CN108516965A - 一种5α-还原酶抑制剂—荨麻裂环木脂素F及其制备方法 - Google Patents

一种5α-还原酶抑制剂—荨麻裂环木脂素F及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及中药生物活性成分的提取制备方法，具体涉及一种5α‑还原酶抑制剂—荨麻裂环木脂素F及其制备方法。本发明以滇藏荨麻为原料，采用乙醇溶剂提取、有机溶剂萃取、柱色谱和高效液相色谱的方法进行制备得到荨麻裂环木脂素F。本发明的荨麻裂环木脂素F对5α‑还原酶具有抑制作用，可用于制备抗前列腺增生药物。

Description

一种5α-还原酶抑制剂—荨麻裂环木脂素F及其制备方法
技术领域
本发明涉及中药生物活性成分的提取制备方法，具体涉及一种5α-还原酶抑制剂—荨麻裂环木脂素F及其制备方法。
背景技术
荨麻属植物中含有大量的木脂素类成分，Kraus等从异株荨麻(Urtica.dioicaL.)中分离得到(-)-开环异落叶松脂素、新橄榄树脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷、新橄榄树脂素-9-O-β-D-葡萄糖苷等15种木脂素类化合物；Schottner等从荨麻(Urtica)根提取物中分离得到全反结构(+)- 新橄榄脂素；王永奇等从滇藏荨麻(U.mairei Levl.)根的醇提取物中分离出2-亚甲基-3-[二(4- 羟基-3-甲氧基苯基)甲基]丁内酯和2,3-Z-2-羟甲基-3-[二(4-羟基-3-甲氧基苯基)甲基]丁内酯；闫兴国等对三角叶荨麻(U.triangularis Hand.-Mazz.)根的乙醇提取物进行了研究，分离得到 4个橄榄素类及其糖苷；周渊等对宽叶荨麻(U.laetevitens Maxim.)的化学成分研究发现了异落叶松脂素-9-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、松脂素-4-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷；冯宝民等从荨麻和三角叶荨麻根中分离到5个新的裂木脂素类化合物；王梦月等还从荨麻根乙醇提取物中分离得到两个新的裂木脂素类化合物：次草降血糖素A和次草降血糖素B；部分化合物结构如下式所示：
有研究表明从大荨麻根中分离到(+)-新橄榄树脂素、(-)-开环异落叶松脂素、脱氢二松柏醇、异落叶松脂素、松脂醇和3,4-二香草基四氢呋喃，并检验了以上几种物质体外与SBHG 的亲和作用，结果除松脂醇外，其余化合物都有亲合力，其中3,4-二香草基四氢呋喃的亲合作用最强，浓度为250μg/ml时抑制率为95％；提示大荨麻根中木脂素类是治疗BPH的活性成分之一。
本发明的课题组曾对国产的8种荨麻属植物根的不同提取物进行了抗前列腺增生的生物活性筛选，结果表明滇藏荨麻根的20％和95％乙醇提取物能显著地抑制前列腺增生大鼠的病变组织。
发明内容
本发明从滇藏荨麻中分离得到了荨麻裂环木脂素F，该成分的结构为一种新的裂环木脂素类成分，其对抑制5α-还原酶作用具有较强活性。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种5α-还原酶抑制剂—荨麻裂环木脂素F，其分子结构式如下：
上述的5α-还原酶抑制剂—荨麻裂环木脂素F的制备方法是以滇藏荨麻为原料，制备步骤如下：
(1)将滇藏荨麻干燥根粉碎处理后，用质量浓度为95％的工业乙醇回流提取，过滤后减压浓缩；
(2)将醇提取物用热水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，各萃取三次；
(3)乙酸乙酯萃取物经大孔树脂D101分离，采用水、质量浓度分别为30、50％的乙醇洗脱，收集洗脱液；
(4)50％乙醇洗脱液用硅胶柱色谱分离纯化，采用体积比为氯仿:甲醇＝30:1、10:1、5:1、 3:1、1:1的梯度洗脱，收集洗脱液；
(5)步骤(4)的洗脱液经反相高效液相色谱分离纯化，采用体积比为甲醇:水＝4:6的溶液洗脱，制备得到荨麻裂环木脂素F。
荨麻裂环木脂素F可以用于制备抗前列腺增生药物，将有效剂量的荨麻裂环木脂素F与药用载体混合并制成适当剂型的药物。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明从滇藏荨麻中得到了一种新的裂环木脂素类成分，其对抑制5α-还原酶作用具有较强活性，可作为抗前列腺增生药物成分，本发明制备原料为纯天然植物根，安全易得，方法简单易操作，不引入有毒物质，成本低廉，在抗前列腺增生药物研究开发上具有非常重要的意义。
具体实施方式
下面以具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不影响本发明的保护范围。
实施例1
滇藏荨麻药材采集自四川省阿巴州。
从滇藏荨麻中制备荨麻裂环木脂素F方法步骤如下：
(1)将滇藏荨麻干燥地下部分粉碎处理后，用质量浓度为95％的工业乙醇回流提取，料液比(kg/l)＝1:8，提取温度90℃，提取时间3h，提取次数3次，合并提取液，过滤后减压浓缩至无醇味；
(2)将醇提物200g用2L热水混悬，依次用2L的石油醚、乙酸乙酯萃取，各萃取3次。
(3)乙酸乙酯萃余物30g经D101大孔树脂(1kg)分离，采用水、质量浓度分别为30、50％的乙醇洗脱，每种洗脱液各收集10L；
(4)50％乙醇洗脱液浓缩至干得2.5g，用硅胶柱色谱(硅胶100g)分离纯化，采用体积比为氯仿:甲醇＝30:1、10:1、5:1、3:1、1:1梯度洗脱，收集每个比例洗脱液1L；
(5)步骤(4)的洗脱液浓缩至干得0.5g，然后经反相高效液相色谱分离纯化，采用甲醇:水＝4:6梯度洗脱，在254nm下检测，收集色谱峰浓缩后得到荨麻裂环木脂素F20mg。
采用核磁共振(NMR)等波谱技术测定其结构，荨麻裂环木脂素苷F的波谱数据见表1。
表1荨麻裂环木脂素F的1H NMR和13C NMR
实施例2
本发明选取前列腺组织中一个关键酶—5α-还原酶为作用靶点，采用酶联免疫(Enzyme-linked immunospecific assay ELISA)的方法，建立抑制5α-还原酶体外模型，从大鼠前列腺组织中提取5α-还原酶，与底物睾酮以及供氢体NADPH共同组成了一种微量反应体系，利用酶标仪检测双氢睾酮(DHT)的含量，以DHT的含量来测定本发明荨麻裂环木脂素F对5α-还原酶的抑制活性。
5α-还原酶抑制作用实验步骤如下：
(1)5α-还原酶的制备：
雄性SD大鼠3只，体重200±10g，大连医科大学实验动物中心提供，禁食不禁水过夜处死，迅速取出腹侧的前列腺组织在冰台上剪碎，用预冷的匀浆液(蔗糖0.73mol·L-1，氯化钙1.91 mmol·L-1)在玻璃匀浆器中匀浆，在4℃下以10 000rpm低温高速离心20min，取上清液再以 16 000rpm低温高速离心30min，即得5α-还原酶提取物。采用lowry法测定蛋白含量，以酶提物中的总蛋白含量表示5α-还原酶提取物的含量，将提取物放入小离心管在-70℃下保存，备用。
(2)5α-还原酶抑制活性测定：
操作分两部分完成，即①将反应成分37℃恒温缓冲液、睾酮、实施例1制备的荨麻裂环木脂苷A样品、阳性对照药、NADPH及酶组织液依次加入96孔板内，使之微量化，设置不同反应孔和对照孔板。反应温度为37℃(相对饱和湿度)，反应时间为60min；
②采用EL ISA法定量测定产物DHT，以产物的生成量大小反映酶活性的强弱。受试样品管中DHT的含量低于酶反应管中DHT含量时，则视为具有抑制5α-还原酶的活性。检测方法及计算参照睾酮试剂盒(购于Adlitteram Diagnostic Laboratories公司)使用说明进行。所有实验孔均为双复孔操作。在已经确定的反应体系基础上，辅酶NADPH浓度为1mmol·L-1，睾酮浓度为0.5μmol·L-1，结合睾酮试剂盒微量测定的特点，将整个反应体系的总量定为200μl。
酶反应体系中各组分的原始浓度分别为：缓冲溶液(PBS 20mmol·L-1，蔗糖0.2mol·L-1， EDTA Na2 1mmol·L-1，pH6.8)；NADPH浓度(20mmol·L-1)；粗酶浓度(4.3mg·ml-1)；睾酮浓度(20μmol·L-1)；非那雄胺(1.3mmol·L-1)。测定结果见表2。
表2荨麻裂环木脂素F抑制5α-还原酶作用
从上表可以看出荨麻裂环木脂素F能显著抑制DHT的生成，作用比阳性药非那雄胺强。

Claims (3)

1.一种5α-还原酶抑制剂—荨麻裂环木脂素F，其特征在于，其分子结构式如下：
2.如权利要求1所述的一种5α-还原酶抑制剂—荨麻裂环木脂素F的制备方法，其特征在于，所述方法以滇藏荨麻为原料，具体步骤如下：
(1)将滇藏荨麻干燥根粉碎处理后，用质量浓度为95％的工业乙醇回流提取，过滤后减压浓缩；
(2)将醇提取物用热水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，各萃取三次；
(3)乙酸乙酯萃取物经大孔树脂D101分离，采用水、质量浓度分别为30、50％的乙醇洗脱，收集洗脱液；
(4)50％乙醇洗脱液用硅胶柱色谱分离纯化，采用体积比为氯仿:甲醇＝30:1、10:1、5:1、3:1、1:1的梯度洗脱，收集洗脱液；
(5)步骤(4)的洗脱液经反相高效液相色谱分离纯化，采用体积比为甲醇:水＝4:6的溶液洗脱，制备得到荨麻裂环木脂素F。
3.如权利要求1所述的化合物在制备抗前列腺增生药物中的应用。
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