CN114392287A - 一种抑制5α还原酶活性的松针提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种抑制5α还原酶活性的松针提取物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及植物有效成分提取技术领域，尤其是涉及一种抑制5α还原酶活性的松针提取物及其制备方法和应用。本发明的抑制5α还原酶活性的松针提取物的制备方法，包括如下步骤：(A)采用醇溶液对松针进行提取得到松针提取物；(B)采用弱极性有机溶剂萃取所述松针提取物得到松针萃取物；(C)将所述松针萃取物经硅胶柱层析和液相色谱分离，在所述液相色谱分离的tR为12～30min时进行收集，得到所述松针提取物。采用该方法可以相对容易的从松针提取得到能够抑制5α还原酶活性的松针提取物，其包括落叶松脂醇和/或罗汉松脂素。

Description

一种抑制5α还原酶活性的松针提取物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及植物有效成分提取技术领域，尤其是涉及一种抑制5α还原酶活性的松针提取物及其制备方法和应用。
背景技术
松针(Pine needle)也称松叶、猪鬃松叶、松毛或山松须，是松科松属这一类植物的叶子，形状像针，是松属类植物的主要副产物之一。马尾松、华山松、雪松、红松、黑松、油松、湿地松和云南松等都是可药用的松属植物。松针是松属植物的主要药用部位。《本草纲目》和《太平圣惠方》等记载了“松针长期服用，治百病，安五脏，生毛发，耐寒暑，耐风吹雨打，轻身益气，守中而辟谷延年”的功能。现代技术研究表明，松针中的主要活性成分为挥发油、黄酮、多糖、木脂素和莽草酸等；并且松针资源丰富，利用价值高。目前，松针多被用于提取松针油或直接添加到畜禽饲料中，对松针原料的深度开发利用很缺乏，导致资源浪费。
脂溢性脱发(又称雄激素性脱发(androgenetic alopecia，AGA))是一种由基因决定、受雄激素影响的脱发疾病，通常伴有头皮油脂分泌过剩的问题。根据性别的不同，AGA的发病时间和脱发模式存在差异，分为男性型脱发(male pattern hair loss，MPHL)和女性型脱发(female pattern hair loss，FPHL)。MPHL通常在青春期后雄激素水平升高时期发生，开始于双侧额角的头发脱落，紧接着是前额和头顶的进行性脱发，最终仅存两侧颞部和枕部头发。FPHL则通常发生在女性更年期前后雌激素水平下降时期，其症状相对于MPHL较轻，表现为头顶和额部头发弥漫性稀疏、变细，但前额发际线不会后移。
目前关于AGA的发病机理研究已经深入到分子层面，主要机理之一为：5α还原酶介导的雄激素转换机制。睾酮(Testosterone，T)在5α还原酶催化下生成代谢产物二氢睾酮(dihydrotestosterone，DHT)。T和DHT均可与雄激素受体结合，所得复合物从细胞质转移到细胞核并结合到特定基因位点，影响蛋白质的转录和翻译，产生一系列造成头发异常生长的细胞因子或生长因子来攻击毛囊，导致毛囊微型化，最终使毛发生长受阻。事实上DHT与雄激素受体的亲和力是T的5倍以上，因此抑制5α还原酶的活性可以有效预防和减缓AGA。
目前医疗、化妆品行业常用的5α还原酶抑制剂主要是以甾体类化合物(非那雄胺和度他雄胺)为主；但其副作用较大，会引起性功能障碍和皮疹等不良反应。随着生物科学技术在医疗化妆品行业的广泛应用，寻找绿色安全、来源丰富、高效价廉的5α还原酶抑制剂是目前的迫切需求。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种抑制5α还原酶活性的松针提取物的制备方法，该方法可以相对容易的从松针中提取出能够抑制5α还原酶活性的松针提取物，该松针提取物中包括落叶松脂醇和/或罗汉松脂素。
本发明的第二目的在于提供一种抑制5α还原酶活性的松针提取物，具有优异的5α还原酶抑制活性。
本发明的第三目的在于提供上述抑制5α还原酶活性的松针提取物在制备脂溢性脱发的药物或防脱发的日化用品中的应用。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明提供了一种抑制5α还原酶活性的松针提取物的制备方法，包括如下步骤：
(A)采用醇溶液对松针进行提取得到松针提取物；
(B)采用弱极性有机溶剂萃取所述松针提取物得到松针萃取物；
(C)将所述松针萃取物经硅胶柱层析和液相色谱分离，在所述液相色谱分离的tR为12～30min时进行收集，得到所述松针提取物。
本发明还提供了一种抑制5α还原酶活性的松针提取物，其主要由所述的抑制5α还原酶活性的松针提取物的制备方法制得。
本发明还提供了所述的抑制5α还原酶活性的松针提取物在制备脂溢性脱发的药物或防脱发的日化用品中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供了一种抑制5α还原酶活性的松针提取物的制备方法，该方法以松针为原料，采用醇溶液提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析和液相色谱分离的方法，可相对容易的从松针中提取出能够抑制5α还原酶活性的松针提取物，即落叶松脂醇和罗汉松脂素，落叶松脂醇和罗汉松脂素的纯度可达90％以上；且该方法的原料来源丰富、简单易得、方法简单、操作方便。
(2)本发明提供了一种抑制5α还原酶活性的松针提取物，包括落叶松脂醇和/或罗汉松脂素；相比于甾体类化合物，落叶松脂醇和罗汉松脂素的潜在毒副作用小、对5α还原酶具有显著的抑制作用，可用于制备脂溢性脱发的药物或防脱发的日化用品。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1的松针提取物I的质谱图。
图2为本发明实施例1的松针提取物II的质谱图。
图3为本发明实施例1的松针提取物I的HPLC谱图。
图4为本发明实施例1的松针提取物II的HPLC谱图。
图5为本发明空白组、松针提取物组、孵育组的HPLC色谱图。
图6为本发明5α还原酶与落叶松脂醇的分子对接图。
图7为本发明5α还原酶与罗汉松脂素的分子对接图。
具体实施方式
下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的抑制5α还原酶活性的松针提取物及其制备方法和应用进行具体说明。
本发明的一些实施方式中提供了一种抑制5α还原酶活性的松针提取物的制备方法，包括如下步骤：
(A)采用醇溶液对松针进行提取得到松针提取物；
(B)采用弱极性有机溶剂萃取松针提取物得到松针萃取物；
(C)将松针萃取物经硅胶柱层析和液相色谱分离，在液相色谱分离的tR为12～30min时进行收集，得到松针提取物。
在本发明的一些实施方式中，步骤(A)中，松针包括马尾松、雪松、红松、黑松、油松中一种或多种。
在本发明的一些实施方式中，步骤(A)中，醇溶液与松针的质量比为6～12：1；典型但非限制性的，例如，醇溶液与松针的质量比为6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1和12：1；优选地，醇溶液与松针的质量比为8～10：1。
在本发明的一些实施方式中，步骤(A)中，醇溶液为乙醇或乙醇的水溶液；优选地，乙醇的水溶液中乙醇的体积分数≥70％。
在本发明的一些实施方式中，步骤(A)中，提取包括：向松针中加入醇溶液超声提取2～4次得到松针提取液，松针提取液经过滤、浓缩后得到松针提取物。
在本发明的一些实施方式中，步骤(A)中，超声提取的时间为0.5～2h；优选地，超声提取的时间为50～60min。
在本发明的一些具体的实施方式中，向松针中加入醇溶液超声提取50～60min，共提取2次，合并松针提取液；上述松针提取液经过滤、减压浓缩至松针提取液体积的1/15～1/10后得到松针提取物。
在本发明的一些实施方式中，步骤(B)中，弱极性有机溶剂包括石油醚和/或乙酸乙酯；优选地，弱极性有机溶剂为乙酸乙酯。
在本发明的一些实施方式中，步骤(B)中，萃取包括：将松针提取物分散于水中，再加入弱极性有机溶剂萃取3～5次得到萃取液，萃取液浓缩后得到松针萃取物。
在本发明的一些实施方式中，步骤(C)中，在液相色谱分离的tR为15.5～16min和/或18～18.5min时进行收集。
在本发明的一些实施方式中，步骤(C)中，硅胶柱层析中的硅胶柱为正相硅胶柱。
在本发明的一些实施方式中，步骤(C)中，液相色谱为半制备高效液相色谱。
在本发明的一些实施方式中，步骤(C)中，硅胶柱层析包括：依次采用石油醚和乙酸乙酯体积比为100：0、90：10、80：20和70：30的混合溶液作为洗脱剂进行梯度洗脱，然后收集石油醚和乙酸乙酯体积比为90：10的混合溶液洗脱得到的馏分。
在本发明的一些实施方式中，步骤(C)中，液相色谱分离的条件为：
流动相：A相为甲醇，B相为水；
流速：2.5～3.5mL/min；
线性梯度洗脱程序：0～10min，A相由20％升值80％；10～15min，A相保持80％；15～20min，A相由80％降低至20％。
在本发明的一些具体的实施方式中，步骤(C)中，液相色谱分离的流速为3mL/min。
在本发明的一些实施方式中，步骤(C)中，在液相色谱分离的tR为15.7min和/或18.3min时进行收集，得到松针提取物。
本发明以松针为原料，经醇溶液提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析和液相色谱分离的方法，在液相色谱分离的tR为15.7min和/或18.3min时进行收集，可相对容易的从松针中提取出能够抑制5α还原酶活性的松针提取物。经高分辨质谱鉴定，在液相色谱分离的tR为15.7min时收集到的松针提取物为落叶松脂醇，在液相色谱分离的tR为18.3min时收集到的松针提取物为罗汉松脂素。采用该方法制备得到的落叶松脂醇和罗汉松脂素的纯度较高，纯度均为90％以上。
本发明的一些实施方式中还提供了一种抑制5α还原酶活性的松针提取物，主要由上述抑制5α还原酶活性的松针提取物的制备方法制得。
在本发明的一些实施方式中，抑制5α还原酶活性的松针提取物包括落叶松脂醇和/或罗汉松脂素；
其中，落叶松脂醇的结构式为：
Figure BDA0003493321240000071
罗汉松脂素的结构式为：
Figure BDA0003493321240000072
本发明的叶松脂醇和罗汉松脂素对5α还原酶具有明显的抑制作用，可作为5α还原酶抑制剂来使用。
本发明的一些实施方式中还提供了抑制5α还原酶活性的松针提取物在制备脂溢性脱发的药物或防脱发的日化用品中的应用。
实施例1
本实施例提供了抑制5α还原酶活性的松针提取物的制备方法，包括如下步骤：
(A)选取马尾松针为原料，加入10倍量的体积分数为70％的乙醇水溶液超声提取60min，共提取2次，合并松针提取液，减压浓缩至原松针提取液体积的1/15得到松针提取物。
(B)将上述松针提取物分散于1倍体积的水中，然后加入1倍量乙酸乙酯萃取3次，减压浓缩得到松针萃取物。
(C)将松针萃取物均匀拌入200目正相硅胶，除去溶剂后将其添加到层析柱上层，进行分离；以石油醚和乙酸乙酯按体积比为100：0、90：10、80：20、70：30和60：40的混合溶液作为洗脱剂进行梯度洗脱，收集石油醚和乙酸乙酯体积比为90：10洗脱得到的洗脱液，洗脱液减压浓缩后将其溶解于体积分数为80％的甲醇水溶液中，采用半制备HPLC分离纯化，以甲醇的水溶液为洗脱剂，洗脱程序为：0～10min，甲醇体积分数20％升至80％；10～15min，甲醇体积分数保持80％；15～20min，甲醇体积分数由80％降低至20％。流速为3mL/min进行洗脱，在tR＝15.7min处进行收集、干燥后得到松针提取物I，在tR＝18.3min处进行收集、干燥后得到松针提取物II。
实施例2
本实施例提供了抑制5α还原酶活性的松针提取物的制备方法，包括如下步骤：
(A)选取红松松针为原料，加入8倍量的体积分数为90％的乙醇水溶液超声提取50min，共提取2次，合并松针提取液，减压浓缩至原松针提取液体积的1/10得到松针提取物。
(B)将上述松针提取物分散于1倍体积的水中，然后加入1倍量乙酸乙酯萃取3次，减压浓缩得到松针萃取物。
(C)将松针萃取物均匀拌入200目正相硅胶，除去溶剂后将其添加到层析柱上层，进行分离；以石油醚和乙酸乙酯按体积比为100：0、90：10、80：20、70：30和60：40的混合溶液作为洗脱剂进行梯度洗脱，收集石油醚和乙酸乙酯体积比为90：10洗脱得到的洗脱液，洗脱液减压浓缩后将其溶解于体积分数为80％的甲醇水溶液中，采用半制备HPLC分离纯化，以甲醇的水溶液为洗脱剂，洗脱程序为：0～10min，甲醇体积分数20％升至80％；10～15min，甲醇体积分数保持80％；15～20min，甲醇体积分数由80％降低至20％。流速为3mL/min进行洗脱，在tR＝15.7min处进行收集、干燥后得到松针提取物I，在tR＝18.3min处进行收集、干燥后得到松针提取物II。
对比例1
本对比例提供了抑制5α还原酶活性的松针提取物的制备方法，包括如下步骤：
(A)选取马尾松松针为原料，加入10倍量的体积分数为60％的乙醇水溶液超声提取50min，共提取2次，合并松针提取液，减压浓缩至原松针提取液体积的1/15得到松针提取物。
(B)将上述松针提取物分散于1倍体积的水中，然后加入1倍量乙酸乙酯萃取3次，减压浓缩得到松针萃取物。
(C)将松针萃取物均匀拌入200目正相硅胶，除去溶剂后将其添加到层析柱上层，进行分离；以二氯甲烷和乙酸乙酯按体积比为100：0、95：5、85：15、75：25和65：35的混合溶液作为洗脱剂进行梯度洗脱，收集二氯甲烷和乙酸乙酯体积比为95：15洗脱得到的洗脱液，洗脱液减压浓缩后将其溶解于体积分数为80％的甲醇水溶液中，采用半制备HPLC分离纯化，以甲醇的水溶液为洗脱剂，洗脱程序为：0～10min，甲醇体积分数20％升至80％；10～15min，甲醇体积分数保持80％；15～20min，甲醇体积分数由80％降低至20％。流速为3mL/min进行洗脱，在tR＝15.7min处进行收集、干燥后得到松针提取物I，在tR＝18.3min处进行收集、干燥后得到松针提取物II。
对比例2
本实施例提供了抑制5α还原酶活性的松针提取物的制备方法，包括如下步骤：
(A)选取红松松针为原料，加入8倍量的体积分数为50％的乙醇水溶液超声提取50min，共提取2次，合并松针提取液，减压浓缩至原松针提取液体积的1/10得到松针提取物。
(B)将上述松针提取物分散于1倍体积的水中，然后加入1倍量乙酸乙酯萃取3次，减压浓缩得到松针萃取物。
(C)将松针萃取物均匀拌入200目正相硅胶，除去溶剂后将其添加到层析柱上层，进行分离；以石油醚和乙酸乙酯按体积比为100：0、80：20、60：40和50：50的混合溶液作为洗脱剂进行梯度洗脱，收集石油醚和乙酸乙酯体积比为80：20洗脱得到的洗脱液，洗脱液减压浓缩后将其溶解于体积分数为80％的甲醇水溶液中，采用半制备HPLC分离纯化，以甲醇的水溶液为洗脱剂，洗脱程序为：0～10min，甲醇体积分数20％升至80％；10～15min，甲醇体积分数保持80％；15～20min，甲醇体积分数由80％降低至20％。流速为3mL/min进行洗脱，在tR＝15.7min处进行收集、干燥后得到松针提取物I，在tR＝18.3min处进行收集、干燥后得到松针提取物II。
试验例1
对实施例1中的松针提取物I进行高分辨质谱鉴定，其结果如图1所示。对实施例1中的松针提取物II进行高分辨质谱鉴定，其结果如图2所示。
经高分辨质谱鉴定，松针提取物I为落叶松脂醇(m/z 359、329、178)；松针提取物II为罗汉松脂素(m/z357、342、313、298)。
试验例2
通过计算得到的实施例1～2和对比例1～2的松针提取物I(落叶松脂醇)和松针提取物II(罗汉松脂素)的产率，以及通过高效液相色谱(HPLC)仪检测得到的实施例1～2和对比例1～2的松针提取物I(落叶松脂醇)松针提取物II(罗汉松脂素)的纯度，其结果记录至表1中，其中，实施例1中的松针提取物I(落叶松脂醇)的HPLC谱图如图3所示，实施例1中的松针提取物II(罗汉松脂素)的HPLC谱图如图4所示。
表1
产率(％) 纯度(％)
实施例1的落叶松脂醇 0.12 95.4
实施例1的罗汉松脂素 0.09 93.7
实施例2的落叶松脂醇 0.08 95.1
实施例2的罗汉松脂素 0.14 93.2
对比例1的落叶松脂醇 0.09 94.2
对比例1的罗汉松脂素 0.05 92.7
对比例2的落叶松脂醇 0.06 93.7
对比例2的罗汉松脂素 0.11 91.4
从表1可以看出，本发明的实施例1～2从松针中提取出的落叶松脂醇和罗汉松脂素具有良好的产率和纯度。
试验例3
松针提取物I和松针提取物II的5α还原酶抑制活性测定方法如下：
(1)5α还原酶的制备
取雄性SD大鼠5只，禁食不禁水过夜后处死，取出前列腺于冰台上剪碎。于0℃下用预冷的缓冲液(含0.32mol/L蔗糖、0.1mmol/L DTT、1mmol/L EDTA和0.2mol/L磷酸盐缓冲液)于玻璃匀浆器制成1：5匀浆，离心(10000g，10min)2次，去除上层白色脂肪层后取上清液加入缓冲液定容至20mL，分装至EP管中，于-80℃冰箱中保存。
(2)5α还原酶-松针提取物反应体系
孵育组(0.4mL磷酸盐缓冲液、0.1mL实施例1制得的松针提取物和0.5mL的5a还原酶提取物)，空白组(0.5mL磷酸盐缓冲液和0.5mL的5a还原酶提取物)和松针提取物组(0.9mL磷酸盐缓冲液和0.1mL实施例1制得的松针提取物)；分别于37℃下反应30min后，于3000r/min下离心10min，过0.45μm滤膜后，用高效液相色谱仪测定色谱峰变化情况，其结果如图5所示。
空白组、松针提取物组、孵育组的HPLC色谱图如图5所示。从图5可以看出，扣除空白组干扰后，与松针提取物组相比，孵育组在tR＝15.7min时的色谱峰消失，在tR＝18.3min处的色谱峰显著下降；表明这2个保留时间处的色谱峰与5α还原酶进行特异性结合，影响5α还原酶活性。
(3)5α还原酶活性测定
取0.5mL磷酸盐缓冲液、0.1mL样品、200uL睾酮溶液(300mg/L)和200uL NADPH溶液(0.8g/L)，添加0.5mL 5α还原酶提取物；于37℃下反应30min后，加入2.5mL二氯甲烷使反应停止并萃取睾酮，再加入0.25mL丙基羟苯酸酯(100mg/L)作为内标，于3000r/min下离心10min。去除上层水相，移出约1mL有机相并蒸干，将残留物溶于1.5mL甲醇，取10μL用高效液相色谱仪测定残留睾酮，根据睾酮转化量计算得到5α-还原酶抑制率(IC50)，其结果记录至表2中。其中，样品分别为实施例1中的松针提取物I、实施例1中的松针提取物II和非那雄胺。以非那雄胺为阳性药物。同时设定5α-还原酶反应管和5α-还原酶空白管。5α-还原酶反应管：0.1mL磷酸盐缓冲液代替0.1mL上述样品，其余不变。5α-还原酶空白管：0.5mL磷酸缓冲液代替0.5mL 5α还原酶提取物，其余不变。5α-还原酶反应管和5α-还原酶空白管的设置可计算出睾酮实际转化量，从而计算5α还原酶活性。
高效液相色谱仪测定的条件为：C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，柱温30℃，流动相为乙腈:水＝7：3(v/v)，流速0.5mL/min，紫外检测器，检测波长242nm。
5α还原酶活性以TμmolL-1/(mg protein·30min)表示，T转化率％＝(0min T浓度测定值-30min T浓度测定值)/0min T浓度测定值×100％。
5α-还原酶抑制率(％)＝(未加抑制剂的反应体系30minT转化量-加抑制剂的反应体系30minT转化量)/未加抑制剂的反应体系30minT转化量×100％。
(4)分子对接
从Protein Data Bank(PDB)、Uniprot数据库获得5a还原酶蛋白质受体，从Pubchem数据库获得小分子配体，利用Autodock 4.2.6软件进行分子对接，得到的5α还原酶与落叶松脂醇分子对接图，如图6所示；得到的5α还原酶与罗汉松脂素分子对接图，如图7所示，得到的G-score值记录至表2中。其中，G-score均为负值，其绝对值的大小说明配体与受体结合的作用力，绝对值越大，结合能力越强，对接效果越好。
表2
IC<sub>50</sub>(μM) G-score(kcal/mol) 化合物类型
松针提取物I 41±1.8 -8.2 木脂素类
松针提取物II 121±8.7 -4.3 木脂素类
非那雄胺 47±3.5 -7.1 4-氮杂甾体化合物
落叶松脂醇G-score高于非那雄胺，IC50低于非那雄胺，说明落叶松脂醇与5α还原酶结合能力强，具有强效的5α还原酶抑制活性。虽然罗汉松脂素G-score低于非那雄胺，IC50高于非那雄胺，但罗汉松脂素与5α还原酶仍具有较强的结合能力和5α还原酶抑制活性。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种抑制5α还原酶活性的松针提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(A)采用醇溶液对松针进行提取得到松针提取物；
(B)采用弱极性有机溶剂萃取所述松针提取物得到松针萃取物；
(C)将所述松针萃取物经硅胶柱层析和液相色谱分离，在所述液相色谱分离的tR为12～30min时进行收集，得到所述松针提取物。
2.根据权利要求1所述的抑制5α还原酶活性的松针提取物的制备方法，其特征在于，步骤(A)中，松针包括马尾松、雪松、红松、黑松和油松中的一种或多种；
优选地，步骤(A)中，所述醇溶液与所述松针的质量比为6～12：1；
优选地，步骤(A)中，所述醇溶液为乙醇或乙醇的水溶液；
优选地，步骤(A)中，所述乙醇的水溶液中乙醇的体积分数≥70％。
3.根据权利要求1所述的抑制5α还原酶活性的松针提取物的制备方法，其特征在于，步骤(A)中，所述提取包括：向所述松针中加入醇溶液超声提取2～4次得到松针提取液，所述松针提取液经过滤、浓缩后得到所述松针提取物；
优选地，所述超声提取的时间为0.5～2h。
4.根据权利要求1所述的抑制5α还原酶活性的松针提取物的制备方法，其特征在于，步骤(B)中，所述弱极性有机溶剂包括石油醚和/或乙酸乙酯；
优选地，步骤(B)中，所述萃取包括：将所述松针提取物分散于水中，再加入弱极性有机溶剂萃取3～5次得到萃取液，所述萃取液浓缩后得到所述松针萃取物。
5.根据权利要求1所述的抑制5α还原酶活性的松针提取物的制备方法，其特征在于，步骤(C)中，在所述液相色谱分离的tR为15.5～16min和/或18～18.5min时进行收集；
优选地，步骤(C)中，所述硅胶柱层析中的硅胶柱为正相硅胶柱；
和/或，步骤(C)中，所述液相色谱为半制备高效液相色谱。
6.根据权利要求1所述的抑制5α还原酶活性的松针提取物的制备方法，其特征在于，步骤(C)中，所述硅胶柱层析包括：依次采用石油醚和乙酸乙酯体积比为100：0、90：10、80：20和70：30的混合溶液作为洗脱剂进行梯度洗脱，然后收集石油醚和乙酸乙酯体积比为90：10的混合溶液洗脱得到的洗脱液。
7.根据权利要求1所述的抑制5α还原酶活性的松针提取物的制备方法，其特征在于，步骤(C)中，所述液相色谱分离的条件为：
流动相：A相为甲醇，B相为水；
流速：2.5～3.5mL/min；
线性梯度洗脱程序：0～10min，A相由20％升至80％；10～15min，A相保持80％；15～20min，A相由80％降低至20％。
8.一种抑制5α还原酶活性的松针提取物，其特征在于，主要由要求1～7任一项所述的抑制5α还原酶活性的松针提取物的制备方法制得。
9.根据权利要求8所述的抑制5α还原酶活性的松针提取物，其特征在于，所述抑制5α还原酶活性的松针提取物包括落叶松脂醇和/或罗汉松脂素。
10.如权利要求8或9所述的抑制5α还原酶活性的松针提取物在制备脂溢性脱发的药物或防脱发的日化用品中的应用。
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