CN115856132A - 一种玫瑰花美白成分的筛选与分离纯化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种玫瑰花美白成分的筛选与分离纯化的方法，包括对玫瑰花进行回流提取得到乙醇粗提物；萃取乙醇粗提物得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水层萃取物；然后进行酪氨酸酶抑制活性试验，确定乙酸乙酯萃取物为酪氨酸酶抑制活性最强的萃取物；对乙酸乙酯萃取物分别进行高效液相色谱和微馏分活性评价得到乙酸乙酯萃取物中抑制酪氨酸酶活性的目标化合物；利用高速逆流色谱方法分离乙酸乙酯样本得到黄没食子酸和N¹‑N⁵‑N¹⁰‑三‑4‑对香豆素酰亚精胺的富集物；通过半制备液相色谱方法对富集物进行纯化提取出黄没食子酸和N¹‑N⁵‑N¹⁰‑三‑4‑对香豆素酰亚精胺。利用该方法能够精准的提取玫瑰花的美白成分。

Description

一种玫瑰花美白成分的筛选与分离纯化的方法

技术领域

本发明属于玫瑰花筛选领域，具体涉及一种玫瑰花美白成分的筛选与分离纯化的方法。

背景技术

玫瑰(学名：Rosa rugosa Thunb.)；是蔷薇目、蔷薇科、蔷薇属的落叶灌木。玫瑰是一味药食同源的药材，既可入中药，也可作为护肤品外用。玫瑰花中含有300多种成分，从玫瑰花中分离到的主要化学成分包括挥发油及黄酮类、酚酸类、多糖类、色素、氨基酸和维生素等，其中挥发油中含有酚类、萜类、醇类、酯类、酮类等化合物。现代药理研究表明，玫瑰具有防治心脑血管疾病、抗氧化、抗抑郁、抑菌、抗病毒、止痛等作用。

经过紫外线的照射，人的皮肤会生成黑色素，黑色素的过度生成会导致皮肤出现色斑、暗沉、变黑、肤色不均等问题，影响了美观，给人们带来了困扰。美白肌肤，减少黑色素的产生是广大爱美人士的迫切需求。紫外线会激活酪氨酸酶，因此产生黑色素，而抑制酪氨酸酶活性是美白的重点内容。随着人们生活水平提高，对优质生活的要求也越来越高，在化妆品市场上，天然且安全的护肤品与化妆品深受消费人群追捧。传统的化学美白活性成分，如汞、氢醌等，具有细胞毒性、刺激性、致敏性及强不良反应，已被禁用于化妆品行业。因此，使用添加天然草本植物精华的美容用品已经成为全球趋势。玫瑰可作为一种潜在的天然美白剂添加于化妆品中，具有很好的美白潜力。

对玫瑰花的化学成分以及生理活性的综合应用等方面的研究也逐渐增多，现有技术中有公开，对玫瑰花美白精华的提取主要是通过大孔吸附树脂对玫瑰花萃取液进行提取获得的，中国专利2021102337931公开了玫瑰美白精华液的制备方法，包括将玫瑰花瓣、乙醇水溶液、促渗剂混合并搅拌，同时使用超声波处理，得到玫瑰浸泡物；所述促渗剂为山苍子油、柠檬草油中的一种或者两种的混合物；对玫瑰浸泡物进行压滤后得到滤液，对所述滤液离心处理，收集上清液；将上清液浓缩，得到浓缩液；将浓缩液和无水乙醇混合并搅拌，同时用超声波处理，得到浓缩液-无水乙醇混合物；用羟基丁二酸调节浓缩液-无水乙醇混合物的pH，然后静置，随后离心处理，取沉淀，并将所述沉淀烘干，得到玫瑰粗提物；用乙醇水溶液浸泡FL-2型大孔吸附树脂，然后用乙醇水溶液清洗所述树脂直至乙醇洗脱液与水混合无白色浑浊，随后将所述经过清洗的树脂装柱；将由玫瑰粗提物和乙醇水溶液混合并搅拌，得到玫瑰粗提物-乙醇水溶液；将玫瑰粗提物-乙醇水溶液上样；然后，先后分别用蒸馏水、乙醇水溶液冲洗除杂；收集高纯洗脱液；将高纯洗脱液冷冻干燥直至得到粉末状固体，即为所述玫瑰提取物。利用上述专利能够去除玫瑰花的杂质从而获得玫瑰花美白精华，但无法精准获得玫瑰花中起到美白作用的天然成分。

发明内容

本发明提供了一种玫瑰花美白成分的筛选与分离纯化的方法，利用该方法能够精准的提取玫瑰花的美白成分。

一种玫瑰花美白成分的筛选与分离纯化的方法，包括：

通过乙醇溶液对玫瑰花进行回流提取获得提取液，对所述提取液进行过滤、真空回收得到乙醇粗提物；

利用纯水将乙醇粗提物进行分散，将分散乙醇粗提物分别通过石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水层萃取物；

将所述石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水层萃取物进行酪氨酸酶抑制活性试验，确定乙酸乙酯萃取物为酪氨酸酶抑制活性最强的萃取物；

对乙酸乙酯萃取物分别进行高效液相色谱和微馏分活性评价得到乙酸乙酯萃取物中抑制酪氨酸酶活性的目标化合物；

将正己烷、乙酸乙酯、甲醇和甲酸水按照体积比为2～4:6～8:2～4:6～8混合形成混合溶液体系，将所述混合溶液体系加入分液漏斗，振荡、静置形成上相和下相，将上相作为高速逆流色谱的固定相，将下相作为高速逆流色谱的流动相，将乙酸乙酯萃取物与固定相混合得到乙酸乙酯样本溶液，利用高速逆流色谱方法对乙酸乙酯样本进行分离得到黄没食子酸的富集物和N¹-N⁵-N¹⁰-三-4-对香豆素酰亚精胺的富集物；

通过半制备液相色谱方法分别对黄没食子酸的富集物和N¹-N⁵-N¹⁰-三-4-对香豆素酰亚精胺的富集物进行纯化提取出黄没食子酸和N¹-N⁵-N¹⁰-三-4-对香豆素酰亚精胺。

所述回流提取的参数为：提取次数为2～4次，提取温度为90～110℃，每次提取时间为0.8h～1.2h。

将分散乙醇粗提物通过石油醚萃取2～4次，合并石油醚萃取层得到石油醚萃取物；将分散乙醇粗提物通过乙酸乙酯萃取2～4次，合并乙酸乙酯萃取层得到乙酸乙酯萃取物；将分散乙醇粗提物通过正丁醇萃取2～4次，合并正丁醇萃取层得到正丁醇萃取物。

所述酪氨酸酶抑制活性试验包括单酚活性试验和二酚活性试验。

本发明提供了对所述石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水层萃取物分别进行单酚活性试验，包括：

构建空白组：将磷酸盐缓冲液、二甲基亚砜和L-酪氨酸工作液混合得到空白组；

构建空白样品组：将石油醚萃取物样品溶液、乙酸乙酯萃取物样品溶液、正丁醇萃取物样品溶液和水层萃取物样品溶液分别与第一混合液混合得到石油醚萃取物空白样品组、乙酸乙酯萃取物空白样品组、正丁醇萃取物样品溶液和水层萃取物空白样品组，所述第一混合液包括磷酸盐缓冲液和L-酪氨酸工作液；

构建对照组：将磷酸盐缓冲液、二甲基亚砜、第一酪氨酸酶溶液和L-酪氨酸工作液混合得到对照组；

构建样品组：将石油醚萃取物样品溶液、乙酸乙酯萃取物样品溶液、正丁醇萃取物样品溶液和水层萃取物样品溶液分别与第二混合液混合得到石油醚萃取物样品组、乙酸乙酯萃取物样品组、正丁醇萃取物样品组和水层萃取物样品组，所述第二混合液包括磷酸盐缓冲液、第一酪氨酸酶溶液和L-酪氨酸工作液；

在28～32℃温度下，分别对空白组、空白样品组、对照组和样品组进行光照，并检测各组的吸光值，并基于空白组、空白样品组、对照组和样品组的吸光值得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水层萃取物对酪氨酸酶的抑制率。

本发明提供了对所述石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水层萃取物进行双酚活性试验，包括：

构建空白组：将磷酸盐缓冲液、二甲基亚砜和L-酪氨酸工作液混合得到空白组；

构建空白样品组：将石油醚萃取物样品溶液、乙酸乙酯萃取物样品溶液、正丁醇萃取物样品溶液和水层萃取物样品溶液分别与第一混合液混合得到石油醚萃取物空白样品组、乙酸乙酯萃取物空白样品组、正丁醇萃取物空白样品组和水层萃取物空白样品组，所述第一混合液包括磷酸盐缓冲液和L-酪氨酸工作液；

构建对照组：将磷酸盐缓冲液、二甲基亚砜、第二酪氨酸酶溶液和L-酪氨酸工作液混合得到对照组；

构建样品组：将石油醚萃取物样品溶液、乙酸乙酯萃取物样品溶液、正丁醇萃取物样品溶液和水层萃取物样品溶液分别与第三混合液混合得到石油醚萃取物样品组、乙酸乙酯萃取物样品组、正丁醇萃取物样品组和水层萃取物样品组，所述第三混合液包括磷酸盐缓冲液、第二酪氨酸酶溶液和L-酪氨酸工作液；

在28～32℃温度下，分别对空白组、空白样品组、对照组和样品组进行光照，并检测各组的吸光值，并基于空白组、空白样品组、对照组和样品组的吸光值得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水层萃取物对酪氨酸酶的抑制率。

所述L-酪氨酸工作液的制备方法，包括将4～5mg L-酪氨酸加入7～9mL磷酸缓冲液得到L-酪氨酸溶液；将4～6mLL-酪氨酸溶液加入9～11mL磷酸缓冲液配制成L-酪氨酸工作液。

所述左旋多巴工作液的制备方法，包括将15～16mg左旋多巴溶液加入7～9mL磷酸缓冲液得到左旋多巴溶液；将5～7mL左旋多巴溶液加入5～7mL磷酸缓冲液配制成左旋多巴工作液。

所述第一酪氨酸酶溶液的制备方法，包括将0.9～1.1mg的酪氨酸酶加入9～11mL磷酸缓冲液得到第一酪氨酸酶溶液。

所述第二酪氨酸酶溶液的制备方法，包括将0.4～0.5mg的酪氨酸酶加入7～9mL磷酸缓冲液得到第二酪氨酸酶溶液。

将所述石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水层萃取物分别溶于二甲基亚砜得到石油醚萃取物样品溶液、乙酸乙酯萃取物样品溶液、正丁醇萃取物样品溶液和水层萃取物样品溶液。

所述单酚实验检测方法为：按各实验组条件规定的量分别加入96孔板中，先加入样品溶液、磷酸缓冲液和酪氨酸酶溶液，孵育4～6min后再加入L-酪氨酸溶液在34～36℃，492nm波长下监测30min。

所述二酚实验检测方法为：各实验组条件规定的量分别加入96孔板中，先加入样品溶液、磷酸缓冲液和左旋多巴溶液，在29～31℃下孵育10min后再加入酪氨酸酶溶液，立刻在29～31℃，492nm波长下监测6min。

酪氨酸酶是一种以Cu²⁺为辅助因子的金属酶，在催化反应中具有单酚酶活力和二酚酶活力。将酪氨酸羟化后产生左旋多巴，然后再将左旋多巴氧化成多巴醌和黑色素。

所述对乙酸乙酯萃取物分别进行高效液相色谱和微馏分活性评价得到乙酸乙酯萃取物中抑制酪氨酸酶活性的目标化合物，包括：

将乙酸乙酯萃取物一部分通过高效液相色谱得到液相色谱图，将乙酸乙酯萃取物另一部用于配置单酚活性试验、双酚活性试验的样品组和空白样品组，并通过单酚活性试验和双酚活性试验得到乙酸乙酯萃取物中抑制酪氨酸酶活性的活性谱图，将活性谱图与液相谱图进行比较得到乙酸乙酯萃取物中抑制酪氨酸酶活性的目标化合物。

所述高效液相色谱的条件为：H&E SP ODS-A C₁₈色谱柱尺寸为：250mm×4.6mm，5μm；柱温30℃；流动相为甲醇A-0.1％甲酸水B溶液，梯度洗脱模式0～8min，10％～15％ A；8～18min，15％～19％ A；18～28min，19％～25％ A；28～40min，25％～34％A；40～48min，34％～40％A；48～85min，40％～75％A，流速：0.8～1.0mL/min，检测波长：280nm、254nm；进样量：10～20μL。

所述混合溶液体系的上下相对目标化合物的分配系数为0.5-2。

所述利用高速逆流色谱方法对乙酸乙酯样本进行分离得到黄没食子酸的富集物和N¹-N⁵-N¹⁰-三-4-对香豆素酰亚精胺的富集物，包括：

将所述固定相加入高速逆流色谱仪的分离柱，在500-1000r/min转速下转动分离柱，以9～10mL/min的流速向分离柱注入流动相，当分离柱尾流出流动相，将乙酸乙酯样本溶液通过进样阀注入分离柱，收集洗脱液，同时通过液相色谱跟踪检测洗脱液，直到洗脱液中无目标化合物停止收集，将收集到的洗脱液通过高效液相色谱进行检测得到黄没食子酸洗脱液和N¹-N⁵-N¹⁰-三-4-对香豆素酰亚精胺洗脱液，将黄没食子酸洗脱液和N¹-N⁵-N¹⁰-三-4-对香豆素酰亚精胺洗脱液分别进行减压蒸发溶剂得到黄没食子酸的富集物和N¹-N⁵-N¹⁰-三-4-对香豆素酰亚精胺的富集物。

所述半制备液相色谱的参数为：H&E SP ODS-A C18(色谱柱参数：10mm×250mm，5μm)；柱温30℃；流动相为甲醇(A)-0.1％甲酸水(B)溶液，等度洗脱模式30％A，70％B)，流速：A：0.6mL/min；B：1.4mL/min检测器波长：280nm、254nm；进样量：200μL。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明首先通过酪氨酸酶抑制活性试验确定乙酸乙酯萃取物为酪氨酸酶抑制活性最强的萃取物。然后通过微馏分活性评价从乙酸乙酯萃取物中获得抑制酪氨酸酶活性的目标化合物，然后通过高速逆流色谱方法分离目标化合物，并通过半制备液相色谱方法进行提纯从而从玫瑰花中首次精准获得到美白成分黄没食子酸和N¹-N⁵-N¹⁰-三-4-对香豆素酰亚精胺。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的乙酸乙酯萃取物的高效液相色谱(HPLC)图谱与酪氨酸酶抑制微馏分活性图谱。

图2为本发明实施例1提供的对乙酸乙酯萃取物样品溶液的高速逆流色谱图；

图3为本发明实施例1提供的黄没食子酸的洗脱液的高效液相色谱图；

图4为本发明实施例1提供的N¹-N⁵-N¹⁰-三-4-对香豆素酰亚精胺的洗脱液的高效液相色谱图；

图5为本发明实施例1提供的黄没食子酸的半制备液相图；

图6为本发明实施例1提供的N¹-N⁵-N¹⁰-三-4-对香豆素酰亚精胺的半制备液相图；

图7为本发明实施例1提供的黄没食子酸的质谱图；

图8为本发明实施例1提供的N¹-N⁵-N¹⁰-三-4-对香豆素酰亚精胺的质谱图；

图9为本发明实施例1提供的黄没食子酸和N¹-N⁵-N¹⁰-三-4-对香豆素酰亚精胺的结构图；

图10为本发明实施例2提供的对乙酸乙酯萃取物样品溶液的高速逆流色谱图；

图11为本发明实施例3提供的对乙酸乙酯萃取物样品溶液的高速逆流色谱图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。

本发明实施例中采用高速逆流色谱仪(分离柱柱体积为120mL)，高速逆流色谱仪分离系统由恒流泵、紫外检测器、记录仪等组成。

实施例1

(1)样品的制备：

(1-1)称取100.0g玫瑰粉末于圆底烧瓶，加入1.5L 70％乙醇，上接冷凝管，下端进水上端出水，加热回流1h，过滤，保留滤液，再往滤渣中加入1L 70％乙醇，加热回流1h，过滤，保留滤液，往滤渣中加入1L 70％乙醇，加热回流:。

(1-2)提取液趁热过滤、真空回收溶剂将浓缩液置于蒸发皿中，于水浴烘干得到乙醇粗提物45.443g。

(1-3)称取浸膏粉即粗提物5.059g，加200mL蒸馏水溶解，以等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取三次，合并萃取层，真空回收溶剂分别得到石油醚萃取物43mg、乙酸乙酯萃取物709mg、正丁醇萃取物1279mg、水层萃取物3038mg。

(2)酪氨酸酶活性抑制实验：

溶液配制：

L-酪氨酸(L-tyrosine)溶液：称取4.35mg L-酪氨酸(L-tyrosine)加入8mL磷酸缓冲液配制成544μg/mL的L-酪氨酸溶液。

L-酪氨酸(L-tyrosine)工作液：取5mL L-酪氨酸溶液加入10mL磷酸缓冲液配制成1mmoL/L(181.19μg/mL)L-tyrosine工作液。

左旋多巴(L-DOPA)溶液：称取15.78mg的L-DOPA加入8mL磷酸缓冲液，配制成1.972mg/mL的左旋多巴溶液。

左旋多巴(L-DOPA)工作液：取6mL左旋多巴溶液加入6mL磷酸缓冲液配制成5mmoL/L(986μg/mL)L-DOPA溶液。

酪氨酸酶溶液：配置酪氨酸酶(1240U/mg)。单酚活性实验：称取酪氨酸酶1.0mg，加入10mL磷酸缓冲液配制成124U/mL的第一酪氨酸酶溶液。二酚活性实验：称取酪氨酸酶0.46mg，加入8mL磷酸缓冲液配制成的第二酪氨酸酶溶液71.4U/mL。

样品溶液配制：将4mg石油醚萃取物和1mL二甲基亚砜(DMSO)溶解得到浓度为4.0mg/mL的混合溶液，将混合溶液分别稀释成浓度为2000μg/mL、1000μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL、31.25μg/mL的石油醚萃取物样本溶液。基于石油醚萃取物样本溶液的制备方法分别制得乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、水层萃取物的样本溶液。

单酚活性试验：

设置空白组(blank)：将140μL磷酸盐缓冲液、10μL DMSO和50μL-tyrosine溶液混合作为空白组；

空白样品组(blank sample)：将140μL磷酸盐缓冲液、50μL L-tyrosine溶液和10μL石油醚萃取物样品溶液混合得到石油醚萃取物空白样品组(blank sample1)；将140μL磷酸盐缓冲液、50μL L-tyrosine溶液和10μL乙酸乙酯萃取物样本溶液混合得到乙酸乙酯萃取物空白样品组(blank sample2)；将140μL磷酸盐缓冲液、50μL L-tyrosine溶液和10μL正丁醇萃取物样本溶液混合得到正丁醇萃取物空白样品组(blank sample3)；将140μL磷酸盐缓冲液、50μL L-tyrosine溶液和10μL水层萃取物样本溶液混合得到水层萃取物空白样品组(blank sample4)；石油醚萃取物空白样品组、乙酸乙酯萃取物空白样品组、正丁醇萃取物空白样品组和水层萃取物空白样品组构建空白样品组。

对照组(control)：90μL磷酸盐缓冲液、10μL DMSO、50μL第一酪氨酸酶溶液和50μLL-tyrosine溶液混合得到对照组。

样品组(sample)：将90μL磷酸盐缓冲液、50μL第一酪氨酸酶溶液、50μL L-tyrosine溶液和10μL石油醚萃取物样本溶液混合得到石油醚萃取物样品组(sample1)；将90μL磷酸盐缓冲液、50μL第一酪氨酸酶溶液、50μL L-tyrosine溶液和10μL乙酸乙酯萃取物样本溶液混合得到乙酸乙酯萃取物样品组(sample2)；将90μL磷酸盐缓冲液、50μL第一酪氨酸酶溶液、50μL L-tyrosine溶液和10μL正丁醇萃取物样本溶液混合得到正丁醇萃取物样品组(sample3)；将90μL磷酸盐缓冲液、50μL第一酪氨酸酶溶液、50μL L-tyrosine溶液和10μL水层萃取物样本溶液混合得到水层萃取物样品组(sample4)；石油醚萃取物样品组、乙酸乙酯萃取物样品组、正丁醇萃取物样品组和水层萃取物样品组构建空白样品组。

二酚活性试验：

设置空白组(blank)：将140μL磷酸盐缓冲液、10μL DMSO和50μLL-DOPA溶液混合作为空白组；

空白样品组(blank sample)：将140μL磷酸盐缓冲液、50μL L-DOPA溶液和10μL石油醚萃取物样品溶液混合得到石油醚萃取物空白样品组(blank sample1)；将140μL磷酸盐缓冲液、50μL L-DOPA溶液和10μL乙酸乙酯萃取物样品溶液混合得到乙酸乙酯萃取物空白样品组(blank sample2)；将140μL磷酸盐缓冲液、50μL L-DOPA溶液和10μL正丁醇萃取物样品溶液混合得到正丁醇萃取物空白样品组(blank sample3)；将140μL磷酸盐缓冲液、50μLL-DOPA溶液和10μL水层萃取物样品溶液混合得到水层萃取物空白样品组(blanksample4)；石油醚萃取物空白样品组、乙酸乙酯萃取物空白样品组、正丁醇萃取物空白样品组和水层萃取物空白样品组构建空白样品组。

对照组(control)：90μL磷酸盐缓冲液、10μL L-DOPA+50μL第二酪氨酸酶溶液和50μL L-tyrosine溶液混合得到对照组；

样品组(sample)：将90μL磷酸盐缓冲液、50μL第二酪氨酸酶溶液、50μL L-DOPA溶液和10μL石油醚萃取物样品溶液混合得到石油醚萃取物样品组(sample1)；将90μL磷酸盐缓冲液、50μL第二酪氨酸酶溶液、50μL L-DOPA溶液和10μL乙酸乙酯萃取物样品溶液混合得到乙酸乙酯萃取物样品组(sample2)；将90μL磷酸盐缓冲液、50μL第二酪氨酸酶溶液、50μLL-DOPA溶液和10μL正丁醇萃取物样品溶液混合得到正丁醇萃取物样品组(sample3)；将90μL磷酸盐缓冲液、50μL第二酪氨酸酶溶液、50μL L-DOPA溶液和10μL水层萃取物样品溶液混合得到水层萃取物样品组(sample4)；石油醚萃取物样品组、乙酸乙酯萃取物样品组、正丁醇萃取物样品组和水层萃取物样品组构建空白样品组。

基于抑制率公式分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水层萃取物对酪氨酸酶的抑制率。

A_sample1、A_sample2、A_sample3、A_sample4分别为石油醚萃取物样品组、乙酸乙酯萃取物样品组、正丁醇萃取物样品组和水层萃取物样品组的吸波值：A_{blank sample1}、A_{blank sample2}、A_{blank sample3}、A_{blank sample4}分别为石油醚萃取物空白样品组、乙酸乙酯萃取物空白样品组、正丁醇萃取物空白样品组和水层萃取物空白样品组的吸波值；A_{blank sample}为空白样品组的吸波值；A_blan为空白组的吸波值。

实验方法：在96孔板中依次加入10μL样品溶液，加入90μL PBS(pH 6.8)，50μL125U/mL酪氨酸酶溶液，于35℃孵育5min，加入50μL 1mM L-tyrosine溶液，立刻在35℃，492nm波长下监测30min(5min测一次)。

实验结果：如表1所示，乙酸乙酯层萃取物的IC₅₀值单酚活性和二酚活性都是最小，IC₅₀(即被检测的药物制剂的半抑制浓度数值)越小则代表活性越好，由表中数据可以得出乙酸乙酯萃取物的活性最好，故后续选择了乙酸乙酯层萃取物作为实验对象。

表1玫瑰花不同萃取层酪氨酸酶抑制率的IC₅₀值

(3)优化玫瑰花乙酸乙酯萃取物液相条件，通过微馏分活性评价法确定活性峰，具体步骤为：将玫瑰乙酸乙酯层萃取物进行高效液相色谱分析：液相进样量2mg，15μL；采样频率12s/孔，收集液相图中0-90min的馏分。每块板设置84个样品组，12个对照组(control)。样品组中样品溶液(乙酸乙酯萃取物溶液)在溶剂挥发仪中除去溶剂后加入10μL DMSO溶液和90μL磷酸盐缓冲液，根据单酚和二酚的酪氨酸酶抑制活性测定方法，按照步骤(2)的方法测定酪氨酸酶抑制活性得到活性谱图。将图1的b的酪氨酸酶二酚酶抑制活性的活性谱图，图1的c的酪氨酸酶单酚酶抑制活性的活性谱图与图1的a的高效液相色谱图比较，可知，39min左右的目标化合物(图1中峰1)和71min左右的目标化合物(图1中峰2)具有酪氨酸酶抑制活性。

本步骤提供的高效液相色谱条件为：H&E SP ODS-A C₁₈(250mm×4.6mm，5μm)；柱温30℃；流动相为甲醇(A)-0.1％甲酸水(B)溶液，梯度洗脱模式(0～8min，10％～15％ A；8～18min，15％～19％ A；18～28min，19％～25％ A；28～40min，25％～34％A；40～48min，34％～40％A；48～85min，40％～75％A)，流速：1.0mL/min；检测波长：280nm、254nm；进样量：15μL。

(4)高速逆流色谱分离

基于步骤(3)得到目标化合物配制高速逆流色谱的混合溶液体系，所述混合溶液体系包括正己烷、乙酸乙酯、甲醇和0.1％甲酸水。正己烷、乙酸乙酯、甲醇和0.1％甲酸水按照体积比3:7:3:7，将混合溶液体系加入分液漏斗中，充分振摇后静置分层，上相作为固定相，下相流动相；称取乙酸乙酯萃取物30mg，用10mL固定相溶解，得到乙酸乙酯萃取物样品溶液。

采用高速逆流色谱对乙酸乙酯萃取物样品溶液进行分离，分离图如图2所示，分离柱的柱体积为125mL。首先将固定相以10mL/min的流速注满分离柱，然后开启速度控制器，使分离柱正转，设置流动相的流速为2mL/min，开始泵入流动相，等到柱尾端流出流动相时，表明两相已达到平衡，这时通过六通阀将样品注入分离柱；用自动部分收集器2min/管的速度接收洗脱液，将试管中的溶剂旋干后用甲醇溶解，并用液相色谱(流动相为甲醇和0.1％甲酸水)跟踪检测至洗脱液中无目标化合物，停止收集。收集得到的洗脱液通过高效液相色谱进行检测，合并含有黄没食子酸的洗脱液(组分Ⅰ)洗脱液代表性高效液相色谱图为图3所示，合并含有N¹-N⁵-N¹⁰-三-4-对香豆素酰亚精胺的洗脱液(组分Ⅱ)，该洗脱液的代表性液相色谱图如图4所示，减压蒸去溶剂得到富集物。

本步骤提供的高效液相色谱条件为：H&E SP ODS-A C₁₈(250mm×4.6mm，5μm)；柱温30℃；流动相为甲醇(A)-0.1％甲酸水(B)溶液，梯度洗脱模式(0～8min，10％～15％ A；8～18min，15％～19％ A；18～28min，19％～25％ A；28～40min，25％～34％A；40～48min，34％～40％A；48～85min，40％～75％A)，流速：1.0mL/min；检测波长：280nm、254nm；进样量：15μL。

(5)半制备液相色谱分离纯化：

(5-1)黄没食子酸的制备分离：采用半制备型液相色谱仪器对含黄没食子酸的富集物(组分Ⅰ)进行分离，半制备液相的操作条件如下，在将组分Ⅰ浓缩后进行进样，如图5所示，在17min开始接出黄没食子酸所在色谱峰的馏分，在接完整个峰后停止，使用圆底烧瓶减压蒸馏除去溶剂，于烧瓶壁上黏附的则为黄没食子酸。

步骤(5-1)提供的半制备液相色谱条件为：H&E SP ODS-A C18(10mm×250mm，5μm)；柱温30℃；流动相为甲醇(A)-0.1％甲酸水(B)溶液，等度洗脱模式30％A，70％B)，流速：A：0.6mL/min；B：1.4mL/min检测波长：280nm、254nm；进样量：200μL。

(5-2)N¹-N⁵-N¹⁰-三-4-对香豆素酰亚精胺采用半制备型液相色谱对含N¹-N⁵-N¹⁰-三-4-对香豆素酰亚精胺的富集物(组分Ⅱ)进行分离，将组分Ⅱ浓缩后进样，如图6所示，在18min开始接出N¹-N⁵-N¹⁰-三-4-对香豆素酰亚精胺所在色谱峰的馏分收集该峰段流出液体，置于圆底烧瓶中减压蒸馏除去溶剂，得到N¹-N⁵-N¹⁰-三-4-对香豆素酰亚精胺。

半制备液相色谱条件为：H&E SP ODS-A C18(10mm×250mm，5μm)；柱温30℃；流动相为甲醇(A)-0.1％甲酸水(B)溶液，等度洗脱模式51％A，49％B)，流速：A：1.04mL/min；B：1.00mL/min检测波长：280nm、254nm；进样量：200μL。

(6)结构鉴定：

对黄没食子酸和N¹-N⁵-N¹⁰-三-4-对香豆素酰亚精胺进行鉴定，如图7所示，如图9所示，得到黄没食子酸的二级质谱结果和结构结果图，如图8所示，如图9所示得到N¹-N⁵-N¹⁰-三-4-对香豆素酰亚精胺的二级质谱结果和结构结果图。说明利用本发明提供的方法能够准确的提纯得到玫瑰花的美白成分黄没食子酸和N¹-N⁵-N¹⁰-三-4-对香豆素酰亚精胺。

实施例2

与实施例1不同的是，高速逆流色谱的混合溶液体系，所述混合溶液体系包括正己烷、乙酸乙酯、甲醇和0.1％甲酸水。正己烷、乙酸乙酯、甲醇和0.1％甲酸水按照体积比3:7:2:8，利用该混合溶液体系建立的高速逆流色谱方法对乙酸乙酯萃取物样品溶液进行分离，如图10所示。

实施例3

与实施例1不同的是，高速逆流色谱的混合溶液体系，所述混合溶液体系包括正己烷、乙酸乙酯、甲醇和0.1％甲酸水。进样量为50mg，利用该混合溶液体系建立的高速逆流色谱方法对乙酸乙酯萃取物样品溶液进行分离，如图11所示。

Claims (10)

1.一种玫瑰花美白成分的筛选与分离纯化的方法，其特征在于，包括：

通过乙醇溶液对玫瑰花进行回流提取获得提取液，对所述提取液进行过滤、真空回收得到乙醇粗提物；

利用纯水将乙醇粗提物进行分散，将分散乙醇粗提物分别通过石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水层萃取物；

将所述石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水层萃取物进行酪氨酸酶抑制活性试验，确定乙酸乙酯萃取物为酪氨酸酶抑制活性最强的萃取物；

对乙酸乙酯萃取物分别进行高效液相色谱和微馏分活性评价得到乙酸乙酯萃取物中抑制酪氨酸酶活性的目标化合物；

将正己烷、乙酸乙酯、甲醇和甲酸水按照体积比为2～4:6～8:2～4:6～8混合形成混合溶液体系，将所述混合溶液体系加入分液漏斗，振荡、静置形成上相和下相，将上相作为高速逆流色谱的固定相，将下相作为高速逆流色谱的流动相，将乙酸乙酯萃取物与固定相混合得到乙酸乙酯样本溶液，利用高速逆流色谱方法对乙酸乙酯样本进行分离得到黄没食子酸的富集物和N¹-N⁵-N¹⁰-三-4-对香豆素酰亚精胺的富集物；

通过半制备液相色谱方法分别对黄没食子酸的富集物和N¹-N⁵-N¹⁰-三-4-对香豆素酰亚精胺的富集物进行纯化提取得到黄没食子酸和N¹-N⁵-N¹⁰-三-4-对香豆素酰亚精胺。

2.根据权利要求1所述的玫瑰花美白成分的筛选与分离纯化的方法，其特征在于，所述回流提取的参数为：提取次数为2～4次，提取温度为90～110℃，每次提取时间为0.8h～1.2h。

3.根据权利要求1所述的玫瑰花美白成分的筛选与分离纯化的方法，其特征在于，将分散乙醇粗提物通过石油醚萃取2～4次，合并石油醚萃取层得到石油醚萃取物；将分散乙醇粗提物通过乙酸乙酯萃取2～4次，合并乙酸乙酯萃取层得到乙酸乙酯萃取物；将分散乙醇粗提物通过正丁醇萃取2～4次，合并正丁醇萃取层得到正丁醇萃取物。

4.根据权利要求1所述的玫瑰花美白成分的筛选与分离纯化的方法，其特征在于，所述酪氨酸酶抑制活性试验包括单酚活性试验和二酚活性试验。

5.根据权利要求4所述的玫瑰花美白成分的筛选与分离纯化的方法，其特征在于，对所述石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水层萃取物分别进行单酚活性试验，包括：

构建空白组：将磷酸盐缓冲液、二甲基亚砜和L-酪氨酸工作液混合得到空白组；

构建空白样品组：将石油醚萃取物样品溶液、乙酸乙酯萃取物样品溶液、正丁醇萃取物样品溶液和水层萃取物样品溶液分别与第一混合液混合得到石油醚萃取物空白样品组、乙酸乙酯萃取物空白样品组、正丁醇萃取物样品溶液和水层萃取物空白样品组，所述第一混合液包括磷酸盐缓冲液和L-酪氨酸工作液；

构建对照组：将磷酸盐缓冲液、二甲基亚砜、第一酪氨酸酶溶液和L-酪氨酸工作液混合得到对照组；

构建样品组：将石油醚萃取物样品溶液、乙酸乙酯萃取物样品溶液、正丁醇萃取物样品溶液和水层萃取物样品溶液分别与第二混合液混合得到石油醚萃取物样品组、乙酸乙酯萃取物样品组、正丁醇萃取物样品组和水层萃取物样品组，所述第二混合液包括磷酸盐缓冲液、第一酪氨酸酶溶液和L-酪氨酸工作液；

在28～32℃温度下，分别对空白组、空白样品组、对照组和样品组进行光照，并检测各组的吸光值，并基于空白组、空白样品组、对照组和样品组的吸光值得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水层萃取物对酪氨酸酶的抑制率。

6.根据权利要求4所述的玫瑰花美白成分的筛选与分离纯化的方法，其特征在于，对所述石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水层萃取物进行双酚活性试验，包括：

构建空白组：将磷酸盐缓冲液、二甲基亚砜和L-酪氨酸工作液混合得到空白组；

构建空白样品组：将石油醚萃取物样品溶液、乙酸乙酯萃取物样品溶液、正丁醇萃取物样品溶液和水层萃取物样品溶液分别与第一混合液混合得到石油醚萃取物空白样品组、乙酸乙酯萃取物空白样品组、正丁醇萃取物空白样品组和水层萃取物空白样品组，所述第一混合液包括磷酸盐缓冲液和L-酪氨酸工作液；

构建对照组：将磷酸盐缓冲液、二甲基亚砜、第二酪氨酸酶溶液和L-酪氨酸工作液混合得到对照组；

构建样品组：将石油醚萃取物样品溶液、乙酸乙酯萃取物样品溶液、正丁醇萃取物样品溶液和水层萃取物样品溶液分别与第三混合液混合得到石油醚萃取物样品组、乙酸乙酯萃取物样品组、正丁醇萃取物样品组和水层萃取物样品组，所述第三混合液包括磷酸盐缓冲液、第二酪氨酸酶溶液和L-酪氨酸工作液；

在28～32℃温度下，分别对空白组、空白样品组、对照组和样品组进行光照，并检测各组的吸光值，并基于空白组、空白样品组、对照组和样品组的吸光值得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水层萃取物对酪氨酸酶的抑制率。

7.根据权利要求5或6所述的玫瑰花美白成分的筛选与分离纯化的方法，其特征在于，所述L-酪氨酸工作液的制备方法，包括将4～5mg L-酪氨酸加入7～9mL磷酸缓冲液得到L-酪氨酸溶液；将4～6mLL-酪氨酸溶液加入9～11mL磷酸缓冲液配制成L-酪氨酸工作液；

所述左旋多巴工作液的制备方法，包括将15～16mg左旋多巴溶液加入7～9mL磷酸缓冲液得到左旋多巴溶液；将5～7mL左旋多巴溶液加入5～7mL磷酸缓冲液配制成左旋多巴工作液；

将0.9～1.1mg的酪氨酸酶加入9～11mL磷酸缓冲液得到第一酪氨酸酶溶液；

将0.4～0.5mg的酪氨酸酶加入7～9mL磷酸缓冲液得到第二酪氨酸酶溶液；

将所述石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水层萃取物分别溶于二甲基亚砜得到石油醚萃取物样品溶液、乙酸乙酯萃取物样品溶液、正丁醇萃取物样品溶液和水层萃取物样品溶液。

8.根据权利要求1所述的玫瑰花美白成分的筛选与分离纯化的方法，其特征在于，所述对乙酸乙酯萃取物分别进行高效液相色谱和微馏分活性评价得到乙酸乙酯萃取物中抑制酪氨酸酶活性的目标化合物，包括：

将乙酸乙酯萃取物一部分通过高效液相色谱得到液相色谱图，将乙酸乙酯萃取物另一部用于配置单酚活性试验、双酚活性试验的样品组和空白样品组，并通过单酚活性试验和双酚活性试验得到乙酸乙酯萃取物中抑制酪氨酸酶活性的活性谱图，将活性谱图与液相谱图进行比较得到乙酸乙酯萃取物中抑制酪氨酸酶活性的目标化合物。

9.根据权利要求1所述的玫瑰花美白成分的筛选与分离纯化的方法，其特征在于，所述混合溶液体系的上下相对目标化合物的分配系数为0.5-2。

10.根据权利要求1所述的玫瑰花美白成分的筛选与分离纯化的方法，其特征在于，所述利用高速逆流色谱方法对乙酸乙酯样本进行分离得到黄没食子酸的富集物和N¹-N⁵-N¹⁰-三-4-对香豆素酰亚精胺的富集物，包括：

将所述固定相加入高速逆流色谱仪的分离柱，在500-1000r/min转速下转动分离柱，以9～10mL/min的流速向分离柱注入流动相，当分离柱尾流出流动相，将乙酸乙酯样本溶液通过进样阀注入分离柱，收集洗脱液，同时通过液相色谱跟踪检测洗脱液，直到洗脱液中无目标化合物停止收集，将收集到的洗脱液通过高效液相色谱进行检测得到黄没食子酸洗脱液和N¹-N⁵-N¹⁰-三-4-对香豆素酰亚精胺洗脱液，将黄没食子酸洗脱液和N¹-N⁵-N¹⁰-三-4-对香豆素酰亚精胺洗脱液分别进行减压蒸发溶剂得到黄没食子酸的富集物和N¹-N⁵-N¹⁰-三-4-对香豆素酰亚精胺的富集物。

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