CN102725307A - 涉及编码dtp21多肽的基因的耐旱植物、以及相关的构建体和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分离的多核苷酸和多肽，以及用于提供耐旱性的重组DNA构建体、包含这些重组DNA构建体的组合物(例如植物或种子)，以及利用这些重组DNA构建体的方法。所述重组DNA构建体包含可操作地连接至植物中有功能的启动子的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码DTP21多肽。

Description

涉及编码DTP21多肽的基因的耐旱植物、以及相关的构建体和方法

发明领域

本发明领域涉及植物育种和基因学，并且具体地讲，涉及用于赋予植物耐旱性的重组DNA构建体。

发明背景

非生物胁迫是世界范围内作物损失的主要原因，它引起主要作物超过50％的平均产量损失(Boyer，J.S.(1982)Science 218：443-448；Bray，E.A.等人(2000)Biochemistry and Molecular Biology of Plants，由Buchannan，B.B.等人编辑，Amer.Soc.Plant Biol.，第1158-1249页)。在多种非生物胁迫中，干旱是限制世界范围内作物产量的主要因素。在不同发育阶段使植物暴露于水限制环境似乎激活了多个生理和发育变化。理解干旱胁迫感受、转导和耐受性的基本生物化学和分子机制是生物学上的主要挑战。已经公布了对非生物胁迫响应的分子机制和干旱胁迫耐受性的基因调控网络的回顾(Valliyodan，B.和Nguyen，H.T.，(2006)Curr.Opin.Plant Biol.9：189-195；Wang，W.等人(2003)Planta218：1-14)；Vinocur，B.和Altman，A.(2005)Curr.Opin.Biotechnol.16：123-132；Chaves，M.M.和Oliveira，M.M.(2004)J.Exp.Bot.55：2365-2384；Shinozaki，K.等人(2003)Curr.Opin.Plant Biol.6：410-417；Yamaguchi-Shinozaki，K.和Shinozaki，K.(2005)Trends Plant Sci.10：88-94)。

熟知的是对非生物胁迫的响应在不同植物种类和同一植物种类中的不同品种和变种之间有显著差别。某些种类、品种或变种比其他品种对非生物胁迫如干旱更有耐受性。此类植物的基因型是涉及对非生物胁迫独特响应的有吸引力的基因来源。迄今已经广泛地尝试鉴定转基因植物中的基因应激反应以及它们的表达。然而，导入植物的应激反应基因经常不被很好地表达。表达不良的原因可包括选择的启动子和/或其他调控元件不合适以及外显子-内含子结构的破坏。将保留天然启动子、整个编码区和完整的外显子-内含子结构的植物基因组片段导入植物可为良好表达外源应激反应基因的有效方法。例如，报道了稻中涉及光合作用的酶从基因组克隆中的表达比从相应的cDNA克隆中的表达要高得多(Ku等人，Nature Biotechnol.17：76-80，1999)。

近来开发了一种有效筛选能够提供植物农学上有利的表型变型的基因组DNA片段的方法(美国专利公布US2008/0301832A1)。在这个方法中，用来自构建自高等植物的基因组文库的基因组片段转化植物，并且筛选所得转基因植物以获得农学上有利的表型变型。可筛选所得植物对非生物胁迫的独特响应如耐旱性，并且最后可鉴定可携带易于在植物中表达的应激反应基因的基因组片段。为了鉴定独特的应激反应基因并在转基因植物中利用这一基因，需要进行大量的实验。需考虑的多个因素包括如下因素：从其中构建基因组文库的植物的选择；如何筛选转基因植物；如何检查基因组片段；以及如何精确地找到、表征并利用应激反应基因。

发明概述

本发明包括：

在一个实施方案中，在基因组中包含重组DNA构建体的植物，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列选自：(a)编码具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中基于Clustal V比对方法，使用逐对比对默认参数KTUPLE＝1，GAP PENALTY＝3，WINDOW＝5以及DIAGONALS SAVED＝5，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQ IDNO：27、32、46、56、60、64、81、83、85或87进行比较时具有至少60％、80％、85％、90％、95％或100％的序列同一性；(b)编码具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列能够在严格条件下与包含SEQ ID NO：26、31、44、55、59、63、80、82、84或86的全长互补序列的DNA分子杂交；(c)编码具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列通过选自删除、取代、添加和插入的至少一种方法改变一个或多个核苷酸而衍生自SEQ ID NO：26、31、44、55、59、63、80、82、84或86；(d)编码多肽的核苷酸序列，其中所述多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO：27、32、46、56、60、64、81、83、85或87；和(e)包含SEQ ID NO：26、31、44、55、59、63、80、82、84或86的核苷酸序列；并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增强的耐旱性。所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。

在另一个实施方案中，在基因组中包含重组DNA构建体的植物，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列选自：(a)编码具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中基于Clustal V比对方法，使用逐对比对默认参数KTUPLE＝1，GAP PENALTY＝3，WINDOW＝5以及DIAGONALS SAVED＝5，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQ IDNO：27、32、46、56、60、64、81、83、85或87进行比较时具有至少60％、80％、85％、90％、95％或100％的序列同一性；(b)编码具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列能够在严格条件下与包含SEQ ID NO：26、31、44、55、59、63、80、82、84或86的全长互补序列的DNA分子杂交；(c)编码具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列通过选自删除、取代、添加和插入的至少一种方法改变一个或多个核苷酸而衍生自SEQ ID NO：26、31、44、55、59、63、80、82、84或86；(d)编码多肽的核苷酸序列，其中所述多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO：27、32、46、56、60、64、81、83、85或87；和(e)包含SEQ ID NO：26、31、44、55、59、63、80、82、84或86的核苷酸序列；并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增加的产量。在水限制条件下，所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的所述对照植物进行比较时可表现出所述产量的提高。所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。

在另一个实施方案中，增强植物耐旱性的方法，包括：(a)将重组DNA构建体导入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列选自：(i)编码具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中基于Clustal V比对方法，使用逐对比对默认参数KTUPLE＝1，GAP PENALTY＝3，WINDOW＝5以及DIAGONALS SAVED＝5，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：27、32、46、56、60、64、81、83、85或87进行比较时具有至少60％、80％、85％、90％、95％或100％的序列同一性；(ii)编码具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列能够在严格条件下与包含SEQ ID NO：26、31、44、55、59、63、80、82、84或86的全长互补序列的DNA分子杂交；(iii)编码具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列通过选自删除、取代、添加和插入的至少一种方法改变一个或多个核苷酸而衍生自SEQ IDNO：26、31、44、55、59、63、80、82、84或86；(iv)编码多肽的核苷酸序列，其中所述多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO：27、32、46、56、60、64、81、83、85或87；和(v)包含SEQ ID NO：26、31、44、55、59、63、80、82、84或86的核苷酸序列；以及(b)在步骤(a)之后，由所述可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体并且在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增强的耐旱性。所述方法还可包括：(c)获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体并且在与不包含该重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增强的耐旱性。

在另一个实施方案中，评价植物耐旱性的方法，包括：(a)获得转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列选自：(i)编码具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中基于Clustal V比对方法，使用逐对比对默认参数KTUPLE＝1，GAP PENALTY＝3，WINDOW＝5以及DIAGONALS SAVED＝5，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQ IDNO：27、32、46、56、60、64、81、83、85或87进行比较时具有至少60％、80％、85％、90％、95％或100％的序列同一性；(ii)编码具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列能够在严格条件下与包含SEQ ID NO：26、31、44、55、59、63、80、82、84或86的全长互补序列的DNA分子杂交；(iii)编码具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列通过选自删除、取代、添加和插入的至少一种方法改变一个或多个核苷酸而衍生自SEQ ID NO：26、31、44、55、59、63、80、82、84或86；(iv)编码多肽的核苷酸序列，其中所述多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO：27、32、46、56、60、64、81、83、85或87；和(v)包含SEQ ID NO：26、31、44、55、59、63、80、82、84或86的核苷酸序列；以及(b)获得来源于(a)的转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及(c)评价所述子代植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物相比的耐旱性。

在另一个实施方案中，测定植物农学特性改变的方法，包括：(a)获得转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列选自：(i)编码具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中基于Clustal V比对方法，使用逐对比对默认参数KTUPLE＝1，GAP PENALTY＝3，WINDOW＝5以及DIAGONALS SAVED＝5，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQ IDNO：27、32、46、56、60、64、81、83、85或87进行比较时具有至少60％、80％、85％、90％、95％或100％的序列同一性；(ii)编码具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列能够在严格条件下与包含SEQID NO：26、31、44、55、59、63、80、82、84或86的全长互补序列的DNA分子杂交；(iii)编码具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列通过选自删除、取代、添加和插入的至少一种方法改变一个或多个核苷酸而衍生自SEQ ID NO：26、31、44、55、59、63、80、82、84或86；(iv)编码多肽的核苷酸序列，其中所述多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO：27、32、46、56、60、64、81、83、85或87；和(v)包含SEQ ID NO：26、31、44、55、59、63、80、82、84或86的核苷酸序列；以及(b)获得来源于所述步骤(a)的转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及(c)测定所述子代植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。所述测定步骤(c)可包括在水限制条件下，测定所述转基因植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。所述至少一种农学性状可以是产量，并且进一步地，可以是产量的提高。

在另一个实施方案中，分离的多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列选自：(a)编码具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中基于Clustal V比对方法，使用逐对比对默认参数KTUPLE＝1，GAPPENALTY＝3，WINDOW＝5以及DIAGONALS SAVED＝5，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：27、32、46、56、60、64、81、83、85或87进行比较时具有至少60％、80％、85％、90％或95％的序列同一性；(b)编码具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列能够在严格条件下与包含SEQ ID NO：26、31、44、55、59、63、80、82、84或86的全长互补序列的DNA分子杂交；(c)编码具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列通过选自删除、取代、添加和插入的至少一种方法改变一个或多个核苷酸而衍生自SEQ ID NO：26、31、44、55、59、63、80、82、84或86；(d)编码多肽的核苷酸序列，其中所述多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO：27、32、46、56、60、64、81、83、85或87；和(e)包含SEQ ID NO：26、31、44、55、59、63、80、82、84或86的核苷酸序列。

在另一个实施方案中，分离的多核苷酸包含本发明的核苷酸序列的全长互补序列，其中本发明的全长互补序列和核苷酸序列由相同数目的核苷酸组成并且是100％互补的。

在另一个实施方案中，重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的本发明的分离的多核苷酸。

在另一个实施方案中，包含本发明的重组DNA构建体的细胞选自细菌细胞、酵母细胞、以及昆虫细胞和植物细胞。

在另一个实施方案中，植物或种子包含本发明的重组DNA构建体。所述植物或种子可为单子叶或双子叶的植物或种子。

在另一个实施方案中，分离由本发明的重组DNA构建体编码的多肽的方法，其中所述方法包括以下步骤：(a)用本发明的重组DNA构建体转化细胞；(b)在适于所述重组DNA构建体表达的条件下使所述步骤(a)的转化的细胞生长；以及(c)从所述步骤(b)的转化细胞中分离所述多肽。

在另一个实施方案中，分离的多肽选自(a)具有耐旱活性的多肽，其中基于Clustal V比对方法，使用逐对比对默认参数KTUPLE＝1，GAPPENALTY＝3，WINDOW＝5以及DIAGONALS SAVED＝5，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：27、32、46、56、60、64、81、83、85或87进行比较时具有至少60％、80％、85％、90％或95％的序列同一性；(b)具有耐旱活性的多肽，其中所述氨基酸序列通过选自删除、取代、添加和插入的至少一种方法改变一个或多个氨基酸而衍生自SEQ IDNO：27、32、46、56、60、64、81、83、85或87；和(c)多肽，其中所述多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO：27、32、46、56、60、64、81、83、85或87。

在另一个实施方案中，载体包含本发明的多核苷酸。

在另一个实施方案中，产生转基因植物的方法，包括用重组DNA构建体转化植物细胞，并且由所述转化的植物细胞再生转基因植物。

在另一个实施方案中，本发明包括本发明的任何植物，其中所述植物选自玉米、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉花、稻、大麦、粟、甘蔗、柳枝稷、烟草、马铃薯和甜菜。

在另一个实施方案中，本发明包括本发明的任何方法，其中所述植物选自玉米、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉花、稻、大麦、粟、甘蔗、柳枝稷、烟草、马铃薯和甜菜。

在另一个实施方案中，本发明包括本发明的任何植物的种子，其中所述种子在其基因组中包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，基于Clustal V比对方法，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQ IDNO：27、32、46、56、60、64、81、83、85或87进行比较时具有至少60％的序列同一性，并且其中由所述种子产生的植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出或者耐旱性的增强、或者产量的提高、或者两者皆有。

附图简述和序列表

根据以下的详细描述和附图以及序列表，可更全面地理解本发明，以下的详细描述和附图以及序列表形成本申请的一部分。

图1示出用于基因型稻的PCR引物对的位点和序列，所述稻用基因组片段IS125转化。

图2示出基因组片段IS125的不同区域，将其亚克隆到稻中以确定导致耐旱表型的区域。

图3示出耐旱基因的结构，该基因编码209个氨基酸的SS-DTP21-1多肽。

图4A-4E示出如SEQ ID NO：27、32、41、42、45、46、52、54、56、58、60、62、64、66、79、81、83、85和87所示的DTP21多肽的氨基酸序列的比对结果。框中包括在给定位点上与SEQ ID NO：27的残基不同的残基。示出了共有序列，其中如果所有序列中的残基相同，显示该残基，否则用圆点表示。

图5给出图4A-4E中给出的每对序列的序列同一性百分比和趋异值。

图6A-6B示出用PHP29675转化的单个Gaspe Flint来源的玉米品系的评价。

图7A-7B示出用PHP29675转化的Gaspe Flint来源的玉米品系的综合评价。

SEQ ID NO：1是重组DNA片段的核苷酸序列，所述片段包含基因组片段IS125的核苷酸位点10-40049。

SEQ ID NO：2是图1的M1引物对的正向引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：3是图1的M1引物对的反向引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：4是图1的M2引物对的正向引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：5是图1的M2引物对的反向引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：6是图1的M3引物对的正向引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：7是图1的M3引物对的反向引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：8是图1的M4引物对的正向引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：9是图1的M4引物对的反向引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：10是图1的M5引物对的正向引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：11是图1的M5引物对的反向引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：12是图1的M6引物对的正向引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：13是图1的M6引物对的反向引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：14是图1的M-hpt引物对的正向引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：15是图1的M-hpt引物对的反向引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：16是用于生成Sub8片段的正向引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：17是用于生成Sub8片段的反向引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：18是用于生成Sub7片段的正向引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：19是用于生成Sub7片段的反向引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：20是由Sub7片段编码的RT-PCR的转录物的正向引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：21是由Sub7片段编码的RT-PCR的转录物的反向引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：22是用于编码SS-DTP21-1的转录物5′-RACE的初始引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：23是用于编码SS-DTP21-1的转录物5′-RACE的巢式引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：24是用于编码SS-DTP21-1的转录物3′-RACE的初始引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：25是用于编码SS-DTP21-1的转录物3′-RACE的巢式引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：26是位于编码SS-DTP21-1多肽的基因组片段IS125内的核苷酸序列。

SEQ ID NO：27是由SEQ ID NO：26编码的SS-DTP21-1多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：28是由Sub5片段编码的RT-PCR转录物的正向引物的核苷酸序列(表17)。

SEQ ID NO：29是由Sub5片段编码的RT-PCR转录物的反向引物的核苷酸序列(表17)。

SEQ ID NO：30是重组DNA片段的核苷酸序列，所述片段包含基因组片段IS127的核苷酸位点3075-37662。

SEQ ID NO：31是基因组片段IS127的区域核苷酸序列，所述片段编码SS-DTP21-2多肽，它是与SS-DTP21-1序列同源的多肽。

SEQ ID NO：32是由SEQ ID NO：31编码的SS-DTP21-2多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：33是用于扩增编码SS-DTP21-2区域的正向引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：34是用于扩增编码SS-DTP21-2区域的反向引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：35是用于制备线性载体的正向引物的核苷酸序列，所述载体用于克隆来自高梁的、编码与SS-DTP21-1同源的多肽的区域。

SEQ ID NO：36是用于制备线性载体的反向引物的核苷酸序列，所述载体用于克隆来自高梁的、编码与SS-DTP21-1同源的多肽的区域。

SEQ ID NO：37是正向引物的核苷酸序列，所述引物用于扩增来自高梁(Gold sorgho)的、编码与SS-DTP21-1同源的多肽的区域。

SEQ ID NO：38是反向引物的核苷酸序列，所述引物用于扩增来自高梁的、编码与SS-DTP21-1同源的多肽的区域。

SEQ ID NO：39是来自高梁(Gold sorgho)的核苷酸序列，其编码与来自苏丹草的SS-DTP21-1同源的多肽SB-DTP21-1。

SEQ ID NO：40是来自高梁(Gold sorgho)的核苷酸序列，其编码与来自苏丹草的SS-DTP21-1同源的多肽SB-DTP21-2。

SEQ ID NO：41是来自高梁(Gold sorgho)的、由SEQ ID NO：39编码的SB-DTP21-1多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：42是来自高梁(Gold sorgho)的、由SEQ ID NO：40编码的SB-DTP21-2多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：43是来自高梁(B35)的核苷酸序列，其编码与来自苏丹草的SS-DTP21-1同源的多肽SB-DTP21-3。

SEQ ID NO：44是来自高梁(B35)的核苷酸序列，其编码与来自苏丹草的SS-DTP21-1同源的多肽SB-DTP21-4。

SEQ ID NO：45是来自高梁(B35)的、由SEQ ID NO：43编码的SB-DTP21-3多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：46是来自高梁(B35)的、由SEQ ID NO：44编码的SB-DTP21-4多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：47是来自高梁克隆SB_BBc0073F19的NCBI GI No.124359063的位点24904至25530的核苷酸序列。

SEQ ID NO：48是来自高梁克隆SB_BBc0109L12的NCBI GI No.124359064的位点44114至44740的核苷酸序列。

SEQ ID NO：49是由SEQ ID NO：47编码并与SS-DTP21-1多肽同源的多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：50是由SEQ ID NO：48编码并与SS-DTP21-1多肽同源的多肽的氨基酸序列；然而，这个翻译包括两个框内终止密码子。

SEQ ID NO：51是来自苏丹草的核苷酸序列，其编码与SS-DTP21-1同源的多肽SS-DTP21-3。

SEQ ID NO：52是由SEQ ID NO：51编码的多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：53是来自苏丹草的核苷酸序列，其编码与SS-DTP21-1同源的多肽SS-DTP21-4。

SEQ ID NO：54是由SEQ ID NO：53编码的多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：55是来自苏丹草的核苷酸序列，其编码与SS-DTP21-1同源的多肽SS-DTP21-5。

SEQ ID NO：56是由SEQ ID NO：55编码的多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：57是来自苏丹草的核苷酸序列，其编码与SS-DTP21-1同源的多肽SS-DTP21-7。

SEQ ID NO：58是由SEQ ID NO：57编码的多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：59是来自约翰逊草的核苷酸序列，其编码与SS-DTP21-1同源的多肽SH-DTP21-1。

SEQ ID NO：60是由SEQ ID NO：59编码的多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：61是来自约翰逊草的核苷酸序列，其编码与SS-DTP21-1同源的多肽SH-DTP21-2。

SEQ ID NO：62是由SEQ ID NO：61编码的多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：63是来自甘蔗的核苷酸序列，其编码与SS-DTP21-1同源的多肽SO-DTP21-1。

SEQ ID NO：64是由SEQ ID NO：63编码的多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：65是来自甘蔗的核苷酸序列，其编码与SS-DTP21-1同源的多肽SO-DTP21-2。

SEQ ID NO：66是由SEQ ID NO：65编码的多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：67是SS-DTP21-1-5′attB正向引物的核苷酸序列，它包含attB1序列，用于扩增SS-DTP21-1蛋白编码区。

SEQ ID NO：68是SS-DTP21-1-3′attB反向引物的核苷酸序列，它包含attB2序列，用于扩增SS-DTP21-1蛋白编码区。

SEQ ID NO：69是attB1位点的核苷酸序列。

SEQ ID NO：70是attB2位点的核苷酸序列。

SEQ ID NO：71是pBC-yellow的核苷酸序列，pBC-yellow是用于拟南芥属的目的载体。

SEQ ID NO：72是SS-DTP21-2-5′attB正向引物的核苷酸序列，它包含attB1序列，用于扩增SS-DTP21-2蛋白编码区。

SEQ ID NO：73是SS-STP21-2-3′attB反向引物的核苷酸序列，它包含attB2序列，用于扩增SS-DTP21-2蛋白编码区。

SEQ ID NO：74是GENERACER^TM 5′引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：75是GENERACER^TM 5′巢式引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：76是GENERACER^TM 3′引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：77是GENERACER^TM 3′巢式引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：78是来自苏丹草的核苷酸序列，其编码与SS-DTP21-1同源的多肽SS-DTP21-6。

SEQ ID NO：79是由SEQ ID NO：78编码的多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：80是来自高梁(Gold sorgho)的核苷酸序列，其编码与SS-DTP21-1同源的多肽SB-DTP21-5。

SEQ ID NO：81是由SEQ ID NO：80编码的多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：82是来自高梁(B35)的核苷酸序列，其编码与SS-DTP21-1同源的多肽SB-DTP21-6。

SEQ ID NO：83是由SEQ ID NO：82编码的多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：84是来自高梁(hoki)的核苷酸序列，其编码与SS-DTP21-1同源的多肽SB-DTP21-9。

SEQ ID NO：85是由SEQ ID NO：84编码的多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：86是来自高梁(hoki)的核苷酸序列，其编码与SS-DTP21-1同源的多肽SB-DTP21-10。

SEQ ID NO：87是由SEQ ID NO：86编码的多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：88是用于扩增实施例20中的Sub8质粒DNA区域的第一引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：89是用于扩增实施例20中的Sub8质粒DNA区域的第二引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：90是用于扩增实施例20中的pSB31(Ishida等人，1996，Nature Biotechnology 14：745-750)质粒DNA区域的第一引物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：91是用于扩增实施例20中的pSB31质粒DNA区域的第二引物的核苷酸序列。

序列描述以及所附序列表遵循如37C.F.R.§1.8211.825所列出的关于专利申请中核苷酸和/或氨基酸序列公开的规定。

此序列表中以单个字母表示核苷酸，以三字母表示氨基酸，如Nucleic Acids Res.13：30213030(1985)和Biochemical J.219(No.2)：345373(1984)所描述的IUPACIUBMB标准中所规定，它们引入本文以供参考。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C.F.R.§1.822中所列出的规定。

发明详述

本文中所列出的每篇参考文献的公开内容的全文以引用的方式并入本文。

本文以及所附权利要求书中所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代，除非上下文中清楚地另有指明。因此，例如，“一株植物”的涵义包括多株此类植物，“一个细胞”的涵义包括一个或多个细胞及本领域的技术人员已知的等同物等等。

如本文所用：

“基因组片段IS125”指来自苏丹草的基因组DNA片段Sugar Slim(苏丹草)当转化时将耐旱表型递送给Yukihikari品种稻。“SS-DTP21-1多肽”指由基因组片段IS125编码的209个氨基酸的多肽，它是耐旱候选蛋白。

“基因组片段127”指来自苏丹草的基因组DNA片段Sugar Slim(苏丹草)当转化时将耐旱表型递送给Yukihikari品种稻。“SS-DTP21-2多肽”指由基因组片段IS127编码的209个氨基酸的多肽，它是一种与SS-DTP21-1高度同源的耐旱候选蛋白。

“SB-DTP21-1多肽”和“SB-DTP21-2多肽”指两个由来自高梁(Goldsorgho)的基因组DNA编码的多肽，它们每个与SS-DTP21-1多肽高度同源。

“SB-DTP21-3多肽”和“SB-DTP21-4多肽”指两个由来自高梁(B35)的基因组DNA编码的多肽，它们每个与SS-DTP21-1多肽高度同源。

“DTP21多肽”指具有与SS-DTP21-1同源的序列并且当转化时能够在Yukihikari品种稻和/或其他植物种类或品种中递送耐旱表型的蛋白。术语“DTP21多肽”和“DTP21蛋白”本文互换使用。

多肽的“耐旱活性”指在转基因植物中过表达所述多肽赋予转基因植物相对于参照植物或对照植物增强的耐旱性。

术语“单子叶植物”和“单子叶的植物”本文互换使用。本发明的单子叶植物包括禾本科植物。

术语“双子叶植物”和“双子叶的植物”本文互换使用。本发明的双子叶植物包括以下家族：十字花科植物、豆科植物和茄科植物。

术语“全长互补序列”和“全长的互补序列”本文互换使用，指给定核苷酸序列的互补序列，其中所述互补序列和核苷酸序列由相同数目的核苷酸组成并且是100％互补的。

除非另外指明，“拟南芥属”和“拟南芥”本文互换使用。

“表达序列标签”(“EST”)是得自cDNA文库的DNA序列，并且因此是已经被转录的序列。EST通常通过cDNA插入序列单程测序获取。将完整的cDNA插入序列称为“全长插入序列”(“FIS”)。“重叠群”序列是由选自，但不限于EST、FIS和PCR序列的两个或更多个序列装配成的序列。将编码完整或功能性蛋白的序列称为“完全基因序列”(“CGS”)，该序列能得自FIS或重叠群。

“农学特性”是可测量的参数，包括但不限于：低温胁迫下的绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总植物含氮量、果实含氮量、种子含氮量、营养组织含氮量、总植物游离氨基酸含量、营养组织游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、总植物蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织蛋白质含量、耐旱性、氮摄取、根倒伏、收获指数、茎倒伏、植株高度、穗高、穗长耐盐性、早期幼苗活力和出苗

“转基因”指其基因组因异源核酸(如重组DNA构建体)的存在而发生改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括那些最初的转基因事件以及从最初的转基因事件通过有性杂交或无性生殖而产生的那些。如本文所用的术语“转基因”不涵盖通过常规植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组(染色体基因组或染色体外基因组)改变。

“基因组”在用于植物细胞时不仅涵盖存在于细胞核中的染色体DNA，而且还包括存在于细胞的亚细胞组分(如线粒体、质粒)中的细胞器DNA。

“植物”包括整个植株、植物器官、植物组织、种子和植物细胞以及同一植株的子代。植物细胞包括但不限于得自下列物质的细胞：种子、悬浮培养物、胚、分生区域、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子。

“子代”包括植物的任何后续世代。

“转基因植物”包括在其基因组内包含异源多核苷酸的植物。例如异源多核苷酸被稳定地整合进基因组中，使得该多核苷酸传递至连续的世代。异源多核苷酸可单独地或作为重组DNA构建体的部分整合进基因组中。

针对序列而言的“异源”意指来自外来物种的序列，或者如果来自相同物种，则指通过蓄意的人为干预而从其天然形式发生了组成和/或基因座的显著改变的序列。

“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互换使用并且是任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基的单链或双链RNA或DNA聚合物。核苷酸(通常以它们的5′单磷酸形式存在)通过它们的单字母命名指代如下：“A”指腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别用于RNA或DNA)，“C”指胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”指鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”指尿苷酸，“T”指脱氧胸苷酸，“R”指嘌呤(A或G)，“Y”指嘧啶(C或T)，“K”指G或T，“H”指A或C或T，“I”指肌苷，“N”指任何核苷酸。

“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”还可包括修饰，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ羧化、羟化和ADP-核糖基化。

“信使RNA(mRNA)”指无内含子并且可通过细胞翻译成蛋白质的RNA。

“cDNA”指与mRNA模板互补并且利用逆转录酶从mRNA模板合成的DNA。cDNA可为单链的或者可用DNA聚合酶I的Klenow片段转化成双链形式。

“成熟”蛋白指经翻译后加工的多肽，即已经去除了存在于初始翻译产物中的任何前肽或肽原的多肽。

“前体”蛋白质指mRNA的初级翻译产物，即前肽和肽原仍然存在。前肽和原肽可为并且不限于细胞内定位信号。

“分离的”指物质，例如核酸和/或蛋白质，该物质基本上不含在天然存在的环境中通常伴随该物质或与其反应的组分，或者说是该物质被从所述组分移出。分离的多核苷酸可从它们天然存在于其中的宿主细胞纯化。技术人员已知的常规核酸纯化方法可用于获得分离的多核苷酸。该术语也涵盖重组多核苷酸和化学合成的多核苷酸。

“重组”指两个分离的不同序列片段的人工组合，例如通过基因工程技术化学合成或通过操纵分离的核酸片段合成。“重组体”也包括细胞或载体，它们已经通过导入异源核酸进行了修改，或者来源于进行如此修改的细胞，但是不涵盖由自然发生事件(例如自发突变、自然转化/转导/转座)改变的细胞或载体，例如那些无蓄意的人为干预产生的细胞或载体。

“重组DNA构建体”指在自然界中通常不会一起存在的核酸片段的组合。因此，重组DNA构建体可包含源于不同来源的调控序列和编码序列，或源于相同来源但以不同于通常天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。

术语“入门克隆”和“入门载体”本文可互换使用。

“调控序列”指位于编码序列的上游(5′非编码序列)、中间或下游(3′非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。术语“调控序列”和“调控元件”在本文中可互换使用。

“启动子”指能够控制另一核酸片段转录的核酸片段。

“植物启动子功能”是能够控制植物细胞中的转录的启动子，无论其是否来源于植物细胞。

“组织特异性启动子”和“组织优选启动子”可互换使用，并且指主要但非必须专一地在一种组织或器官中表达，而是也可在一种特定细胞中表达的启动子。

“发育调控启动子”指其活性由发育事件决定的启动子。

术语“可操作地连接”指核酸片段连接成单一片段，使得其中一个核酸片段的功能受到另一个核酸片段的调控。例如，在启动子能够调节核酸片段的转录时，该启动子与该核酸片段进行了可操作地连接。

“表达”指功能产物的产生。因此，核酸片段的表达可指核酸片段的转录(如生成mRNA或功能RNA的转录)和/或RNA翻译成前体或成熟蛋白质。

“表型”意指细胞或生物体的可检测的特征。

有关将核酸片段(例如重组DNA构建体)插入细胞内的“导入”意指“转染”或“转化”或“转导”，并且包括指将核酸片段整合进真核或原核细胞中，在该细胞中核酸片段可整合进细胞的基因组(如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)内，转变成自主的复制子或瞬时表达(如转染的mRNA)。

“转化细胞”是将核酸片段(如重组DNA构建体)导入其中的任何细胞。

在此所用的“转化”指稳定转化和瞬时转化两者。

“稳定转化”指将核酸片段导入宿主生物体的基因组中，导致基因稳定遗传。一旦稳定转化，核酸片段稳定地整合进宿主生物体和任何连续世代的基因组中。

“瞬时转化”指将核酸片段导入宿主生物体的核中或包含DNA的细胞器中，引起基因表达而没有基因稳定遗传。

“等位基因”是占据染色体上给定位点的基因的几种供选择替代形式的其中一种。当二倍体植物中一对同源染色体上给定基因座上存在的等位基因相同时，该植物在该基因座处是纯合的。如果二倍体植物中一对同源染色体上给定基因座上存在的等位基因不同，则该植物在该基因座处是杂合的。如果转基因存在于二倍体植物中一对同源染色体中的其中之一上，则该植物在该基因座处是半合子的。

“叶绿体转运肽”是与蛋白质共同被翻译，并将该蛋白质导向叶绿体或导向该蛋白质在其中被生成的细胞中的其他质体类型的氨基酸序列。“叶绿体转运序列”是指编码叶绿体转运肽的核苷酸序列。“信号肽”是一种与蛋白质共同被翻译并将蛋白导向分泌系统的氨基酸序列(Chrispeels(1991)Ann.Rev.Plant Phys.Plant Mol.Biol.42：2153)。如果将所述蛋白导向液泡，可另外加上液泡靶向信号(同上)，或者如果将所述蛋白导向内质网，可加上内质网驻留信号(同上)。如果将蛋白导向细胞核，将移除任何存在的信号肽并用以核定位信号替代(Raikhel(1992)Plant Phys.100：16271632)。“线粒体信号肽”是指导前体蛋白质导进入线粒体中的氨基酸序列(Zhang和Glaser(2002)Trends Plant Sci 7：14-21)。

两个氨基酸序列或核酸序列间的百分比同一性可通过目测和数学计算来测定。

作为另外一种选择，序列比对和同一性百分比可用设计用于检测同源序列的多种比较方法来测定，这些方法包括但不限于LASERGENE

生物信息计算包(DNASTAR

Inc.(Madison，WI))的MEGALIGN

程序。除非另外说明，本文提供的序列的多重比对用Clustal V比对方法(Higgins和Sharp(1989)CABIOS.5：151 153)进行序列的多重比对，默认参数(GAP PENALTY＝10，GAP LENGTH PENALTY＝10)。用ClustalV方法进行逐对比对和蛋白质序列的百分比同一性计算的默认参数为KTUPLE＝1、GAP PENALTY＝3、WINDOW＝5以及DIAGONALSSAVED＝5。对于核酸，这些参数为KTUPLE＝2，GAP PENALTY＝5，WINDOW＝4以及DIAGONALS SAVED＝4。在序列比对后，使用ClustalV程序，通过参阅相同程序上的“序列距离”表可能获得“百分比同一性”和“趋异度”值；除非另外说明，本文提供的和申明的同一性百分比和趋异度是以该方式计算。

作为另外一种选择，两个蛋白序列的百分比同一性可通过比较序列信息来测定，该比较基于Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(J.Mol.Biol.，48：443-453，1970)的算法并使用购自University of Wisconsin GeneticsComputer Group(UWGCG)的GAP计算机程序。GAP程序的优选默认参数包括：(1)计分矩阵，blosum62，如Henikoff，S.和Henikoff，J.G.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：10915-10919，1992)所述；(2)空位权重为12；(3)空位长度权重为4；以及(4)末端空位无罚分。

也可使用本领域的技术人员所用的其他序列比较程序。可通过比较序列信息测定百分比同一性，所述比较使用例如如Altschul等人(Nucl.Acids.Res.，25，第3389-3402页，1997)所述的BLAST程序。这个程序在因特网上的National Center for Biotechnology Information(NCBI)或DNA Data Bank of Japan(DDBJ)网站上获得。使用BLAST程序进行同一性搜索的多个条件(参数)的详细情况在这些网站上示出，并且常使用默认值搜索，然而可酌情改变部分设置。作为另外一种选择，两个氨基酸序列的百分比同一性可使用程序如遗传学信息处理软件GENETYX Ver.7(Genetyx Corporation，Japan)或使用算法如FASTA进行测定。在这种情况下，可使用默认值进行搜索。

两个核酸序列之间的百分比同一性可通过目测和数学计算进行测定，或者更优选地，通过使用计算机程序比较序列信息完成比较。一个示例性的优选程序是Genetic Computer Group(GCG；Madison，WI)WISCONSIN PACKAGE

程序，版本10.0，“GAP”(Devereux等人，1984，Nucl.Acids Res.，12：387)。除了比较两个核酸序列之外，这个“GAP”程序可用于比较两个氨基酸序列以及比较一个核酸序列和一个氨基酸序列。“GAP”的优选默认参数包括：(1)GCG

应用一元比较矩阵(包含用于同一性的值1和用于非同一性的值0)用于核苷酸，并且应用加权氨基酸比较矩阵(Gribskov和Burgess，Nucl.Acids Res.，14：6745，1986，如Schwartz和Dayhoff(编辑)所述，“Atlas of PolypeptideSequence and Structure，”National Biomedical Research Foundation，第353-358页，1979)，或其他可比较的比较矩阵；(2)氨基酸序列的每个空位的罚分为30，并且在每个空位中的每个符号附加罚分为1，或者核苷酸序列的每个空位的罚分为50，并且在每个空位中的每个符号附加罚分为3；(3)末端空位无罚分；以及(4)长空位无最大罚分。也可使用本领域的技术人员使用的其他序列比较程序例如获取自National Library ofMedicine网站的BLASTN程序2.2.7版，或者WU-BLAST 2.0算法(Advanced Biocomputing，LLC)。此外，BLAST算法使用BLOSUM62氨基酸计分矩阵，并且可使用的任选参数如下：(A)包含过滤器以遮蔽具有组成低复杂性的查询序列片段(通过Wootton和Federhen的SEG程序(Computers and Chemistry，1993)测定；也参见Wootton和Federhen，1996，“Analysis of compositionally biased regions in sequence databases，”Methods Enzymol.，266：554-71)或由短周期内部重复序列(通过Claverie和States的XNU程序(Computers and Chemistry，1993)进行测定)，以及(B)用于报告与数据库序列匹配的统计学显著性阈值，或E-score(根据Karlin和Altschul的随机模型，仅偶然发现匹配的预期概率，1990；如果某一匹配的统计学显著性大于这一E-score阈值，将不报告该匹配)；优选的E-score阈值是0.5，或者按照优先度递增的顺序：0.25、0.1、0.05、0.01、0.001、0.0001、1e-5、1e-10、1e-15、1e-20、1e-25、1e-30、1e-40、1e-50、1e-75或1e-100。

本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的并且在如下文献中有更全面的描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold Spring HarborLaboratory Press：Cold Spring Harbor，1989(下文称为“Sambrook”)。

现在来看实施方案：

实施方案包括分离的多核苷酸和多肽、用于提供耐旱性的重组DNA构建体、包含这些重组DNA构建体的组合物(例如植物或种子)，以及利用这些重组DNA构建体的方法。

分离的多核苷酸和多肽：

本发明包括下列分离的多核苷酸和多肽：

分离的多核苷酸包含：(i)编码多肽的核酸序列，基于Clustal V比对方法，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：27、32、46、56、60、64、81、83、85或87进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；或(ii)(i)的核酸序列的全长互补序列，其中(i)的核酸序列的全长互补序列由相同数目的核苷酸组成并且是100％互补的。任一上述分离的多核苷酸可用于本发明的任何重组DNA构建体。所述多肽优选地为DTP21多肽。

分离的多肽，基于Clustal V比对方法，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：27、32、46、56、60、64、81、83、85或87进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。所述多肽优选地为DTP21多肽。

分离的多肽，其中所述氨基酸序列通过选自删除、取代、添加和插入的至少一种方法改变一个或多个氨基酸而衍生自SEQ ID NO：27、32、46、56、60、64、81、83、85或87；和(c)多肽，其中所述多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO：27、32、46、56、60、64、81、83、85或87。所述多肽优选地为DTP21多肽。

分离的多核苷酸，所述多核苷酸包括：(i)核酸序列，基于Clustal V比对方法，所述核酸序列在与SEQ ID NO：26、31、44、55、59、63、80、82、84或86进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；或(ii)(i)的核酸序列的全长互补序列。任一上述分离的多核苷酸可用于本发明的任何重组DNA构建体。分离的多核苷酸优选地编码DTP21多肽。

分离的多核苷酸包含编码具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列能够在严格条件下与包含SEQ ID NO：26、31、44、55、59、63、80、82、84或86的全长互补序列的DNA分子杂交；

分离的多核苷酸包含编码具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列通过选自删除、取代、添加和插入的至少一种方法改变一个或多个核苷酸而衍生自SEQ ID NO：26、31、44、55、59、63、80、82、84或86。

重组DNA构建体：

在一个方面，本发明包括重组DNA构建体。

在一个实施方案中，重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(如在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括(i)核酸序列，基于Clustal V比对方法，所述核酸序列编码的氨基酸序列在与SEQ ID NO：27、32、46、56、60、64、81、83、85或87进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；或(ii)(i)核酸序列的全长互补序列。

在另一个实施方案中，重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一种调控序列(如在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括：(i)核酸序列，基于Clustal V比对方法，所述核酸序列在与SEQ ID NO：26、31、44、55、59、63、80、82、84或86进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；或(ii)(i)的核酸序列的全长互补序列。

在另一个实施方案中，重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(如在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码DTP21多肽。DTP21多肽可来自拟南芥、玉米、大豆、烟豆、野大豆和短绒野大豆。

应当理解(正如本领域技术人员将会理解的)，本发明不仅仅涵盖这些具体的示例性序列。导致给定位点处产生化学上等价的氨基酸但不影响所编码多肽的功能特性的核酸片段中的改变是本领域众所周知的。因此，氨基酸丙氨酸(一种疏水性氨基酸)的密码子可被编码另一个疏水性较弱的残基(例如甘氨酸)或疏水性较强的残基(例如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)的密码子取代。类似地，导致一个带负电荷的残基替换为另一个带负电荷的残基(例如，天冬氨酸替换谷氨酸)或者一个带正电荷的残基替换为另一个带正电荷的残基(例如，赖氨酸替换精氨酸)的改变也可预期产生功能上等价的产物。导致多肽分子的氮末端和碳末端部分改变的核苷酸变化也将预计不会改变多肽的活性。所提出的修饰中的每一种均完全在本领域常规技术内，如测定编码产物生物活性的保留情况。

本发明的蛋白也可为包含在其中包括删除、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO：27、32、41、42、45、46、52、54、56、58、60、62、64和66。所述取代可为保守取代，它指某个氨基酸残基用另一个具有相似物理和化学特性的残基取代。保守取代的非限制性实例包括在包含脂族基团的氨基酸残基如Ile、Val、Leu或Ala之间的取代，以及在极性残基如Lys-Arg、Glu-Asp或Gln-Asn之间的取代。

当编码它们的野生型蛋白的DNA经受例如熟知的定点诱变时，可制备通过氨基酸删除、取代、插入和/或添加获得的蛋白质(参见例如Nucleic Acid Research，Vol.10，No.20，第6487-6500页，1982，其据此全文以引用方式并入)。如本文所用，术语“一个或多个氨基酸”旨在表示可通过定点诱变删除、取代、插入和/或添加可能数目的氨基酸。

可如下使用例如与将发生突变的单链噬菌体DNA互补、不同的是具有特定错配(即，期望的突变)的合成寡核苷酸引物完成定点诱变。即，上述合成寡核苷酸用作引发噬菌体互补链合成的引物，并且然后所得双工DNA用于转化宿主细胞。将转化的细菌培养物置于琼脂上，从而从包含噬菌体的单细胞形成菌斑。因此，理论上50％的新菌落包含具有突变的单链噬菌体，而剩余的50％具有初始序列。在允许与具有上述期望突变的DNA完全相同的DNA杂交、但是不与具有初始链的DNA杂交的温度下，允许所得噬菌体与通过激酶处理标记的合成探针杂交。随后，挑取与探针杂交的菌斑并进行培养以收集它们的DNA。

允许在生物活性肽如酶中删除、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸，同时保留它们的活性的技术包括上文提到的定点诱变和其他技术如用诱变剂处理基因的那些，以及其中选择性中断基因以移除、取代、插入或添加选择的一个或多个核苷酸、然后连接的那些。

本发明的蛋白也可为由核酸编码的蛋白，所述核酸包含的核苷酸序列在其中删除、取代、插入和/或添加一个或多个氨基酸，所述核苷酸序列选自SEQ ID NO：26、31、39、40、43、44、51、53、55、57、59、60、63和65。核苷酸的删除、取代、插入和/或添加可通过定点诱变或其他上文提到技术完成。

本发明的蛋白也可为由核酸编码的蛋白，所述核酸包含的核苷酸序列能够在严格条件下与选自SEQ ID NO：26、31、39、40、43、44、51、53、55、57、59、60、63和65的核苷酸序列的互补链杂交。

术语“在严格条件下”指两个序列在中或高严格条件下杂交。更具体地讲，中严格可由本领域的普通技术人员通过例如根据DNA长度来容易地测定。基本条件如Sambrook等人，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，第三版，第6章和第7章，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001所示，并且包括使用硝化纤维滤膜的预洗涤溶液5×SSC，0.5％SDS，1.0mM EDTA(pH8.0)，杂交条件为约50％的甲酰胺，2×SSC至6×SSC，在约40-50℃下进行(或其他类似的杂交溶液，例如Stark溶液，在约50％的甲酰胺中，在约42℃下进行)并且洗涤条件为例如约40-60℃，0.5-6×SSC，0.1％SDS。优选地，中严格条件包括在约50℃和6×SSC条件下杂交(并洗涤)。高严格条件也可由本领域的技术人员通过例如根据DNA长度来容易地测定。

一般来讲，此类条件包括在比中严格条件更高的温度和/或更低的盐浓度下杂交和/或洗涤(例如在约65℃，6×SSC至0.2×SSC，优选地6×SSC，更优选地2×SSC，最优选地0.2×SSC条件下杂交)。例如，高严格条件可包括如上所述杂交并在大约65-68℃，0.2×SSC，0.1％SDS条件下洗涤。在杂交和洗涤缓冲液中可以用SSC(1×SSC为0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠)取代SSPE(1×SSPE为0.15M NaCl，10mM NaH2PO4和1.25mM EDTA，pH7.4)；在完成杂交后洗涤15分钟。

使用可商购获得的杂交试剂盒也是可能的，所述试剂盒无放射性的底物作为探针。特异性的样品包括与ECL直接标记&检测系统(Amersham)杂交。严格条件包括例如使用所述试剂盒包括的杂交缓冲液在42℃杂交4小时，所述缓冲液补充有5％(w/v)封闭液和0.5M NaCl，并在0.4％SDS，0.5×SSC中，在55℃下洗涤两次，每次20分钟，然后在2×SSC中，在室温下洗涤一次，时间5分钟。

本发明的蛋白优选地为具有耐旱活性的蛋白。

“抑制DNA构建体”是在转化或稳定整合进植物基因组时，导致该植物中的靶基因“沉默”的重组DNA构建体。对该植物来说，该靶基因可以是内源性的或是转基因的。如本文针对靶基因所使用的，“沉默”通常指在由靶基因表达的mRNA或蛋白质/酶的水平上的抑制，和/或在酶活性或蛋白质功能性的水平上的抑制。本文中可交换使用的术语“抑制”、“抑制性”以及“沉默”包括降低、减少、减退、减小、抑制、消除或防止。“沉默”或“基因沉默”不确定机理并且包括但不限于反义、共抑制、病毒-抑制、发夹抑制、茎-环抑制、基于RNAi的方法以及基于小RNAi的方法。

抑制DNA构建体可包含源自所关注的靶基因的区域并且可包含所关注的靶基因的有义链(或反义链)的核酸序列的全部或部分。取决于所要采用的方法，该区域可与受关注基因的有义链(或反义链)的全部或部分100％相同或者具有少于100％的同一性(如，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性)。

抑制DNA构建体是本领域所熟知的，一旦选定所关注的靶基因就很容易构建，并且包括但不限于共抑制构建体、反义构建体、病毒抑制构建体、发夹抑制构建体、茎环抑制构建体、产生双链RNA的构建体，以及更通常的是，RNAi(RNA干扰)构建体和小RNA构建体，例如siRNA(短干扰RNA)构建体和miRNA(微RNA)构建体。

“反义抑制”指产生能够抑制靶基因或基因产物表达的反义RNA转录物。“反义RNA”指与靶初级转录物或mRNA的全部或部分互补，并阻断分离的靶核酸片段表达的RNA转录物(美国专利5,107,065)。反义RNA可与特定基因转录物的任何部分，即5′非编码序列、3′非编码序列、内含子或编码序列互补。

“共抑制”指产生能够抑制靶基因或基因产物表达的有义RNA转录物。“有义”RNA指包括mRNA并且可在细胞内或体外翻译成蛋白质的RNA转录物。此前，已通过着眼于以有义方向过表达与内源mRNA具有同源性的核酸序列(其导致与过表达的序列具有同源性的所有RNA减少)设计出了植物中的共抑制构建体(参见Vaucheret等人，Plant J.16：651-659(1998)；和Gura，Nature 404：804-808(2000))。

另一种变型描述了将植物病毒序列用于引导对近端mRNA编码序列的抑制(于1998年8月20日公开的PCT公开WO 98/36083)。

调控序列：

本发明的重组DNA构建体可包含至少一种调控序列。

调控序列可为启动子。

多种启动子可用于本发明的重组DNA构建体中。可根据所需结果来选择启动子，并且可包括用于在宿主生物体中表达的组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子或其他启动子。

在多数情况下引起基因在大多数细胞型中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。

虽然候选基因当通过组成型启动子驱动表达时可预测其效应，但候选基因在35S或UBI启动子控制下的高水平、组成型表达可具有多重效应。使用组织特异和/或胁迫特异启动子可消除不需要的效应但保留耐旱性的能力。在拟南芥属中已经观察到了该效应(Kasuga等人(1999)Nature Biotechnol.17：287-91)。

适用于植物宿主细胞的组成型启动子包括(例如)Rsyn7启动子的核心启动子和在WO 99/43838和美国专利6,072,050中公开的其他组成型启动子；CaMV 35S核心启动子(Odell等人，Nature 313：810-812(1985))；稻肌动蛋白(McElroy等人，Plant Cell 2：163-171(1990))；泛素(Christensen等人，Plant Mol.Biol.12：619-632(1989)和Christensen等人，Plant Mol.Biol.18：675-689(1992))；pEMU(Last等人，Theor.Appl.Genet.81：581-588(1991))；MAS(Velten等人，EMBO J.3：2723-2730(1984))；ALS启动子(美国专利5,659,026)等。其他组成型启动子包括例如在美国专利5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463、5,608,142和6,177,611中公开的那些启动子。

在选择启动子用于本发明方法时，可能有利的是使用组织特异性启动子或发育调控启动子。

组织特异性启动子或发育调节启动子是这样的DNA序列：该序列调节DNA序列选择性地在对雄穗发育、结籽或两者重要的植物细胞/组织中表达，并限制这种DNA序列只在植物的雄穗发育或种子成熟期间表达。任何引起所需时空表达的可鉴定启动子均可用于本发明的方法中。

可用于本发明的种子或胚芽特异性启动子包括大豆Kunitz胰蛋白酶抑制剂启动子(Kti3，Jofuku和Goldberg，Plant Cell 1：1079-1093(1989))、马铃薯块茎特异蛋白启动子(patatin启动子)(马铃薯块茎)(Rocha-Sosa，M.等人，(1989)EMBO J.8：23-29)、convicilin启动子、豌豆球蛋白启动子和豆球蛋白启动子(豌豆子叶)(Rerie，W.G.等人，(1991)Mol.Gen.Genet.259：149-157；Newbigin，E.J.等人，(1990)Planta 180：461-470；Higgins，T.J.V.等人，(1988)Plant.Mol.Biol.11：683-695)、玉米蛋白启动子(玉米胚乳)(Schemthaner，J.P.等人，(1988)EMBO J.7：1249-1255)、菜豆蛋白启动子(菜豆子叶)(Segupta-Gopalan，C.等人，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：3320-3324)、植物血球凝集素启动子(菜豆子叶)(Voelker，T.等人，(1987)EMBO J.6：3571-3577)、B-伴球蛋白启动子和大豆球蛋白启动子(大豆子叶)(Chen，Z-L等人，(1988)EMBO J.7：297-302)、谷蛋白启动子(大米胚乳)、大麦醇溶蛋白启动子(大麦胚乳)(Marris，C.等人，(1988)Plant Mol.Biol.10：359-366)、麦谷蛋白启动子和麦醇溶蛋白启动子(小麦胚乳)(Colot，V.等人，(1987)EMBO J.6：3559-3564)和甘薯贮藏蛋白启动子(甘薯块根)(Hattori，T.等人，(1990)Plant Mol.Biol.14：595-604)。可操作地连接至嵌合基因构建体异源编码区的种子特异性基因的启动子在转基因植物中保持它们的时空表达模式。这样的实施例包括在拟南芥和甘蓝型油菜种子中表达脑啡肽的拟南芥属2S种子储藏蛋白基因启动子(Vanderkerckhove等人，Bio/Technology 7：L929-932(1989))、表达荧光素酶的菜豆凝集素和β-菜豆蛋白启动子(Riggs等人，Plant Sci.63：47-57(1989))，以及表达氯霉素乙酰转移酶的小麦谷蛋白启动子(Colot等人，EMBO J6：3559-3564(1987))。

可诱导启动子响应内源性或外源性刺激的存在，例如，通过化合物(化学诱导剂)，或响应环境、激素、化学信号和/或发育信号而选择性表达可操作地连接的DNA序列。可诱导的或受调控的启动子包括(例如)受光、热、胁迫、水涝或干旱、植物激素、创伤或诸如乙醇、茉莉酮酸酯、水杨酸或安全剂之类的化学品调控的启动子。

本发明使用的启动子包括以下启动子：1)胁迫诱导型RD29A启动子(Kasuga等人，(1999)Nature Biotechnol.17：287-91)；2)大麦启动子B22E；B22E的表达是发育中的玉米籽粒中的柄所特异性的(“PrimaryStructure of a Novel Barley Gene Differentially Expressed in ImmatureAleurone Layers(在未成熟糊粉层中差异表达的新大麦基因的一级结构)”，Klemsdal，S.S.等人，Mol.Gen.Genet.228(1/2)：9-16(1991))；以及3)玉米启动子Zag2(“Identification and molecular characterization ofZAG1，the maize homolog of the Arabidopsis floral homeotic geneAGAMOUS(ZAG1-拟南芥花同源异形基因AGAMOUS的玉米同系物的鉴定和分子表征)”，Schmidt，R.J.等人，Plant Cell 5(7)：729-737(1993)；“Structural characterization，chromosomal localization and phylogeneticevaluation of two pairs of AGAMOUS-like MADS-box genes from maize(两对来自玉米的AGAMOUS样MADS-box基因的结构表征、染色体定位及系统发育评价)”，Theissen等人，Gene 156(2)：155-166(1995)；NCBI GenBank登录号X80206))。Zag2转录物可在授粉前5天至授粉后(DAP)7天至8天被检测到，并且引导Ciml在发育中的雌花序的心皮中表达，Ciml对发育中的玉米籽粒的籽仁而言是特异性的。Ciml转录物在授粉前4天至5天至授粉后6至8天被检测到。其他可用的启动子包括可源自其表达与发育中的雌小花母系相关的基因的任何启动子。

用于调控本发明的核苷酸序列在植物中表达的启动子是茎特异性启动子。这种茎特异性启动子包括苜蓿S2A启动子(GenBank登录号：EF030816；Abrahams等人，Plant Mol.Biol.27：513-528(1995))和S2B启动子(GenBank登录号：EF030817)等等，将这些文献以引用的方式并入本文。

启动子可整体源于天然基因，或者由源于天然存在的不同启动子的不同元件构成，或者甚至可包含合成的DNA片段。

用于本发明的启动子可包括：RIP2、mLIP15、ZmCOR1、Rab17、CaMV 35S、RD29A、B22E、Zag2、SAM合成酶启动子、泛素启动子、CaMV 19S、nos、Adh、蔗糖合成酶启动子、R-等位基因启动子、维管组织优选的启动子S2A(Genbank登陆号EF030816)和S2B(Genbank登录号EF030817)及来自玉米的组成型启动子GOS2。其他启动子包括根优选的启动子，例如玉米NAS2启动子、玉米Cyclo启动子(US2006/0156439，公开于2006年7月13日)、玉米ROOTMET2启动子(WO05063998，公开于2005年7月14日)、CR1BIO启动子(WO06055487，公开于2006年5月26日)、CRWAQ81(WO05035770，公开于2005年4月21日)和玉米ZRP2.47启动子(NCBI保藏号：U38790；GI No.1063664)，

本发明的重组DNA构建体也可包括其他调控序列，包括但不限于翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。在本发明的另一个实施方案中，本发明的重组DNA构建体还包括增强子或沉默子。

内含子序列可加至5′非翻译区、蛋白编码区或3′非翻译区以增加积聚在胞浆中的成熟信息的量。已经显示，在植物和动物两者的表达构建体的转录单位中包含可剪接内含子可使基因表达在mRNA和蛋白质水平上均增强高达1000倍。参见Buchman和Berg，Mol.Cell Biol.8：4395-4405(1988)；Callis等人，Genes Dev.1：1183-1200(1987)。

任何植物都可以选择用来鉴定将用于本发明重组DNA构建体的调控序列和DTP21多肽基因。适用于分离基因和调控序列的靶植物的实例应该包括但不限于：苜蓿、苹果、杏、拟南芥属、洋蓟、芝麻菜、芦笋、鳄梨、香蕉、大麦、豆类、甜菜、黑莓、蓝莓、西兰花、抱子甘蓝、卷心菜、卡诺拉、香瓜、胡萝卜、木薯、蓖麻、菜花、芹菜、樱桃、菊苣、芫荽、柑桔类、克莱门氏小柑橘类、三叶草、椰子、咖啡、玉米、棉、蔓越莓、黄瓜、花旗松、茄子、菊苣、茅菜、桉树、茴香、无花果、大蒜、葫芦、葡萄、柚子树、白兰瓜、豆薯、猕猴桃、生菜、韭葱、柠檬、酸橙、火炬松、亚麻子、芒果、甜瓜、蘑菇、油桃、坚果、燕麦、油棕、油菜、秋葵、橄榄树、洋葱、橙、观赏植物、棕榈、木瓜树、欧芹、欧洲防风草、豌豆、桃树、花生、梨树、胡椒、柿树、松树、菠萝、大蕉、李树、石榴树、白杨、马铃薯、南瓜、温柏、辐射松、红菊苣、萝卜、油菜、树莓、稻、黑麦、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甘薯、枫香树、柑橘、茶、烟草、蕃茄、黑小麦、草皮草、芜菁、葡萄树、西瓜、小麦、薯蓣和西葫芦。

组合物：

本发明的组合物是其基因组中包含本发明的任何重组DNA构建体(例如上面所讨论的任何一种构建体)的植物。组合物也包括任何植物的子代，以及获取自植物或其子代的任何种子，其中所述子代或种子在其基因组中包含重组DNA构建体。子代包括通过植物的自花授粉或异型杂交而获得的连续世代。子代也包括杂交种和近交系。

在杂交种子繁殖的农作物中，成熟的转基因植物可自花授粉而产生纯合的自交系植物。该近交系植物产生含有新导入的重组DNA构建体的种子。这些种子可生长而产生将会表现出改变的农学特性(例如，任选地在水限制条件下农学特性增加)的植物，或者可用于育种程序以产生杂交种子，这些杂交种子可生长而产生将会表现出如改变的农学特性的植物。所述种子可为玉米种子。

植物可为单子叶植物或双子叶植物，例如玉米、稻或大豆植物，如玉米杂种植物或玉米自交系植物。所述植物也可为向日葵、高粱、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉花、大麦、粟、甘蔗、柳枝稷、烟草、马铃薯和甜菜。

重组DNA构建体可稳定地整合进植物的基因组中。

具体实施方案包括但不限于下列的：

1.在基因组中包含重组DNA构建体的植物(例如玉米、稻或大豆植物)，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，基于Clustal V比对方法，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：27、32、46、56、60、64、81、83、85或87进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增强的耐旱性。所述植物与所述对照植物进行比较时还可表现出至少一种农学特性的改变。

2.在基因组中包含重组DNA构建体的植物(例如玉米、稻或大豆植物)，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码DTP21多肽序列，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增强的耐旱性。所述植物在与所述对照植物进行比较时还可表现出至少一种农学特性的改变。

3.在基因组中包含重组DNA构建体的植物(在例如玉米、稻或大豆植物)，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码DTP21多肽序列，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一种农学特性的改变。

4.其基因组中包含重组DNA构建体的植物(例如玉米、稻或大豆植物)，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，基于Clustal V比对方法，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：27、32、46、56、60、64、81、83、85或87进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一种农学特性的改变。

5.在基因组中包含重组DNA构建体的植物(例如玉米、稻或大豆植物)，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列：(a)能够在严格条件下与包含SEQ ID NO：26、31、44、55、59、63、80、82、84或86的全长互补序列的DNA分子杂交；或(b)通过选自删除、取代、添加和插入的至少一种方法改变一个或多个核苷酸而衍生自SEQ ID NO：26、31、44、55、59、63、80、82、84或86；并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一种农学特性的改变。

6.在基因组中包含重组DNA构建体的植物(例如玉米、稻或大豆植物)，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列：(a)能够在严格条件下与包含SEQ ID NO：26、31、44、55、59、63、80、82、84或86的全长互补序列的DNA分子杂交；或(b)通过选自删除、取代、添加和插入的至少一种方法改变一个或多个核苷酸而衍生自SEQ ID NO：26、31、44、55、59、63、80、82、84或86；并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一种农学特性的改变。

7.在基因组中包含重组DNA构建体的植物(例如玉米、稻或大豆植物)，所述重组DNA构建体包含多核苷酸其中所述多核苷酸包含至少一种核苷酸序列，所述核苷酸序列选自：(a)基因组片段IS125；(b)基因组片段IS125的Sub2；(c)基因组片段IS125的Sub3；(d)基因组片段IS125的Sub5；(e)基因组片段IS125的Sub7；(f)基因组片段IS125的Sub8；和(g)基因组片段IS127。

8.上述实施方案1-7中的植物的任何子代、上述实施方案1-7中的植物的任何种子、上述实施方案1-7中的植物的子代的任何种子以及来自上述实施方案1-6中的植物以及它们的子代的细胞。

在上述实施方案1-8或本发明的任一其他实施方案中的任一项中，DTP21多肽序列可来自拟南芥、玉米、大豆、烟豆、野大豆或短绒野大豆。

在前述实施方案1-8中的任一项或本发明的任何其他实施方案中，所述重组DNA构建体可包含至少一种在植物中有功能的启动子作为调控序列。

在前述实施方案1-8中的任一项或本发明的任何其他实施方案中，所述至少一种农学特性的改变是增加或减少。

在前述实施方案1-8中的任一项或本发明的任何其他实施方案中，所述至少一种农学特性可选自：绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总植物含氮量、果实含氮量、种子含氮量、营养组织含氮量、总植物氨基酸含量、营养组织游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、总植物蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织蛋白质含量、耐旱性、氮摄取、根倒伏、收获指数、茎倒伏、植株高度、穗高、穗长、盐耐受性、早期幼苗活力和在低温胁迫下的出苗。例如，至少一种农学特性的改变可为产量、绿度或生物量的增加。

在任一上述实施方案1-8或本发明的任一其他实施方案中，在与不包含所述重组DNA构建的对照植物在水限制条件下进行比较时，植物可表现出至少一种农学特性的改变。

“干旱”指植物可利用的水不足，尤其是当时间延长时，能够引起植物损伤或阻止其正常发育(例如限制植物生长或种子产量)。

“耐旱性”指植物在干旱条件下存活较长时间并且基本上不表现出生理或物理退化的特性。

植物的“耐旱性增加”相对于参比植物或对照植物进行测量，它是植物在干旱条件下存活较长时间，并且相对于在相似干旱条件下生长的参比或对照植物基本上不表现出相同程度的生理或物理退化的特性。通常当转基因植物在其基因组中包含重组构建时，它相对于参比或对照植物表现出增强的耐旱性，所述参比或对照植物在其基因组中不包含重组构建体。

本领域的普通技术人员熟悉模拟干旱条件并评价植物耐旱性的规程，所述植物已经遭受了模拟的或天然存在的干旱条件。例如，技术人员可通过向植物提供比正常需求较少的水或在一定时期内不提供水来模拟干旱条件，并且技术人员可通过寻找在生理和/或物理条件上的差异来评价耐旱性，包括但不限于活力、生长、大小、或根长、或具体地讲叶片颜色或叶片面积大小。用于评价耐旱性的其他技术包括测量叶绿素荧光、光合作用速率和换气速率。

干旱胁迫实验可涉及慢性胁迫(即缓慢干燥)和/或可涉及两种急性胁迫(即突然除去水)，它们由一天或两次恢复分开。慢性胁迫可持续8-10天。急性胁迫可持续3-5天。在对转基因植物和相应对照植物进行干旱胁迫以及良好灌溉处理期间可测量以下变量：

变量“％面积chg_慢性开始-急性2”是介于慢性胁迫第一天和第二次急性胁迫那一天之间的、通过远可见光谱成像测定的总面积百分比变化的量度

变量“％面积chg_慢性开始-慢性结束”是介于慢性胁迫第一天和慢性胁迫最后一天之间的、通过远可见光谱成像测定的总面积百分比变化的量度。

变量“％面积chg_慢性开始-收获”是介于慢性胁迫第一天和收获那一天之间的、通过远可见光谱成像测定的总面积百分比变化的量度。

变量“％面积chg_慢性开始-恢复24小时”是介于慢性胁迫第一天和恢复24小时(急性胁迫2之后24小时)之间的、通过远可见光谱成像测定的总面积百分比变化的量度。

变量“psii_急性1”是在第一次急性胁迫末期的光系统II(PSII)效率的量度。它提供对PSII天线吸光效率的评价，并且直接涉及叶片内部的二氧化碳同化。

变量“psii_急性2”是在第二次急性胁迫末期的光系统II(PSII)效率的量度。它提供对PSII天线吸光效率的评价，并且直接涉及叶片内部的二氧化碳同化。

变量“fv/fm_急性1”是在第一次急性胁迫末期的最佳量子产率(Fv/Fm)的量度-(最大和最小荧光之间的可变荧光差值/最大荧光)。

变量“fv/fm_急性2”是在第二次急性胁迫末期的最佳量子产率(Fv/Fm)的量度-(最大和最小荧光之间的可变荧光差值/最大荧光)。

变量“叶片卷曲_收获”是在收获日的顶部图像对侧面图像的比率的量度。

变量“叶片卷曲_恢复24小时”是恢复24小时顶部图像对侧面图像的比率的量度。

变量“比生长速率(SGR)”指植物总表面积经过单独一天的变化(通过Lemna Tec Instrument测量)(Y(t)＝Y0*e^r*t)。Y(t)＝Y0*e^r*t等同于Y/Δt的％变化，其中各个术语含义如下：Y(t)＝t时的总表面积；Y0＝初始总表面积(估计值)；r＝比生长速率，天数^-1，以及t＝种植后的天数(“DAP”)

变量“苗干重”是将苗置于104℃烘箱96小时后的苗重量的量度。

变量“苗鲜重”是从植物切除后立即称重的苗重量的量度。

下文实例描述一些用于模拟干旱条件和/或评价耐旱性的代表性规程和技术。

也可通过在田间测试中比较植物在模拟的或天然存在的干旱条件下(例如通过测量与非干旱条件下相比，在干旱条件下基本等同的产量，或测量与对照或参比植物相比，在干旱条件下更少的产量损失)保持足够产量(至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％产量)的能力来评价耐旱性。

在评价或测量其中利用了对照或参照植物的本发明任何实施方案(例如，如本文描述的组合物或方法)中的转基因植物的农学特性或表型时，本领域的普通技术人员将很容易认识到要利用的合适对照植物。例如，通过如下非限制性示例来说明：

1.转化的植物的子代，该转化的植物对于重组DNA构建体来说是半合子的，使得该子代分离成包含或不包含该DNA构建体的植株：包含该重组DNA构建体的子代将通常相对于不包含该重组DNA构建体的子代来进行测量(即，不包含该重组DNA构建体的子代是对照或参照植物)。

2.重组DNA构建体基因渗入至近交系中，例如在玉米中，或基因渗入进变种中，例如在大豆中：基因渗入品系将通常相对于亲本近交系或变种品系进行测量(即，亲本近交系或品种品系是对照或参照植物)。

3.双杂交系，其中第一杂交系由两个亲本近交系产生，而第二杂交系由相同的两个亲本近交系产生，不同的是其中一个亲本近交系含有重组DNA构建体：第二杂交系通常将相对于第一杂交系进行测量(即第一杂交系为对照植物或参照植物)。

4.包含重组DNA构建体的植物：该植株可以相对于这样的对照植物进行评价或测量，该对照植物不包含重组DNA构建体，但具有与该植株相当的遗传背景(例如，与包含重组DNA构建体的植株相比较，核遗传物质具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。存在许多可用于分析、比较和表征植物遗传背景的基于实验室的技术；其中这些技术是同工酶电泳、限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、任何引物聚合成酶链反应(AP-PCR)、DNA扩增指纹(DAF)、序列特异扩增区域(SCAR)、扩增片段长度多态性(AFLP

)和也称为微卫星的简单序列重复(SSR)。

此外，本领域的普通技术人员将容易认识到，评价或测量转基因植物的农学特性或表型时合适的对照或参照植物将不包括先前已经针对所需的农学特性或表型，通过诱变或转化而选择的植物。

方法：

方法包括但不限于：用于增强植物耐旱性的方法、用于评价植物耐旱性的方法、用于改变植物农学特性的方法、用于测定植物农学特性改变的方法和用于制备种子的方法。所述植物可为单子叶植物或双子叶植物，例如玉米、稻或大豆植物。植物还可以是向日葵、高梁、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉花、大麦或黍。所述种子可为玉米、稻或大豆种子，例如玉米杂交种子或玉米自交系种子。

方法包括但不限于如下方法：

转化细胞的方法包括用本发明的任何分离的多核苷酸转化细胞。也包括通过这种方法转化的细胞。在具体实施方案中，所述细胞是真核细胞，例如酵母、昆虫或植物细胞，或原核细胞例如细菌细胞。

产生转基因植物的方法，其包括用本发明的任何分离的多核苷酸或重组DNA构建体来转化植物细胞并由转化的植物细胞再生转基因植物。本发明也涉及由该方法制备的转基因植物，以及从该转基因植物中获取的转基因种子。

用于从细胞或细胞培养基中分离本发明多肽的方法，其中所述细胞包含具有本发明多核苷酸的重组DNA构建体，所述多核苷酸可操作地连接到至少一种调控序列，并且其中转化的宿主细胞在适于重组DNA构建体表达的条件下生长。

改变宿主细胞中本发明多肽表达水平的方法，包括：(a)用本发明的重组DNA构建体转化宿主细胞；以及(b)在适于表达所述重组DNA构建体的条件下使转化的细胞生长，其中重组DNA构建体的表达导致转化的宿主细胞中的本发明多肽含量改变。

增强植物耐旱性的方法，包括(a)将重组DNA构建体导入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(例如在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，基于Clustal V比对方法，所述所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：27、32、46、56、60、64、81、83、85或87进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；和(b)在步骤(a)之后，由所述可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体并且在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增强的耐旱性。所述方法还可包括(c)获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含重组DNA构建体并且在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增强的耐旱性。

增强植物耐旱性的方法，包括(a)将重组DNA构建体导入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列：(a)能够在严格条件下与包含SEQ IDNO：26、31、44、55、59、63、80、82、84或86的全长互补序列的DNA分子杂交；或(b)通过选自删除、取代、添加和插入的至少一种方法改变一个或多个核苷酸而衍生自SEQ ID NO：26、31、44、55、59、63、80、82、84或86；以及(b)在步骤(a)之后，由所述可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体并且在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增强的耐旱性。所述方法还可包括(c)获得来源于该转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体并且在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增强的耐旱性。

评价植物耐旱性的方法，包括：(a)获得转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(例如在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，基于Clustal V比对方法，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：27、32、46、56、60、64、81、83、85或87进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；(b)获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及(c)评价所述子代植物与不包含所述重组DNA构建体的对照植物相比的耐旱性。

评价植物耐旱性的方法，包括(a)获得转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列：(a)能够在严格条件下与包含SEQ ID NO：26、31、44、55、59、63、80、82、84或86的全长互补序列的DNA分子杂交；或(b)通过选自删除、取代、添加和插入的至少一种方法改变一个或多个核苷酸而衍生自SEQ ID NO：26、31、44、55、59、63、80、82、84或86；以及(b)获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及(c)评价所述子代植物与不包含所述重组DNA构建体的对照植物相比的耐旱性。

测定植物农学特性改变的方法，包括：(a)获得转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(例如在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中基于Clustal V比对方法，所述多核苷酸编码的多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：27、32、46、56、60、64、81、83、85或87进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；(b)获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及(c)任选地在水限制条件下，测定所述子代植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

测定植物农学特性改变的方法，包括：(a)获得转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列：(a)能够在严格条件下与包含SEQ ID NO：26、31、44、55、59、63、80、82、84或86的全长互补序列的DNA分子杂交；或(b)通过选自删除、取代、添加和插入的至少一种方法改变一个或多个核苷酸而衍生自SEQ IDNO：26、31、44、55、59、63、80、82、84或86；(b)获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及(c)任选地在水限制条件下，测定所述子代植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

产生种子(例如可作为提供耐旱性的产品销售的种子)的方法，该方法包括任一上述的方法，并且还包括从所述子代植物获得种子，其中所述种子在其基因组中包含所述重组DNA构建体。

在任一前述方法或本发明方法的任一其他实施方案中，在所述导入步骤中所述可再生的植物细胞可包括愈伤组织细胞、胚胎愈伤组织细胞、配子细胞、分生细胞或未成熟胚芽细胞。可再生的植物细胞可来自近交系玉米植物。

在任一前述方法或本发明方法的任一其他实施方案中，所述再生步骤可包括：(i)在包含促胚发生激素的培养基中培养所述转化的植物细胞，直至观察到愈伤组织；(ii)将步骤(i)的所述转化植物细胞转移到第一培养基中，所述培养基包括促组织形成激素；以及(iii)在第二培养基上传代培养步骤(ii)后的所述转化的植物细胞，以允许嫩芽伸长、根发育或这两者同时发生。

在任何前述方法或本发明的方法的任何其他实施方案中，所述至少一种农学特性可选自：绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总植物含氮量、果实含氮量、种子含氮量、营养组织含氮量、总植物游离氨基酸含量、营养组织游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、总植物蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织蛋白质含量、耐旱性、氮摄取、根倒伏、收获指数、茎倒伏、植株高度、穗高、穗长、盐耐受性、早期幼苗活力和在低温胁迫下的出苗。至少一种农学特性的改变可为产量、绿度或生物量的增加。

在任一上述方法或本发明的任一其他方法中，在水限制条件下，所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时可表现出至少一种农学特性的改变。

在任一前述方法或本发明方法的任何其他实施方案中，存在供选择的替代方案用于将包含可操作地连接到至少一种调控序列的多核苷酸的重组DNA构建体导入到可再生的植物细胞中。例如，可将调控序列(例如一种或多种增强子、任选地作为转位因子的部件)导入到可再生的植物细胞中，然后筛选其中将所述调控序列可操作地连接至编码本发明多肽的内源基因的事件。

将本发明的重组DNA构建体导入植物可通过任何合适的技术来进行，这些技术包括但不限于引导DNA摄取、化学处理、电穿孔、微注射、细胞融合、感染、载体介导的DNA转移、轰击或农杆菌介导的转化。植物转化和再生技术已经在国际专利公布WO 2009/006276中进行了描述，其内容以引用方式并入本文。

含有编码所关注蛋白质的外来的外源性分离核酸片段的植物的发育或再生是本领域所熟知的。可将再生的植物进行自花授粉以产生纯合的转基因植物。或者，将得自再生植物的花粉与农学上重要的品系的产生种子的植株进行杂交。相反，将来自这些重要品系植物的花粉用于给再生植物授粉。利用本领域技术人员所熟知的方法培育含有所需多肽的本发明的转基因植物。

实施例

本发明将在下面的实施例中进一步说明，其中份数和百分比是以重量计并且度数是摄氏度，除非另外说明。应当理解，尽管这些实施例说明了本发明的优选实施方案，但仅是以例证的方式给出的。根据上面的论述和这些实施例，本领域的技术人员能够确定本发明的基本特征，并且在不脱离其实质和范围的情况下，能够对本发明做出各种变化和修改以使其适用于各种用法和条件。因此，除了那些本文所示和所述的那些之外，根据前文所述，本发明的各种修改形式对本领域的技术人员来说将是显而易见的。这些修改形式也旨在涵盖于所附权利要求书的范围内。

实施例1

制备苏丹草粘粒文库

苏丹草(Sorghum sudanense/Sugar Slim/Sugar Slim)购自KanekoSeeds Co.，Ltd.并将其种植在温室中以进行培养。从植物叶片中提取基因组DNA。用限制性酶TaqI部分消化提取的基因组DNA，并且随后通过蔗糖密度梯度离心法制备包含30kb至50kb的DNA的片段。将来自那些片段的DNA克隆进粘粒载体pSB200中，该载体已经经Nsp(7524)V(本文也称为“NspV”)消化以构建基因组DNA文库。

克隆载体pSB200构建自pSB11(Komari等人，Plant J.10：165-174，1996)。具体地讲，将玉米泛素启动子置于潮霉素抗性基因和NOS基因的3′末端信号之前。将一个Nsp(7524)V裂解位点加到该构建体上，然后将其插入pSB11，从而构建pSB200。使用pSB200，人们能够构建基因组DNA文库，其具有约40kb的平均片段长度。载体pSB200也是高等植物的转化载体并且包含用作选择标记的潮霉素抗性基因。克隆进文库的大多数DNA片段具有约30kb至约50kb的长度并且克隆总数为约30,000。使用的大肠杆菌菌株是DH5α^TM和GENEHOGS

。

实施例2

筛选以鉴定具有增强的耐旱性的转基因稻品系

Yukihikari品种稻的原种购自食品零售商，并且子代种子在温室中收获。Suweon 287品种稻的原种得自National Institute of AgribiologicalResources of Japan，并且子代种子在温室中收获。

通过以下方法检查小容器中的稻植株经重度缺水后仍存活的能力。

1)将六株转基因植物和对照植物Suweon 287和Yukihikari每种各一株一起在小罐内的土壤中培养(小罐直径10.5cm，高9cm，体积570mL)。Suweon 287是耐旱对照品种，而Yukihikari是不耐旱的对照品种。在这个条件下，将根系包含在有限空间中以便根系深入到土壤中的能力差异不成为该测定法的影响因素。这个方法中的总体植株状况是相当均匀的，因为罐内土壤的水含量变化非常小。

2)当第六片叶片伸展开时，在第三和第四天中止灌溉直至对照Yukihikari的叶片丧失任何明显的生存信号。罐与罐之间的脱水水平可能在某些程度上不同，但是对照Yukihikari的外观提供了罐内干旱胁迫水平的良好指示。

3)为了有利于评分，再次灌溉植株并在次日检查。

4)在次日，目测植株并根据表1所述的标准评分。

表1

稻干旱测定中的评分标准

这一测定法是简单的和高度可再现的。在这个测定法中超过一半的Suweon 287植株的评分通常为2或更高，而不耐旱的植株的评分很少超过2。因此，当测试品系中的两个或更多个植株的评分为2或更高时，将该品系记录为耐旱品系。

实施例3

鉴定赋予稻耐旱性的苏丹草粘粒

将组成来源于实施例1中所述的苏丹草的基因组DNA文库转移到农杆菌属菌株LBA4404(pSB1)(Komari等人Plant J.10：165-174，1996)中。用于转移的方法是三亲本杂交(Ditta等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77：7347-7351，1980)。将在携带所述克隆的所得农杆菌属品系中的基因组DNA片段单个导入Yukihikari品种稻中。该转化方法根据Hiei等人(Plant J.6：271-282，1994)所述并且基于农杆菌属的幼胚接种方法。使用潮霉素抗性基因作为选择标记基因。Yukihikari品种的幼胚获取自在温室中培养的植株。Yukihikari品种稻的原种购自食品零售商，并且使用在温室中收获的子代种子。

获取包含来自苏丹草的单个基因组DNA片段的转基因植物。对于每个基因组DNA片段，获取来自独立转化事件的一个或两个单个植株。在下文中，根据一般规则，初代的转基因植物将称为T0代植株，并且它们的子代称为T1代、T2代等。

检查来源于转基因植物的T1子代植株的耐旱性。对于上述每种T0转化体，检测六个T1植株。然后根据第一次T1检测的评分给来自苏丹草的总计1045个基因组片段排序，并且从序列顶部中选择它们中的128个进行另一次T1检测。随后，选择25个片段进行进一步的研究。

T2种子得自潮霉素抗性T1植株，该植株来自用25个片段中的每一个转化的稻。检查来自25个T2品系中每一个的12株潮霉素抗性植株的耐旱性。重复T2检测。

用来自苏丹草的特定基因组片段转化的Yukihikari品种稻的子代品系称为基因组片段“IS125”，该品系经重复检测在T1和T2检测中是耐旱品系。从这些检测中筛选的包含基因组片段IS125的转基因稻事件称为“IS125 Event No.1”。

表2、表3和表4分别显示转基因稻IS125 Event No.1的T1、T2和T3代耐旱性测试结果。在T3检测中，检查12株植株中每一株的潮霉素抗性和潮霉素敏感型表型。在这个表中清楚地显示由基因组片段IS125赋予的耐旱性性状被反复检测到并且稳定地遗传直到T3代，并且耐旱性和潮霉素抗性性状共分离。

表2

用基因组片段IS125转化的稻品系的T1干旱检测

表3

用基因组片段IS125转化的稻品系的T2干旱检测

表4

用基因组片段IS125转化的稻品系的T3干旱检测

此外，Yukihikari品种稻如上所述用基因组片段IS125再次转化，并且检查T1代中附加事件的耐旱性。其中一个称为“IS125 Event No.3”的转基因稻事件在T1代中显然是耐旱的(表5)。

表5

用基因组片段IS125转化的附加稻品系的T1干旱检测

用来自苏丹草的不同基因组片段转化的Yukihikari品种稻的子代品系称为基因组片段“IS127”，该品系经重复检测在T1和T2检测中也是耐旱品系。从这些检测中筛选到的基因组片段IS127的转基因稻事件称为“IS127Event No.1”。表6示出在T3代中的转基因稻IS127EventNo.1的耐旱性测试结果。因此，它清楚地显示由基因组片段IS127赋予的耐旱性被反复检测到，并且被稳定地遗传直到T3代。

表6

用基因组片段IS127转化的稻品系的T3干旱检测

此外，Yukihikari品种稻如上所述用基因组片段IS127再次转化，并且检查T1代中附加事件的耐旱性。测试的所有3个转基因稻事件称为“IS127Event No.2”、“IS127Event No.3”和“IS127Event No.4”，它们在T1代中明显是耐旱的(表7)。

表7

用基因组片段IS127转化的附加稻品系的T1干旱检测

实施例4

鉴定作为耐旱基因候选的DTP21

如实施例3所示，发现来自苏丹草的基因组片段IS125能够赋予Yukihikari品种稻耐旱性。基因组片段IS125通过标准方法进行全序列测序以获得由42,104个核苷酸组成的SEQ ID NO：1。进行PCR分析以鉴定基因组片段IS125的区域，该区域存在于转基因稻品系IS125EventNo.3中。基于如图1所示的基因组片段IS125序列设计六对PCR引物(M1、M2、M3、M4、M5和M6)。此外，引物对M-Hpt来源于选择性标记基因HPT的序列。从来源于IS125Event No.3的耐旱性T1子代植株的T2子代植株中分离DNA样品并通过图1中列出的引物对进行检查。引物对M1、M2和M-Hpt能够扩增来自所有子代的期望DNA片段。然而，引物对M3、M4、M5和M6不能扩增期望的产物。这些结果符合下述假设：在M1和M2之间的片段存在于IS125Event No.3中，而M3和M6之间的片段不存在于其中。因此，耐旱性基因位于M1和M2之间的区域中是可能的。

接下来，从基因组片段IS125(图2)中亚克隆出片段并将它们导入Yukihikari品种稻中以证实上述假设。表8显示用基因组片段IS125和IS125的多个亚片段转化的稻的耐旱性检测综述。

表8

用基因组片段IS125和多个亚片段转化的稻的耐旱性检测

亚克隆片段是12.9kb的PvuII-BstZ17I片段，它在下文中称为“Sub5”并且包括大多数M1-M3区域(图2)，将该片段插入pSB200并且确认该序列位于连接区域。通过三亲本杂交将所得质粒导入农杆菌属菌株LBA4404(pSB1)。如实施例3所述用重组农杆菌属转化Yukihikari品种稻。也用农杆菌属LBA4404转化Yukihikari品种稻，所述菌株携带pSB134(Hiei和Komari，Plant Cell Tissue and Organ Cult.85：271-283，2006)，其包含潮霉素抗性基因和GUS基因。

检测用Sub5转化的稻在T0和T1代中的耐旱性。对于T0代，评分为2或更高的Sub5转化体的48个再生株中的十个具有耐旱性，而GUS转化体的48个再生株无一具有耐旱性，它们是不耐旱的对照植物(表9)。因此，Sub5足以产生耐旱性稻转化事件。

表9

用Sub5转化的稻的T0再生株的耐旱性检测

表10显示用基因组片段IS125的亚片段Sub5转化的T1代稻的耐旱性检测结果。测试来源于T0代中评分为2或更高的七个事件的七个品系(称为“Sub5Event No.1”-“Sub5Event No.7”)。七个品系中的六个清楚地显示耐旱性。也在这些亚片段评价试验中检测在T5代中的转基因稻IS125Event No.3，并且其在每个实验中明显地是耐旱的。因此，由基因组片段IS125赋予的耐旱性被稳定地遗传到T5代，并且这一系列的耐旱性检测受到良好的控制。

表10

用Sub5转化的七个转基因稻品系的T1代的耐旱性检测

为了进一步确定包含耐旱性基因的区域，测试更小的亚片段。将8.1kb的SmaI片段(在下文中称为“Sub2”)、3.2kb的HindIII片段(在下文中称为“Sub3”)和6.8kb的BstBI片段(在下文中称为“Sub4”)插入分别用EcoRV、HindIII和BstBI预处理、然后用CIAP处理的pSB200中，上述各片段均为Sub5的亚片段。在所述用于Sub5的相似方法中，将三个亚片段中的每一个通过农杆菌属介导的转化方法导入Yukihikari品种稻中。

检查用亚片段Sub2转化的稻的十六个事件在T1代中的耐旱性(表11)。六个事件(Sub2Events No.5、No.7、No.9、No.12、No.15和No.16)显然是耐旱的。

表11

用Sub2转化的十六个转基因稻品系的T1代的耐旱性检测

检查用亚片段Sub3转化的稻的十六个事件在T1代中的耐旱性(表12)。八个事件(Sub3Events No.3、No.4、No.6、No.7、No.9、No.10、No.12和No.16)显然是耐旱的。

表12

用Sub3转化的十六个转基因稻品系的T1代的耐旱性检测

检查用亚片段Sub4转化的稻的十六个事件在T1代中的耐旱性(表13)。无Sub4事件是耐旱的。

表13

用Sub4转化的十六个转基因稻品系的T1代的耐旱性检测

为了较精确地确定耐旱性基因区域，如下制备两个Sub3的亚片段。使用Pyrobest DNA聚合酶(TAKARA-BIO)的PCR利用Sub5质粒DNA作为模板，并利用引物SEQ ID NO：16(5′-TACCTTGTTAACCTCATAGGTTCTTCTCAG-3′)和SEQ ID NO：17(5′-TCCCATGGAGAGTTAACGCCCGACCTT-3′)进行，然后用HpaI消化PCR产物以产生2.1kb的片段(在下文中称为“Sub8”)。在类似的方法中，在PCR中使用引物SEQ ID NO：18(5′-CCCCATACTTGTTAACTGCTTTCTTGC-3′)和SEQ ID NO：19(5′-TCCCATGGAGAGTTAACGCCCGACCTT-3′)，然后用HpaI消化PCR产物以产生1.2kb的片段(在下文中称为“Sub7”)。Sub7是Sub8的亚片段。将Sub8和Sub7插入pSB200，其已经用EcoRV消化，然后用CIAP预处理。在确认PCR扩增区域和连接区域后，通过如上所述的农杆菌属介导的转化方法将Sub8和Sub7导入Yukihikari品种稻。

用Sub8和Sub7转化的稻的干旱响应评价在T0代进行。48个Sub8事件中的十七个显然是耐旱的，而GUS转化事件无一是耐旱的(表14)。48个Sub7事件中的三个显然是耐旱的，而GUS转化事件无一是耐旱的(表15)。

表14

用Sub8转化的稻的T0代的耐旱性检测

表15

用Sub7转化的稻的T0代的耐旱性检测

从这些结果中，明显地是在基因组克隆IS125中的耐旱性基因存在于亚片段Sub7的区域中。

通过RT-PCR检查由Sub7编码的转录物的存在。使用RNEASY

Mini试剂盒(QIAGEN)，从整株T0转基因稻植株中制备总RNA，所述植株包含亚片段Sub5并显示耐旱性。携带GUS基因和HPT基因的转基因稻植株的RNA用作阴性对照。RNA样品通过用于RT-PCR的SuperScript^TM III First-Strand Synthesis System(Invitrogen)进行cDNA合成。RT-PCR利用两个引物进行，它们是SEQ ID NO：20(5′-TCCCTAATCTTCTTGTTGGCACTG-3′)和SEQ ID NO：21(5′-TTAGTTCCTTGCTGCTCCAATGGC-3′)，其基于Sub7的序列进行设计。因此，从Sub5转化体的cDNA中，而不是从GUS转化体的cDNA中扩增出约0.6kb的片段(图3；表16)。此外，当反应中不包括逆转录酶时，未观察到扩增，这指示该片段从RNA中扩增出来。0.6kb片段的序列分析证实RT-PCR产品来自Sub7序列。

表16

包含SEQ ID NO：1从4,827至5,459的核苷酸的转录物的RT-PCR

利用GENERACER^TM试剂盒(Invitrogen)进行使用5′和3′RACE(快速扩增cDNA末端)的实验以表征编码耐旱性多肽的基因(在下文中称为“SS-DTP21-1”多肽)。对于5′RACE，引物SEQ ID NO：22(5′-CCTTTGGAGGGATGAAACGGACTTTG-3′)与GENERACER^TM 5′引物SEQ ID NO：74(5′-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3′)混合，然后引物SEQ ID NO：23(5′-TGATCTCACCGCTCCGGTTGGTCTTG-3′)与GENERACER^TM 5′巢式引物SEQ ID NO：75(5′-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3′)混合。对于3′RACE，引物SEQ ID NO：24(5′-TCCTTGCTGCTCCAATGGCCGAGAAG-3′)与GENERACER^TM 3′引物SEQ ID NO：76(5′-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3′)混合，然后引物SEQ IDNO：25(5′-ACCTCAGCATGGAGCCTGTGGAAGAC-3′)与GENERACER^TM3′巢式引物SEQ ID NO：77(5′-CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3′)混合。将巢式PCR扩增的片段插入pCR

4-TOPO

(Invitrogen)并进行序列分析。在SEQ ID NO：1的核苷酸编号5,499处鉴定单个转录起始位点，并且在SEQ ID NO：1的核苷酸编号4,655、4,652、4,471、4,464、4,069、4,011和3,956处发现七个3′末端位点(图3)，指示7种类型的转录物存在于耐旱性稻中。然而，所有转录物似乎编码相同的蛋白质，因为差异位于3′-非翻译区域内。编码SS-DTP21-1多肽的核苷酸序列列为SEQID NO：26。SS-DTP21-1的氨基酸序列列为SEQ ID NO：27。

基于这些结果，设计两个引物SEQ ID NO：28(5′-TGCGAGGTTGTCGAGCACTTGCTCCT-3′)和SEQ ID NO：29(5′-CAAGCCTTCTCTTCTTCAGTTAGAGC-3′)并且使用来自上述Sub5转化体和GUS转化体的RNA进行RT-PCR。仅仅当用逆转录酶处理来自Sub5转化体的RNA时，才观察到期望尺寸(1.5kb)的条带(表17)，这确认了跨越两个引物的转录物的存在。

表17

包含SEQ ID NO：1从4,019至5,489的核苷酸的转录物的RT-PCR

实施例5

鉴定作为耐旱性候选基因的SS-DTP21-2基因

如实施例3所述，来自苏丹草的基因组片段IS127也能够赋予Yukihikari品种稻耐旱性。通过标准方法对基因组片段IS127进行全测序并阐明了34,231核苷酸的序列(SEQ ID NO：30)。

基因组片段IS127(SEQ ID NO：30)包含与基因组片段IS125的亚片段Sub8高度同源的区域。这个IS127同源区域包含核苷酸序列(SEQID NO：31)，其编码多肽(SEQ ID NO：32)，在下文中称为“SS-DTP21-2”多肽，它与SS-DTP21-1多肽同源。如下亚克隆这一区域。用来源于基因组片段IS127的两个引物SEQ ID NO：33(5′-ATACCTTGTTAACCTCATAGGTTCTCTCAG-3′)和SEQ ID NO：34(5′-CCTTCCCATGGAGAGTTAACGCCCGACACT-3′)扩增同源区域，然后通过上述方法将所得PCR片段亚克隆到pSB200中。

实施例6

鉴定编码与SS-DTP21-1同源的多肽的高粱基因

使用标准DNA序列分析方法，鉴定编码与SS-DTP21-1同源的多肽的高梁基因。公开可用的核苷酸序列的TBLASTN分析指示SS-DTP21-1的氨基酸序列SEQ ID NO：27与由下列序列编码的氨基酸序列高度同源：高梁基因组BAC克隆SB_BBc0073F19(NCBI GI No.124359063)的核苷酸25530-24904；和高梁基因组BAC克隆SB_BBc0109L12(NCBI GINo.124359064)的核苷酸44114-44740。公开可用的高粱EST序列的TBLASTN分析指示SEQ ID NO：27的亚片段与由下列序列编码的氨基酸序列高度同源：获取自干旱胁迫植物(即，在停止灌溉后第7天和第8天的5周龄植株)的两个高粱EST序列(NCBI GI No.7659303；NCBI GINo.7659212)；以及获取自8周龄植株不同未成熟期的子房的EST序列(NCBI GI No.11922211)。

编码基因组片段IS125的亚克隆Sub8中的SS-DTP21-1的区域被多个编码与SS-DTP-21-1同源多肽的高梁基因的蛋白编码区置换。其中PCR片段的末端与线性载体的同源末端融合的Clontech IN-FUSION^TMPCR克隆系统用于载体构建。

如下制备线性载体。PCR扩增使用如下组分进行：PRIMESTAR

Max(TAKARA-BIO)酶；在实施例4中构建的包含pSB200中的亚片段Sub8的质粒，该质粒作为模板；以及以下两个引物：

5′-GCTCTAACTGAAGAAGAGAAGGCTTGGTGGCTTGGTGTTTG-3′(SEQ ID NO：35)；和

5′-GCTATCATTTAAATCGGTTTAGGTTTACTATTATCATCAG-3′(SEQ ID NO：36)。

在用T4多核苷酸激酶(TAKARA-BIO)处理后，使用DNA连接试剂盒“Mighty Mix”(TAKARA-BIO)，PCR产物自身连接。所得DNA用于通过电穿孔转化大肠杆菌MACH1^TM-T1R(Invitrogen)。在出现在包含奇放线菌素(50μg/ml)的LB平板上的重组菌落中，基于菌落PCR和针对连接区域的质粒的序列分析结果选择一个菌落。选择菌落的质粒用SwaI和AfeI消化并用BAP(TAKARA-BIO)处理消化产物，在电泳后从琼脂糖凝胶中纯化产物。

编码与SS-DTP21-1同源的多肽的高梁(Gold sorgho)基因的蛋白编码区通过PCR扩增制备，所述PCR使用以下组分：PRIMESTAR

Max(TAKARA-BIO)酶；高梁(Gold sorgho)的基因组DNA作为模板；以及下述两个引物：

5′-TTCTTCAGTTAGAGCTTGATTAGTTCCTTGCTGCTCCAATG-3′(SEQ ID NO：37)；和

5′-AAACCTAAACCGATTTTAAAGATAGATAACTAAGATGCATTGC

CTCAATGTCTAATCTAGATAAATTA-3′(SEQ ID NO：38)。

在电泳后从琼脂糖凝胶中纯化PCR产物。

编码与SS-DTP21-1同源的多肽的线性载体和PCR产物，它们每个共有在末端区域中的15-16个碱基对的序列同一性，使用IN-FUSION^TMAdvantage PCR克隆试剂盒(Clontech)，按照使用说明书将它们彼此融合。所得DNA用于通过电穿孔转化大肠杆菌MACH1^TM-T1R(Invitrogen)。在出现在包含奇放线菌素(50μg/ml)的LB平板上的重组菌落中，基于菌落PCR和质粒的序列分析结果选择两个菌落。所选菌落的编码区的核苷酸序列列为SEQ ID NO：39(编码SB-DTP21-1多肽)和SEQ ID NO：40(编码SB-DTP21-2多肽)。两个蛋白的相应氨基酸序列分别列为SEQ IDNO：41(SB-DTP21-1)和SEQ ID NO：42(SB-DTP21-2)。

在三亲本杂交中所述菌落与农杆菌属菌株LBA4404(pSB1)和辅助大肠杆菌菌株HB101(pRK2013)一起使用，并且所得农杆菌属菌株用于转化如上所述的稻品种。

在类似的方法中，与SS-DTP21-1同源的两个基因的蛋白编码区得自高梁(B35)。得自高梁(B35)的两个同源核苷酸序列列为SEQ IDNO：43(编码SB-DTP21-3多肽)和SEQ ID NO：44(编码SB-DTP21-4多肽)。两个蛋白的相应氨基酸序列分别列为SEQ ID NO：45(SB-DTP21-3)和SEQ ID NO：46(SB-DTP21-4)。

实施例7

鉴定编码与SS-DTP21-1同源的多肽的附加基因

在与上述实施例类似的方法中，从苏丹草(sudan grass/Sorghumsudanense)、约翰逊草(Johnson grass/Sorghum halepense)、甘蔗(sugarcane/Saccharum officinarum)和高粱(sorghum/Sorghum bicolor(Gold sorgho)；Sorghum bicolor(B35)；以及Sorghum bicolor(hoki))中鉴定与SS-DTP21-1同源的其他基因的蛋白编码区。SS-DTP21-1的氨基酸序列的SEQ ID NO以及多个同源蛋白和编码SS-DTP21-1的相应核苷酸序列以及多个同源蛋白在下表中列出。

表18

来自多种生物的SS-DTP21-1和同源蛋白

实施例8

表征与SS-DTP21-1同源的多肽

图4A-4E给出如SEQ ID NO：27、32、41、42、45、46、52、54、56、58、60、62、64、66、79、81、83、85和87所示的氨基酸序列的比对，所述氨基酸序列来自苏丹草、高粱、约翰逊草和甘蔗的DTP21多肽。图5给出图4A-4E中给出的每对序列的序列同一性百分比和趋异值。

用LASERGENE

生物信息计算包(DNASTAR

Inc.，Madison，WI)的MEGALIGN

程序进行序列比对和同一性百分比计算。用Clustal V比对方法(Higgins和Sharp(1989)，CABIOS.5：151153)进行序列的多重比对，默认参数(GAP PENALTY＝10，GAP LENGTH PENALTY＝10)。使用Clustal方法采用以下逐对比对的默认参数：KTUPLE＝1，GAPPENALTY＝3，WINDOW＝5，DIAGONALS SAVED＝5。

SS-DTP21-1的氨基酸序列与图4A-4E中给出的同源物具有以下百分比序列同一性：91.4％(SS-DTP21-2)；88.5％(SB-DTP21-1)；84.6％(SB-DTP21-2)；83.3％(SB-DTP21-3)；93.3％(SB-DTP21-4)；92.8％(SS-DTP21-3)；92.3％(SS-DTP21-4)；91.4％(SS-DTP21-5)；84.7％(SS-DTP21-7)；91.9％(SH-DPT21-1)；93.3％(SH-DTP21-2)；63.8％(SO-DTP21-1)，63.8％(SO-DTP21-2)，91.4％(SS-DTP21-6)，91.9％(SB-DTP21-5)，93.3％(SB-DTP21-6)，92.8％(SB-DTP21-9)和92.3％(SB-DTP21-10)。

实施例9

电穿孔根癌农杆菌LBA4404

电穿孔感受态细胞(40L)如根癌农杆菌LBA4404，其包含PHP10523(“pSB1”；Komari等人，Plant J.10：165-174(1996)；NCBI通用标识符59797027)，在冰上解冻(20-30分钟)。PHP10523含有用于T-DNA转移的VIR基因、农杆菌属的低拷贝数质粒复制起始区、四环素抗性基因以及用于体内DNA生物分子重组的cos位点。同时，将电穿孔管在冰上冷却。将该电穿孔仪的设置调节至2.1kV。将DNA等分试样(0.5μL亲代DNA，在低盐缓冲液或双蒸H₂O中的浓度为0.2μg-1.0μg)与解冻的根癌农杆菌LBA4404细胞混合，同时仍然保持在冰上。将混合物转移至电穿孔管的底部并静止保持在冰上1-2分钟。按下“pulse(脉冲)”键两次(理想的是获得4.0毫秒的脉冲)对细胞进行电穿孔(Eppendorf电穿孔仪2510)。随后，将0.5mL室温下的2xYT培养基(或SOC培养基)加入到电穿孔管并转移至15mL按压盖管(例如Falcon^TM管)中。将细胞在28-30℃、200-250rpm下培养3小时。

将250μL的等分试样散布在包含YM培养基和50μg/mL奇放线菌素的板上并在28-30℃下培养三天。为了增加转化体的数目，可进行如下两个可选步骤中的其中一个：

选择1：用30μL 15mg/mL的利福平覆盖平板。LBA4404具有针对利福平的染色体抗性基因。这种附加的选择消除了在使用较差的LBA4404感受态细胞制备物时观察到的一些污染克隆。

选择2：进行两次重复的电穿孔以补偿较差的电感受态细胞。

转化体的鉴定：

选取四个独立的克隆并划痕接种在包含AB基本培养基和50μg/mL奇放线菌素的平板上用于分离单个克隆。将平板在28℃下孵育二天至三天。对于每个推定的共整合体选取单个克隆并将其接种在4mL的10g/L细菌蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/L氯化钠和50mg/L奇放线菌素中。将该混合物在28℃下摇动培养24小时。采用QIAGEN

Miniprep和可选的PB缓冲液洗涤，从4mL培养物分离出质粒DNA。DNA在30L中洗脱。如上所述，将2L的等分试样用于电穿孔20L DH10b+20L双蒸H₂O。可任选地，可将15L等分试样用于转化75-100L的INVITROGEN^TMLibrary Efficiency DH5。将细胞散布在包含LB培养基和50μg/mL奇放线菌素的平板上并将其在37℃下培养过夜。

对于每个推定的共整合体选取三至四个独立克隆并将其接种在4mL的2xYT培养基(10g/L细菌蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/L氯化钠)和50μg/mL奇放线菌素中。将细胞在37℃下摇晃培养过夜。接下来，使用QIAPREP

Miniprep，用任选PB缓冲液洗涤液(洗脱成50L)从4mL培养物中分离质粒DNA。8L质粒DNA用SalI(使用亲本DNA和PHP10523作对照物)进行消化。对于4个质粒，利用限制性内切酶BamHI、EcoRI和HindIII再进行三次消化(使用亲代DNA和PHP10523作为对照)，这4个质粒代表2种具有正确SalI消化模式的推定共整合体。推荐电凝胶用于比较。

实施例10

使用农杆菌属三亲本杂交用基因组片段IS125转化玉米

由于基因组片段IS125的大尺寸，玉米可经由与农杆菌属的三亲本杂交进行转化，使用以下规程(Ditta等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77：7347-7351，1980)。

第1天：将农杆菌属菌株LBA4404(pAL4404，pSB1)划线接种到加四环素(10μg/ml)的基本琼脂培养基上并在28℃培养3天。

第2天：将具有包含IS125的DNA的大肠杆菌菌株GENEHOGS

接种到含奇放线菌素(100μg/ml)的LB琼脂上并在25℃培养2天。

第3天：将大肠杆菌(pRK2013)划线接种到加卡那霉素(50μg/ml)的LB琼脂上并在37℃培养过夜。

第4天：在营养琼脂平板上混合3种菌株各一环并在28℃培养过夜。

第5天：将混合物划线接种到加奇放线菌素(50μg/ml)的基本琼脂培养基平板上并在28℃培养3天。

第8天：挑取单菌落，划线接种到相同培养基上并在28℃培养3天。

第11天：挑取单菌落，划线接种到相同培养基上并在28℃培养3天。

第14天：挑取单菌落并开始接种到包含奇放线菌素(100μg/ml)的2ml 2XYT肉汤培养物中，在28℃培养过夜至1天。

第15天：过夜培养物的小量制备DNA。使用1μL用于电穿孔的20μlGENEHOGS细胞。

第16天：挑取一个单菌落并开始接种到包含奇放线菌素(100μg/ml)的1.2ml 2XYT肉汤培养物中，在37℃培养过夜。

第17天：小量制备过夜培养物的DNA并用BamHI、EcoRI和HindIII进行限制性分析。

实施例11

使用农杆菌属细菌转化玉米

农杆菌介导的玉米转化基本上按照以下文献中描述的方法进行：Zhao等人，在Meth.Mol.Biol.318：315-323(2006)中描述的方法进行(还可参见Zhao等人，Mol.Breed.8：323-333(2001)和1999年11月9日公布的美国专利5,981,840，所述文献以引用方式并入本文)。该转化过程涉及细菌接种、共培养、静止期、选择以及植株再生。

1.未成熟胚芽制备：

将未成熟胚芽从颖果上切下来，并且放置在含有2mL PHI-A培养基的2mL微管中。

2.未成熟胚芽的农杆菌属细菌感染和共培养：

2.1感染步骤：

用1mL微吸移管将(1)的PHI-A培养基取出，并且加入1mL农杆菌属悬浮液。将该管轻轻地倒置以混合。将该混合物在室温下培养5分钟。

2.2共培养步骤：

用1mL微量吸移管将农杆菌属悬浮液从感染步骤中移出。使用无菌刮刀将胚从管中刮出并转移到100×15mm培养皿中的PHI-B培养基的平板中。测定胚的朝向，使得胚轴在培养基表面上朝下。将具有胚芽的平板在20℃下于黑暗中培养三天。L-半胱氨酸可用于共培养阶段。采用标准二元载体，补充有100-400mg/L L-半胱氨酸的共培养培养基对于回收稳定的转基因事件是至关重要的。

3.选择推定的转基因事件：

向在100×15mm培养皿中的PHI-D培养基的每个平板中转移10个胚芽，保持朝向，并且用PARAFILM将培养皿密封。将平板在黑暗中于28℃下培养。预计在六周至八周将看见作为黄色胚芽组织的主动生长推定事件。不产生事件的胚可能是棕色和坏死的，并且几乎看不见脆性组织生长。以二-三周的间隔将推定的转基因胚芽组织转移到新鲜的PHI-D平板上进行传代培养，时间间隔取决于生长速度。记录事件。

4.T0植株的再生：

将在PHI-D培养基上繁殖的胚芽组织转移到在100×25mm培养皿中的PHI-E培养基(体细胞胚芽成熟培养基)中进行传代培养，在28℃于黑暗中培养直至体细胞胚芽成熟，培养大约十天至十八天。将具有良好限定的盾片和胚芽鞘的个体成熟体细胞胚芽转移到PHI-F胚芽发芽培养基中，并且在28℃下于光中(约80μE，来自冷光灯或同等荧光灯)培养。在七天至十天，将约10cm高的再生的植株置于盆中的园艺混合物中，并且使用标准园艺方法进行耐寒锻炼。

用于植物转化的培养基：

●PHI-A：4g/L CHU基础盐，1.0mL/L 1000×Eriksson′s维生素混合物，0.5mg/L盐酸硫胺，1.5mg/L 2，4-D，0.69g/L L-脯氨酸，68.5g/L蔗糖，36g/L葡萄糖，pH5.2。加入100μM乙酰丁香酮(过滤灭菌的)。

●PHI-B：PHI-A，不含有葡萄糖，将2，4-D增加至2mg/L，将蔗糖降低至30g/L，并且补充0.85mg/L硝酸银(过滤灭菌的)，3.0g/LGELRITE，100μM乙酰丁香酮(过滤灭菌的)，pH5.8。

●PHI-C：PHI-B，不含GELRITE

和乙酰丁香酮，将2，4-D降低至1.5mg/L，并且补充8.0g/L琼脂，0.5g/L 2-[N-吗啉代]乙烷-磺酸(MES)缓冲液，100mg/L羧苄西林(过滤灭菌的)。

●PHI-D：PHI-C补充3mg/L双丙氨磷(过滤灭菌的)。

●PHI-E：4.3g/L Murashige and Skoog(MS)盐(Gibco，BRL11117-074)，0.5mg/L烟酸，0.1mg/L盐酸硫胺，0.5mg/L盐酸吡哆醇，2.0mg/L甘氨酸，0.1g/L肌醇，0.5mg/L玉米素(Sigma，目录号Z-0164)，1mg/L吲哚乙酸(IAA)，26.4μg/L脱落酸(ABA)，60g/L蔗糖，3mg/Lbialaphos(过滤灭菌的)，100mg/L羧苄西林(过滤灭菌的)，8g/L琼脂，pH5.6。

●PHI-F：PHI-E，不含有玉米素、IAA、ABA；将蔗糖降低至40g/L；用1.5g/L GELRITE

替代琼脂；pH 5.6。

通过首先将组织簇转移到补充有0.2mg每升的2，4D的N6培养基中，可由所述转基因愈伤组织再生植物。两周后，可将组织转移至再生培养基中(Fromm等人，Bio/Technology 8：833839(1990))。

转基因T0植株可以再生，并且可以确定其表型。可收集T1种子。可培养T1植株和/或它们的子代并测定它们的表型。

实施例12

用验证过的耐旱性前导基因转化Gaspe Flint来源的玉米品系

为了检查所得表型，可转化玉米植株以过表达耐旱性前导基因(或来自其他物种的对应同源物)。

受体植株：

受体植株细胞可来自具有短的生活周期(“快速循环”)、小的个体尺寸以及转化潜能高的单一玉米品系。对玉米典型的这些植株细胞是来自可公开获得的Gaspe Flint(GBF)品系品种的植株细胞。一种可能的候选植株品系品种是GBF×QTM(Quick Turnaround Maize(快速周转玉米)，选择用于在温室条件下生长的Gaspe Flint的可公开获得形式)的F1杂交种，其在Tomes等人的美国专利申请公开2003/0221212中有所公开。从该品系获得的转基因植株具有如此小的尺寸使得它们可在四英寸的盆中生长(是正常大小的玉米植株所需空间的1/4)并且它们在少于2.5个月时间内成熟。(传统上，一旦转基因植株适应温室后需要3.5个月来获得转基因T0种子。)另一合适的品系是GS3(高度可转化的品系)×Gaspe Flint的双单倍体品系。还有另一种合适的品系是携带引起较早开花、高度减小或这两者的转基因的可转化的优良近交系。

转化规程：

任何合适的方法可用于将转基因导入玉米细胞中，包括但不限于利用基于农杆菌载体的接种类型的步骤。转化可在受体(靶标)植株的未成熟胚上进行。

精确的生长和植株跟踪：

将由转化的玉米胚产生的转基因(T0)植株的事件群体在受控的温室环境中栽培，该温室使用改良的随机分块(block)设计以降低或消除环境误差。随机分块设计是这样一种植株布局，在该布局中，实验植株被分成组(如，每组三十株植株)，称为块，而每株植株随块被随机分配一个位置。

对于一组三十株植株，二十四株转化的实验植株和六株对照植物(具有设定好的表型的植株)(总起来说称为“重复组”)被置于盆中，这些盆在位于温室内的桌子上布置成阵列(也叫做重复组或块)。每株植株(对照植物或实验植株)随块被随机分配一个位置，所述的块映射一个唯一的、温室物理位置以及映射该重复组。使在单次实验中多个三十株植株的重复组中的每一个可在相同的温室中生长。应该测定重复组的布局(布置方式)以使对空间的要求最小以及温室内的环境影响最小。这样一种布局可称为压缩的温室布局。

对于加入特定的对照组的一种替代方法是鉴定不表达所关注基因的那些转基因植株。可将诸如RT-PCR之类的多种技术应用于定量评价导入基因的表达水平。可将不表达转基因的T0植株与表达转基因的那些植株进行比较。

在整个评价过程中鉴定和跟踪事件群体中的每株植株，并且从那些植株收集的数据自动与那些植株相关联，使得所搜集的数据可与由该植株携带的转基因关联。例如，每个植株容器具有机器可读的标签(例如通用货单代码(UPC)条形码)，该标签包含了关于植物身份的信息，身份信息继而又与温室位置相关，使得从植物获得的数据可自动与该植物相关联。

作为另外一种选择，可使用任何有效的、机器可读的植物识别系统，例如二维矩阵代码或甚至是射频识别标签(RFID)，其中数据被接收并由射频接收器/处理器进行翻译。参见美国公布的专利申请2004/0122592，其以引用方式并入本文。

利用三维成像进行表型分析：

对T0事件群体中的每株温室植株(包括任何对照植物)分析所关注的农学特性，并且以这样一种方式记录或存储每株植株的农学数据，该方式使得数据与该植株的辨识数据(见上面)相关联。可利用与上述类似的实验设计，可在T1代中完成对表型(基因效应)的确认。

在植物的整个温室生活周期中，利用定量的非破坏性成像技术在表型水平上来分析T0植株以评价所关注的性状。可将数字成像分析仪用于整株植物的自动多维分析。成像可在温室内进行。将两个摄像系统(位于顶部和侧面)和用于旋转植物的装置用于从所有侧面观察植物和成像。从每株植物的顶部、前面和侧面采集图像。所有的三个图像一起提供了足够的信息用于评价每株植物的生物量、大小和形态。

由于植物在第一片叶片从土壤显现出来时到植物处于它们发育的末期时大小的改变，最好是从顶部以较高的放大倍率记录植物发育的早期。这可通过利用完全由成像软件控制的自动变焦镜头系统来完成。

在单次成像分析操纵中，进行如下事件：(1)将植株传送至分析仪区域内，旋转360度以便其机器可读标签可被读取，并且让其保持静止直至其叶片停止移动；(2)获取侧面图像并将其输入数据库；(3)将植株旋转90度并再次让其保持静止直至其叶片停止移动，以及(4)将该植株传送出分析仪。

每二十四小时的周期让植物至少六个小时处于黑暗以便具有正常的白天/黑夜周期。

成像仪器：

可使用任何合适的成像仪器，包括但不限于可从LemnaTec GmbH(Wurselen，Germany)商购获得的光谱数字成像仪。获取图像并用具有1/2″IT Progressive Scan IEE CCD成像设备的LemnaTec ScanalyzerHTS LT-0001-2进行分析。该成像照相机可配备有自动变焦、自动调节光圈和自动聚焦。可利用LemnaTec软件设定所有的照相机设置。例如对于主要组成成像分析仪的仪器差异小于约5％，对于次要组成成像分析仪的仪器差异可小于约10％。

软件：

成像分析系统包括用于颜色和构造分析的LemnaTec HTS Bonit软件程序和用于存储约500,000次分析的数据(包括分析数据)的服务器数据库。原始图像和分析过的图像储存在一起以允许用户根据需要进行再次分析。可将数据库连接至成像硬件用于自动的数据收集和存储。可将多种市售的软件系统(如Matlab等)用于定量判读成像数据，并且这些软件系统中的任何一种均可应用于图像数据集。

传送系统：

具有植物旋转装置的传送系统可用于将植物传送至成像区域并在成像过程中选择植物。例如，将最多四株植物(每株最高高度为1.5m)装上汽车，该汽车在循环的传送系统上行进并通过成像测量区域。在这种情况下，该单位(成像分析仪和传送环线)的总占有面积为约5m×5m。

可扩大传送系统以同时容纳更多植物。将植物沿传送环线传送至成像区域并对每株植物分析最多50秒。获取植物的三个视图。传送系统以及成像设备应该能够用于温室环境条件。

照明：

任何合适的照明模式可用于图像采集。例如，可在暗背景上使用顶部照明。作为另外一种选择，可采用使用白色背景的顶部照明和背部照明的组合。应该将被照亮的区域围起来以确保恒定的照明条件。遮蔽物应该长于测量区域使得能保持恒定的光条件而不需要打开和关闭门。作为另一种选择，可变化照明以引起转基因(如，绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP))的激发或者引起内源性(如叶绿素)荧光基团的激发。

基于三维成像的生物量估计：

为了更好地估计生物量，应该从至少三个轴(例如顶部视图和两个侧面(侧面1和侧面2)视图)获取植物图像。然后分析这些图像以将植物从背景(盆和花粉控制袋(如果适用的话))分离。可通过如下计算评价植物的体积：

在上面的等式中，体积和面积的单位是“任意单位”。在该系统中，任意单位完全足以检测基因对植物大小和生长影响，因为所需的是检测与实验平均值或对照平均值的差值(正较大和负较小两者)。大小(如面积)的任意单位可通过将物理参照加入到成像过程而轻易地转化成物理量度。例如，可在顶部成像过程和侧面成像过程两者中均包括已知面积的物理参照。基于这些物理参照的面积，可测定转换因子以允许从像素转换为面积单位，例如平方厘米(cm²)。物理参照可以是或可以不是独立的样本。例如，具有已知直径和高度的盆足可用作物理参照。

颜色分类：

成像技术还可用于测定植物颜色以及用于将植物颜色归为各种衍生类型。将图像颜色归属于颜色类型是LemnaTec软件的固有特色。使用其他图像分析软件系统，可通过多种计算方法测定颜色分类。

对于植物大小和生长参数的测定，一种有用的分类方案是定义一种单一颜色方案，包括绿色的两种或三种色调，此外，还有关于缺绿病、坏死和漂白(在这些条件出现时)的颜色类型。还使用了背景颜色类型，其包括图像中的非植物颜色(例如盆和土壤颜色)，并将这些像素特别地从测定大小中排除。在受控的恒定照明下分析植物，使得可以定量一株植物内随时间推移的任何改变，或者植物之间或植物不同分枝之间的任何改变(如季节差异)。

除了其在测定植物的大小、生长中的有效性以外，颜色分类还可用于评价其他产量构成性状。对于这些其他产量构成性状，可使用另外的颜色分离方案。例如，称为“保绿度”的性状(已经将其与产量的提高相关联)可通过颜色分类来评价，该颜色分类将绿色色调与黄色和棕色色调(其指示老化的组织)相分离。通过将这种颜色分类应用于在T0或T1植物生活周期末获取的图像，可鉴定绿色的量相对于黄色和棕色(例如，可表示为绿色/黄色比率)增加的植物。这种绿色/黄色比率具有显著差异的植物可被鉴定为携带影响这种重要农学性状的转基因。

熟练的植物学家将认识到可指示植物健康或应激反应的其他植物颜色(花青素)的出现，以及认识到其他颜色分类方案可提供对基因在与这些响应相关的性状方面的作用的进一步度量。

植物结构分析：

改变植物构造参数的转基因也可用本发明鉴定，包括诸如最大高度和宽度、节间距离、叶与茎之间的角度、在节处开始的叶片数以及叶片长度。LemnaTec系统软件可如下用于测定植物构造。在第一成像步骤中将植物简化至其主要的几何构造，并且随后基于该图像可进行不同构造参数的参数化鉴定。或者是单独地或者是组合地修改任何这些构造参数的转基因可通过应用此前所述的统计方法来鉴定。

花粉脱落日期：

花粉脱落日期是转基因植物中要分析的一个重要参数，并且可通过活性雄花第一次出现在植物上来测定。为了找到雄花目标，通过颜色对茎的上端进行分类以检测黄色或紫色花药。然后将这种颜色分类分析用于定义活性花，活性花继而可用于计算花粉脱落日期。

作为另外一种选择，花粉脱落日期和其他易于在视觉上检测到的植物属性(如授粉日期、第一穗丝日期)可由负责进行植物看护的工作任人员来记录。为了使数据完整性和过程效率最大化，通过利用相同的由LemnaTec光谱数字分析设备利用的条形码来跟踪该数据。可将具有条形码阅读器的电脑、掌上设备或笔记本电脑用于使记录观察时间、植物标识符的数据捕捉变得容易，以及使捕捉数据的操作者感觉舒适。

植物的取向：

以接近商业栽培的密度种植的成熟玉米植物通常具有平面的构造。也就是说，植物具有一可清晰分辨的宽的侧面和窄的侧面。对来自植物宽侧的图像进行测定。对于每株植物，给其赋予一个明确界定的基本取向以获得宽侧图像与窄侧图像之间的最大差别。将顶部图像用于测定植物的主轴，而将额外的旋转装置用于在开始主图像采集前将植物转至合适的取向。

实施例13

评价Gaspe Flint来源的玉米品系的耐旱性

可用以下方法筛选具有耐旱性的含候选耐旱性基因的转基因GaspeFlint来源的玉米品系。

转基因玉米植物经受供水良好条件(对照)和干旱胁迫条件。在T1阶段或更晚的时期筛选转基因玉米植物。

对于植物生长，土壤混合物由1/3 TURFACE、1/3 SB300和1/3沙土构成。所有罐装满相同量的土壤±10克。手动浇水使得罐达到最多100％的罐体容量(“FC”)。使用20-10-20(氮-磷-钾)125ppm氮营养溶液将所有植物保持在60％F C。在整个实验期间每张表监测pH每周至少三次。在种植后第13天开始(DAP)，所述实验可分成两个处理组，良好灌溉组和缺水组。将包括缺水处理组在内的所有植物保持在40％FC，而将良好灌溉处理组的植物保持在80％FC。缺水植物在慢性干旱胁迫条件下(40％FC)生长10天。在慢性胁迫期间所有植物每日拍照。在慢性干旱末期(22DAP)采集植物样品用于代谢特征分析。在慢性胁迫结束时给所有植物拍照并测量叶绿素荧光。缺水植物经过重度干旱胁迫期及随后的恢复期，分别为23-31DAP和32-34DAP。在重度干旱胁迫期间，限制水和营养物质直至植物达到8％FC。在重度胁迫期和回复期结束时给所有植物再次拍照并测量叶绿素荧光。计算更大的Student t检验的概率用于比较每个转基因平均值与合适的无效转基因平均值(分离无效转基因或构建体无效转基因)。使用最小值(P＜t)0.1作为具有统计意义上显著性的结果的临界值。

实施例14

转化并评价用PHP29675转化的Gaspe Flint来源的玉米品系

Gaspe Flint来源的玉米品系经由包含苏丹草基因组DNA片段IS125的农杆菌属，使用质粒DNA PHP29675进行转化。用与实施例13所述的方法相似的方法评价质粒构建体的四个转化事件的耐旱性。

表19-20显示每个转基因事件的变量，所述事件与无效分离相比发生了显著改变。将“正效应”定义为转基因事件的变量相对于无效对照植物发生了具有统计意义上的显著性的改善。将“负效应”定义为无效对照植物相对于转基因事件的变量发生了具有统计意义上的显著性的改善。表19提供了单个事件具有显著性改变的变量的数目，所述事件用质粒DNA构建体转化。表20提供了所述构建体的事件数目，其显示每个变量的显著改变。

表19

用包含基因组片段IS125的PHP29675转化的单个事件具有显著改 变 ^* 的变量数

^*P值小于或等于0.1

表20

用PHP29675转化的单个事件具有显著改变 ^* 的变量数

^*P值小于或等于0.1

对于评价的构建体PHP29675，与每个改善变量相关联的统计值在图6A、6B、7A和7B中示出。显著阳性结果具有小于或等于0.1的P值。各个转化玉米品系的结果如图6A和6B所示。构建体PHP30853的综合评价如图7A和7B所示。如表18和图6A及6B所示，在缺水条件下玉米转化事件EA2393.324.2.1和EA2393.324.5.1的列出的十三个变量中的三个变量具有显著正值。

实施例15

用耐旱前导基因转化的玉米品系的产量分析

可通过直接转化或者从单独转化的品系基因掺入而将含有证实的耐旱性基因的重组DNA构建体导入玉米优良自交系内。

自交或杂交的转基因植物可通过更严苛的大田试验来研究在水限制条件下和水充分条件下的产量增加和/或稳定性。

可对产量进行后续分析以测定含有验证过的耐旱性前导基因的植株在与不含有验证过的耐旱性前导基因的对照植物比较时，在水限制条件下是否具有产量的改善。具体地讲，可在包含验证过的耐旱性前导基因的植物和对照植物的开花期和/或结实期施加干旱条件。可以测得这两种植物的产量都有所减少。包含验证过的耐旱性前导基因的植物相对于对照植物具有更少的产量损失，例如在水限制条件下产量损失减少至少25％，或在不限制水条件下相对于对照植物将具有提高的产量。

可使用以上方法选择在水限制条件下和/或水充分条件下，与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时具有增加产量的转基因植物。

实施例16

筛选以鉴定具有增强耐旱性的转基因拟南芥属品系

定量干旱筛选：将来自每个转基因拟南芥属品系的九个草胺磷抗性T2植株每株种植在有SCOTTS

METRO-MIX

200土壤的单个罐中。每个浅箱配置有8个方罐。每个方罐顶部填充有土壤。每个罐(或单元)均播种以产生3×3阵列的9个草胺磷抗性幼苗。

土壤浇水至饱和，然后植株在标准条件下生长(即，16小时光照，8小时黑暗循环；22℃；～60％相对湿度)。不提供附加的水。

在可见的干旱胁迫症状出现时拍摄植物的数字图像。每天拍摄图像一次(在每天的相同时间)，直至植物变干。通常收集连续四天的数据。

使用颜色分析鉴定潜在的耐旱性品系。可使用颜色分析测量进入黄色区的叶片面积百分比的增加。使用色调、饱和度和强度数据(“HSI”)，黄色区由色调35至45组成。

叶片面积的保持也被用作鉴定潜在耐旱性品系的另一个标准，因为拟南芥属叶片在干旱胁迫期间萎蔫。叶片面积的保持可用莲座型叶丛面积随时间的减少来测量。

叶片面积根据使用LemnaTec成像系统获取的绿色像素数目进行测量。激活标记和对照(例如野生型)植物在浅箱中并列生长，浅箱包含72株植物(9株/罐)。当萎蔫开始时，拍摄图像多日以监控萎蔫过程。基于连续四天获取的绿色像素数，从这些数据中测定激活标记植物和伴随的对照植物的萎蔫特征图。该特征图选自发生最大程度萎蔫的四天中的一系列测量结果。耐旱能力通过激活标记植物与对照植物相比的抗萎蔫倾向来测量。

使用LemnaTec HTSBonitUV软件分析CCD图像。根据绿色像素数目获取对拟南芥属植物的叶片面积的评价。对每张图像的数据进行平均化以获取对激活标记植物和对照植物的绿色像素值的平均值和标准偏差的评价。噪声函数的参数通过平方偏差对平均像素数的直线回归获得，使用批中的所有图像数据。平均像素数数据的误差估计使用噪声函数的拟合参数进行计算。激活标记植物和野生型植物的平均像素数相加以获取每张图像的总叶片面积的评价。具有最大萎蔫的四天间隔通过选择对应于植物生长最大差异的间隔获得。激活标记植物和野生型植物的单个萎蔫响应通过归一化使用间隔第一天的绿色像素数值的数据获得。激活标记植物与野生型植物相比的耐旱性通过相加经过两天至四天的激活标记植物和野生型植物间的萎蔫响应的加权差值来评分；加权数通过传递数据误差进行评价。耐旱性评分为正对应于激活标记植物与野生型植物相比萎蔫更慢。激活标记植物和野生型植物之间的萎蔫响应的差异显著性从平方偏差的加权和获取。

将在与整个浅箱的平均值进行比较时具有黄色积聚显著延迟和/或莲座型叶丛面积显著保持的品系命名为Phase 1hits。在相同分析条件下进行Phase 1hits的重复试样再筛选。当Phase 2平行测定的其中一个或全部显示与整个浅箱的平均值有显著差异时(评分大于0.9)，则认为该品系是经验证的耐旱性品系。

实施例17

通过转化到拟南芥属中验证SS-DTP21-1

用以下方法测试编码SS-DTP21-1(SEQ ID NO：27)的候选基因赋予拟南芥属耐旱性的能力。

用紧接Invitrogen^TM Gateway

C1转化插入序列上游的1.3kb的35S启动子构建16.8kb的T-DNA基二元载体，称为pBC-yellow。该载体也包含RD29a启动子，该启动子驱动基因表达ZS-Yellow(Invitrogen^TM)，它赋予转化的种子黄色荧光。

从苏丹草的基因组DNA中通过RT-PCR扩增SS-DTP21-1蛋白编码区，所述RT-PCR使用以下引物：

●SS-DTP21-1-5′attB正向引物(SEQ ID NO：67)：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGGCCGAGAAGTACCACGAAG

●SS-DTP21-1-3′attB反向引物(SEQ ID NO：68)：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTAGCGGCGCTCTAATTCCCTAATC

正向引物包含attB1序列(ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT；SEQ ID NO：69)，其邻近蛋白编码区的前22个核苷酸(以ATG起始密码子开头)。

反向引物包含attB2序列(ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT；SEQ ID NO：70)，该序列邻近蛋白编码区的反向互补序列的后25个核苷酸(以终止密码子的反向互补序列开头)。

使用INVITROGEN^TM GATEWAY

CLONASE^TM技术，利用pDONR^TM/Zeo进行BP重组反应。这种方法将细菌致死ccdB基因以及氯霉素抗性基因(CAM)从pDONR^TMZeo移除并定向地克隆了在旁侧具有attB1和attB2位点的PCR产物而得到入门克隆pDONR^TM/Zeo-SS-DTP21-1。该入门克隆与目的载体一起用于随后的LR重组反应如下。

用紧接Invitrogen^TM Gateway

C1转化插入序列上游的1.3kb 35S启动子构建称为pBC-yellow(SEQ ID NO：71)的16.8kb T-DNA基的二元载体(目的载体)，所述插入序列包含ccdB细菌致死基因以及侧接attR1和attR2序列的氯霉素抗性基因(CAM)。该载体也包含RD29a启动子，该启动子驱动基因表达ZS-Yellow(Invitrogen^TM)，它赋予转化的种子黄色荧光。使用Invitrogen^TM Gateway

技术，对包含定向克隆PCR产物和pBC的pDONR^TM/Zeo-SS-DTP21-1入门克隆进行LR重组反应。这允许迅速的和定向的克隆pBC中在35S启动子后的候选基因以制备35S启动子::SS-DTP21-1表达构建体，pBC-Yellow-SS-DTP21-1。

然后将35S启动子::SS-DTP21-1表达构建体导入野生型拟南芥属生态型Col-0，上述过程使用整株农杆菌属介导的转化方法(国际专利公布WO 2009/006276，其内容以引用方式并入本文)。转基因T1种子通过黄色荧光进行选择，并且将T1种子紧邻着野生型种子种植并在水限制条件下生长。生长条件和成像分析如实施例16所述。发现用其中SS-DTP21-1由35S启动子直接表达的构建体转化的转基因拟南芥属植株是耐旱的。通过实施例16的方法测定的耐旱性评分是1.0。

实施例18

通过转化到拟南芥属中验证SS-DTP21-2

用以下方法测试编码SS-DTP21-2(SEQ ID NO：32)的候选基因赋予拟南芥属耐旱性的能力。

用紧接Invitrogen^TM Gateway

C1转化插入序列上游的1.3kb的35S启动子构建16.8kb的T-DNA基二元载体，称为pBC-yellow。该载体也包含RD29a启动子，该启动子驱动基因表达ZS-Yellow(Invitrogen^TM)，它赋予转化的种子黄色荧光。

从苏丹草的基因组DNA中通过RT-PCR扩增SS-DTP21-2蛋白编码区，所述RT-PCR使用以下引物：

●SS-DTP21-2-5′attB正向引物(SEQ ID NO：72)：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGGCCGAGAAGTACCACCATG

●SS-DTP21-2-3′attB反向引物(SEQ ID NO：73)：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTAGCGGTGCTCTAATTCCTTG

正向引物包含attB1序列(ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT；SEQ ID NO：69)，其邻近蛋白编码区的前22个核苷酸(以ATG起始密码子开头)。

反向引物包含attB2序列(ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT；SEQ ID NO：70)，该序列邻近蛋白编码区的反向互补序列的后22个核苷酸(以终止密码子的反向互补序列开头)。

使用INVITROGEN^TM GATEWAY

CLONASE^TM技术，与pDONR^TM/Zeo进行BP重组反应以生成入门克隆pDONR^TM/Zeo-SS-DTP21-2。然后包含定向克隆的PCR产物的pDONR^TM/Zeo-SS-DTP21-2入门克隆与目的载体pBC-yellow(SEQ IDNO：71；实施例17)进行LR连接反应。这允许迅速的和定向的克隆pBC中在35S启动子后的候选基因以制备35S启动子::SS-DTP21-2表达构建体，pBC-Yellow-SS-DTP21-2。

然后将35S启动子::SS-DTP21-2表达构建体导入野生型拟南芥属生态型Col-0，上述过程使用整株农杆菌属介导的转化方法(国际专利公布WO 2009/006276，其内容以引用方式并入本文)。转基因T1种子通过黄色荧光进行选择，并且将T1种子紧邻着野生型种子种植并在水限制条件下生长。生长条件和成像分析如实施例16所述。发现用其中SS-DTP21-2由35S启动子直接表达的构建体转化的转基因拟南芥属植株是耐旱的。通过实施例16的方法测定的耐旱性评分是2.2。

实施例19

稻中的SS-DTP21-1同源物耐旱性检测

通过如实施例3所述的农杆菌属介导的转化将实施例7中所述的SS-DTP21-1同源物导入Yukihikari品种稻。对于这些实验，编码基因组片段IS125的亚克隆Sub8中的SS-DTP21-1的区域被多个编码与SS-DTP21-1同源多肽的基因的蛋白编码区置换。检测转基因稻植株在T0代中的耐旱性。在实施例2中详述了耐旱性检测。八个同源物(SS-DTP21-5、SB-DTP21-4、SB-DTP21-5、SB-DTP21-6、SB-DTP21-9、SB-DTP21-10、SH-DTP21-1、SO-DTP21-1)的36、42或48个再生株中多于一个的转基因植株评分为2或更高，而非转基因的Yukihikari的42个再生株中无一如此(表21)。因此，这八个同源物中每一个均足以产生耐旱性转基因稻。

表21

用SS-DTP21-1同源物转化的T0再生株的耐旱性检测

¹转化中使用的DNA。

²测试再生株的总数。

³评分为2或更高的再生株数。

实施例20

用SS-DTP21-1转化的烟草品系的T1代的耐旱性检测

编码SS-DTP21-1的基因组片段IS125的亚片段Sub8的启动子区域被35S启动子如下置换。使用Pyrobest DNA聚合酶(TAKARA-BIO)的PCR利用Sub8质粒DNA作为模板并利用引物对SEQ ID NO：88(5′-ACCTTTTTATCCTCAAAGCTTCTTCTCAGA-3′)和SEQ ID NO：89(5′-ACCCCTGACCTCAATTGTCAAACACCAAGC-3′)进行，然后将PCR产物插入pCR4Blunt-TOPO(Invitrogen)。在确认PCR扩增区域的序列后，所得质粒用HindIII和MfeI消化以产生1.8kb的片段。在类似的方法中，使用pSB31(Ishida等人，1996，Nature Biotechnology14：745-750)质粒DNA作为模板并使用引物对SEQ ID NO：90(5′-GGGCGTCGTTCTGGGTCAATTGTTATAGAG-3′)和SEQ ID NO：91(5′-GGACGTTTTTAAGGTACCGAATTCCAATCC-3′)进行PCR，然后将所述PCR产物插入pCR4Blunt-TOPO，随后用KpnI和MfeI处理以产生1.4kb的片段。将两个片段(1.8kb和1.4kb的片段)插入已经用HindIII和KpnI消化过并且随后用CIAP(小牛肠碱性磷酸酶)预处理过的pSB200中。通过农杆菌属介导的转化将所得嵌合基因(在下文中称为“35S+Sub8”或“35S启动子::SS-DTP21-1构建体”，这些术语本文互换使用)导入烟草品种SR1中。检测转基因烟草植株在T1代中的耐旱性。

经基因修饰的植株和野生型植株在12cm罐中培养，并且仅有潮霉素抗性基因修饰植株用于耐旱性检测。在其中停止灌溉的干旱处理期间，使用Scanalyzer(LemnaTec GmbH)从顶部拍照并以像素数为单位测量叶片面积。统计学检查相对于在干旱处理第一天测得的叶片面积的叶片面积。野生型植株的叶片在干旱处理后快速萎缩，而九个T1品系中的其中一个甚至在干旱处理3天后保持叶片面积，如下表所示。这个品系为T1品系号9，它也与第6天的野生型植株的相对叶片面积在统计学上不同。因此包含35S启动子::SS-DTP21-1构建体的转基因烟草品系T1品系号9显然是耐旱的。

表22

叶片面积相对于第一天叶片面积的比率(％)

Claims (32)

1.在基因组中包含重组DNA构建体的植物，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列选自：

(a)编码具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中基于Clustal V比对方法，使用逐对比对默认参数KTUPLE＝1，GAP PENALTY＝3，WINDOW＝5以及DIAGONALS SAVED＝5，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：27、32、46、56、60、64、81、83、85或87进行比较时具有至少60％的序列同一性；

(b)编码具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列能够在严格条件下与包含SEQ ID NO：26、31、44、55、59、63、80、82、84或86的全长互补序列的DNA分子杂交；

(c)编码具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列通过选自删除、取代、添加和插入的至少一种方法改变一个或多个核苷酸而衍生自SEQ ID NO：26、31、44、55、59、63、80、82、84或86；

(d)编码多肽的核苷酸序列，其中所述多肽的氨基酸序列包含SEQID NO：27、32、46、56、60、64、81、83、85或87；和

(e)包含SEQ ID NO：26、31、44、55、59、63、80、82、84或86的核苷酸序列；

并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增强的耐旱性。

2.在基因组中包含重组DNA构建体的植物，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列选自：

(a)编码具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中基于Clustal V比对方法，使用逐对比对默认参数KTUPLE＝1，GAP PENALTY＝3，WINDOW＝5以及DIAGONALS SAVED＝5，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：27、32、46、56、60、64、81、83、85或87进行比较时具有至少80％的序列同一性；

(b)编码具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列能够在严格条件下与包含SEQ ID NO：26、31、44、55、59、63、80、82、84或86的全长互补序列的DNA分子杂交；

(c)编码具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列通过选自删除、取代、添加和插入的至少一种方法改变一个或多个核苷酸而衍生自SEQ ID NO：26、31、44、55、59、63、80、82、84或86；

(d)编码多肽的核苷酸序列，其中所述多肽的氨基酸序列包含SEQID NO：27、32、46、56、60、64、81、83、85或87；和

(e)包含SEQ ID NO：26、31、44、55、59、63、80、82、84或86的核苷酸序列；

并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出产量的提高。

3.权利要求3的植物，其中在水限制条件下，所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的所述对照植物进行比较时表现出所述产量的提高。

4.权利要求1、2或3中的任一项的植物，其中所述植物是单子叶植物或双子叶植物。

5.权利要求4的植物，其中所述植物选自：玉米、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉花、稻、大麦、粟、甘蔗、柳枝稷、烟草、马铃薯和甜菜。

6.增强植物耐旱性的方法，包括：

(a)将重组DNA构建体导入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列选自：

(i)编码具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中基于ClustalV比对方法，使用逐对比对默认参数KTUPLE＝1，GAP PENALTY＝3，WINDOW＝5以及DIAGONALS SAVED＝5，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：27、32、46、56、60、64、81、83、85或87进行比较时具有至少80％的序列同一性；

(ii)编码具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列能够在严格条件下与包含SEQ ID NO：26、31、44、55、59、63、80、82、84或86的全长互补序列的DNA分子杂交；

(iii)编码具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列通过选自删除、取代、添加和插入的至少一种方法改变一个或多个核苷酸而衍生自SEQ ID NO：26、31、44、55、59、63、80、82、84或86；

(iv)编码多肽的核苷酸序列，其中所述多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO：27、32、46、56、60、64、81、83、85或87；和

(v)包含SEQ ID NO：26、31、44、55、59、63、80、82、84或86的核苷酸序列；以及

(b)在步骤(a)之后，由所述可再生的植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体并且在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增强的耐旱性。

7.权利要求6的方法，还包括：

(c)获得来源于所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体并且在与不包含所述DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增强的耐旱性。

8.评价植物耐旱性的方法，包括：

(a)获得转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列选自：

(i)编码具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中基于ClustalV比对方法，使用逐对比对默认参数KTUPLE＝1，GAP PENALTY＝3，WINDOW＝5以及DIAGONALS SAVED＝5，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：27、32、46、56、60、64、81、83、85或87进行比较时具有至少80％的序列同一性；

(ii)编码具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列能够在严格条件下与包含SEQ ID NO：26、31、44、55、59、63、80、82、84或86的全长互补序列的DNA分子杂交；

(iii)编码具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列通过选自删除、取代、添加和插入的至少一种方法改变一个或多个核苷酸而衍生自SEQ ID NO：26、31、44、55、59、63、80、82、84或86；

(iv)编码多肽的核苷酸序列，其中所述多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO：27、32、46、56、60、64、81、83、85或87；和

(v)包含SEQ ID NO：26、31、44、55、59、63、80、82、84或86的核苷酸序列；以及

(b)获得来源于所述(a)的转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及

(c)评价所述子代植物与不包含所述重组DNA构建体的对照植物相比的耐旱性。

9.测定植物农学特性改变的方法，包括：

(a)获得转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列选自：

(i)编码具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中基于ClustalV比对方法，使用逐对比对默认参数KTUPLE＝1，GAP PENALTY＝3，WINDOW＝5以及DIAGONALS SAVED＝5，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：27、32、46、56、60、64、81、83、85或87进行比较时具有至少80％的序列同一性；

(ii)编码具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列能够在严格条件下与包含SEQ ID NO：26、31、44、55、59、63、80、82、84或86的全长互补序列的DNA分子杂交；

(iii)编码具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列通过选自删除、取代、添加和插入的至少一种方法改变一个或多个核苷酸而衍生自SEQ ID NO：26、31、44、55、59、63、80、82、84或86；

(iv)编码多肽的核苷酸序列，其中所述多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO：27、32、46、56、60、64、81、83、85或87；和

(v)包含SEQ ID NO：26、31、44、55、59、63、80、82、84或86的核苷酸序列；以及

(b)获得来源于所述步骤(a)的转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及

(c)测定所述子代植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

10.权利要求9的方法，其中所述至少一种农学性状是产量，并且进一步地，其中所述改变是提高。

11.权利要求9或10中的任一项的方法，其中所述测定步骤(c)包括在水限制条件下，测定所述转基因植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

12.权利要求6至11中的任一项的方法，其中所述植物是单子叶植物或双子叶植物。

13.权利要求12的方法，其中所述植物选自：玉米、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉花、稻、大麦、粟、甘蔗、柳枝稷、烟草、马铃薯和甜菜。

14.分离的多核苷酸，包含核苷酸序列，所述核苷酸序列选自：

(a)编码具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中基于Clustal V比对方法，使用逐对比对默认参数KTUPLE＝1，GAP PENALTY＝3，WINDOW＝5以及DIAGONALS SAVED＝5，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：27、32、46、56、60、64、81、83、85或87进行比较时具有至少60％的序列同一性；

(b)编码具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列能够在严格条件下与包含SEQ ID NO：26、31、44、55、59、63、80、82、84或86的全长互补序列的DNA分子杂交；

(c)编码具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列通过选自删除、取代、添加和插入的至少一种方法改变一个或多个核苷酸而衍生自SEQ ID NO：26、31、44、55、59、63、80、82、84或86；

(d)编码多肽的核苷酸序列，其中所述多肽的氨基酸序列包含SEQID NO：27、32、46、56、60、64、81、83、85或87；和

(e)包含SEQ ID NO：26、31、44、55、59、63、80、82、84或86的核苷酸序列。

15.分离的多核苷酸，包含权利要求14的核苷酸序列的全长互补序列，其中权利要求14的全长互补序列和核苷酸序列由相同数目的核苷酸组成并且是100％互补的。

16.权利要求14的多核苷酸，其中基于Clustal V比对方法，使用所述逐对比对默认参数，所述(a)部分的多肽具有的氨基酸序列在与SEQID NO：27、32、46、56、60、64、81、83、85或87进行比较时具有至少80％的序列同一性。

17.权利要求14的多核苷酸，其中基于Clustal V比对方法，使用所述逐对比对默认参数，所述(a)部分的多肽具有的氨基酸序列在与SEQID NO：27、32、46、56、60、64、81、83、85或87进行比较时具有至少85％的序列同一性。

18.权利要求14的多核苷酸，其中基于Clustal V比对方法，使用所述逐对比对默认参数，所述(a)部分的多肽具有的氨基酸序列在与SEQID NO：27、32、46、56、60、64、81、83、85或87进行比较时具有至少90％的序列同一性。

19.权利要求14的多核苷酸，其中基于Clustal V比对方法，使用所述逐对比对默认参数，所述(a)部分的多肽具有的氨基酸序列在与SEQID NO：27、32、46、56、60、64、81、83、85或87进行比较时具有至少95％的序列同一性。

20.重组DNA构建体，包含可操作地连接至少一种调控元件的权利要求14的分离的多核苷酸。

21.包含权利要求20的重组DNA构建体的细胞，其中所述细胞选自细菌细胞、酵母细胞、以及昆虫细胞和植物细胞。

22.包含权利要求20的重组DNA构建体的植物。

23.包含权利要求20的重组DNA构建体的种子。

24.分离由权利要求20的重组DNA构建体编码的多肽的方法，其中所述方法包括以下步骤：

(a)用权利要求20的重组DNA构建体转化细胞；

(b)在适于所述重组DNA构建体表达的条件下使所述步骤(a)的转化的细胞生长；以及

(c)从所述步骤(b)的转化的细胞中分离所述多肽。

25.分离的多肽，选自：

(a)具有耐旱活性的多肽，其中基于Clustal V比对方法，使用逐对比对默认参数KTUPLE＝1，GAP PENALTY＝3，WINDOW＝5以及DIAGONALS SAVED＝5，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQ IDNO：27、32、46、56、60、64、81、83、85或87进行比较时具有至少60％的序列同一性；

(b)具有耐旱活性的多肽，其中所述氨基酸序列通过选自删除、取代、添加和插入的至少一种方法改变一个或多个氨基酸而衍生自SEQ IDNO：27、32、46、56、60、64、81、83、85或87；和

(c)多肽，其中所述多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO：27、32、46、56、60、64、81、83、85或87。

26.权利要求25的多肽，其中基于Clustal V比对方法，使用所述逐对比对默认参数，所述(a)部分的多肽具有的氨基酸序列在与SEQ IDNO：27、32、46、56、60、64、81、83、85或87进行比较时具有至少80％的序列同一性。

27.权利要求25的多肽，其中基于Clustal V比对方法，使用所述逐对比对默认参数，所述(a)部分的多肽具有的氨基酸序列在与SEQ IDNO：27、32、46、56、60、64、81、83、85或87进行比较时具有至少85％的序列同一性。

28.权利要求25的多肽，其中基于Clustal V比对方法，使用所述逐对比对默认参数，所述(a)部分的多肽具有的氨基酸序列在与SEQ IDNO：27、32、46、56、60、64、81、83、85或87进行比较时具有至少90％的序列同一性。

29.权利要求25的多肽，其中基于Clustal V比对方法，使用所述逐对比对默认参数，所述(a)部分的多肽具有的氨基酸序列在与SEQ IDNO：27、32、46、56、60、64、81、83、85或87进行比较时具有至少95％的序列同一性。

30.包含权利要求14的多核苷酸的载体。

31.产生转基因植物的方法，包括用权利要求20的重组DNA构建体转化植物细胞，并且由所述转化的植物细胞再生转基因植物。

32.权利要求1至5中的任一项的植物的种子，其中所述种子在其基因组中包含重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，基于Clustal V比对方法，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：27、32、46、56、60、64、81、83、85或87进行比较时具有至少60％的序列同一性，并且其中由所述种子产生的植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出或者耐旱性的增强、或者产量的提高、或者两者皆有。

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