MX2011010121A - Plantas que tienen caracteristicas agronomicas alteradas en condiciones de limitacion de nitrogeno y constructos y metodos relacionados que implican genes que codifican polipeptidos que contiene el dominio snf2. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona polinucleótidos y polipéptidos aislados y constructos de ADN recombinante particularmente útiles para alterar las características agronómicas de las plantas en condiciones de limitación de nitrógeno, composiciones (tales como plantas o semillas) que comprenden estos constructos de ADN recombinante y métodos que usan estos constructos de ADN recombinante. El constructo de ADN recombinante comprende un polinucleótido unido operacionalmente a un promotor funcional en una planta, en donde ese polinucleótido codifica un polipéptido que contiene el dominio SNF2.

Description

PLANTAS QUE TIENEN CARACTERISTICAS AGRONOMICAS ALTERADAS EN CONDICIONES DE LIMITACION DE NITROGENO Y CONSTRUCTOS Y METODOS RELACIONADOS QUE IMPLICAN GENES QUE CODIFICAN POLIPEPTIDOS QUE CONTIENEN EL DOMINIO SNF2 CAMPO DE LA INVENCIÓN El campo de la invención se relaciona con el cultivo y la genética de plantas y, particularmente, se relaciona con constructos de ADN recombinante útiles en plantas para conferir un uso eficiente del nitrógeno y/o tolerancia a las condiciones de limitación de nitrógeno.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los estresores abióticos limitan considerablemente la producción de cultivos en todo el mundo. Se estima que estos factores, acumulativamente, son responsables de una reducción promedio del 70 % en la producción agrícola. Las plantas son sésiles y deben adaptarse a las condiciones ambientales reinantes en su entorno. En consecuencia, han desarrollado una gran plasticidad para la regulación génica, la morfogénesis y el metabolismo. Las estrategias de adaptación y defensa implican la activación de proteínas que codifican genes importantes para la aclimatación o defensa frente a los distintos estresores.

El nitrógeno absorbido por las plantas es esencial para REF. :223077 su crecimiento (Galláis et al., J. Esp. Bot . 55 (396) : 295-306 (2004)) . Las plantas sintetizan aminoácidos a partir del nitrógeno inorgánico del ambiente. En consecuencia, la fertilización con nitrógeno ha sido una herramienta muy útil para aumentar la producción de plantas cultivadas, tales como el maíz y el frijol de soya. Actualmente, los agricultores desean reducir el uso de fertilizantes de nitrógeno para evitar la contaminación con nitratos y mantener un margen de ganancia suficiente. Si se puede incrementar la capacidad de una planta para asimilar el nitrógeno se espera, además, un mayor crecimiento de la planta y un aumento de la producción. En síntesis, se desea las variedades de plantas en las cuales la eficiencia de uso del nitrógeno (NUE, por sus siglas en inglés) es mayor.

Se puede usar la rotulación de la activación para identificar genes con la capacidad de afectar una característica. Este planteamiento se ha usado en la especie modelo de planta Arabidopsis thaliana (Weigel et al., Plant Physiol . 122:1003-1013 (2000)). Las inserciones de elementos potenciadores de la transcripción pueden, en forma dominante, activar y/o aumentar la expresión de genes endógenos cercanos. Este método se puede usar para identificar genes de interés para una característica específica (por ejemplo, eficiencia del uso del nitrógeno en una planta) , genes que al colocarlos en un organismo como un transgén pueden alterar esa característica.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención incluye: En una modalidad, una planta que comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinueléótido unido operacionalmente a por lo menos un elemento regulador, en donde ese polinueléótido codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de al menos 50 % de identidad de secuencia, basada en el método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec . con núm. de ident . : 19, 21, 23, 25, 27, 29, 30, 31, 32, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 o 49, y en donde esa planta exhibe una mayor tolerancia al estrés de nitrógeno cuando se compara con una planta de control que no comprende ese constructo de ADN recombinante .

En otra modalidad, una planta que comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinueléótido unido operacionalmente a por lo menos un elemento regulador, en donde el polinueléótido codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de al menos 50 % de identidad de secuencia, basada en el método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec. con núm. de ident.: 19, 21, 23, 25, 27, 29, 30, 31, 32, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 o 49, y en donde la planta exhibe una alteración de al menos una característica agronómica cuando se compara con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante. Opcionalmente , la planta exhibe esa alteración de por lo menos esa única característica agronómica cuando se compara, en condiciones de limitación de nitrógeno, con esa planta de control que no comprende ese constructo de ADN recombinante . Por lo menos la única característica agronómica podría ser la producción, la biomasa o ambas, y la alteración podría ser un aumento.

En otra modalidad la presente invención incluye cualquiera de las plantas de la presente invención en donde la planta se selecciona del grupo que consiste en: maíz, frijol de soya, girasol, sorgo, cañóla, trigo, alfalfa, algodón, arroz, cebada, mijo, caña de azúcar y pasto aguja.

En otra modalidad la presente invención incluye la semilla de cualquiera de las plantas de la presente invención, en donde la semilla comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operacionalmente a por lo menos un elemento regulador, en donde el polinucleótido codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de al menos 50 % de identidad de secuencia, basada en el método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec . con núm. de ident . : 19, 21, 23, 25, 27, 29, 30, 31, 32, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 o 49, y en donde la planta producida a partir de esa semilla exhibe una mayor tolerancia al estrés de nitrógeno o una alteración de al menos una característica agronómica, o ambas, cuando se compara con una planta de control que no comprende ese constructo de ADN recombinante . Por lo menos la única característica agronómica podría ser la producción, la biomasa o ambas y la alteración podría ser un aumento.

En otra modalidad, un método para aumentar la tolerancia al estrés de nitrógeno en una planta; el método comprende (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operacionalmente a por lo menos una secuencia reguladora, en donde el polinucleótido codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de al menos 50 % de identidad de secuencia, basada en el método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec . con núm. de ident . : 19, 21, 23, 25, 27, 29, 30, 31, 32, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 o 49; (b) regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante; y (c) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica de la etapa (b) , en donde esa planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante y exhibe una mayor tolerancia al estrés de nitrógeno cuando se compara con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante.

En otra modalidad, un método para evaluar la tolerancia al estrés de nitrógeno en una planta; el método comprende (a) obtener una planta transgénica, en donde la planta transgénica comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operacionalmente a por lo menos una secuencia reguladora, en donde el polinucleótido codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de al menos 50 % de identidad de secuencia, basada en el método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec . con núm. de ident . : 19, 21, 23, 25, 27, 29, 30, 31, 32, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 o 49; (b) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante; y (c) evaluar la planta progenie para determinar la tolerancia al estrés de nitrógeno cuando, se compara con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante .

En otra modalidad, un método para determinar una alteración de una característica agronómica en una planta; el método comprende (a) obtener una planta transgénica, en donde la planta transgénica comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operacionalmente a por .lo menos una secuencia reguladora, en donde el polinucleótido codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de al menos 50 % de identidad de secuencia, basada en el método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec. con núm. de ident.: 19, 21, 23, 25, 27, 29, 30, 31, 32, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 O 49, en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante ; (b) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante; y (c) determinar si la planta progenie exhibe una alteración de al menos una característica agronómica cuando se compara con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante. Opcionalmente , esa etapa de determinación (c) comprende determinar si la planta transgénica exhibe una alteración de al menos una característica agronómica cuando se compara, en condiciones de limitación de nitrógeno, con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante. Por lo menos la única característica agronómica podría ser la producción, la biomasa o ambas y la alteración podría ser un aumento.

En otra modalidad la presente invención incluye cualquiera de los métodos de la presente invención, en donde la planta se selecciona del grupo que consiste en: maíz, frijol de soya, girasol, sorgo, cañóla, trigo, alfalfa, algodón, arroz, cebada, mijo, caña de azúcar y pasto aguja.

En otra modalidad la presente invención incluye un polinucleótido aislado que comprende: (a) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que contiene el dominio SNF2 , en donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos de al menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de identidad de secuencia, basada en el método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec . con núm. de ident . : 19, 21, 23, 36, 38 o 46 o (b) un complemento completo de la secuencia de nucleótidos, en donde el complemento completo y la secuencia de nucleótidos consisten en el mismo número de nucleótidos y son 100 % complementarios. El polipéptido podría comprender la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.: 19, 21, 23, 36, 38, o 46. La secuencia de nucleótidos podría comprender la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.: 18, 20, 22, 35, 37 o 45.

En otra modalidad la presente invención trata sobre un constructo de ADN recombinante que comprende cualquiera de los polinucleótidos aislados de la presente invención unidos operacionalmente a por lo menos una secuencia reguladora, y una célula, una planta y una semilla que comprende el constructo de ADN recombinante. La célula podría ser eucariota, por ejemplo, una célula de una planta, un insecto o una levadura, o procariota, por ejemplo, una célula de una bacteria.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La invención se puede entender mejor con la siguiente descripción detallada y las figuras acompañantes y listado de secuencias, los cuales forman parte de esta solicitud.

La Fig. 1 muestra un esquema del constructo de rotulación de la activación de pHSbarENDs2 que se usa para elaborar las poblaciones de Arabidopsis (sec. con núm. de ident. : 1) .

La Fig. 2 muestra un esquema del vector pDONR™Zeo (sec. con núm. de ident . : 2) , vector donante de GATEWAY®. Él sitio attPl se encuentra en los nucleótidos 570-801; el sitio attP2 se encuentra en los nucleótidos 2754-2985 (hebra complementaria) .

La Fig. 3 muestra un esquema del vector pD0NR™221 (sec. con núm. de ident.: 3), vector donante de GATEWAY®. El sitio attPl se encuentra en los nucleótidos 570-801; el sitio attP2 se encuentra en los nucleótidos 2754-2985 (hebra complementaria) .

La Fig. 4 muestra un esquema del vector pBC-amarillo (sec. con núm. de ident.: 4), un vector objetivo para Usar en la construcción de vectores de expresión para Arabidopsis. El sitio attRl se encuentra en los nucleótidos 11276-11399 (hebra complementaria) ; el sitio attR2 se encuentra en los nucleótidos 9695-9819 (hebra complementaria) .

La Fig. 5 muestra un esquema del vector PHP2784Q (sec. con núm. de ident. : 5) , un vector objetivo para usar en la construcción de vectores de expresión para el frijol de soya. El sitio attRl se encuentra en los nucleótidos 7310-7434; el sitio attR2 se encuentra en los nucleótidos 8890-9014.

La Fig. 6 muestra un esquema del vector PHP23236 (sec. con núm. de ident. : 6) , un vector objetivo para usar en la construcción de vectores de expresión para las línéas de maíz derivadas de Gaspe Flint. El sitio attRl se encuentra en los nucleótidos 2006-2130; el sitio attR2 se encuentra en los nucleótidos 2899-3023.

La Fig. 7 muestra un esquema del vector PHP10523 (sec. con núm. de ident . : 7), un ADN plasmídico presente en la cepa de Agrobacterium .LBA4404 (Komari et al., Plant J. 10:165-174 (1996) ; núm. de identificación general del NCBI 59797027) .

La Fig. 8 muestra un esquema del vector PHP23235 (sec. con núm. de ident. : 8), un vector que se usa para construir el vector objetivo PHP23236.

La Fig. 9 muestra un esquema del vector PHP20234 (sec. con núm. de ident. : 9) .

La Fig. 10 muestra un esquema del vector objetivo PHP22655 (sec. con núm. de ident.: 10).

La Fig. 11 muestra un esquema del vector objetivo PHP29634 (sec. con núm. de ident.: 15) que se usa para construir vectores de expresión para las líneas de maíz derivadas de Gaspe Flint.

La Fig. 12 muestra un patrón de cuadrícula típico para cinco líneas (marcadas 1 a 5 - once ejemplares para cada línea) además del control de tipo silvestre Cl (nueve ejemplares) que se usan en los análisis.

La Fig. 13 muestra una gráfica que ilustra el efecto de varias concentraciones diferentes de nitrato potásico en el color de la planta tal como se determina mediante análisis de imágenes. La respuesta del intervalo del color verde (tonos 50 a 66) a la dosificación del nitrato demuestra que este intervalo se puede usar como indicador de la asimilación del nitrógeno .

La Fig. 14 muestra el medio de crecimiento que se usa para cultivos semi-hidropónicos de maíz en el Ejemplo 18.

La Fig. 15 muestra un cuadro que especifica los datos relacionados con el efecto de distintas concentraciones de nitrato en el crecimiento y desarrollo de líneas de maíz derivadas de Gaspe Flint en el Ejemplo 18.

Las Figs. 16A-16AM muestran el alineamiento múltiple de las secuencias de aminoácidos de longitud completa de los polipéptidos que contienen el dominio SNF2 de Arabidopsis thaliana (secs. con núm. de ident. : 25, 27 y 29) y sus homólogos (secs. con núm. de ident.: 19, 21, 23, 30, 31, 32, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 y 49).

La Fig. 17 muestra un cuadro del porcentaje de identidad de secuencia y los valores de divergencia para cada par de secuencias de aminoácidos ilustradas en las Figs. 16A-16AM.

BREVE DESCRIPCIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIAS Las descripciones y el listado de secuencias adjuntos a la presente cumplen las reglas que determinan las descripciones de secuencias de nucleótidos y/o de aminoácidos en solicitudes de patente como se describe en 37 C.F.R. §1.821-1.825. El listado de secuencias contiene el código de una sola letra para los caracteres de la secuencia de nucleótidos y los códigos de tres letras para aminoácidos como se define de conformidad con los estándares de IUPAC-IUB B descritos en Nucleic Acide Res. 13:3021-3030 (1985) y en Biochemical J. 219 (2):345-373 (1984) que se incorporan en la presente descripción como referencia. Los símbolos y el formato que se usan para los datos de -las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos cumplen con las reglas que se describen en el Título 37 del C.F.R. , §1.822.

La Tabla 1 enumera ciertos polipéptidos que se describen en la presente invención, la designación de los clones de ADNc que comprenden los fragmentos de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos que representan todos estos polipéptidos o una parte sustancial de éstos y el identificador correspondiente (sec. con núm. de ident.:), tal como se usa en el listado de secuencias adjunto.

Tabla 1 Polipéptidos que contienen el dominio SNF2 Proteína que Eragrostis contiene el N/A 35 36 nindensis dominio SNF2 Proteína que Paspalum contiene el N/A 37 38 notatum dominio SNF2 La sec . con núm. de ident . : 1 es la secuencia de nucleótidos del vector de rotulación de la activación de HSbarENDs2 (Fig. 1) .

La sec. con núm. de ident. : 2 es la secuencia de nucleótidos del constructo pDONR™ Zeo (Fig. 2) .

La sec. con núm. de ident. : 3 es la secuencia de nucleótidos del constructo pDONR™221 (Fig. 3) .

La sec. con núm. de ident. : 4 es la secuencia de nucleótidos del vector pBC-amarillo (Fig. 4) .

La sec. con núm. de ident. : 5 es la secuencia de nucleótidos del vector PHP27840 (Fig. 5) .

La sec. con núm. de ident. : 6 es la secuencia de nucleótidos del vector objetivo PHP23236 (Fig. 6) .

La sec. con núm. de ident. : 7 es la secuencia de nucleótidos del vector PHP10523 (Fig. 7) .

La sec. con núm. de ident. : 8 es la secuencia de nucleótidos del vector PHP23235 (Fig. 8) .

La sec. con núm. de ident. : 9 es la secuencia de nucleótidos del vector PHP20234 (Fig. 9) .

La sec. con núm. de ident. : 10 es la secuencia de nucleótidos del vector objetivo PHP22655 (Fig. 10) .

La sec. con núm. de ident . : 11 es la secuencia de nucleótidos del policonector que se usa para sustituir él sitio de restricción Pací en la posición 5775 del pHSbarE Ds2.

La sec. con núm. de ident.: -12 es la secuencia de nucleótidos de la secuencia de attBl .

La sec. con núm. de ident. : 13 es la secuencia de nucleótidos de la secuencia de attB2.

La sec. con núm. de ident. : 14 es la secuencia de nucleótidos del clon de entrada PHP23112.

La sec. con núm. de ident.: 15 es la secuencia de nucleótidos del vector PHP29634 (Fig. 11).

La sec. con núm. de ident. : 16 es el cebador directo VC062.

La sec. con núm. de ident.: 17 es el cebador inverso VC063.

Secs . con núm. de ident.: 18-23 (véase la Tabla 1) .

La sec. con núm. de ident. : 24 es la secuencia de nucleótidos del gen que codifica la proteína que contiene el dominio SNF de Arabidopsis thaliana, variante 1 (SNF2.1) (Atlg61140.1 ; núm. general de identificación del NCBI 186492169) .

La sec. con núm. de ident.: 25 es la secuencia de aminoácidos de la proteína que contiene el dominio SNF de Arabidopsis thaliana, variante 1 (mencionado en la presente invención como SNF2.1) (Atlg61140.1 ; núm. general de identificación del NCBI 186492170) .

La sec. con núm. de ident . : 26 es la secuencia de nucleótidos del gen que codifica la proteína que contiene el dominio SNF de Arabidopsis thaliana, variante 2 (SNF2.2) (Atlg61140.2 ; núm. general de identificación del NCBI 186492171) .

La sec. con núm. de ident.: 27 es la secuencia de aminoácidos de la proteína que contiene el dominio SNF de Arabidopsis thaliana , variante 2 (mencionada en la presente descripción como SNF2.2) (Atlg61140.2 ; núm. general de identificación del NCBI 186492172) .

La sec. con núm. de ident. : 28 es la secuencia de nucleótidos del gen que codifica la proteína que contiene el dominio SNF de Arabidopsis thaliana, variante 3 (SNF2.3) (Atlg61140.3 ; núm. general de identificación del NCBI 186492174) .

La sec. con núm. de ident.: 29 es la secuencia de aminoácidos de la proteína que contiene el dominio SNF de Arabidopsis thaliana, variante 3 (mencionada en la presente descripción como SNF2.3) (Atlg61140.3 ; núm. general de identificación del NCBI 186492175) .

La sec. con núm. de ident. : 30 es la secuencia de aminoácidos de la proteína ATPasa putativa de Oryza sativa (núm. general de identificación del NCBI 53792213) .

La sec. con núm. de ident . : 31 es la secuencia de aminoácidos de la proteína hipotética Osl_28047 de Oryza sativa (núm. general de identificación del NCBI 218200575) .

La sec. con núm. de ident.: 32 es la secuencia de aminoácidos de la proteína de Oryza sativa (núm. general de identificación 90399293) .

La sec. con núm. de ident. : 33 es la secuencia de nucleótidos del cebador directo de attB Atlg61140.1-5 ' .

La sec. con núm. de ident. : 34 es la secuencia de nucleótidos del cebador inverso de attB Atlg61140.1-3 ' .

Secs. con núm. de ident. : 35-38 (véase la Tabla 1) .

La sec. con núm. de ident. : 39 es la secuencia de nucleótidos del gen Atlg61140.1 ( identificador del transcrito 47522 en el sitio web Phytozome) de Arabidopsis lyrata.

La sec. con núm. de ident. : 40 es la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por la sec. con núm. de ident . : 39.

La sec. con núm. de ident. : 41 es la secuencia de nucleótidos del gen AtlglllOO.l (identificador del transcrito 471244 en el sitio web Phytozome) de Arabidopsis lyrata.

La sec. con núm. de ident. : 42 es la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por la sec. con núm. de ident . : 41.

La sec. con núm. de ident. : 43 es la predicción de FGENESH de un gen de Zea mays que contiene el dominio SNF2 en el BAC c0566n04 público.

La sec. con núm. de ident . : 44 es la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por la sec. con núm. de ident . : 43.

La sec. con núm. de ident. : 45 es una versión editada manualmente de la sec. con núm. de ident. : 43 en la cual la sec. con núm. de ident.: 43 se alineó con secuencias de otras especies y se editó manualmente para eliminar los intrones putativos.

La sec. con núm. de ident. : 46 es la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por la sec. con núm. de ident . : 45.

La sec. con núm. de ident.: 47 es la secuencia de nucleótidos del locus Os01g57110.2 de Oryza sativa, una proteína que contiene el dominio N-terminal de la familia de SNF2.

La sec. con núm. de ident. : 48 es la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por la sec. con núm. de ident . : 49.

La sec. con núm. de ident.: 49 es la secuencia de aminoácidos de la proteína hipotética del sorgo bicolor (locus Sb03g036380 ; núm. GI del NCBI 242058897) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La descripción de cada referencia indicada en la presente se incorpora en la presente descripción como referencia en su totalidad.

Como se usa en la presente descripción y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno/una" y "el/la" incluyen la referencia del plural a menos que el contexto claramente indique lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "una planta" incluye una pluralidad de tales plantas, la referencia a "una célula" incluye una o más células y los equivalentes de éstas que conoce un experimentado en la técnica, etc.

Como se usan en la presente descripción: Los términos "monocot" y "planta monocotiledónea" se usan indistintamente en la presente descripción. Una monocot de la presente invención incluye las gramíneas.

Los términos "dicot" y "planta dicotiledónea" se usan indistintamente en la presente descripción. Una dicot de la presente invención incluye las familias siguientes: Brassicaceae , Leguminosae y Solanaceae.

Los términos "complemento completo" y "complemento de extensión completa" se usan indistintamente en la presente descripción, y se refieren a un complemento de una secuencia de nucleótidos determinada, en donde el complemento y la secuencia de nucleótidos consisten del mismo número de nucleótidos y son 100 % complementarios.

Un "característica" se refiere a una característica fisiológica, morfológica, bioquímica o física de una planta o del material o célula de una planta específica. En algunos casos, esta característica es visible a simple vista, tal como el tamaño . de la semilla o planta o se puede medir mediante técnicas bioquímicas, tal como la detección del contenido de · proteínas, almidón o aceite de la semilla u hojas o mediante observación de un proceso metabólico o fisiológico, por ejemplo, mediante la medición de la tolerancia a la privación de agua o concentraciones específicas de sal o azúcar o mediante la observación del nivel de expresión de uno o varios genes o mediante observaciones agrícolas, tales como la tolerancia al estrés osmótico o la producción.

La frase "condiciones de limitación de nitrógeno" se refiere a las condiciones en las cuales la cantidad de nitrógeno total disponible (por ejemplo, de nitratos, amoníaco u otras fuentes conocidas de nitrógeno) no es suficiente para sustentar el crecimiento y desarrollo óptimo de la planta. Una persona con experiencia en la técnica reconocería las condiciones en las cuales el nitrógeno disponible total es suficiente para sustentar el crecimiento y desarrollo óptimo de la planta. Una persona con experiencia en la técnica reconocería cuáles son las cantidades suficientes de nitrógeno disponible total y las características de los suelos, medios y fertilizantes adecuadas para proporcionar nitrógeno a las plantas. Las condiciones de limitación de nitrógeno variarán en función de diversos factores que incluyen, pero no se limitan a, las condiciones específicas de la planta y el ambiente.

La "característica agronómica" es un parámetro medible que incluye, pero no se limita a, verdor, producción, índice de crecimiento, biomasa, peso fresco en la maduración, peso seco en la maduración, producción de frutos, producción de semillas, contenido total de nitrógeno en la planta, contenido de nitrógeno en los frutos, contenido de nitrógeno en las semillas, contenido de nitrógeno en un tejido vegetativo, contenido de aminoácidos en la planta entera, contenido de aminoácidos libres en un tejido vegetativo, contenido de aminoácidos libres en los frutos, contenido de aminoácidos libres en las semillas, contenido total de proteínas en la planta, contenido de proteínas en los frutos, contenido de proteínas en las semillas, contenido de proteínas en un tejido vegetativo, tolerancia a la sequía, captación de nitrógeno, resistencia al encamado de raíz, índice de cosecha, encamado del tallo, altura de la planta, altura de las espigas, longitud de las espigas, tolerancia a la sal, vigor de las plántulas tempranas y afloramiento de las plántulas en condiciones de estrés causado por temperaturas bajas.

El aumento en la biomasa puede medirse, por ejemplo, como un aumento en la altura de la planta, área total de la hoja de la planta, peso fresco de la planta, peso seco de la planta o producción de la semilla de la planta, cuando se compara con las plantas de control .

La capacidad para aumentar la biomasa o el tamaño de una planta tendría varias aplicaciones comerciales importantes. Se podrían generar especies de cultivos que produzcan cultivares más grandes y generar una mayor producción, por ejemplo, de las plantas en las cuales la parte vegetativa de la planta es útil como alimento, biocombustibie o ambos.

El incremento en el tamaño de la hoja podría ser de especial interés. El aumento de la biomasa de la hoja se puede usar para aumentar la producción de productos farmacéuticos o industriales derivados de las plantas. Un aumento en la fotosíntesis total de la planta se obtiene, típicamente, por medio del aumento del área de la hoja de la planta. La capacidad fotosintética adicional se podría usar para aumentar la producción derivada de un tejido vegetal específico que incluye las hojas, raíces, frutos o semillas o para que la planta pueda crecer bajo una intensidad de luz menor o una intensidad de luz alta.

La modificación de la biomasa de otro tejido, tal como el tejido de la raíz, podría ser útil para mejorar la capacidad de la planta para crecer en condiciones ambientales rigurosas que incluyen la sequía o la privación de nutrientes, debido a que las raíces más largas podrían llegar con mayor facilidad al agua o a los nutrientes o captar agua o nutrientes .

Sería altamente deseable que algunas plantas ornamentales pudieran proporcionar variedades más grandes . En el caso de varias plantas que incluyen árboles frutales, árboles usados para la producción de madera o árboles y arbustos útiles como pantalla frente al viento o que tapan la visión, una altura mayor proporciona más beneficios en forma de una mayor producción o una mayor protección. "índice de cosecha" se refiere al peso del grano dividido por el peso total de la planta.

Los "dominios SNF2" se encuentran en proteínas de remodelación de la cromatina dependientes de ATP implicadas en el control transcripcional , la reparación del ADN y la recombinación. Contienen siete motivos de secuencia conservada encontrados en la superfamilia II de ADN/ARN helicasas.

Los genes que codifican proteínas que contienen el dominio SNF2 incluyen, pero no se limitan a, las tres variantes del locus del gen de Arabidopsis thaliana Atlg61140 (secs. con núm. de ident . : 24, 26 y 28) mencionadas en la presente como snf2.1, snf2.2 y snf2.3, respectivamente, y los nucleótidos homólogos de otras especies de plantas que incluyen, pero no se limitan a, Zea mays, Arabidopsis lyrata, Eragrostis nindensis (pasto Resurrection) , Paspalum notatum (Bahiagrass) y Oryza sativa (secs. con núm. de ident.: 18, 20, 22, 35, 37, 39, 41, 43, 45 y 47).

Las proteínas que contienen el dominio SNF2 incluyen, pero no se limitan a, las proteínas codificadas por las secs. con núm. de ident . : 24, 26 y 28 (y mencionadas en la presente invención como SNF2.1, SNF2.2 y SNF2.3 , respectivamente) y las proteínas homologas de otras especies de plantas que incluyen, pero no se limitan a, Zea mays, Arabidopsis lyrata, Eragrostis nindensis (pasto Resurrection) , Paspalum notatum (Bahiagrass) , Oryza sativa y sorgo bicolor (secs. con núm. de ident.: 19, 21, 23, 30, 31, 32, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 y 49).

Como se usa en la presente invención, "variantes de empalme" se refiere a formas alternativas de ARN transcripto de un gen. La variación de empalme se produce naturalmente como resultado del empalme de sitios alternativos dentro de una sola molécula de ARN transcrita o entre moléculas de ARN transcritas en forma separada, y podría producir varias formas diferentes de ARNm transcrito del mismo gen. En consecuencia, las variantes de empalme podrían codificar polipéptidos que tienen distintas secuencias de aminoácidos cuyas funciones en el organismo podrían no ser similares.

La "tolerancia al estrés de nitrógeno" es una característica de una planta y se refiere a la capacidad de la planta para sobrevivir en condiciones de limitación de nitrógeno .

La "mayor tolerancia al estrés de nitrógeno" de una planta se mide con respecto a una planta de control o referencia, y significa que la tolerancia al estrés de nitrógeno de la planta aumenta en cualquier cantidad o medida cuando se compara con la tolerancia al estrés de nitrógeno de la planta de control o referencia.

Una "planta tolerante al estrés de nitrógeno" es una planta que exhibe tolerancia al estrés de nitrógeno, Una planta tolerante al estrés de nitrógeno podría ser una planta que exhibe un aumento en por lo menos una característica agronómica con respecto a una planta de control en condiciones de limitación de nitrógeno.

"Condiciones ambientales" se refiere a las condiciones en las cuales se cultiva la planta, tales cómo la disponibilidad de agua, la disponibilidad de nutrientes (por ejemplo, nitrógeno) o la presencia de insectos o enfermedad.

"Transgénico" se refiere a cualquier célula, línea celular, callo, tejido, parte de la planta o planta, cuyo genoma se ha alterado mediante la presencia de un ácido nucleico heterólogo, tal como un constructo de ADN recombinante , que incluye los eventos transgénicos iniciales así como los creados mediante cruces sexuales o propagación asexual a partir del evento transgénico inicial. Como se usa en la presente, el término "transgénico" no abarca la alteración del genoma (cromosómico o extracromosómico) por métodos convencionales de cultivo de vegetales o por eventos de origen natural, tales como fertilización cruzada aleatoria, infección viral no recombinante, transformación bacterial no recombinante, transposición no recombinante o mutación espontánea.

El término "genoma" , como se aplica a las células vegetales, abarca no sólo el ADN cromosómico que se encuentra dentro del núcleo, sino también el ADN del organelo que se encuentra en los componentes subcelulares (por ejemplo, mitocondrial , plástido) de la célula.

"Planta" incluye lo referente a plantas completas, órganos de plantas, tejidos de plantas, semillas, células vegetales y progenie de éstas. Las células vegetales incluyen, sin limitación, células de semillas, cultivos en suspensión, embriones, regiones meristemáticas , tejido calloso, hojas, raíces, brotes, gametofitos, esporofitos, polen y microsporas .

"Progenie" comprende cualquier generación subsiguiente de una planta.

"Planta transgénica" incluye lo referente a una planta que comprende en su genoma un polinucleótido heterologo. Por ejemplo, el polinucleótido heterologo está integrado de manera estable dentro del genoma de manera tal que el polinucleótido se transmita a generaciones sucesivas. El polinucleótido heterologo puede estar integrado en el genoma solo o como parte de un constructo dé ADN recombinante .

"Heteróloga" , con respecto a una secuencia, se refiere a una secuencia que se origina de una especie foránea o de la misma especie, se modifica sustancialmente de su forma natural en composición y/o locus genómico por intervención humana intencional.

Los términos "polinucleótido" , "secuencia de ácido nucleico", "secuencia nucleótida" o "fragmento de ácido nucleico" se usan indistintamente y se refieren a un polímero de ARN o ADN mono o bicatenario que contiene, opcionalmente , bases de nucleótidos sintéticas, no naturales o alteradas. Se hace referencia a los nucleótidos (que se encuentran usualmente en su forma 51 -monofosfato) por su designación con una única letra de la siguiente manera: "A" para adenilato o desoxiadenilato (para ARN o ADN respectivamente) , "C" para citidilato o desoxicitidilato , "G" para guanilato o desoxiguanilato , "U" para uridilato, "T" para desoxitimidilato, "R" para las purinas (A o G) , "Y" para las pirimidinas (C o T) , "K" para G o T, "H" para A, C o T, "I" para adenosina, y "N" para cualquier nucleótido.

Los términos "polipéptido" , "péptido" , "secuencia de aminoácidos" y "proteína" se usan indistintamente en la presente descripción y se refieren a un polímero de residuos de aminoácido. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en donde uno o más residuos de aminoácidos es o son un análogo químico artificial de un aminoácido correspondiente de origen natural, así como polímeros de aminoácidos de origen natural. Los términos "polipéptido", "péptido" , "secuencia de aminoácidos" y "proteína" también son inclusivos de modificaciones que incluyen, pero no se limitan a, glicosilación, unión lipídica, sulfación, gamacarboxilación de residuos de ácido glutámico, hidroxilación y ribosilación del ADP .

"ARN mensajero (ARNm) " se refiere al AR que no tiene intrones y que la célula puede traducir en proteína.

"ADNc" se refiere a un ADN complementario a y sintetizado a partir de un molde de ARNm con el uso de la enzima transcriptasa inversa. El ADNc puede ser monocatenario o se puede convertir a la forma bicatenaria con el uso del fragmento Klenow de la ADN polimerasa I.

Una "etiqueta de secuencia expresada" ("EST", por sus siglas en inglés) es una secuencia de ADN derivada de una genoteca de ADNc y, por lo tanto, es una secuencia que ha sido transcrita. Una EST se obtiene, típicamente, mediante un paso de secuenciamiento único de un inserto de ADNc. La secuencia de todo el inserto de ADNc se denomina "secuencia de inserto completo" ("FIS", por sus siglas en inglés). Una secuencia de "cóntigos" es una secuencia integrada de dos o más secuencias que se pueden seleccionar de, pero no se limitan a, el grupo que consiste en una EST, una FIS y una secuencia de PCR. Una secuencia que codifica una proteína entera o funcional se denomina "secuencia completa de genes" ("CGS", por sus siglas en inglés) y puede derivarse de una FIS o un contigo.

Proteína "madura" se refiere a un polipéptido procesado después de la transición; es decir, del cual se ha eliminado cualquier pre o propéptido presente en el producto de traducción primario.

Proteína "precursora" se refiere al producto primario de traducción del A Nm; es decir, cuando los pre y propéptidos aún están presentes. Los pre y propéptidos pueden ser, pero no se limitan a, señales intracelulares de localización.

"Aislados" se refiere a materiales tales como moléculas de ácidos nucleicos y/o proteínas sustancialmente libres o eliminados de algún modo de los componentes que normalmente acompañan o interactúan con los materiales en un ambiente de origen natural. Los polinucleótidos aislados se pueden purificar a partir de una célula huésped en donde se originan naturalmente. Se puede usar métodos convencionales de purificación de ácidos nucleicos conocidos para los expertos para obtener polinucleótidos aislados. El término también abarca polinucleótidos recombinantes y polinucleótidos sintetizados químicamente.

"Recombinante" se refiere a una combinación artificial de dos segmentos de una secuencia separados de alguna manera, por ejemplo, por síntesis química o manipulación de segmentos aislados de ácidos nucleicos mediante técnicas de ingeniería genética. "Recombinante" también incluye lo referente a una célula o vector que ha sido modificado mediante la introducción de un ácido nucleico heterólogo o una célula derivada de una célula ya modificada, pero no abarca la alteración de la célula o vector mediante eventos de origen natural (por ejemplo, mutación espontánea, transformación/transducción/transposición natural) tales como los ocurridos sin intervención humana intencional.

"Constructo de ADN recombinante" se refiere a una combinación de fragmentos de ácidos nucleicos que, normalmente, no se encuentran juntos en la naturaleza. Por lo tanto, un constructo de ADN recombinante puede comprender secuencias reguladoras y secuencias codificantes derivadas de diferentes fuentes, o secuencias reguladoras y secuencias codificantes derivadas de la misma fuente, pero dispuestas de una manera diferente a como se encuentran en la naturaleza.

Los términos "clon de entrada" y "vector de entrada" se usan indistintamente en la presente descripción.

"Secuencias reguladoras" y "elementos reguladores" se usan indistintamente y se refieren a secuencias de nucleótidos ubicadas corriente arriba (secuencias 5' no codificantes), dentro o corriente abajo (secuencias 3' no codificantes) de una secuencia codificante, y que influyen en la transcripción, el procesamiento o la estabilidad del ARN o la traducción de la secuencia codificante asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir, pero no se limitan a, promotores, secuencias líderes de traducción, intrones y secuencias de reconocimiento de poliadenilación .

"Promotor" se refiere a un fragmento de ácido nucleico con la capacidad de controlar la transcripción de otro fragmento de ácido nucleico.

"Promotor funcional en una planta" es un promotor con la capacidad de controlar la transcripción en las células vegetales, se origine o no de una célula vegetal.

Los términos "promotor específico para el tejido" y "promotor preferido para el tejido" se usan indistintamente para referirse a un promotor que se expresa predominantemente, pero no necesariamente, exclusivamente en un tejido u órgano, pero que se podría expresar, además, en una célula específica.

"Promotor regulado por el desarrollo" se refiere a un promotor cuya actividad está determinada por los eventos del desarrollo.

"Unido operacionalmente" se refiere a la asociación de fragmentos de ácido nucleico en un solo fragmento de modo que la función de uno es regulada por la función del otro. Por ejemplo, un promotor está operacionalmente unido con un fragmento de ácido nucleico cuando puede regular la transcripción de ese fragmento de ácido nucleico.

La "expresión" se refiere a la producción de un producto funcional. Por ejemplo, la expresión de un fragmento de ácido nucleico se puede referir a la transcripción del fragmento de ácido nucleico (por ejemplo, la transcripción resultante en ARNm o AR funcional) y/o la traducción de ARNm en una proteína precursora o madura.

"Fenotipo" se refiere a las características perceptibles de una célula u organismo.

"Introducido", en el contexto de insertar un fragmento de ácido nucleico (por ejemplo, un constructo de ADN recombinante) en una célula, significa "transíección" , "transformación" o "transducción" e incluye la referencia a la incorporación de un fragmento de ácido nucleico en una célula eucariótica o procariótica , en donde el fragmento de ácido nucleico se puede incorporar en el genoma de la célula (por ejemplo, ADN cromosómico, plasmídico, plástido o mitocondrial ) , convertido en un replicón autónomo o expresado transitoriamente (por ejemplo, ARNm transíectado) .

Una "célula transformada" es cualquier célula en la cual se ha introducido un fragmento de ácido nucleico (por ejemplo, un constructo de ADN recombinante) .

"Transformación" , como se usa en la presente descripción, se refiere tanto a la transformación estable como a la transitoria.

"Transformación estable" se refiere a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico a un genoma de un organismo huésped que produce una herencia genéticamente estable. Una vez transformado de manera estable, el fragmento de ácido nucleico se integra establemente en el genoma del organismo huésped y cualquier generación posterior.

"Transformación transitoria" se refiere a la introducción de un fragmento de ácido nucleico en el núcleo, u orgánulo que contiene ADN, de un organismo huésped que resulta en una expresión genética sin herencia genéticamente estable.

.El "alelo" es una de las varias formas alternativas de un gen que ocupa un locus determinado en un cromosoma. Cuando los alelos presentes en un locus dado en un par de cromosomas homólogos en una planta diploide son iguales, esa planta es homocigota para ese locus. Si los alelos presentes en un locus dado en uno de un par de cromosomas homólogos en una planta diploide difieren, esa planta es heterocigota para ese locus. Si un . transgén está presente en uno de un par de cromosomas homólogos en una planta diploide, esa planta es hemicigota para ese locus.

Un "péptido de tránsito al cloroplasto" es una secuencia de aminoácidos que se traduce junto con una proteína y dirige la proteína al cloroplasto u otros tipos de plástidos presentes en la célula en la cual se elabora la próteína. "Secuencia de tránsito al cloroplasto" se refiere a una secuencia nucleótida que codifica un péptido de tránsito al cloroplasto. Un "péptido de señal" es una secuencia de aminoácidos que se traduce junto con una proteína y dirige la proteína al sistema secretor (Chrispeels (1991) Ann. Rev. Plant Phys . Plant Mol. Biol . 42:21-53). Si la proteína se dirigirá a una vacuola, también se puede añadir una señal de dirección vacuolar (más arriba) , y si se dirigirá al retículo endoplásmico, se puede añadir una señal de retención del retículo endoplásmico (más arriba) . Si la proteína se dirigirá al núcleo, cualquier péptido señal presente se debe eliminar -e incluir en su lugar una señal de localización nuclear (Raikhel (1992) Plant Phys . 100:1627-1632). Un "péptido de señal mitocondrial" es una secuencia de aminoácidos que dirige una proteína precursora a la mitocondria (Zhang y Glaser (2002) Trends Plant Sci 7:14-21) .

Los cálculos de alineamientos de secuencias y porcentajes de identidad se puede determinar por medio del uso de una variedad de métodos de comparación diseñados para detectar secuencias homologas, que incluyen, pero no se limitan a, el programa MEGALIGN® del paquete bioinformático LASÉRGENE® (DNASTAR® Inc., Madison, WI) . A menos que se indique de otra manera, se realizaron múltiples alineamientos de las secuencias proporcionadas en la presente descripción con el uso del método de alineamiento Clustal V (Higgins y Sharp, CABIOS. 5:151-153 (1989)) con los parámetros predeterminados (PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN=10 , PENALIZACIÓN DE LONGITUD DE INTERRUPCIÓN=10 ) . Los parámetros predeterminados para alineamientos en pares y cálculo del porcentaje de identidad de las secuencias de proteínas con el uso del método Clustal V son KTUPLE=1, PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN=3 , VENTANA=5 y DIAGONALES GUARDADAS=5. En el caso de los ácidos nucleicos, estos parámetros son KTUPLE=2 , PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN5 , VENTANA=4 y DIAGONALES GUARDADAS=4. Después del alineamiento de las secuencias con el programa Clustal V se pueden obtener valores de "porcentaje de identidad" y "divergencia" mediante la observación -de la tabla de "distancias de secuencias" en el mismo programa; a menos que se especifique de cualquier otra forma, los porcentajes de identidad y las divergencias que se proporcionan y reivindican en la presente invención se calcularon de esta manera.

Las técnicas estándar de clonación molecular y de ADN recombinante usadas en la presente son muy conocidas en la técnica y se describen con mayor detalle en Sambrook, J. , Fritsch, E.F. and Maniatis, G. Molecular Cloning : A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989 (de aquí en adelante, "Sambrook") .

Ahora, en cuanto a las modalidades: Las modalidades incluyen polinucleótidos y polipéptidos aislados, constructos de ADN recombinante, composiciones (tales como plantas o semillas) que comprenden los constructos de ADN recombinante y métodos que usan estos constructos de ADN recombinante.

Polinucleótidos y polipéptidos aislados La presente invención incluye los siguientes polinucleótidos y polipéptidos aislados: Un polinucleótido aislado que comprende: (i) una secuencia ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de al menos 50 %, 51 52 53 54 %, 55 56 57 58 59 60 %, 61 62 63 64 %, 65 %, 66 67 68 69 70 %, 71 72 73 74 %, 75 76 7 78 79 80 %, 81 82 83 84 %, 85 86 87 88 89 90 %, 91 92 93 94 %, 95 96 97 98 99 o 100 % de identidad de secuencia, basada en el método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec . con núm. de ident . : 19, 21, 23, 36, 38 o 46; o (ii) un complemento completo de la secuencia de ácido nucleico de (i) , en donde el complemento completo y la secuencia de ácido nucleico de (i) consisten del mismo número de nucleótidos y son 100 % complementarios. Cualquiera de los polinucleótidos aislados mencionados anteriormente se puede usar en cualquier constructo de ADN recombinante (incluso las constructos de ADN supresor) de la presente invención. El polipéptido es una proteína que contiene el dominio SNF2.

Un polipéptido aislado que tiene una secuencia de aminoácidos de al menos 50 51 52 53. 54 55 % 56 %, 57 58 59 60 61 62 63 64 65 % 66 %, 67 68 69 70 71 72 73 74 75 % 76 %, 77 78 79 80 81 82 83 84 85 % 86 %, 87 88 89 90 91 92 93 94 95 % 96 %, 97 98 99 o 100 de identidad de secuencia basada en el método de alineamiento Clustal V, cuando compara con la sec . con núm. de ident . : 19, 21, 23, 36, 38 o 46. El polipéptido es una proteína que contiene el dominio SNF2. polinucleótido aislado que comprende (i) una secuencia de ácido nucleico de al menos 50 51 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 57 % , 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 % , 68 % , 69 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 % , 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 86 87 % , 88 %, 89 90 %, 91 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % O 100 o de identidad de secuencia, basada en el método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec. con núm. de ident. : 18, 20, 22, 35, 37 o 45; o (ii) un complemento completo de la secuencia de ácido nucleico de (i) . Cualquiera de los polinucleótidos aislados mencionados anteriormente se puede usar en cualquier constructo de ADN recombinante (incluso las constructos de ADN supresor) de la presente invención. El polinucleótido aislado codifica una proteína que contiene el dominio SNF . Constructos de ADN recombinante y constructos de ADN supresor En un aspecto, la presente invención incluye constructos de ADN recombinante (incluso constructos de ADN supresor) .

En una modalidad un constructo de ADN recombinante comprende un polinucleótido unido operacionalmente a por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) , en donde el polinucleótido comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de al menos %, %, %, %, %, %, %, %, %, %, %, %, %, %, %, %, ° ( "° %, o % de identidad de secuencia basada en el método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec. con núm. de ident . o o (ii) un complemento completo de la secuencia de ácido nucleico dé (i) .

En otra modalidad un constructo de ADN recombinante comprende un polinucleótido unido operacionalmente a por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) , en donde ese polinucleótido comprende (i) una secuencia de ácido nucleico de al menos %, %, %, "5 %, %, %, %, %, % %, %, %, %, "5 "S / %, %, %, %, % %, %, % de identidad de secuencia, basada en el método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec. con núm. de ident.: o o (ii) un complemento completo de la secuencia de ácido nucleico de (i) .

En otra modalidad un constructo de ADN recombinante comprende un polinucleótido unido operacionalmente a por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) , en donde ese polinucleótido codifica una proteína que contiene, el dominio SNF2.

En otro aspecto la presente invención incluye constructos de ADN supresor.

Un constructo de ADN supresor puede comprender por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) unida operacionalmente a (a) todo o parte de: (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de al menos 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 55 %, 56 %, 57 %, 58 59 %, 60 , 61 %, 62 %, 63 %, 64 65 ¾ f 66 %, 67 %, 68 69 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 0, %, 81 "5 , 82 o 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 o. 89 %, 90 "o , 91 92 93 o ; 94 ¾ í 95 ·¾ , 96 •o , 97 98 % 99 % o 100 % de identidad de secuencia, basada en el método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec . con núm. de ident.: 19, 21, 23, 25, 27, 29, 30, 31, 32, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 o 49; o (ii) un complemento completo de la secuencia de ácido nucleico de (a) (i); o (b) una región derivada de todo o parte de un secuenciador o hebra no codificante de un gen objetivo de interés; esa región tiene una secuencia de ácido nucleico de al menos 50 %, 51 %, 52 %, 53 g, o, %, 54 %, 55 ° / 56 0 f 57 %, 58 % , 59 o / 60 %, 61 %, 62 %, Í 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 *^ ( 72 %, 73 *S f 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 % 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 *° / 85 %, 86 %, 87 %, 88 % 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 0 / 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia, basada en el método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la todo o parte de un secuenciador o hebra no codificante de donde se deriva esa región, y en donde ese gen objetivo de interés codifica una proteína que contiene el dominio SNF2 ; o (c) todo o parte de: (i) una secuencia d< ácido nucleico de al menos 50 % , 51 % , 52 %, 53 %, 54 9- 1 ¾ / 55 % 56 %, 57 o , 58 "o / 59 %, 60 61 o / 62 o / 63 o / 64 ¾ / 65 % 66 %, 67 % , 68 %, 69 %, 70 o / 71 ¦¾ / 72 o, ¾ / 73 %, 74 %, 75 % 76 %, 77 , 78 79 %, 80 81 o, ° / 82 ° / 83 %, 84 85 % 86 %, 87 o, o , 88 %, 89 %, 90 o / 91 %, 92 %, 93 %, 94 95 % 96 %, 97 o, , 98 "o , 99 % o 100 % de identidad de secuencia basada en el método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec . con núm. de ident . : 18, 20, 22, 24, 26, 28, 35, 37, 39, 41, 43, 45 o 47; o (ii) un complemento completo de la secuencia de ácido nucleico de (c) (i) . El constructo de ADN supresor podría comprender un constructo cosupresor, constructo no codificante, constructo supresor de virus, constructo supresor de horquillas, constructo supresor de tallo-lazo, constructo productor de AR bicatenario, constructo de iARN o constructo de ARN pequeño (por ejemplo, un constructo de ARNip o un constructo de miARN) .

Se entiende, tal como apreciarán aquellos con experiencia en la técnica, que la invención abarca otras secuencias además de las secuencias ilustrativas específicas. En la técnica se conocen bien las alteraciones de un fragmento -de ácido nucleico que resultan en la producción de un aminoácido químicamente equivalente en un sitio dado pero que no afectan la propiedades funcionales del polipéptido codificado. Por ejemplo, un codón para el aminoácido alanina, un aminoácido hidrofóbico, puede ser sustituido por un codón que codifica otro residuo menos hidrofóbico, tal como la glicina, o un residuo más hidrofóbico, tal como la valina, la leucina o la isoleucina. De modo similar, también se puede esperar cambios que resultan en la sustitución de un residuo cargado negativamente por otro, tal como ácido aspártico para ácido glutámico, o un residuo cargado positivamente por otro, tal como lisina por arginina, para producir un producto funcionalmente equivalente. Además, no se espera cambios de nucleótidos que resultan en la alteración de las porciones N-terminal y C-terminal de la molécula de polipéptido para alterar la actividad del polipéptido. Cada una de las modificaciones propuestas permanece dentro de la rutina de la técnica, como lo hace la determinación de la retención de la actividad biológica de los productos codificados.

"Constructo de ADN supresor" es un constructo de ADN recombinante que al transformarse o integrarse de manera estable en el genoma de la planta produce el "silenciamiento" de un gen objetivo en la planta. El gen objetivo puede ser endógeno o transgénico a la planta. "Silenciamiento" , como se usa en la presente descripción con respecto al gen objetivo, se refiere, generalmente, a los niveles de supresión del ARNm o proteína/enzima expresada por el gen objetivo y/o el nivel de la actividad enzimática o de la funcionalidad proteica. Los términos "supresión", "suprimir" y "silenciamiento", usados indistintamente en la presente invención, incluyen: bajar, reducir, decaer, disminuir, inhibir, eliminar o evitar. "Silenciamiento" o "silenciamiento génico" no especifica el mecanismo y es inclusivo y no se limita a no codificación, cosupresión, supresión viral, supresión de horquillas, supresión de tallo-lazo, aproximaciones basadas en iARN y métodos basados en ARN pequeños.

Un constructo de ADN supresor puede comprender una región derivada de un gen objetivo de interés y puede comprender total o parcialmente la secuencia de ácido nucleico del secuenciador (o hebra no codificante) del gen objetivo de interés. Según la aproximación que se use, la región podría ser 100 % idéntica o menor que 100 %· idéntic. (por ejemplo, por lo menos 50 % 51 %, 52 %, 53 54 % 55 % , 56 % , 57 % , 58 %, 59 %, 60 61 %, 62 %, 63 64 % 65 % , 66 % , 67 % , 68 %, 69 %, 70 71 %, 72 %, 73 74 % 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 % 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica) a todo o parte del secuenciador (o hebra no codificante) del gen de interés .

Los constructos de ADN supresor se conocen bien en la técnica, se construyen fácilmente una vez se seleccione el gen objetivo de interés e incluyen, pero no se limitan a, constructos cosupresores , constructos no codificantes, constructos de supresión viral, constructos supresores de horquilla, constructos supresores de tallo-lazo, constructos productores de ARN bicatenario y, más generalmente, constructos de iARN (ARN de interferencia) y constructos de ARN pequeños tales como constructos de ARNip (ARN de interferencia corta) y constructos de miARN (microARN) .

"Inhibición no codificante" se refiere a la producción de transcritos de ARN no codificante con la capacidad de suprimir la expresión del gen o producto génico objetivo. "ARN no codificante" se refiere a un transcrito de ARN complementario a todo o a una parte de un transcrito primario o ARNm objetivo y que bloquea la expresión de un fragmento aislado de ácido nucleico objetivo (patente de los Estados Unidos núm. 5,107,065). La complementariedad de un ARN no codificante puede ser con cualquier porción del transcrito genético específico, es decir, en la secuencia 5' no codificante, secuencia 3' no codificante, intrones o secuencia codificante.

"Cosupresión" se refiere a la producción de transcritos de ARN efector con la capacidad de suprimir la expresión del gen o producto génico objetivo. ARN "efector" se refiere al transcrito de ARN que incluye el ARNm y que se puede traducir en proteína dentro de una célula o in vitro. Anteriormente se han diseñado constructos cosupresores en plantas basados en la sobreexpresión de una secuencia de ácido nucleico con homología a un ARNm nativo, en la orientación codificante, que producen la reducción de todo el ARN con homología a la secuencia sobreexpresada (véase Vaucheret et al . , Plant J. 16:651-659 (1998); y Gura, Nature 404 : 804-808 (2000)).

Otra variación describe el uso de secuencias virales en plantas para dirigir la supresión de secuencias proximales que codifican el ARNm (publicación del PCT núm. WO 98/36083 publicada el 20 de agosto de 1998) .

El ARN de interferencia se refiere al proceso de silenciamiento génico postranscripcional específico de la secuencia en animales mediado por ARN pequeños de interferencia (ARNip) (Fire et al., Nature 391:806 (1998)). El proceso correspondiente en plantas se denomina, comúnmente, silenciamiento génico postranscripcional (SGPT) o silenciamiento de ARN, así como represión en hongos. Se cree que el proceso de silenciamiento génico postranscripcional es un mecanismo de defensa de células conservadas evoluti amente para prevenir la expresión de genes extraños, y es común en diversas especies de la flora ? y filos (Fire et al., Trends Genet . 15:358 (1999)).

Los ARN pequeños juegan un papel importante en el control de la expresión genética. La regulación de varios procesos del desarrollo, que incluyen la floración, está controlada por ARN pequeños. Ahora es posible crear cambios en la expresión genética de los genes vegetales mediante el uso de constructos transgénicos que producen ARN pequeños en la planta.

Al parecer, los ARN pequeños funcionan por apareamiento de bases con ARN complementario o con secuencias objetivo de ADN. Al unirse con ARN, los ARN pequeños accionan ya sea el clivaje del ARN o la inhibición de traducción de la secuencia objetivo. Al unirse con secuencias objetivo de ADN, se piensa que los ARN pequeños pueden mediar la metilación de ADN de la secuencia objetivo. La consecuencia de estos eventos, independientemente del mecanismo específico, es que la expresión genética se inhibe.

Los microARN (miARN) son ARN no codificantes de aproximadamente 19 a aproximadamente 24 nucleótidos (nt) de longitud que se han identificado tanto en animales como en vegetales (Lagos-Quintana et al., Science 294:853-858 (2001), Lagos-Quintana et al., Curr. Biol . 12:735-739 (2002); Lau et al., Science 294:858-862 (2001); Lee y Ambros, Science 294:862-864 (2001); Llave et al., Plant Cell 14:1605-1619 (2002); Mourelatos et al., Genes. Dev. 16:720-728 (2002); Park et al., Curr. Biol. 12:1484-1495 (2002); Reinhárt et al., Genes. Dev. 16:1616-1626 (2002)). Estos se procesan a partir de transcritos precursores más largos que en tamaño se encuentran en el intervalo desde aproximadamente 70 hasta 200 nt y estos transcritos precursores tienen la capacidad de formar estructuras de horquilla estables.

Los microARN (miARN) parecen regular genes objetivo al unirse a las secuencias complementarias ubicadas en los transcritos producidos por estos genes. Parece posible que los miARN puedan entrar en al menos dos rutas de regulación del gen objetivo: (1) inhibición de la traducción; y (2) elivaje de ARN. Los microARN que entran en la ruta de elivaje del ARN son análogos a los ARN interferentes pequeños (ARNip) de 21-25 nt generados durante la interferencia por ARN (iARN) en los animales y el silenciamiento génico postranscripcional (PTGS, por sus siglas en inglés) en los vegetales, y es probable que se incorporen en un complejo silenciador inducido por ARN (RISC, por sus siglas en inglés) que sea similar o idéntico al observado para iARN.

Secuencias reguladoras: Un constructo de ADN recombinante (incluso un constructo de ADN supresor) de la presente invención podría comprender por lo menos una secuencia reguladora.

Una secuencia reguladora podría ser un promotor.

Se puede usar una gran variedad de promotores en los constructos de ADN recombinante (y los constructos de ADN supresor) de la presente invención. Los promotores se pueden seleccionar en función del resultado deseado y podrían incluir los promotores constitutivos, específicos del tejido, inducibles u otros promotores para la expresión en el organismo huésped.

Los promotores que hacen que un gen se exprese en la mayoría de tipos de células, la mayoría de veces se denominan comúnmente "promotores constitutivos" .

La expresión constitutiva de alto nivel del gen candidato controlado por el promotor 35S o UBI podría tener (o no tener) efectos pleiotrópicos , aunque la eficacia del gen candidato se podría determinar cuando lo acciona un promotor constitutivo. El uso de promotores específicos para el tejido y/o el estrés podría eliminar los efectos no deseados, pero retener la capacidad de mejorar la tolerancia de nitrógeno. Este tipo de efecto se ha observado en Arabidopsis con respecto a la tolerancia a la sequía y al frío (Kasuga et al., Nature Biotechnol . 17:287-91 (1999)).

Los promotores constitutivos adecuados para usar en una célula de la planta huésped incluyen, por ejemplo, el promotor mínimo del promotor Rsyn7 y otros promotores constitutivos descritos en la patente núm. WO 99/43838 y en la patente de los Estados Unidos núm. 6,072,050; el- promotor mínimo CáMV 35S (Odell et al., Nature 313:810-812 (1985)); actina de arroz (McElroy et al., Plant Cell 2:163-171 (1990)); ubiquitina (Christensen et al., Plant Mol. Biol . 12:619-632 (1989) y Christensen et al . , Plant Mol. Biol. 18:675-689 (1992)); pEMU (Last et al., Theor. Appl . Genet . 81:581-588 (1991)); MAS (Velten et al . , EMBO J. 3:2723-2730 (1984)); promotor ALS (patente de los Estados Unidos núm. 5,659,026) y similares. Otros promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, los mencionados en las patentes de los Estados Unidos núms . 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; 5,608,142 y 6,177,611.

Al seleccionar un promotor para su uso en los métodos de la invención, puede que se prefiera un promotor específico para el tejido o regulado por el desarrollo.

Un promotor específico para el tejido o regulado por el desarrollo es una secuencia de ADN que regula la expresión de una secuencia de ADN selectivamente en las células/tejidos de una planta, crítico para el desarrollo de la panoja, las semillas o ambos y limita la expresión de la secuencia de ADN al período de desarrollo de la panoja o a la maduración de las semillas en la planta. En los métodos de la presente invención se puede usar cualquier promotor identificable que cause la expresión temporal y espacial deseada.

Los promotores específicos de las semillas o embriones y que podrían ser útiles en la invención incluyen el inhibidor de tripsina Kunitz del frijol de soya (Kti3, Jofuku y Goldberg, Plant Cell 1:1079-1093 (1989)), patatina (tubérculos de papa) (Rocha-Sosa, M. ,' et al. (1989) EMBO J. 8:23-29 (1989)), convicilina, vicilina y legumina (cotiledones de chícharos) (Rerie, .G., et al., Mol. Gen. Genet . 259:149-157 (1991); Newbigin, E.J., et al., Planta 180:461-470 (1990); Higgins, T.J.V., et al., Plant . Mol. Biol . 11:683-695 (1988)), zeína (endosperma del maíz) (Schemthaner, J.P., et al., EMBO J. 7:1249-1255 (1988)), faseolina (cotiledón del frijol) (Segupta-Gopalan, C, et al., Proc . Nati. Acad. Sci. U.S. A. 82:3320-3324 (1995) ) , fitohemaglutinina (cotiledón del frijol) (Voelker, T. et al., EMBO J. 6:3571-3577 (1987)), B-conglicinina y glicinina (cotiledón del frijol de soya) (Chen, Z-L, et al., EMBO J. 7:297-302 (1988)), glutelina (endosperma de arroz), hordeína (endosperma de cebada) (Marris, C, et al., Plant Mol. Biol. 10:359-366 (1988)), glutenina y gliadina (endosperma de trigo) (Colot, V., et al., EMBO J. 6:3559-3564 (1987)) y esporamina (raíz tuberosa del camote) (Hattori, T. , et al., Plant Mol. Biol. 14:595-604 (1990)). Los promotores de genes específicos de semillas unidos operacionalmente a regiones codificantes heterólogas en constructos de genes quiméricos mantienen su estructura de expresión temporal y espacial en las plantas transgénicas . Tales ejemplos incluyen al promotor génico de la proteína de almacenamiento de semilla 2S de Arabidopsis thaliana para expresar péptidos de encefalina en semillas de Arabidopsis y Brassica napus (Vanderkerckhove et al., Bio/Technology 7: L929-932 (1989)), promotores de lectina de frijol y beta-faseolina de frijol para expresar luciferasa (Riggs et al., Plant Sci. 63:47-57 (1989)) y promotores de glutenina de trigo para expresar cloranfenicol acetiltransferasa (Colot et al., EMBO J. 6:3559- 3564 (Í987)) .

Los promotores inducibles expresan selectivamente una secuencia de ADN operacionalmente unida en respuesta de un estímulo endógeno o exógeno, por ejemplo, por compuestos químicos (inductores químicos) o en respuesta de señales ambientales, hormonales, químicas y/o del desarrollo. Los promotores inducibles o regulados incluyen, por ejemplo, los promotores regulados por luz, calor, estrés, inundación o sequía, f itohormonas , lesiones, o sustancias químicas, tales como etanol, jasmonato, ácido salicílico o sustancias protectoras .

Los promotores para usar en la presente invención incluyen los siguientes: 1) el promotor RD29A inducible por estrés (Kasuga et al., Nature Biotechnol . 17:287-91 (1999)); 2) el promotor de cebada, B22E; la expresión de B22E es específica para el pedicelo en granos de maíz en desarrollo ("Primary Structure of a Novel Barley Gene Differentially Expressed in Immature Aleurone Layers" , Klemsdal et al., Mol. Gen. Genet . 228 (1/2) : 9-16 (1991)); y 3) el promotor del maíz, Zag2 ("Identification and molecular characterization of ZAG1, the maize homolog of the Arabidopsis floral homeotic gene AGAMOUS" , Schmidt et al., Plant Cell 5(7) :729-737 (1993); "Structural characterization, chromosomal localization and phylogenetic evaluation of two pairs of AGAMOUS- like MADS-box genes f om maize", Theissen et al., Gene 156 (2) : 155-166 (1995); número de registro del GenBank del NCBI X80206) ) . Los transcritos de Zag2 se pueden detectar cinco días antes de la polinización hasta siete a ocho días después de la polinización ( "DDP" ) y dirigen la expresión en el carpelo de inflorescencias hembra en desarrollo y Ciml que es específico para el núcleo de granos de maíz en desarrollo. El transcrito de Ciml se detecta cuatro a cinco días antes de la polinización hasta seis a ocho DDP. Otros promotores útiles incluyen cualquier promotor que pueda derivarse de un gen cuya expresión esté asociada maternalmente con cogollos hembra en desarrollo.

Los promotores adicionales para regular la expresión de las secuencias de nucleótidos de la presente invención en plantas son los promotores específicos del tallo. Tales promotores específicos del tallo incluyen el promotor S2A de alfalfa (núm. de registro del GenBank EF030816; Abrahams et al., Plant Mol. Biol. 27:513-528 (1995)) y el promotor S2B (núm. de registro del GenBank EF030817) y similares, incorporados en la presente invención como referencia.

Los promotores pueden derivarse en su totalidad de un gen nativo o pueden estar compuestos por elementos diferentes derivados de promotores distintos que se encuentran en la naturaleza, o incluso comprender segmentos sintéticos de ADN.

Los promotores para usar en la presente invención podrían incluir: RIP2, mLIP15, ZmCORl, Rabl7, CaMV 35S, RD29A, B22E, Zag2 , SAM sintetasa, ubiquitina, CaMV 19S, nos, Adh, sacarosa sintasa, R-alelo, los promotores del tejido vascular S2A (número de registro del GenBank EF030816) y S2B (número de registro del GenBank EF030817) y el promotor constitutivo G0S2 de Zea mays . Otros promotores incluyen promotores de la raíz, tales como el promotor NAS2 de maíz, el promotor Cyclo de maíz (publicación de patente de los Estados Unidos núm. 2006/0156439 publicada el 13 de julio de 2006) , el promotor ROOTMET2 de maíz (patente núm. WO2005/063998 publicada el 14 de julio de . 2005) , el promotor CR1BIO (patente núm. WO2006/055487 publicada el 26 de mayo de 2006) , el promotor CR AQ81 (patente núm. WO2005/035770 publicada el 21 de abril de 2005) y el promotor ZRP2.47 de maíz (núm. de registro del NCBI: U38790; núm. GI del NCBI 1063664).

Los constructos de ADN recombinante (y constructos de ADN supresor) de la presente invención podrían incluir, además, otras secuencias reguladoras que incluyen, pero no se limitan a, secuencias líderes de traducción, intrones y secuencias de reconocimiento de poliadenilación . En otra modalidad de la presente invención, un constructo de ADN recombinante de la presente invención también comprende un potenciador o silenciador.

Se puede agregar una secuencia de intrones a la región 5' no traducida, la región codificante de proteínas o la región 3' no traducida para incrementar la cantidad del mensaje maduro que se acumula en el citosol. La inclusión de un intrón divisible en la unidad de transcripción en los constructos de expresión, tanto de plantas como de animales, ha demostrado incrementar la expresión génica tanto en los niveles de ARNm como en los de proteína hasta 1000 veces (Buchman y Berg, Mol. Cell Biol . 8:4395-4405 (1988) ; Callis et al., Genes Dev. 1:1183-1200 (1987)).

Para identificar las secuencias reguladoras y los genes que se usarán en los constructos de ADN recombinante de la presente invención se puede seleccionar cualquier planta. Los ejemplos de plantas objetivo adecuadas para el aislamiento de genes y secuencias reguladoras incluirían, sin limitarse a, alfalfa, manzana, chabacano, Arabidopsis, alcachofa, rúgula, espárragos, aguacate, banana, cebada, frijoles, betabel, zarzamora, arándano vaccinio, brócoli, coles de bruselas, col, cañóla, cantalupo, zanahoria, mandioca, semilla de ricino, coliflor, apio, cereza, . achicoria, cilantro, cítricos, clementinas, trébol, coco, café, maíz, algodón, arándano, pepino, abeto Douglas, berenjena, endibia, escarola, eucalipto, hinojo, higueras, ajo, calabaza, uva, toronja, melón de pulpa verde, jicama, kiwi, lechuga, puerro, limón, lima, pino taeda, linaza, maíz, mango, melón, champiñones, nectarina, nuez, avena, palma aceitera, aceite de colza, quingombó, aceituna, cebolla, naranja, una planta ornamental, palma, papaya, perejil, chirivía, chícharos, melocotón, cacahuate, pera, chile, caqui, pino, piña, plátano, ciruela, granada roja, álamo, papa, calabaza, membrillo, pino de Monterrey, achicoria, rábano, semilla de colza, frambuesa, arroz, centeno, sorgo, pino palustre, frijol de soya, espinaca, calabacín, fresa, remolacha azucarera, caña de azúcar, girasol, camote, árbol de ámbar, mandarina, té, tabaco, tomate, tritical, césped, nabo, una vid, sandía, trigo, ñames y calabacín.

Composiciones Una composición de la presente invención es una planta que comprende en su genoma cualquiera de los constructos de ADN recombinante (que incluyen cualquiera de los constructos de ADN supresor) de la presente invención (tal como cualquiera de los otros constructos mencionados anteriormente) . Las composiciones incluyen, además, cualquier progenie de la planta y cualquier semilla obtenida de la planta o su progenie, en donde la progenie o semilla comprende dentro de su genoma el constructo de ADN -recombinante (o constructo de ADN supresor) . La progenie incluye generaciones posteriores obtenidas mediante la autopolinización o cruce de una planta. La progenie también incluye híbridas y endogámicas.

En cultivos propagados por semillas híbridas, las plantas transgénicas maduras pueden autopolinizarse para producir una planta endogámica homocigota. La planta endogámica produce semillas que contienen el constructo recientemente introducido de ADN recombinante (o constructo de ADN supresor) . Estas semillas se pueden cultivar para producir plantas que exhibirían una característica agronómica alterada (por ejemplo, una característica agronómica incrementada, por ejemplo, en condiciones de limitación de nitrógeno) o usarse en un programa de cultivos con el propósito de producir una semilla híbrida que se puede cultivar para producir plantas que exhibirían la característica agronómica alterada. Las semillas podrían ser semillas de maíz.

La planta podría ser una planta monocotiledónea o dicotiledónea, por ejemplo, una planta de maíz o frijol de soya, tal como una planta híbrida de maíz o una planta endogámica de maíz. La planta podría ser, además, girasol, sorgo, cañóla, trigo, alfalfa, algodón, arroz, cebada, mijo, caña de azúcar o pasto aguja.

El constructo de ADN recombinante podría estar integrado establemente en el genoma de la planta.

Las modalidades particulares . incluyen, pero no se limitan a: 1. Una planta (por ejemplo, una planta de maíz o frijol de soya) que comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operacionalmente a por lo menos una secuencia reguladora, en donde ese polinucleótido codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de al menos 50 %, 51 %, 52 %, 53 % , 54 55 56 57 %, 58 % , 59 60 61 62 %, 63 % , 64 65 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 % , 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 82 %, 83 % , 84 %, 85 ·%, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 92 %, 93 , 94 f 95 %, 96 %, 97 ¾, 98 %, 99 % o 100 de identidad de secuencia, basada en el método de alineamiento Clustál V, cuando se compara con la sec . con núm. de ident . : 19, 21, 23, 25, 27, 29, 30, 31, 32, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 o 49, y en donde esa planta exhibe una mayor tolerancia al estrés de nitrógeno cuando se compara con una planta de control qüe no comprende ese constructo de ADN recombinante . La planta podría exhibir, además, una alteración de por lo menos una característica agronómica cuando se compara con la planta de control . 2. Una planta (por ejemplo, una planta de maíz o frijol de soya) que comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operacionalmente a por lo menos una secuencia reguladora, en donde ese polinucleótido codifica un polipéptido que contiene el dominio SNF2 y en donde esa planta exhibe una mayor tolerancia al estrés de nitrógeno cuando se compara con una planta de control que no comprende ese constructo de ADN recombinante. La planta podría exhibir, además, una alteración de por lo menos una característica agronómica cuando se compara con la planta de control . 3. Una planta (por ejemplo, una planta de maíz o frijol de soya) que comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operacionalmente a por lo menos una secuencia reguladora, en donde ese polinucleótido codifica un polipéptido que contiene el dominio SNF2 y en donde esa planta exhibe una alteración de al menos una característica agronómica en condiciones de limitación de nitrógeno cuando se compara con una planta de control que no comprende ese constructo de ADN recombinante . 4. - Una planta (por ejemplo, una planta de maíz o frijol de soya) que comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operacionalmente a por lo menos un elemento regulador, en donde ese polinucleótido codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de al menos 50 51 %, 52 53 % , 54 %, 55 %, 56 %, 57 58 59 60 61 %, 62 % 63 % , 64 %, 65 %, 66 67 68 %, 69 70 .-s , 71 %, 72 % 73 % , 74 %, 75 %, 76 %, 77 78 79 %, 80 %, 81 %, 82 % 83 , 84 %, 85 %, 86 %, 87 88 89 %, 90 %, 91 %, 92 % 93 94 95 96 %, 97 98 % 99 o 100 % d identidad de secuencia, basada en el método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec . con núm. de ident . : 19, 21, 23, 25, 27, 29, 30, 31, 32, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 o 49, y en donde esa planta exhibe una alteración de al menos una característica agronómica en condiciones de limitación de nitrógeno cuando se compara con una planta de control que no comprende ese constructo de ADN recombinante . 5. Una planta (por ejemplo, una planta de maíz o frijol de soya) que comprende en su genoma un constructo de ADN supresor que comprende por lo menos un elemento regulador unido operacionalmente a una región derivada de todo o parte de un secuenciador o hebra no codificante de un gen objetivo de interés; esa región tiene una secuencia de ácido nucleico de al menos 50 %, 51 %, 52 %, 53 54 %, 55 56 57 58 59 %, 60 61 62 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 68 % 69 %, 70 %, 71 72 73 74 75 %, 76 77 78 79 %, 80 %, 81 82 83 84 85 86 87 88 % 89 %, 90 ¾. 91 92 %, 93 %, 94 %, 95 96 97 98 % 99 % o 100 % de identidad de secuencia, basada en el método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con todo o parte del secuenciador o hebra no codificante de la cual se deriva esa región, y en donde ese gen objetivo de interés codifica un polipéptido que contiene el dominio SNF2, y en donde esa planta exhibe una alteración de al menos una característica agronómica en condiciones de limitación de nitrógeno cuando se compara con una planta de control que no comprende ese constructo de ADN supresor. 6. Una planta (por ejemplo, una planta de maíz o frijol de soya) que comprende en su genoma un constructo de ADN supresor que comprende por lo menos un elemento regulador unido operacionalmente a todo o parte de: (a) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de al menos 50 %, 51 %, 52 %, 53 , 54 %, 55 56 57 58 %, 59 60 % 61 62 %, 63 65 %, 66 67 68 % , 69 70 %, 71 %, 72 %, 73 , 74 75 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 , 84 %, 85 86 , 87 %, 88 % , 89 %, 90 91 92 %, 93 % , 94 %, 95 %, 96 97 , 98 % , 99 % o 100 de identidad de secuencia, basada en el método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec . con núm. de ident . : 19, 21, 23, 25, 27, 29, 30, 31, 32, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 o 49; o (b) un complemento completo de la secuencia de ácido nucleico de (a) , y en donde esa planta exhibe una alteración de al menos una característica agronómica en condiciones de limitación de nitrógeno cuando se compara con una planta de control que no comprende ese constructo de ADN supresor . 7. Cualquier progenie de las plantas mencionadas anteriormente en las modalidades 1-6, cualquier semilla de las plantas mencionadas anteriormente en las modalidades 1-6, cualquier semilla de la progenie de las plantas mencionadas anteriormente en las modalidades 1-6 y las células de cualquiera de las plantas mencionadas anteriormente en las modalidades 1-6, así como la progenie de éstas .

En cualquiera de las modalidades anteriores 1-7 o en cualquier otra modalidad de la presente invención, el polipéptido que contiene el dominio SNF2 podría ser de Arabidopsis thaliana, Zea mays, Glycine max, Glycine tabacina, Glycine soja o Glycine tomentella.

En cualquiera de las modalidades anteriores 1-7 o en cualquier otra modalidad de la presente invención, el constructo de ADN recombinante (o constructo de ADN supresor) podría comprender por lo menos un promotor funcional en una planta como una secuencia reguladora.

En cualquiera de las modalidades anteriores 1-7 o en cualquier otra modalidad de la presente invención, la alteración de al menos una característica agronómica es un incremento o una disminución.

En cualquiera de las modalidades anteriores 1-7 o en cualquier otra modalidad de la presente invención, por lo menos la única característica agronómica podría seleccionarse del-grupo que consiste en verdor, producción, índice de crecimiento, biomasa, peso fresco en la maduración, peso seco en la maduración, producción de frutos, producción de semillas, contenido total de nitrógeno en la planta, contenido de nitrógeno en los frutos, contenido de nitrógeno en las semillas, contenido de nitrógeno en un tejido vegetativo, I contenido de aminoácidos en la planta entera, contenido de aminoácidos libres en el tejido vegetativo, contenido de aminoácidos libres en los frutos, contenido de aminoácidos libres en las semillas, contenido total de proteínas en la planta, contenido de proteínas en los frutos, contenido de proteínas en las semillas, contenido de proteínas en un tejido vegetativo, tolerancia a la sequía, captación de nitrógeno, resistencia al encamado de raíz, índice de cosecha, encamado del tallo, altura de la planta, altura de las espigas, longitud de las espigas, tolerancia a la sal, vigor de las plántulas tempranas y afloramiento de las plántulas en condiciones de estrés causado por temperaturas bajas. Por ejemplo, la alteración de por lo menos una característica agronómica podría ser un aumento en la producción, el verdor o la biomasa.

En cualquiera de las modalidades anteriores 1-7 o en cualquier otra modalidad de la presente invención, la planta podría exhibir una alteración de por lo menos una característica agronómica cuando se compara, en condiciones de estrés de nitrógeno, con una planta de control que no comprende ese constructo de ADN recombinante (o constructo de ADN supresor) .

Una persona con experiencia en la técnica conoce los protocolos para simular condiciones de nitrógeno, ya sea de nitrógeno limitado o no limitado, y para evaluar plantas que se expusieron a condiciones de nitrógeno naturales o simuladas, ya sea de nitrógeno limitado o no limitado. Por ejemplo, para simular condiciones de nitrógeno se puede suministrar a las plantas una cantidad de nitrógeno menor que la requerida normalmente o evitar el suministro de nitrógeno durante un periodo de tiempo, y las plantas se pueden evaluar mediante la observación de las diferencias en las características agronómicas, por ejemplo, cambios en la condición fisiológica y/o física que incluyen (pero no se limitan) a, vigor, crecimiento, tamaño o longitud de la raíz o, particularmente, el color de la hoja o el tamaño del área de la hoja. Otras técnicas para evaluar las plantas incluyen la medición de la fluorescencia de la clorofila, los índices fotosintéticos, el crecimiento de la raíz o los índices de intercambio de gas.

Los siguientes ejemplos describen algunos protocolos y técnicas representativas para simular condiciones de limitación de nitrógeno y/o evaluar las plantas en esas condiciones.

La tolerancia al estrés de nitrógeno se puede evaluar, además, en función de la capacidad de la planta para mantener una producción suficiente (por ejemplo, por lo menos 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 82 %, 83 % 84 %, 85 86 87 %, 88 %, 89 %, 90 "S , 91 %, 92 %, 93 % 94 %, 95 96 97 %, 98 %, 99 % o 100 de producción determinada en las pruebas de campo para las cuales se usan condiciones simuladas o naturales de nitrógeno alto o bajo (por ejemplo, se mide una producción prácticamente equivalente en concentraciones altas o bajas de nitrógeno en comparación con una concentración de nitrógeno normal o se cuantifica la menor pérdida de producción en concentraciones bajas o altas de nitrógeno en comparación con una planta de control o de referencia) .

Una persona con experiencia en la técnica reconocería fácilmente una planta de control o de referencia adecuada para su uso al evaluar o determinar una característica agronómica o fenotipo de una planta transgénica en cualquier modalidad de la presente invención en la cual se usa una planta de control (por ejemplo, las composiciones o métodos que se describen en la presente invención) . Por ejemplo, a manera de ilustraciones no limitantes: 1. La progenie de una planta transformada que es hemicigota con respecto a un constructo de ADN recombinante (o constructo de ADN supresor) , de tal manera que la progenie se segregue en plantas que comprenden o no comprenden el constructo de ADN recombinante (o constructo de ADN supresor) : la progenie que comprende el constructo de ADN recombinante (o constructo de ADN supresor) se mediría, típicamente, con respecto a la progenie que no comprende el constructo de ADN recombinante (o constructo de ADN supresor) (es decir, la progenie que no comprende el constructo de ADN recombinante (o el constructo de ADN supresor) es la planta de control o de referencia) . 2. Introgresión de un constructo de ADN recombinante (o constructo de ADN supresor) en una línea endogámica, tal como en el maíz o en una variedad, tal como en el frijol de soya: la línea introgresada se mediría, típicamente, con respecto a la línea de variedad o endogámica parental (es decir, la línea de variedad o endogámica parental es la planta de control o de referencia) . 3. Dos líneas híbridas, en donde la primera línea híbrida se produce a partir de dos líneas endogámicas parentales y la segunda línea híbrida se produce a partir de las mismas dos líneas endogámicas parentales con la diferencia de que una de las líneas endogámicas parentales contiene un constructo de ADN recombinante (o constructo de ADN supresor) : la segunda línea híbrida se mediría, típicamente, con respecto a la primera línea híbrida (es decir, la primera línea híbrida es la planta de control o de referencia) . 4. Una planta que comprende un constructo de ADN recombinante (o constructo de ADN supresor) : la planta se podría evaluar o determinar en relación con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante (o constructo de ADN supresor) , pero que, por otro lado, tiene antecedentes genéticos comparables con la planta (por ejemplo, comparte por lo menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia del material genético en comparación con la planta que comprende el constructo de ADN recombinante (o constructo de ADN supresor) ) . Existen varias técnicas de laboratorio disponibles para el análisis, la comparación y la caracterización de antecedentes genéticos de las plantas; entre ellas se incluyen: electroforesis de isoenzimas, polimorfismo de la longitud de fragmentos de restricción (RFLP, por sus siglas en inglés) , ADN polimórfico amplificado al azar (RAPD, por sus siglas en inglés) , reacción en cadena de la polimerasa con cebadores arbitrarios (AP-PCR, por sus siglas en inglés) , análisis de amplificación de la huella del ADN (DAF, por sus siglas en inglés) , regiones amplificadas caracterizadas de secuencia (SCAR, por sus siglas en inglés) , polimorfismo de la longitud de fragmentos amplificados (AFLP®, por sus siglas en inglés) y repeticiones de secuencia simple (SSR, por sus siglas en inglés) conocidas, además, como microsatélites .

Además, un experto en la técnica reconocería fácilmente que una planta de control o de referencia adecuada que se usa al evaluar o determinar una característica agronómica o fenotipo de una planta transgénica no incluiría una planta que haya sido seleccionada anteriormente, por mutagénesis o transformación, con respecto a la característica agronómica o fenotipo deseado.

Métodos Los métodos incluyen, pero no se limitan a, los métodos para aumentar la tolerancia al estrés de nitrógeno en una planta, los métodos para evaluar la tolerancia al estrés de nitrógeno en una planta, los métodos para alterar una característica agronómica en una planta, los métodos para determinar una alteración de una característica agronómica en una planta y los métodos para producir semillas. La planta podría ser una planta monocotiledónea o dicotiledónea, por ejemplo, una planta de maíz o de frijol de soya. La planta podría ser, además, girasol, sorgo, cañóla, trigo, alfalfa, algodón, arroz, cebada, mijo o caña de azúcar. La semilla podría ser una semilla de maíz o de frijol de soya, por ejemplo, una semilla híbrida de maíz o una semilla endogámica de maíz.

Los métodos incluyen, pero no se limitan á, los siguientes: Un método para transformar una célula que comprende transformar una célula con cualquiera de los polinucleótidos aislados de la presente invención. Además, se incluye la célula transformada por este método. En modalidades específicas, la célula es una célula eucariota, por ejemplo, una célula de una planta, insecto o levadura, o procariota, por ejemplo, una célula de una bacteria.

Un método para producir una planta transgénica que comprende transformar una célula de una planta con cualquiera de los polinucleótidos aislados o constructos de ADN recombinante (incluso los constructos de ADN supresor) de la presente invención y regenerar una planta transgénica de la célula vegetal transformada. La invención está dirigida, además, a la planta transgénica producida por este método, y a la semilla transgénica obtenida de esta planta transgénica. La planta transgénica obtenida por este método se podría usar en otros métodos de la presente invención.

Un método para aislar un polipéptido de la invención a partir de una célula o medio de cultivo de la célula, en donde la célula comprende un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido de la invención unido operacionalmente a por lo menos una secuencia reguladora, y en donde la célula huésped transformada se cultiva en condiciones adecuadas para la expresión del constructo de ADN recombinante. un método para alterar el nivel de expresión , de un polipéptido de la invención en una célula huésped; el método comprende: (a) transformar una célula huésped con un constructo de ADN recombinante de la presente invención; y (b) cultivar la célula huésped transformada en condiciones adecuadas para la expresión del constructo de ADN recombinante en donde la expresión del constructo de ADN recombinante resulta en la producción de niveles alterados del polipéptido de la invención en la célula huésped transformada.

Un método para aumentar la tolerancia al estrés de nitrógeno en una planta; el método comprende: (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operacionalmente á por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta), en donde el polinucleótido codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 %, 51 %, 52 % 53 54 55 %, 56 57 58 59 60 61 62 % 63 %, 64 %, 65 %, 66 67 %, 68 69 70 71 %> 72 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 78 %, 79 %, 80 81 %, 82 % 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 % 93 %, 94 %, 95 % 96 *, 97 %, 98 % 99 % O 100 % d identidad de secuencia, basada en el método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec . con núm. de ident . : 19, 21, 23, 25, 27, 29, 30, 31, 32, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 o 49; y (b) regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante y exhibe una mayor tolerancia al estrés de nitrógeno cuando se compara con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante. El método podría comprender, adicionalmente , (c) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde esa planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN supresor y exhibe una mayor tolerancia al nitrógeno cuando se compara con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante .

Un método para aumentar la tolerancia al estrés de nitrógeno en una planta; el método comprende: (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN supresor que comprende por lo menos una secuencia reguladora (por e emplo, un promotor funcional en una planta) unida operacionalmente a todo o parte de (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 % , 51 % , 52 %, 53 %, 54 %, 55 % 56 %, 57 58 %, 59 "o / 60 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 % 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 % 76 %, 77 78 %, 79 80 o / 81 o, "o / 82 83 o "S , 84 85 % 86 %, 87 88 % , 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 94 o / 95 % 96 %, 97 %, 98 %, 99 o 100 % de identidad de secuencia basada en el método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec. con núm. de ident . : 19, 21, 23, 25, 27, 29, 30, 31, 32, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 o 49 o (ii) un complemento completo de la secuencia de ácido nucleico de (a), (i); y (b) regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo dé ADN supresor y exhibe una mayor tolerancia al estrés de nitrógeno cuando se compara con una planta de control que no comprende el constructo de ADN supresor. El método podría comprender, además, (c) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde esa planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN supresor y exhibe una mayor tolerancia al nitrógeno cuando se compara con una planta de control que no comprende el constructo de ADN supresor.

Un método para aumentar la tolerancia al estrés de nitrógeno en una planta, el método comprende: (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN supresor que comprende por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) unida operacionalmente a una región derivada de todo o parte de un secuenciador o hebra no codificante de un gen objetivo de interés; esa región tiene una secuencia de ácido nucleico de por lo menos 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %', 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 % 66 %, 67 68 , 69 70 %, 71 %, 72 73 74 %, 75 % 76 77 78 79 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 % 86 ° ? 87 88 %, 89 90 %, 91 ¾, 92 o o ; 93 %, 94 %, 95 ¾ , 96 %* 97 98 %, 99 % O 100 % de identidad de secuencia basada en método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con todo o parte de un secuenciador o de una hebra no codificante de la cual se deriva esa región, y en donde ese gen objetivo de interés codifica un polipéptido que contiene el dominio SNF2 ; y (b) regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN supresor y exhibe una mayor tolerancia al estrés de nitrógeno cuando se compara con una planta de control que no comprende el constructo de ADN supresor. El método podría comprender, además, (c) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde esa planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN supresor y exhibe una mayor tolerancia al nitrógeno cuando se compara con una planta de control que no comprende el constructo de ADN supresor.

Un método para evaluar la tolerancia al estrés de nitrógeno en una planta; el método comprende (a) obtener una planta transgénica, en donde la planta transgénica comprende en su. genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operacionalmente a por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) , en donde el polinucleótido codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 o 51 52 o , 53 "o / 54 "o f 55 "o , 56 %, 57 58 %, 59 %, 60 % 61 %, 62 g. 63 o, 64 o, Q, o r 65 o, ¾ , 66 67 g, 68 Q, *B ^ 69 %, 70 o, "o 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %> 78 %, 79 %, 80 % 81 %, 82 %, 83 o, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %/ 88 %, 89 %, 90 Q. ¾ 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia, basada en el método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec. con núm. de ident.: 19, 21, 23, 25, 27, 29, 30, 31, 32, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 o 49; (b) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en' donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante ; y (c) evaluar la planta progenie para determinar la tolerancia al estrés de nitrógeno cuando se compara con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante.

Un método para evaluar la tolerancia al estrés de nitrógeno en una planta; el método comprende (a) obtener una planta transgénica, en donde la planta transgénica comprende en su genoma un constructo de ADN supresor que comprende por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) unida operacionalmente a todo o parte de (i) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 51 52 , 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 *S , 59 %, 60 % 61 %, 62 63 64 65 %, 66 %, 67 68 %, 69 %, 70 % 71 %, 72 %, 73 74 %, 75 %, 76 77 %, 78 %, 79 %, 80 % 81 82 83 84 85 86 87 88 89 %, 90 % 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 / 98 99 % o 100 % de identidad de secuencia, oasada en el método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec. con núm de ident.: 19, 21, 23, 25, 27, 29, 30, 31, 32, 36, 38, 40, 42 44, 46, 48 o 49; o (ii) un complemento completo de 1 secuencia de ácido nucleico de (a) (i) ; (b) obtener una plant progenie derivada de la planta transgénica, en donde la plant progenie comprende en su genoma el constructo de ADN supresor y (c) evaluar la planta progenie para determinar la tolerancia al estrés de nitrógeno cuando se compara con una planta de control que no comprende el constructo de ADN supresor.

Un método para evaluar la tolerancia al estrés de nitrógeno en una planta; el método comprende (a) obtener una planta transgénica, en donde la planta transgénica comprende en su genoma un constructo de ADN supresor que comprende por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) unida operacionalmente a una región derivada de todo o parte de un secuenciador o hebra no codificante de un gen objetivo de interés; esa región tiene una secuencia de ácido nucleico de por lo menos 50 51 52 %, 53 %, 54 %, 55 ¾ / 56 ¾ / 57 %, 58 %, 59 %, 60 61 62 %, 63 %, 64 ¾ , 65 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 ° / 76 77 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 87 %' 88 %, 89 %, 90 %, 91 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 97 98 % , 99 % o 100 de idéntidad de secuencia, basada en el método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con todo o parte de un secuenciador o de una hebra no codificante de la cual se deriva esa región, y en donde ese gen objetivo de interés codifica un polipéptido que contiene el dominio SNF2 ; (b) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN supresor; y (c) evaluar la planta progenie para determinar la tolerancia al estrés de nitrógeno cuando se compara con una planta de control que no comprende el constructo de ADN supresor.

Un método para determinar una alteración de una característica agronómica en una planta; el método comprende (a) obtener una planta transgénica, en donde la planta transgénica comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operacionalmente a por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta), en donde ese polinucleótido codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 %, 51 ' 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 57 % , 58 % , 59 60 ¦6 / 61 62 %, 63 %, 64 %, 65 66 Q, 67 % , 68 %, 69 %, 70 %, 71 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 % , 78 %, 79 80 %, 81 82 %, 83 %, 84 %, 85 g. 86 %, 87 % , 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 9- Q 7 9- 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia, basada en el método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec . con núm. de ident . : 19, 21, 23, 25, 27, 29, 30, 31, 32, 36,. 38, 40, 42, 44, 46, 48 o 49; (b) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante; y (c) determinar si la planta progenie exhibe una alteración de por lo menos una característica agronómica cuando se compara, opcionalmente en condiciones de limitación de nitrógeno, con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante .

Un método para determinar una alteración de una característica agronómica en una planta; el método comprende (a) obtener una planta transgénica, en donde la planta transgénica comprende en su genoma un constructo de ADN supresor que comprende por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) unida operacionalmente a todo o parte de (i) una secuencia dé ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de por lo menos 50 %, 51 %, 52 % , 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 59 %, 60 %, 61 62 % , 63 64 %, 65 66 67 %, 68 69 "° / 70 71 72 , 73 74 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 80 %, 81 %, 82 , 83 0 ' 84 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 90 %, 91 %, 92 % , 93 94 95 96 ° / 97 % 98 % 99 o 100 de identidad de secuencia, basada en el método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec . con núm. de ident . : 19, 21, 23, 25, 27, 29, 30, 31, 32, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 o 49; o (ii) un complemento completo de la secuencia de ácido nucleico de (i) ; (b) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN supresor; y (c) determinar si la planta progenie exhibe una alteración de por lo menos una característica agronómica cuando se compara, opcionalmente , en condiciones de limitación de nitrógeno, con una planta de control que no comprende el constructo de ADN supresor.

Un método para determinar una alteración de una característica agronómica en una planta; el método comprende (a) obtener una planta transgénica, en donde la planta transgénica- comprende en su genoma un constructo de ADN supresor que comprende por lo menos una secuencia reguladora (por ejemplo, un promotor funcional en una planta) unida operacionalmente a una región derivada de todo o parte de un secuenciador o hebra no codificante de un gen objetivo de interés; esa región tiene una secuencia de ácido nucleico de por lo menos 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 59 60 / 61 ° / 62 ¾ / . 63 64 "° / 65 66 ° / 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 0 / 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 ° ( 97 98 99 o 100 % de identidad de secuencia basada en método de alineamiento Clustal V, cuando se compara cón todo o parte de un secuenciador o de una hebra no codificante de la cual se deriva esa región, y en donde ese gen objetivo de interés codifica un polipéptido que contiene el dominio SNF2 ; (b) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN supresor; y (c) determinar si la planta progenie exhibe una alteración de por lo menos una característica agronómica cuando se compara, opcionalmente en condiciones de limitación de nitrógeno, con una planta de control que no comprende el constructo de ADN supresor.

Un método para producir semillas (por ejemplo, semillas que se pueden vender como productos tolerantes al estrés de nitrógeno) que comprende cualquiera de los métodos anteriores y que comprende, además, obtener semillas de esa 1 planta progenie, en donde esas semillas comprenden en su genoma ese constructo de ADN recombinante (o constructo de ADN supresor) .

En cualquiera de los métodos anteriores o en cualquier otra modalidad de los métodos de la presente invención, en esa etapa de introducción, esa célula vegetal regenerable podría comprender una célula callosa, una célula callosa embriogénica, una célula gamética, una célula meristemática o una célula de un embrión inmaduro. Las células vegetales regenerables se podrían derivar de una planta endogámica de maíz.

En cualquiera de los métodos anteriores o en cualquier otra modalidad de los métodos de la presente invención, esa etapa de regeneración podría comprender lo siguiente: (i) cultivar esas células vegetales transformadas en un medio que comprende una hormona promotora de la embriogénesis hasta que se observa la organización del callo; (ii) transferir esas células vegetales transformadas de la etapa (i) a un primer medio que incluye una hormona promotora de la organización tisular; y (iii) subcultivar esas células vegetales transformadas después de la etapa (ii) sobre un segundo medio para permitir el alargamiento del brote, el desarrollo de la raíz o ambos.

En cualquiera de los métodos anteriores o en cualquier otra modalidad de los métodos de la presente invención, por lo menos la única característica agronómica podría seleccionarse del grupo que consiste en verdor, producción, índice de crecimiento, biomasa, peso fresco en la maduración, peso seco en la maduración, producción de frutos, producción de semillas, contenido total de nitrógeno en la planta, contenido de nitrógeno en los frutos, contenido de nitrógeno en las semillas, contenido de nitrógeno en un tejido vegetativo, contenido de aminoácidos en la planta entera, contenido de aminoácidos libres en el tejido vegetativo, contenido de aminoácidos libres en los frutos, contenido de aminoácidos libres en las semillas, contenido total de proteínas en la planta, contenido de proteínas en los frutos, contenido de proteínas en las semillas, contenido de proteínas en un tejido vegetativo, tolerancia a la sequía, captación de nitrógeno, resistencia al encamado de raíz, índice de cosecha, encamado del tallo, altura de la planta, altura de las espigas, longitud de las espigas, tolerancia a la sal, vigor de las plántulas tempranas y afloramiento de las plántulas en condiciones de estrés causado por temperaturas bajas. La alteración de pór lo menos una característica agronómica podría ser un aumento en la producción, el verdor o la biomasa.

En cualquiera de los métodos anteriores o en cualquier otra modalidad de los métodos de la presente invención, la planta podría exhibir la alteración de por lo menos una característica agronómica cuando se compara, en condiciones de estrés de nitrógeno, con una planta de control que no comprende ese constructo de ADN recombinante (o ese constructo de ADN supresor) .

En cualquiera de los métodos anteriores o en cualquier otra modalidad de los métodos de la presente invención, existen alternativas para introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operacionalmente a por lo menos una secuencia reguladora. Por ejemplo, se podría introducir en una célula vegetal regenerable una secuencia reguladora (tal como uno o más potenciadores , por ejemplo, como parte de un elemento transponible) y, después, analizarla en busca de un evento en el que la secuencia reguladora se una operacionalmente a un gen endógeno que codifica un polipéptido de la presente invención.

La introducción de constructos de ADN recombinante de la presente invención en plantas se podría realizar mediante cualquiera de las técnicas adecuadas, que incluyen, pero no se limitan a, la captación directa de ADN, el tratamiento con sustancias químicas, la electroporación, la microinyección, la fusión celular, la infección, la transferencia de ADN mediada por vectores, el bombardeo o la transformación mediada con Agrobacterium . Las técnicas para transformar y regenerar plantas se han descrito en la publicación de patente internacional nútn. WO 2009/006276, cuyo conteñido se incorpora en la presente descripción como referencia.

El desarrollo o regeneración de plantas que contienen el fragmento foráneo, exógeno de ácido nucleico que codifica una proteína de interés se conoce bien en la técnica. Las plantas regeneradas se podrían autopolinizar para proporcionar plantas transgénicas homocigóticas . De lo contrario, el polen obtenido de las plantas regeneradas se cruza con el de plantas cultivadas de semillas de líneas agronómicamente importantes. A la inversa, el polen de las plantas de estas líneas importantes se usa para polinizar plantas regeneradas. Una planta transgénica de la presente invención que contiene un polipéptido deseado se cultiva por medio de métodos muy conocidos por una persona con experiencia en la técnica.

EJEMPLOS La presente invención se ilustra con más detalle en los siguientes ejemplos, en los cuales las partes y los porcentajes están en peso y los grados están en grados Celsius, a menos que se indique de otra manera. Debe entenderse que si bien estos ejemplos señalan las modalidades de la invención, se aportan a manera de ejemplo únicamente. A partir de la descripción anterior y de estos ejemplos, una persona con experiencia en la técnica podrá determinar las características esenciales de esta invención y, sin apartarse del espíritu ni del alcance de ella, podrá introducir varios cambios y modificaciones en la invención para adaptarla a los diversos usos y condiciones. Por consiguiente, diversas modificaciones · de la invención además de aquellas que se muestran y describen en la presente invención resultarán evidentes para aquellos con experiencia en la técnica a partir de la descripción anterior. Las modificaciones también estarán comprendidas dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplo 1 Creación de una población de Arabidopsis con genes con rotuladas para activación Se preparó un constructo binario basado en T-ADN de 18.49 kb, pHSbarENDs2 (sec. con núm. de ident . : 1; Fig. 1) que contiene cuatro elementos potenciadores multimerizados derivados del promotor del virus mosaico de la coliflor 35S (que corresponde a las secuencias -341 a -64, tal como definen Odell et al., Nature 313:810-812 (1985)). El constructo contiene, además, secuencias del vector (pUC9) y un policonector (sec. con núm. de ident. : 11) para permitir el rescate del plásmido, secuencias de transposones (Ds) para removilizar el T-ADN y el gen bar para permitir la selección del glufosinato de las plantas transgénicas . Inicialmente se transferirá al genoma de la planta huésped solamente el segmento de 10.8 kb del borde derecho (BD) al borde izquierdo (BI) inclusive. Ya que los elementos potenciadores se encuentran cerca del BD, pueden inducir la cis-activación de los loci genómicos seguida de la integración de T-ADN.

Se crearon poblaciones de Arabidopsis rotuladas por activación por medio de la transformación de la planta entera de ñgrobacterium. El constructo pHSbarENDs2 se transformó en la cepa de Agrobacterium turnefaciens C58 cultivada en un medio de caldo de lisogenia a 25 °C hasta OD600 ~1.0. Después, las células se conformaron en bolillas mediante centrifugación y se resuspendieron en un volumen igual de 5 % de sacarosa/0.05 % de Silwet L-77 (OSI Specialties, Inc) . Durante la germinación precoz, el ecotipo Col-0 de Arabidopsis thaliana cultivado en el suelo se empapó con la suspensión de Agrobacterium. Una semana después, las mismas plantas se empaparon nuevamente con la misma cepa de Agrobacterium en sacarosa/Silwet . Se permitió que las plantas dejaran semilla como lo hacen normalmente. Las semillas resultantes TI se sembraron en suelo y, para seleccionar las plántulas transgénicas , se atomizaron con glufosinato (FINALE®,- AgrEvo; Bayer Environmental Science) . Se seleccionó un total de 100,000 plántulas TI resistentes al glufosinato. La semilla T2 de cada línea se conservó por separado.

Ejemplo 2 Ensayos para identificar líneas tolerantes a un bajo contenido de nitrógeno A partir de cada una de las 100,000 líneas TI con rotuladas para activación separadas se siembran · once plantas T2 en placas cuadradas (15 mm X 15 mm) que contienen 0.5x N-Free Hoagland's, 0.4 mM de nitrato de potasio, 0.1 % de sacarosa, 1 mM de MES y 0.25 % de Phytagel™ (medio con bajo contenido de nitrógeno) . Se colocan cinco líneas en cada placa y se incluyen 9 ejemplares de tipo silvestre en cada placa para completar un total de 64 ejemplares en un patrón de cuadrícula de 8x8 (véase la Fig. 12) . Las placas se conservan tres días en la oscuridad a 4 °C para estratificar las semillas y, después, se colocan horizontalmente durante nueve días a 22 °C en condiciones de luz y a 20 °C en condiciones de oscuridad. El fotoperiodo es de dieciséis horas de luz y ocho horas de oscuridad con una intensidad de luz promedio de -200 mmol/m2/s. Las placas se rotan y se cambian de lugar diariamente en cada anaquel En el día doce (nueve días de cultivo) se evalúa la condición de las plántulas mediante captación de imágenes de la planta entera.

Después de cubrir la imagen de la placa para eliminar el color del fondo se realizan dos mediciones diferentes para cada ejemplar: el área total de la roseta y el porcentaje de color que queda comprendido en el ancho del intervalo del color verde. En función de los datos del tono, saturación e intensidad ("HSI", por sus siglas en inglés), el ancho del intervalo del color verde consiste en los tonos 50 a 66. El área total de la roseta se usa como una medida de la biomasa de la planta, mientras que los estudios de respuesta a las dosis muestran que el ancho del intervalo del color verde es un indicador de la asimilación de nitrógeno (véase la Fig. 13).

Las líneas con un aumento considerable en el área total de la roseta y/o en el ancho del intervalo del color verde, cuando se comparan con los controles de tipo silvestre, se designan como aciertos de la Fase 1. Los aciertos de la Fase 1 se ensayan nuevamente por duplicado en las mismas condiciones de prueba (ensayo de la Fase 2) . Un ensayo de la Fase 3 se usa, además, para validar los mutantes que pasaron las Fases 1 y 2. En la Fase 3, cada línea se coloca en placas en forma separada en un medio con bajo contenido de N y, de ese modo, se cultivan 32 ejemplares de T2 cerca de 32 ejemplares de tipo silvestre en una placa para proporcionar así una mayor rigurosidad estadística al análisis. Las líneas que muestran una diferencia significativa en comparación con los controles en la Fase 3 se consideran como líneas tolerantes a la deficiencia de nitrógeno validadas.

Ejemplo 3 Identificación de genes con rotuladas para activación Los genes contiguos al inserto de T-ADN en líneas tolerantes al nitrógeno se identifican con el uso de uno o ambos procedimientos estándar siguientes: (1) PCR termal de entrelazado asimétrico (TAIL PCR, por sus siglas en inglés) (Liu et al., Plant J. 8:457-63 (1995)); y (2) SAIFF PCR (Siebert et al., Nucleic Acids Res. 23:1087-1088 (1995)). En las líneas con insertos de T-ADN multimerizados complejos, tanto el TAIL PCR como el SAIFF PCR pueden ser insuficientes para identificar genes candidatos. En estos casos se puede usar otros procedimientos, incluso la PCR inversa, el rescate de plásmidos y/o la construcción de la genoteca de ADN.

Un resultado exitoso es cuando un fragmento único de TAIL o SAIFF PCR contiene una secuencia de borde de T-ADN y una secuencia genómica de Arabidopsis . Una vez que se obtiene una etiqueta de la secuencia genómica contigua al inserto de T-ADN, los genes candidatos se identifican mediante el alineamiento para la secuencia del genbma de Arabidopsis disponible al público. Especialmente, el mencionado gen más cercano a los elementos potenciadores 35S/BD del T-ADN es candidato para genes activos.

Para verificar que un gen identificado está verdaderamente cerca de un T-ADN y excluir la posibilidad de que el fragmento TAIL/SAIFF sea un artefacto de clonación quimérica, se realiza una PCR diagnóstica en el ADN genómico con un oligo en el T-ADN y un oligo específico para el gen candidato. Las muestras de ADN genómico que proporcionan un producto de PCR se interpretan como representantes de la inserción de T-ADN. Este análisis también verifica una situación en donde ocurre más de un evento de inserción en la misma línea, por ejemplo, si se identifican múltiples fragmentos genómicos diferentes en. los análisis TAIL y/o SAIFF PCR.

Ejemplo 4 Identificación del gen con rotuladas para activación que codifica un polipéptido que contiene el dominio SNF2 Se analizó aún más una línea rotulada para activación (línea 112579) que muestra tolerancia a la deficiencia de nitrógeno. Se extrajo el ADN de la línea y los genes contiguos al inserto del T ADN en la línea mutante se identificaron por PCR mediada por ligación (Siebert et al., Nucleic Acids Res. 23:1087-1088 (1995)). Se identificó un solo fragmento amplificado que contenía una secuencia de borde de T-ADN y una secuencia genómica de Arabidopsis. Una vez que se obtuvo una etiqueta de la secuencia genómica contigua al inserto de T-ADN, se identificó un gen candidato mediante el alineamiento para el genoma de Arabidopsis completo. Especí icamente, el mencionado gen más cercano a los elementos potenciadores 35S/BD del T-ADN fue el candidato para el gen activado en la línea. En el caso de la línea 112579, el gen más cercano a los potenciadores 35S fue el Atlg61140 que codifica el polipéptido que contiene el dominio SNF2 de Arabidopsis thaliana .

Ejemplo 5 Validación del gen candidato de Arabidopsis (Atlg61140) por medio de la transformación en Arabidopsis Los genes candidatos se pueden transformar en Arabidopsis y sobreexpresar bajo el promotor 35S. Si se observa el mismo fenotipo o uno similar en la línea transgénica como en la línea parental rotulada para activación, entonces se considera que el gen candidato es un "gen guía" validado en Arabidopsis .

El gen candidato de Arabidopsis (Atlg61140) que codifica un polipéptido que contiene el dominio SNF2 se probó para determinar su capacidad para conferir tolerancia a la deficiencia de nitrógeno de la siguiente manera. Se designaron cebadores para amplificar la variante Atlg61140.1.

El ADNc de Atlg61140.1 (sec. con núm. de ident . : 24) se amplificó mediante RT-PCR con los siguientes cebadores: 1. Iniciador directo de attB Atlg61140-5' (sec. con núm. de ident. : 33) El cebador directo contiene la secuencia de attBl (ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT; sec. con núm. de ident.: 12) y una secuencia de consenso de Kozak (CAACA) corriente arriba de los primeros 21 nucleótidos de la región codificante de proteínas, comenzando con el codón de iniciación ATG, de ese ADNc. 2. Iniciador inverso de attB Atlg61140-3' (sec. con núm. de ident . : 34) El cebador inverso contiene la secuencia de attB2 (ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT; sec. con núm. de ident.' : 13) adyacente al complemento inverso de los últimos 21 nucleótidos de la región codificante de proteínas que comienza con el complemento inverso del codón de terminación, de ese ADNc.

Con la tecnología I VITROGEN™ GATEWAY® CLONASE™ se realizó una reacción de recombinación BP para el producto de la RT-PCR con el pD0NR™Zeo (sec. con núm. de ident.: 2; Fig. 2) . Este proceso elimina el gen letal bacteriano ccdB, así como el gen resistente al cloranfenicol (CAM) de pDONR™Zeo y clona direccionalmente el producto de la PCR con sitios attBl y attB2 contiguos, de modo que se crea un clon de entrada. Para una reacción de recombinación LR posterior con un vector objetivo se usó un clon de entrada identificado positivamente de la siguiente manera.

Se preparó un vector binario con base de T-ADN de 16.8 kb (vector objetivo) denominado pBC-amarillo (sec. con núm. de ident.: 4; Fig. 4) con un promotor 35S de 1.3 kb ubicado inmediatamente corriente arriba del inserto de conversión Cl INVITROGEN™ GATEWAY que contiene el gen ccdB letal bacteriano además del gen de resistencia al cloranfenicol (CAM) contiguo a las secuencias de attRl y attR2. El vector contiene, además, el promotor RD29a que conduce la expresión del gen para ZS- amarillo ( I VITROGEN™) que confiere fluorescencia amarilla a la semilla transformada. Con el uso de la tecnología de INVITROGEN™ GATEWAY® se realizó una reacción de recombinación LR con el clon de entrada que contiene la secuencia codificante de nucleótidos de Atlg61140.1 (sec. con núm. de ident.: 24) y el vector pBC-amarillo; sin embargo, podría usarse, además, cualquiera de las otras variantes (secs. con núm. de ident. : 26 y 28) . Esta amplificación permitió la clonación rápida y direccional de Atlg61140.1 (SNF2.1; sec. con núm. de ident.: 24) detrás del promotor 35S en pBC-amarillo .

Después, los solicitantes introdujeron los constructos de expresión del promotor 35S :Atlg61140 en el ecotipo Col-0 de Arabidopsis de tipo silvestre para lo cual usaron el mismo procedimiento de transformación mediado por Agrobacterium descrito en el Ejemplo 1. Se seleccionaron semillas TI transgénicas mediante fluorescencia amarilla y 32 de estas semillas TI se colocaron en placas al lado de 32 semillas del ecotipo Col-0 de Arabidopsis de tipo silvestre en un medio con ¦ bajo contenido de nitrógeno. Todas las condiciones posteriores de crecimiento y análisis por captación de imágenes se realizaron tal como se describió en el Ejemplo 1. Se encontró que el fenotipo original de la rotulación con activación, la tolerancia a condiciones de limitación de nitrógeno, se podría recapitular en plantas de Arabidopsis de tipo silvestre que se transformaron con un constructo en donde un gen Atlg61140 se expresó directamente por medio del promotor 35S.

Ejemplo 6A Preparación de genotecas de ADNc y aislamiento y secuenciación de clones de ADNc Las genotecas de ADNc se pueden preparar mediante i cualquiera de los diversos métodos disponibles. Por ejemplo, los ADNc se podrían introducir en vectores plasmídicos para lo cual primero se preparan las genotecas de ADNc en vectores XR UNI-ZAP™ de conformidad con el protocolo del fabricante (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) . Las genotecas XR UNI-ZAP™ se convierten en genotecas plasmídicas de conformidad con el protocolo proporcionado por Stratagene. Al realizar la conversión, los insertos de ADNc estarán contenidos en el vector plasmídico pBLUESCRIPT® . Además, los ADNc se podrían introducir directamente en los vectores precortados BLUESCRIPT® II SK(+) (Stratagene) con ADN-ligasa T4 (New England Biolabs) , seguido de la transfección en células DH10B de conformidad con el protocolo del fabricante (GIBCO BRL Products) . Una vez que los insertos de ADNc están en vectores plasmídicos, los ADN plasmídicos se preparan a partir de colonias bacterianas seleccionadas aleatoriamente que contienen plásmidos recombinantes pBLUESCRIPT® o las secuencias de ADNc insertadas se amplifican mediante la reacción en cadena de la polimerasa con el uso de cebadores específicos para secuencias de vectores contiguos a las secuencias de ADNc insertadas. Los ADN o ADN plasmídicos de insertos amplificados se someten a secuenciación en reacciones de secuenciación tinte-cebador para generar secuencias parciales de ADNc (etiquetas de secuencia expresada o "EST" ; véase Adams et al., Science 252:1651-1656 (1991)) . Las EST resultantes se analizan con el uso1 de un secuenciador fluorescente Modelo 377 de Perkin Elmer.

Los datos de la secuencia de inserto completo (FIS) se generan con el uso de un protocolo de transposición modificado. Los clones identificados por las FIS se recuperan de reservas de glicerina conservadas como colonias únicas y los ADN plasmídicos se aislan vía lisis alcalina. Las plantillas ' de ADN aisladas se hacen reaccionar con nucleótidos directos e inversos MI3 cebados por el vector en una reacción de secuenciamiento en base a PCR y se cargan en secuenciadores automatizados. La confirmación de la identificación de clones se realiza por alineamiento de secuencias con la secuencia de EST original de donde se realiza la solicitud de FIS.

Los moldes confirmados son transpuestos mediante el kit de transposición Primer Island (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) que se basa en el elemento transponible Tyl de Saccharomyces cerevisiae (Devine y Boeke, Nucleic Acids Res. 22:3765-3772 (1994)). El sistema de transposición in vitro coloca aleatoriamente sitios de unión únicos en toda la población de moléculas grandes de ADN. Después, el ADN transpuesto se usa para transformar las células electrocompetentes de DH10B (Gibco BRL/Life Technologies, Rockville, MD) vía electroporación . El elemento transponible contiene un marcador seleccionable adicional (denominado DHFR; Fling y Richards, Nucleic Acids Res. 11:5147-5158 (1983)) que permite la selección doble en placas con agar únicamente de los subclones que contienen el transposón integrado. Aleatoriamente, se selecciona múltiples subclones de cada reacción de transposición, los ADN plasmídicos se preparan vía lisis alcalina y las plantillas se someten a secuenciamiento (tinte-terminador ABI Prism mezcla ReadyReaction) hacia afuera del sitio del evento de transposición, con el uso de cebadores únicos específicos para los sitios de unión dentro del transposón.

La información de las secuencias se recolecta (ABI PRISM® Collections) y se ensambla con el uso de Phred y Phrap (Ewing et al., Genome Res. 8:175-185 (1998); Ewing et al., Genome Res. 8:186-194 (1998)) . Phred es un programa de dominio público que relee los datos de secuencias ABI, vuelve a llamar a las bases, asigna valores de calidad y escribe llamadas de bases y valores de calidad en archivos de salida editables . El programa de ensamble de secuencias Phrap usa estos valores de calidad para aumentar la precisión de los cóntigos de secuencias ensamblados. Los ensambles se observan mediante el editor de secuencias Consed (Gordon et al., Genome Res. 8:195-202 (1998)) .

En algunos clones el fragmento de ADNc corresponde a la porción 3 '-terminal del gen y no cubre el marco de lectura abierto completo. Para obtener la información corriente arriba se usa uno o dos protocolos diferentes. El primero de estos métodos resulta en la producción de un fragmento de ADN que contiene una porción de la secuencia de genes deseada mientras que el segundo método resulta en la producción de un fragmento que contiene el marco de lectura abierto completo.! Ambos métodos usan dos tandas de amplificación de la PCR para obtener fragmentos de una o más genotecas . Las genotecas se escogen, algunas veces, en función del conocimiento previo de que el gen específico debería encontrarse en un determinado tejido y, algunas veces, se escogen aleatoriamente. Las reacciones para obtener el mismo gen se pueden realizar en varias genotecas en paralelo o en un grupo de genotecas . Los grupos de genotecas se preparan, normalmente, con el uso de 3 a 5 genotecas diferentes y se normalizan hasta una dilución uniforme. En la primera tanda de amplificación ambos métodos usan un cebador específico del vector (directo) correspondiente a una porción del vector localizada en la región 5 '-terminal del clon junto con un cebador específico del gen (inverso) . El primer método usa una secuencia complementaria a una porción de la secuencia de genes ya conocida, mientras que el segundo método usa un cebador específico del gen complementario a una porción de la región 3' no traducida (también llamada UTR, por sus siglas en inglés) . En la segunda tanda de amplificación se usa un grupo subdividido de cebadores para ambos métodos. El fragmento de ADN resultante se liga al vector pBLUESCRIPT® con el uso de un kit comercial y se sigue el protocolo del fabricante. Este kit se selecciona de la variedad disponible de varios proveedores que incluye INVITROGEN™ (Carlsbad, CA) , Promega Biotech (Madison, WI) y Gibco-BRL (Gaithersburg, MD) . El ADN plasmídico se aisla mediante el método de lisis alcalina y se somete a secuenciamiento y ensamble con el uso de Phred/Phrap, como se mencionó anteriormente.

Ejemplo 6B Preparación de genotecas de ADNc y obtención de secuencias Los ARNm se pueden aislar con el kit de aislamiénto de ARN Qiagen para el aislamiento total del ARN, seguido del aislamiento del ARNm mediante el acoplamiento a oligo(dT) Dynabeads de Invitrogen^ (Life Technologies, Carlsbad, CA) , y las genotecas de secuenciación se pueden preparar con el kit estándar Seq para ARNm de Illumina, Inc. (San Diego, CA) . En este método, los ARNm se fragmentan con una solución de ZnCl2, se retrotranscriben a ADNc con cebadores aleatorios, y los extremos se reparan para crear fragmentos con extremos romos, 3' A-tailed, y se ligan con adaptadores de las genotecas de extremos apareados Illumina. Después, los fragmentos de ADNc ligados se pueden amplificar mediante PCR con cebadores de genotecas de extremos apareados Illumina, y los prpductos purificados por PCR se pueden controlar para determinar la calidad y cantidad en el chip de ADN del equipo Ágilent Bioanalyzer antes de la secuenciación en el analizador Genome Analyzer II equipado con un módulo de extremos apareados.

Las lecturas de las pruebas de secuenciación se pueden editar antes del ensamblado de tal manera que el primer par de bases de cada lectura con un valor de calidad FASTQ observado menor que 15 y todas las bases siguientes se recorten con una rutina de Python. El ensamblador de la aplicación Velvet (Zerbino et al. Genome Research 18:821-9 (2008)) se puede ejecutar con diversos k-meros y valores de corte para producir varios ensambles simulados a lo largo de un intervalo de severidad. Las secuencias contiguas (cóntigos) dentro de esos ensamblajes se pueden combinar en grupos con la aplicación informática Vmatch (disponible en el sitio web de Vmatch) de modo que los cóntigos que se identifican como sublíneas de cóntigos más largos se agrupan y se eliminan y dejan un conjunto no redundante de los cóntigos "señalizadores" más largos. Estos conjuntos no redundantes se pueden usar en alineamientos a secuencias homologas a partir de especies de plantas modelo conocidas.

Si un contigo no representa un gen completo, los conjuntos no redundantes se pueden evaluar nuevamente por medio de Blast o de una rutina de Perl con las secuencias descubiertas en la primera búsqueda. Si se descubren secuencias que extienden los extremos de los cóntigos, éstas se pueden ensamblar con las secuencias originales con un ensamblador de escritorio, tal como SeqMan de DNAStar o Sequencher de GeneCode . Estas etapas se pueden repetir hasta que no se detecten secuencias de extensión. Para transcritos que aún no están completados, los fragmentos de genes teóricamente relacionados (basados en homología a otras gramíneas) se pueden unir artificialmente por medio de secuencias de unión de otra gramínea.

Ejemplo 7 Identificación de secuencias de ADNc Las secuencias de ADNc que codifican polipéptidos que contienen el dominio SNF2 se identifican por medio de BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1993); véase, además, la explicación del algoritmo BLAST en el sitio web del National Center for Biotechnology Information at the National Library of Medicine of the National Institutes of Health) para identificar la similitud con las secuencias de aminoácidos contenidas en la base de datos "nr" del BLAST (que comprende todas las traducciones no redundantes CDS del GenBank, las secuencias derivadas de la estructura tridimensional de Brookhaven Protein Data Bank, el último lanzamiento de la base de datos de secuencias de proteínas de SWISS-PROT y las bases de datos de EMBL y DDBJ) . Las secuencias de ADN se pueden traducir en todos los marcos de lectura y la similitud se puede comparar con todas las secuencias de- proteínas disponibles al público contenidas en la base de datos "nr" con el uso del algoritmo BLASTX (Gish y States, Wat. Genet. 3:266-272 (1993)) que proporciona el NCBI. Los polipéptidos codificados por las secuencias de ADNc se pueden analizar para determinar la similitud con todas las secuencias de aminoácidos disponibles al público contenidas en la base de datos "nr" con el uso del algoritmo BLASTP proporcionado por el National Center for Biotechnology Information (NCBI) . Por conveniencia, el valor P (probabilidad) o el valor E (expectativa) de la observación de una coincidencia entre una secuencia codificada de ADNc y una secuencia contenida en las bases de datos de búsqueda simplemente por casualidad, según se calcula con BLAST, se informan en la presente invención como valor "pLog" que representa el negativo del logaritmo del valor P o valor E informado. En consecuencia, mientras mayor sea el valor pLog, mayor es la probabilidad de que la secuencia codificada de ADNc y el "acierto" del BLAST representen proteínas homologas.

Las secuencias de EST se pueden comparar con la base de datos del Genbank tal como se describió anteriormente. Las secuencias que contienen EST hacia los extremos 5 ' o 3 ' se pueden encontrar mediante el algoritmo BLASTN (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)) con respecto a la base de datos de propiedad de Dupont por la comparación de secuencias de nucleótidos que comparten regiones de secuencias homologas comunes o traslapadas. En donde hay secuencias comunes o traslapadas entre dos o más fragmentos de ácidos nucleicos, las secuencias se pueden ensamblar en una sola secuencia de nucleótidos contiguos, lo que extiende así el fragmento original ya sea en la dirección del cebador 5 o 3. Una vez que se identifica la etiqueta que está más cerca del extremo 51 , su secuencia completa se puede determinar mediante secuenciación del inserto completo.

Para encontrar los genes homólogos que pertenecen a diferentes especies se puede comparar la secuencia de aminoácidos de un gen conocido (ya sea de una fuente registrada o de una base de datos pública) con una base de datos de EST mediante el algoritmo tBLASTn. El algoritmo tBLASTn busca aminoácidos en una base de datos de nucleótidos traducida en los 6 marcos de lectura. Esta búsqueda permite diferencias en el uso de codones de nucleótidos entre diferentes especies y para la degeneración del codón.

Ejemplo 8A Caracterización de secuencias de ADNc que codifican polipéptidos que contienen el dominio SNF2 Se prepararon genotecas de ADNc que represen aban ARNm de diversos tejidos de Zea mays (maíz) , Eragrost i s nindens i s (pasto Resurrection) y Paspalu notatum (Bahiagrass) . Las características dé la genotecas se describen más abajo.

Tabla 2 Genotecas de ADNc de maíz Descripción Nucleótido Aminoácidos Genoteca Clon (tej ido) Panojas de maíz V7 a V12 agrupadas, de Sec . con núm. Sec . con núm. cfpln longitud cfpln. k008. f7 : fis de ident.: 18 de idént.: 19 completa, enriquecido y normalizado Espigas polinizadas de maíz, reunidas 48-72 h después de la Sec. con núm. Sec. con núm. cfp4n cfp4n . k061. ol8 : fis polinización, de de ident.: 20 de ident.: 21 longitud completa, enriquecido, normalizado Brotes de la panoja, Sec . con núm. Sec . con núm. p0016 p0016.ctscal2r agrupados, 0.1- de ident.: 22 de ident.: 23 1.4 cm Raíces en estado vegetativo del pasto Sec . con núm . Sec . con núm .

N/A N/A Resurrection de ident.: 35 de idént. : 36 {Eragrostis nindensis) Raices en estado Sec . con núm . Sec . con núm . vegetativo de de ident.: 37 de ident.: 38 N/A Bahiagrass N/A {Paspalum notatu ) Tal como se ilustra en la Tabla 3, las Figuras 16A-16AM y la Figura 17, los ADNc identificados en la Tabla 2 codifican polipéptidos similares a los polipéptidos que contienen el dominio SNF2 de Arabidopsis thaliana (Atlg61140.1 (núm. GI 186492170; sec. con núm. de ident.: 25); Atlg61140.2 (núm. GI 186492172; sec. con núm. de ident.: 27); y Atlg61140.3 (núm. GI 186492175; sec. con núm. de ident.: 29)) y a los polipéptidos que contienen el dominio SNF2 de Oryza sativa (núm. GI 53792213 que corresponde a la sec. con núm. de ident.: 30, núm. GI 218200575 que corresponde a la sec. con núm. de ident.: 31 y núm. GI 90399293 que corresponde a la sec. con núm. de ident. : 32) y del sorgo bicolor (núm. GI 242058897 que corresponde a la sec. con núm. de ident.: 49).

En la Tabla 3 (literatura no correspondiente a patentes) y la Tabla 4 (literatura correspondiente a patentes) se indican los resultados de BLASTP para las EST individuales, las secuencias de los insertos de ADNc completos que comprenden los clones de ADNc indicados ("FIS"), las secuencias de cóntigos ensambladas de dos o más secuencias de EST, FIS o PCR ("contigo") o secuencias que codifican una proteína completa o funcional derivada de un FIS o un contigo ("CGS"). En las Tablas 3 y 4 se muestra, además, los valores del porcentaje de identidad de secuencia para cada par de secuencias de aminoácidos obtenidos mediante el método de alineamiento Clustal V con parámetros predeterminados (descritos a continuación) .

Tabla 3 Resultados de BLASTP para los polipéptidos homólogos a los polipéptidos que contienen el dominio SNF2 Secuencia % de identidad Puntuación de Estado Núm. Gl del CNIB (Sec. con núm. de ident . : ) pLog de BLAST cfpln.pk008.f7:fis (sec. con 53792213 (sec.

SCG núm. de ident . : 19) núm . de iden . cfp4n .pk061.ol8 : fis (sec. con 218200575 (sec SCG núm. de ident.: 21) núm. de ident .

Cóntigo de: p0016.ctscal2r 90399293 (sec.

SCG (sec. con núm. de ident.: 23) núm. de ident . 242058897 (sec Sec. con núm. de ident.: 36 SCG núm . de ident . 242058897 (sec Sec. con núm. de ident.: 38 SCG núm. de ident .

Tabla 4 Resultados de BLASTP para los polipéptidos homólogos a los polipéptidos que contienen el dominio SNF2 Secuencia % de identidad Puntuación de Estado Referencia con núm . de ident . pLog de BLAST Sec . con núm. de iden . 17848 En la patente de los Estados Unidos núm. 20080229439 Sec. con núm. de ident. 25068 En la patente de los cfpln.pk008. f7 : f s (sec. con Estados Unidos núm. 109 núm. de ident.: 19) 20080229439 Sec . con núm . de ident . 17848 En la patente de los Estados Unidos núm. 20070192889 Sec . con núm. de ident . 25068 En la patente de los Estados Unidos núm. 20070192889 Sec . con núm . de ident . 110654 En la patente de los Estados Unidos núm. 20040123343 Sec . con núm . de ident . 48529 cfp4n.pk061.ol8 : fis (sec. con En la patente de los >250 núm. de ident.: 21) Estados Unidos núm. 20060123505 Sec . con núm . de ident . 55175 Contigo de: p0016.ctscal2r En la patente de los >250 (sec. con núm. de ident.: 23) Estados Unidos núm. 20060123505 Sec . con núm. de ident . : 16967 Sec. con núm. de ident.: 36 SCG En la patente de los 79.4 >250 Estados Unidos núm. 20090094717 Sec. con núm. de ident.: 16967 Sec. con núm. de ident.: 38 SCG En la patente de los 83.9 >2S0 Estados Unidos núm. 20090094717 Ejemplo 8B Identificación de otros polipéptidos que contienen el dominio SNF2 Las secuencias homologas a los genes guía que codifican proteínas que contienen el dominio SNF2 se pueden identificar por medio de algoritmos de comparación de secuencias, tales como BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1993); véase, además, la explicación del algoritmo BLAST en el sitio en la web del National Center for Biotechnology Information at the National Library of Medicine of the National Institutes of Health) . Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por Atlg61140 se usó para buscar en la base de datos pública con BlastP, y las secuencias de polipéptidos representadas en las secs. con núm. de ident.: 40, 42 y 48 se identificaron posteriormente como homólogos (las secuencias de nucleótidos correspondientes son las sec. con núm. de ident.: 39, 41 y 47, respectivamente). Además, una búsqueda de TblastN contra las secuencias públicas de BAC identificó el homólogo del maíz representado por la sec. con núm. de ident . : 44 (la secuencia de nucleótidos correspondiente es la sec. con núm. de ident. : 43) .

Ejemplo 8C Alineamiento de secuencias y cálculos de porcentaje de identidad para polipéptidos que contienen el dominio SNF2 Las Figs. 16A-16AM presentan un alineamiento de las secuencias de aminoácidos expuestas en las secs . con núm. de ident.: 19, 21, 23, 25, 27, 29, 30, 31, 32, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 y 49. La Fig. 17 es un cuadro del porcentaje de identidad de secuencia y los valores de divergencia para cada par de secuencias de aminoácidos ilustrado en las Figs. 16A-16AM.

Los alineamientos de secuencias y los cálculos del porcentaje de identidad se realizaron con el programa MEGALIGN® del paquete integrado para bioinformática LASERGENE® (DNASTAR® Inc., Madison, WI). Se realizaron múltiples alineamientos de las secuencias con el método de alineamiento Clustal (Higgins y Sharp (1989) CABIOS. 5:151-153) con los parámetros predeterminados (PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN=10 , PENALIZACIÓN DE LONGITUD DE INTERRUPCIÓN=10 ) . Los parámetros predeterminados para alineamientos en pares con el uso del método Clustal fueron KTUPLE 1, PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN=3 , VENTANA=5 y DIAGONALES GUARDADAS=5.

Ejemplo 9 Preparación de un vector de expresión de una planta que contiene un homólogo del gen guía de Arabidopsis Las secuencias homologas a los genes guía que codifican proteínas que contienen el dominio SNF2 se pueden identificar por medio de algoritmos de comparación de secuencias, tales como BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul et al., J". Mol. Biol. 215:403-410 (1993); véase, además, la explicación del algoritmo BLAST en el sitio en la web del National Center for Biotechnology Information at the National Library of Medicine of the National Institutes of Health) . Las secuencias de nucleótidos de genes similares que codifican proteínas que contienen el dominio SNF2 , tales como las descritas en los Ejemplos 8A-C, se pueden amplificar por PCR mediante cualquiera de los siguientes métodos.

Método 1 (basado en AR ) : Si la información acerca de las secuencias 5' y 3' de la región codificante de la proteína está disponible se pueden diseñar cebadores específicos para los genes tal como se describe en el Ejemplo 5. Se puede usar RT-PCR con el ARN de la planta para obtener un fragmento de ácido nucleico que contiene la región codificante de proteínas contigua a las secuencias de attBl (sec. con núm. de ident.: 12) y attB2 (sec. con núm. de ident. : 13) . El cebador puede contener una secuencia consenso de Kozak (CAACA) corriente arriba del codón de inicio.

Método 2 (basado en ADN) : Alternativamente, si un clon de ADNc está disponible, el inserto completo de ADNc (que contiene las regiones 5' y 3' no codificantes) se puede amplificar por PCR. Se puede diseñar cebadores directos e inversos que contengan ya sea la secuencia attBl y- la secuencia específica del vector que precede el inserto de ADNc o la secuencia attB2 y la secuencia específica del vector que sigue al inserto de ADNc, respectivamente. Para clonar un inserto de ADNc en el vector pBLUESCRIPT SK+, se puede usar el cebador directo VC062 (sec. con núm. de ident . : 16) y el cebador inverso VC063 (sec. con núm. de ident. : 17) .

Método 3 (ADN genómico) : Las secuencias genómicas se pueden obtener por medio de PCR genómica de captura de, largo alcance. Los cebadores se pueden diseñar en base a la secuencia del locus genómico, y el producto de PCR resultante se puede secuenciar. La secuencia se puede analizar con el programa FGENESH (Salamov, A. y Solovyev, V. (2000) Genome Res., 10:516-522) y, opcionalmente , se puede alinear con secuencias homologas de otras especies para facilitar la identificación de intrones y exones simulados.

Los métodos 1, 2 y 3 se pueden modificar de conformidad con los procedimientos conocidos por una persona con experiencia en la técnica. Por ejemplo, los cebadores del método 1 pueden contener sitios de restricción en vez de sitios attBl y attB2, para la clonación posterior del producto de la PCR en un vector que contiene sitios attBl y attB2. Además, el método 2 puede requerir la amplificación de un clon de ADNc, un clon lambda, un clon BAC o ADN genómico.

Un producto de la PCR obtenido por cualquiera de los métodos anteriores se puede combinar con el vector donante de · GATEWAY®, tal como pDONR™Zeo (sec. con núm. de ident . : 2; Fig. 2) o pDONR™221 (sec. con núm. de ident.: 3; Fig. 3) mediante una reacción de recombinación BP. Este proceso elimina el gen letal bacteriano ccdB, así como el gen resistente al cloranfenicol (CAM) de pD0NR™Zeo o pDONR™221 y clona direccionalmente el producto de la PCR con sitios attBl y attB2 contiguos para crear un clon de entrada. Con la tecnología de INVITROGEN™ GATEWAY® CLONASE™, la secuencia que codifica el polipéptido que contiene el dominio SNF2 homólogo del clon de entrada se puede transferir después a un vector objetivo adecuado, tal como pBC-amarillo (sec. con núm. de ident.: 4; Fig. 4), PHP27840 (sec. con núm. de ident.: 5 ; Fig. 5) o PHP23236 (sec. con núm. de ident.: 6; Fig. 6), para obtener un vector de expresión vegetal para usar con Arabidopsis, frijol de soya y maíz, respectivamente.

Los sitios attPl y attP2 de vectores donantes pDONR™/Zeo o pDONR™221 se ilustran en las Figuras 2 y 3, respectivamente. Los sitios attRl y attR2 de los vectores objetivo pBC-amarillo, PHP27840 y PHP23236 se ilustran en las Figuras 4, 5 y 6, respectivamente.

Alternativamente, se puede realizar una reacción de recombinación LR de MultiSite GATEWAY® entre múltiples clones de entrada y un vector objetivo adecuado para crear un vector de expresión.

Ejemplo 10 Preparación de vectores de expresión del frijol de soya y transformación del frijol de soya con genes guía de Arabidopsis validados Las plantas de frijol de soya se pueden transformar para sobreexpresar cada gen de Arabidopsis validado o los homólogos correspondientes de diversas especies para examinar el fenotipo resultante.

El mismo clon de entrada GATEWAY® descrito en el Ejemplo 5 se puede usar para clonar direccionalmente cada gen en el vector PHP27840 (sec. con núm. de ident . : 5; Fig. 5) de tal forma que la expresión del gen esté controlada por el promotor SCP1.

Los embriones de frijol de soya se pueden transformar con el vector de expresión que comprende secuencias que codifican los polipéptidos instantáneos. Las técnicas para transformar y regenerar el frijol de soya se han descrito en la publicación de patente internacional núm. WO 2009/006276, cuyo contenido se incorpora en la presente descripción como referencia.

Las plantas TI se pueden cultivar en condiciones de limitación de nitrógeno, por ejemplo, 1 mM nitrato y se pueden analizar para determinar los cambios fenotípicos. Los parámetros siguientes se pueden cuantificar por medio de análisis de imágenes: el área de la planta, el volumen, el índice de crecimiento y el análisis del color se- pueden recolectar y cuantificar. Los constructos de sobreexpresion que producen una alteración, cuando se compara con las plantas de control adecuadas, en el verdor (ancho del intervalo del color verde) , producción, índice de crecimiento, biomasa, peso fresco o seco en la maduración, producción de frutos o semillas, contenido total de nitrógeno en la planta, contenido de nitrógeno en los frutos o semillas, contenido de nitrógeno en el tejido vegetativo, contenido de aminoácidos libres en la planta entera, contenido de aminoácidos libres en el tejido vegetativo, contenido de aminoácidos libres en los frutos o semillas, contenido de proteínas en los frutos o semillas o contenido de proteínas en un tejido vegetativo se pueden considerar como evidencia de que el gen guía de Arabidopsis actúa en el frijol de soya para mejorar la tolerancia a la privación de nitrógeno (mayor tolerancia al nitrógeno) .

Las plantas de frijol de soya transformadas con genes validados se pueden analizar para estudiar las características agronómicas en relación con plantas de control o de referencia. Por ejemplo, la mejora en la producción y/o la estabilidad se pueden probar en concentraciones bajas y altas de nitrógeno (por ejemplo, condiciones de limitación de nitrógeno y cantidad suficiente de nitrógeno) .

Ejemplo 11 Transformación de maíz con genes guía de Arabidopsis validados mediante bombardeo de partículas Las plantas de maíz se pueden transformar' para sobreexpresar un gen guía de Arabidopsis validado o los homólogos correspondientes a partir de varias especies para examinar el fenotipo resultante.

Los clones de entrada de GATEWAY® descritos en el Ejemplo 5 se pueden usar para clonar direccionalmente cada gen respectivo en un vector de transformación de maíz. La expresión del gen en el vector de transformación dé maíz puede estar controlada por un promotor constitutivo, tal como el promotor de maíz de ubiquitina (Christensen et al., Plant Mol. Biol . 12:619-632 (1989) y Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18:675-689 (1992)) Después, el constructo de ADN recombinante descrito anteriormente se puede introducir en células de maíz mediante bombardeo con partículas. Las técnicas para la transformación del maíz mediante bombardeo con partículas se han descrito en la publicación de patente internacional núm. WO 2009/006276, cuyo contenido se incorpora en la presente descripción como referencia.

Las plantas TI se pueden cultivar en condiciones de limitación de nitrógeno, por ejemplo, 1 mM nitrato y se pueden analizar para determinar los cambios fenotípicos. Los parámetros siguientes se pueden cuantificar por medio de análisis de imágenes: el área de la planta, el volumen, el índice de crecimiento y el análisis del color se pueden recolectar y cuantificar. Los constructos de sobreexpresión que producen una alteración, cuando se comparan con las plantas de control adecuadas, en el verdor (ancho del intervalo del color verde) , producción, índice de crecimiento, biomasa, peso fresco o seco en la maduración, producción de frutos o semillas, contenido total de nitrógeno en la planta, contenido de nitrógeno en los frutos o semillas, contenido de nitrógeno en el tejido vegetativo, contenido de aminoácidos libres en la planta entera, contenido de aminoácidos libres en el tejido vegetativo, contenido de aminoácidos libres en los frutos o semillas, contenido de proteínas en los frutos o semillas o contenido de proteínas en un tejido vegetativo se pueden considerar como evidencia de que el gen guía de Arabidopsis actúa en el maíz para mejorar la tolerancia a la privación de nitrógeno (mayor tolerancia al nitrógeno) .

Ejemplo 12 Electroporación de Agrobacterium turnefaciens LBA4404 Las células competentes con la electroporación (40 µL) , tales como Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (que contienen PHP10523) , se descongelan en hielo (20-30 min) . El PHP10523 contiene genes VIR para la transferencia de T-ADN, un origen de replicación de plásmido con un número de copia bajo de Agrobacterium, un gen de resistencia a la tetraciclina y un sitio Cos para la recombinación biomolecular de ADN in vivo. Mientras tanto, la cubeta de electroporación se enfría en hielo. La configuración del electroporador se determina para ser 2.1 kV. Una alícuota de ADN (0.5 uL de ADN parental a una concentración de 0.2 µg -1.0 µg en tampón de poca sal o H20 destilada dos veces) se mezcla con las células de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 descongeladas mientras aún están en el hielo. La mezcla se transfiere al fondo de la cubeta de electroporación y se deja en reposo en el hielo durante 1 a 2 minutos. Las células se electroporan (electroporador Eppendorf 2510) al presionar el botón "pulse" dos veces (idealmente, hasta alcanzar un pulso de 4.0 mi1isegundos) . Posteriormente, se agrega 0.5 mi del medio 2xYT (o medio SOC) a temperatura ambiente en la cubeta y se transfiere a un tubo con tapa a presión de 15 mi (por ejemplo, tubo FALCON™) . Las células se incuban a 28-30 °C, 200-250 rpm durante 3 h.

Se esparcen alícuotas de 250 uL sobre placas que contienen medio YM y 50 ug/ml de espectinomicina y se incuban durante tres días a 28-30 °C. Para incrementar la cantidad de transformantes, se puede realizar uno de dos pasos opcionales: Opción 1: Cubrir las placas con 30 uL de rifampicina de 15 mg/ml . El LBA4404 tiene un gen de resistencia crompsómica para la rifampicina. Esta selección adicional elimina algunas colonias contaminantes observadas cuando se usa preparaciones más deficientes de células competentes de LBA4404.

Opción 2: Hacer dos réplicas de la electroporación para compensar las células electrocompetentes de menor calidad. Identificación de transformantes: Cuatro colonias independientes se escogen y se dispersan en placas que contienen un medio mínimo AB y 50 µg/ml de espectinomicina para aislar las colonias simples. Las placas se incuban a 28 °C durante dos a tres días. Se elige una única colonia por cada cointegrado simulado y esa colonia se inocula con 4 mi de 10 g/1 de bactopeptona, 10 g/1 de extracto de levadura, 5 g/1 cloruro sódico y 50 mg/1 de espectinomicina. La mezcla se incuba durante 24 h a 28 °C con agitación. Se aisla el ADN plasmídico de los 4 mi de cultivo por medio de la minipreparación QIAGEN® Miniprep y un tampón de lavado PB opcional. El ADN se eluye en 30 µL . Se usan alícuotas de 2 µL para electroporar 20 µL de DHlOb + 20 µL de H20 destilada dos veces, según se describió anteriormente. Opcionalmente , se puede usar una alícuota de 15 µL para transformar 75-100 µL de INVITROGEN™ a. Las células se diseminan en placas que contienen medio LB y 50 µg/ml de espectinomicina y se incuban a 37 °C durante la noche.

Se eligen tres a cuatro colonias independientes para cada cointegrado simulado y esas colonias se inoculan con 4 mi de medio 2xYT (10 g/1 de bactopeptona, 10 g/1 de extracto de levadura, 5 g/1 de cloruro sódico 5 g/1) con 50 pg/ml de espectomicina . Las células se incuban a 37 °C durante la noche con agitación. Después, el ADN plasmídico se aisla de los 4 mi de cultivo por medio de la minipreparación QIAprep® Miniprep con lavado con tampón PB opcional (eluido en 50 µ??) . Se usan 8 L para la digestión con Salí (con ADN parental y PHP10523 como controles) . Se realizan otras tres digestiones más con el uso de las enzimas de restricción BamHI , EcoRI y HindIII para 4 plásmidos que representan 2 cointegrados simulados con patrón de digestión de Salí correcto (con el uso de ADN parental y PHP10523 como controles) . Se recomienda geles electrónicos para comparación.

Ejemplo 13 Transformación del maíz con el uso de Agrobacterium Las plantas de maíz se pueden transformar para sobreexpresar un gen guía de Arabidopsis validado o los homólogos correspondientes a partir de varias especies para examinar el fenotipo resultante.

La transformación de maíz mediada por Agrobacterium se realiza prácticamente como lo describen Zhao et al., en Meth. Mol. Biol. 318:315-323 (2006) (véanse también Zhao y col., Mol. Breed. 8:323-333 (2001) y la patente de los Estados Unidos núm. 5,981,840 concedida el 9 de noviembre de 1999, incorporada en la presente descripción como referencia) . El proceso de transformación implica la inoculación de bacterias, cocultivo, reposo, selección y regeneración de la planta. 1. Preparación de embriones inmaduros: Los embriones inmaduros de maíz se separan de las cariopses y se colocan en un microtubo de 2 mi que contiene 2 mi de medio PHI-A. 2. Infección por Agrobacte ium y cocultivo de embriones inmaduros : 2.1 Etapa de infección: Se retira el medio PHI-A de (1) con una micropipeta de 1 mi , y se añade 1 mi de suspensión de Agrobacteriüm. El tubo se invierte cuidadosamente para mezclar. La mezcla se incuba durante 5 min a temperatura ambiente . 2.2. Etapa de cocultivo: La suspensión de Agrobacteriüm se retira de la etapa de infección con una micropipeta de 1 mi . Con el uso de una espátula estéril, los embriones se desprenden del tubo y se transfieren a una placa de medio PHI-B en una caja petri de 100x15 mm. Los embriones se orientan con su eje hacia: abajo sobre la superficie del medio. Las placas con los embriones se cultivan a 20 °C, en la oscuridad, durante tres días. Se puede usar L-cisteína en la fase de cocultivo. Con el vector binario estándar, el medio de cocultivo proporcionado con 100-400 mg/1 de L-cisteína es crítico para recuperar eventos transgénicos estables. 3. Selección de eventos transgénicos putativos: Se transfieren 10 embriones a cada placa de medio PHI-D en una placa de Petri de 100x15 mm, en tanto que se mantiene la orientación, y las placas se sellan con Parafilm. Las placas se incuban en la oscuridad a 28 °C. Se espera que los eventos simulados de crecimiento activo, evidenciados como tejido embrionario amarillo pálido, sean visibles en seis a ocho semanas. Los embriones que no producen eventos pueden ser. cafés y necróticos y el poco crecimiento de tejido friable es evidente. El tejido embrionario transgénico putativo se subcultiva en placas de PHI-D fresco en intervalos de dos a tres semanas, dependiendo del índice de crecimiento. Se registran los eventos. 4. Regeneración de vegetales T0 : El tejido embrionario propagado en medio PHI-D se subcultiva en medio PHI-E (medio de maduración de embrión somático) , en cajas petri de 100x25 mm y se incuban a 28 °C, a oscuras, hasta que maduran los embriones somáticos, durante aproximadamente diez a dieciocho días. Los embriones somáticos maduros e individuales con escutelo y coleóptilo bien definidos se transfieren al medio de germinación de embriones PHI-F y se incuban a 28 °C en la luz (aproximadamente a 80 µ? de las lámparas de luz blanca o lámparas fluorescentes equivalentes) . En siete a diez días, las plantas regeneradas de aproximadamente 10 cm de altura se colocan en macetas en una mezcla hortícola y endurecida con el uso de métodos hortícolas estándar.

Medios para la transformación vegetal : 1. PHI-A: 4 g/1 de sales básales de CHU, 1.0 ml/1 de mezcla de vitaminas de Eriksson 1000X, 0.5 mg/1 de tiamina HCl, 1.5 mg/1 de 2,4-D, 0.69 g/1 de L-prolina, 68.5 g/1 de sacarosa, 36 g/1 de glucosa, pH 5.2. Se adicionan 100 µ? de acetosiringona (esterilizada con filtro) . 2. PHI-B: PHI-A sin glucosa, se incrementa la cantidad de 2,4-D hasta 2 mg/1, se reduce la cantidad de sacarosa hasta 30 g/1 y se suplementa con 0.85 mg/1 de nitrato de plata (esterilizado con filtro), 3.0 g/1 de GELRITE®, 100 µ? de acetosiringona (esterilizada con filtro), pH 5.8. 3. PHI-C: PHI-B sin GELRITE® y acetosiringona, se reduce el 2,4-D. a 1.5 mg/1 y se suplementa con 8.0 g/1 de agar, 0.5 g/1 de tampón de ácido 2-[N-morfolino] etanosulfónico (MES), 100 mg/1 de carbenicilina (esterilizada con filtro) . 4. PHI-D: PHI-C suplementado con 3 mg/1 de bialafos (esterilizado con filtro) . 5. PHI-E: 4.3 g/1 de sales de Murashige and Skoog (MS) , (GIBCO, BRL 11117-074), 0.5 mg/1 de ácido nicotínico, 0.1 mg/1 de tiamina HC1, 0.5 mg/1 de piridoxina HC1 , 2.0 mg/1 de glicina, 0.1 g/1 de mio-inositol , 0.5 mg/1 de zeatina (Sigma, cat . núm. Z-0164) , 1 mg/1 de ácido indol acético (AIA) , 26.4 ug/l de ácido abscísico (ABA), 60 g/1 de sacarosa, 3 mg/1 de bialafos (esterilizados con filtro) , 100 mg/1 de carbenicilina (esterilizada con filtro), 8 g/1 de agar, pH 5.6. 6. PHI-F: PHI-E sin zeatina, IAA, ABA; se reduce la cantidad de sacarosa a 40 g/1; se reemplaza el agar con 1.5 g/1 de GELRITE® ; pH 5.6.

Las plantas pueden regenerarse a partir del callo transgénico al transferir primeramente grupos de tejido al medio N6 suplementado con 0.2 mg por litro de 2,4-D. Después de dos semanas el tejido se puede transferir al medio regenerativo (Fromm et al., Bio/Technology 8:833-839 (1990)).

Las plantas transgénicas T0 se pueden regenerar, y se puede determinar su fenotipo. Se puede recolectar semillas TI.

Además, se puede introducir un constructo de ADN recombinante que contiene un gen de Arabidopsis validado en una línea de maíz endogámica, ya sea mediante transformación directa o introgresión de una línea transformada por separado.

Las plantas transgénicas, ya sea endogámicas o híbridas, se pueden probar mediante estudios de campo más intensos para analizar la mejora en la producción y/o estabilidad en condiciones de limitación de nitrógeno y sin limitación de nitrógeno.

El análisis de producción posterior se puede realizar para determinar si las plantas que contienen el gen guía de Arabidopsis validado tienen una mejora en el rendimiento de -producción (en condiciones de limitación de nitrógeno o sin limitación de nitrógeno) , cuando se comparan con las plantas de control (o de referencia) que no contienen el gen guía de Arabidopsis validado. Las plantas que contienen el gen guía de Arabidopsis validado tendrían una pérdida menor de la producción que las plantas de control, por ejemplo, una pérdida de la producción al menos 25 % menor, en condiciones de nitrógeno limitado, o tendrían una producción mayor que las plantas de control en condiciones en las que el nitrógeno no está limitado.

Ejemplo 14A Preparación del vector de expresión para la transformación de líneas de maíz con el gen candidato de Arabidopsis validado (Atlg61140) mediante el uso de Agrojbacterium Con la tecnología de INVITROGEN™ GATEWAY®, se realizó una reacción de recombinación LR con el clon de entrada de GATEWAY® que contiene la secuencia que codifica la proteína de Arabidopsis que contiene el dominio SNF2 (descrita en el Ejemplo 5 y a la que se hace referencia en este ejemplo y en los posteriores como AT-SNF2.1), el clon de entrada PHP23112 (sec. con núm. de ident . : 14), el clon de entrada PHP20234 (sec. con núm. de ident.: 9; Fig. 9) y el vector objetivo PHP22655 (sec. con núm. de ident.: 10) para generar el plásmido precursor PHP29872. El PHP29872 contiene los siguientes casetes de expresión: 1. Cásete del promotor de ubiquitina : : moPA : : terminador Pinll que expresa el gen PAT de resistencia a herbicidas usado para la selección durante el proceso de transformación. 2. Cásete del promotor LTP2 : :DS-RED2 :: terminador Pinll que expresa el gen marcador de color DS-RED usado para la selección de las semillas. 3. Cásete del promotor de ubiquitina : : AT-SNF2.1 :: terminador Pinll que sobreexpresa la proteína que contiene el dominio SNF2.1 de Arabidopsis (Atlg61140.1) .

Ejemplo 14B Transformación de líneas de maíz con el gen candidato de Arabidopsis validado (Atlg61140) con Agrobacterium El cásete de expresión de SNF2.1 presente en el vector PHP29872 (descrito en el Ejemplo 14A) o los vectores que contienen cualquiera de las otras dos variantes de Atlg61140 se puede introducir en una línea endogámica de maíz o una línea transformable de maíz derivada de una línea endogámica de élite del maíz por medio de transformación mediada por Agrobacterium, tal como se describe en los Ejemplos 12 y 13.

El vector de expresión PHP29872 se puede electroporar en la cepa LBA4404 de Agrobacterium que contiene el vector PHP10523 (sec. con núm. de ident.: 7, Fig. 7) para crear el vector cointegrado PHP29875 que contiene el cásete de expresión de SNF2.1. El vector cointegrado se forma mediante la recombinación de los dos plásmidos, PHP29872 y PHP10523, a través de los sitios de recombinación de COS contenidos en cada vector y contiene los mismos tres casetes de expresión anteriores (Ejemplo 14A) además de otros genes (TET, TET, TRFA, terminador ORI, CTL, ORI V, VIR Cl, VIR C2 , VIR G, VIR B) necesarios para la transformación de la cepa de Agrobacterium y la transformación mediada por Agrobacterium. Se podría usar el protocolo de electroporación del Ejemplo 12, sin limitarse a él.

Ejemplo 15 Preparación del vector objetivo PHP23236 para la transformación en líneas de maíz derivadas de Gaspe Flint El vector objetivo PHP23236 (Fig. 6; sec. con núm. de ident.: 6) se obtuvo mediante la transformación de la cepa de Agrobacterium LBA4404 que contiene PHP10523 (Fig. 7; sec. con núm. de ident. : 7) con el vector PHP23235 (Fig. 8; sec. con núm. de ident. : 8) y el aislamiento del producto de cointegración resultante.

El vector objetivo PHP23236 se puede usar en una reacción de recombinación con un clon de entrada, tal como se describe en el Ejemplo 16, para crear un vector de expresión del maíz para la transformación de líneas de maíz derivadas de Gaspe Flint.

Ejemplo 16 Preparación de constructos de expresión para la transformación en líneas de maíz derivadas de Gaspe Flint Con la tecnología de recombinación LR INVITROGEN™ GATEWAY®, el mismo clon de entrada descrito en el Ejemplo 5 se puede clonar direccionalmente en el vector objetivo PHP29634 (sec. con núm . de ident . : 15; Fig. 11) para crear un vector de expresión. El vector objetivo PHP29634 es similar al vector objetivo PHP23236; sin embargo, el vector objetivo PHP29634 tiene sitios de recombinación específica del sitio FRT1 y FRT87 y, además, codifica la proteína marcadora seleccionable GAT4602 para la selección de transformantes por medio de glifosato. El vector de expresión contendría el ADNc de interés que codifica At-SNF2.1, At-SNF2.2 o AtSNF2.3 bajo el control del promotor UBI y es un vector binario de T-ADN para la transformación mediada por Agrojbacterium en maíz tal como se describe en, pero sin limitarse a, los ejemplos descritos en la presente invención.

Ejemplo 17A Transformación de líneas de maíz derivadas de Gaspe Flint con el gen candidato de Arabidopsis validado (Atlg61140) Las plantas de maíz se pueden transformar: para sobreexpresar el gen de Arabidopsis Atlg61140 (y los homólogos correspondientes de otras especies) para examinar el fenotipo resultante. Se podrían usar los constructos de expresión, tales como el descrito en el Ejemplo 16.

Plantas receptoras Las células de plantas receptoras pueden ser de una línea de maíz uniforme con un ciclo de vida corto ("ciclo rápido"), un tamaño reducido y un potencial alto de transformación. Típico de estas células vegetales para maíz son las células vegetales de cualquiera de las variedades de líneas de Gaspe Flint (GF) disponibles al publicó. Una variedad posible de la línea de plantas candidato es el híbrido Fl de GF x QTM (Quick Turnaround Maize, una forma disponible al público de Gaspe Flint seleccionada para el crecimiento en condiciones de invernadero) descrito en Tomes et al. (solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 10/367,416 presentada el 13 de febrero de 2003; publicación de patente de los Estados Unidos núm. 2003/0221212 Al publicada el 27 de noviembre de 2003) . Las plantas transgénicas obtenidas de esta línea tienen un tamaño reducido tal que se pueden cultivar en macetas de 10.2 cm (cuatro pulgadas) (1/4 del espacio necesario para una planta de maíz de tamaño normal) y que maduran en menos de 2.5 meses. (Tradicionalmente , para obtener la semilla transgénica T0 una vez que las plantas transgénicas se aclimatan al invernadero se requieren 3.5 meses) . Otra línea adecuada incluye, pero no se limita, a una línea haploide doble de X Gaspe Flint de GS3 (un línea altamente transformable) . Otra línea adecuada adicional es una línea endogámica de maíz de élite transformable que lleva un transgén que causa floración, estatura reducida o ambas.

Protocolo de transformación Para introducir los transgenes en las células del maíz se podría usar cualquier método adecuado que incluye, pero no se limita a, los procedimientos de inoculación que emplean vectores basados en Agrobacterium (véase, por ejemplo, los Ejemplos 12 y 13) . La transformación se podría realizar en embriones inmaduros de la planta receptora (objetivo).

Cultivo de precisión y seguimiento de las plantas La población del evento de las plantas transgénicas (TO) resultante de los embriones de maíz transformado se cultiva en un ambiente controlado de invernadero con el uso de un diseño de bloqueo aleatorizado modificado para reducir o eliminar el error ambiental. Un diseño de bloques aleatorizado es una presentación vegetal en donde las plantas experimentales se dividen en grupos (por ejemplo, treinta plantas por grupo) denominados bloques y a cada planta se le asigna aleatoriamente un lugar dentro del bloque.

Para un grupo de treinta plantas se colocan veinticuatro plantas de experimento transformadas y seis plantas de control (plantas con un fenotipo determinado) (colectivamente, un "grupo de réplicas") en macetas dispuestas en un arreglo (mencionado también como un bloque o grupo de réplicas) sobre una mesa ubicada dentro de un invernadero. Cada planta, de control o de experimento, se asigna aleatoriamente a un lugar dentro del bloque demarcado en el mapa con respecto a un lugar físico único del invernadero y al grupo de réplicas. Múltiples grupos de réplicas de treinta plantas cada una se pueden cultivar en el mismo invernadero en un solo experimento. La presentación (arreglo) de los grupos de réplicas debería determinarse para minimizar los requerimientos de espacio, así como los efectos ambientales dentro del invernadero. Tal presentación puede denominarse presentación de invernadero comprimido.

Una alternativa a la adición de un grupo de control específico es identificar las plantas transgénicas que no expresan el gen de interés. Una gran variedad de técnicas, tales como TI-PCR, se puede aplicar para analizar cuantitativamente el nivel de expresión del gen introducido. Las plantas TO que no expresan el transgén se pueden comparar con las que sí lo expresan.

Cada planta en la población del evento se identifica y se monitorea por todo el proceso de evaluación y la información recopilada de esa planta se asocia automáticamente con esa planta, de modo que la información recopilada se puede asociar con el transgén transportado por la planta. Por ejemplo, cada contenedor de plantas puede tener una etiqueta legible para computadora (tal como un código de barras del Código Universal de Productos (UPC, por sus siglas en inglés) ) que incluye la información de la identidad de la planta, que a su vez se correlaciona con una localidad del invernadero, de modo que la información obtenida de la planta se puede asociar automáticamente con esa planta.

Alternativamente, se puede usar cualquier sistema de identificación de plantas eficiente y legible para computadora, tal como códigos de matriz bidimensional o incluso etiquetas de identificación por radiofrecuencia (RFID, por sus siglas en inglés) , en donde la información se recibe y se interpreta por un receptor/procesador de radiofrecuencias. Véase la solicitud de los Estados Unidos núm. 10/324,288 presentada el 19 de diciembre de 2002 (publicación de patente de los Estados Unidos núm. 2004/0122592 Al publicada el 24 de junio de 2004) incorporada en la presente descripción como referencia.

Análisis fenotípico con el uso de imágenes tridimensionales Cada planta del invernadero en la población del evento TO, incluso cualquier planta de control, se analiza por las características agronómicas de interés y . la información agronómica para cada planta se registra o se almacena de modo que se asocie con información que la identifique (ver arriba) La confirmación de un fenotipo (efecto de los genes) se puede obtener en la generación TI con un diseño experimental similar al descrito anteriormente.

Las plantas TO se analizan a nivel fenotípico con el uso de tecnología de imágenes cuantitativa y no destructiva por medio del ciclo de vida completo en invernadero de las plantas para analizar las cepas de interés. Opcionalmente , se usa un analizador digital de imágenes para el análisis multidimensional y automático de las plantas completas. La obtención de imágenes se puede realizar adentro del invernadero. Para ver la planta de todos lados se usa dos sistemas de cámara colocados en la parte superior y al lado, así como un aparato para girar la planta. Las imágenes se obtienen desde la parte superior, frontal y a un lado de cada planta. Las tres imágenes juntas proporcionan suficiente información para evaluar, por ejemplo, la biomasa, el tamaño y la morfología de cada planta.

Debido al cambio en el tamaño de las plantas desde el momento en que aparece la primera hoja del suelo hasta el momento en que las plantas se encuentran en el final de su desarrollo, las etapas tempranas del desarrollo de la planta se documentan, opcionalmente, con una magnificación mayor desde la parte superior. Esta obtención de imágenes se -podría lograr con el uso de un sistema de lentes de acercamiento motorizado controlado completamente por el programa de imágenes.

En una sola operación de análisis de imágenes, ocurren los siguientes eventos: (1) la planta se lleva dentro del área del analizador, se gira 360 grados de modo que su etiqueta legible para la computadora se pueda leer y se deja en reposo hasta que sus hojas dejen de moverse; (2) la imagen lateral se toma y se ingresa en una base de datos; (3) la planta se gira 90 grados y nuevamente se deja en reposo hasta que sus hojas dejen de moverse y (4) la planta se retira del analizador.

Las plantas se dejan por lo menos seis horas en la oscuridad por un período de veinticuatro horas para que tengan un ciclo normal de día/noche.

Instrumentación de imágenes Se puede usar cualquier tipo de instrumentación de imágenes, incluso, pero sin limitarse a, la instrumentación de imágenes digital de espectro de luz comercialmente disponible de LemnaTec GmbH of Wurselen, Alemania. Las imágenes se toman y se analizan con un LemnaTec Scanalyzer HTS LT-0001-2 con un dispositivo de imágenes IT Progressive Sean IEE CCD de 1.3 cm (1/2"). Las cámaras de imágenes se podrían equipar con acercamiento motorizado, apertura motorizada y enfoque motorizado. Toda la configuración de la cámara se puede realizar con el uso del programa LemnaTec. Opcionalmente, la variación instrumental del analizador de imágenes es menor que aproximadamente 5 % para componentes mayores y menor que aproximadamente 10 % para componentes menores.

Programas El sistema de análisis de imágenes comprende un programa informático de LemnaTec HTS Bonit para análisis de color y arquitectura y una basa de datos del servidor para almacenar datos desde aproximadamente 500,000 análisis, que incluyen las fechas de análisis. Las imágenes originales y las imágenes analizadas se almacenan juntas para permitir que el usuario reanalice tanto como desee. La base de datos se puede conectar al hardware de imágenes para la recolección y almacenamiento automático de datos. Se puede usar una gran variedad de sistemas de programas disponibles comercialmente (por ejemplo, Matlab y otros) para la interpretación cuantitativa de los datos de imágenes, así como cualquiera de estos sistemas de programas para aplicarlo al conjunto de datos de imágenes.

Sistema transportador Se puede usar un sistema transportador con un dispositivo giratorio de plantas para transportar las plantas al área de imágenes y girarlas durante la obtención de las imágenes. Por ejemplo, hasta cuatro plantas, cada una con una altura máxima de 1.5 m, se colocan en carros para pasar sobre el sistema transportador circular y por el área de medición de imágenes. En este caso, la huella total de la unidad (analizador de imágenes y lazo del transportador) es de aproximadamente 5 m x 5 m.

El sistema transportador se puede agrandar para acomodar más plantas a la vez. Las plantas se transportan a lo largo del lazo del transportador hacia el área de imágenes y se analizan hasta 50 segundos por planta. Se toman las vistas de la planta. El sistema transportador, así como el equipo de imágenes, debe poder usarse en condiciones ambientales de invernadero.

Iluminación Cualquier modo adecuado de iluminación se puede usar para la captación de imágenes. Por ejemplo, se puede usar una luz en la parte superior sobre un fondo negro. Alternativamente, se puede usar una combinación de luz superior y posterior con un fondo blanco. El área iluminada se debe encerrar para asegurar condiciones constantes de iluminación. El alojamiento debe ser mayor que el área de medición de modo que prevalezcan las condiciones constantes de iluminación sin necesidad de abrir, cerrar o puertas. Alternativamente, la iluminación se puede variar para causar la activación ya sea del transgén (por ejemplo, proteína fluorescente verde (GFP, por sus siglas en inglés) , proteína fluorescente roja (RFP, por sus siglas en inglés) ) o de fluoróforos endógenos (por ejemplo, clorofila) ) . Cálculo de la masa en base a imágenes tridimensionales Para calcular mejor la biomasa, las imágenes de la planta deben tomarse por lo menos desde tres ejes, opcionalmente , la vista superior y dos vistas laterales (lados 1 y 2) . Después estas imágenes se analizan para separar la planta del fondo, de la maceta y de la bolsa de control de polen (si aplica) . El volumen de la planta se puede calcular mediante el cálculo: Volumen (voxeles)= jÁrea superior (pixeles) x^Área del lado 1 (pixeles)x^Área del lado 2 (pixeles,' En la ecuación anterior las unidades de volumen y área son "unidades arbitrarias" . Las unidades arbitrarias son completamente suficientes para detectar efectos genéticos en el tamaño y crecimiento de las plantas en este sistema ya que lo que se desea es detectar las diferencias (tanto las mayores-positivas como las menores-negativas) del medio experimental o del medio de control . Las unidades arbitrarias de tamaño (por ejemplo, área) podrían convertirse comúnmente en mediciones físicas mediante la adición de una referencia física al proceso de imágenes. Por ejemplo, una referencia física de área conocida se puede incluir tanto en el proceso de imágenes superiores como en el de imágenes laterales. En base al área de estas referencias físicas, se puede determinar un factor de conversión para permitir la conversión de pixeles a una unidad de área tal como centímetros cuadrados (cm2) . La referencia física puede o no ser una muestra independiente. Por ejemplo, la maceta, con un diámetro y altura conocidos, podría servir como una referencia física adecuada.

Clasificación de color La tecnología de imágenes también se puede usar para determinar color de la planta y para asignar los colores de las plantas a varias clases de color. La asignación del color de las imágenes a las clases de color es una característica propia del programa LemnaTec . Con otros sistemas de programas de análisis de imágenes, la clasificación de color se puede determinar por una gran variedad de planteamientos computacionales .

Para la determinación de los parámetros del tamaño y crecimiento de las plantas se presenta un esquema de clasificación útil para definir un esquema simple de color que incluye dos o tres degradaciones de verde (por ejemplo, tonos 50-66, véase la Fig. 13) y, además, una clase de color para clorosis, necrosis y blanqueamiento, si ocurrieran estas condiciones. También se usa una clase de color de fondo que incluye colores en la imagen que no son de plantas (por ejemplo, colores de macetas y suelo) y estos pixeles se excluyen, específicamente, de la determinación del tamaño. Las plantas se analizan bajo una iluminación constante controlada de modo que se pueda cuantificar cualquier cambio que se produce en una planta con el tiempo o entre plantas o lotes diferentes de plantas (por ejemplo, diferencias estacionales) .

Además de su utilidad en determinar el crecimiento de la planta, la clasificación de color se puede usar para analizar otras características del componente de producción. Para estas otras características del componente de producción se puede usar esquemas adicionales de la clasificación del color. Por ejemplo, la característica conocida como "siempre verde", que se ha asociado con mejorías en el rendimiento, se puede analizar mediante la clasificación de color que separa las degradaciones de verde de las sombras de amarillo y café (que son indicativos de tejidos senescentes). Si se aplica esta clasificación de color a las imágenes tomadas hacia eí final del ciclo de vida de las plantas T0 o TI, se puede identificar las plantas con cantidades aumentadas de colores de verde en relación con los colores amarillo o café (expresados, por ejemplo, como relación verde/amarillo) . Las plantas con una diferencia importante en esta relación verde/amarillo se pueden identificar como transgenes portadores que impactan esta característica agronómica importante.

El biólogo experto en plantas reconocerá que surgen otros colores de plantas que pueden indicar salud de la planta o respuesta al estrés (por ejemplo, antocianina) y que otros esquemas de clasificación de color pueden proporcionar medidas adicionales dé la acción genética en características relacionadas con estas respuestas.

Análisis de la arquitectura de la planta Los transgenes que modifican los parámetros de la arquitectura de la planta también se podrían identificar con el uso de la presente invención, incluso los parámetros tales como altura y anchura máxima, distancias internodales, ángulo entre las hojas y el tallo, cantidad de hojas que surgen de los nodulos y longitud de las hojas. El programa del sistema LemnaTec se puede usar para determinar la arquitectura de la planta de la siguiente manera. La planta se reduce a su arquitectura geométrica principal en una primera etapa de imágenes y después, en base a esta imagen, se puede realizar la identificación parametrizada de los diferentes parámetros de arquitectura. Los transgenés que modifican cualquiera de estos parámetros de arquitectura, ya sea solos o combinados, se pueden identificar mediante la aplicación de los enfoques estadísticos descritos anteriormente.

Fecha de esparcimiento del polen La fecha de esparcimiento del polen es un parámetro importante de analizar en una planta transformada y se puede determinar mediante la primera aparición en la planta de una flor macho activa. Para encontrar el elemento de la flor macho, el extremo superior del tallo se clasifica por color para detectar anteras amarillas o violeta. Este análisis de la clasificación de color después se usa para definir una flor activa, que a su vez se puede usar para calcular la fecha de esparcimiento del polen.

Alternativamente, el personal responsable del cuidado de la planta puede registrar la fecha de esparcimiento del polen y otros atributos de la planta fácilmente detectables por medio de la vista (por ejemplo, fecha de polinización, primera fecha de maduración) . Para maximizar la integridad de los datos y la eficacia del proceso, esta información se monitorea mediante el uso de los mismos códigos de barra usados por el dispositivo de análisis digital de espectro de luz de LemnaTec. Una computadora con lector de códigos de barras, un dispositivo digital personal o una computadora portátil se pueden usar para facilitar la captura de datos por medio de registrar las horas de observación, el identificador vegetal y el operador que captó los datos .

Orientación de las plantas Las plantas maduras de maíz cultivadas a densidades que se aproximan a la siembra comercial tienen, frecuentemente, una arquitectura plana. Es decir, la planta tiene un lado ancho claramente observable y un lado estrecho. La imagen de la planta está determinada por el lado ancho. Para cada planta se asigna una orientación básica bien definida para obtener la máxima diferencia entre el lado ancho y las imágenes de lado. La imagen superior se usa para determinar el eje principal de la planta y se usa un dispositivo giratorio adicional para posicionar la planta en la orientación adecuada antes de empezar la captación principal de imágenes.

Ejemplo 17B Transformación de líneas de maíz derivadas de Gaspe Flint con un homólogo de maíz Con la tecnología de recombinación L I VITROGEN™ GATEWAY® se podrían crear clones de entrada para cualquier homólogo del maíz (sec. con núm. de ident.: 18/19, 20/21, 22/23, 43/44 o 45/46) (véase en el Ejemplo 5 la preparación del clon de entrada) y se pueden clonar directamente en el vector objetivo de GATEWAY® 29634 (sec. con núm. de ident.: 15; Fig. 11) para crear los vectores de expresión correspondientes. Cada vector de expresión i podría contener el ADNc de interés controlado por el promotor UBI y sería un vector binario de T-ADN para la transformación mediada por Agrobacterium en maíz tal como se describe en, pero sin limitarse a los ejemplos descritos en la presente invención.

Ejemplo 18 Análisis de líneas de maíz en condiciones de limitación de nitrógeno Líneas de maíz derivadas de Gaspe Flint Las plantas transgénicas pueden contener dos o tres dosis de Gaspe Flint-3 con una dosis de GS3 (GS3/ (Gaspe-3) 2X o GS3/;(Gaspe-3)3X) y segregar 1:1 para un transgén dominante. Las plantas transgénicas se pueden sembrar en 100 % Turface, un medio comercial para plantar en maceta, y se pueden regar cuatro veces al día con medio de crecimiento KN03 1 mM y con KN03 2 mM o superior (véase la Fig. 14) . Las plantas de control cultivadas en medio KN03 1 mM tendrán menos verdor, producirán menos biomasa y tendrán una espiga más pequeña en la antesis (véase en la Fig. 15 una ilustración de los datos de la muestra) . Las líneas derivadas de Gaspe se cultivarían hasta la etapa de floración.

Las estadísticas se usarían para decidir si las diferencias observadas entre los tratamientos son realmente diferentes. La Figura 15 ilustra un método que coloca letras después de los valores . Los valores en la misma columna que tienen después la misma letra (no grupo de letras) no son significativamente diferentes. Con el uso de este método, si no hay letras después de los . valores en una columna, entonces no hay diferencias significativas entre ninguno de los valores en esa columna ó, en otras palabras, todos los valores en esa columna son iguales1.

La expresión de un transgén resultará en plantas con un crecimiento mejorado en K 03 1 mM cuando se compara con un nulo transgénico. Por lo tanto, durante el crecimiento se controlará la biomasa y el verdor (tal como se describe en los Ejemplos 2 y 17A) y se comparará con un nulo transgénico. Las mejoras ! en el crecimiento, el verdor y el tamaño de la espiga en la antesis serían indicadores de una mayor tolerancia al nitrógeno.

Análisis de la plántula Las plantas de maíz transgénico se pueden evaluar, además, mediante el análisis de la plántula que evalúa el rendimiento de la planta en condiciones de limitación de nitrógeno. En un análisis de plántulas de 18 días, por ejemplo, las plantas transgénicas se siembran en Turface, un medio comercial para plantar en macetas y, después, se riegan cuatro veces cada día con una solución que contiene los siguientes nutrientes: 1 mM CaCl2, 2 mM MgS04, 0.5 mM KH2P04, 83 ppm de Sprint330, 3 mM KC1, 1 mM K03, 1 uM ZnS04, 1 uM MnCl2, 3 uM H3B04, 0.1 uM CuS04 y 0.1 µ? NaMo04 , Las plantas se cosechan 18 días después de la siembra y se evalúan varias características que incluyen, pero no se limitan a: SPAD (verdor) , diámetro del tallo, peso seco de la raíz, peso seco del brote, peso seco total, mg de nitrógeno por gramo de peso seco (mg N/g dwt) y concentración de N de la planta. Los medios se comparan con los parámetros medios del nulo con una prueba t Student con un mínimo (P < t) de 0.1.

Ejemplo 19 Prueba de eficacia del uso de nitrógeno en plántulas Las semillas de eventos transgénicos se separaron en semilla Transgénica (Tratamiento 1; contiene el constructor PHP29875) y Nula (Tratamiento 2) con un marcador de color de semilla.

Los tratamientos (transgénico o grupo de nulos) se asignaron aleatoriamente a bloques de 54 macetas (unidades experimentales) dispuestas en 6 hileras por 9 columnas. Cada tratamiento (transgénico o grupo de nulos) se repitió 9 veces.

Todas las semillas se sembraron en macetas cuadradas de 10.2 cm (4 pulgadas) que contenían Turface en centros escalonados de 20,3 cm (8 pulgadas) y se regaron cuatro veces cada día con una solución que contenía los siguientes nutrientes: 1 mM CaCl2 2 raM MgS04 0.5 mM KH2P04 83 ppm de Sprint330 3 mM KC1 1 mM KN03 1 µ? ZnS04 1 uM MnCl2 3 µ? H3B04 1 µ? MnCl2 0.1 µ? CuS04 0.1 µ? NaMo04 Después del afloramiento, las plantas se redujeron a una semilla por maceta. En la cosecha, las plantas se retiraron de las macetas y el Turface se lavó de las raíces. Las raíces se separaron del brote, se colocaron en una bolsa de papel y se secaron a 70 °C durante 70 horas. Las partes secas de la planta (raíces y brotes) se pesaron y se colocaron en un tubo cónico de 50 mi con bolas de acero de aproximadamente 51.2 cm (20 5/32 pulgadas) y después se redujeron a polvo mediante agitación en un mezclador de pintura.

El analizador de nitrógeno/proteínas de Thermo Electron Corporation (modelo FlashEA 1112 N) usa aproximadamente 30 mg del tejido pulverizado. Una muestra se deja caer desde el Automuestreador en el crisol dentro de la cámara del reactor de oxidación. A 900 °C y con oxígeno puro, la muestra se oxida mediante una fuerte reacción exotérmica que crea una mezcla de gas de N2, C02, H20 y S<¾. Después de completar la combustión, el portador de gas helio se activa y la mezcla de gas fluye a la cámara de reacción de reducción. A 680 °C, la mezcla de gas fluye a través del cobre de reducción en donde los óxidos de nitrógeno posiblemente formados se convierten en nitrógeno elemental y el exceso de oxígeno se retiene. Desde el reactor de reducción, la mezcla de gas fluye a través de una serie de dos filtros de absorción. El primer filtro contiene cal sodada y retiene dióxidos de carbono y azufre. El segundo filtro contiene tamices moleculares y gel de sílice granular para detener el agua. Después, el nitrógeno se eluye en la columna cromatográfica y se transmite al detector de conductividad térmica que genera una señal eléctrica que, procesada adecuadamente por la aplicación informática Eager 300, proporciona el porcentaje de nitrógeno-proteína.

Con estos datos se midieron los siguientes parámetros y los valores medios de los parámetros del Transgénico se compararon con los valores medios de los parámetros del Nulo con una prueba t de Biomasa total de la planta (dwt (g) total) Biomasa de la raíz (dwt (g) de la raíz) Student : Biomasa del brote (dwt (g) del brote) Relación raíz/brote (relación dwt raíz: brote) Concentración de N de la planta (mg N / g dwt) N total de la planta (N (mg) total) La varianza se calculó dentro de cada bloque con un cálculo de análisis de varianza (ANOVA, por sus siglas en inglés) y un modelo de diseño completamente aleatorio (ORD, por sus siglas en inglés) . Se calculó un efecto global del tratamiento para cada bloque mediante una estadística F, en donde el cuadrado promedio del tratamiento global del bloque se dividió por el cuadrado promedio del error global del bloque.

Se calculó la probabilidad de una prueba t Student mayor para cada promedio del transgénico en comparación con el nulo correspondiente. Las variables que muestran una diferencia significativa (*) tienen un (P < t) mínimo de 0.1.

La Tabla 5 muestra los datos no procesados y la probabilidad de la prueba t Student de dos colas para plantas que contienen el constructo PHP29875. El símbolo matemático del valor p refleja el rendimiento relativo del evento en comparación con el nulo correspondiente, es decir, ' + ' = mayor rendimiento, '-' = menor rendimiento. Se realizaron comparaciones entre los eventos transgénicos y los constructos nulos. Un constructo nulo es una entrada negativa que se compone de un muestreo de semillas de los segregantes negativos y, por lo tanto, es una muestra representativa de todos los negativos.

Tabla 5. Datos del análisis de las plántulas en invernadero para PHP29875 d t (g) de la raíz dwt (g) del brote Fecha de siembra Nombre del . evento Media Nulo Prueba t Media Nulo Prueba t 8/11/2008 E7733 .53 .2. 2 0. .769 0. .758 0. 851 1. ,350 1. .342 0. 948 8/11/2008 E7733 .53 . 2 . 4 0. .811 0. ,758 0. 383 1 , .426 1. .342 0. 496 8/11/2008 E7733 .53 . 2 . 7.a 0 , .830 0. .758 0. 227 1. .520 1 , .342 0. 141 8/11/2008 E7733 .53 . 2 . 7.b 0 , .833 0. .758 0. 206 1. .529 1, .342 0. 123 0/11/2008 E7733 .53 .3. 13 0. .803 0 , .758 0. 444 1. .421 1, .342 0. 510 .9/2/2009 E7733 .53 .2. 19 0 , .778 0. .776 0. 963 1. .360 1, .330 0. 756 9/2/2009 E7733 .53 .2. 2 0. .800 0 , .776 0. 607 1. .366 1, .330 0. 713 9/2/2009 E7733 .53 .2. 20 0. .781 0. .776 0. 907 1. .350 1, .330 0. 836 9/2/2009 E7733 .53 .2. 25 0 .728 0, .776 -0 .316 1 .286 1 .330 -0 .646 9/2/2009 E7733 .53 .2. 4 0 .706 0 , .776 -0 .144 1 .204 1 .330 -0 .197 relación dwt de raíz: dwt (g) total brote Fecha de siembra Nombre del evento Media Nulo Prueba t Media Nulo Prueba t 8/11/2008 E7733. 53. .2 .2 2. .119 2. .100 0. 913 0. .575 0. ,569 0. 798 8/11/2008 E7733. 53. .2. .4 2. .238 2. .100 0. 444 0. .571 0. .569 0. 919 8/11/2008 E7733. 53 , .2 .7.a 2. .350 2. .100 0. 155 0 , .552 0. ,569 0. 445 8/11/2008 E7733. 53. .2 .7.b 2, .362 2, .100 0. 136 0. .546 0. ,569 0. 314 8/11/2008 E7733. 53. .3 .13 2, .224 2. .100 0. 475 0, .567 0. .569 0. 918 9/2/2009 E7733. 53 .2 .19 2. .138 2. .106 0. 816 0. .577 0, .583 -0 .829 9/2/2009 E7733. 53 .2 .2 2 .166 2. .106 0. 665 0. .593 0. .583 0. 707 9/2/2009 E7733. 53 .2 .20 2 .131 2 .106 0. 854 0 .581 0. .583 -0 .963 9/2/2009 E7733. 53 .2 .25 2 .013 2 .106 -0 .507 0 .568 0. .583 -ó .587 9/2/2009 E7733. 53 .2 .4 1 .910 2 .106 -0 .163 0 .596 0. .583 0. 638 mg N / g dwt N (mg) total Fecha de siembra Nombre del . evento Media Nulo Prueba t Media Nulo Prueba t 8/11/2008 E7733. .53 .2. 2 29. .700 26, .800 0. 265 39, .638 35. .542 0. 284 8/11/2008 E7733. .53 .2. 4 24. .813 ' 26 .800 0. 457 34 , .457 35. .542 0. 782 8/11/2008 E7733. .53 .2. 7.a 24. .878 26 .800 0. 458 37 .938 35 , .542 0. 529 8/11/2008 E7733. .53 .2. 7.b 25, .844 26 .800 0. 712 39 .253 35, .542 0. 331 8/11/2008 E7733. .53 .3. 13 25 , .278 26 .800 0. 557 34 .949 35, .542 0. 876 9/2/2009 E7733 .53 .2. 19 21, .722 21 .756 -0 .971 29 .197 28, .759 0. 791 9/2/2009 E7733 .53 .2. 2 22 .289 21 .756 0. 564 30 .363 28, .759 0. 334 9/2/2009 E7733 .53 .2. 20 22 .922 21 .756 0. 210 30 .644 28 .759 0. 257 9/2/2009 E7733 .53 .2. 25 23 .000 21 .756 0. 181 29 .289 28 .759 0. 748 9/2/2009 E7733 .53 .2. 4 21 .989 21 .756 0. 800 26 .311 28 .759 -0 .143 Ejemplo 20A Análisis de la producción de las líneas de maíz con los genes guía de Arabidopsis u homólogos de maíz Las plantas transgénicas , ya sea endogámicas o híbridos de progenie superior- inferior , se pueden probar mediante estudios de campo más intensos para analizar la mejora en la producción y/o estabilidad en condiciones de limitación de nitrógeno y sin limitación de nitrógeno. Típicamente, en una prueba estandarizada de la producción se realizarán de 4 a 6 replicaciones en por lo menos 4 lugares.

El análisis de la producción se puede realizar para determinar si las plantas que contienen el gen de Arabidopsis validado que codifica una proteína que contiene el dominio SNF2 o un gen de maíz relacionado que exhibe un mayor rendimiento de la producción (en condiciones de limitación de nitrógeno o sin limitación de nitrógeno) , cuando se comparan con las plantas de control (o de referencia) , tienen un constructo nulo o de tipo silvestre. Específicamente, las condiciones de limitación de nitrógeno se pueden imponer durante el periodo de floración y/o llenado del grano para las plantas que contienen el gen guía de Arabidopsis validado o un homólogo del maíz de lnt6 y para las plantas de control . La reducción en la producción se puede medir para ambas. Las plantas que contienen el gen guía de Arabidopsis validado o un homólogo del maíz de éste tendrían una pérdida de la producción menor que las plantas de control en condiciones de limitación de nitrógeno o una producción mayor que las plantas de control en condiciones en las cuales no se limita el nitrógeno.

Ejemplo 20B Análisis de la producción de líneas de maíz transformadas con PHP29875 Los cruzamientos de prueba del maíz híbrido que contiene el cásete de expresión del gen guía de Arabidopsis thaliana (que codifica un polipéptido que contiene el dominio SNF2) presente en el vector PHP29875 y sus controles se cultivaron en ambientes con bajo contenido de nitrógeno (LN) y contenido normal de nitrógeno (NN) en 2008 y en 2009 en varias ubicaciones. Un ambiente con bajo contenido de nitrógeno (LN) consiste en la aplicación de una cantidad de fertilizante de nitrógeno menor que la normal a principios de primavera o verano, mientras que un ambiente con un contenido normal de nitrógeno (NN) consiste en la adición de la cantidad de nitrógeno necesaria para obtener una producción normal, según los estándares de prueba del suelo establecidos para áreas de cultivo específicas por los servicios de extensión federal y estadual . En las condiciones LN se observó una reducción en la producción en comparación con la obtenida en condiciones NN. Para el análisis, un constructo nulo es una entrada negativa compuesta de segregantes negativos de todos los eventos dentro de · un constructo y un grupo de nulos es una entrada negativa compuesta por todos los segregantes negativos de todos los constructos de un experimento.

Nueve eventos transgénicos se probaron en campo en 2008 en dos lugares, York, NE (YK) y oodland, CA ( O) , y se analizó la producción. Las pruebas cruzadas de los híbridos del maíz se compararon con los constructos nulos (CN) . Los resultados de la prueba de campo de 2008 se incluyen en la Tabla 6.

Tabla 6 Pruebas de campo de 2008 para el maíz transformado con PHP29875 La unidad de medida es bushels/acre .

El sombreado representa un resultado significativamente más alto (P<0.1) en comparación con el constructo nulo (CN) .

Los valores en negrita representan un resultado significativamente más bajo (P<0.1) en comparación con el constructo nulo (CN) .

Ocho de los nueve eventos transgénicos probados anteriormente se probaron en campo en 2009 en los siguientes lugares: York, NE (YK) ; Marión, IA (MR); Woodland, CA (WO) ; Dallas Center, IA (DS) y Princeton, IN (PR) . Sin embargo, en 2009, las pruebas cruzadas de los híbridos del maíz se compararon con el grupo de nulos (BN) . Los resultados de la prueba de campo de 2009 se incluyen en la Tabla 7. En York, en condiciones de concentración baja de nitrógeno, tres eventos mostraron un aumento significativo en la producción con respecto al grupo de nulos, y en condiciones de concentración de nitrógeno normal, un evento mostró un aumento significativo en la producción con respecto al grupo de nulos. En Woódland, en condiciones de concentración baja de nitrógeno, un evento mostró una producción significativamente más alta en comparación con el grupo de nulos. En Marión, en condiciones de concentración baja de nitrógeno, la producción para tres eventos fue significativamente mayor que el grupo de nulos.

Tabla 7 Pruebas de campo de 2009 para el maíz transformado con PHP29875 La unidad de medida es bushels/acre .

El sombreado representa un resultado significativamente más alto (P<0.1) en comparación con el grupo de nulos (BN) .

Los valores en negrita representan un resultado significativamente más bajo (P<0.1) en comparación con el grupo de nulos (BN) .

Ejemplo 21 Transformación y evaluación del frijol de soya con homólogos del frijol de soya de genes guía validados En función de búsquedas de homología se puede identificar uno o varios homólogos del frijol de soya candidato de genes guía validados de Arabidopsis y, además, se pueden evaluar para determinar su capacidad para mejorar la tolerancia a condiciones de limitación de nitrógeno en el frijol de soya. La construcción de vectores, la transformación de plantas y el análisis fenotípico serán similares a los descritos en los ejemplos anteriores.

Ejemplo 22 Trans ormación y evaluación del maíz con homólogos del maíz de genes guía validados En función de búsquedas de homología se puede identificar uno o varios homólogos del maíz candidato de genes guía de Arabidopsis validados (por ejemplo, secs . con núm. de ident.: 18/19, 20/21, 22/23, 43/44 o 45/46) y, además, se pueden evaluar para determinar su capacidad para mejorar la tolerancia a condiciones de limitación de nitrógeno en el maíz. La construcción de vectores, la transformación de plantas y el análisis fenotípico pueden ser similares a los descritos en los ejemplos anteriores.

Ejemplo 23 Transformación de Arabidopsis con homólogos del maíz y frijol de soya de genes guía validados Los homólogos del maíz y frijol de soya de genes guía de Arabidopsis validados se pueden transformar en Arabidopsis bajo el control del promotor 35S y se pueden analizar para determinar el área de la hoja y la acumulación en el ancho del intervalo del color verde cuando se cultiva en un medio con baja concentración de nitrógeno. La construcción de los vectores y la transformación de las plantas pueden ser tal como se describió en los ejemplos de la presente invención. Las condiciones de los ensayos, la captura de datos y el análisis de datos pueden ser similares a los descritos en los ejemplos anteriores.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (15)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Una planta que comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operacionalmente a por lo menos un elemento regulador, caracterizada porque el polinucleótido codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de al menos 50 % de identidad de secuencia, basada en el método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec . con núm. de ident . : 19, 21, 23, 25, 27, 29, 30, 31, 32, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 o 49, y en donde la planta exhibe una mayor tolerancia al estrés de nitrógeno cuando se compara con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante .

2. Una planta caracterizada porque comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operacionalmente a por lo menos un elemento regulador, caracterizada porque el polinucleótido codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de al menos 50 % de identidad de secuencia, basada en el método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec. con núm. de ident.: 19, 21, 23, 25, 27, 29, 30, 31, 32, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 o 49; y en donde la planta exhibe un aumento en la producción, biomasa o ambas cuando se compara con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante .

3. La planta de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la planta exhibe el aumento j en la producción, biomasa o ambas cuando se compara, en condiciones de limitación de nitrógeno, con la planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante.

4. La planta de conformidad con cualquiera ele las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque la planta se selecciona del grupo que consiste en: maíz, frijol de' soya, girasol, sorgo, cañóla, trigo, alfalfa, algodón, arroz, cebada, mijo, caña de azúcar y pasto aguja.

5. La semilla de la planta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque la semilla comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operacionalmente a por lo menos un elemento regulador, en donde el polinucleótido codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de al menos 50 % de identidad de secuencia, basada en el método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec . con núm. de ident . : 19, 21, 23, 25, 27, 29, 30, 31, 32, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 o 49, y en donde además una planta producida de la semilla exhibe un aumento en al menos una característica seleccionada del grupo que consiste en: tolerancia al estrés de nitrógeno, producción y biomasa cuando se compara con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante .

6. Un método para aumentar la tolerancia al estrés de nitrógeno en una planta, caracterizado porque comprende: (a) introducir en una célula vegetal regenerable un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operacionalmente a por lo menos una secuencia reguladora, en donde el polinucleótido codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de al menos 50 % de identidad de secuencia, basada en el método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec. con núm. de ident . : 19, 21, 23, 25, 27, 29, 30, 31, 32, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 o 49; y (b) regenerar una planta transgénica a partir de la célula vegetal regenerable después de la etapa (a) , en donde la planta transgénica comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante; y (c) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante y exhibe una mayor, tolerancia al estrés de nitrógeno cuando se compara con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante .

7. Un método para evaluar la tolerancia al estrés de nitrógeno en una planta, caracterizado porque el método comprende : (a) obtener una planta transgénica, en donde la planta transgénica comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operacionalmente a por lo menos una secuencia reguladora, en donde el polinucleótido codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de al menos 50 % de identidad de secuencia, basada en el método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec . con núm. de ident . : 19, 21, 23, 25, 27, 29, 30, 31, 32, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 o 49; (b) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante; y (c) evaluar la planta progenie para determinar la tolerancia al estrés de nitrógeno cuando se compara con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante .

8. Un método para determinar una alteración en la producción, biomasa o ambas en una planta, caracterizado porque comprende : (a) obtener una planta transgénica, en donde la planta transgénica comprende en su genoma un constructo de ADN recombinante que comprende un polinucleótido unido operacionalmente a por lo menos una secuencia reguladora, en donde el polinucleótido codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de al menos 50 % de identidad de secuencia, basada en el método de alineamiento Clustal V, cuando se compara con la sec. con núm. de ident . : 19, 21, 23, 25, 27, 29, 30, 31, 32, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 o 49; (b) obtener una planta progenie derivada de la planta transgénica, en donde la planta progenie comprende en su genoma el constructo de ADN recombinante ; y (c) determinar si la planta progenie exhibe una alteración en la producción, biomasa o ambas cuando se compara con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante.

9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la etapa determinante (c) comprende determinar si la planta transgénica exhibe una alteración en la producción, biomasa o ambas cuando se compara, en condiciones de limitación de nitrógeno, con una planta de control que no comprende el constructo de ADN recombinante .

10. El método de conformidad con la reivindicación 8 o 9, caracterizado porque además la alteración es un aumento.

11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, caracterizado porque la planta se selecciona del grupo que consiste en: maíz, frijol de soya, girasol, sorgo, cañóla, trigo, alfalfa, algodón, arroz, cebada, mijo, caña de azúcar y pasto aguja.

12. Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende : (a) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que contiene el dominio SNF2 , en donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos de al menos 50 % de identidad de secuencia, basada en el método de alineamiento Clustal V con parámetros predeterminados para alineamientos en pares de KTUPLE=1, PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN3 , VENTANA=5 y DIAGONALES GUARDADAS=5 , cuando se compara con la sec. con núm. de ident. : 19, 21, 23, 36, 38 o 46 o (b) el complemento completo de la secuencia de nucleótidos de (a) .

13. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos del polipéptido comprende la sec. con nüm. de ident.: 19, 21, 23, 36, 38 o 46.

14. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos comprende la sec. con núm. de ident.: 18, 20, 22, 35, 37 o 45.

15. Una planta o semilla que comprende Un ADN recombinante , caracterizada porque el constructo de ADN recombinante comprende el polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14.