谱法分析
用紫外可见分光光度计进行扫描，扫描范围为190～500nm。
(3)傅里叶-红外光谱法分析
采用KBr压片法分别对甾醇类物质粉体进行FTIR谱图的测试。
(4)气相色谱-质谱(GC-MS)测定
气相色谱条件：毛细管柱：TG-5柱(30m×0.25mm，0.32μm)；升温程序：起始温度150℃，保持4min，以10℃/min升至240℃，保持2min，然后以5℃/min升至310℃，保持13min。进样口温度310℃；载气流速1.0mL/min；分流比20：1。
质谱条件：电子轰击离子源(EI)；电子能量70eV；离子源温度230℃；接口温度300℃；扫描质量范围20～510μ。各组分经过与标准品对照及MAINLAB谱库检索相匹配，确定其结构。
实施例5：本发明制备的油菜花粉总甾醇的小鼠抗前列腺增生试验
取雄性SD大鼠50只，体质量240-260g，常规饲养20d左右，增重至350-400g。随机分为正常对照组(n＝10)；增生模型组(n＝10)；前列康组(n＝10)；CN103417597B专利组(以下简称专利组)；油菜花粉甾醇组(n＝10，本发明实施例1提取物)；实验动物自由饮水进食，每天称重记录。
将丙酸睾酮用注射用油稀释，除正常对照组外，增生模型组、前列康组和油菜花粉甾醇组每只于皮下注射丙酸睾酮40mg/kg·d，连续注射30d，正常对照组注射等体积生理盐水，根据体重调节皮下注射剂量。自注射丙酸睾酮第1天起，依据表5各给药组每天灌胃给药一次，连续30天，正常对照组及增生模型组给予等溶剂蒸馏水，组别及给药剂量设计如表5所示。CN103417597B专利组给药的总甾醇为按照CN103417597B中方法所提取的总甾醇。
表5：组别及剂量设计
组别 剂量/mg·kg-1
正常对照组 给予等体积溶剂
增生模型组 给予等体积溶剂
前列康组 570.00(含甾醇约2.5％)
专利组 27(含甾醇约53.1％)
油菜花粉甾醇组 16(含甾醇约89.3％)
末次给药24h后，称量大鼠体重，剖检大鼠前列腺，并小心将其完整取出，分离大鼠前列腺右侧背叶和腹叶，分别用分析天平称量其湿重(mg)，测定体积(排水法)，计算前列腺脏器指数，见表6。前列腺脏器指数＝前列腺湿重(mg)/体重(g)。
表6：大鼠前列腺重量及脏器指数(n＝10)
注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与增生模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01
结论：与正常对照组比较，增生模型组前列腺总重、腹叶的重量及体积极显著增加(P＜0.01)，脏器指数、背叶湿重及体积均显著增加(P＜0.05)，说明前列腺增生大鼠造模成功。与增生模型组相比，前列康组、专利组对缓解前列腺增生均有效；油菜花粉甾醇组治疗后，小鼠的前列腺重量及脏器指数、丙酸睾酮诱导后前列腺背叶、腹叶的重量和体积均明显降低，具有统计学意义(P＜0.05)，且疗效均优于前列康(普乐安片)组，专利组；另一方面，油菜花粉甾醇给药剂量明显低于前列康组、专利组(P＜0.01)。

Claims (6)

1.一种治疗前列腺增生的油菜花粉总甾醇，其特征是，油菜花粉总甾醇重量含量为75-90％，其甾醇成份及重量百分比为β-谷甾醇10-15％、菜油甾醇15-20％、豆甾醇60-70％和环阿屯醇2-10％。
2.根据权利要求1所述的治疗前列腺增生的油菜花粉总甾醇的制备方法，其特征是：以油菜花粉为原料，经超临界液体萃取、皂化和分子蒸馏纯化工艺，制备得到治疗前列腺增生的总甾醇，该总甾醇为β-谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和环阿屯醇4种，总甾醇纯度75-90％，其具体方法为：
(1)超临界CO2流体萃取：取油菜花粉放入萃取釜，CO2超临界萃取，萃取压力为28～35MPa，时间1～3h，温度45～70℃，CO2流速为10～20g/min，收集分离釜中棕色油膏状萃取物；
(2)皂化工艺：按重量体积比g/ml为1:5～10比例取棕色油膏状萃取物、重量体积百分比为5％～10％的氢氧化钠乙醇溶液混合，加入到反应容器中，在70～90℃水浴中回流加热20～40min后，加入4-6倍氢氧化钠乙醇溶液体积量的饱和NaCl溶液，转入分液漏斗中，用4-6倍氢氧化钠乙醇溶液体积量的正己烷有机溶剂萃取1-3次，合并萃取液，水洗至pH中性后以无水硫酸钠脱水，于旋转蒸发器上40-60℃蒸干，待分子蒸馏纯化用；
(3)分子蒸馏纯化：进料温度40～60℃，蒸发面温度80～200℃，系统压力5～20Pa，刮膜器转速为150～250r/min，进料速度2～6ml/min，冷凝管通入冷凝水，冷阱充满液氮，收集残余液出口产物即得到油菜花粉总甾醇。
3.根据权利要求2所述的治疗前列腺增生的油菜花粉总甾醇的制备方法，步骤1超临界CO2流体萃取之前，对油菜花粉进行干燥，干燥时间1～2h，温度40～60℃，然后采用聚乙烯(PE)袋双层包装，4℃冷藏，备用。
4.根据权利要求2所述的治疗前列腺增生的油菜花粉总甾醇的制备方法，步骤1超临界CO2流体萃取的萃取压力30-35MPa，时间1.5-2.5h，温度为50-60℃，CO2流速为15～18g/min。
5.根据权利要求2所述的治疗前列腺增生的油菜花粉总甾醇的制备方法，步骤2皂化工艺中氢氧化钠乙醇溶液浓度为8％，棕色油膏状萃取物与氢氧化钠乙醇溶液的重量体积比为1g:7.5ml。
6.根据权利要求2所述的治疗前列腺增生的油菜花粉总甾醇的制备方法，步骤2皂化工艺中水浴温度为80℃，水浴时间为30min。
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