MX2012005099A - Plantas tolerantes a la sequia y constructores relacionados y metodos que implican genes que codifican polipeptidos dtp21. - Google Patents

Abstract

La presente invención describe polinucleótidos y polipéptidos aislados y constructos de AIJN recombinante útiles para conferir tolerancia a la sequía, composiciones (tales como plantas o semillas) que comprenden estos constructos de ADN recombinante y métodos que usan estos constructos de ADN recombinante. El constructo de ADN comprende un polinucleótido unido operativamente a un promotor funcional en una planta, en donde ese polinucleótido codifica un polipéptido DTP21.

Description

PLANTAS TOLERANTES A LA SEQUIA Y CONSTRUCTOS RELACIONADOS Y METODOS QUE IMPLICAN GENES QUE CODIFICAN POLIPEPTIDOS DTP21 CAMPO DE LA INVENCIÓN El campo de la invención se relaciona con el cultivo y la genética de plantas y, particularmente, se relaciona con constructos de ADN recombinante útiles en plantas para conferir tolerancia a la sequía.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El estrés abiótico es la causa principal de la pérdida de cultivos en el mundo lo que genera una pérdida promedio en la producción de más del 50 % para los cultivos principales (Boyer, J.S. (1982) Science 218:443-448; Bray, E.A. et al. (2000) en Biochemistry and Molecular Biology of Plants editado por Buchannan, B.B. et al., Amer. Soc . Plant Biol., págs . 1158-1249) . Entre los diversos estreses abióticos, la sequía es el factor principal que limita la productividad de los cultivos en todo el mundo. La exposición de las plantas a un ambiente con limitación de agua durante varias etapas de desarrollo parece activar diversos cambios fisiológicos y del desarrollo. La comprensión del mecanismo básico bioquímico y molecular para la percepción del estrés por sequía, la transducción y la tolerancia es un desafío principal en biología. Se ha publicado informes sobre los mecanismos moleculares de las respuestas al Ref . :230027 estrés abiótico y las redes de regulación genética de la tolerancia al estrés por sequía (Valliyodan, B., y Nguyen, H.T., (2006) Curr. Opin. Plant Biol . 9:189-195; Wang, W. , et al. (2003) Planta 218:1-14); Vinocur, B., y Altman, A. (2005) Curr. Opin. Biotechnol . 16:123-132; Chaves, M.M., y Oliveira, M. . (2004) J. Esp. Bot . 55:2365-2384; Shinozaki, K. , et al. (2003) Curr. Opin. Plant Biol. 6:410-417; Yamaguchi-Shinozaki , K. , y Shinozaki, K. (2005) Trends Plant Sci. 10:88-94).

Se conoce que las respuestas al estrés abiótico varían significativamente entre especies de plantas y entre variedades y cultivares dentro de una especie de planta. Ciertas especies, variedades o cultivares son más tolerantes que otras al estrés abiótico, tal como la sequía. Los genotipos de estas plantas constituyen interesantes fuentes de genes implicados en respuestas únicas al estrés abiótico. A la fecha se han realizado muchos intentos para identificar genes de respuesta al estrés y para expresarlos en plantas transgénicas . Sin embargo, frecuentemente, los genes de respuesta al estrés introducidos en plantas no se expresan adecuadamente. Las razones para que no se expresen adecuadamente pueden incluir la elección inapropiada de promotores y/u otros elementos reguladores y la destrucción de la estructura exón-intrón. La introducción de un segmento genómico de la planta que retiene el promotor nativo, una región codificante completa y una estructura exón-intrón intacta en las plantas puede ser un método eficaz para que un gen foráneo de respuesta al estrés se exprese adecuadamente. Por ejemplo, se reportó que la expresión de una enzima implicada en la fotosíntesis fue mucho más alta a partir de un clon genómico que de un clon de ADNc correspondiente en el arroz (Ku et al. Nature Biotechnol . 17:76-80, 1999).

Recientemente, se desarrolló un método para analizar eficazmente fragmentos de ADN genómico capaces de proporcionar plantas con una variación fenotípica ventajosa para la agricultura (publicación de patente de los Estados Unidos núm. US2008/0301832A1) . En este método, las plantas se transforman con fragmentos genómicos de una genoteca genómica construida a partir de una planta superior, y las plantas transgénicas resultantes se analizan para determinar una variación fenotípica ventajosa para la agricultura. Las plantas resultantes podrían analizarse para identificar una respuesta única al estrés abiótico, tal como tolerancia a la sequía y, eventualmente, para identificar un fragmento genómico que puede portar un gen de respuesta al estrés que se expresa fácilmente en plantas. Para identificar un gen de respuesta única al estrés y usar este gen en plantas transgénicas se requiere una experimentación considerable. Algunos de los diversos factores que se deben considerar incluyen los siguientes: la elección de una planta a partir de la cual se construye una genoteca genómica; la forma en que se analizan las plantas transgénicas ; la forma en que se examinan los fragmentos genómicos y la forma en que se localiza, caracteriza y usa el gen de respuesta al estrés.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención incluye: En una modalidad se describe una planta que comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operativamente a por lo menos un elemento regulador, en donde ese polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: (a) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de tolerancia a la sequía, en donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos 60 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % basada en el método de alineamiento Clustal V con parámetros predeterminados para alineamientos en pares de KTUPLE=1, PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN=3 , VENTANA=5 y DIAGONALES GUARDADAS=5 cuando se compara con las sec. con núms . de ident.:27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 u 87; (b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de tolerancia a la sequía, en donde la secuencia de nucleótidos es hibridable en condiciones rigurosas con una molécula de ADN que comprende el complemento completo de las sec. con núms. de ident.:26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 u 86; (c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de tolerancia a la sequía, en donde la secuencia de nucleótidos se deriva de las sec . con núms . de ident.:26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 u 86 por la alteración de uno o más nucleótidos por medio de al menos un método seleccionado del grupo que consiste en: deleción, sustitución, adición e inserción; (d) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido, en donde la secuencia de aminoácidos del polipéptido comprende las sec. con núms. de ident.:27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 u 87; y (e) una secuencia de nucleótidos que comprende las sec. con núms. de ident.:26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 u 86; y en donde esa planta exhibe una mayor tolerancia a la sequía cuando se compara con una planta de control que no comprende ese constructo de ADN recombinante . La planta puede ser monocotiledónea o dicotiledónea .

En otra modalidad se describe una planta que comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operativamente a por lo menos un elemento regulador, en donde ese polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: (a) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de tolerancia a la sequía, en donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos 60 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % basada en el método de alineamiento Clustal V con parámetros predeterminados para alineamientos en pares de KTUPLE=1, PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN=3 , VENTA A=5 y DIAGONALES GUARDADAS=5 cuando se compara con las sec. con núms . de ident.:27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 u 87; (b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de tolerancia a la sequía, en donde la secuencia de nucleótidos es hibridable en condiciones rigurosas con una molécula de ADN que comprende el complemento completo de las sec. con núms. de ident. : 26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 u 86; (c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de tolerancia a la sequía, en donde la secuencia de nucleótidos se deriva de las sec. con núms. de ident.: 26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 u 86 por la alteración de uno o más nucleótidos por medio de al menos un método seleccionado del grupo que consiste en: deleción, sustitución, adición e inserción; (d) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido, en donde la secuencia de aminoácidos del polipéptido comprende las sec. con núms. de ident. :27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 u 87; y (e) una secuencia de nucleótidos que comprende las sec. con núms. de ident.: 26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 u 86; y en donde esa planta exhibe un aumento en la producción cuando se compara con una planta de control que no comprende ese constructo de ADN recombinante . La planta puede exhibir ese aumento en la producción cuando se compara, en condiciones de limitación de agua, con esa planta de control que no comprende ese constructo de ADN recombinante . La planta puede ser monocotiledónea o dicotiledónea.

En otra modalidad se describe un método para aumentar la tolerancia a la sequía en una planta; el método comprende: (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operativamente a por lo menos un elemento regulador, en donde ese polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de tolerancia a la sequía, en donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos 60 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % basada en el método de alineamiento Clustal V con parámetros predeterminados para alineamientos en pares de KTUPLE=1, PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN=3 , VENTANA=5 y DIAGONALES GUARDADAS=5 cuando se compara con las sec . con núms . de ident.:27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 u 87; (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de tolerancia a la sequía, en donde la secuencia de nucleótidos es hibridable en condiciones rigurosas con una molécula de ADN que comprende el complemento completo de las sec. con núms. de ident.:26, 31, 44, . 55, 59, 63, 80, 82, 84 u 86; (iii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de tolerancia a la sequía, en donde la secuencia de nucleótidos se deriva de las sec . con núms. de ident.:26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 u 86 por la alteración de uno o más nucleótidos por medio de al menos un método seleccionado del grupo que consiste en: deleción, sustitución, adición e inserción; (iv) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido, en donde la secuencia de aminoácidos del polipéptido comprende las sec. con núms. de ident.:27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 u 87; y (v) una secuencia de nucleótidos que comprende las sec. con núms. de ident.:26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 u 86; y (b) regenerar una planta transgénica de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante y exhibe una mayor tolerancia a la sequía cuando se compara con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante . El método también puede comprender: (c) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde esa planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante y exhibe una mayor tolerancia a la sequía cuando se compara con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante.

En otra modalidad se describe un método para evaluar la tolerancia a la sequía en una planta; el método comprende: (a) obtener una planta transgénica, en donde la planta transgénica comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operativamente a por lo menos un elemento regulador, en donde ese polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de tolerancia a la sequía, en donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos 60 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % basada en el método de alineamiento Clustal V con parámetros predeterminados para alineamientos en pares de KTUPLE=1, PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN=3 , VENTA A=5 y DIAGONALES GUARDADAS=5 cuando se compara con las sec . con núms. de ident.:27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 u 87; (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de tolerancia a la sequía, en donde la secuencia de nucleótidos es hibridable en condiciones rigurosas con una molécula de ADN que comprende el complemento completo de las sec. con núms. de ident . : 26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 u 86; (iii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de tolerancia a la sequía, en donde la secuencia de nucleótidos se dériva de las sec. con núms. de ident.: 26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 u 86 por la alteración de uno o más nucleótidos por medio de al menos un método seleccionado del grupo que consiste en: deleción, sustitución, adición e inserción; (iv) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido, en donde la secuencia de aminoácidos del polipéptido comprende las sec. con núms . de ident. : 27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 u 87; y (v) una secuencia de nucleótidos que comprende las sec. con núms. de ident.: 26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 u 86; y (b) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica de (a) , en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante ; y (c) evaluar la planta progenie para determinar la tolerancia a la sequía por comparación con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante .

En otra modalidad se describe un método para determinar una alteración de una característica agronómica en una planta; el método comprende: (a) obtener una planta transgénica, en donde la planta transgénica comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operativamente a por lo menos un elemento regulador, en donde ese polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de tolerancia a la sequía, en donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos 60 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 ¾ o 100 % basada en el método de alineamiento Clustal V con parámetros predeterminados para alineamientos en pares de KTUPLE=1, PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN=3 , VENTA A=5 y DIAGONALES GUARDADAS=5 cuando se compara con las sec. con núms . de ident . : 27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 u 87; (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de tolerancia a la sequía, en donde la secuencia de nucleótidos es hibridable en condiciones rigurosas con una molécula de ADN que comprende el complemento completo de las sec. con núms. de ident.: 26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 u 86; (iii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de tolerancia a la sequía, en donde la secuencia de nucleótidos se deriva de las sec. con núms. de ident.: 26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 u 86 por la alteración de uno o más nucleótidos por medio de al menos un método seleccionado del grupo que consiste en: deleción, sustitución, adición e inserción; (iv) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido, en donde la secuencia de aminoácidos del polipéptido comprende las sec. con núms. de ident.: 27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 u 87; y (v) una secuencia de nucleótidos que comprende las sec. con núms. de ident.: 26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 u 86; y (b) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica de la etapa (a) , en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante ; y (c) determinar si la planta progenie exhibe una alteración de al menos una característica agronómica cuando se compara con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante . Esa etapa de determinación (c) puede comprender determinar si la planta transgénica exhibe una alteración de al menos una característica agronómica cuando se compara, en condiciones de limitación de agua, con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante . Ese al menos un rasgo agronómico puede ser la producción y, además, puede ser un aumento en la producción.

En otra modalidad se describe un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: (a) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de tolerancia a la sequía, en donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos 60 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % basada en el método de alineamiento Clustal V con parámetros predeterminados para alineamientos en pares de KTUPLE=1, PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN=3 , VENTANA=5 y DIAGONALES GUARDADAS=5 cuando se compara con las sec. con núms. de ident . : 27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 u 87; (b) uña secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de tolerancia a la sequía, en donde la secuencia de nucleótidos es hibridable en condiciones rigurosas con una molécula de ADN que comprende el complemento completo de las sec. con núms . de ident . : 26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 u 86; (c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de tolerancia a la sequía, en donde la secuencia de nucleótidos se deriva de las sec. con núms. de ident.: 26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 u 86 por la alteración de uno o más nucleótidos por medio de al menos un método seleccionado del grupo que consiste en: deleción, sustitución, adición e inserción; (d) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido, en donde la secuencia de aminoácidos del polipéptido comprende las sec. con núms. de ident.: 27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 u 87; y (e) una secuencia de nucleótidos que comprende las sec. con núms. de ident.: 26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 u 86.

En otra modalidad se describe un polinucleótido aislado que comprende el complemento completo de la secuencia de nucleótidos de la invención, en donde el complemento completo y la secuencia de nucleótidos de la invención consisten del mismo número de nucleótidos y son 100 % complementarios.

En otra modalidad se describe un constructo de ADN recombinante que comprende el polinucleótido aislado de la invención unido operativamente a por lo menos un elemento regulador .

En otra modalidad se describe una célula que comprende el constructo de ADN recombinante de la invención, en donde la célula se selecciona del grupo que consiste en una célula bacteriana, una célula de levadura y una célula de insectos y una célula vegetal.

En otra modalidad se describe una planta o una semilla que comprende el constructo de ADN recombinante de la invención. La planta o semilla puede ser una planta o semilla monocotiledónea o dicotiledónea.

En otra modalidad se describe un método para aislar un polipéptido codificado por el constructo de ADN recombinante de la invención, en donde el método comprende lo siguiente: (a) transformar una célula con el constructo de ADN recombinante de la invención; (b) cultivar la célula transformada de la etapa (a) en condiciones adecuadas para la expresión del constructo de ADN recombinante; y (c) aislar el polipéptido de la célula transformada de la etapa (b) .

En otra modalidad se describe un polipéptido aislado seleccionado del grupo que consiste en: (a) un polipéptido con actividad de tolerancia a la sequía, en donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos 60 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % basada en el método de alineamiento Clustal V con parámetros predeterminados para alineamientos en pares de KTUPLE=1, PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN=3 , VENTANA=5 y DIAGONALES GUARDADAS=5 cuando se compara con las sec. con núms . de ident . : 27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 u 87; (b) un polipéptido con actividad de tolerancia a la sequía, en donde la secuencia de aminoácidos se deriva de las sec. con núms. de ident . : 27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 u 87 por la alteración de uno o más aminoácidos por medio de al menos un método seleccionado del grupo que consiste en: deleción, sustitución, adición e inserción; y (c) un polipéptido en donde la secuencia de aminoácidos del polipéptido comprende las sec. con núms. de ident.: 27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 u 87.

En otra modalidad se describe un vector que comprende el polinucléótido de la invención.

En otra modalidad se describe un método para producir una planta transgénica que comprende transformar una célula vegetal con el constructo de ADN recombinante de la invención y regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal transformada.

En otra modalidad, la presente invención incluye cualquiera de las plantas de la presente invención, en donde la planta se selecciona del grupo que consiste en: maíz, frijol de soja, girasol, sorgo, cañóla, trigo, alfalfa, algodón, arroz, cebada, mijo, caña de azúcar, pasto aguja, tabaco, papa y remolacha azucarera.

En otra modalidad, la presente invención incluye cualquiera de los métodos de la presente invención, en donde la planta se selecciona del grupo que consiste en: maíz, frijol de soja, girasol, sorgo, cañóla, trigo, alfalfa, algodón, arroz, cebada, mijo, caña de azúcar, pasto aguja, tabaco, papa y remolacha azucarera.

En otra modalidad, la presente invención incluye la semilla de cualquiera de las plantas de la presente invención, en donde esa semilla comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operativamente a por lo menos un elemento regulador, en donde ese polinucleótido codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos 60 % basada en el método de alineamiento Clustal V cuando se compara con las sec. con núms. de ident . : 27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 u 87, y en donde una planta producida a partir de esa semilla exhibe una mayor tolerancia a la sequía o un aumento en la producción, o ambos, cuando se compara con una planta de control que no comprende ese constructo de ADN recombinante.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La invención se puede comprender mejor con la siguiente descripción detallada y las figuras acompañantes y listado de secuencias, los cuales forman parte de esta solicitud.

La Figura 1 muestra la posición y la secuencia de los pares de iniciadores de PCR usados para genotipar el arroz transformado con el fragmento genómico IS125.

La Figura 2 muestra las distintas regiones del fragmento genómico IS125 que se subclonaron en arroz para definir la región responsable del fenotipo tolerante a la sequía.

La Figura 3 muestra la estructura del gen tolerante a la sequía que codifica el polipéptido SS-DTP21-1 de 209 aminoácidos .

Las Figuras 4A - 4E presentan un alineamiento de las secuencias de aminoácidos de polipéptidos DTP21 indicados en las sec. con núms . de ident.: 27, 32, 41, 42, 45, 46, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 79, 81, 83, 85 y 87. Los residuos que son diferentes al residuo de la sec. con núm. de ident.: 27 en una posición determinada están marcados con un recuadro. Se presenta una secuencia consenso en donde se muestra un residuo si es idéntico en todas las secuencias; de lo contrario, se muestra un punto.

La Figura 5 presenta los valores porcentuales de identidades y divergencia de secuencias para cada par de secuencias presentado en las Figuras 4A - 4E.

Las Figuras 6A - 6B muestran una evaluación de líneas de maíz derivadas de Gaspe Flint individuales transformadas con PHP29675.

Las Figuras 7A - 7B muestran una evaluación resumida de las líneas de maíz derivadas de Gaspe Flint transformadas con PHP29675.

BREVE DESCRIPCIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIAS La sec. con núm. de ident. :1 es la secuencia de nucleótidos de un fragmento de ADN recombinante que contiene el fragmento genómico IS125 en las posiciones de los nucleótidos 10 - 40049.

La sec . con núm. de ident.:2 es la secuencia de nucleótidos del iniciador directo para el par de iniciadores MI de la Figura 1.

La sec. con núm. de ident . :3 es la secuencia de nucleótidos del iniciador inverso para el par de iniciadores MI de la Figura 1.

La sec. con núm. de ident. :4 es la secuencia de nucleótidos del iniciador directo para el par de iniciadores M2 de la Figura 1.

La sec. con núm. de ident. : 5 es la secuencia de nucleótidos del iniciador inverso para el par de iniciadores M2 de la Figura 1.

La sec. con núm. de ident. :6 es la secuencia de nucleótidos del iniciador directo para el par de iniciadores M3 de la Figura 1.

La sec. con núm. de ident. :7 es la secuencia de nucleótidos del iniciador inverso para el par de iniciadores M3 de la Figura 1.

La sec. con núm. de ident. :8 es la secuencia de nucleótidos del iniciador directo para el par de iniciadores M4 de la Figura 1.

La sec. con núm. de ident. :9 es la secuencia de nucleótidos del iniciador inverso para el par de iniciadores M4 de la Figura 1.

La sec . con núm. de ident.:10 es la secuencia de nucleótidos del iniciador directo para el par de iniciadores M5 de la Figura 1.

La sec. con núm. de ident.:ll es la secuencia de nucleótidos del iniciador inverso para el par de iniciadores M5 de la Figura 1.

La sec. con núm. de ident . : 12 es la secuencia de nucleótidos del iniciador directo para el par de iniciadores M6 de la Figura 1.

La sec. con núm. de ident.: 13 es la secuencia de nucleótidos del iniciador inverso para el par de iniciadores M6 de la Figura 1.

La sec. con núm. de ident. : 14 es la secuencia de nucleótidos del iniciador directo para el par de iniciadores M-hpt de la Figura 1.

La sec. con núm. de ident. :15 es la secuencia de nucleótidos del iniciador inverso para el par de iniciadores M-hpt de la Figura 1.

La sec. con núm. de ident..-16 es la secuencia de nucleótidos del iniciador directo para producir el fragmento Sub8.

La sec. con núm. de ident.: 17 es la secuencia de nucleótidos del iniciador inverso para producir el fragmento Sub8.

La sec. con núm. de ident.:18 es la secuencia de nucleótidos del iniciador directo para producir el fragmento Sub7.

La sec. con núm. de ident.:19 es la secuencia de nucleótidos del iniciador inverso para producir el fragmento Sub7.

La sec. con núm. de ident.:20 es la secuencia de nucleótidos del iniciador directo para la RT-PC de los transcritos codificados por el fragmento Sub7.

La sec. con núm. de ident.:21 es la secuencia de nucleótidos del iniciador inverso para la RT-PCR de los transcritos codificados por el fragmento Sub7.

La sec. con núm. de ident.:22 es la secuencia de nucleótidos de un iniciador inicial usado para la amplificación rápida (RACE, por sus siglas en inglés) de los extremos 5' del transcrito que codifica SS-DTP21-1.

La sec. con núm. de ident.:23 es la secuencia de nucleótidos de un iniciador anidado usado para la amplificación rápida (RACE) de los extremos 5' del transcrito que codifica SS-DTP21-1.

La sec. con núm. de ident.:24 es la secuencia de nucleótidos de un iniciador inicial usado para la amplificación rápida (RACE) de los extremos 3 'del transcrito que codifica SS-DTP21-1.

La sec. con núm. de ident.:25 es la secuencia de nucleótidos de un iniciador anidado usado para la amplificación rápida (RACE) de los extremos 3' del transcrito que codifica SS-DTP21-1.

La sec . con núm. de ident.:26 es la secuencia de nucleótidos dentro del fragmento genómico IS125 que codifica el polipéptido SS-DTP21-1.

La sec. con núm. de ident.:27 es la secuencia de aminoácidos del polipéptido SS-DTP21-1 codificado por la sec. con núm. de ident . :26.

La sec. con núm. de ident. :28 es la secuencia de nucleótidos del iniciador directo para la RT-PCR de los transcritos codificados por el fragmento Sub5 (Tabla 17) .

La sec. con núm. de ident. :29 es la secuencia de nucleótidos del iniciador inverso para la RT-PCR de los transcritos codificados por el fragmento Sub5 (Tabla 17) .

La sec. con núm. de ident. :30 es la secuencia de nucleótidos de un fragmento de ADN recombinante que contiene el fragmento genómico IS127 en las posiciones de los nucleótidos 3075 - 37662.

La sec. con núm. de ident. :31 es la secuencia de nucleótidos de la región del fragmento genómico IS127 que codifica el polipéptido SS-DTP21-2, un polipéptido con secuencias homologas a SS-DTP21-1.

La sec. con núm. de ident. :32 es la secuencia de aminoácidos del polipéptido SS-DTP21-2 codificado por la sec . con núm. de ident.:31.

La sec. con núm. de ident.:33 es la secuencia de nucleótidos del iniciador directo usado para amplificar la región que codifica SS-DTP21-2.

La sec. con núm. de ident.:34 es la secuencia de nucleótidos del iniciador inverso usado para amplificar la región que codifica SS-DTP21-2.

La sec. con núm. de ident.:35 es la secuencia de nucleótidos del iniciador directo usado para preparar un vector linealizado para clonar regiones de Sorghum bicolor que codifican polipéptidos homólogos a SS-DTP21-1.

La sec. con núm. de ident.:36 es la secuencia de nucleótidos del iniciador inverso usado para preparar un vector linealizado para clonar regiones de Sorghum bicolor que codifican polipéptidos homólogos a SS-DTP21-1.

La sec. con núm. de ident.:37 es la secuencia de nucleótidos del iniciador directo usado para amplificar regiones de Sorghum bicolor (sorgo dorado) que codifican polipéptidos homólogos a SS-DTP21-1.

La sec. con núm. de ident.:38 es la secuencia de nucleótidos del iniciador inverso usado para amplificar regiones de Sorghum bicolor que codifican polipéptidos homólogos a SS-DTP21-1.

La sec. con núm. de ident.:39 es la secuencia de nucleótidos de Sorghum bicolor (sorgo dorado) que codifica SB-DTP21-1, un polipéptido homólogo a SS-DTP21-1 del pasto Sudán.

La sec . con núm. de ident . : 40 es la secuencia de nucleótidos de Sorghum bicolor (sorgo dorado) que codifica SB-DTP21-2, un polipéptido homólogo a SS-DTP21-1 de pasto Sudán.

La sec. con núm. de ident. :41 es la secuencia de aminoácidos del polipéptido SB-DTP21-1 de Sorghum bicolor (sorgo dorado) codificado por la sec. con núm. de ident. :39.

La sec. con núm. de ident. :42 es la secuencia de aminoácidos del polipéptido SB-DTP21-2 de Sorghum bicolor (sorgo dorado) codificado por la sec. con núm. de ident. :40.

La sec. con núm. de ident. :43 es la secuencia de nucleótidos de Sorghum bicolor (B35) que codifica SB-DTP21- 3, un polipéptido homólogo a SS-DTP21-1 de pasto Sudán.

La sec. con núm. de ident. :44 es la secuencia de nucleótidos de Sorghum bicolor (B35) que codifica SB-DTP21- 4, un polipéptido homólogo a SS-DTP21-1 de pasto Sudán.

La sec. con núm. de ident. :45 es la secuencia de aminoácidos del polipéptido SB-DTP21-3 de Sorghum bicolor (B35) codificado por la sec. con núm. de ident. :43.

La sec. con núm. de ident. :46 es la secuencia de aminoácidos del polipéptido SB-DTP21-4 de Sorghum bicolor (B35) codificado por la sec. con núm. de ident. :44.

La sec. con núm. de ident. :47 es la secuencia de nucleótidos de las posiciones 24904 a 25530 del número de registro del NCBI 124359063 para el clon del Sorghum bicolor SB_BBc0073F19.

La sec. con núm. de ident.:48 es la secuencia de nucleótidos de las posiciones 44114 a 44740 del número de registro del NCBI 124359064 para el clon del Sorghum bicolor SB_BBc0109L12.

La sec. con núm. de ident.:49 es la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por la sec. con núm. de ident.:47, y es homologa al polipéptido SS-DTP21-1.

La sec. con núm. de ident.:50 es la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por la sec. con núm. de ident.:48, y es homologa al polipéptido SS-DTP21-1; sin embargo, esta traducción incluye dos codones de terminación en el marco.

La sec. con núm. de ident.:51 es la secuencia de nucleótidos de pasto Sudán que codifica SS-DTP21-3, un polipéptido homólogo a SS-DTP21-1.

La sec. con núm. de ident.:52 es la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por la sec. con núm. de ident . : 51.

La sec. con núm. de ident. :53 es la secuencia de nucleótidos de pasto Sudán que codifica SS-DTP21-4, un polipéptido homólogo a SS-DTP21-1.

La sec. con núm. de ident .: 54 es la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por la sec. con núm. de ident . : 53.

La sec . con núm. de ident.:55 es la secuencia de nucleótidos de pasto Sudán que codifica SS-DTP21-5, un polipéptido homólogo a SS-DTP21-1.

La sec. con núm. de ident.:56 es la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por la sec. con núm. de ident . : 55.

La sec. con núm. de ident. -.57 es la secuencia de nucleótidos de pasto Sudán que codifica SS-DTP21-7, un polipéptido homólogo a SS-DTP21-1.

La sec. con núm. de ident.: 58 es la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por la sec. con núm. de ident . : 57.

La sec. con núm. de ident.: 59 es la secuencia de nucleótidos de pasto Johnson que codifica SH-DTP21-1, un polipéptido homólogo a SS-DTP21-1.

La sec. con núm. de ident.: 60 es la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por la sec. con núm. de ident . : 59.

La sec. con núm. de ident.: 61 es la secuencia de nucleótidos de pasto Johnson que codifica SH-DTP21-2, un polipéptido homólogo a SS-DTP21-1.

La sec. con núm. de ident. -.62 es la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por la sec. con núm. de ident . : 61.

La sec. con núm. de ident . : 63 es la secuencia de nucleótidos de caña de azúcar que codifica S0-DTP21-1, un polipéptido homólogo a SS-DTP21-1.

La sec. con núm. de ident.:64 es la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por la sec. con núm. de ident . : 63.

La sec. con núm. de ident.: 65 es la secuencia de nucleótidos de caña de azúcar que codifica SO-DTP21-2, un polipéptido homólogo a SS-DTP21-1.

La sec. con núm. de ident.: 66 es la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por la sec. con núm. de ident . : 65.

La sec. con núm. de ident.: 67 es la secuencia de nucleótidos del iniciador directo SS-DTP21-1-5 ' attB que contiene la secuencia attBl que se usa para amplificar la región codificante de proteínas SS-DTP21-1.

La sec. con núm. de ident. : 68 es la secuencia de nucleótidos del iniciador inverso SS-DTP21-1-3 ' attB que contiene la secuencia attB2 que se usa para amplificar la región codificante de proteínas SS-DTP21-1.

La sec. con núm. de ident.: 69 es la secuencia de nucleótidos del sitio attBl.

La sec. con núm. de ident.: 70 es la secuencia de nucleótidos del sitio attB2.

La sec. con núm. de ident.: 71 es la secuencia de nucleótidos de pBC-amarillo, un vector de destino para usar con Arabidopsis .

La sec . con núm. de ident.:72 es la secuencia de nucleótidos del iniciador directo SS-DTP21-2-5 ' attB que contiene la secuencia attBl que se usa para amplificar la región codificante de proteínas SS-DTP21-2.

La sec. con núm. de ident.:73 es la secuencia de nucleótidos del iniciador inverso SS-STP21-2-3 ' attB que contiene la secuencia attB2 que se usa para amplificar la región codificante de proteínas SS-DTP21-2.

La sec. con núm. de ident.:74 es la secuencia de nucleótidos del iniciador de extremos 5' GENERACER™ .

La sec. con núm. de ident.:75 es la secuencia de nucleótidos del iniciador anidado de extremos 5' GENERACER™.

La sec. con núm. de ident.:76 es la secuencia de nucleótidos del iniciador de extremos 3' GENERACER™.

La sec. con núm. de ident.:77 es la secuencia de nucleótidos del iniciador anidado de extremos 3' GENERACER™.

La sec. con núm. de ident.:78 es la secuencia de nucleótidos de pasto Sudán que codifica SS-DTP21-6, un polipéptido homólogo a SS-DTP21-1.

La sec. con núm. de ident.:79 es la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por la sec. con núm. de ident . : 78.

La sec. con núm. de ident. :80 es la secuencia de nucleótidos de Sorghum bicolor (sorgo dorado) que codifica SB-DTP21-5, un polipéptido homólogo a SS-DTP21-1.

La sec. con núm. de ident.:81 es la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por la sec. con núm. de ident.:80.

La sec. con núm. de ident.:82 es la secuencia de nucleótidos de Sorghum- bicolor (B35) que codifica SB-DTP21-6, un polipéptido homólogo a SS-DTP21-1.

La sec. con núm. de ident. :83 es la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por la sec. con núm. de ident.: 82.

La sec. con núm. de ident. :84 es la secuencia de nucleótidos de Sorghum bicolor (hoki) que codifica SB-DTP21-9, un polipéptido homólogo a SS-DTP21-1.

La sec. con núm. de ident.: 85 es la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por la sec. con núm. de ident.: 84.

La sec. con núm. de ident.: 86 es la secuencia de nucleótidos de Sorghum bicolor (hoki) que codifica SB-DTP21-10, un polipéptido homólogo a SS-DTP21-1.

La sec. con núm. de ident.: 87 es la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por la sec. con núm. de ident.: 86.

La sec. con núm. de ident. :88 es la secuencia de nucleótidos de un primer iniciador usado para amplificar una región de ADN plasmídico de Sub8 en el Ejemplo 20.

La sec. con núm. de ident.: 89 es la secuencia de nucleótidos de un segundo iniciador usado para amplificar una región de ADN plasmídico de Sub8 en el Ejemplo 20.

La sec. con núm. de ident.: 90 es la secuencia de nucleótidos de un primer iniciador usado para amplificar una región de ADN plasmídico de pSB31 (Ishida et al. 1996, Nature Biotechnology 14:745-750) en el Ejemplo 20.

La sec. con núm. de ident. :91 es la secuencia de nucleótidos de un segundo iniciador usado para amplificar una región de ADN plasmídico de pSB31 en el Ejemplo 20.

Las descripciones y el listado de secuencias adjuntos a la presente cumplen las reglas que determinan las descripciones de secuencias de nucleótidos y/o de aminoácidos en solicitudes de patente como se describe en 37 C.F.R. §1.8211.825.

El listado de secuencias contiene el código de una sola letra para los caracteres de la secuencia de nucleótidos y los códigos de tres letras para aminoácidos como se define de conformidad con los estándares de IUPAC-IUBMB descritos en Nucleic Acids Res. 23:30213030 (1985) y en Biochemical J. 219 (núm. 2) :345373 (1984) que se incorporan en la presente descripción como referencia. Los símbolos y el formato que se usan para los datos de las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos cumplen con las reglas que se describen en el Título 37 del C.F.R. , §1.822.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La descripción de cada referencia indicada en la presente descripción se incorpora como referencia en su totalidad.

Como se usa en la presente descripción y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno/una" y "el/la" incluyen la referencia del plural a menos que el contexto claramente indique lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "una planta" incluye una pluralidad de tales plantas, la referencia a "una célula" incluye una o más células y los equivalentes de estas que conoce un experimentado en la técnica, etc.

Como se usa en la presente descripción: "Fragmento genómico IS125" se refiere a un fragmento de ADN genómico de Sorghum sudanense cv. Sugar Slim (pasto Sudán) que al transformarse proporciona al cultivar de arroz Yukihikari un fenotipo tolerante a la sequía. "Polipéptido SS-DTP21-1" se refiere a un polipéptido de 209 aminoácidos codificado por el fragmento genómico IS125 y que es una proteína candidato tolerante a la sequía.

"Fragmento genómico IS127" se refiere a un fragmento de ADN genómico de Sorghum sudanense cv. Sugar Slim (pasto Sudán) que al transformarse proporciona al cultivar de arroz Yukihikari un fenotipo tolerante a la sequía. El "polipéptido SS-DTP21-2" se refiere a un polipéptido de 209 aminoácidos codificado por el fragmento genómico IS127 que es altamente homólogo a la proteína candidato tolerante a la sequía SS-DTP21-1.

"Polipéptido SB-DTP21-1" y "polipéptido SB-DTP21-2" se refieren a dos polipéptidos codificados por ADN genómico de Sorghu bicolor (sorgo dorado) , cada uno de los cuales es altamente homólogo al polipéptido SS-DTP21-1.

"Polipéptido SB-DTP21-3" y "polipéptido SB-DTP21-4" se refieren a dos polipéptidos codificados por ADN genómico de Sorghum bicolor (B35), cada uno de los cuales es altamente homólogo al polipéptido SS-DTP21-1.

"Polipéptido DTP21" se refiere a una proteína con secuencias homologas a SS-DTP21-1 y que al transformarse puede transmitir al cultivar de arroz Yukihikari y/o a otras especies o cultivares de plantas un fenotipo tolerante a la sequía. Los términos "polipéptido DTP21" y "proteína DTP21" se usan indistintamente en la presente descripción.

La "actividad de tolerancia a la sequía" de un polipéptido indica que la sobreexpresión del polipéptido en una planta transgénica confiere a la planta transgénica una mayor tolerancia a la sequía en comparación con una planta de referencia o de control .

Los términos "monocotiledónea" y "planta monocotiledóneailedónea" se usan indistintamente en la presente descripción. Una monocotiledónea de la presente invención incluye las gramíneas.

Los términos "dicotiledónea" y "planta dicotiledónea" se usan indistintamente en la presente descripción. Una dicotiledónea de la presente invención incluye las familias siguientes: Brassicaceae , Leguminosae y Solanaceae.

Los términos "complemento total" y "complemento de longitud total" se usan indistintamente en la presente descripción, y se refieren a un complemento de una secuencia de nucleótidos determinada, en donde el complemento y la secuencia de nucleótidos consisten en el mismo número de nucleótidos y son 100 % complementarios.

"Arabidopsis" y "Arabidopsis thaliana" se usan indistintamente en la presente descripción, a menos que se indique de cualquier otra forma.

Un "marcador de secuencia expresada" ( "EST" , por sus siglas en inglés) es una secuencia de ADN derivada de una biblioteca de ADNc y, por lo tanto, es una secuencia que ha sido transcrita. Un EST se obtiene, típicamente, mediante una etapa de secuenciamiento único de un inserto de ADNc. La secuencia de todo el inserto de ADNc se denomina "secuencia de inserto completo" ("FIS", por sus siglas en inglés). Una secuencia de "cóntigos" es una secuencia integrada de dos o más secuencias que pueden seleccionarse de, pero no se limitan a, el grupo que consiste en un EST, una FIS y una secuencia de PCR. Una secuencia que codifica una proteína entera o funcional se denomina "secuencia completa de genes" ("CGS", por sus siglas en inglés) y puede derivarse de una FIS o un contigo.

"Característica agronómica" es un parámetro medible que incluye, pero no se limita a, verdor, producción, índice de crecimiento, biomasa, peso fresco en la maduración, peso seco en la maduración, producción de frutos, producción de semillas, contenido total de nitrógeno en la planta, contenido de nitrógeno en los frutos, contenido de nitrógeno en las semillas, contenido de nitrógeno en un tejido vegetativo, contenido total de aminoácidos libres en la planta, contenido de aminoácidos libres en los frutos, contenido de aminoácidos libres en las semillas, contenido de proteínas en un tejido vegetativo, tolerancia a la sequía, captación de nitrógeno, ubicación de la raíz, índice de cosecha, ubicación del tallo, altura de la planta, altura de las espigas, longitud de las espigas, tolerancia a la sal, vigor de las plántulas tempranas y afloramiento de las plántulas en condiciones de estrés por temperaturas bajas.

"Transgénico" se refiere a cualquier célula, línea celular, callo, tejido, parte de una planta o planta cuyo genoma se ha alterado mediante la presencia de un ácido nucleico heterólogo, tal como un constructo de ADN recombinante , que incluye los eventos transgénicos iniciales, así como los creados mediante cruces sexuales o propagación asexual a partir del evento transgénico inicial. Como se usa en la presente descripción, el término "transgénico" no abarca la alteración del genoma (cromosómico ni extracromosómico) por métodos convencionales de cultivo de plantas o por eventos de origen natural, tales como fertilización cruzada aleatoria, infección viral no recombinante, transformación bacteriana no recombinante , transposición no recombinante o mutación espontánea.

El término "genoma" , como se aplica a las células vegetales, abarca no solo el ADN cromosómico que se encuentra dentro del núcleo sino, además, el ADN del organelo que se encuentra en los componentes subcelulares (por ejemplo, mitocondrial , plástido) de la célula.

"Planta" incluye lo referente a plantas completas, órganos de plantas, te idos de plantas, semillas, células vegetales y progenie de estas. Las células vegetales incluyen, sin limitación, células de semillas, cultivos en suspensión, embriones, regiones meristemáticas, tejido calloso, hojas, raíces, brotes, gametofitos, esporofitos, polen y microsporas .

"Progenie" comprende cualquier generación posterior de una planta.

"Planta transgénica" incluye lo referente a una planta que comprende en su genoma un polinucleótido heterólogo. Por ejemplo, el polinucleótido heterólogo está integrado de manera estable dentro del genoma de manera tal que el polinucleótido se transmita a generaciones sucesivas. El polinucleótido heterólogo puede estar integrado en el genoma solo o como parte de un constructo de ADN recombinante.

"Heteróloga" , con respecto a una secuencia, se refiere a una secuencia que se origina de una especie extraña o de la misma especie, se modifica sustancialmente de su forma natural en composición y/o locus genómico por intervención humana intencional.

Los términos "polinucleótido" , "secuencia de ácido nucleico", "secuencia nucleotídica" o "fragmento de ácido nucleico" se usan indistintamente y se refieren a un polímero de ARN o ADN mono o bicatenario que contiene, opcionalmente , bases nucleotídicas sintéticas, no naturales o alteradas. Se hace referencia a los nucleótidos (que, usualmente, se encuentran en su forma 51 -monofosfato) mediante su designación con una sola letra, de la siguiente manera: "A" para adenilato o desoxiadenilato (para el ARN o ADN, respectivamente) , "C" para citidilato o desoxicitidilato, "G" para guanilato o desoxiguanilato, "U" para uridilato, "T" para desoxitimidilato, "R" para purinas (A o G) , "Y" para pirimidinas (C o T) , "K" para G o T, "H" para A, C o T, "I" para inosina y "N" para cualquier nucleótido.

Los términos "polipéptido" , "péptido" , "secuencia de aminoácidos" y "proteína" se usan indistintamente en la presente descripción y se refieren a un polímero de residuos de aminoácido. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos, en donde uno o más residuos de aminoácidos son un análogo químico artificial de un aminoácido correspondiente de origen natural, así como polímeros de aminoácidos de origen natural. Los términos "polipéptido", "péptido", "secuencia de aminoácidos" y "proteína" incluyen, además, modificaciones que incluyen, pero no se limitan a, glicosilación, unión lipídica, sulfación, gamacarboxilación de residuos de ácido glutámico, hidroxilación y ribosilacion del ADP.

"ARN mensajero (ARNm) " se refiere al ARN que no tiene intrones y que la célula puede traducir en proteína.

"ADNc" se refiere a un ADN complementario a y sintetizado a partir de un molde de ARNm mediante el uso de la enzima transcriptasa inversa. El ADNc puede ser monocatenario o se puede convertir a la forma bicatenaria con el uso del fragmento Klenow de la ADN polimerasa I.

Proteína "madura" se refiere a un polipéptido procesado después de la transición, es decir, del cual se ha eliminado cualquier pre o propéptido presente en el producto de traducción primario.

Proteína "precursora" se refiere al producto primario de traducción del ARNm, es decir, cuando los pre y propéptidos aún están presentes. Los pre y propéptidos pueden ser, pero no se limitan a, señales intracelulares de localización.

"Aislados" se refiere a materiales tales como moléculas de ácidos nucleicos y/o proteínas sustancialmente libres o eliminados de alguna manera de los componentes que normalmente acompañan o interactúan con los materiales en un ambiente de origen natural. Los polinucleótidos aislados se pueden purificar a partir de una célula huésped, en donde se originan naturalmente. Se puede usar métodos convencionales de purificación de ácidos nucleicos conocidos para los técnicos con experiencia para obtener polinucleótidos aislados. El término también abarca polinucleótidos recombinantes y polinucleótidos sintetizados químicamente.

"Recombinante" se refiere a una combinación artificial de dos segmentos de secuencia separados de cualquier otra manera, por ejemplo, mediante síntesis química o mediante la manipulación de segmentos aislados de ácidos nucleicos por medio de técnicas de ingeniería genética. "Recombinante" incluye, además, lo referente a una célula o vector que se ha modificado mediante la introducción de un ácido nucleico heterólogo o una célula derivada de una célula ya modificada, pero no abarca la alteración de la célula o vector mediante eventos de origen natural (por ejemplo, mutación espontánea, transíormación/transducción/transposición natural) , tales como los que ocurren sin intervención humana intencional.

"Constructo de ADN recombinante" se refiere a una combinación de fragmentos de ácidos nucleicos que, normalmente, no se encuentran juntos en la naturaleza. Por lo tanto, un constructo de ADN recombinante puede comprender secuencias reguladoras y secuencias codificantes derivadas de diferentes fuentes o secuencias reguladoras y secuencias codificantes derivadas de la misma fuente, pero dispuestas de una manera diferente a como se encuentran en la naturaleza.

Los términos "clon de entrada" y "vector de entrada" se usan indis intamente en la presente descripción.

"Secuencias reguladoras" se refiere a las secuencias de nucleótidos que están ubicadas corriente arriba (secuencias 5' no codificantes), dentro o corriente abajo (secuencias 3' no codificantes) de una secuencia codificante y que influyen en la transcripción, el procesamiento o la estabilidad del ARN o la traducción de la secuencia codificante asociada. Las secuencias reguladores pueden incluir, pero no se limitan a, promotores, secuencias líderes de traducción, intrones y secuencias de reconocimiento de poliadenilación. Los términos "secuencia reguladora" y "elemento regulador" se usan indistintamente en la presente descripción.

"Promotor" se refiere a un fragmento de ácido nucleico con la capacidad de controlar la transcripción de otro fragmento de ácido nucleico.

"Promotor funcional en una planta" es un promotor capaz de controlar la transcripción en células vegetales independientemente de que se origine en una célula vegetal .

Los términos "promotor específico para el tejido" y "promotor preferido del tejido" se usan indistintamente y se refieren a un promotor que se expresa predominantemente, pero no necesariamente, exclusivamente, en un tejido u órgano, pero que también se puede expresar en una célula específica.

"Promotor regulado por el desarrollo" se refiere a un promotor cuya actividad está determinada por los eventos del desarrollo .

"Unido operativamente" se refiere a la asociación de fragmentos de ácido nucleico en un solo fragmento de manera que la función de uno es regulada por la función del otro. Por ejemplo, un promotor está operativamente unido con un fragmento de ácido nucleico cuando puede regular la transcripción de ese fragmento de ácido nucleico.

La "expresión" se refiere a la producción de un producto funcional. Por ejemplo, la expresión de un fragmento de ácido nucleico se puede referir a la transcripción del fragmento de ácido nucleico (por ejemplo, la transcripción resultante en ARNm o ARN funcional) y/o la traducción de ARNm en una proteína precursora o madura.

"Fenotipo" se refiere a las características perceptibles de una célula u organismo.

"Introducido", en el contexto de insertar un fragmento de ácido nucleico (por ejemplo, un constructo de ADN recombinante) en una célula, significa "transíección" , "transformación" o "transducción" e incluye la referencia a la incorporación de un fragmento de ácido nucleico en una célula eucariota o procariota, en donde el fragmento de ácido nucleico se puede incorporar en el genoma de la célula (por ejemplo, ADN cromosómico, plasmídico, plástido o mitocondrial ) , convertido en un replicón autónomo o expresado transitoriamente (por ejemplo, ARNm transfectado) . Una "célula transformada" es cualquier célula en la cual se ha introducido un fragmento de ácido nucleico (por ejemplo, un constructo de ADN recombinante) .

"Transformación" , como se usa en la presente descripción, se refiere tanto a la transformación estable como a la transitoria.

"Transformación estable" se refiere a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico a un genoma de un organismo huésped que produce una herencia genéticamente estable. Una vez transformado de manera estable, el fragmento de ácido nucleico se integra establemente en el genoma del organismo huésped y cualquier generación posterior.

"Transformación transitoria" se refiere a la introducción de un fragmento de ácido nucleico en el núcleo, u organelo que contiene ADN, de un organismo huésped que resulta en una expresión genética sin herencia genéticamente estable.

El "alelo" es una de las varias formas alternativas de un gen que ocupa un locus determinado en un cromosoma. Cuando los alelos presentes en un locus dado en un par de cromosomas homólogos en una planta diploide son iguales, esa planta es homocigota para ese locus. Si los alelos presentes en un locus dado en uno de un par de cromosomas homólogos en una planta diploide difieren, esa planta es heterocigota para ese locus. Si un transgen está presente en uno de un par de cromosomas homólogos en una planta diploide, esa planta es hemicigota para ese locus .

Un "péptido de tránsito al cloroplasto" es una secuencia de aminoácidos que se traduce junto con una proteína y dirige la proteína al cloroplasto u otros tipos de plástidos presentes en la célula en la que se elabora la proteína. "Secuencia de tránsito al cloroplasto" se refiere a una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido de tránsito al cloroplasto. Un "péptido señal" es una secuencia de aminoácidos que se traduce junto con una proteína y dirige la proteína al sistema secretor (Chrispeels (1991) Ann. Rev. Plant Phys. Plant Mol. Biol . 42:2153). Si la proteína se dirigirá a una vacuola, también se puede añadir una señal de dirección vacuolar (más arriba) , y si se dirigirá al retículo endoplásmico, se podría añadir una señal de retención del retículo endoplásmico (más arriba) . Si la proteína se dirigirá al núcleo, cualquier péptido señal presente se debería eliminar e incluir en su lugar una señal de localización nuclear (Raikhel (1992) Plant Phys. 100 :16271632) . Un "péptido señal mitocondrial" es una secuencia de aminoácidos que dirige una proteína precursora a la mitocondria (Zhang y Glaser (2002) Trends Plant Sci 7:14-21).

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos o de ácido nucleico se puede determinar por medio de inspección visual y cálculos matemáticos.

Alternativamente, los cálculos de alineamientos de secuencias y porcentajes de identidad se pueden determinar por medio del uso de una variedad de métodos de comparación diseñados para detectar secuencias homologas que incluyen, pero no se limitan a, el programa MEGALIGN® del paquete bioinformático LASERGENE® (DNASTAR® Inc., Madison, WI) . A menos que se indique de otra manera, se realizaron múltiples alineamientos de las secuencias proporcionadas en la presente invención con el uso del método de alineamiento Clustal V (Higgins and Sharp (1989) CABIOS. 5:151153) con los parámetros predeterminados (PENALIZACION DE INTERRUPCIÓN=10 , PENALIZACION DE TAMAÑO DE INTERRUPCIÓN=10) . Los parámetros predeterminados para alineamientos en pares y para el cálculo del porcentaje de identidad de las secuencias de proteínas con el método Clustal V son KTUPLE=1, PENALIZACION DE INTERRUPCIÓN3 , VENTANA=5 y DIAGONALES GUARDADAS=5. Para los ácidos nucleicos, estos parámetros son KTUPLE=2, PENALIZACION DE INTERRUPCIÓN5 , VENTANA=4 y DIAGONALES GUARDADAS=4. Después del alineamiento de las secuencias, el programa Clustal V se puede usar para obtener valores de "porcentaje de identidad" y "divergencia" mediante la lectura de la tabla de "distancias de secuencias" del mismo programa; a menos que se indique de otra manera, los porcentajes de identidad y divergencias proporcionados y reivindicados en la presente invención se calcularon de esta forma.

Alternativamente, el porcentaje de identidad de dos secuencias de proteínas se puede determinar por medio de la comparación de la información de secuencias en base al algoritmo de Needleman, S. B. y Wunsch, C. D. (J. Mol. Biol . , 48:443-453, 1970) y el uso del programa para computación GAP disponible de University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG) . Los parámetros predeterminados preferidos para el programa GAP incluyen: (1) una matriz de puntaje, blosum62, tal como describen Henikoff, S. y Henikoff, J. G. (Proc. Nati. Acad. Sci. EE. UU. , 89:10915-10919, 1992); (2) un peso de interrupción de 12; (3) un peso de longitud de interrupción de 4; y (4) cero penalización para interrupciones de extremo.

Además, , son útiles otros programas usados por las personas con experiencia en la técnica de comparación de secuencias. El porcentaje de identidad puede determinarse al comparar la información de las secuencias, por ejemplo, mediante el programa BLAST descrito por Altschul et al. (Nucí. Acids. Res., 25, p. 3389-3402, 1997). Este programa está disponible en el sitio de internet de National Center for Biotechnology Information (NCBI) o en DNA Data Bank of Japan (DDBJ) . Los detalles de varias condiciones (parámetros) para la búsqueda de identidad con el programa BLAST se muestran en estos sitios de internet y los valores predeterminados se usan comúnmente para la búsqueda si bien, de ser necesario, algunos parámetros pueden modificarse.

Alternativamente, el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos se puede determinar con un programa tal como el software de procesamiento de información GENETYX Ver.7 (Genetyx Corporation, Japón) o con un algoritmo tal como FASTA. En este caso, para la búsqueda se pueden usar los valores predeterminados.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de ácido nucleico puede determinarse por medio de inspección visual y cálculo matemático o, con mayor preferencia, se puede comparar la información de secuencias con un programa para computadora. Un programa para computadora preferido ilustrativo es el programa de Genetic Computer Group (GCG® Madison, WI) WISCONSIN PACKAGE® versión 10.0, "GAP" (Devereux et al., 1984, Nucí. Acids Res., 12:387). Además de comparar dos secuencias de ácido nucleico, este programa "GAP" puede usarse para comparar dos secuencias de aminoácidos y también una secuencia de ácido nucleico y una secuencia de aminoácidos. Los parámetros predeterminados preferidos para el programa "GAP" incluyen: (1) la implementación GCG® de una matriz de comparación unaria (que contiene un valor de 1 para las identidades y un valor de 0 para las faltas de identidades) para los nucleótidos, y la matriz de comparación de aminoácidos ponderada de Gribskov y Burgess, Nucí. Acids Res., 14:6745, 1986, tal como describen Schwartz y Dayhoff, eds . , "Atlas of Polypeptide Sequence and Structure," National Biomedical Research Foundation, págs . 353-358, 1979, u otras matrices de comparación comparables; (2) una penalización de 30 para cada interrupción y una penalización adicional de 1 para cada símbolo en cada interrupción para secuencias de aminoácidos o penalización de 50 para cada interrupción y una penalización adicional de 3 para cada símbolo en cada interrupción para secuencias de nucleótidos ; (3) cero penalización para interrupciones de extremo; y (4) cero penalización máxima para interrupciones largas. Además, son útiles otros programas usados por las personas con experiencia en la técnica de la comparación de secuencias, tales como, por ejemplo, el programa BLASTN versión 2.2.7 disponible en el sitio en internet de National Library of Medicine o el algoritmo de U-BLAST 2.0 (Advanced Biocomputing, LLC) . Además, el algoritmo BLAST usa la matriz de puntaje de aminoácidos BLOSUM62, y los parámetros opcionales que pueden usarse son: (A) inclusión de un filtro para enmascarar segmentos de la secuencia de consulta con una composición poco compleja (tal como se determina por medio del programa SEG de Wootton y Federhen (Computers and Chemistry, 1993); ver, además, Wootton y Federhen, 1996, "Analysis of compositionally biased regions in sequence databases," Methods Enzymol . , 266: 554-71) o segmentos que consisten en repeticiones internas de periodicidad corta (tal como se determina por medio el programa XNU de Claverie y States (Computers and Chemistry, 1993) ) , y (B) un umbral de significancia estadística para reportar coincidencias contra secuencias de bases de datos, o puntaje E (la probabilidad esperada de coincidencias que se encuentran por casualidad, de conformidad con el modelo estocástico de Karlin y Altschul, 1990; si la importancia estadística atribuida a una coincidencia es mayor que este umbral de puntaje E, la coincidencia no se reportará) ; los valores del umbral de puntaje E preferidos son 0.5 o, en orden creciente de preferencia, 0.25, 0.1, 0.05, 0.01, 0.001, 0.0001, le-5, le-10, le-15, le-20, le-25, le-30, le-40, le-50, le-75 o le-100.

Las técnicas estándar de clonación molecular y ADN recombinante usadas en la presente descripción son muy conocidas en la técnica y se describen con mayor detalle en Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989 (de aquí en adelante "Sambrook").

Ahora, en cuanto a las modalidades: Las modalidades incluyen polinucleótidos y polipéptidos aislados, constructos de ADN recombinante útiles para conferir tolerancia a la sequía, composiciones (tales como plantas o semillas) que comprenden estos constructos de ADN recombinante y métodos que usan estos constructos de ADN recombinante.

Polinucleótidos y polipéptidos aislados: La presente invención incluye los siguientes polinucleótidos y polipéptidos aislados: Un polinucleótido aislado que comprende: (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos 50 %, 51 %, 52 %, 53 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 % 59 %, 60 61 %, 62 %, 63 64 %, 65 66 %, 67 %, 68 % 69 %, 70 71 %, 72 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 78 % 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 , 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 89 %, 90 , 91 %, 92 %, 93 %, 94 , 95 %, 96 97 , 98 99 % o 100 % basada en el método de alineamiento Clustal V cuando se compara con las sec . con núms . de ident.:27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 u 87; o (ii) un complemento completo de la secuencia de ácido nucleico de (i) , en donde el complemento completo y la secuencia de ácido nucleico de (i) consisten del mismo número de nucleótidos y son 100 % complementarios. Cualquiera de los polinucleótidos aislados mencionados anteriormente se puede usar en cualquier constructo de ADN recombinante de la presente invención. El polipéptido es, preferentemente, un polipéptido DTP21.

Un polipéptido aislado que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 83 84 %, 85 %, 86 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % basada en el método de alineamiento Clustal V cuando se compara con las sec . con núms . de ident.:27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 u 87. El polipéptido es, preferentemente, un polipéptido DTP21.

Un polipéptido aislado, en donde la secuencia de aminoácidos se deriva de las sec. con núms. de ident.:27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 u 87 por la alteración de uno o más aminoácidos por medio de al menos un método seleccionado del grupo que consiste en: deleción, sustitución, adición e inserción; y (c) un polipéptido en donde la secuencia de aminoácidos del polipéptido comprende las sec. con núms. de ident.:27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 u 87. El polipéptido es, preferentemente, un polipéptido DTP21.

Un polinucleótido aislado que comprende (i) una secuencia de ácido nucleico con una identidad de secuencia de al menos 50 %, 51 %, 52 % 53 % 54 55 56 57 %, 58 59 %, 60 %, 61 % , 62 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 % , 72 %, 73 74 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 80 81 , 82 %, 83 84 %, 85 %, 86 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 % , 92 %, 93 %, 94 %, 95 96 97 ¾, 98 %, 99 % o 100 % basada en el método de alineamiento Clustal V cuando se compara con las sec . con núms . ident.:26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 u 86; o (ii) un complemento completo .de la secuencia de ácido nucleico de (i). Cualquiera de los polinucleótidos aislados mencionados anteriormente se puede usar en cualquier constructo de ADN recombinante de la presente invención. El polinucleótido aislado codifica, preferentemente, unpolipéptido DTP21.

Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de tolerancia a la sequía, en donde la secuencia de nucleótidos es hibridable en condiciones rigurosas con una molécula de ADN que comprende el complemento completo de las sec. con núms . de ident.:26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 u 86; Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de tolerancia a la sequía, en donde la secuencia de nucleótidos se deriva de las sec. con núms. de ident.:26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 u 86 por la alteración de uno o más nucleótidos por medio de al menos un método seleccionado del grupo que consiste en: deleción, sustitución, adición e inserción.

Constructos de ADN recombinante : En un aspecto, la presente invención incluye constructos de ADN recombinante.

En una modalidad, un constructo de ADN recombinante comprende un polinucleótido unido operativamente a por lo menos una secuencia reguladora (p. e . , un promotor funcional en una planta) , en donde el polinucleótido comprende (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos 50 % 51 %, 52 %, 53 54 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 61 %, 62 %, 63 %, 64 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 71 72 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 78 79 %, 80 81 %/ 82 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 88 %, 89 90 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 98 %, 99 % o 100 basada en el método de alineamiento Clustal V cuando se compara con las sec . con núms . de ident.:27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 u 87; o (ii) un complemento completo de la secuencia de ácido nucleico de (i) .

En otra modalidad, un constructo de ADN recombinante comprende un polinucleótido unido operat vamente a por lo menos una secuencia reguladora (p. ej . , un promotor funcional en una planta) , en donde ese polinucleótido comprende (i) una secuencia de ácido nucleico con una identidad de secuencia de al menos 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 % 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 % 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 76 77 78 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 99 % o 100 % basada en el método de alineamiento Clustal V cuando se compara con las sec. con núms. de ident.:26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 u 86; o (ii) un complemento completo de la secuencia de ácido nucleico de (i) .

En otra modalidad, un constructo de ADN recombinante comprende un polinucleótido unido operativamente a por lo menos una secuencia reguladora (p. ej . , un promotor funcional en una planta) , en donde ese polinucleótido codifica un polipéptido DTP21. El polipéptido DTP21 puede ser de Arabidopsis thaliana, Zea mays, Glycine max, Glycine tabacina, Glycine soja y Glycine tomentella.

Se entiende, tal como apreciarán aquellos con experiencia en la técnica, que la invención abarca otras secuencias además de las secuencias ilustrativas específicas. En la técnica se conocen bien las alteraciones de un fragmento de ácido nucleico que resultan en la producción de un aminoácido químicamente equivalente en un sitio dado pero que no afectan la propiedades funcionales del polipéptido codificado. Por ejemplo, un codón para el aminoácido alanina, un aminoácido hidrofóbico, puede ser sustituido por un codón que codifica otro residuo menos hidrofóbico, tal como la glicina o un residuo más hidrofóbico, tal como la valina, la leucina o la isoleucina. De manera similar, también se puede esperar cambios que resultan en la sustitución de un residuo cargado negativamente por otro, tal como ácido aspártico para ácido glutámico o un residuo cargado positivamente por otro, tal como lisina por arginina, para producir un producto funcionalmente equivalente. Además, no se espera cambios de nucleótidos que resultan en la alteración de las porciones N-terminal y C-terminal de la molécula de polipéptido para alterar la actividad del polipéptido. Cada una de las modificaciones propuestas permanece dentro de la rutina de la técnica, como lo hace la determinación de la retención de la actividad biológica de los productos codificados.

Además, la proteína de la presente invención puede ser una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la deleción, sustitución, inserción y/o adición de uno o más aminoácidos en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las sec . con núms . de ident.:27, 32, 41, 42, 45, 46, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64 y 66. La sustitución puede ser conservativa, lo que significa el reemplazo de un determinado residuo de aminoácidos por otro residuo que tiene características físicas y químicas similares. Los ejemplos no limitantes de sustituciones conservativas incluyen el reemplazo entre residuos aminoacídicos que contienen grupos alifáticos tales como lie, Val, Leu o Ala, y el reemplazo entre residuos polares tales como el reemplazo de Lys-Arg, Glu-Asp o Gln-Asn.

Las proteínas derivadas por deleción, sustitución, inserción y/o adición de aminoácidos pueden prepararse cuando el ADN que codifica sus proteínas silvestres se expone, por ejemplo, a la técnica conocida de mutagénesis dirigida al sitio (ver, p. ej . , Nucleic Acid Research, Vol . 10, núm. 20, págs . 6487-6500, 1982, incorporada en la presente descripción como referencia) . Como se usa en la presente descripción, el término "uno o más aminoácidos" está previsto para indicar un número posible de aminoácidos que pueden suprimirse, sustituirse, insertarse y/o añadirse por medio de mutagénesis dirigida al sitio.

Para realizar la mutagénesis dirigida al sitio se puede usar, por ejemplo, un iniciador de oligonucleótidos sintéticos complementario al ADN monocatenario del fago que se mutará, excepto si carece de una coincidencia específica (es decir, una mutación deseada) . Es decir, el oligonucleótido sintético anterior se usa como un iniciador para producir la síntesis de una cadena complementaria por medio de fagos y, después, el ADN bicatenario resultante se usa para transformar células huésped. El cultivo bacteriano transformado se coloca en placas sobre agar, por medio de lo cual se permite la formación de placas a partir de células únicas que contienen fagos. En consecuencia, teóricamente, 50 % de colonias nuevas contienen fagos con la mutación como una cadena única, mientras que el 50 % restante tiene la secuencia original. A una temperatura que permite la hibridación con ADN completamente idéntico al que tiene la mutación deseada anteriormente, pero no con ADN que tiene la cadena original, las placas resultantes se pueden hibridar con una sonda sintética marcada por tratamiento con cinasa. Posteriormente, las placas hibridadas con la sonda se extraen y se cultivan para recolectar su ADN.

Las técnicas para permitir la deleción, sustitución, inserción y/o adición de uno o más aminoácidos en las secuencias de aminoácidos de péptidos biológicamente activos, tales como enzimas, mientras retienen su actividad, incluyen la mutagénesis dirigida al sitio mencionada anteriormente, además de otras técnicas tales como las usadas para tratar un gen con un mutágeno y aquellas en las cuales un gen se divide selectivamente para eliminar, sustituir, insertar o añadir uno o varios nucleótidos seleccionados y, después, se liga.

La proteína de la presente invención puede ser, además, una proteína codificada por un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende una deleción, sustitución, inserción y/o adición de uno o más nucleótidos en una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las sec . con núms . de ident.:26, 31, 39, 40, 43, 44, 51, 53, 55, 57, 59, 60, 63 y 65. La deleción, sustitución, inserción y/o adición de nucleótidos se puede realizar mediante mutagénesis dirigida al sitio u otras técnicas tal como se mencionó anteriormente.

La proteína de la presente invención puede ser, además, una proteína codificada por un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos hibridable en condiciones rigurosas con la cadena complementaria de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las sec . con núms . de ident.:26, 31, 39, 40, 43, 44, 51, 53, 55, 57, 59, 60, 63 y 65.

El término "en condiciones rigurosas" significa que dos secuencias se hibridan en condiciones moderadamente o altamente rigurosas. Más específicamente, aquellos con experiencia en la técnica pueden determinar fácilmente las condiciones moderadamente rigurosas, por ejemplo, en función de la longitud del ADN. Las condiciones básicas son - las establecidas por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tercera edición, capítulos 6 y 7, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001 e incluyen el uso de una solución de prelavado para filtros de nitrocelulosa SSC 5x, SDS al 0.5 %, EDTA 1.0 mM (pH 8.0), condiciones de hibridación con formamida a aproximadamente el 50 %, SSC 2x a SSC 6x a aproximadamente 40-50 °C (u otras soluciones de hibridación similares, tales como la solución de Stark en formamida a aproximadamente el 50 % a una temperatura aproximada de 42 °C) y condiciones de lavado, por ejemplo, de aproximadamente 40-60 °C, SSC 0.5-6x, SDS al 0.1 %. Preferentemente, las condiciones moderadamente rigurosas incluyen hibridación (y lavado) a aproximadamente 50 °C y SSC 6x. Además, aquellos con experiencia en la técnica pueden determinar fácilmente las condiciones altamente rigurosas, por ejemplo, en función de la longitud del ADN.

Generalmente, las condiciones incluyen hibridación y/o lavado a una temperatura más alta y/o concentración de sal más baja (tal como hibridación a aproximadamente 65 °C, SSC 6x a SSC 0.2x, preferentemente, SSC 6x, con mayor preferencia, SSC 2x, con la máxima preferencia, SSC 0.2x), en comparación con las condiciones moderadamente rigurosas. Por ejemplo, las condiciones altamente rigurosas pueden incluir la hibridación, tal como se definió anteriormente, y el lavado a aproximadamente 65-68 °C, SSC 0.2x, SDS ai 0.1 %. El SSPE (SSPE lx es NaCl 0.15 M, NaH2P04 10 mM y EDTA 1.25 mM, pH 7.4) puede sustituirse por SSC (SSC lx es NaCl 0.15 M y citrato de sodio 15 mM) en la hibridación y tampones de lavado; el lavado se realiza por 15 minutos después de completar la hibridación.

Además, se puede usar un estuche de hibridación disponible comercialmente que no usa una sustancia radioactiva como sonda. Los ejemplos específicos incluyen hibridación con un sistema de detección y marcado directo por electroquimioluminiscencia (ECL, por sus siglas en inglés) & (Amersham) . Las condiciones rigurosas incluyen, por ejemplo, hibridación a 42 °C por 4 horas con el tampón de hibridación incluido en el estuche que está suplementado con reactivo de bloqueo al 5 % (p/v) y NaCl 0.5 M y el lavado, dos veces, en SDS al 0.4 %, SSC 0.5x a 55 °C por 20 minutos y una vez en SSC 2x a temperatura ambiente por 5 minutos.

La proteína de la presente invención es, preferentemente, una proteína con actividad de tolerancia a la sequía.

"Constructo de ADN supresor" es un constructo de ADN recombinante que al transformarse o integrarse de manera estable en el genoma de la planta, resulta en el "silenciamiento" de un gen objetivo en la planta. El gen objetivo puede ser endógeno o transgénico a la planta. "Silenciamiento" , como se usa en la presente descripción con respecto al gen objetivo, se refiere, generalmente, a la supresión de niveles de A Nm o proteína/enzima expresada por el gen objetivo y/o el nivel de la actividad enzimática o funcionalidad de la proteína. Los términos "supresión", "que suprime" y "silenciamiento" se usan indistintamente en la presente descripción e incluyen baja, reducción, declinación, disminución, inhibición, eliminación o prevención. "Silenciamiento" o "silenciamiento de genes" no especifican un mecanismo e incluyen, pero no se limitan a, no codificante, cosupresión, supresión viral, supresión de horquilla, supresión de tallo-lazo, métodos basados en ARNi y métodos basados en ARN pequeño.

Un constructo de ADN supresor puede comprender una región derivada de un gen objetivo de interés y puede comprender total o parcialmente la secuencia de ácido nucleico de la cadena codificante (o cadena no codificante) del gen objetivo de interés. Según la aproximación que se use, la región podría ser 100 % idéntica o menor que 100 % idéntica (por ejemplo, por lo menos 50 %, 51 %, 52 %, 53 0, o / 54 %, 55 O, o / 56 %, 57 % 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 % 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 o, ¾ / 75 %, 76 Q, 77 % 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 % 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 g, ¾ / 93 o ° / 94 o o / 95 a 0 í 96 o / 97 o "o 98 % o 99 % idéntica) a todo o parte del secuenciador (o cadena no codificante) del gen de interés.

Los constructos de ADN supresor se conocen bien en la técnica, se construyen fácilmente una vez se seleccione el gen objetivo de interés e incluyen, pero no se limitan a, constructos cosupresores , constructos no codificantes, constructos de supresión viral, constructos supresores de horquilla, constructos supresores de tallo-lazo, constructos productores de ARN bicatenario y, más generalmente, constructos de ARNi (ARN de interferencia) y constructos de ARN pequeños tales como constructos de ARNip (ARN de interferencia corta) y constructos de miARN (microARN) .

"Inhibición no codificante" se refiere a la producción de transcritos de ARN no codificante capaces de suprimir la expresión del gen objetivo o producto génico. "ARN no codificante" se refiere a un transcrito de ARN que es complementario a todo o parte de un transcrito primario objetivo o ARNm y que bloquea la expresión de un fragmento de ácido nucleico aislado objetivo (patente de los Estados Unidos núm. 5,107,065). La complementariedad de un ARN no codificante puede ser con cualquier porción del transcrito genético específico, es decir, en la secuencia 5' no codificante, secuencia 3' no codificante, intrones o secuencia codificante.

"Cosupresión" se refiere¦ a la producción de transcritos de ARN efector con la capacidad de suprimir la expresión del gen o producto génico objetivo. ARN "efector" se refiere al transcrito de ARN que incluye el ARNm y que se puede traducir en proteína dentro de una célula o in vitro. Anteriormente, se diseñaron eonstructos cosupresores en plantas en función de la sobreexpresión de una secuencia de ácido nucleico con homología a un ARNm nativo, en la orientación codificante, lo que produce la reducción de todo el ARN con homología a la secuencia sobreexpresada (ver Vaucheret et al., Plant J. 16:651-659 (1998); y Gura, Nature 404 : 804 - 808 (2000)).

Otra variación describe el uso de secuencias virales en plantas para dirigir la supresión de secuencias proximales que codifican el ARNm (publicación del PCT núm. O 98/36083 publicada el 20 de agosto de 1998) .

Secuencias reguladoras : Un constructo de ADN recombxnante de la presente invención puede comprender por lo menos una secuencia reguladora.

Una secuencia reguladora podría ser un promotor.

Se puede usar una gran variedad de promotores en los eonstructos de ADN recombinante de la presente invención. Los promotores se pueden seleccionar en función del resultado deseado y podrían incluir los promotores constitutivos, específicos del tejido, inducibles u otros promotores para la expresión en el organismo huésped.

Los promotores que hacen que un gen se exprese en la mayoría de tipos de células, la mayoría de veces se denominan comúnmente "promotores constitutivos" .

La expresión constitutiva de alto nivel del gen candidato bajo control del promotor 35S o UBI puede tener éfectos pleiotrópicos , aunque la eficacia del gen candidato se puede determinar cuando lo acciona un promotor constitutivo. El uso de promotores específicos para el tejido y/o el estrés podría eliminar los efectos no deseados, pero retener la capacidad de mejorar la tolerancia a la sequía. Este efecto se ha observado en Arabidopsis (Kasuga et al. (1999) Nature Biotechnol . 17:287-91) .

Los promotores constitutivos adecuados para usar en una célula de la planta huésped incluyen, por ejemplo, el promotor mínimo del promotor Rsyn7 y otros promotores constitutivos descritos en la patente núm. O 99/43838 y en la patente de los Estados Unidos núm. 6,072,050; el promotor mínimo CaMV 35S (Odell et al., Nature 313:810-812 (1985)); actina de arroz (McElroy et al., Plant Cell 2:163-171 (1990)); ubiquitina (Christensen et al., Plant Mol. Biol . 12:619-632 (1989) y Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18:675-689 (1992)); pEMU (Last et al., Theor. Appl . Genet . 81:581-588 (1991)); MAS (Velten et al., EMBO J. 3:2723-2730 (1984)); promotor ALS (patente de los Estados Unidos núm. 5,659,026) y similares. Otros promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, los mencionados en las patentes de los Estados Unidos núms . 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; 5,608,142 y 6,177,611.

Al seleccionar un promotor para el uso en los métodos de la invención, puede que se prefiera un promotor específico para el tejido o regulado por el desarrollo.

Un promotor específico para el tejido o regulado por el desarrollo es una secuencia de ADN que regula la expresión de una secuencia de ADN selectivamente en las células/tejidos de una planta, crítico para el desarrollo de la panoja, las semillas o ambos y limita la expresión de la secuencia de ADN al período de desarrollo de la panoja o a la maduración de las semillas en la planta. En los métodos de la presente invención se puede usar cualquier promotor identificable que cause la expresión temporal y espacial deseada.

Los promotores específicos de las semillas o embriones y que pueden ser útiles en la presente invención incluyen el inhibidor Kunitz de tripsina del frijol de soja (Kti3, Jofuku and Goldberg, Plant Cell 1:1079-1093 (1989)), patatina (tubérculos de papa) (Rocha-Sosa, M. , et al. (1989) EMBO J. 8:23-29), convicilina, vicilina y legumina (cotiledones de chícharos) (Rerie, W.G., et al. (1991) Mol. Gen. Genet . 259:149-157; Newbigin, E.J., et al. (1990) Planta 180:461-470; Higgins, T.J.V., et al. (1988) Plant . Mol. Biol . 11:683-695), zeína (endosperma de maíz) (Schemthaner, J.P., et al. (1988) EMBO J. 7:1249-1255), faseolina (cotiledones de frijol) (Segupta-Gopalan, C, et al. (1985) Proc . Nati. Acad. Sci. Estados Unidos. 82:3320-3324), fitohemaglutinina (cotiledón de frijol) (Voelker, T. et al. (1987) EMBO J. 6:3571-3577), B-conglicinina y glicinina (cotiledón de frijol de soja) (Chen, Z-L, et al. (1988) EMBO J. 7:297- 302), glutelina (endosperma de arroz) , hordeí a (endosperma de cebada) (Marris, C, et al. (1988) Plant Mol. Biol. 10:359-366), glutenina y gliadina (endosperma de trigo) (Colot, V. , et al. (1987) EMBO J. 6:3559-3564) y esporamina (raíz tuberosa del camote) (Hattori, T.; et al. (1990) Plant Mol. Biol. 14:595-604). Los promotores de genes específicos de semillas unidos operativamente a regiones codificantes heterólogas en constructos de genes quiméricos mantienen su estructura de expresión temporal y espacial en las plantas transgénicas . Tales ejemplos incluyen al promotor genético de proteína de almacenamiento de semilla 2S de Arabidopsis thaliana para expresar péptidos de encefalina en semillas de Arabidopsis y Brassica napus (Vanderkerckhove et al . , Bio/Technology 7:L929-932 (1989)), promotores de lectina de frijol y beta-faseolina de frijol para expresar luciferasa (Riggs et al., Plant Sci. 63:47-57 (1989)) y promotores de glutenina de trigo para expresar cloranfenicol acetiltransferasa (Colot et al., EMBO J 6:3559- 3564 (1987)).

Los promotores inducibles expresan selectivamente una secuencia de ADN operativamente unida en respuesta de un estímulo endógeno o exógeno, por ejemplo, por compuestos químicos (inductores químicos) o en respuesta de señales ambientales, hormonales, químicas y/o del desarrollo. Los promotores inducibles o regulados incluyen, por ejemplo, los promotores regulados por luz, calor, estrés, inundación o sequía, fitohormonas , lesiones o sustancias químicas, tales como etanol, jasmonato, ácido salicílico o sustancias protectoras .

Los promotores a ser usados en la presente invención incluyen los siguientes: 1) el promotor RD29A inducible por estrés (Kasuga et al. (1999) Nature Biotechnol. 17:287-91); 2) el promotor de cebada, B22E; la expresión de B22E es específica para el pedicelo en granos de maíz en desarrollo ("Primary Structure of a Novel Barley Gene Differentially Expressed in Immature Aleurone Layers". Klemsdal, S.S. et al., Mol. Gen. Genet . 228 (1/2) : 9-16 (1991)) y 3) el promotor del maíz, Zag2 ("Identification and molecular characterization of ZAG1, the maize homolog of the Arabidopsis floral homeotic gene AGAMOUS" , Schmidt, R.J. et al., Plant Cell 5(7):729-737 (1993) ,· "Structural characterization, chromosomal localization and phylogenetic evaluation of two pairs of AGAMOUS-lik.e MADS-box genes from maize" , Theissen et al. Gene 156 (2) : 155-166 (1995); núm. de registro del GenBank del NCBI X80206) ) . Los transcritos Zag2 se pueden detectar 5 días antes de la polinización hasta 7 a 8 días después de la polinización ("DDP") y dirigen la expresión en el carpelo de inflorescencias hembra en desarrollo y Ciml que es específico para el núcleo de granos de maíz en desarrollo. El transcrito Ciml se detecta 4 a 5 días antes de la polinización hasta 6 a 8 DDP. Otros promotores útiles incluyen cualquier promotor que pueda derivarse de un gen cuya expresión esté asociada maternalmente con cogollos hembra en desarrollo.

Los promotores adicionales para regular la expresión de las secuencias de nucleótidos de la presente invención en plantas son los promotores específicos del tallo. Tales promotores específicos del tallo incluyen el promotor S2A de alfalfa (núm. de registro del GenBank EF030816; Abrahams et al., Plant Mol. Biol . 27:513-528 (1995)) y el promotor S2B (núm. de registro del GenBank EF030817) y similares, incorporados en la presente invención como referencia.

Los promotores pueden derivarse en su totalidad de un gen nativo o pueden estar compuestos por elementos diferentes derivados de promotores distintos que se encuentran en la naturaleza o incluso comprender segmentos sintéticos de ADN.

Los promotores útiles en la presente invención pueden incluir: RIP2, mLIP15, ZmCORl , Rabl7, CaMV 35S, RD29A, B22E, Zag2 , SAM sintetasa, ubiquitina, CaMV 19S, nos, Adh, sacarosa sintasa, R-alelo, los promotores específicos de tejido vascular S2A (número de registro del Genbank EF030816) y S2B (número de registro del Genbank EF030817) , y el promotor constitutivo G0S2 de Zea mays . Otros promotores incluyen promotores específicos de la raíz, tales como el promotor NAS2 de maíz, el promotor Cyclo de maíz (patente de los Estados Unidos núm. 2006/0156439 publicada el 13 de julio de 2006), el promotor ROOTMET2 del maíz (patente -núm. O05063998 publicada el 14 de julio de 2005) , el promotor CR1BI0 (patente núm. O06055487 publicada el 26 de mayo de 2006) , el promotor CRWAQ81 (patente núm. O05035770 publicada el 21 de abril de 2005) y el promotor de maíz ZRP2.47 (número de registro del CNIB : U38790; núm. GI . 1063664).

Los constructos de ADN recombinante de la presente invención podrían incluir, además, otras secuencias reguladoras que incluyen, pero no se limitan a, secuencias líderes de traducción, intrones y secuencias de reconocimiento de poliadenilación . En otra modalidad de la presente invención, un constructo de ADN recombinante de la presente invención también comprende un potenciador o silenciador.

Se puede agregar una secuencia de intrones a la región 5' no traducida, la región codificante de proteínas o la región 3' no traducida para incrementar la cantidad del mensaje maduro que se acumula en el citosol. La inclusión de un intrón divisible en la unidad de transcripción en los constructos de expresión, tanto de plantas como de animales, ha demostrado incrementar la expresión genética tanto en los niveles de ARNm como en los de proteína hasta 1000 veces. Buchman and Berg, Mol. Cell Biol. 8:4395-4405 (1988); Callis et al., Genes Dev. 1:1183-1200 (1987).

Para identificar las secuencias reguladoras y los genes del polipéptido DTP21 que se usarán en los constructos de ADN recombinante de la presente invención se puede seleccionar cualquier planta. Los ejemplos de plantas objetivo adecuadas para el aislamiento de genes y secuencias reguladoras incluyen, pero no se limitan a, alfalfa, manzana, chabacano, Arabidopsis, alcachofa, rúgula, espárragos, aguacate, banana, cebada, frijoles, betabel, zarzamora, arándano vaccinio, brócoli, coles de bruselas, col, cañóla, cantalupo, zanahoria, mandioca, semilla de ricino, coliflor, apio, cereza, achicoria, cilantro, cítricos, clementinas, trébol, coco, café, maíz, algodón, arándano, pepino, abeto Douglas, berenjena, endibia, escarola, eucalipto, hinojo, higueras, ajo, calabaza, uva, toronja, melón de pulpa verde, jicama, kiwi, lechuga, puerro, limón, lima, pino taeda, linaza, mango, melón, champiñones, nectarina, nuez, avena, palma aceitera, aceite de colza, quingombó, aceituna, cebolla, naranja, una planta ornamental, palma, papaya, perejil, chirivía, chícharos, melocotón, cacahuate, pera, chile, caqui, pino, piña, plátano, ciruela, granada roja, álamo, papa, calabaza, membrillo, pino de Monterrey, achicoria, rábano, semilla de colza, frambuesa, arroz, centeno, sorgo, pino palustre, frijol de soja, espinaca, calabacín, fresa, remolacha azucarera, caña de azúcar, girasol, camote, árbol del ámbar, mandarina, té, tabaco, tomate, tritical, césped, nabo, una vid, sandía, trigo, ñames y calabacín.

Composiciones : Una composición de la presente invención es una planta que comprende en su genoma cualquiera de los constructos de ADN recombinante de la presente invención (tal como cualquiera de los constructos mencionados anteriormente) . Las composiciones incluyen, además, cualquier progenie de la planta y cualquier semilla obtenida de la planta o su progenie, en donde la progenie o semilla comprende dentro de su genoma el constructo de ADN recombinante. La progenie incluye generaciones posteriores obtenidas mediante la autopolinización o cruce de una planta. La progenie también incluye híbridas y endogámicas.

En cultivos propagados por semillas híbridas, las plantas transgénicas maduras pueden autopolinizarse para producir una planta endogámica homocigota. La planta endogámica produce semillas que contienen el constructo de ADN recombinante recientemente introducido. Estas semillas pueden cultivarse para producir plantas que mostrarían una característica agronómica alterada (por ejemplo, una característica agronómica incrementada, opcionalmente, en condiciones de agua limitada) o usarse en un programa de cultivo para producir una semilla híbrida que se puede cultivar para producir plantas que exhibirían la característica agronómica alterada. Las semillas podrían ser semillas de maíz.

La planta puede ser una planta monocotiledónea o dicotiledónea, por ejemplo, una planta de maíz, arroz o frijol de soja, tal como una planta híbrida de maíz o una planta endogámica de maíz. Además, la planta puede ser girasol, sorgo, cañóla, trigo, alfalfa, algodón, cebada, mijo, caña de azúcar, pasto aguja, tabaco, papa y remolacha azucarera.

El constructo de ADN recombinante podría estar integrado establemente en el genoma de la planta.

Las modalidades particulares incluyen, pero no se limitan a: 1. Una planta (por ejemplo, una planta de maíz, arroz o frijol de soja) que comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operativamente a por lo menos una secuencia reguladora, en donde ese polinucleótido codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos 50 %, 51 %, 52 %, 53 % , 54 %, 55 %, 56 %, 57 58 %, 59 %, 60 61 62 % , 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 % , 86 87 %, 88 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % basada en el método de alineamiento Clustal V cuando se compara con las sec. con núms . de ident . :27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 u 87, y en donde esa planta exhibe una mayor tolerancia a la sequía cuando se compara con una planta de control que no comprende ese constructo de ADN recombinante . La planta podría mostrar, además, una alteración de por lo menos una característica agronómica en comparación con la planta control . 2. Una planta (por ejemplo, una planta de maíz, arroz o frijol de soja) que comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operativamente a por lo menos una secuencia reguladora, en donde ese polinucleótido codifica un polipéptido DTP21, y en donde esa planta exhibe una mayor tolerancia a la sequía cuando se compara con una planta de control que no comprende ese constructo de ADN recombinante. La planta podría mostrar, además, una alteración de por lo menos una característica agronómica en comparación con la planta control. 3. Una planta (por ejemplo, una planta de maíz, arroz o frijol de soja) que comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operativamente a por lo menos una secuencia reguladora, en donde ese polinucleótido codifica un polipéptido DTP21, y en donde esa planta exhibe una alteración de al menos una característica agronómica cuando se compara con una planta de control que no comprende ese constructo de ADN recombinante. 4. Una planta (por ejemplo, una planta de maíz, arroz o frijol de soja) que comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operativamente a por lo menos un elemento regulador, en donde ese polinucleótido codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 56 %, 57 58 % 59 %, 60 61 62 %, 63 %, 64 , 65 %, 66 67 %, 68 % 69 %, 70 71 %, 72 %, 73 %, 74 75 %, 76 77 %, 78 % 79 %, 80 %, 81 , 82 %, 83 %, 84 85 %, 86 87 88 % 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 98 % 99 % o 100 % basada en el método de alineamiento Clustal V cuando se compara con las sec. con núms . de ident . :27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 u 87, y en donde esa planta exhibe una alteración de al menos una característica agronómica cuando se compara con una planta de control que no comprende ese constructo de ADN recombinante . 5. Una planta (por ejemplo, una planta de maíz, arroz o frijol de soja) que comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operativamente a por lo menos un elemento regulador, en donde ese polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de tolerancia a la sequía, en donde la secuencia de nucleótidos: (a) es hibridable en condiciones rigurosas con una molécula de ADN que comprende el complemento completo de las sec . con núms. de ident.:26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 u 86; o (b) se deriva de las sec. con núms. de ident.:26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 u 86 por la alteración de uno o más nucleótidos por medio de al menos un método seleccionado del grupo que consiste en: deleción, sustitución, adición e inserción; y en donde esa planta exhibe una mayor tolerancia a la sequía cuando se compara con una planta de control que no comprende ese constructo de ADN recombinante . 6. Una planta (por ejemplo, una planta de maíz, arroz o frijol de soja) que comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operativamente a por lo menos un elemento regulador, en donde ese polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de tolerancia a la sequía, en donde la secuencia de nucleótidos: (a) es hibridable en condiciones rigurosas con una molécula de ADN que comprende el complemento completo de las sec. con núms. de ident.:26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 u 86; o (b) se deriva de las sec. con núms. de ident.:26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 u 86 por la alteración de uno o más nucleótidos por medio de al menos un método seleccionado del grupo que consiste en: deleción, sustitución, adición e inserción; y en donde esa planta exhibe una alteración de al menos una característica agronómica cuando se compara con una planta de control que no comprende ese constructo de ADN recombinante . 7. Una planta (por ejemplo, una planta de maíz, arroz o frijol de soja) que comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido, en donde ese polinucleótido comprende al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: : (a) el fragmento genómico IS125; (b) el fragmento Sub2 del fragmento genómico IS125; (c) el fragmento Sub3 del fragmento genómico IS125; (d) el fragmento Sub5 del fragmento genómico IS125; (e) el fragmento Sub7 del fragmento genómico IS125; (f) el fragmento Sub8 del fragmento genómico IS125; y (g) el fragmento genómico IS127. 8. Cualquier progenie de las plantas mencionadas anteriormente en las modalidades 1-7, cualquier semilla de las plantas mencionadas anteriormente en las modalidades 1-7, cualquier semilla de la progenie de las plantas mencionadas anteriormente en las modalidades 1-6 y las células de cualquiera de las plantas mencionadas anteriormente en las modalidades 1-7 así como la progenie de estas .

En cualquiera de las modalidades anteriores 1-8 o en cualquier otra modalidad la presente invención, el polipéptido DTP21 puede ser de Arabidopsis thaliana, Zea mays, Glycine max, Glycine tabacina, Glycine soja o Glycine tomentella.

En cualquiera de las modalidades anteriores 1-8 o en cualquier otra modalidad de la presente invención, el constructo de ADN recombiñante puede comprender por lo menos un promotor funcional en una planta como una secuencia reguladora.

En cualquiera de las modalidades anteriores 1-8 o en cualquier otra modalidad de la presente invención, la alteración de al menos una característica agronómica es un incremento o una disminución.

En cualquiera de las modalidades anteriores 1-8 o en cualquier otra modalidad de la presente invención, por lo menos la única característica agronómica puede seleccionarse del grupo que consiste en verdor, producción, índice de crecimiento, biomasa, peso fresco en la maduración,- peso seco en la maduración, producción de frutos, producción de semillas, contenido total de nitrógeno en la planta, contenido de nitrógeno en los frutos, contenido de nitrógeno en las semillas, contenido de nitrógeno en un tejido vegetativo, contenido total de aminoácidos libres en la planta, contenido de aminoácidos libres en los frutos, contenido de aminoácidos libres en las semillas, contenido de aminoácidos libres en un tejido vegetativo, contenido total de proteínas en la planta, contenido de proteínas en los frutos, contenido de proteínas en las semillas, contenido de proteínas en un tejido vegetativo, tolerancia a la sequía, captación de nitrógeno, resistencia al encamado de raíz, índice de cosecha, encamado del tallo, altura de la planta, altura de las espigas, longitud de las espigas, tolerancia a la sal, vigor de las plántulas tempranas y afloramiento de las plántulas en condiciones de estrés causado por temperaturas bajas. Por ejemplo, la alteración de por lo menos una característica agronómica podría ser un aumento en la producción, el verdor o la biomasa.

En cualquiera de las modalidades anteriores 1-8 o en cualquier otra modalidad de la presente invención, la planta puede exhibir la alteración de por lo menos una característica agronómica cuando se compara, en condiciones de limitación de agua, con una planta de control que no comprende ese constructo de ADN recombinante .

"Sequía" se refiere a una disminución en la disponibilidad de agua para una planta que, especialmente cuando es prolongada, puede dañar la planta o evitar su crecimiento adecuado (por ejemplo, limita el crecimiento de la planta o la producción de semillas) .

"Tolerancia a la sequía" es un rasgo de una planta para sobrevivir en condiciones de sequía durante periodos de tiempo prolongados sin mostrar un deterioro fisiológico o físico considerable.

La "tolerancia aumentada a la sequía" de una planta se mide con respecto a una planta de referencia o de control, y es un rasgo de la planta para sobrevivir en condiciones de sequía durante periodos de tiempo prolongados sin mostrar el mismo grado de deterioro fisiológico o físico con respecto a la planta de referencia o de control cultivada en condiciones de sequía similares. Típicamente, cuando una planta transgénica que comprende un constructo de ADN recombinante en su genoma exhibe una mayor tolerancia a la sequía con respecto a una planta de referencia o de control, la planta de referencia o de control no comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante.

Una persona de habilidad ordinaria en la técnica conoce los protocolos para simular condiciones de sequía y para evaluar la tolerancia a la sequía de plantas que se expusieron a condiciones de sequía naturales o simuladas. Por ejemplo, se pueden simular condiciones de sequía si se suministra a las plantas una cantidad de agua menor que la requerida normalmente o nada de agua durante un período de tiempo, y se puede evaluar la tolerancia a la sequía mediante la observación de las diferencias en la condición fisiológica y/o física que incluye (pero no se limita) al vigor, crecimiento, tamaño o longitud de la raíz o, particularmente, en el color de la hoja o el tamaño del área de la hoja. Otras técnicas para evaluar la tolerancia a la sequía incluyen la medición de la fluorescencia de la clorofila, los índices fotosintéticos y los índices de intercambio de gas .

Un experimento para probar el estrés de la sequía podría implicar un estrés crónico (es decir, eliminación lenta de agua) y/o dos estreses agudos (es decir, eliminación abrupta del agua) separados por uno o dos días de recuperación. El estrés crónico podría durar de 8 a 10 días. El estrés agudo podría durar de 3 a 5 días. Las siguientes variables podrían medirse durante el estrés de la sequía y los tratamientos de riego adecuado de plantas transgénicas y plantas de control relevantes: La variable "% de área camb_inicio crónico - agudo2" es una medida del porcentaje de cambio en el área total determinada por medio de captación remota de imágenes de espectro visible entre el primer día de estrés crónico y el día del segundo estrés agudo.

La variable "% de área camb_inicio crónico - fin crónico" es una medida del porcentaje de cambio en el área total determinada por medio de captación remota de imágenes de espectro visible entre el primer día de estrés crónico y. el último día de estrés crónico.

La variable "% de área camb_inicio crónico - cosecha" es una medida del porcentaje de cambio en el área total determinada por medio de captación remota de imágenes de espectro visible entre el primer día de estrés, crónico y el día de cosecha.

La variable "% de área camb_inicio crónico - recuperación 24 h" es una medida del porcentaje de cambio en el área total determinada por medio de captación remota de imágenes de espectro visible entre el primer día de estrés crónico y las 24 horas de recuperación (24 horas después del estrés agudo 2) .

La variable "psii_agudol" es una medida de la eficacia del Photosystem II (PSII) al final del primer período de estrés agudo. Proporciona un cálculo de la eficacia de las antenas del PSII para absorber la luz y se relaciona directamente con la asimilación de dióxido de carbono dentro de la hoja.

La variable upsii_agudo2" es una medida de la eficacia del Photosystem II (PSII) al final del segundo período de estrés agudo. Proporciona un cálculo de la eficacia de las antenas del PSII para absorber la luz y se relaciona directamente con la asimilación de dióxido de carbono dentro de la hoja.

La variable "fv/fm_agudol" es una medida del rendimiento cuántico óptimo (Fv/Fm) al final del primer estrés agudo - (diferencia de fluorescencia variable entre la fluorescencia máxima y mínima / fluorescencia máxima) .

La variable "fv/fm_agudo2" es una medida del rendimiento cuántico óptimo (Fv/Fm) al final del segundo estrés agudo - (diferencia de fluorescencia variable entre la fluorescencia máxima y mínima / fluorescencia máxima) .

La variable "enrollamiento de hoj a_cosecha" es una medida de la relación de la imagen superior a la imagen lateral en el día de la cosecha.

La variable "enrollamiento de hoj a_recuperación 24 h" es una medida de la relación de la imagen superior a la imagen lateral 24 horas después de iniciada la recuperación.

La variable "índice de crecimiento específico (SGR, por sus siglas en inglés)" representa el cambio en el área de superficie total de la planta (medida con un instrumento Lemna Tec Instrument) en un solo día (Y(t) = Y0*er*t) . Y(t) = Y0*er*t es equivalente al % de cambio en ?/? t, en donde los términos individuales son los siguientes: Y(t) = Área de superficie total en t; YO = Área de superficie total inicial (calculada) ; r = índice de crecimiento específico día"1 y t = Días después de la plantación ("DAP", por sus siglas en inglés).

La variable "peso seco del brote" es una medida del peso del brote 96 horas después de colocarlo en un horno a 104 °C.

La variable "peso fresco del brote" es una medida del peso del brote inmediatamente después de cortarlo de la planta.

Los ejemplos incluidos a continuación describen algunos protocolos y técnicas representativas para simular condiciones de sequía y/o para evaluar la tolerancia a la sequía.

Además, se puede evaluar la tolerancia a la sequía en base a la capacidad de una planta para mantener la producción suficiente (una producción de por lo menos 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %) determinada en las pruebas de campo en condiciones de sequía natural o simulada (por ejemplo, mediante la medición de una producción considerablemente equivalente en condiciones de sequía en comparación con condiciones que no implican sequía o mediante la medición de una pérdida menor de producción en condiciones de sequía en comparación con una planta control o de referencia) .

Una persona con experiencia en la técnica reconocería fácilmente una planta de control o de referencia adecuada para su uso al evaluar o determinar una característica agronómica o fenotipo de una planta transgénica en cualquier modalidad de la presente invención en la cual se usa una planta de control (por ejemplo, las composiciones o métodos que se describen en la presente invención) . Por ejemplo, a manera de ilustraciones no limitantes: 1. La progenie de una planta transformada que es hemicigota con respecto a un constructo de ADN recombinante, de tal manera que la progenie se segregue en plantas que comprenden o no comprenden el constructo de ADN recombinante: la progenie que comprende el constructo de ADN recombinante se mediría, típicamente, con respecto a la progenie que no comprende el constructo de ADN recombinante (es decir, la progenie que no comprende el constructo de ADN recombinante es la planta de control o de referencia) . 2. Introgresión de un constructo de ADN recombinante en una línea endogámica, tal como en el maíz o en una variedad, tal como en el frijol de soja: la línea introgresada se mediría, típicamente, con respecto a la línea de variedad o endogámica parental (es decir, la línea de variedad o endogámica parental es la planta de control o de referencia) . 3. Dos líneas híbridas, en donde la primera línea híbrida se produce a partir de dos líneas endogámicas parentales y la segunda línea híbrida se produce a partir de las mismas dos líneas endogámicas parentales con la diferencia de que una de las líneas endogámicas parentales contiene un constructo de ADN recombinante : la segunda línea híbrida se mediría, típicamente, con respecto a la primera línea híbrida (es decir, la primera línea híbrida es la planta de control o de referencia) . 4. Una planta que comprende un constructo de ADN recombinante: la planta se puede evaluar o determinar en relación con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante, pero que de cualquier otra forma tiene antecedentes genéticos comparables con la planta (p. ej . , comparte una identidad de secuencia de por lo menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de material genético nuclear en comparación con la planta que comprende el constructo de ADN recombinante.

Existen varias técnicas de laboratorio disponibles para el análisis, la comparación y la caracterización de antecedentes genéticos de las plantas; entre ellas se incluyen: electroforesis de isoenzimas, polimorfismo de la longitud de fragmentos de restricción (RFLP, por sus siglas en inglés) , ADN polimórfico amplificado al azar (RAPD, por sus siglas en inglés) , reacción en cadena de la polimerasa con iniciadores arbitrarios (AP-PCR, por sus siglas en inglés) , análisis de amplificación de la huella del ADN (DAF, por sus siglas en inglés) , regiones amplificadas caracterizadas de secuencia (SCAR, por sus siglas en inglés) , polimorfismo de la longitud de fragmentos amplificados (AFLP®, por sus siglas en inglés) y repeticiones de secuencia simple (SSR, por sus siglas en inglés) conocidas, además, como microsatélites .

Además, un experto en la técnica reconocería fácilmente que una planta control o de referencia adecuada que se usa al evaluar o determinar una característica agronómica o fenotipo de una planta transgénica no incluiría una planta que haya sido seleccionada anteriormente, por mutagénesis o transformación, con respecto a la característica agronómica o fenotipo deseado. Métodos- : Los métodos incluyen, pero no se limitan a, los métodos para aumentar la tolerancia a la sequía en una planta, los métodos para evaluar la tolerancia a la sequía en una planta, los métodos para alterar una característica agronómica en una planta, los métodos para determinar una alteración de una característica agronómica en una planta y los métodos para producir semillas. La planta puede ser una planta monocotiledónea o dicotiledónea, por ejemplo, una planta de maíz, arroz o frijol de soja. Además, la planta puede ser girasol, sorgo, cañóla, trigo, alfalfa, algodón, cebada o mijo. La semilla puede ser una semilla de maíz, arroz o frijol de soja, por ejemplo, una semilla híbrida de maíz o una semilla endogámica de maíz.

Los métodos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes : Un método para transformar una célula que comprende transformar una célula con cualquiera de los polinucleótidos aislados de la presente invención. Además, se incluye la célula transformada por este método. En modalidades específicas, la célula es una célula eucariota, por ejemplo, una célula de una planta, insecto o levadura, o procariota, por ejemplo, una célula de una bacteria.

Un método para producir una planta transgénica que comprende transformar una célula de una planta con cualquiera de los polinucleótidos aislados o constructos de ADN recombinante de la presente invención y regenerar una planta transgénica de la célula vegetal transformada. La invención está dirigida, además, a la planta transgénica producida por este método, y a la semilla transgénica obtenida de esta planta transgénica.

Un método para aislar un polipéptido de la invención a partir de una célula o medio de cultivo de la célula, en donde la célula comprende un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido de la ^invención unido operativamente a por lo menos una secuencia reguladora, y en donde la célula huésped transformada se cultiva en condiciones adecuadas para la expresión del constructo de ADN recombinante.

Un método para alterar el nivel de expresión de un polipéptido de la invención en una célula huésped; el método comprende: (a) transformar una célula huésped con un constructo de ADN recombinante de la presente invención y (b) cultivar la célula huésped transformada en condiciones adecuadas para la expresión del constructo de ADN recombinante, en donde la expresión del constructo de ADN recombinante resulta en la producción de niveles alterados del polipéptido de la invención en la célula huésped transformada.

Un método para aumentar la tolerancia a la sequía en una planta; el método comprende: (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operativamente a por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) , en donde el polinucleótido codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos 50 51 ¦6 / 52 %, 53 %, 54 %, 55 % , 56 % , 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 62 %, 63 %, 64 %, 65 % , 66 % , 67 68 %, 69 %, 70 %, 71 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 % , 86 % / 87 %, 88 89 %, 90 91 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 % 99 ¾ o 100 % basada en el método de alineamiento Clustal V cuando se compara con las sec . con núms. de ident.:27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 u 87; y (b) regenerar una planta transgénica de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante y exhibe una mayor tolerancia a la sequía cuando se compara con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante. El método podría comprender, además, (c) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde esa planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante y muestra una tolerancia aumentada a la sequía en comparación con una planta control que no comprende el constructo de ADN recombinante.

Un método para aumentar la tolerancia a la sequía en una planta; el método comprende: (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operativamente a por lo menos un elemento regulador, en donde ese polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de tolerancia a la sequía, en donde la secuencia de nucleótidos: (a) es hibridable en condiciones rigurosas con una molécula de ADN que comprende el complemento completo de las sec. con núms. de ident.:26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 u 86; o (b) se deriva de las sec. con núms. de ident.:26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 u 86 por la alteración de uno o más nucleótidos por medio de al menos un método seleccionado del grupo que consiste en: deleción, sustitución, adición e inserción; y (b) regenerar una planta transgénica de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante y exhibe una mayor tolerancia a la sequía cuando se compara con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante. El método podría comprender, además, (c) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde esa planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante y muestra una tolerancia aumentada a la sequía en comparación con una planta control que no comprende el constructo de ADN recombinante .

Un método para evaluar la tolerancia a la sequía en una planta; el método comprende (a) obtener una planta transgénica, en donde la planta transgénica comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operativamente a por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) , en donde ese polinucleótido codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos 50 o, "O i 51 o. 52 %, 53 o.

O , 54 o, O f 55 Q. ¾ 56 o. 0, 0 f 57 "O / 58 O, "0 , 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 % , 64 o, "O / 65 %, 66 %, 67 O, *o , 68 %, 69 %, 70 o, o, 0 / 71 0, ¾ , 72 %, 73 % , 74 *o / 75 g, ¾ / 76 o, "o r 77 % , 78 "o , 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 % , 84 %, 85 % , 86 %, 87 % , 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 % , 94 %, 95 g, o , 96 97 , 98 99 % o 100 % basada en el método de alineamiento Clustal V cuando se compara con las sec . con núms . de ident.:27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 u 87; (b) obtener una planta progenie derivada de esa planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante ; y (c) evaluar la planta progenie para determinar la tolerancia a la sequía por comparación con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante.

Un método para evaluar la tolerancia a la sequía en una planta; el método comprende (a) obtener una planta transgénica, en donde la planta transgénica comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operativamente a por lo menos un elemento regulador, en donde ese polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de tolerancia a la sequía, en donde la secuencia de nucleótidos: (a) es hibridable en condiciones rigurosas con una molécula de ADN que comprende el complemento completo de las sec. con núms. de ident.:26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 u 86; o (b) se deriva de las sec. con núms. de ident. :26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 u 86 por la alteración de uno o más nucleótidos por medio de al menos un método seleccionado del grupo que consiste en: deleción, sustitución, adición e inserción; (b) obtener una planta progenie derivada de esa planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante ; y (c) evaluar la planta progenie para determinar la tolerancia a la sequía por comparación con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante .

Un método para determinar una alteración de una característica agronómica en una planta; el método comprende (a) obtener una planta transgénica, en donde la planta transgénica comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operativamente a por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) , en donde ese polinucleótido codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos 50 %, 51 52 53 %, 54 55 56 %, 57 %, 58 59 60 % 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 66 %, 67 68 69 70 % 71 , 72 %, 73 %, 74 75 %, 76 77 %, 78 %, 79 80 % 81 %, 82 %, 83 %, 84 85 86 87 %, 88 %, 89 90 % 91 92 %, 93 %, 94 %, 95 96 97 %, 98 % 99 % o 100 basada en el método de alineamiento Clustal V cuando se compara con las sec. con núms . de ident.:27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 u 87; (b) obtener una planta progenie derivada de esa planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante ; y (c) determinar si la planta progenie exhibe una alteración en al menos una característica agronómica cuando se compara, opcionalmente en condiciones de limitación de agua, con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante .

Un método para determinar una alteración de una característica agronómica en una planta; el método comprende (a) obtener una planta transgénica, en donde la planta transgénica comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operativamente a por lo menos un elemento regulador, en donde ese polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de tolerancia a la sequía, en donde la secuencia de nucleótidos: (a) es hibridable en condiciones rigurosas con una molécula de ADN que comprende el complemento completo de las sec. con núms. de ident.:26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 u 86; o (b) se deriva de las sec. con núms. de ident.:26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 u 86 por la alteración de uno o más nucleótidos por medio de al menos un método seleccionado del grupo que consiste en: deleción, sustitución, adición e inserción; (b) obtener una planta progenie derivada de esa planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el" constructo de ADN recombinante ; y (c) determinar si la planta progenie exhibe una alteración en al menos una característica agronómica cuando se compara, opcionalmente en condiciones de limitación de agua, con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante.

Un método para producir semillas (por ejemplo, semillas que se pueden vender como productos tolerantes a la sequía) el método comprende cualquiera de los métodos anteriores y comprende, además, obtener semillas de esa planta progenie, en donde esas semillas comprenden en su genoma ese constructo de ADN recombinante.

En cualquiera de los métodos anteriores o en cualquier otra modalidad de los métodos de la presente invención, en esa etapa de introducción, esa célula vegetal regenerable podría comprender una célula callosa, una célula callosa embriogénica, una célula gamética, una célula meristemática o una célula de un embrión inmaduro. Las células vegetales regenerables se podrían derivar de una planta endogámica de maíz.

En cualquiera de los métodos anteriores o en cualquier otra modalidad de los métodos de la presente invención, esa etapa de regeneración podría comprender lo siguiente: (i) cultivar esas células vegetales transformadas en un medio que comprende una hormona promotora de la embriogénesis hasta que se observa la organización del callo; (ii) transferir esas células vegetales transformadas de la etapa (i) a un primer medio que incluye una hormona promotora de la organización tisular y (iii) subcultivar esas células vegetales transformadas después de la etapa (ii) sobre un segundo medio para permitir el alargamiento del brote, el desarrollo de la raíz o ambos.

En cualquiera de los métodos anteriores o en cualquier otra modalidad de los métodos de la presente invención, por lo menos la única característica agronómica podría seleccionarse del grupo que consiste en verdor, producción, índice de crecimiento, biomasa, peso fresco en la maduración, peso seco en la maduración, producción de frutos, producción de semillas, contenido total de nitrógeno en la planta, contenido de nitrógeno en los frutos, contenido de nitrógeno en las semillas, contenido de nitrógeno en un tejido vegetativo, contenido de aminoácidos libres en la planta, contenido de aminoácidos libres en los frutos, contenido de aminoácidos libres en las semillas, contenido de aminoácidos libres en un tejido vegetativo, contenido total de proteínas en la planta, contenido de proteínas en los frutos, contenido de proteínas en las semillas, contenido de proteínas en un tejido vegetativo, tolerancia a la sequía, captación de nitrógeno, ubicación de la raíz, índice de cosecha, ubicación del tallo, altura de la planta, altura de las espigas, longitud de las espigas, tolerancia a la sal, vigor de las plántulas tempranas y afloramiento de las plántulas en condiciones de estrés de temperaturas bajas. La alteración de por lo menos una característica agronómica podría ser un aumento en la producción, el verdor o la biomasa.

En cualquiera de los métodos anteriores o en cualquier otra modalidad de los métodos de la presente invención, la planta puede exhibir la alteración de al menos una característica agronómica cuando se compara, en condiciones de limitación de agua, con una planta de control que .no comprende ese constructo de ADN recombinante .

En cualquiera de los métodos anteriores o en cualquier otra modalidad de los métodos de la presente invención, existen alternativas para introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operativamente a por lo menos una secuencia reguladora. Por ejemplo, se podría introducir en una célula vegetal regenerable una secuencia reguladora (tal como uno o más potenciadores , opcionalmente , como parte de un elemento transponible) y, después, ensayar en busca de un evento en el que la secuencia reguladora se una operativamente a un gen endógeno que codifica un polipéptido de la presente invención.

La introducción de constructos de ADN recombinante de la presente invención en plantas se podría realizar mediante cualquiera de las técnicas adecuadas que incluyen, pero no se limitan a, la captación directa de ADN, el tratamiento con sustancias químicas, la electroporación, la microinyección, la fusión celular, la infección, la transferencia de ADN mediada por vectores, el bombardeo o la transformación mediada con Agrobacterium. Las técnicas para transformar y regenerar plantas se han descrito en la publicación de patente internacional núm. O 2009/006276, cuyo contenido se incorpora en la presente descripción como referencia.

El desarrollo o regeneración de plantas que contienen el fragmento foráneo, exógeno de ácido nucleico que codifica una proteína de interés se conoce bien en la técnica. Las plantas regeneradas se podrían autopolinizar para proporcionar plantas transgénicas homocigóticas . De lo contrario, el polen obtenido de las plantas regeneradas se cruza con el de plantas cultivadas de semillas de líneas agronómicamente importantes. A la inversa, el polen de las plantas de estas líneas importantes se usa para polinizar plantas regeneradas. Una planta transgénica de la presente invención que contiene un polipéptido deseado se cultiva por medio de métodos muy conocidos por una persona con experiencia en la técnica.

EJEMPLOS La presente invención se ilustra con más detalle en los siguientes ejemplos, en los cuales las partes y los porcentajes están en peso y los grados están en grados Celsius, a menos que se indique de otra manera. Debe entenderse que si bien estos ejemplos señalan las modalidades preferidas de la invención, se aportan a manera de ejemplo únicamente. A partir de la descripción anterior y de estos ejemplos, una persona con experiencia en la técnica podrá determinar las características esenciales de esta invención y, sin apartarse del espíritu ni del alcance de ella, podrá introducir varios cambios y modificaciones en la invención para adaptarla a los diversos usos- y condiciones. Por consiguiente, diversas modificaciones de la invención además de aquellas que . se muestran y describen en la presente serán aparentes para aquellos con experiencia en la técnica a partir de la descripción anterior. Las modificaciones también estarán comprendidas dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplo 1 Creación de una genoteca de cósmidos de pasto Sudán Se compraron semillas de Sorghum sudanense cv. Sugar Slim (pasto Sudán) en Kaneko Seeds Co . , Ltd. y se plantaron para cultivarlas en un invernadero. Se extrajo el ADN genómico de las hojas de las plantas. El ADN genómico extraído se trató por medio de digestión parcial con la enzima de restricción Taql y, después, se prepararon fracciones que contenían ADN de 30 kb a 50 kb por medio de centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa. El ADN de esas fracciones se clonó en el vector cósmido pSB200 tratado previamente por digestión con Nsp(7524)V (designado, además, como "NspV" en la presente descripción) para construir una genoteca de ADN genómico.

El vector de clonación pSB200 se construyó a partir de pSBll (Komari et al. Plant J. 10:165-174, 1996). Específicamente, se colocó un promotor de ubiquitina antes de un gen de resistencia a la higromicina y de la señal del terminal 3' del gen NOS. Se añadió un sitio de clivaje Nsp(7524)V al constructo que, después, se insertó en pSBll y, de esa manera, se construyó pSB200. Con el pSB200 se puede construir una genoteca de ADN genómico que tiene una longitud de fragmento promedio de aproximadamente 40 kb . Además, el vector pSB200 es un vector de transformación para plantas superiores y contiene el gen de resistencia a la higromicina útil como marcador seleccionable . La mayoría de los fragmentos de ADN clonados en la genoteca tenían un tamaño de aproximadamente 30 kb a aproximadamente 50 kb y el número total de clones era de aproximadamente 30,000. Se usaron las cepas de E. coli DH5a™ y GENEHOGS®.

Ejemplo 2 Ensayos para identificar líneas de arroz transgénico con una mayor tolerancia a la sequía Se compraron semillas originales de cultivar de arroz Yukihikari de un minorista de alimentos y las semillas de la progenie se cultivaron en invernaderos. Las semillas originales del cultivar de arroz Suweon 287 se obtuvieron del National Institute oE Agribiological Resources de Japón y las semillas de la progenie se cultivaron en invernaderos.

La capacidad de las plantas de arroz para sobrevivir a una escasez severa de agua en recipientes pequeños se analizó por medio del siguiente método. 1) Se cultivaron seis plantas transgénicas y una planta de control de Suweon 287 y de Yukihikari juntas en la tierra de una maceta pequeña (10.5 cm de diámetro, 9 cm de altura, 570 mi de volumen) . Suweon 287 es un cultivar de control tolerante a la sequía y Yukihikari es un cultivar de control susceptible a la sequía. En estas condiciones las raíces quedan contenidas en un espacio limitado de manera que la diferencia en la capacidad para extender las raíces hacia la profundidad del suelo no es un factor en el ensayo. La condición general de las plantas en este método es bastante uniforme porque la variación en el contenido de agua en el suelo dentro de una maceta es muy pequeña. 2) Una vez que se extiende la sexta hoja, el riego se retiene por tres a cuatro días hasta que las hojas del control Yukihikari pierden cualquier signo aparente de viabilidad. El nivel de deshidratación puede variar de una maceta a otra en cierta medida, pero la apariencia del control Yukihikari proporciona una indicación adecuada del nivel de estrés por sequía en la maceta. 3) Para facilitar la puntuación las plantas se riegan nuevamente y se examinan al día siguiente. 4) Al día siguiente se examinan las plantas visualmente y se asigna puntuación de conformidad con los criterios descritos en la Tabla 1.

Tabla 1 Criterios para asignar puntaje en el ensayo de sequía del arroz Emergencia de cuatro hojas superiores de una planta que se regó nuevamente después del estrés por sequía Parte viable de la Parte viable del área expuesta de Valor lámina de la hoja la vaina de la hoja Ninguno Ninguno Menos de la mitad de la suma de las Ninguno cuatro hojas La mitad o más de la suma de las Ninguno cuatro hojas Tres cuartos o más de la suma de Una hoj a las cuatro hojas Tres cuartos o más de la suma de Dos hojas las cuatro hojas Tres o cuatro hojas Todas Este ensayo es simple y altamente reproducible Los puntajes de más de la mitad de las plantas Suweon 287 son, usualmente, de 2 o más en este ensayo mientras que los puntajes de las plantas susceptibles raramente exceden un valor .de 2. Por lo tanto, cuando los puntajes de dos o más plantas en una línea probada son de 2 o mayores, la línea se registra como tolerante a la sequía.

Ejemplo 3 Identificación de cósmidos de pasto Sudán que confieren al arroz tolerancia a la sequía Los clones que constituyen la genoteca de ADN genómico derivado de pasto Sudán descrito en el Ejemplo 1 se transfirieron individualmente a la cepa de Agrobacterium LBA4404 (pSBl) (Komari et al. Plant J. 10:165-174,1996) . Para la transferencia se usó el método de apareamiento triparental (Ditta et al. Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos 77:7347-7351, 1980) . Los fragmentos de ADN genómico en las líneas de Agrobacterium resultantes que portan los clones se introdujeron individualmente en el cultivar de arroz Yukihikari . El método de transformación se realizó de acuerdo con Hiei et al. (Plant J. 6:271-282, 1994) y se basó en la inoculación de embriones inmaduros con Agrobac erium . Se usó un gen de resistencia a la higromicina como marcador de selección. Los embriones inmaduros del cultivar Yukihikari se obtuvieron de plantas cultivadas en un invernadero. Se compraron semillas originales de cultivar de arroz Yukihikari de un minorista de alimentos y se usaron las semillas de la progenie cultivadas en invernaderos.

Se obtuvieron plantas transgénicas que contenían fragmentos de ADN genómico individuales de pasto Sudán. Para cada fragmento de ADN genómico se obtuvieron una o dos plantas individuales de eventos de transformación independientes. De aquí en adelante se hará referencia a las plantas transgénicas de la generación inicial como plantas de la generación TO y a su progenie como generación TI, generación T2 , etc. de conformidad con la regla general.

Las plantas de la progenie TI derivadas de las plantas transgénicas se examinaron para determinar la tolerancia a la sequía. Para cada transformante de TO descrito anteriormente se probaron seis plantas TI. Así, se ordenó un total de 1045 fragmentos genómicos de pasto Sudán de conformidad con los puntajes obtenidos en el primer ensayo de TI y, de la parte superior de la lista, se seleccionaron 128 de ellos para otro ensayo de TI. Posteriormente, se seleccionaron 25 fragmentos para un análisis más detal lado .

Se obtuvieron semillas de T2 a partir de plantas TI resistentes a la higromicina derivadas de arroz transformado con cada uno de los 25 fragmentos. De cada una de las 25 líneas T2 se examinaron 12 plantas resistentes a la higromicina para determinar la tolerancia a la sequía. Se repitió el ensayo de T2.

La línea de progenie del cultivar de arroz Yukihikari transformado con un fragmento genómico particular de pasto Sudán que se designó como el fragmento genómico "IS125" se detectó repetidamente como tolerante a la sequía en los ensayos de TI y T2. El evento de arroz transgénico que contenía el fragmento genómico IS125, tal como se analizó a partir de estos ensayos, se designó como "IS125 evento núm . 1" .

Las Tablas 2, 3 y 4 muestran los resultados de las pruebas de tolerancia a la sequía del IS125 evento núm. 1 del arroz transgénico en las generaciones TI, T2 y T3 , respectivamente. En el ensayo T3 se examinaron 12 plantas de fenotipos resistentes a la higromicina y 12 plantas del fenotipo sensible a la higromicina. Tal como se demuestra claramente en esta tabla, el rasgo de tolerancia a la sequía conferido por el fragmento genómico IS125 se detectó repetidamente y se heredó establemente hasta la generación T3 y los rasgos de tolerancia a la sequía y resistencia a la higromicina se cosegregaron .

Tabla 2 Ensayo de sequía de TI de una línea de arroz transformada con el fragmento genómico IS125 Núm. total Núm. de plantas Es . de plantas con puntaje de Respuesta a núm. Línea probadas 2 o mayor la sequía 1 Yukihikari 6 0 Susceptible 1 Suweon 287 6 5 Tolerante 1 IS125 evento 6 2 Tolerante núm . 1 2 Yukihikari 6 0 Susceptible 2 Suweon 287 6 3 Tolerante 2 IS125 evento 6 4 Tolerante núm . 1 Tabla 3 Ensayo de sequía de T2 de una línea de arroz transformada con el fragmento genómico IS125 Núm . de Núm. total de plantas con Exp. plantas puntaje de 2 o Respuesta a la núm. Línea probadas mayor seguía Yukihikari 12 Susceptible Su eon 287 12 Tolerante IS125 evento núm. 12 Tolerante 1 Yukihikari 12 0 Susceptible Suweon 287 12 10 Tolerante IS125 evento núm. 1 12 10 Tolerante Tabla 4 Ensayo de sequía de T3 de una línea de arroz transformada con el fragmento genómico IS125 Núm. total de plantas con plantas puntaje de 2 o Respuesta a la Esp. núm. Línea probadas mayor sequía Yukihikari 12 Susceptible Suweon 287 10 Tolerante Progenie resistente a la higromicina del 12 Tolerante IS125 evento núm. 1 Progenie sensible a la higromicina 12 Susceptible del IS125 evento núm. 1 Yukihikari 12 0 Susceptible Suweon 287 12 3 Tolerante Progenie resistente a la 12 11 Tolerante higromicina del IS125 evento núm. 1 Progenie sensible a la higromicina 12 Susceptible del IS125 evento núm. 1 Además, el cultivar de arroz Yukihikari se transformó otra vez con el fragmento genómico IS125 tal- como se describió anteriormente, y los eventos adicionales se examinaron para determinar la tolerancia a la sequía en la generación TI. Uno de los eventos de arroz transgénico designado como "IS125 evento núm. 3", fue claramente tolerante a la sequía en la generación TI (Tabla 5) .

Tabla 5 Ensayo de tolerancia de TI de líneas de arroz adicionales transformadas con el fragmento genómico IS125 Núm. total de Núm. de plantas plantas con puntaje de 2 o Respuesta a la Línea probadas mayor seguía Yukihikari 12 0 Susceptible Suweon 287 12 8 Tolerante IS125 evento núm. 2 12 0 Susceptible IS125 evento núm. 3 12 10 Tolerante IS125 evento núm. 4 12 0 Susceptible IS1 5 evento núm. 5 12 1 Susceptible La línea de progenie del cultivar de arroz Yukihikari transformado con un fragmento genómico diferente de pasto Sudán que se designó como el fragmento genómico "IS127" se detectó, además, repetidamente como tolerante a la sequía en los ensayos de TI y T2. El evento de arroz transgénico del fragmento genómico IS127 analizado a partir de estos ensayos se designó como "IS127 evento núm. 1" . La Tabla 6 muestra los resultados de la prueba de tolerancia a la sequía del IS127 evento num. 1 del arroz transgénico en' la generación T3. Así, se demostró claramente que la tolerancia a la sequía conferida por el fragmento genómico IS127 se detectó repetidamente y se heredó establemente hasta la generación T3.

Tabla 6 Ensayo de sequía de T3 de una línea de arroz transformada con el fragmento genómico IS127 Núm. total de Núm. de plantas Es . plantas con puntaje de 2 Respuesta a la núm . Línea probadas o mayor sequía 1 Yukihikari 12 0 Susceptible 1 Suweon 287 12 3 Tolerante 1 IS127 evento núm. 12 10 Tolerante 1 2 Yukihikari 12 0 Susceptible 2 Suweon 287 12 3 Tolerante 2 IS127 evento núm. 12 8 Tolerante 1 Además, el cultivar de arroz Yukihikari se transformó otra vez con el fragmento genómico IS127 tal como se describió anteriormente, y los eventos adicionales se examinaron para determinar la tolerancia a la sequía en la generación TI. Los 3 eventos de arroz transgénico probados designados como "IS127 evento núm. 2", "IS127 evento núm. 3" e "IS127 evento núm. 4" fueron claramente tolerantes a la sequía en la generación TI (Tabla 7) .

Tabla 7 Ensayo de tolerancia de TI de líneas de arroz adicionales transformadas con el fragmento genómico IS127 Núm . de Núm. total de plantas con plantas puntaje de 2 o Respuesta a la Línea probadas mayor sequía Yukihikari 12 0 Susceptible Suweon 287 12 8 Tolerante IS127 evento núm 12 4 Tolerante IS127 evento núm 12 7 Tolerante IS1 7 evento núm 12 6 Tolerante Ejemplo 4 Identificación de DTP21 como un gen candidato tolerante a la sequía Tal como se muestra en el EJEMPLO 3 se encontró que el fragmento genómico IS125 de pasto Sudán fue capaz de proporcionar tolerancia a la sequía al cultivar de arroz Yukihikari . El fragmento genómico IS125 se secuenció completamente por medio de un procedimiento estándar para obtener la sec . con núm. de ident . : 1 que consiste en 42,104 nucleótidos. Se realizó el análisis por PCR para identificar las regiones del fragmento genómico IS125 presentes en la línea de arroz transgénico, IS125 evento núm. 3. Se diseñaron seis pares de iniciadores de PCR (MI, M2 , M3 , M4 , M5 y M6) basados en la secuencia del fragmento genómico IS125 tal como sé muestra en la Fig. 1. Además, el par M-Hpt se deriva de la secuencia del gen marcador seleccionable , HPT. Se aislaron muestras de ADN de plantas progenie de T2 derivadas de una planta progenie de TI tolerante a la sequía del IS125 evento núm. 3 y se examinaron por medio de los pares de iniciadores enunciados en la Fig. 1. Los pares de iniciadores MI, M2 y M-Hpt amplificaron los fragmentos de ADN esperados a partir de toda la progenie. Sin embargo, los pares de iniciadores M , M4 , M5 y M6 no pudieron amplificar los productos esperados. Estos resultados concuerdan con la hipótesis de que el segmento entre MI y M2 está presente en IS125 evento núm. 3 mientras que el segmento entre M3 y M6 no está presente. Así, es posible que el gen con tolerancia a la sequía se ubique en la región entre MI y M2.

A continuación se subclonaron fragmentos del fragmento genómico IS125 (Fig. 2) y se introdujeron en el cultivar de arroz Yukihikari para confirmar la hipótesis descrita anteriormente. La Tabla 8 muestra el resumen del ensayo de tolerancia a la sequía del arroz transformado con el fragmento genómico IS125 y varios subfragmentos de IS125.

Tabla 8 Ensayo de tolerancia a la sequía del arroz transformado con el fragmento genómico IS125 y varios subfragmentos Sec . con núm . de ident . : 1 Evento (s) Coordenadas tolerante (s) a la Fragmento de ADN Tamaño (bp) De A sequía IS125 40, 040 10 40,049 : Sí . Sub5 12,938 1,659 14,596 Sí Sub2 8,068 2,343 10,410 Sí Sub4 6,833 7,738 14,570 No Sub3 3,158 2,868 6,025 Sí Sub8 2,083 3,735 5,817 Sí Sub7 1,210 4,608 5,817 Sí Un fragmento del subclon, el fragmento PvuII -BstZ17I de 12.9 kb, designado de aquí en adelante como "Sub5" y que cubre la mayor parte de la región M1-M3 (Fig. 2) , se insertó en pSB200 y se confirmaron las secuencias en las regiones de unión. El plásmido resultante se introdujo en la cepa de Agrobacterium LBA4404 (pSBl) por medio de apareamiento triparental . El Agrobacterium recombinante se usó para transformar el cultivar de arroz Yukihikari tal como se describió en el Ejemplo 3. El cultivar de arroz Yukihikari se transformó, además, con Agrobacterium LBA4404 que portaba pSB134 (Hiei y Komari, Plant Cell Tissue and Organ Cult. 85:271-283, 2006) y que contenía un gen de resistencia a la higromicina y un gen GUS .

El arroz transformado con Sub5 se ensayó para determinar la tolerancia a la sequía en las generaciones TO y TI. Para la generación TO, diez de 48 regenerantes de transformantes de Sub5 generaron un puntaje de 2 o mayor mientras que ninguno de los 48 regenerantes de transformantes de GUS que eran plantas de control susceptibles a la sequía generó el puntaje (Tabla 9) . Por lo tanto, el fragmento Sub5 fue suficiente para generar eventos de t ansformación del arroz tolerantes a la sequía.

Tabla 9 Ensayo de tolerancia a la sequía de regenerantes TO del arroz transformado con Sub5 ADN usado en la Núm. total de Núm. de regenerantes con Regenerantes transformación regenerantes puntaje de 2 o mayor tolerantes a probados la seguía GUS (Control) 48 0 No Su 5 48 10 Sí La Tabla 10 muestra los resultados de los ensayos de tolerancia a la sequía de la generación TI del arroz transformado con el subfragmento Sub5 del fragmento genómico IS125. Se probaron siete líneas (designadas como "Sub5 evento núm. 1" - "Sub5 evento núm. 7") derivadas de siete eventos con un puntaje de 2 o mayor en la generación T0. Seis de las siete líneas mostraron claramente tolerancia a la sequía. El IS125 evento núm. 3 del arroz transgénico en la generación T5 se ensayó, además, en estas pruebas de evaluación de subfragmentos y fue distintivamente tolerante a la sequía en cada experimento. En consecuencia, la tolerancia a la sequía conferida por el fragmento genómico IS125 se heredó establemente a la generación T5 y esta serie de ensayos de tolerancia a la sequía se controló adecuadamente.

Tabla 10 Ensayo de tolerancia a la sequía de la generación TI de siete líneas de arroz transgénico transformado con Sub5 Núm . de Núm. total de Esp . Puntaje plantas con Respuesta a Línea plantas num. T0 un puntaje de la sequía probadas 2 o mayor Yukihikari 12 Susceptible IS125 evento núm. 12 12 Tolerante 3 (T5) Sub5 evento núm. 12 Susceptible 1 Sub5 evento núm. 3 12 8 Tolerante 2 1 Sub5 evento núm. 3 12 2 Tolerante 3 2 Yukihikari — 12 0 Susceptible 2 IS125 evento núm. 3 (T5) — 12 11 Tolerante 2 Sub5 evento núm. 4 2 12 5 Tolerante 2 Sub5 evento núm. 5 3 12 11 · Tolerante 2 Sub5 evento núm. 6 4 12 9 Tolerante 2 Sub5 evento núm. 7 3 12 10 Tolerante Para definir aún más la región que contiene el gen de tolerancia a la sequía se probaron subfragmentos más pequeños . El fragmento Smal de 8.1 kb (de aquí en adelante designado como "Sub2"), el fragmento HindIII de 3.2 kb (de aquí en adelante designado como "Sub3") y el fragmento BstBI de 6.8 kb (de aquí en adelante designado como "Sub4")/ cada uno de los cuales es un subfragmento de Sub5, se insertaron en pSB200 pretratado con Eco V, HindIII y BstBI, respectivamente y, después, con CIAP. En una forma similar a la descrita para Sub5, cada uno de los tres subfragmentos se introdujo en el cultivar de arroz Yukihikari por medio del método de transformación mediado por Agrobacterium.

Dieciséis eventos de arroz transformado con el subfragmento Sub2 se examinaron para determinar la tolerancia a la sequía en la generación TI (Tabla 11) . Seis eventos (Sub2 eventos núm. 5, núm. 7, núm. 9, núm. 12, núm. 15 y núm. 16) fueron claramente tolerantes a la sequía.

Tabla 11 Ensayo de tolerancia a la sequía de la generación TI de dieciséis líneas de arroz transgénico transformado con Sub2 Esp. Linea Nútn. total de Núm. de plantas Respuesta a la núm . plantas con un puntaje sequía probadas de 2 o mayor 1 Yukihikari 12 0 Susceptible 1 IS125 evento núm. 1 (T5) 12 8 Tolerante 1 Sub2 evento núm. 1 12 0 Susceptible 1 Sub2 evento núm. 2 12 1 Susceptible 1 Sub2 evento núm. 3 12 1 Susceptible 1 Sub2 evento núm. 4 12 · 0 Susceptible 2 Yukihikari 12 0 Susceptible 2 IS125 evento núm. 1 (T5) 12 12 Tolerante 2 Sub2 evento núm. 5 12 4 Tolerante 2 Sub2 evento núm. 6 12 . 1 Susceptible 2 Sub2 evento núm. 7 12 2 Tolerante 2 Sub2 evento núm. 8 12 1 Susceptible 3 Yukihikari 12 0 Susceptible 3 IS125 evento núm. 3 (T5) 12 12 Tolerante 3 Sub2 evento núm. 9 12 5 Tolerante 3 Sub2 evento núm. 10 12 0 Susceptible 3 Sub2 evento núm. 11 12 0 Susceptible 3 Sub2 evento núm. 12 12 4 Tolerante 4 Yukihikari 12 0 Susceptible 4 IS125 evento núm. 3 (T5) 12 12 Tolerante 4 Sub2 evento núm. 13 12 0 Susceptible 4 Sub2 evento núm. 14 12 0 Susceptible 4 Sub2 evento núm. 15 12 5 Tolerante 4 Sub2 evento núm. 16 11 5 Tolerante Se examinaron dieciséis eventos de arroz transformado con el subfragmento Sub3 para determinar la tolerancia a la sequía en la generación TI (Tabla 12) . Ocho eventos (Sub3 eventos núm. 3, núm. 4, núm. 6, núm. 7, núm. 9. núm. 10. núm. 12 y núm. 16) fueron claramente tolerantes a la sequía.

Tabla 12 Ensayo de tolerancia a la sequía de la generación TI de dieciséis líneas de arroz transgénico transformado con Sub3 Esp. Línea Núm. total de Núm. de plantas Respuesta a la núm. plantas con un puntaje de sequía probadas 2 o mayor 1 Yukihikari 12 0 Susceptible 1 IS125 evento núm. 1 (T5) 12 6 Tolerante 1 Sub3 evento núm. i 12 0 Susceptible 1 Sub3 evento núm. 2 12 1 Susceptible 1 Sub3 evento núm. 3 12 2 Tolerante 1 Sub3 evento núm. 4 12 3 Tolerante 2 Yukihikari 12 0 Susceptible 2 IS125 evento núm. 1 (T5) 12 8 Tolerante 2 Sub3 evento núm. 5 12 0 Susceptible 2 Sub3 evento núm. 6 12 5 Tolerante 2 Sub3 evento núm. 7 12 4 Tolerante 2 Sub3 evento núm. 8 12 1 Susceptible 3 Yukihikari 12 0 Susceptible 3 IS125 evento núm. 1 (T5) 12 7 Tolerante 3 Sub3 evento núm. 9 12 6 Tolerante 3 Sub3 evento núm. 10 12 7 Tolerante 3 Sub3 evento núm. 11 12 1 Susceptible 3 Sub3 evento núm. 12 12 6 Tolerante 4 Yukihikari 12 0 Susceptible 4 IS125 evento núm. 1 (T5) 12 9 Tolerante 4 Sub3 evento núm. 13 12 0 Susceptible 4 Sub3 evento núm. 14 10 0 Susceptible 4 Sub3 evento núm. 15 12 1 Susceptible 4 Sub3 evento núm. 16 12 5 Tolerante Se examinaron dieciséis eventos de arroz transformado con el subfragmento Sub4 para determinar la tolerancia a la sequía en la generación TI (Tabla 13) . Ninguno de los eventos Sub4 fue tolerantes a la sequía.

Tabla 13 Ensayo de tolerancia a la sequía de la generación TI de dieciséis líneas de arroz transgénico transformado con Sub4 Esp . Línea Núm. total de Núm. de plantas Respuesta a 1 núm. plantas con un puntaje sequía probadas de 2 o mayor 1 ¦ Yukihikari 12 0 Susceptible 1 IS125 evento núm. 1 (T5) 12 6 Tolerante 1 Sub4 evento núm. 1 12 0 Susceptible 1 Sub4 evento núm. 2 12 0 Susceptible 1 .Sub4 evento núm.' 3 12 0 Susceptible 1 Sub4 evento núm. 4 12 0 Susceptible 2 Yukihikari 12 0 Susceptible 2 IS125 evento núm. 1 (T5) 12 10 Tolerante 2 Sub4 evento núm. 5 12 0 Susceptible 2 Sub4 evento núm. 6 12 0 Susceptible 2 Sub4 evento núm. 7 12 0 Susceptible 2 Sub4 evento núm. 8 12 0 Susceptible 3 Yukihikari 12 0 Susceptible 3 IS125 evento núm. 3 (T5) 12 11 Tolerante 3 Sub4 evento núm. 9 12 0 Susceptible 3 Sub4 evento núm. 10 12 0 Susceptible 3 Sub4 evento núm. 11 12 0 Susceptible 3 Sub4 evento núm. 12 12 0 Susceptible 4 Yukihikari 12 0 Susceptible 4 IS125 evento núm. 3 (T5) 12 11 Tolerante 4 Sub4 evento núm. 13 12 0 Susceptible 4 Sub4 evento núm. 14 12 0 Susceptible 4 Sub4 evento núm. 15 12 0 Susceptible 4 Sub4 evento núm. 16 12 0 Susceptible Para definir con mayor precisión la región de genes tolerantes a la sequía se crearon dos subfragmentos de Sub3 de la siguiente manera. Se realizó la PCR con Pyrobest ADN polimerasa (TAKARA-BIO) con ADN plásmido de Sub5 como molde y los iniciadores de la sec . con núm. de ident.:16 (5'-TACCTTGTTAACCTCATAGGTTCTTCTCAG -3') y sec. con núm. de ident.:17 (5'- TCCCATGGAGAGTTAACGCCCGACCTT -3') y, después, se realizó la digestión de los productos de PCR con Hpal para producir un fragmento de 2.1 kb (de aquí en adelante designado como "Sub8") . De manera similar, se usaron iniciadores de la sec. con núm. de ident.:18 (5'-CCCCATACTTGTTAACTGCTTTCTTGC -3') y sec. con núm. de ident.:19 (5'- TCCCATGGAGAGTTAACGCCCGACCTT -3') en la PCR y, después, se realizó la digestión de los productos de PCR con Hpal para producir un fragmento de 1.2 kb (de aquí en adelante designado como "Sub7"). El Sub7 es un subsegmento de Sub8. Sub8 y Sub7 se insertaron en pSB200 tratado por digestión con EcoRV y, después, pretratado con CIAP. Después de confirmar las secuencias de las regiones amplificadas por PCR y las regiones de unión, se introdujeron Sub8 y Sub7 en el cultivar de arroz Yukihikari por el método de transformación mediado por Agrobacterium tal como se describió anteriormente.

Se realizó la evaluación de la respuesta a la sequía del arroz transformado con Sub8 y Sub7 en la generación T0. Diecisiete de los 48 eventos Sub8 fueron claramente tolerantes a la sequía mientras que ninguno de los eventos de trans ormación de GUS fue tolerante a la sequía (Tabla 14) . Tres de los 48 eventos Sub7 fueron claramente tolerantes a la sequía mientras que ninguno de los eventos de transformación de GUS fue tolerante a la sequía (Tabla 15) .

Tabla 14 Ensayo de tolerancia a la sequía de la generación TO de arroz transformado con Sub8 ADN usado en la Núm. total Núm. de eventos Eventos transformación de eventos con un puntaje tolerantes a probados de 2 o mayor la sequía GUS (Cont 48 0 No Sub8 48 17 Sí Tabla 15 Ensayo de tolerancia a la sequía de la generación TO de arroz transformado con Sub7 ADN usado en la Núm. total Núm. de eventos Eventos transformación de eventos con un puntaje tolerantes a probados de 2 o mayor la sequía GUS (Cont 48 No Sub7 48 Sí partir de estos resultados es evidente que el gen tolerancia a la sequía en el clon genómico IS125 está presente en la región del subfragmento Sub7.

La presencia de transcritos codificados por Sub7 se examinó por medio de RT-PCR. Con el miniestuche RNEASY® (QIAGEN) se preparó ARN total a partir de una planta de arroz transgénico TO entera que contenía el subfragmento Sub5 y que mostró tolerancia a la sequía. El ARN de una planta de arroz transgénico que portaba un gen GUS y un gen HPT se usó como control negativo. Las muestras de ARN se expusieron a síntesis de ADNc con el sistema de síntesis de la primera cadena SuperScript™ III para RT-PCR (Invitrogen) . Se realizó la RT-PCR con dos iniciadores, la sec . con núm . de ident.:20 (5'-TCCCTAATCTTCTTGTTGGCACTG -3') y la sec . con núm. de ident.:21 (5'- TTAGTTCCTTGCTGCTCCAATGGC -3') diseñados en base a la secuencia de Sub7. Como resultado se amplificó un fragmento de aproximadamente 0.6 kb a partir del ADNc del transformante de Sub5, pero no a partir del ADNc del transformante de GUS (Fig. 3; Tabla 16) . Además, cuando no se incluyó transcriptasa inversa en la reacción, no se observó amplificación y ello indicó que el fragmento se amplificó a partir del ARN. El análisis de la secuencia del fragmento de 0.6 kb confirmó que el producto de RT-PCR era un producto la secuencia de Sub7.

Tabla 16 RT-PCR de transcritos que contienen los nucleótidos núm. 4,827 a núm. 5,459 de la sec . con núm. de ident . : 1 Fuente de ARN para Pretratado con Amplificación de el molde transcriptasa inversa ADN de 0.6 kb Transformante de Sub5 Sí Sí Transformante de Sub5 No No Transformante de GUS Sí No Transformante de GUS No No Los experimentos en los que se usa RACE de 5' y 3' (amplificación rápida de extremos de ADNc) se realizaron con el estuche GENERACER™ (Invitrogen) para caracterizar el gen que codifica el polipéptido con tolerancia a la sequía (de aquí en adelante designado como el polipéptido "SS-DTP21-1" ) . Para la RACE 5' se combinó el iniciador de sec. con núm. de ident.: 22 (5'- CCTTTGGAGGGATGAAACGGACTTTG -3') con un iniciador GENERACER™ de 5', sec. con núm. de ident .: 74 (5'-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3 ' ) y, después, el iniciador de sec. con núm. de ident.: 23 (5'- TGATCTCACCGCTCCGGTTGGTCTTG -3') se combinó con un iniciador anidado GENERACER™ de 5', sec. con núm. de ident.: 75 (5'- GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3 ' ) . Para la RACE 3' se combinó el iniciador de sec . con núm. de ident.:24 (5'- TCCTTGCTGCTCCAATGGCCGAGAAG -3') con un iniciador GENERACER™ de 3', sec. con núm. de ident.:76 (5'-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3 ' ) y, después, el iniciador de sec. con núm. de ident.:25 (5'- ACCTCAGCATGGAGCCTGTGGAAGAC -3') se combinó con un iniciador anidado GENERACER™ de 3', sec. con núm. de ident.:77 (5'- CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3 ' ) . Los fragmentos amplificados de las PCR anidadas se insertaron en pCR®4-T0P0® (Invitrogen) y se expusieron a análisis de secuencias. Se identificó un solo sitio de iniciación de transcripción en el nucleótido núm. 5,499 de sec. con núm. de ident . :1 y siete sitios de extremo 3' se encontraron en los nucleótidos núm. 4,655, núm. 4,652, núm. 4,471, núm. 4,464, núm. 4,069, núm. 4,011 y núm. 3,956 de la sec. con núm. de ident. :1 (Fig. 3) lo que indica que 7 tipos de transcritos estaban presentes en el arroz tolerante a la sequía. Sin embargo, todos los transcritos aparentemente codificaban la misma proteína porque la diversidad estaba dentro de la región 3' no traducida. La secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido SS-DTP21-1 se presenta como la sec. con núm. de ident.: 26. La secuencia de aminoácidos de SS-DTP21-1 se presenta como la sec. con núm. de ident. :27.

En base a estos resultados se diseñaron dos iniciadores, sec. con núm. de ident.: 28 (5'- TGCGAGGTTGTCGAGCACTTGCTCCT -3') y sec. con núm. de ident.: 29 (5'-CAAGCCTTCTCTTCTTCAGTTAGAGC -3') y se realizó la RT-PCR con ARN del transformante de Sub5 y del transformante de GUS descritos anteriormente . Se observó una banda del tamaño esperado (1.5 kb) solamente cuando el ARN del transformante de Sub5 se trató con transcriptasa inversa (Tabla 17) lo que confirmó la existencia de transcritos que abarcaban los dos iniciadores.

Tabla 17 RT-PCR de transcritos que contienen los nucleótidos núm. 4,019 a núm. 5,489 de la sec . con núm. de ident . : 1 Pretratado con Amplificación Fuente de ARN para el transcriptasa de ADN de molde inversa 1.5 kb Transformante de Sub5 Sí Sí Transformante de Sub5 No No Transformante de GUS Sí No Transformante de GUS No No Ejemplo 5 Identificación del gen SS-DTP21-2 como un gen candidato tolerante a la sequía Tal como se describió en el EJEMPLO 3, el fragmento genómico IS127 del pasto Sudán fue capaz, además, de conferir al cultivar de arroz Yukihikari tolerancia a la sequía. El fragmento genómico IS127 se secuenció completamente por medio de un procedimiento estándar y se elucidó una secuencia de 34,231 nucleótidos (sec. con núms . de iden . :30) .

El fragmento genómico IS127 (sec. con núms. de ident.: 30) contiene una región altamente homologa con el subfragmento Sub8 del fragmento genómico IS125. Esta región homologa IS127 contiene una secuencia de nucleótidos (sec. con núm . de ident. :31) que codifica un polipéptido (sec. con núm. de ident. :32) , de aquí en adelante designado como el polipéptido " SS - DTP21 -2", que es homólogo al polipéptido SS-DTP21-1. Esta región se subclonó de la siguiente manera. La región homologa se amplificó con dos iniciadores derivados del fragmento genómico IS127, sec. con núm. de ident. : 33 (5'- ATACCTTGTTAACCTCATAGGTTCTCTCAG -3') y sec. con núm. de ident. :34 (5'- CCTTCCCATGGAGAGTTAACGCCCGACACT -3'), y el fragmento de PCR resultante se subclonó después en pSB200 por medio de los métodos descritos anteriormente.

Ejemplo 6 Identificación de genes de sorgo que codifican polipéptidos homólogos a SS-DTP21-1 Con métodos de análisis de secuencias de ADN estándar se identificaron genes de Sorghum bicolor que codifican polipéptidos homólogos a SS-DTP21-1. Un análisis TBLASTN de secuencias de nucleótidos disponibles públicamente indicó que la secuencia de aminoácidos de SS-DTP21-1, sec. con núm . de ident. :27, es altamente homologa a las secuencias de aminoácidos codificadas por los nucleótidos 25530-24904 del clon BAC genómico de Sorghum bicolor SB_BBc0073F19 (núm. GI del NCBI 124359063) y los nucleótidos 44114-44740 del clon BAC genómico de Sorghum bicolor SB_BBc 0109 Ll 2 (núm. GI del NCBI 124359064) . Un análisis TBLASTN de secuencias EST de sorgo disponibles públicamente indicó que los subf ragmentos de la sec. con núm. de ident. :27 son altamente homólogos a las secuencias de aminoácidos codificadas por dos secuencias EST de sorgo obtenidas de plantas con estrés por agua, es decir, plantas de cinco semanas en los días 7 y 8 posteriores a la retención de agua (núm. GI del NCBI 7659303 ; núm. GI del NCBI 7659212) ; y una secuencia EST obtenida de los ovarios de en distintas etapas inmaduras de plantas de 8 semanas (núm. GI del NCBI 11922211) .

La región que codifica SS-DTP21-1 en el subclon Sub8 del fragmento genómico IS125 se reemplazó con varias regiones codificantes de proteínas de genes de Sorghum bicolor que codifican polipéptidos homólogos a SS-DTP-21-1. Para construir el vector se usó el sistema de clonación por PCR Clontech IN-FUSION™ en el cual los extremos de un fragmento de PCR se funden a los extremos homólogos de un vector linealizado.

El vector linealizado se preparó de la siguiente manera. Se realizó amplificación por PCR con una enzima PRIMESTAR® Max ( TAKARA- B IO ) ; el plásmido que contiene el subfragmento Sub8 en pSB200 que se construyó en el EJEMPLO 4 como un molde y los siguientes dos iniciadores: 5 ' - GCTCTAACTGAAGAAGAGAAGGC TGGTGGCTTGGTGTTTG - 3 ' (sec. con núm . de ident . :35) ; y 5 ' - GCTATCATTTAAATCGGTTTAGGTTTACTATTATCATCAG- 3 ' ( sec . con núm. de ident. :36) .

Los productos de la PCR se autoligaron con el estuche de ligación de ADN "Mighty Mix" ( TAKARA- B I0 ) después del tratamiento con pol inuc leót ido cinasa de T4 ( TAKARA- BI O ) . El ADN resultante se usó para transformar E. coli MACH1™-T1R (Invitrogen) por medio de elect roporación . Entre las colonias recombinantes que aparecieron en las placas de' LB que contenían espect inomicina (50 ug/ml), se seleccionó una colonia en base a los resultados de la PCR de colonias y análisis de secuencias del plásmido con respecto a las regiones de unión. Los plásmidos de la colonia seleccionada se trataron por digestión con SwaI y Afel, y el producto de la digestión se trató con BAP (TAKARA-BIO) y se purificó a partir de un gel de agarosa después de la electroforesis.

Las regiones codificantes de proteínas de genes de Sorghum bicolor (sorgo dorado) que codifican polipéptidos homólogos a SS-DTP21-1 se prepararon por medio de amplificación por PCR con una enzima PRIMESTAR® Max (TAKARA-BIO) ; ADN genómico de Sorghum bicolor (sorgo dorado) como molde y los siguientes dos iniciadores: 5 ' -TTCTTCAGTTAGAGCTTGATTAGTTCCTTGCTGCTCCAATG- 3 ' (sec . con núm . de ident. :37) ; y 5 ' -AAACCTAAACCGATTTTAAAGATAGATAACTAAGATGCATTGC CTCAATGTCTAATCTAGATAAATTA -3' (sec. con núm. de ident . : 38 ) .

Los productos de la PCR se purificaron a partir de un gel de agarosa después de la electroforesis.

El vector linealizado y los productos de PCR que codifican polipéptidos homólogos a SS-DTP21-1, cada uno de los cuales compartía 15-16 pares de bases con una identidad de secuencia en las regiones terminales se fundieron entre sí con un estuche de clonación INFUSION™ Advantage PCR Cloning Kit (Clontech) de conformidad con el manual de instrucciones. El ADN resultante se usó para transformar E. coli MACH1™-T1R (Invitrogen) por medio de electroporacion. Entre las colonias recombinant e s que aparecieron en las placas de LB que contenían e spec t inomi c ina (50 µ9/??1) se seleccionaron dos colonias en base a los resultados de la PCR de colonias y análisis de secuencias de los plásmidos. Las secuencias de nucleótidos de las regiones codificantes de las colonias seleccionadas se presentan como la sec. con núm . de ident. :39 (que codifica el polipéptido SB-DTP21-1) y la sec. con núm. de ident. :40 (que codifica el polipéptido SB-DTP21-2) . Las secuencias de aminoácidos correspondientes de las dos proteínas se presentan como la sec. con núm. de ident. :41 (SB-DTP21-1) y la sec. con núm. de ident. :42 ( SB -DTP21 - 2 ) , respectivamente .

Las colonias se usaron en el apareamiento triparental junto con la cepa de Agrobacterium LBA4404 (pSBl) y la cepa "helper" de E. coli HB101 (pRK2013) , y las cepas de Agrobacterium resultantes se usaron para transformar una variedad de arroz tal como se describió anteriormente.

De manera similar se obtuvieron las regiones codificantes de proteínas de dos genes homólogos a SS-DTP21-1 a partir de Sorghum bicolor (B35) . Las dos secuencias de nucleótidos homólogos de Sorghum bicolor (B35) se presentan como la sec. con núm . de ident.:43 (que codifica el polipéptido SB-DTP21-3) y la sec. · con núm. de ident . :44 (que codifica el polipéptido SB-DTP21-4) . Las secuencias de aminoácidos correspondientes de las dos proteínas se presentan como la sec. con núm. de ident. :45 (SB-DTP21-3) y la sec. con núm. de ident. :46 (SB-DTP21-4), respectivamente.

Ej emplo 7 Identificación de genes adicionales que codifican polipéptidos homólogos a SS-DTP21-1 De manera similar a los ejemplos anteriores se identificaron las regiones codificantes de proteínas de otros genes homólogos a SS-DTP21-1 a partir de pasto Sudán (Sorghum sudanense) , pasto Johnson {Sorghum halepense) , caña de azúcar (Saccharum officinarum) y sorgo (Sorghum bicolor (sorgo dorado) ; Sorghum bicolor (B35) ; y Sorghum bicolor (hoki) ) . Las sec. con núms . de ident. para las secuencias de aminoácidos para SS-DTP21-1 y las distintas proteínas homologas, además de las secuencias de nucleótidos correspondientes que codifican SS-DTP21-1 y las distintas proteínas homologas, se presentan en la siguiente Tabla.

Tabla 18 SS-DTP21-1 y proteínas homologas de diversos organismos Designación de Nucleótido - sec . Aminoácido proteínas Organismo con núm. de ident . con núm. de SS-DTP21-1 Pasto Sudán 26 27 SS-DTP21-2 Pasto Sudán 31 32 SB-DTP21-1 Sorghum bicolor (sorgo 39 41 dorado) SB-DTP21-2 Sorghum bicolor (sorgo 40 42 dorado) SB-DTP21-3 Sorghum bicolor (B35) 43 45 SB-DTP21-4 Sorghum bicolor (B35) 44 46 SS-DTP21-3 Pasto Sudán 51 52 SS-DTP21-4 Pasto Sudán 53 54 SS-DTP21-5 Pasto Sudán 55 56 SS-DTP21-7 Pasto Sudán 57 58 SH-DTP21-1 Pasto Johnson 59 60 SH-DTP21-2 Pasto Johnson 61 62 S0-DTP21-1 Caña de azúcar 63 64 S0-DTP21-2 Caña de azúcar 65 66 SS-DTP21-6 Pasto Sudán 78 79 SB-DTP21-5 Sorghum bicolor (sorgo 80 81 dorado) SB-DTP21-6 Sorghum bicolor (B35) 82 83 SB-DTP21-9 Sorghum bicolor (hoki) 84 85 SB-DTP21-10 Sorghum bicolor (hoki) 86 87 Ejemplo 8 Caracterización de polipéptidos homólogos a SS-DTP21-1 Las Figuras 4A - 4E presentan un alineamiento de las secuencias de aminoácidos indicadas en las sec. con núms . de ident. :27, 32, 41, 42, 45, 46, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 79, 81, 83, 85 y 87 para los polipéptidos DTP21 de pasto Sudán, sorgo, pasto Johnson y caña de azúcar. La Figura 5 presenta los valores porcentuales de identidades y divergencia de secuencias para cada par de secuencias presentado en las Figuras 4A - 4E.

Los alineamientos de secuencias y los cálculos del porcentaje de identidad se realizaron con el programa MEGALIGN® del paquete integrado para bioinformática LASERGENE® (ADNSTAR® Inc., Madison, I). El alineamiento múltiple de las secuencias se realizó con el uso del método de alineamiento-Clustal V (Higgins and Sharp (1989) CABIOS. 5:151153) con los parámetros predeterminados (PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN=10 , PENALIZACIÓN DE LONGITUD DE INTERRUPCIÓN10 ) . Los parámetros predeterminados para alineamientos en pares con el uso del método Clustal fueron KTUPLE=1, PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN3 , VENTANA=5 y DIAGONALES GUARDADAS=5.

La secuencia de aminoácidos de SS-DTP21-1 tiene el siguiente porcentaje de identidad de secuencia con los homólogos presentados en las Figuras 4A - 4E: 91.4 % (SS-DTP21-2) ; 88.5 % (SB-DTP21-1) ; 84.6 % (SB-DTP21-2 ) ; 83.3 % (SB-DTP21-3) ; 93.3 % (SB-DTP21-4 ) ; 92.8 % (SS-DTP21-3 ) ; 92.3 % (SS-DTP21-4) ; 91.4 % (SS-DTP21-5 ) ; 84.7 % (SS-DTP21-7 ) ; 91.9 % (SH-DPT21-1) ; 93.3 % (SH-DTP21-2 ) ; 63.8 % (SO-DTP21-1) , 63.8 % (SO-DTP21-2) , 91.4 % (SS-DTP21-6) , 91.9 % (SB-DTP21-5) , 93.3 % (SB-DTP21-6) , 92.8 % (SB-DTP21-9) y 92.3 % (SB-DTP21-10) .

Ejemplo 9 Electroporación de Agrohacterium turnefaciens LBA4404 Algunas células competentes por electroporación (40 u ) , tales como Agrohacterium tumefaciens LBA4404 que contienen PHP10523 ("pSBl"); Komari et al., Plant J. 10:165-174 (1996); núm. GI del NCBI 59797027) , se descongelaron en hielo (20-30 min) . El PHP10523 contiene genes VIR para la transferencia de ADN-T, un origen de replicacion del plásmido con un número bajo de copias de Agrohacterium, un gen de resistencia a la tetraciclina y un sitio Cos para la recombinación bimolecular del ADN in vivo. Mientras tanto, la cubeta de electroporación se enfría en hielo. La configuración del electroporador se determina para ser 2.1 kV. Una alícuota de ADN (0.5 µ? de ADN parental a una concentración de 0.2 -1.0 ug en amortiguador de sal baja o H2O) destilado dos veces mezclado con las células LBA4404 del AgroJbacterium tumefaciens descongelado LBA4404 mientras aún está sobre hielo. La mezcla se transfiere al fondo de la cubeta de electroporación y se deja en reposo en el hielo durante 1 a 2 minutos. Las células se electroporan (electroporador Eppendorf 2510) al presionar el botón "pulse" dos veces (idealmente, hasta alcanzar un pulso de 4.0 milisegundos) . Posteriormente, se agrega 0.5 mi del medio 2xYT (o medio SOC) a temperatura ambiente en la cubeta y se transfiere a un tubo con tapa a presión de 15 mi (por ejemplo, tubo FALCON™) . Las células se incuban a 28-30 °C, 200-250 rpm durante 3 h.

Se esparcen alícuotas de 250 µ? sobre placas que contienen medio YM y 50 ug/ml de espectinomicina y se incuban durante tres días a 28-30 °C. Para incrementar la cantidad de transformantes se puede realizar una de dos etapas opcionales: Opción 1: cubrir las placas con 30 µ? de rifampicina de 15 mg/ml. El LBA4404 tiene un gen de resistencia cromosómica para la rifampicina. Esta selección adicional elimina algunas colonias contaminantes observadas cuando se usa preparaciones más deficientes de células competentes de LBA4404.

Opción 2 : hacer dos réplicas de la electroporación para compensar las células electrocompetentes de menor calidad. Identificación de transformantes: Cuatro colonias independientes se escogen y se dispersan en placas que contienen un medio mínimo AB y 50 µg/ml de espectinomicina para aislar las colonias simples. Las placas se incuban a 28 °C durante dos a tres días. Se elige una colonia única por cada cointegrado supuesto y se inocula con 4 mi de bactopeptona de 10 g/l, extracto de levadura de 10 g/l, cloruro sódico de 5 g/l y espectinomicina de 50 mg/1. La mezcla se incuba durante 24 h a 28 °C con agitación. Se aisla el ADN de plasmados de 4 mi de cultivo por medio de la minipreparación de Qiagen® y un amortiguador de lavado PB opcional. El ADN se eluye en 30 L. Se usan alícuotas de 2 pL para electroporar 20 µL de DHlOb + 20 µL de H20 destilada dos veces según se describió anteriormente. Opcionalmente , se puede usar una alícuota de 15 1 para transformar 75-100 L de células DH5 Library Efficiency de INVITROGEN™. Las células se diseminan en placas que contienen medio LB y 50 µ9/p\1 de espectinomicina y se incuban a 37 °C durante la noche.

Se eligen de tres a cuatro colonias independientes por cada cointegrado putativo y se inoculan 4 mi de medio 2xYT (10 g/1 de bactopeptona , 10 g/1 de extracto de levadura, 5 g/1 de cloruro de sodio) con 50 \ig/ml de espectinomicina . Las células se incuban a 37 °C durante la noche con agitación. A continuación se aisla el ADN plasmídico de 4 mi de cultivo mediante la minipreparación QIAPREP® con tampón de lavado PB opcional (eluido en 50 \i~L) . Se usan 8 µ? para la digestión con Salí (con ADN parental y PHP10523 como controles) . Se realiza otras tres digestiones más con el uso de las enzimas de restricción BamHI, EcoRI y HindIII para 4 plásmidos que representan 2 cointegrados putativos con patrón de digestión de Salí correcto (con el uso de ADN parental y PHP10523 como controles) . Se recomienda geles electrónicos para comparación.

Ejemplo 10 Transformación de maíz con el fragmento genómico IS125 con apareamiento triparental de Agrobacterium Debido al gran tamaño del fragmento genómico IS125, el maíz puede transformarse por medio de apareamiento triparental con Agrobacterium con el siguiente protocolo (Ditta et al . Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos 77:7347-7351, 1980).

Día 1: la cepa de Agrobacterium LBA4404 (pAL4404, pSBl) se siembra en medio mínimo de agar más tetraciclina (10 g/ml) y se incuba a 28 °C por 3 días.

Día 2: la cepa de E. coli GENEHOGS® se inocula con ADN que contiene IS125 en LB agar con espectinomicina (100 ug/ml) y se incuba 2 días a 25 °C.

Día 3: la E. coli (pRK2013) se siembra sobre LB agar más canamicina (50 g/ml) y se incuba de la noche a la mañana a 37 °C.

Día 4 : se mezcla una asa de cada una de las 3 cepas en una placa de nutriente agar y se incuba de la noche a la mañana a 28 °C.

Día 5: la mezcla se siembra en una placa de medio mínimo de agar más espectinomicina (50 ug/ml) y se incuba a 28 °C por 3 días.

Día 8: se recoge una sola colonia, se siembra en el mismo medio y se incuba a 28 °C por 3 días.

Día 11: se recoge una sola colonia, se siembra en el mismo medio y se incuba a 28 °C por 3 días.

Día 14 : se recogen colonias únicas y se comienza el cultivo en 2 mi de caldo 2XYT con espectinomicina (100 ug/ml) a 28 °C durante una noche a 1 día.

Día 15: se realiza la minipreparación de ADN del cultivo de la noche. Se usa 1 µ? para electroporar 20 µ? de células GENEHOGS® .

Día 16 : se recogen colonias únicas y se comienza el cultivo en 1.2 mi de caldo 2XYT con espectinomicina (100 ]g/ml) a 37 °C de la noche a la mañana.

Día 17: se realiza la minipreparación de ADN del cultivo de la noche y se hace el análisis de restricción con BamHÍ, EcoRI e HindIII.

Ejemplo 11 Transformación del maíz con el uso de Agrobacterium La transformación de maíz mediada por Agrobacterium se realiza prácticamente como lo describen Zhao et al. en et . Mol. Biol . 318:315-323 (2006) (ver también Zhao et al., Mol. Breed. 8:323-333 (2001) y la patente de los Estados Unidos núm . 5,981,840 otorgada el 9 de noviembre de 1999, incorporada en la presente como referencia) . El proceso de transformación requiere inoculación bacteriana, cocultivo, reposo, selección y regeneración vegetal. 1. Preparación de embriones inmaduros: Los embriones inmaduros de maíz se separan de las cariopses y se colocan en un microtubo de 2 mi que contiene 2 mi de medio PHI-A. 2. Infección de Agrobacterium y cocultivo de embriones inmaduros : 2.1. Etapa de infección: Se retira el medio PHI-A de (1) con una micropipeta de 1 mi, y se añade 1 mi de suspensión de Agrobacterium. El tubo se invierte cuidadosamente para mezclar. La mezcla se incuba durante 5 min a temperatura ambiente. 2.2. Etapa de cocultivo: La suspensión de Agrobacterium se retira de la etapa de infección con una micropipeta de 1 mi . Con el uso de una espátula estéril, los embriones se desprenden del tubo y se transfieren a una placa de medio PHI-B en una caja petri de 100x15 mm. Los embriones se orientan con su eje hacia abajo sobre la superficie del medio. Las placas con los embriones se cultivan a 20 °C, en la oscuridad, durante tres días. Se puede usar L-cisteína en la fase de cocultivo. Con el vector binario estándar, el medio de cocultivo proporcionado con 100-400 mg/1 de L-cisteína es crítico para recuperar eventos transgénicos estables. 3. Selección de eventos transgénicos putativos: A cada placa de medio PHI-D en una caja Petri de 100x15 mm se transfieren 10 embriones, se mantiene la orientación y las cajas se sellan con PARAFILM®. Las placas se incuban en la oscuridad a 28 °C. Se espera observar eventos supuestos de crecimiento activo, como tejido embrionario amarillo pálido, en seis a ocho semanas. Los embriones que no producen eventos pueden ser cafés y necróticos y el poco crecimiento de tejido friable es evidente. El tejido embrionario transgénico putativo se subcultiva en placas de PHI-D fresco en intervalos de dos a tres semanas, dependiendo del índice de crecimiento. Se registran los eventos. 4. Regeneración de vegetales TO : El tejido embrionario propagado en medio PHI-D se subcultiva en medio PHI-E (medio de maduración de embrión somático) , en cajas petri de 100x25 mm y se incuban a 28 °C, a oscuras, hasta que maduran los embriones somáticos, durante aproximadamente diez a dieciocho días. Los embriones somáticos maduros e individuales con escutelo y coleóptilo bien definidos se transfieren al medio de germinación de embriones PHI-F y se incuban a 28 °C en la luz (aproximadamente a 80 µ? de las lámparas de luz blanca o lámparas fluorescentes equivalentes) . En siete a diez días, las plantas regeneradas de aproximadamente 10 cm de altura se colocan en macetas en una mezcla hortícola y endurecida con el uso de métodos hortícolas estándar.

Medios para la transformación vegetal: 1. PHI-A: 4 g/1 de sales básales de CHU, 1.0 ml/1 de mezcla de vitaminas de Eriksson 1000X, 0.5 mg/1 de tiamina HC1, 1.5 mg/1 de 2,4-D, 0.69 g/1 de L-prolina, 68.5 g/1 de sacarosa, 36 g/1 de glucosa, pH 5.2. Se adicionan 100 µ? de acetosiringona (esterilizada con filtro) . 2. PHI-B: PHI-A sin glucosa, el 2,4-D aumenta a 2 mg/1, la sacarosa se reduce a 30 g/1 y se complementa con 0.85 mg/1 de nitrato de plata (esterilizado con filtro), 3.0 g/1 de GELRITE® 100 µ? de acetosiringona (esterilizada con filtro) , pH 5.8. 3. PHI-C: PHI-B sin GELRITE ® y acetosiringona, el 2,4-D se reduce a 1.5 mg/1 y se complementa con 8.0 g/1 de agar, 0.5 g/1 de tampón de ácido 2- [N-morfolino] etanosulfónico (MES), 100 mg/1 de carbenicilina (esterilizada con filtro) . 4. PHI-D: PHI-C suplementado con 3 mg/1 de bialafos (esterilizado con filtro) . 5. PHI-E: 4.3 g/1 de sales de Murashige y Skoog (MS) , (Gibco, BRL 11117-074), 0.5 mg/1 de ácido nicotínico, 0.1 mg/1 de tiamina HCl, 0.5 mg/1 de piridoxina HCl, 2.0 mg/1 de glicina, 0.1 g/1 de mio-inositol, 0.5 mg/1 de zeatina (Sigma, Cat . núm. Z-0164), 1 mg/1 de ácido indol acético (AIA) , 26.4 yg/1 de ácido abscísico (ABA), 60 g/1 de sacarosa, 3 mg/1 de bialafos (esterilizados con filtro) , 100 mg/1 de carbenicilina (esterilizada con filtro) , 8 g/1 de agar, pH 5.6. 6. PHI-F: PHI-E sin zeatina, IAA, ABA; se reduce la sacarosa a 40 g/1; se reemplaza el agar con 1.5 g/1 de GELRITE®; PH 5.6.

Para regenerar las plantas a partir del callo transgénico se puede transferir primero los grupos de tejido al medio N6 suplementado con 0.2 mg por litro de 2,4-D. Después de dos semanas el tejido se puede transferir al medio regenerativo (Fromm et al., Bio/Technology 8:833839 (1990)).

Las plantas transgénicas T0 se pueden regenerar, y se puede determinar su fenotipo. Se puede recolectar semillas TI. Las plantas TI y/o su progenie se pueden regenerar y su fenotipo se puede determinar.

Ejemplo 12 Transformación de líneas de maíz derivadas de Gaspe Flint con un gen guía tolerante a la sequía validado Las plantas de maíz se pueden transformar para sobreexpresar el gen guía tolerante a la sequía o los homólogos correspondientes de otras especies para examinar el fenotipo resultante.

Plantas receptoras : Las células de plantas receptoras pueden ser de una línea de maíz uniforme con un ciclo de vida corto ("ciclo rápido"), un tamaño reducido y un potencial alto de transformación. Las células vegetales para maíz típicas son las células vegetales de las variedades de líneas de Gaspe Flint (GBF) disponibles al público. Una variedad posible de la línea de plantas candidato es el híbrido Fl de GBF x QTM (Quick Turnaround Maize, una forma disponible al público de Gaspe Flint seleccionada para el crecimiento en condiciones de invernadero) descrito en Tomes et al., publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2003/0221212. Las plantas transgénicas obtenidas de esta línea tienen un tamaño reducido tal que se pueden cultivar en macetas de cuatro pulgadas (10.16 cm) (1/4 del espacio necesario para una planta de maíz de tamaño normal) y que maduran en menos de 2.5 meses. (Tradicionalmente, para obtener la semilla transgénica T0 una vez que las plantas transgénicas se aclimatan al invernadero se requieren 3.5 meses). Otra línea adecuada es una línea doble haploide de X Gaspe Flint de GS3 (una línea altamente transformable) . Otra línea adecuada adicional es una línea endogámica de élite transformable que lleva un transgen que causa floración, estatura reducida o ambas Protocolo de transformación: Para introducir los transgenes en las células del maíz se podría usar cualquier método adecuado que incluye, pero no se limita a, los procedimientos de inoculación que emplean vectores basados en Agrobacterium. La transformación se podría realizar en embriones inmaduros de la planta receptora (objetivo) .

Cultivo de precisión y seguimiento de las plantas: La población del evento de las plantas transgénicas (T0) resultante de los embriones de maíz transformado se cultiva en un ambiente controlado de invernadero con el uso de un diseño de bloqueo aleatorizado modificado para reducir o eliminar el error ambiental. Un diseño de bloques aleatorizado es una presentación vegetal, en donde, las plantas experimentales se dividen en grupos (por ejemplo, treinta plantas por grupo) denominados bloques y a cada planta se le asigna aleatoriamente una localidad con el bloque.

Para un grupo de treinta plantas se colocan veinticuatro plantas de experimento transformadas y seis plantas de control (plantas con un fenotipo determinado) (colectivamente, un "grupo de réplicas") en macetas dispuestas en un arreglo (mencionado también como un bloque o grupo de réplicas) sobre una mesa ubicada dentro de un invernadero. Cada planta, control o experimento se asigna aleatoriamente a una localidad con el bloque mapeado hacia la localidad de un invernadero físico y único, así como al grupo de réplicas. Múltiples grupos de réplicas de treinta plantas cada una se puede cultivar en el mismo invernadero en un solo experimento. La presentación (arreglo) de los grupos de réplicas debería determinarse para minimizar los requerimientos de espacio, así como los efectos ambientales dentro del invernadero. Tal presentación puede denominarse presentación de invernadero comprimido.

Una alternativa a la adición de un grupo de control específico es identificar las plantas transgénicas que no expresan el gen de interés. Una gran variedad de técnicas, tales como TI-PCR, se puede aplicar para analizar cuantitativamente el nivel de expresión del gen introducido. Las plantas TO que no expresan el transgen se pueden comparar con las que sí lo expresan.

Cada planta en la población del evento se identifica y se monitorea por todo el proceso de evaluación y la información recopilada de esa planta se asocia automáticamente con esa planta, de manera que la información recopilada se puede asociar con el transgen transportado por la planta. Por ejemplo, cada contenedor de plantas puede tener una etiqueta legible para computadora (tal como un código de barras del Código Universal de Productos (UPC, por sus siglas en inglés) ) que incluye la información de la identidad de la planta, que a su vez se correlaciona con una localidad del invernadero, de manera que la información obtenida de la planta se puede asociar automáticamente con esa planta.

Alternativamente, se puede usar cualquier sistema de identificación de plantas eficiente y legible para computadora, tal como códigos de matriz bidimensional o incluso etiquetas de identificación por radiofrecuencia (RFID, por sus siglas en inglés) , en donde la información se recibe y se interpreta por un receptor/procesador de radiofrecuencias. Ver la solicitud de patente publicada de los Estados Unidos núm. 2004/0122592, incorporada en la presente descripción como referencia.

Análisis fenotípico con el uso de imágenes tridimensionales: Cada planta del invernadero en la población del evento TO, incluso cualquier planta control, se analiza por las características agronómicas de interés y la información agronómica para cada planta se registra o se almacena de manera que se asocie con información que la identifique (ver arriba) La confirmación de un fenotipo (efecto de los genes) se puede obtener en la generación TI con un diseño experimental similar al- descrito anteriormente.

Las plantas TO se analizan a nivel fenotípico con el uso de tecnología .de imágenes cuantitativa y no destructiva por medio del ciclo de vida completo en invernadero de las plantas para analizar las cepas de interés. Para el análisis multidimensional y automático de las plantas completas se podría usar un analizador digital de imágenes. La obtención de imágenes se puede realizar adentro del invernadero. Para ver la planta de todos lados se usa dos sistemas de cámara colocados en la parte superior y al lado, así como un aparato para girar la planta. Las imágenes se obtienen desde la parte superior, frontal y a un lado de cada planta. Las tres imágenes juntas proporcionan suficiente información para examinar la biomasa, el tamaño y la morfología de cada planta.

Debido al cambio en el tamaño de las plantas desde el momento en que aparece la primera hoja del suelo hasta el momento en que las plantas se encuentran en el final de su desarrollo, las etapas tempranas del desarrollo de la planta se documentan de la mejor manera con una magnificación mayor desde la parte superior. Esto se puede lograr con el uso de un sistema de lentes de acercamiento motorizado controlado completamente por un programa de imágenes .

En una sola operación de análisis de imágenes, ocurren los siguientes eventos: (1) la planta se lleva dentro del área del analizador, se gira 360 grados de manera que su etiqueta legible para la computadora se pueda leer y se deja en reposo hasta que sus hojas dejen de moverse; (2) la imagen lateral se toma y se ingresa en una base de datos; (3) la planta se gira 90 grados y nuevamente se deja en reposo hasta que sus hojas dejen de moverse y (4) la planta se retira del analizador.

Las plantas se dejan por lo menos seis horas en la oscuridad por un período de veinticuatro horas para que tengan un ciclo normal de día/noche.

Instrumentación de imágenes: Se puede usar cualquier tipo de instrumentación de imágenes, incluso, pero sin limitarse a, la instrumentación de imágenes digital de espectro de luz comercialmente disponible de LemnaTec GmbH of urselen, Alemania. Las imágenes se toman y se analizan con un LemnaTec Scanalyzer HTS LT-0001-2 con un dispositivo de imágenes IT Progressive Sean IEE CCD de 1.27 cm (1/2"). Las cámaras de imágenes pueden estar equipadas con acercamiento motorizado, apertura motorizada y enfoque motorizado. Toda la configuración de la cámara se puede realizar con el uso del programa LemnaTec . Por ejemplo, la variación instrumental del analizador de imágenes es menor que aproximadamente 5 % para componentes mayores y menor que aproximadamente 10 % para componentes menores.

Software : El sistema de análisis de imágenes comprende un programa informático de LemnaTec HTS Bonit para análisis de color y arquitectura y una basa de datos del servidor para almacenar datos desde aproximadamente 500,000 análisis, que incluyen las fechas de análisis. Las imágenes originales y las imágenes analizadas se almacenan juntas para permitir que el usuario reanalice tanto como desee. La base de datos se puede conectar al hardware de imágenes para la recolección y almacenamiento automático de datos. Puede usarse una gran variedad de sistemas de programas disponibles comercialmente (por ejemplo, Matlab y otros) para la interpretación cuantitativa de los datos de imágenes, y cualquiera de estos sistemas de programas puede aplicarse al conjunto de datos de imágenes.

Sistema transportador: Se puede usar un sistema transportador con un dispositivo giratorio de plantas para transportar las plantas al área de imágenes y girarlas durante la obtención de las imágenes. Por ejemplo, hasta cuatro plantas, cada una con una altura máxima de 1.5 m, se colocan en carros para pasar sobre el sistema transportador circular y por el área de medición de imágenes. En este caso, la huella total de la unidad (analizador de imágenes y lazo del transportador) es de aproximadamente 5 m x 5 m.

El sistema transportador se puede agrandar para acomodar más plantas a la vez . Las plantas se transportan a lo largo del lazo del transportador hacia el área de imágenes y se analizan hasta 50 segundos por planta. Se toman las vistas de la planta. El sistema transportador, así como el equipo de imágenes, debe poder usarse en condiciones ambientales de invernadero.

Iluminación : Cualquier manera adecuado de iluminación se puede usar para la captación de imágenes. Por ejemplo, se puede usar una luz en la parte superior sobre un fondo negro. Alternativamente, se puede usar una combinación de luz superior y posterior con un fondo blanco. El área iluminada se debe encerrar para asegurar condiciones constantes de iluminación. El alojamiento debe ser mayor que el área de medición de manera que prevalezcan las condiciones constantes de iluminación sin necesidad de abrir, cerrar o puertas. Alternativamente, la iluminación se puede variar para causar la activación ya sea del transgen (por ejemplo, proteína fluorescente verde (GFP, por sus siglas en inglés) , proteína fluorescente roja (RFP, por sus siglas en inglés) ) o de fluoróforos endógenos (por ejemplo, clorofila) .

Cálculo de la biomasa en base a imágenes tridimensionales: Para el cálculo óptimo de la biomasa, las imágenes de la planta deben tomarse por lo menos en vistas de tres ejes, por ejemplo, la vista superior y dos vistas laterales (lados 1 y 2) . Después, estas imágenes se analizan para separar la planta del fondo, de la maceta y de la bolsa de control de polen (si aplica) . El volumen de la planta se puede calcular mediante el cálculo: Volumen (voxeJes) = Área superior (pixeles) x-jÁrea del lado 2 (pixeles) En la ecuación anterior las unidades de volumen y área son "unidades arbitrarias" . Las unidades arbitrarias son completamente suficientes para detectar efectos genéticos en el tamaño y crecimiento de las plantas en este sistema ya que lo que se desea es detectar las diferencias (tanto las mayores-positivas como las menores-negativas) del medio experimental o del medio de control . Las unidades arbitrarias de tamaño (por ejemplo, área) podrían convertirse comúnmente en mediciones físicas mediante la adición de una referencia física al proceso de imágenes. Por ejemplo, una referencia física de área conocida se puede incluir tanto en el proceso de imágenes superiores como en el de imágenes laterales. En base al área de estas referencias físicas, se puede determinar un factor de conversión para permitir la conversión de pixeles a una unidad de área tal como centímetros cuadrados (era2) . La referencia física puede o no ser una muestra independiente. Por ejemplo, la maceta, con un diámetro y altura conocidos, podría servir como una referencia física adecuada.

Clasificación del color: La tecnología de imágenes también se puede usar para determinar color de la planta y para asignar los colores de las plantas a varias clases de color. La asignación del color de las imágenes a las clases de color es una característica propia del programa LemnaTec . Con otros sistemas de programas de análisis de imágenes, la clasificación de color se puede determinar por una gran variedad de planteamientos computacionales .

Para la determinación de los parámetros del tamaño y crecimiento de las plantas se presenta un esquema de clasificación útil para definir un esquema simple de color que incluye dos o tres degradaciones de verde y, adicionalmente , una clase de color para clorosis, necrosis y blanqueamiento, si ocurrieran estas condiciones. También se usa una clase de color de fondo que incluye colores en la imagen que no son de plantas (por ejemplo, colores de macetas y suelo) y estos pixeles se excluyen, específicamente, de la determinación del tamaño. Las plantas se analizan bajo una iluminación constante controlada de manera que se pueda cuantificar cualquier cambio que se produce en una planta con el tiempo o entre plantas o lotes diferentes de plantas (por ejemplo, diferencias estacionales) .

Además de su utilidad en determinar el crecimiento de la planta, la clasificación de color se puede usar para analizar otras características del componente de producción. Para estas otras características del componente de producción se puede usar esquemas adicionales de la clasificación del color. Por ejemplo, la característica conocida como "siempre verde", que se ha asociado con mejorías en el rendimiento, se puede analizar mediante la clasificación de color que separa las degradaciones de verde de las sombras de amarillo y café (que son indicativos de tejidos senescentes). Si se aplica esta clasificación de color a las imágenes tomadas hacia el final del ciclo de vida de las plantas T0 o TI, se puede identificar las plantas con cantidades aumentadas de colores de verde en relación con los colores amarillo o café (expresados, por ejemplo, como relación verde/amarillo). Las plantas con una diferencia importante en esta relación verde/amarillo se pueden identificar como transgenes portadores que impactan esta característica agronómica importante.

El biólogo experto en plantas reconocerá que surgen otros colores de plantas que pueden indicar salud de la planta o respuesta al estrés (por ejemplo, antocianina) y que otros esquemas de clasificación de color pueden proporcionar medidas adicionales de la acción genética en características relacionadas con estas respuestas.

Análisis de la arquitectura de la planta: Los transgenes que modifican los parámetros de la arquitectura de la planta se pueden identificar, además, con el uso de la presente invención, incluso los parámetros tales como altura y anchura máxima, distancias internodales, ángulo entre las hojas y el tallo, cantidad de hojas que surgen de los nodulos y longitud de las hojas. El programa del sistema LemnaTec se puede usar para determinar la arquitectura de la planta de la siguiente manera. La planta se reduce a su arquitectura geométrica principal en una primera etapa de imágenes y después, en base a esta imagen, se puede realizar la identificación parametrizada de los diferentes parámetros de arquitectura. Los transgenes que modifican cualquiera de estos parámetros de arquitectura, ya sea solos o combinados, se pueden identificar mediante la aplicación de los enfoques estadísticos descritos anteriormente.

Fecha de esparcimiento del polen: La fecha de esparcimiento del polen es un parámetro importante de analizar en una planta transformada y se puede determinar mediante la primera aparición en la planta de una flor macho activa. Para encontrar el elemento de la flor macho, el extremo superior del tallo se clasifica por color para detectar anteras amarillas o violeta. Este análisis de la clasificación de color se usa después para definir una flor activa, que a su vez se puede usar para calcular la fecha de esparcimiento del polen.

Alternativamente, el personal responsable del cuidado de la planta puede registrar la fecha de esparcimiento del polen y otros atributos de la planta fácilmente detectables por medio de la vista (por ejemplo, fecha de polinización, primera fecha de maduración) . Para maximizar la integridad de los datos y la eficacia del proceso, esta información se monitorea mediante el uso de los mismos códigos de barra usados por el dispositivo de análisis digital de espectro de luz de LemnaTec . Una computadora con lector de códigos de barras, un dispositivo digital personal o una computadora portátil se pueden usar para facilitar la captura de datos por medio de registrar las horas de observación, el identificador vegetal y el operador que captó los datos.

Orientación de las plantas: Las plantas maduras de maíz cultivadas a densidades que se aproximan a la siembra comercial tienen, frecuentemente, una arquitectura plana. Es decir, la planta tiene un lado ancho claramente observable y un lado estrecho. La imagen de la planta está determinada por el lado ancho. Para cada planta se asigna una orientación básica bien definida para obtener la máxima diferencia entre el lado ancho y las imágenes de lado. La imagen superior se usa para determinar el eje principal de la planta y se usa un dispositivo giratorio adicional para posicionar la planta en la orientación adecuada antes de empezar la captación principal de imágenes.

E emplo 13 Evaluación de líneas de maíz derivadas de Gaspe Flint para determinar la tolerancia a la sequía Las líneas de maíz transgénicas derivadas de Gaspe Flint que contienen el gen candidato tolerante a la sequía se pueden analizar de la siguiente manera para determinar la tolerancia al estrés por sequía.

Las plantas de maíz transgénicas se exponen a condiciones de riego adecuadas (control) y a condiciones de estrés de la sequía. Las plantas de maíz transgénicas se analizan en la etapa TI o posterior.

Para crecimiento vegetal, la mezcla de tierra consiste en ¼ de TURFACE®, ¾ de SB300 y H de arena. Todas las macetas se llenan con la misma cantidad de tierra + 10 gramos. Las macetas se llevan hasta un 100 % de la capacidad de campo ("CC") mediante riego manual. Todas las plantas se mantienen a 60 % de la CC con el uso de una solución de nutrientes 20-10-20 (N-P-K) 125 ppm N. A lo largo del experimento se controla el pH por lo menos tres veces por semana para cada tabla. Se empieza a los 13 días después de la plantación (DDP) , el experimento se puede dividir en dos grupos de tratamiento, buen riego y riego reducido. Todas las plantas que comprenden el tratamiento con riego reducido se mantienen a 40 % de la CC, mientras que las plantas con el tratamiento con buen riego se mantienen a 80 ¾ de la CC . Las plantas con riego reducido se cultivan durante 10 días bajo condiciones crónicas de estrés por sequía (40 % de la CC) . Todas las plantas se capturan en imagen diariamente durante todo el período de estrés crónico. Se toma muestras de las plantas para analizar los perfiles metabólicos al final dél período de sequía crónica, 22 DDP. Al finalizar el período de estrés crónico todas las plantas de capturan en imagen y se determina la fluorescencia clorofílica. Las plantas con riego reducido se someten a un período de estrés por sequía severo seguido por un período de recuperación, 23 31 DDP y 32 - 34 DDP, respectivamente. Durante el estrés severo por sequía, el agua y los nutrientes se mantienen hasta que las plantas alcanzan 8 % de laCC. Al finalizar los períodos de estrés severo y de recuperación todas las plantas se capturan en imágenes y se determina la fluorescencia clorofílica nuevamente. La probabilidad de una prueba t de Student mayor se calcula para cada medio transgénico en comparación con el medio nulo apropiado (ya sea nulo segregante o nulo del constructo) . Un mínimo (P<t) de 0.1 se usa como corte para un resultado estadísticamente significati o.

Ejemplo 14 Transformación y evaluación de líneas de maíz derivadas de Gaspe Flint transformadas con PHP29675 Se transformó una línea de maíz derivada de Gaspe Flint por medio de Agrobacterium con el ADN plasmídico PHP29675 que contiene el fragmento de ADN genómico de pasto Sudán IS125. Se evaluaron cuatro eventos de transformación para el constructo plasmídico para determinar la tolerancia a la sequía en una forma similar a la descrita en el Ejemplo 13.

Las Tablas 19-20 muestran las variables para cada evento transgénico que se alteraron significativamente, en comparación con los segregantes nulos. Un "efecto positivo" se definió como una mejora estadísticamente significativa en esa variable para el evento transgénico con respecto al control negativo. Un "efecto negativo" se definió como una mejora estadísticamente significativa en esa variable para el control negativo con respecto al evento transgénico. La Tabla 19 presenta el número de variables con un cambio significativo para los eventos individuales transformados con el constructo de ADN plasmídico. La Tabla 20 presenta el número de eventos para el constructo que mostró un cambio significativo para cada variable individual.

Tabla 19 Número de variables con un cambio significativo* para los eventos individuales transformados con PHP29675 que contenían el fragmento genómico IS125 Reducción de agua Riego adecuado Evento Efecto Efecto Efecto Efecto positivo negativo positivo negativo EA2393.324.2.1 3 2 3 EA2393.324.3.2 1 1 0 2 EA2393.324.4.2 0 1 0 1 EA2393.324.5.1 3 1 2 0 * valor P menor o igual que 0.1 Tabla 20 Número de eventos transformados con PHP29675 con un cambio significativo* para las variables individuales Reducción de agua Riego adecuado Variable Efecto Efecto Efecto Efecto positivo negativo positivo negativo % de área camb_inicio crónico - final crónico 1 0 0 2 % de área camb_inicio crónico - cosecha 1 0 0 1 % de área camb_inicio crónico - recuperación 24 h 0 0 0 0 % de área camb_inicio crónico - recuperación 48 h 0 0 0 0 fv/fm_agudol 2 0 2 1 fv/fm_agudo2 0 0 0 0 enrollamiento de hoja_recuperación 24 h 0 1 0 0 enrollamiento de hoja_recuperación 48 h 0 0 0 0 psii_agudol 2 0 1 0 psii_agudo2 0 0 0 0 sgr - r2 > 0.9 0 2 0 2 Peso seco del brote 1 1 0 0 Peso fresco del brote 0 0 1 0 * Valor P menor o igual que 0.1 Para el constructo evaluado, PHP29675, el valor estadístico asociado con cada variable mejorada se presenta en las Figuras 6A, 6B, 7A y 7B. Un resultado positivo significativo tenía una valor P menor que o igual a 0.1. Los resultados para las líneas de maíz transformadas individuales se presentan en las Figuras 6A y 6B. La evaluación resumida para el constructo PHP30853 se presenta en las Figuras 7A y 7B. Como se muestra en la Tabla 18 y en las Figuras 6A y 6B, en condiciones de agua reducida los eventos de transformación del maíz EA2393.324.2.1 y EA2393.324.5.1 tenían valores positivos significativos para tres de las trece variables enunciadas.

Ejemplo 15 Análisis de producción de líneas de maíz transformadas con el gen guía tolerante a la sequía Un constructo de ADN recombinante que contiene un gen tolerante a la sequía validado puede introducirse en una línea endogámica de élite del maíz mediante transformación directa o introgresión de una línea transformada separadamente.

Las plantas transgénicas , ya sea endogámicas o híbridas, se pueden probar mediante estudios de campo más intensos para analizar la mejora en la producción y/o estabilidad en condiciones de riego adecuadas y en condiciones de limitación de agua.

El análisis de producción posterior se puede realizar para determinar si las plantas que contienen el gen guía tolerante a la sequía validado tienen una mejora en el rendimiento de producción en condiciones de limitación de agua, cuando se comparan con las plantas de control que no contienen el gen guía tolerante a la sequía validado. Específicamente, las condiciones de sequía se pueden imponer durante el periodo de floración y/o llenado del grano para las plantas que contienen el gen guía tolerante a la sequía validado y para las plantas de control. La reducción en la producción se puede medir para ambas. Las plantas que contienen el gen guía tolerante a la sequía validado pueden tener una pérdida menor de la producción que las plantas de control, por ejemplo, una pérdida de la producción al menos 25 % menor, en condiciones de limitación de agua o tendrían una producción mayor que las plantas de control en condiciones de agua no limitada.

El método anterior podría usarse para seleccionar plantas transgénicas con un mayor rendimiento, en condiciones de limitación de agua y/o de riego adecuado, en comparación con una planta control que no comprende el constructo de ADN recombinante .

Ejemplo 16 Ensayos para identificar líneas de Arabidopsis transgénicas con una mayor tolerancia a la sequía Ensayo cuantitativo de sequía: A partir de cada una de las líneas de Arabidopsis transgénicas se sembraron nueve plantas T2 resistentes al glufosinato, cada una de ellas en una sola maceta con suelo SCOTTS® METRO-MIX® 200. Se prepararon bandejas de cultivo con 8 macetas cuadradas cada una. Cada maceta cuadrada se llenó con suelo hasta la parte superior. Cada maceta (o célula) se sembró para producir 9 plántulas resistentes al glufosinato en una matriz de 3x3.' El suelo se regó hasta la saturación y, después, las plantas se cultivaron en condiciones estándar (es decir, un ciclo de 16 horas de luz y 8' horas de oscuridad; 22 °C; -60 % de humedad relativa) . No se suministró agua adicional.

Se tomaron imágenes digitales de las plantas cuando comenzaron los síntomas visibles de estrés de la sequía. Las imágenes se tomaron una vez al día (a la misma hora del día) hasta que las plantas se desecaron. Típicamente, los datos se recolectan durante cuatro días consecutivos.

Para identificar potenciales líneas tolerantes a la sequía se usa análisis del color. El análisis del color se puede usar para medir el incremento en el porcentaje de área de la hoja que cae dentro del ancho del intervalo del color amarillo. En base a los datos del tono, saturación e intensidad ("HSI", por sus siglas en inglés), el ancho del intervalo del color amarillo consiste en los tonos 35 a 45.

Además, otro criterio usado para identificar líneas potencialmente tolerantes a la sequía es el mantenimiento del área de la hoja, ya que las hojas de Arabidopsis se marchitan durante el estrés de la sequía. El mantenimiento del área de la hoja se puede medir como la reducción del área de la hoja de roseta en el tiempo.

El área de la hoja se mide en términos del número de pixeles verdes obtenidos con el sistema de captación de imágenes LemnaTec. Se cultivan plantas con rotulación de activación y de control (por ejemplo, de tipo silvestre) una al lado de la otra en bandejas de cultivo que contienen 72 plantas (9 plantas/maceta) . Una vez que empiezan a marchitarse, se miden las imágenes por una cantidad de días necesaria para controlar el proceso de marchitado. A partir de estos datos se determinan perfiles de marchitado en base a los recuentos de pixeles verdes obtenidos durante cuatro días consecutivos para las plantas con rotulación de activación y las plantas de control acompañantes. El perfil se selecciona a partir de una serie de mediciones durante el período de cuatro días que produce el mayor grado de marchitado. La capacidad para soportar la sequía se mide por medio de la tendencia de las plantas con rotulación de activación para resistir el marchitado cuando se comparan con plantas de control .

Para analizar las imágenes en CCD se usa la aplicación informática LemnaTec HTSBonitUV. Se obtienen cálculos del área de la hoja de las plantas de Arabidopsis en términos de la cantidad de pixeles verdes. Se promedian los datos de cada imagen para calcular la desviación media y estándar para los conteos de pixeles verdes de las plantas con rotulación de activación y de tipo silvestre. Se obtienen parámetros para una función de ruido mediante regresión lineal de la desviación cuadrática contra el recuento medio de pixeles con datos de todas las imágenes en un grupo. Se calcula los errores para los datos del recuento promedio de pixeles con los parámetros de ajuste para la función de ruido. Los recuentos promedio de pixeles para las plantas con rotulación de activación y de tipo silvestre se suman para obtener la evaluación del área total de la hoja para cada imagen. Para obtener el intervalo de cuatro días con marchitado máximo se selecciona el intervalo que corresponde a la diferencia máxima en el crecimiento de la planta. Las respuestas de marchitado individuales de las plantas con rotulación de activación y de tipo silvestre se obtienen mediante normalización de los datos con el valor del recuento de pixeles verdes del primer día en el intervalo. La tolerancia a la sequía de la planta con rotulación de activación en comparación con la planta de tipo silvestre se califica por medio de la suma de la diferencia ponderada entre la respuesta- de marchitado de las plantas con rotulación de activación y las plantas de tipo silvestre en el día dos al día cuatro; los pesos se calculan mediante la propagación del error en los datos. Un puntaje positivo para la tolerancia a la sequía corresponde a una planta con rotulación de activación con marchitado más lento en comparación con la planta de tipo silvestre. El significado de la diferencia en la respuesta al marchitado entre las plantas con rotulación de activación y de tipo silvestre se obtiene a partir de la suma ponderada de las desviaciones cuadráticas.

Las líneas con un retardo significativo en la acumulación de color amarillo y/o con un mantenimiento significativo del área de la hoja de la roseta, en comparación con el promedio de la bandeja de cultivo completa, se designan como aciertos de la Fase 1. Los aciertos de la Fase 1 se tamizan nuevamente por duplicado bajo las mismas condiciones de la prueba. Cuando una o ambas réplicas de la Fase 2 muestran una diferencia significativa (puntaje mayor que 0.9) con la media de la bandeja completa, la línea se considera como una línea tolerante a la sequía validada.

Ejemplo 17 Validación de SS-DTP21-1 por medio de la transformación en Arabidopsis El gen candidato que codifica SS-DTP21-1 (sec. con núm. de ident.:27) se probó para determinar su capacidad de conferir tolerancia a la sequía en Arabidopsis de la siguiente manera.

Se preparó un vector binario basado en ADN-T de 16.8 kb denominado pBC-amarillo con un promotor 35S de 1.3 kb ubicado inmediatamente corriente arriba del inserto de conversión Cl INVITROGEN™ GATEWAY®. El vector contiene, además, el promotor RD29a que conduce la expresión del gen para ZS-amarillo (INVITROGEN™) que confiere fluorescencia amarilla a la semilla transformada.

La región codificante de proteínas de SS-DTP21-1 se amplificó a partir de ADN genómico de pasto Sudán por medio de RT-PCR con los siguientes iniciadores: (1) Iniciador directo de SS-DTP21-1-5 ' attB (sec. con núm. de ident.:67) : GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGGCCGAGAAGTACCACGAAG (2) Iniciador inverso de SS-DTP21-1-3 ' attB (sec. con núm. de ident.:68) : GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTAGCGGCGCTCTAATTCCCTAATC El iniciador directo contiene la secuencia de attBl (ACAAGTTTgTACAAAAAAGCAGGCT; sec . con núm . de ident.:69) adyacente a los primeros 22 nucleótidos de la región codificante de proteínas que comienza con el codón de iniciación ATG.

El iniciador inverso contiene la secuencia de attB2 (ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT; sec. con núms . de ident.:70) adyacente al complemento inverso de los últimos 25 nucleótidos de la región codificante de proteínas que comienza con el complemento inverso del codón de terminación .

Con el uso de la tecnología INVITROGEN™ GATEWAY® CLONASE™ se realizó una reacción de recombinación BP con pDONR™/Zeo. Este proceso eliminó el gen letal bacteriano ccdB, así como el gen de resistencia al cloranfenicol (CAM) de pDONR™/Zeo y clonó direccionalmente el producto de PCR con los sitios de flanqueo attBl y attB2 para crear un clon de entrada, pD0NR™/Zeo-SS-DTP21-l . Este clon de entrada se usó para una reacción de recombinación LR posterior con un vector de destino, de la siguiente manera.

Se preparó un vector binario con base de ADN-T de 16.8 kb (vector de destino) denominado pBC-amarillo (sec. con núm. de ident.:71) con un promotor 35S de 1.3 kb ubicado inmediatamente corriente arriba del inserto de conversión Cl INVITROGEN™ GATEWAY® Cl que contiene el gen ccdB letal bacteriano ' además del gen de resistencia al cloranfenicol (CAM, por sus siglas en inglés) contiguo a las secuencias de attRl y attR2. El vector contiene, además, el promotor RD29a que conduce la expresión del gen para ZS-amarillo (INVITROGEN™) que confiere fluorescencia amarilla a la semilla transformada. Con el uso de la tecnología de INVITROGEN™ GATEWAY®, se realizó una reacción pD0NR™/Zeo-SS-DTP21-1 de recombinación LR en el clon de entrada que contiene el producto de PCR clonado direccionalmente y el pBC-amarillo. Esto permitió realizar la clonación rápida y direccional del gen candidato por detrás del promotor 35S en el pBC-amarillo para crear la expresión SS-DTP21-1 del constructo promotor 35S : : SS -DTP21 - 1 , pBC-amarillo- .

Después, el constructo de expresión promotor 35S::SS- DTP21-1 se introdujo en Arabidopsis silvestre, ecotipo Col-0 con un procedimiento de transformación mediado por Agrobacterium de planta entera (publicación de patente internacional núm . WO 2009/006276, cuyo contenido se incorpora en la presente descripción como referencia) . Se seleccionaron semillas TI transgénicas seleccionadas mediante fluorescencia amarilla y las semillas TI se colocaron en placas cerca de las semillas de tipo silvestre y se cultivaron en condiciones de agua limitada. Las condiciones de crecimiento y el análisis por captación de imágenes fueron tal como se describe en el Ejemplo 16. Se determinó que las plantas de Arabidopsis transgénicas transformadas con un constructo, en donde SS-DTP21-1 se expresó directamente por medio del promotor 35S eran tolerantes a la sequía. El puntaje de la tolerancia a la sequía, determinado por medio del método del Ejemplo 16, fue de 1.0.

Ejemplo 18 Validación de SS-DTP21-2 por medio de la transformación en Arabidops i s El gen candidato que codifica SS-DTP21-2 (sec. con núm . de ident . :32) se probó para determinar su capacidad de conferir tolerancia a la sequía en Arabidopsis de la siguiente manera.

Se preparó un vector binario basado en ADN-T de 16.8 kb denominado pBC-amarillo con un promotor 35S de 1.3 kb ubicado inmediatamente corriente arriba del inserto de conversión Cl I VI TROGEN™ GATEWAY®. El vector contiene, además, el promotor RD29 a que conduce la expresión del gen para ZS-amarillo ( I VI TROGEN™ ) que confiere fluorescencia amarilla a la semilla transformada.

La región codificante de proteínas de SS-DTP21-2 se amplificó a partir de ADN genómico de pasto Sudán por medio de RT-PCR con los siguientes iniciadores: (3) Iniciador directo de SS-DTP21-2-5 ' attB (sec. con núm . de ident . :72) : GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGGCCGAGAAGTACCACCATG (4) Iniciador inverso de SS-DTP21-2-3 ' attB (sec. con núm. de ident. :73) : GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTAGCGGTGCTCTAATTCCTTG El iniciador directo contiene la secuencia de attBl (ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT; sec. con núm. de ident. :69) adyacente a los primeros 22 nucleótidos de la región codificante de proteínas que comienza con el codón de iniciación ATG .

El iniciador inverso contiene la secuencia de attB2 (ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT; sec. con núms . de ident. :70) adyacente al complemento inverso de los últimos 22 nucleótidos de la región codificante de proteínas que comienza con el complemento inverso del codón de terminación.

Con el uso de la tecnología INVITROGEN™ GATEWAY® CLONASE™ se realizó una reacción de recombinación BP con pDONR™/Zeo para crear un clon de entrada, pDONR™/Zeo-SS-DTP21-2. Después, se realizó una reacción de recombinación LR en el clon de entrada pDONR™ /Zeo-SS-DTP21-2 que contiene el producto de PCR clonado direccionalmente , y el vector de destino pBC-amarillo (sec. con núm . de ident . :71; Ejemplo 17) . Esto permitió realizar la clonación rápida y direccional del gen candidato por detrás del promotor 35S en el pBC-amarillo para crear la expresión SS-DTP21-2 del constructo promotor 35S : : SS -DTP21 - 2 , pBC-amaril lo .

Después, el constructo de expresión promotor 35S : : SS -DTP21 - 2 se introdujo en Arabidopsis silvestre, ecotipo Col-0 con un procedimiento de transformación mediado por Agrobacterium de planta entera (publicación de patente internacional núm. O 2009/006276, cuyo contenido se incorpora en la presente descripción como referencia) . Se seleccionaron semillas TI transgénicas seleccionadas mediante fluorescencia amarilla y las semillas TI se colocaron en placas cerca de las semillas de tipo silvestre y se cultivaron en condiciones de agua limitada. Las condiciones de crecimiento y el análisis por captación de imágenes fueron tal como se describe en el Ejemplo 16. Se determinó que las plantas de Arabidopsis transgénicas transformadas con un constructo en donde SS-DTP21-2 se expresó directamente por medio del promotor 35S eran tolerantes a la sequía. El puntaje de la tolerancia a la sequía, determinado por medio del método del Ejemplo 16, fue de 2.2.

Ejemplo 19 Ensayo de tolerancia a la sequía De homólogos de SS-DTP21-1 en arroz Los homólogos de SS-DTP21-1 Descritos en el Ejemplo 7 se introdujeron en un cultivar de arroz Yukihikari por medio de transformación mediada por Agrojbacteriura, tal como se describió en el Ejemplo 3. Para estos experimentos, la región que codifica SS-DTP21-1 en el subclon Sub8 del fragmento genómico IS125 se reemplazó con las regiones codificantes de proteínas de varios genes que codifican polipéptidos homólogos a SS-DTP21-1. Se ensayaron plantas de arroz transgénico para determinar la tolerancia a la sequía en la generación T0. Los detalles del ensayo de tolerancia a la sequía se describen en el Ejemplo 2. Más de una planta transgénica de 36, 42 o 48 regenerantes de ocho homólogos (SS-DTP21-5, SB-DTP21-4, SB-DTP21-5, SB-DTP21-6, SB-DTP21-9, SB-DTP21-10, SH-DTP21-1, SO-DTP21-1) obtuvo un puntaje de 2 o mayor, mientras que ninguno de los 42 regenerantes del Yukihikari no transgénico obtuvo ese puntaje (Tabla 21) . Por lo tanto, cada uno de estos ocho homólogos fue suficiente para producir arroz transgénico tolerante a la sequía.

Tabla 21 Ensayo de tolerancia a la sequía de regenerantes de TO transformados con homólogos de 5S-DTP21-1 DNA1 Homólogo Núm. total2 Núm. =23 Respuesta a la Sec. con núm. sequía de ident .

Yukihikari 42 0 Susceptible (control) SS-DTP21-3 52 36 . 0 Susceptible SS-DTP21-4 54 36 0 Susceptible SS-DTP21-5 56 36 7 Tolerante SS-DTP21-6 79 48 0 Susceptible SS-DTP21-7 58 36 0 Susceptible SB-DTP21-1 41 36 0 Susceptible SB-DTP21-2 42 36 0 Susceptible SB-DTP21-3 45 36 0 Susceptible SB-DTP21-4 46 36 17 Tolerante SB-DTP21-5 81 42 12 Tolerante SB-DTP21-6 83 42 9 Tolerante SB-DTP21-9 85 42 16 Tolerante SB-DTP21-10 87 42 9 Tolerante SH-DTP21-1 60 48 21 Tolerante SH-DTP21-2 62 36 0 Susceptible S0-DTP21-1 64 36 6 Tolerante SO-DTP21-2 66 36 0 Susceptible 1 ADN usado en la transformación. 2 Número total de regenerantes probados. 3 Número de regenerantes con un puntaje de 2 o mayor.

Ejemplo 20 Ensayo de tolerancia a la sequía de la generación TI de líneas de tabaco transformadas con SS-DTP21-1 La región promotora del subfragmento Sub8 del fragmento genómico IS125 que codifica SS-DTP21-1 se reemplazó con el promotor 35S de la siguiente manera. Se realizó la PCR con Pyrobest ADN polimerasa (TAKARA-BIO) con ADN plasmídico de Sub8 como molde y un par de iniciadores, sec. con núm. de ident . : 88 (5 ' -ACCTTTTTATCCTCAAAGCTTCTTCTCAGA-3 ' ) y sec . con núm. de ident . : 89 (5 ' - CCCCTGACCTCAATTGTCAAACACC AGC-3 ' ) , después, los productos de PCR se insertaron en pCR4 Blunt-TOPO (Invitrogen) . Después de confirmar la secuencia de la región amplificada por PCR se realizó la digestión con HindIII y Mfel para producir un fragmento de 1.8 kb. De manera similar se realizó la PCR con ADN plasmídico de pSB31 (Ishida et al. 1996 Nature Biotechnology 14:745-750) como molde y un par de iniciadores, sec. con núm. de ident. :90 (5'-GGGCGTCGTTCTGGGTCAATTGTTATAGAG-3 ' ) y sec. con núm. de ident . : 91 (5 ' -GGACGTTTTTAAGGTACCGAATTCCAATCC-3 ' ) y, después , los productos de PCR se insertaron en pCR4 Blunt-TOPO seguido del tratamiento con Kpnl y Mfel para producir un fragmento de 1.4 kb. Los dos fragmentos (fragmentos de 1.8 kb y 1.4 kb) se insertaron en pSB200 tratado por digestión con HindIII y Kpnl y, después, pretratado con fosfatasa alcalina intestinal de ternero (CIAP, por sus siglas en inglés) . El gen quimérico resultante (de aquí en adelante designado como "35S+Sub8" o "constructo promotor 35S : : SS-DTP21- 1" términos que se usan indistintamente en la presente descripción) se introdujo en la variedad de tabaco SR1 por medio de transformación mediada por Agrojbacterium. Las plantas de tabaco transgénico se ensayaron para determinar la tolerancia a la sequía en la generación TI.

Las plantas modificadas genéticamente y las plantas silvestres se cultivaron en macetas de 12 cm y solamente se usaron plantas modificadas genéticamente resistentes a la higromicina para el ensayo de tolerancia a la sequía. Durante el tratamiento de la sequía en el cual se interrumpió el riego se tomaron fotografías desde la parte superior con un Scanalyzer (LemnaTec GmbH) y el área de la hoja se midió en unidades de números de píxeles. Se examinó estadísticamente las áreas de la hoja relativas a las áreas de la hoja medidas en el primer día del tratamiento de la sequía. Las hojas de las plantas silvestres se encogieron rápidamente después del tratamiento de la sequía, mientras que una de las nueve líneas TI mantuvo el tamaño de la hoja aun 3 días después del tratamiento de la sequía según se presenta en la siguiente tabla. Además, el área relativa de la hoja de esta línea, la línea TI núm. 9, fue estadísticamente diferente a las plantas silvestres en el día 6. Por lo tanto, la línea TI núm. 9, una línea de tabaco transgénico que contiene el constructo promotor 35S : : SS-DTP21-1 fue claramente tolerante a la sequía.

Tabla 22 Relación (¾) del área de la hoja relativa al área de la hoja para el primer día Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (32)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Una planta caracterizada porque comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operativamente a por lo menos un elemento regulador, en donde el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: (a) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de tolerancia a la sequía, en donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos 60 % basada en el método de alineamiento Clustal V con parámetros predeterminados para alineamientos en pares de KTUPLE=1, PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN3 , VENTANA=5 y DIAGONALES GUARDADAS=5 cuando se compara con las sec . con núms . de ident.:27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 u 87; (b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de tolerancia a la sequía, en donde la secuencia de nucleótidos es hibridable en condiciones rigurosas con una molécula de ADN que comprende el complemento completo de las sec. con núms. de ident.:26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 u 86; (c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de tolerancia a la sequía, en donde la secuencia de nucleótidos se deriva de las sec . con núms. de ident.:26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 u 86 por la alteración de uno o más nucleótidos por medio de al menos un método seleccionado del grupo que consiste en: deleción, sustitución, adición e inserción; (d) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido, en donde la secuencia de aminoácidos del polipéptido comprende las sec. con núms. de ident.:27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 u 87; y (e) una secuencia de nucleótidos que comprende las sec. con núms. de ident.:26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 u 86; y en donde la planta exhibe una mayor tolerancia a la sequía cuando se compara con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante.

2. Una planta que comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operativamente a por lo menos un elemento regulador, caracterizada porque el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: (a) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de tolerancia a la sequía, en donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos 80 % basada en el método de alineamiento Clustal V con parámetros predeterminados para alineamientos en pares de KTUPLE=1, PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN=3 , VENTANA=5 y DIAGONALES GUARDADAS=5 cuando se compara con las sec . con núm. de ident.:27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 u 87; (b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de tolerancia a la sequía, en donde la secuencia de nucleótidos es hibridable en condiciones rigurosas con una molécula de ADN que comprende el complemento completo de las sec. con núms . de ident.:26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 u 86; (c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de tolerancia a la sequía, en donde la secuencia de nucleótidos se deriva de las sec. con núms. de ident.:26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 u 86 por la alteración de uno o más nucleótidos por medio de al menos un método seleccionado del grupo que consiste en: deleción, sustitución, adición e inserción; (d) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido, en donde la secuencia de aminoácidos del polipéptido comprende las sec. con núms. de ident.:27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 u 87; y (e) una secuencia de nucleótidos que comprende las sec. con núms. de ident.:26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 u 86 ; y en donde la planta exhibe un aumento en la producción cuando se compara con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante .

3. La planta de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque exhibe el aumento en la producción cuando se compara, bajo condiciones de limitación de agua, con la planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante.

4. La planta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 3, caracterizada porque la planta es una monocotiledónea o dicotiledónea.

5. La planta de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque se selecciona del grupo que consiste en: maíz, frijol de soja, girasol, sorgo, cañóla, trigo, alfalfa, algodón, arroz, cebada, mijo, caña de azúcar, pasto aguja, tabaco, papa y remolacha azucarera.

6. Un método para aumentar la tolerancia a la sequía en una planta, caracterizado porque comprende: (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operativamente a por lo menos un elemento regulador, en donde el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de tolerancia a la sequía, en donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos 80 % basada en el • método de alineamiento Clustal V con parámetros predeterminados para alineamientos en pares de KTUPLE=1, PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN3 , VENTANA=5 y DIAGONALES GUARDADAS=5 cuando se compara con las sec. con núms . de ident. :27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 u 87; (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de tolerancia a la sequía, en donde la secuencia de nucleótidos es hibridable en condiciones rigurosas con una molécula de ADN que comprende el complemento completo de las sec. con núms. de ident. :26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 u 86; (iii)una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de tolerancia a la sequía, en donde la secuencia de nucleótidos se deriva de las sec. con núms. de ident. :26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 u 86 por la alteración de uno o más nucleótidos por medio de al menos un método seleccionado del grupo que consiste en: deleción, sustitución, adición e inserción; (iv) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido, en donde la secuencia de aminoácidos del polipéptido comprende las sec. con núms. de ident. :27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 u 87; y (v) una secuencia de nucleótidos que comprende las sec. con núms . de ident.:26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 u 86; y (b) regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante y exhibe una mayor tolerancia a la sequía cuando se compara con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante.-

7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque comprende, además: (c) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante y muestra una tolerancia aumentada a la sequía en comparación con una planta control que no comprende el constructo de ADN recombinante .

8. Un método para evaluar la tolerancia a la sequía en una planta, caracterizado porque comprende: (a) obtener una planta transgénica, en donde la planta transgénica comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operativamente a por lo menos un elemento regulador, en donde el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de tolerancia a la sequía, en donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos 80 % basada en el método de alineamiento Clustal V con parámetros predeterminados para alineamientos en pares de KTUPLE=1, PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN=3 , VENTA A-5 y DIAGONALES GUARDADAS=5 cuando se compara con las sec . con núms . de ident.:27, 32, 46, 56, 60, 64, '81-, 83, 85 u 87; (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de tolerancia a la sequía, en donde la secuencia de nucleótidos es hibridable en condiciones rigurosas con una molécula de ADN que comprende el complemento completo de las sec. con núms. de ident.:26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 u 86; (iii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de tolerancia a la sequía, caracterizado porque la . secuencia de nucleótidos se deriva de las sec. con núms. de ident.:26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 u 86 por la alteración de uno o más nucleótidos por medio de al menos un método seleccionado del grupo que consiste en: deleción, sustitución, adición e inserción; (iv) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido, en donde la secuencia de aminoácidos del polipéptido comprende las sec. con núms. de ident.:27, 32, 46, 56, 60, 64,. 81, 83, 85 u 87; y (v) una secuencia de nucleótidos que comprende las sec. con núms . de ident.:26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 u 86; y (b) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica de (a) , en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante ; y (c) evaluar la planta progenie para determinar la tolerancia a la sequía por comparación con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante.

9. Un método para determinar las alteraciones de una característica agronómica en una planta, caracterizado porque comprende : (a) obtener una planta transgénica, en donde la planta transgénica comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operativamente a por lo menos un elemento regulador, en donde el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de tolerancia a la sequía, en donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos 80 % basada en el método de alineamiento Clustal V con parámetros predeterminados para alineamientos en pares de KTUPLE=1, PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN=3 , VENTA A=5 y DIAGONALES GUARDADAS=5 cuando se compara con las sec . con núms . de ident.:27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 u 87; (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de tolerancia a la sequía, en donde la secuencia de nucleótidos es hibridable en condiciones rigurosas con una molécula de ADN que comprende el complemento completo de las sec. con núms. de ident.:26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 u 86; (iii)una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de tolerancia a la sequía, en donde la secuencia de nucleótidos se deriva de las sec. con núms. de ident.:26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 u 86 por la alteración de uno o más nucleótidos por medio de al menos un método seleccionado del grupo que consiste en: deleción, sustitución, adición e inserción; (iv) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido, en donde la secuencia de aminoácidos del polipéptido comprende las sec. con núms. de ident.:27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 u 87; y (v) una secuencia de nucleótidos que comprende las sec. con núms. de ident.:26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 u 86; y (b) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica de la etapa (a) , en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante ; y (c) determinar si la planta progenie exhibe una alteración de al menos una característica agronómica cuando se compara con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante.

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque al menos un rasgo agronómico es la producción y, en donde la alteración es un aumento.

11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10, caracterizado porque la etapa de determinación (c) comprende determinar si la planta transgénica exhibe una alteración de al menos una característica agronómica cuando se compara, en condiciones de limitación de agua, con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante.

12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, caracterizado porque la planta es una monocotiledónea o una dicotiledónea.

13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la planta se selecciona del grupo que consiste en: maíz, frijol de soja, girasol, sorgo, cañóla, trigo, alfalfa, algodón, arroz, cebada, mijo, caña de azúcar pasto aguja, tabaco, papa y remolacha azucarera.

14. Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: (a) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de tolerancia a la sequía, en donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos 60 % basada en el método de alineamiento Clustal V con parámetros predeterminados para alineamientos en pares de KTUPLE=1, PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN=3 , VENTANA=5 y DIAGONALES GUARDADAS=5 cuando se compara con las sec. con núms . de ident.:27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 u 87; (b) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de tolerancia a la sequía, en donde la secuencia de nucleótidos es hibridable en condiciones rigurosas con una molécula de ADN que comprende el complemento completo de las sec. con núms. de ident.:26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 u 86; (c) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido con actividad de tolerancia a la sequía, en dodne la secuencia de nucleótidos se deriva de las sec. con núms. de ident.:26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 u 86 por la alteración de uno o más nucleótidos por medio de al menos un método seleccionado del grupo que consiste en: deleción, sustitución, adición e inserción; (d) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido, en donde la secuencia de aminoácidos del polipéptido comprende las sec. con núms . de ident.:27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 u 87; y (e) una secuencia de nucleótidos que comprende las sec. con núms. de ident.:26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 u 86.

15. Un polinucleótido aislado que comprende el complemento completo de la secuencia de nucleótidos de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el complemento completo y la secuencia de nucleótidos de conformidad con la reivindicación 14 consisten del mismo número de nucleótidos y son 100 % complementarios.

16. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el polipéptido de la parte (a) tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos 80 % basada en el método de alineamiento Clustal V con los parámetros predeterminados de alineamiento en pares, cuando se compara con las sec. con núms. de ident.:27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 u 87.

17. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el polipéptido de la parte (a) tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos 85 % basada en el método de alineamiento Clustal V con los parámetros predeterminados de alineamiento en pares cuando se compara con las sec. con núms. de ident.:27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 u 87.

18. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el polipéptido de la parte (a) tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos 90 % basada en el método de alineamiento Clustal V con los parámetros predeterminados de alineamiento en pares, cuando se compara con las sec. con núms. de ident.:27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 u 87.

19. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el polipéptido de la parte (a) tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos 95 % basada en el método de alineamiento Clustal V con los parámetros predeterminados de alineamiento en pares cuando se compara con las sec. con núms. de ident.:27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 u 87.

20. Un constructo de ADN recombinante caracterizado porque comprende el polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 14 unido operativamente a por lo menos un elemento regulador.

21. Una célula que comprende el constructo de ADN de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque se selecciona del grupo que consiste en una célula bacteriana, una célula de levadura y una célula de insectos y una célula vegetal.

22. Una planta caracterizada porque comprende el constructo de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 20.

23. Una semilla caracterizada porque comprende el constructo de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 20.

24. Un método para aislar un polipéptido codificado por el constructo de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque comprende lo siguiente : (a) transformar una célula con el constructo de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 20; (b) cultivar la célula transformada de la etapa (a) en condiciones adecuadas para la expresión del constructo de ADN recombinante; y (c) aislar el polipéptido de la célula transformada de la etapa (b) .

25. Un polipéptido aislado caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste en: (a) un polipéptido con actividad de tolerancia a la sequía, caracterizado porque el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos 60 % basada en el método de alineamiento Clustal V con parámetros predeterminados para alineamientos en pares de KTUPLE=1, PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN=3 , VENTANA=5 y DIAGONALES GUARDADAS=5 cuando se compara con las sec . con núms . de ident.:27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 u 87; (b) un polipéptido con actividad de tolerancia a la sequía, en donde la secuencia de aminoácidos se deriva de las sec. con núms . de ident.:27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 u 87 por la alteración de uno o más aminoácidos por medio 5 de al menos un método seleccionado del grupo que consiste en: deleción, sustitución, adición e inserción; y (c) un polipéptido caracterizado porque la secuencia de aminoácidos del polipéptido comprende las sec. con núms. de ident.:27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 u 87. 0

26. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el polipéptido de la parte (a) tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos 80 % basada en el método de alineamiento Clustal V con los parámetros predeterminados 5 de alineamiento en pares, cuando se compara con las sec. con núms. de ident.:27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 u 87.

27. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el polipéptido de la parte (a) tiene una secuencia de aminoácidos con una 0 identidad de secuencia de al menos 85 % basada en el método de alineamiento Clustal V con los parámetros predeterminados de alineamiento en pares cuando se compara con las sec. con núms. de ident.:27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 u 87.

28. El polipéptido de conformidad con la 5 reivindicación 25, caracterizado porque el polipéptido de la parte (a) tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos 90 % basada en el método de alineamiento Clustal V con los parámetros predeterminados de alineamiento en pares cuando se compara con las sec . con núms. de ident.:27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 u 87.

29. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el polipéptido de la parte (a) tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos 95 % basada en el método de alineamiento Clustal V con los parámetros predeterminados de alineamiento en pares, cuando se compara con las sec. con núms. de ident.:27, 32, 45, 56, 60, 64, 81, 83, 85 u 87.

30. Un vector caracterizado porque comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 14.

31. Un método para producir una planta transgénica caracterizado porque comprende transformar una célula vegetal con el constructo de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 20 y regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal transformada.

32. La semilla de la planta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operativamente a por lo menos un elemento regulador, en donde el polinucleótido codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos 60 % basada en el método de alineamiento Clustal V cuando se compara con las sec. con núms . de ident.:27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 u 87, y caracterizada porque una planta producida a partir de la semilla exhibe una mayor tolerancia a la sequía o un aumento en la producción, o ambos, cuando se compara con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante .