BR112012009996A2 - ''planta compreendendo em seu genoma um construtor de dna recombinante método para aumentar a tolerância á seca em um planta ,método de avaliação de tolerância aseca em uma planta ,método para uma determinação de uma alteração de uma característica agronômica em uma planta ,polinucleotídeo isolado,construtor de dna recombinante, célula,planta,semente,método para o isolamento de um polinucleotídeo,polipeptídeo,vetor método para produção de uma planta transgênica e semante da planta'' - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA AUMENTAR E AVALIAR A TOLERÂNCIA À SECA, PARA DETERMINAR UMA ALTERAÇÃO DE UMA CARACTERÍSTICA AGRONÔMICA, CONSTRUÇÕES DE DNA RECOMBINANTE, MICROORGANISMO TRANSGÊNICO, MÉTODO PARA ISOLAR UM POLIPEPTÍDEO, VETOR E MÉTODO PARA PRODUZIR UMA PLANTA TRANSGÊNICA. A presente invenção refere-se a poIinucleotídeos isolados e polipeptídeos e construções de DNA recombinante úteis para conferir tolerância à seca, compositions (tais como plantas ou sementes) compreendendo essas construções de DNA recombinante, e métodos que utilizam essas construções de DNA recombinante. A construção de DNA recombinante compreende um polinucleotídeo operativamente Iigado a um promotor que é funcional em uma planta, em que o dito poIinucleotídeo codifica um polipeptídeo DTP21.

Description

“MÉTODO PARA AUMENTAR E AVALIAR A TOLERÂNCIA À SECA, PARA DETERMINAR UMA ALTERAÇÃO DE UMA CARACTERÍSTICA AGRONÔMICA, CONSTRUÇÕES DE DNA RECOMBINANTE, MICRO- ORGANISMO TRANSGÊNICO, MÉTODO PARA ISOLAR UM POLIPEPTÍDEO, VETOR E MÉTODO PARA PRODUZIR UMA PLANTA TRANSGÊNICA”

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se ao melhoramento de plantas e genética e, particularmente, refere-se a construções de DNA recombinantes úteis em plantas para conferir tolerância à seca.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO O estresse abiótico é a primeira causa de perda de cultura no mundo inteiro, causando perdas médias de rendimento superiores a 50% para culturas principais (Boyer, J.S. (1982) Science 218:443- 448; Bray, E.A. et al. (2000) em Biochemistrty and Molecular Biology of Plants, Editado por Buchannan, B.B. et al., Amer. Soc. Plant Biol., pp. 1158-1249). Entre os vários estresses abióticos, a seca é o principal fator que limita a produtividade de culturas no mundo inteiro. A exposição de plantas a um ambiente de escassez hídrica durante vários estágios de desenvolvimento parece ativar várias mudanças fisiológicas e de desenvolvimento. O entendimento do mecanismo básico bioquímico e molecular para percepção do estresse à seca, transdução e tolerância e um desafio principal em biologia. Foram publicados estudos sobre os mecanismos moleculares de respostas aos estresse abiótico e redes reguladoras gênicas de tolerância ao estresse à seca (Valliyodan, B., and —Nguyen, H.T., (2006) Curr. Opin. Plant Biol. 9:189-195; Wang, W,, et al. (2003) Planta 218; 1 -14); Vinocur, B., and Altman, A. (2005) Curr. Opin. Biotechnol. 16:123-132; Chaves, M.M., and Oliveira, M.M. (2004) J. Exp. Bot. 55:2365- 2384; Shinozaki, K., et al. (2003) Curr. Opin. Plant Biol. 6:410-417; Yamaguchi-

Shinozaki, K., and Shinozaki, K. (2005) Trends Plant Sci. 10:88-94).

Sabe-se que respostas ao estresse abiótico variam significativamente entre espécies de planta e entre variedades e cultivares dentro de uma espécie de planta. Determinadas espécies, variedades ou cultivares são mais tolerantes ao estresse abiótico tais como à seca do que outras. Os genotipos de tais plantas são fontes atraentes de genes envolvidos em respostas únicas ao estresse abiótico. A identificação de genes de resposta ao estresse e expressão destes em plantas transgênicas foi testada bastante até agora, Porém, os genes de resposta ao estresse introduzidos em plantas muitas vezes não são expressados muito bem. As razões para a expressão pobre podem incluir escolha inapropriada de promotores e/ou outros elementos reguladores e destruição da estrutura exon-intron. A introdução de um segmento genômico de planta, que retém o promotor nativo, toda a região de codificação e estrutura exon-intron intacta, em plantas, pode ser um método eficaz para a boa expressão de um gene de resposta ao estresse estranho. Por exemplo, foi relatado que uma enzima envolvida em fotossíntese foi expressada em um nível muito mais elevado a partir de um clone genômico do que a partir de um clone cDNA correspondente em arroz (Ku et al. Nature Biotechnol. 17:76-80, 1999).

Recentemente, foi desenvolvido um método para a varredura eficiente de fragmentos de DNA genômicos capaz de prover plantas com uma variação fenotípica vantajosa em termos agrícolas (Pedido de patente americano No. US2008/0301832A1 ). Neste método, plantas são transformadas com fragmentos genômicos transformados a partir de um banco —genômico construído a partir de uma planta superior, e as plantas transgênicas resultantes foram identificadas e quantificadas “para uma variação fenotípica vantajosa em termos agrícolas. As plantas resultantes podem ser identificadas e quantifcadas para uma resposta única ao estresse abiótico, tais como tolerância à seca, e eventualmente um fragmento genômico que pode portar um gene de resposta ao estresse prontamente expressável em plantas, pode ser identificado. Para identificar um gene de resposta ao estresse único e utilizar esses gene em plantas transgênicas, é necessário um teste considerável. Entre os muitos fatores a serem considerados, temos o seguinte: a escolha de uma planta a partir da qual um banco genômico é construído; como as plantas transgênicas são identificadas e quantificadas; como os fragmentos genômicos são examinados; e como o gene de resposta ao estresse é detalhadamente apontado, caracterizado e usado.

DECRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO A presente invenção inclui: Em uma concretização, a planta compreendendo em seu genoma uma construção de DNA recombinante que compreende um polinucleotídeo ligado operativamente a pelo menos um elemento regulador, em que o dito —polinucleotideo compreende uma sequência nucleotídica selecionada do grupo que consiste em : (a) uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo com atividade de tolerância à seca em que o polipeptídeo apresenta uma sequência de aminoácido de pelo menos 60%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% de entidade de sequência, com base no método Clustal V de alinhamento com parâmetros padrão “de alinhamento de pares de KTUPLE=1 , GAP PENALTY=3, WINDOW=5 and DIAGONALS SAVED=5, em comparaçãos a SEQ ID NO: 27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 or 87; (b) uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo com atividade de tolerância à seca, em que a sequência nucleotídica é hibridizável sob condições estringentes com uma molécula de DNA compreendendo o complemento total de SEQ ID NO: 26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 or 86; (c) uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo com atividade de tolerância à seca, em que a sequência nucleotídica é derivada de SEQ ID NO: 26, 31, 44, 55, 59, 63, 80,

82, 84 ou 86 mediante alteração de um ou mais nucleotídeos através de pelo menos um método selecionado a partir do grupo consistindo em: deleção, substituição, adição e inserção; (d) uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo, em que a sequência de aminoácido do polipeptídeo compreende SEQIDNO: 27, 32,46, 56,60, 64, 81, 83, 85 ou 87; e (e) uma sequência nucleotídica que compreende SEQ ID NO: 26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 ou 86; e em que a dita planta exibe tolerância à seca aumentada em comparação com uma planta controle não compreendendo a dita construção de DNA recombinante. A planta pode ser um monocotiledônia ou dicotiledônia.

Em uma outra concretização, uma planta compreendendo em seu genoma uma construção de DNA recombinante, que compreende um polinucleotídeo operativamente ligado a pelo menos um elemento regulador, em que o dito polinucleotideo compreende uma sequência nucleotídica selecionada do grupo que consiste em: (a) uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo com atividade de tolerância à seca, em que o polipeptídeo apresenta uma sequência de aminoácido de pelo menos 60%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% de identidade de sequência, com base no método Clustal V de alinhamento com parâmetros default de alinhamento por pares de sequência de KTUPLE=1 , GAP PENALTY=3, WINDOW=5 e — DIAGONALS SAVED=5, em comparação a SEQ ID NO: 27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 ou 87; (b) uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo com atividade de tolerância em que a sequência nucleotídica é hibridizável sob condições estringentes com a molécula de DNA compreendendo o complemento inteiro de SEQ ID NO: 26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 ou 86; (c) uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo com atividade de tolerância à seca, em que a sequência nucleotídica é derivada de SEQ ID NO: 26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 ou 86 pela alteração de um ou mais nucleotídeos através de pelo menos um método selecionado do grupo que consiste em: deleção, substituição, adição e inserção; (d) uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo em que a sequência de aminoácido do polipeptídeo compreende SEQ ID NO: 27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 ou 87; e (e) uma sequência nucleotídica compreendendo SEQ ID NO: 26, 31, 44, 5 55,59,63,80,82,840u86; eem que a dita planta exibe um aumento em rendimento em comparação com uma planta controle que não compreende a dita construção de DNA recombinante. A planta pode exibir aumento em rendimento em comparação sob condições hídricas limitantes, em relação a dita planta controle que não compreende a dita construção de DNA recombinante. A planta pode ser um monocotiledônia ou dicotiledônia.

Em outra concretização, um método para aumentar a tolerância à seca em uma planta, compreendendo: (a) introduzir em uma célula de planta regenerável uma construção de DNA recombinante compreendendo um polinucleotídeo operativamente ligado a pelo menos um elemento regulador, em que o dito polinucleotideo compreende uma sequência nucleotídica selecionada do grupo que consiste em: (i) uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo com atividade de tolerância à seca, em que oO polipeptídeo apresenta uma sequência de aminoácido de pelo menos 60%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% de identidade de sequência, com base no método Clustal V method de alinhamento com parâmetros padrão de pares de sequência de KTUPLE=1 , GAP PENALTY=3, WINDOW=5 e DIAGONALS SAVED=5, em comparação a SEQ ID NO: 27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 ou 87; (li) uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo com atividade de tolerância à seca, em que a sequência nucleotídica é hibridizável sob condições estringentes com uma Molécula de DNA compreendendo o complemento inteiro de SEQ ID NO: 26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 ou 86; (iii) uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo com atividade de tolerância à seca, em que a sequência nucleotídica é derivada de SEQ ID NO:

26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 ou 86 pela alteração de um ou mais nucleotídeos através de pelo menos um método selecionado do grupo que consiste em: deleção, substituição, adição e inserção; (iv) uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo, em que a sequência de aminoácido — do polipeptideo compreende SEQ ID NO: 27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 ou 87; e (v) uma sequência nucleotídica compreendendo SEQ ID NO: 26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 ou 86; e (b) regenerar uma planta transgênica a partir da célula de planta regenerável após etapa (a), em que a planta transgênica compreende em seu genoma a construção de DNA recombinante e exibe tolerância à seca aumentada, em comparação com uma planta controle que não compreende a construção de DNA recombinante. O método pode compreender ainda: (c) obter uma progênie de planta derivada da planta transgênica, em que a dita progênie de planta compreende em seu genoma a construção de DNA recombinante e exibe tolerância à seca em comparação com uma planta controle que não compreende a construção de DNA recombinante.

Em outra concretização, um método de avaliação da tolerância à seca em uma planta, compreendendo: (a) obter uma planta transgênica, em que a planta transgênica compreende em seu genoma uma construção de DNA recombinante compreendendo um polinucleotídeo operativamente ligado a pelo menos um elemento regulador, em que o dito polinucleotídeo compreende uma sequência nucleotídica selecionada do grupo que consiste em: (i) uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo com atividade de tolerância à seca, em que o polipeptídeo apresenta uma sequência de —aminoácidode pelomenos 60%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% identidade de sequência, com base no método Clustal V de alinhamento com parâmetros padrão de alinhamento de pares KTUPLE=1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 and DIAGONALS SAVED=5, em comparação com SEQ ID NO: 27, 32, 46, 56,

60, 64, 81, 83, 85 ou 87; (ii) uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo com atividade de tolerância à seca, em que a sequência nucleotídica é hibridizável sob condições estringentes com a molécula de DNA compreendendo o complemento inteiro de SEQ ID NO: 26, 31, 44, 55, 59,63, 80, 82,84 ou 86; (ii) uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptideo com atividade de tolerância à seca, em que a sequência nucleotídica é derivada de SEQ ID NO: 26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 ou 86 pela alteração de um ou mais nucleotídeos através de pelo menos um método selecionado do grupo que consiste em: deleção, substituição, adição e inserção; (iv) uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo, em que a sequência de aminoácido do polipeptídeo compreende SEQ ID NO: 27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 ou 87; e (v) uma sequência nucleotídica compreendendo SEQ ID NO: 26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 ou 86; e (b) obter uma progênie de planta derivada da planta transgênica da etapa (a), em que a progênie de planta compreende em seu genoma a construção de DNA recombinante; e (c) avaliar a progênie de planta quanto à tolerância à seca comparada com uma planta controle que não compreender a construção de

DNA recombinante.

Em outra concretização, um método para determinação e uma alteração de uma característica agronômica em uma planta, compreendendo: (a) obter uma planta transgênica, em que a planta transgênica compreende em seu genoma uma construção de DNA recombinante compreendendo um polinucleotídeo operativamente ligado a pelo menos um elemento regulador, em que o dito polinucleotideco compreende uma sequência nucleotídica selecionada do grupo que consiste em: (i) uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo com atividade de tolerância à seca, em que o polipeptídeo apresenta uma sequência de aminoácido de pelo menos 60%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% identidade de sequência, com base no método

Clustal V de alinhamento com parâmetros padrão de alinhamento de pares KTUPLE=1 , GAP PENALTY=3, WINDOW=5 e DIAGONALS SAVED=5, em comparação com a SEQ ID NO: 27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 ou 87; (ii) uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo com atividade de tolerância à seca, em que a sequência nucleotídica é hibridizável sob condições estringentes com uma molécula de DNA que compreende o complemento inteiro de SEQ ID NO: 26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 ou 86, (iii) uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo com atividade de tolerância à seca, em que a sequência nucleotídica é derivada de SEQ ID NO: 26,31, 44,55, 59,63, 80, 82, 84 ou 86 pela alteração de um ou mais nucleotídeos através de pelo menos um método selecionado do grupo que consiste em: deleção, substituição, adição e inserção; (iv) uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo, em que a sequência de aminoácido do polipeptídeo compreende SEQ ID NO: 27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 ou 87;e(v) uma sequência nucleotídica compreendendo SEQ ID NO: 26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 ou 86; e (b) obter uma progênie de planta derivada da planta transgênica da etapa (a), em que a progênie de planta compreende em seu genoma a construção de DNA recombinante; e (c) da etapa (a) determinar se a progênie de planta exibe uma alteração de pelo menos uma característica — agronômica em comparação com uma planta controle que não compreende a construção de DNA recombinante.

A dita etapa de determinação (c) pode compreender a determinação se a progênie de planta exibe uma alteração de pelo menos uma característica agronômica em comparação , sob condições hídricas limitantes, a uma planta controle que não compreende a construção de —DNA recombinante.

Pelo menos um o dito traço agronômico pode ser obtido e além disso pode ser um aumento em rendimento.

Em outra concretização um polinucleotideo isolado compreendendo uma sequência nucleotídica selecionada do grupo que consiste em: (a) uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo com atividade de tolerância à seca, em que o polipeptídeo apresenta uma sequência de aminoácido de pelo menos 60%, 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade de sequência, com base no método Clustal V de alinhamento com parâmetros padrão de alinhamento de pares KTUPLE=1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 e DIAGONALS SAVED=5, em comparação com SEQ ID NO: 27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 ou 87; (b) uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo com atividade de tolerância à seca, em que a sequência nucleotídica é hibridizável sob condições estringentes com a molécula de DNA compreendendo o complemento inteiro de SEQ ID NO: 26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 ou 86; (c) uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptideo com atividade de tolerância à seca, em que a sequência nucleotídica é derivada de SEQ ID NO: 26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 ou 86 pela alteração de um ou mais nucleotídeos através de pelo menos um método selecionado do grupo que consiste em: deleção, substituição, adição e inserção; (d) uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo, em que a sequência de aminoácido do polipeptíideo compreende SEQ ID NO: 27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 ou 87; e (e) uma sequência nucleotídica compreendendo SEQ ID NO: 26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 ou

66.

Em outra concretização um polinucleotideo isolado compreendendo o complemento inteiro da sequência nucleotídica da invenção, em que o complemento inteiro e a sequência nucleotídica da invenção consiste do mesmo número de nucleotídeos e são 100% complementares.

Em outra concretização, uma construção de DNA recombinante compreendendo o polinucleotídeo isolado da invenção operativamente ligado a pelo menos um elemento regulador.

Em outra concretização, uma célula compreendendo a construção de DNA recombinante da invenção, em que a célula é selecionada do grupo consistindo de uma célula bacteriana, uma célula de levedura e uma célula de inseto e uma célula de planta. Em outra concretização, uma planta ou uma semente — compreendendo a construção de DNA recombinante da invenção. A planta ou semente pode ser uma planta monocotiledônia ou uma planta dicotiledônia ou semente. Em outra concretização, um método para o isolamento de um polinucleotídeo codificado pela construção de DNA recombinante da invenção, em que o método compreende o seguinte: (a) transformar uma célula com a construção de DNA recombinante da invenção; (b) cultivar a célula transformada da etapa (a) sob condições adequadas para expressão da construção de DNA recombinante; e (c) isolar o polinucleotídeo da célula transformada da etapa (b).

Em outra concretização, um polinucleotideo isolado selecionado do grupo que consiste em: (a) um polipeptídeo com atividade de tolerância à seca, em que o polipeptídeo apresenta uma sequência de aminoácido de pelo menos 60%, 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade de sequência, com base no método Clustal V de alinhamento com parâmetros padrão de alinhamento de pares KTUPLE=1 , GAP PENALTY=3, WINDOW3=5 e DIAGONALS SAVED=5, em comparação com SEQ ID NO: 27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 ou 87; (b) um polipeptídeo com atividade de tolerância à seca, em que a sequência de aminoácido é derivado de SEQ ID NO: 27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 ou 87 pela alteração de um ou mais —aminoácidos através de pelo menos um método selecionado do grupo que consiste em: deleção, substituição, adição e inserção ; e (c) um polipeptídeo em que a sequência de aminoácido do polipeptídeo compreende SEQ ID NO: 27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 ou 87.

Em outra concretização, um vetor compreendendo o polinucleotídeo da invenção.

Em outra concretização, um método para produção de uma planta transgênica compreendendo a transformação de uma célula de planta com a — construção de DNA recombinante da invenção e regeneração de uma planta transgênica a partir da célula de planta transformada.

Em outra concretização, a presente invenção inclui qualquer uma das plantas da presente invenção em que a planta é selecionada da grupo consistindo: milho amarelo, soja, girassol, sorgo, canola, trigo, alfalfa, algodão, arroz, cevada, painço, cana de açúcar, switchgrass, tabaco, batata e beterraba.

Em outra concretização, a presente invenção inclui qualguer um dos métodos da presente invenção em que a planta é selecionada do grupo que consiste em : milho amarelo, soja, girassol, sorgo, canola, trigo, alfalfa, algodão, arroz, cevada, painço, cana de açúcar, switchgrass, tabaco, batata e beterraba.

Em outra concretização, apresente invenção inclui semente de qualquer uma das plantas da presente invenção, em que a dita semente compreende em seu genoma uma construção de DNA recombinante compreendendo um polinucleotídeo operativamente ligado a pelo menos um elemento regulador, em que o dito polinucleotídeo codifica um polipeptídeo que apresenta uma sequência de aminoácido de pelo menos 60% de identidade de sequência, com base no método Clustal V de alinhamento, em comparação com SEQ ID NO: 27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 ou 87, e em que uma planta produzida a partir da dita semente exibe ou um tolerância aumentada à seca, —ouum aumento em rendimento, ou ambos, em comparação com uma planta controle que não compreende a dita construção de DNA recombinante.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS E LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS A invenção pode ser mais totalmente entendida a partir da descrição detalhada a seguir e das figuras em anexo e da listagem de sequência que constituem parte deste pedido de patente.

A figura 1 mostra a posição e sequência dos pares de primers PCR usados para genotipar arroz transformado com fragmento genômico

18125.

A figura 2 mostra as várias regiões do fragmento genômico IS125 que foram subclonadas em arroz para definir a região responsável pelo fenótipo tolerante à seca.

A figura 3 mostra a estrutura do gene tolerante à seca que codificao polipeptideo SS-DTP21 -1 de 209 aminoácidos. As figuras 4A - 4E apresentam um alinhamento das sequências de aminoácido de polipetídeos DTP21 estabelecidas em SEQ ID NOs: 27, 32, 41 , 42, 45, 46, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 79, 81, 83, 85 e 87. Resíduos que são diferentes do resíduo de SEQ ID NO: 27 em determinada posição estão contidos em uma caixa Uma sequência de consenso é apresentada onde um resíduo é mostrado se igual em todas as sequências, caso contrário, é mostrado um período, A figura 5 apresenta as identidades de sequência em porcento e valores de divergência para cada par de sequência apresentado nas figuras 4A-4E As Tabelas A.1 e A.2 mostram uma avaliação de linhagens de milho derivadas do Gaspe Flint individual! transformadas com PHP29675.

As Tabelas B.1 e B.2 mostram uma avaliação sumária das linhagens de milho derivadas do Gaspe Flint tanbsformadas com PHP29675.

SEQ ID NO: 1 é a sequência de um fragmento de DNA recombinante que contém o fragmento genômico IS125 em posições de nucleotídeo 10 - 40049.

SEQ ID NO: 2 é a sequência nucleotídica do primer anterior para o par de primer M1 da figura 1. SEQ ID NO: 3 é a sequência nucleotídica do primer reverso para o par de primer M1 da figura 1. SEQ ID NO: 4 é à sequência nucleotídica do primer anterior para o parde primer M2 dafigura1. SEQ ID NO: 5 é a sequência nucleotídica do primer reverso para o par de primer M2 da figura 1. SEQ ID NO: 6 é a sequência nucleotídica do primer anterior para o par de primer M3 da figura 1. SEQ ID NO: 7 é a sequência nucleotídica do primer reverso para o par de primer M3 da figura 1. SEQ ID NO: 8 é a sequência nucleotídica do primer anterior para o par de primer M4 da figura 1 . SEQ ID NO: 9 é a sequência nucleotídica do primer reverso para oparde primer M4 da figura 1. SEQ ID NO; 10 é a sequência nucleotídica do primer anterior para o par de primer M5 da figura 1. SEQ ID NO: 1 1 é a sequência nucleotídica do primer reverso para o par de primer M5 da figura 1 . SEQ ID NO: 12 é a sequência nucleotídica do primer anterior para o par de primer M6 da figura 1. SEQ ID NO: 13 é a sequência nucleotídica do primer reverso para o par de primer M6 da figura 1. SEQ ID NO: 14 é a sequência nucleotídica do primer anterior para o parde primer M-hpt dafigura1. SEQ ID NO: 15 é a sequência nucleotídica do primer reverso para o par de primer M-hpt da figura 1. SEQ ID NO: 16 é a sequência nucleotídica do primer anterior para produção do fragmento Sub8. SEQ ID NO: 17 é a sequência nucleotídica do primer reverso para produção do fragmento Sub8. SEQ ID NO: 18 é a sequência nucleotídica do primer anterior para produção do fragmento Sub7. SEQ ID NO: 19 é a sequência nucleotídica do primer reverso para produção do fragmento Sub7. SEQ ID NO: 20 é a sequência nucleotídica do primer anterior para produção do RT-PCR do transcrito codificado pelo fragmento Sub7. SEQ ID NO: 21 é a sequência nucleotídica do primer reverso para RT-PCR de transcritos codificados pelo fragmento Sub7. SEQ ID NO: 22 é a sequência nucleotídica de um primer inicial usado para 5'- RACE do transcrito que codifica SS-DTP21 -1. SEQ ID NO: 23 é a sequência nucleotídica de um primer embutido usadopara 5'- RACE do transcrito que codifica SS-DTP21 -1. SEQ ID NO: 24 é a sequência nucleotídica de um primer inicial usado para 3'- RACE do transcrito que codifica SS-DTP21 -1. SEQ ID NO: 25 é a sequência nucleotídica de um primer embutido usado para 3'- RACE do transcrito que codifica SS-DTP21 -1 . SEQ ID NO: 26 é a sequência nucleotídica dentro do fragmento genômico IS125 que codifica o polipeptídeo SS-DTP21 -1. SEQ ID NO: 27 é a sequência de aminoácido do polipeptídeo SS- DTP21 -1 codificado pela SEQ ID NO: 26. SEQ ID NO: 28 é a sequência nucleotídica do primer anterior para —produçãodo RT-PCR de transcritos codificados pelo fragmento Sub5 (tabela 17). SEQ ID NO: 29 é a sequência nucleotídica do primer reverso para RT-PCR de transcritos codificados pelo fragmento Sub5 (tabela 17).

SEQ ID NO: 30 é a sequência de nulceotídeo de um fragmento de DNA que contém o fragmento genômico 18127 em posições de nucleotídeos 3075 - 37662.

SEQ ID NO: 31 é a sequência nucleotídica da região de fragmento genômico IS127 que codifica o polipeptideo SS-DTP21 -2, um polipeptídeo com homologia de sequência em relação a SS-DTP21-1.

SEQ ID NO: 32 é a sequência de aminoácido do SS-DTP21 -2 codificado pela SEQ ID NO: 31 .

SEQ ID NO: 33 é a sequência nucleotídica do primer anterior usado para amplificar a região que codifica SS-DTP21 -2.

SEQ ID NO: 34 é a sequência nucleotídica do primer reverso usado para amplificar a região que codifica SS-DTP21 -2.

SEQ ID NO: 35 é a sequência nucleotídica do primer anterior usado para preparar um vetor linearizado para a clonagem de regiões do —Sorghum bicolor que codifica polipeptideos homólogos a SS-DTP21 -1.

SEQ ID NO: 36 é a sequência nucleotídica do primer reverso usado para preparar um vetor linearizado para clonagem de regiões do Sorghum bicolor que codifica polipeptídeos homólogos para SS-DTP21 -1.

SEQ ID NO: 37 é a sequência nucleotídica do primer anterior usado para amplificar regiões do Sorghum bicolor (Gold sorgho) que codifica polipeptídeos homólogos a SS-DTP21 -1.

SEQ ID NO: 38 é a sequência nucleotídica do primer reverso usado para amplificar regiões do Sorghum bicolor que codifica polipeptídeos homólogos a SS- DTP21-1.

SEQ ID NO: 39 é a sequência nucleotídica do Sorghum bicolor (Gold sorgho) que codifica SB-DTP21 -1, um polipeptídeo homólogo a SS- DTP21 -1 a partir do capim Sudão.

SEQ ID NO: 40 é a sequência nucleotídica de Sorghum bicolor

(Gold sorgho) que codifica SB-DTP21 -2, um polipeptídeo homólogo a SS- DTP21 -1 a partir do capim Sudão.

SEQ ID NO: 41 é a sequência de aminoácido do polipeptídeo SB- DTP21 -1 de Sorghum bicolor (Gold sorgho) codificado pela SEQ ID NO: 39.

SEQ ID NO: 42 é a sequência de aminoácido do polipeptídeo SB- DTP21 -2 de Sorghum bicolor (Gold sorgho) codificado pela SEQ ID NO: 40.

SEQ ID NO: 43 é a sequência nucleotídica de Sorghum bicolor (B35) que codifica SB-DTP21 -3, um polipeptídeo homólogo a SS-DTP21 -1 a partir do capim Sudão.

SEQ ID NO: 44 é a sequência nucleotídica de Sorghum bicolor (B35) que codifica SB-DTP21 -4, um polipeptídeo homólogo a SS-DTP21 -1 a partir do capim Sudão.

SEQ ID NO: 45 é a sequência de aminoácido do polipeptídeo SB- DTP21 -3 de Sorghum bicolor (B35) codificado pela SEQ ID NO: 43.

SEQ ID NO: 46 é a sequência de aminoácido do polipeptídeo SB- DTP21 -4 de Sorghum bicolor (B35) codificado pela SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 47 é a sequência nucleotídica de posições 24904 a 25530 de NCBI Gl No. 124359063 para clone de Sorghum bicolor SB BBc0073F19.

SEQ ID NO: 48 é a sequência nucleotídica a partir de posições 441 14 a 44740 de NCBI GI No. 124359064 para clone de Sorghum bicolor SB BBc0109L12.

SEQ ID NO: 49 é a sequência de aminoácido de um polipeptídeo codificado pela SEQ ID NO: 47, e é homóloga ao polipeptíideo SS-DTP21 -1.

Fo SEQ ID NO: 50 é a sequência de aminoácido de um polipeptídeo codificado pela SEQ ID NO: 48, e é homóloga ao polipeptideo SS-DTP21 -1; porém, esta translação inclui dois códons de parada na estrutura.

SEQ ID NO: 51 é a sequência nucleotídica a partir do capim

Sudão que codifica SS-DTP21 -3, um polipeptídeo homólogo a SS-DTP21-1. SEQ ID NO: 52 é a sequência de aminoácido do codificado pela SEQ ID NO: 51. SEQ ID NO: 53 é a sequência nucleotídica a partir do capim — Sudão que codifica SS-DTP21-A4, um polipeptídeo homólogo a SS-DTP21 -1. SEQ ID NO: 54 é a sequência de aminoácido do codificado pela SEQ ID NO: 53. SEQ ID NO: 55 é a sequência nucleotídica a partir do capim Sudão que codifica SS-DTP21 -5, um polipeptídeo homólogo a SS-DTP21 -1. SEQ ID NO: 56 é a sequência de aminoácido do codificado pela SEQ ID NO: 55. SEQ ID NO: 57 é a sequência nucleotídica a partir do capim Sudão que codifica SS-DTP21 -7, um polipeptídeo homólogo a SS-DTP21 -1. SEQ ID NO: 58 é a sequência de aminoácido do codificado pela SEQIDNO: 57. SEQ ID NO: 59 é a sequência nucleotídica a partir da grama Johnson que codifica SH-DTP21-1, um polipeptídeo homólogo a SS-DTP21 -1, SEQ ID NO: 60 é a sequência de aminoácido do codificado pela SEQ ID NO: 59. SEQ ID NO: 61 é a sequência nucleotídica a partir da grama Johnson que codifica SH-DTP21-2, um polipeptídeo homólogo a SS-DTP21 -1. SEQ ID NO: 62 é a sequência de aminoácido do polipeptídeo codificado pela SEQ ID NO: 61. SEQ ID NO: 63 é a sequência nucleotídica a partir da cana de açúcar que codifica SO- DTP21 -1, um polipeptídeo homólogo a SS-DTP21 -1. SEQ ID NO: 64 é a sequência de aminoácido do polipeptídeo codificado pela SEQ ID NO: 63. SEQ ID NO: 65 é a sequência nucleotídica a partir da cana de açúcar que codifica SO- DTP21 -2, um polipeptídeo homólogo a SS-DTP21 -1. SEQ ID NO: 66 é a sequência de aminoácido do polipeptídeo codificado pela SEQ ID NO: 65. SEQ ID NO: 67 é a sequência nucleotídica do primer anterior SS-DTP21-1-5'attB, contendo a sequência attB1i, usada para amplificar a região de codificação da proteína SS-DTP21 -1. SEQ ID NO: 68 é a sequência nucleotídica do primer reverso SS-DTP21 -1 -3'attB, contendo a sequência attB2, usada para amplificar a região de codificação da proteina SS-DTP21. SEQ ID NO: 69 é a sequência nucleotídica do sítio attB1. SEQ ID NO: 70 é a sequência nucleotídica do sítio attB2. SEQ ID NO: 71 é a sequência nucleotídica de pBC-amarelo, um vetor de destinação para uso com Arabidopsis.

SEQ ID NO: 72 é a sequência nucleotídica do primer anterior SS-DTP21 -2-5'attB, contendo a sequência attB1i, usada para amplificar a região de codificação da proteína SS-DTP21 -2. SEQ ID NO: 73 é a sequência nucleotídica do primer reverso SS-STP21 -2-3'attB, contendo a sequência attB2, usada para amplificar a região de codificação de proteina SS-DTP21 -2, SEQ ID NO: 74 é a sequência nucleotídica do primer GENERACER'Y 5", SEQ ID NO: 75 é a sequência nucleotídica do primer embutido GENERACER'"Y 5", SEQ ID NO: 76 é a sequência nucleotídica do primer —GENERACERTY3', SEQ ID NO: 77 é a sequência nucleotídica do primer embutido GENERACER'Y 3', SEQ ID NO: 78 é a sequência nucleotídica a partir do capim

Sudão que codifica SS-DTP21 -6, um polipeptideo homólogo a SS-DTP21-1. SEQ ID NO: 79 é a sequência de aminoácido do polipeptídeo codificado pela SEQ ID NO: 78. SEQ ID NO: 80 é a sequência nucleotídica de Sorghum bicolor (Gold sorgho) que codifica SB-DTP21 -5, um polipeptídeo homólogo a SS- DTP21 -1. SEQ ID NO: 81 é a sequência de aminoácido do polipeptídeo codificado pela SEQ ID NO: 80. SEQ ID NO: 82 é a sequência nucleotídica de Sorghum bicolor (B35) que codifica SB-DTP21-6, um polipeptídeo homólogo a SS-DTP21 -1. SEQ ID NO: 83 é a sequência de aminoácido do polipeptídeo codificado pela SEQ ID NO: 82. SEQ ID NO: 84 é a sequência nucleotídica de Sorghum bicolor (hoki) que codifica SB-DTP21 -9, um polipeptideo homólogo a SS-DTP21 -1. SEQ ID NO: 85 é a sequência de aminoácido do polipeptídeo codificado pela SEQ ID NO: 84. SEQ ID NO: 86 é a sequência nucleotídica de Sorghum bicolor (hoki) que codifica SB-DTP21 -10, um polipeptídeo homólogo a SS-DTP21 -1. SEQ ID NO: 87 é a sequência de aminoácido do polipeptídeo codificado pela SEQ ID NO: 86. SEQ ID NO: 88 é a sequência nucleotídica de um primeiro primer usado para amplificar uma região de DNA de plasmídeo Sub8 no exemplo 20. SEQ ID NO: 89 é a sequência nucleotídica de um segundo primer usado para amplificar uma região de DNA de plasmídeo Sub8 no exemplo 20. SEQ ID NO: 90 é a sequência nucleotídica de um primeiro primer usado para amplificar uma região de DNA de plasmídeo pSB31 (Ishida et al. 1996 Nature Biotechnology 14:745-750) no exemplo 20. SEQ ID NO: 91 é a sequência nucleotídica de um segundo primer usado para amplificar uma região de DNA de plasmídeo pSB31 no exemplo 20.

As descrições de sequência e listagem de sequência aqui anexadas cumprem as regras que governam as descrições de sequência —nucleotídicae/ou aminoácido em pedidos de patente conforme estabelecido em 37 C.F.R. $1 .821 -1 .825, A listagem de sequência contém um código de letra para caracteres de sequência nucleotídica e os três códigos de letra para aminoácidos como definido em conformidade com os padrões IUPAC-IUBMB descritos em Nucleic Acids Res. 73:3021 -3030 (1985) e na Biochemical J. 219 (No. 24:345-373 (1984) que são aqui incorporados por referência. Os símbolos e formato usados para dados de sequência nucleotídica e de aminoácido cumprem as regras estabelecidas em 37 C.F.R. $1 .822.

DESCRIÇÃO DETALHADA A descrição de cada referência estabelecida aqui e incorporada por referência em sua totalidade.

Conforme aqui usado e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma", e "o/a" incluem referência de plural a menos que o contexto cite claramente uma indicação contrária. Desse modo, por exemplo, referência a "uma planta" inclui uma pluralidade de tais plantas, referência a "uma célula" inclui uma ou mais células e equivalentes desta conhecidos pelo versado na técnica, e assim por diante.

Conforme aqui usado: "Fragmento genômico I1S125" refere-se a um fragmento de DNA —genômico de Sorghum sudanense cv. Sugar Slim (grama de Sudan) que sob transformação transporta um fenótipo tolerante à seca em relação a cultívare de arroz Yukihikari. O "polipeptideo SS-DTP21 -1" refere-se a um aminoácido 209 codificado pelo fragmento genômico IS125 que é uma proteína candidata tolerante à seca.

"Fragmento genômico 18127" refere-se a um fragmento de DNA genômico a partir de Sorghum sudanense cv. Sugar Slim (grama de Sudan) que sob transformação transporta um fenótipo tolerante à seca em relação a cultivarede arroz Yukihikari. O “polipeptideo SS-DTP21 -2" refere-se a um polipeptídeo de aminoácido 209 codificado pelo fragmento genômico 18127 que é altamente homólogo à proteína candidata tolerante à seca SS-DTP21 -1. O "polipeptídeo SB-DTP21 -1" e "polipeptídeo SB-DTP21 -2 " referem-se a dois polipeptídeos codificados pelo DNA genômico de Sorghum bicolor (Gold sorgho), em que cada um deles é altamente homólogo ao polipeptídeo SS- DTP21 -1.

O "polipeptideo SB-DTP21 -3" e "polipeptideo SB-DTP21 -4" referem-se a dois polipeptídeos codificados pelo DNA genômico de Sorghum bicolor (B35), cada um deles sendo altamente homólogo ao polipeptídeo SS- DTP21-1.

O "polipeptídeo DTP21" refere-se a uma proteína com homologia de sequência para SS- DTP21 -1 que é capaz sob transformação de transportar um fenótipo tolerante à seca em cultivare de arroz Yukihikari e/ou em outras espécies de planta ou cultivares. Os termos "polipeptídeo DTP21" e "proteina DTP21" são usados aqui de forma intercambiável.

"Atividade de tolerância à seca" de um polipeptídeo indica que a superexpressão do polipeptídeo em uma planta transgênica confere tolerância aumentada à seca à planta transgênica com relação a uma planta de referência ou de controle, Os termos "monocotiledônia" e "planta monocotiledônea" são usados de forma intercambiável aqui. Uma monocotiledônia da presente invenção inclui o Gramineae.

Os termos "dicotiledônia" e "planta dicotiledônea" são usados aqui de forma intercambiável aqui. Uma dicotiledônia da presente invenção inclui as seguintes famílias: Brassicaceae, Leguminosae, e Solanaceae.

Os termos "complemento inteiro" e "complemento de corpo inteiro" são usados de forma intercambiável aqui, e referem-se a um complemento de uma determinada sequência nucleotídica, em que o complemento e a sequência nucleotídica consistem do mesmo número de nucleotídeos e são 100% complementares.

"Arabidopsis" e "Arabidopsis thaliana" são usados de forma intercambiável aqui, a mesmo que consta outra indicação.

Uma "marca de sequência expressada" ("EST") é uma sequência de DNA derivado de um banco de cDNA, e portanto, é uma sequência que foi transcrita. Un EST é tipicamente obtido através de um sequenciamento de fila única de um inserto de cDNA. A sequência de um inserto inteiro de cCDNA é denominada de a "sequência de inserto inteiro " ("FIS”). Uma sequência "Contig" é uma sequência montada a partir de duas ou mais sequências que podem ser selecionadas de, porém não limitada ao grupo consistindo de uma sequência EST, FIS e PCR. Uma sequência que codifica uma proteína inteira ou funcional é denominada de uma "Sequência Gênica Completa " ("CGS") e pode ser derivada de um FIS ou um contig.

"Característica agronômica" é um parâmetro mensurável que inclui mas não está limitado a, verdor, rendimento, taxa de crescimento, biomassa, peso fresco de maturação, peso seco na maturação, rendimento de fruto, rendimento de semente, conteúdo total de nitrogênio da planta, conteúdo de nitrogênio de fruto, conteúdo de nitrogênio de semente, conteúdo de nitrogênio em um tecido vegetativo, conteúdo total de aminoácido livre, conteúdo de aminoácido livre no fruto, conteúdo de aminoácido livre na semente, contéudo de aminoácido livre em um tecido vegetativo, conteúdo total de proteína de planta, conteúdo de proteína de fruto, conteúdo de proteína de semente, contéudo de proteína em um tecido vegetativo, tolerância à seca, absorção de nitrogênio, acamamento de raíz, índice cultivado, tombamento dos colmos, altura de planta, altura, altura de espiga, tolerância ao sal, vigor de da plântulia “precoce e emergência de plântula sob estresse a baixas temperaturas.

"Transgênico" refere-se a qualquer célula, linhagem celular, tecido caloso, parte de planta ou planta, o genoma da qual foi alterado pela presença de um ácido nucléico heterólogo, tal como uma construção de DNA recombinante, incluindo aqueles eventos transgênicos iniciais assim como aqueles criados por cruzamentos sexuais ou propagação assexual a partir do evento transgênico inicial. O termo "transgênico", conforme aqui usado não abrange a alteração do genoma (cromossomal ou extra-cromossomal) a través de métodos de melhoramento de planta convencionais ou através de eventos de ocorrência natural tais como fertilização cruzada randômica, infecção viral —não-recombinante, transformação bacteriana não-recombinante, transposição não-recombinante, ou mutação espontânea.

"Genoma" conforme se aplica a células de planta não abrange DNA cromossomal encontrado dentro do núcleo, mas DNA em organelas encontrado dentro de componentes subcelulares (p.ex., mitocondrial, plastídeo) dacélula.

"Planta" inclui referência a plantas inteiras, orgãos de planta, tecidos de planta, sementes e células de planta e progênie das mesmas. Células de planta incluem, sem limitação, células de sementes, culturas de suspensão, embriões, regiões meristemáticas, tecido caloso, folhas, —raízes,brotos, gametófitos, esporófitos, pólen e microesporos.

"Progênie" compreende qualquer geração de planta subsequente.

"Planta transgênica" inclui referência a uma planta que compreende dentro de seu genoma um polinucleotídeo heterólogo. Por exemplo, o polinucleotídeo heterólogo é estavelmente integrado dentro do genoma de forma que o o polinucleotídeo seja passado para gerações sucessivas. O polinucleotídeo heterólogo pode ser integrado no genoma isoladamente ou como parte de uma construção de DNA recombinante.

"Heterólogo" com relação a sequência significa uma sequência que se origina a partir de espécies estranhas, ou, se for da mesma espécie, é substancialmente modificada a partir de sua forma nativa em composição e/ou local genômico através de intervenção humana deliberada.

"Polinucleotídeo", "sequência de ácido nucléico ", "sequência —nucleotídica ", ou "fragmento de ácido nucléico " são usados de forma intercambiável e é um polímero de RNA ou DNA que é de fita única ou fita dupla, contendo opcionalmente bases de nucleotídeo sintéticas, não naturais ou alteradas. Nucleotídeos (usualmente encontrados em sua forma 5"- monofosfato) são chamados devido à sua designação de letra única como: "A" para adenilato ou deoxiadenilato (para RNA ou DNA, respectivamente), "C" para citidilato ou deoxicitidilato, "G" para guanilato ou deoxiguanilato, "U" para uridilato, "T" para deoxitimidilato, "R" para purinas (A ou G), "Y" para pirimidinas (C ou T), "K" para G ou T, H" para A ou C ou T, "Il" para inosina, e "N" para qualquer nucleotídeo.

"Polipeptídeo", "peptídeo", "sequência de aminoácido" e "proteina" são usados de forma intercambiável aqui para denominar um polímero de resíduos de aminoácido. Os termos são aplicáveis a polímeros de aminoácido nos quais um ou mais resíduos de aminoácido é um análogo químico artificial de correspondente a aminoácido de ocorrência natural assim como a polímeros de aminoácido de ocorrência natural. Os termos "polipeptídeo", "peptide", "sequência de aminoácido", e "proteína" são também inclusive de modificações que incluem, mas não são limitados a, glicosilação, ligação lipídica, sulfação, gama-carboxilação de resíduos de ácido glutâmico,

hidroxilação e ADP-ribosilação.

"RNA mensageiro (mMRNA)" refere-se ao RNA que é sem Íntrons e que pode ser transladado para proteína através da célula.

"CcDNA" refere-se a um DNA que é complementar a e sintetizado a partirdo MRNA padrão enzima transcriptase reversa. O cDNA pode ser de fila única ou convertido em um de fila dupla utilizando-se o fragmento Klenow de DNA polimerase |.

Protéina "madura" refere-se a um polipeptídeo processado pós- translacionalmente; i.e., um do qual quaisquer pré- ou pró-peptídeos presentes no produto de translação primária haviam sido removidos.

Proteína "Precursora" refere-se ao produto primário de translação de mRNA; i.e., com pré- e pró-peptídeos ainda presentes. Pre- e pró-peptídeos podem ser e não são limitados a sinais de localização celular.

"Isolado" refere-se a materiais tais como moléculas de ácido —nucléico e/ou proteínas, que são substancialmente livres ou de outra forma removidas de componentes que normalmente acompanham ou interagem com os materiais em um ambiente de ocorrência natural. Polinucleotídeos isolados podem ser purificados a partir de uma célula hospedeira na qual eles ocorrem naturalmente. Métodos de purificação d ácido nucléico convencionais conhecidos pelo versado na técnica podem ser usados para obter polinucleotídeos isolados. O termo também compreende polinucleotídeos recombinantes e polinucleotídeos quimicamente sintetizados.

"Recombinante" refere-se a uma combinação artificial de dois segmentos de sequência outra forma separados, por exemplo, por síntese química, por exemplo, através de síntese química ou através de manipulação de segmentos isolados de ácidos nucléicos através de técnicas de engenharia genética. "Recombinante" também inclui referência a uma célula ou vetor, que foi modificado pela introdução de um ácido de um ácido nucléico heterólogo ou uma célula derivada a partir de uma célula assim modificada, mas não abrange a alteração da célula ou vetor através de eventos de ocorrência natural (por exemplo, mutação espontânea, transformação natural transdução/transposição) tais como aqueles que ocorrem sem intervenção — humana deliberada, "Construção de DNA recombinante" refere-se a uma combinação de fragmentos de ácido nucléico que não são normalmente encontrados juntos na natureza. Correspondentemente, uma construção de DNA recombinante pode compreender sequências reguladoras e sequências codificadoras que são derivadas de diferentes fontes, ou sequências reguladoras e sequências codificadoras derivadas da mesma fonte, porém arranjadas de maneira diferente daquela normalmente encontrada na natureza.

Os termos "clone de entrada" e "vetor de entrada" são usados de forma intercambiável aqui.

"Sequências reguladoras" referem-se a sequências nucleotídicas localizadas a montante (sequências não codificadoras 5'), dentro, ou a jusante (sequências não codificadoras 3") de uma sequência codificadora e que influencia a transcrição, processamento de RNA e estabilidade, ou translação da sequência codificadora associada. Sequências reguladoras podem incluir, mas não estão limitadas a promotores, sequências sinalizadoras de translação, intróns, e sequências de reconhecimento de. Os termos "sequência reguladora" e "elemento regulador" são usados aqui de forma intercambiável.

"Promotor" refere-se a um fragmento de ácido nucléico capaz de controlar a transcrição de outro fragmento de ácido nucléico.

"Promotor funcional em uma planta" é um promotor capaz de controlar a transcrição em células de planta independentemente se sua origem deriva de uma célula de planta.

"Promotor tecido-específico " e "promotor tecido-preferido " são usados de forma intercambiável, e referem-se a um promotor que é expressado predominantemente mas não necessariamente exclusivamente em um tecido ou órgão, mas que também pode ser expressado em uma célula específica. "Promotor regulado de modo desenvolvemental" refere-se a um promotor cuja atividade é determinada por eventos desenvolvementais. "Operativamente ligado" refere-se à associação de fragmentos de ácido nucléico em um fragmento simples de forma que a função de um é regulada pelo outro.

Por exemplo, um promotor é operativamente ligado com um fragmento de ácido nucléico que ele é capaz de regular a transcrição daquele fragmento de ácido nucléico, "Expressão" refere-se à produção de um produto funcional.

Por exemplo, expressão de um fragmento de ácido nucléico pode referir-se a transcrição do fragmento de ácido nucléico (por exemplo, transcrição resultante em mRNA ou RNA funcional) e/ou translação de MRNA em um precursor ou proteina madura. "Fenótipo" significa as características detectáveis de uma célula ou organismo. "Introduzido" no contexto de inserção de um fragmento de ácido nucléico (por exemplo, uma construção de DNA recombinante) em uma célula, significa "transfecção" ou "transformação" ou "transdução" e inclui a referência à incorporação de um fragmento de ácido nucléico em uma célula eucariótica ou procariótica onde o fragmento de ácido nucléico pode ser incorporado no genoma da célula (por exemplo., cromossomo, plasmídeo, plastideo ou DN mitocondrial), convertido em um replicon autônomo, ou transientemente expressado (por exemplo, mMRNA transfectado). Uma "célula transformada " é qualquer célula na qual um fragmento de ácido nucléico (por exemplo, uma construção de DNA recombinante) foi introduzido.

"Transformação" conforme aqui usado refere-se tanto à transformação estável como à transformação transiente, "Transformação estável" refere-se à introdução de um fragmento de ácido nucléico em um genoma de um organismo hospedeiro que resulta em berança geneticamente estável. Uma vez estavelmente transformado, o fragmento de ácido nucléico é estavelmente integrado no genoma do organismo hospedeiro e qualquer geração subsequente.

"Transformação transiente " refere-se à introdução de um fragmento de ácido nucléico no núcleo, ou organela contendo DNA de um organismo hospedeiro que resulta em expressão gênica sem herança geneticamente estável.

"Alelo" é uma das diversas formas alternativas de um gene ocupar um determinado lugar em um cromossomo. Quando os alelos presentes em um determinado lugar em um par de cromossomos homólogos e uma planta —diploide foram iguais, aquela planta será homozigosa nesse locus. Se os alelos presentes em um determinado lugar em um par de cromossomos homólogos em uma planta diploide forem diferentes, aquela planta será heterozigosa nesse locus. Se um transgene estiver presente em um dos cromossomos homólogos em uma planta diploide de um par de cromossomos homólogos em uma planta diploide, aquela planta será hemizigosa nesse locus.

Um "peptídeo de trânsito para cloroplasto" é uma sequência de aminoácido que é translatada em conjugação com uma proteína e direciona a proteína ao cloroplasto ou outros tipos de plastídeo presentes na célula, na quala proteina é feita. "Sequência de trânsito para cloroplasto " refere-se a uma sequência nucleotídica que codifica um peptídeo de trânsito para cloroplasto. Um "peptídeo sinal " é uma sequência de aminoácido que é translatada em conjunção com uma proteína e direciona a proteína ao sistema secretório (Chrispeels (1991 ) Ann. Rev. Plant Phys. Plant Mol. Biol. 42:21 -53). Se a proteina tiver que ser direcinada a um vacúolo, um sinal alvo vacuolar (supra) pode ser ainda adicionado, ou se ao retículo endoplasmático, um sinal de retenção de retículo endoplasmático (supra) poderá ser adicionado. Se a —protéina tiver que ser direcionada ao núcleo, qualquer peptídeo sinal presente será removido e ao invés disso um sinal de localização nuclear incluído (Raikhel (1992) Plant Phys. 700:1627-1632) Um "peptídeo de sinal mitocondrial " é uma sequência de aminoácido que direciona uma proteína precursora na mitocôndria (Zhang and Glaser (2002) Trends Plant Sci 7:14- 21).

A identidiade em porcento entre duas sequências de ácido nucléiclo ou de aminoácido pode ser determinada por inspeção visual e cálculo matemático.

Alternativamente, alinhamentos de sequência e cálculos de identidade podem ser determinados utilizando-se uma variedade de métodos de comparação designados como sequências homólogas incluindo, mas não limitadas a, ao programa MEGALIGN & da LASERGENEQG bioinformatics computing suite (DNASTARO Inc, Madison, WI). A menos que conste indicação contrária, o alinhamento múltiplo as sequências aqui providas foi feito utilizando-se o método Clustal V de alinhamento (Higgins and Sharp (1989) CABIOS. 5:151 153) com os parâmetros padrão (GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=10). Parâmetros padrão para alinhamentos aos pares e cálculo de identidade em porcentagem de sequências de proteína utilizando-se o método Clustal V são KTUPLE=1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 e —DIAGONALS SAVED=5. Para parâmetros de ácido nucléico esses parâmetros são KTUPLE=2, GAP PENALTY=5, WINDOW=4 e DIAGONALS SAVED=4. Após o alinhamento das sequências, utilizando-se o programa Clustal V, é possível obter “identidade em porcentagem" e "valores de divergência " pela visualização da tabela de "distâncias de sequência " no mesmo programa; a menos que conste indicação contrária, identidades em porcentagem e divergências providas e reivindicadas foram calculados desta maneira. Alternativamente, a identidade em porcentagem de duas — sequências de proteina pode ser determinada mediante comparação de informação de sequência baseada no algoritmo de Needleman, S. B. e Wunsch, C. D. (J. Mol, Biol., 48:443-453, 1970) e utilizando-se o programa de computador GAP — comercializado pela University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). Os parâmetros padrão preferidos para o programa GAP incluem: (1) uma matriz de classificação, blosum62, conforme descrito por Henikoff, S. e Henikoff, J. G. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915-10919, 1992); (2) um peso de lacuna de 12; (3) um peso comprimento de uma lacuna de 4; e(4)sem penalização para lacunas terminais.

Outros programas usados pelo versado na técnica de comparação de sequência também podem ser usados. A identidade em porcentagem pode ser determinada mediante comparação de informação de sequência utilizando-se, por exemplo, o programa BLAST descrito por Altschul et al. (Nucl. Acids. Res., 25, p. 3389-3402, 1997). Este programa está disponível na internet no website do National Center for Biotechnology Information (NCBI) ou do Banco de Dados de DNA do Japão (DDBJ). Os detalhes de várias condições (parâmetros) para busca de identidade utilizando- se o programa BLAST são apresentados nesses websites, e valores por defeito são comumente usados para busca embora parte das configurações possam ser mudadas se apropriado. Alternativamente, a identidade em porcentagem de duas sequências de aminoácido pode ser determinada mediante o uso de um programa tais como software de processamento de informação genética GENETYX Ver.7 (Genetyx Corporation, Japão) ou uso de um algoritmo tais como FASTA.

Neste caso, valores por defeito podem ser usados para busca.

A identidade por porcentagem entre duas sequências de ácido nucléico pode ser determinada pela inspeção visual e cálculo matemático, ou mais preferivelmente a comparação é feita comparando a informação de sequência com o uso de programa de computador.

Um programa de computador preferido, a título de exemplo é o programa Genetic Computer Group (GCGO; Madison, WI) WISCONSIN PACKAGEG versão 10.0, "GAP" (Devereux et al., 1984, Nucl.

Acids Res., 12:387). Adicionalmente à realização de uma comparação entre duas — sequências de ácido nucléico, este programa"GAP" pode ser usado para comparação entre duas sequências de aminoácidos e entre uma sequência de ácido nucléico e uma sequência de aminoácido.

Os parâmetros padrão preferidos para o programa "GAP" incluem: (1 ) a implementação GCGO de uma matriz de comparação unária (contendo um valor de 1 para identidades e O para não-identidades) para nucleotídeos, e a comparação de aminoácido ponderada de Gribskov e Burgess, Nucl.

Acids Res., 14:6745, 1986, conforme descrito por Schwartz e Dayhoff, eds., "Atlas of Polipeptideo Sequence and Structure," National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358, 1979, ou outras matrizes de comparação comparáveis; (2) uma penalização de 30 para cada lacuna e uma penalização adicional de 1 para cada símbolo em cada lacuna para sequência de aminoácidos, ou penalização de 50 para cada lacuna e uma penalização adicional de 3 para cada símbolo em cada lacuna para — sequência nucleotídicas; (3) sem penalização para lacunas finais; e (4) sem penalização máxima para lacunas longas.

Outros programas usados pelo versado na técnica de comparação de sequência também podem ser usados, tais como por exemplo o programa BLASTN versão 2.2.7, disponível para uso pelo website da National Library of Medicine, ou o algoritmo WU- BLAST 2.0 (Advanced Biocomputing, LLC). Adicionalmente, o algoritmo BLAST utiliza a matriz de classificação de aminoácido BLOSUM62, e parâmetros opcionais que podem ser usados são os seguintes: (A) inclusão de um filtro para mascarar segmentos da sequência de consulta que apresentam baixa complexidade composicional (conforme determinado pelo programa SEG de Wootton and Federhen (Computers and Chemistry, 1993); vide também Wootton and Federhen, 1996, "Analysis of compositionally biased regions in sequence databases," Methods Enzymol., 266: 554-71 ) ou segmentos que consistem de repetições internas de curta periocidade (conforme determinado pelo programa — XNU de Claverie and States (Computers and Chemistry, 1993)), e (B) um limite de significância estatística para relatar combinações contra sequências de base de dados, ou E-score (a probabilidade esperada de combinações que são encontradas meramente por chance, de acordo com o modelo estocástico de Karlin and Altschul, 1990; se a significância estatística atribuída a uma combinação for superior do que este limite E-score, a combinação não será relatada); valores-limite de E-score preferidos são 0,5, ou para a finalidade de aumentar a preferência, 0,25, 0,1 , 0,05, 0,01 , 0,001, 0,0001 , 1 e-5, 16-10, 1 e-15, 1 e-20, 1 e-25, 1 e-30, 1 e-40, 1 e-50, 1 e-75, ou 1e-100.

DNA recombinante padrão e técnicas de clonagem molecular usadas aqui são bem conhecidas no estado da técnica e são descritas mais detalhadamente em Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989 (doravante "Sambrook”).

Recorrendo agora às concretizações: Concretizações incluem polinucleotídeos isolados e polipeptídeos, construção de DNA recombinantes úteis para conferir tolerância à seca, composições (tais como plantas e sementes) compreendendo essas construções de DNA recombinante, e método que utilizam essas construções de DNA recombinantes.

Polinucleotídeos isolados e Polipeptídeos: A presente invenção inclui os seguintes polinucleotídeos isolados e polipeptídeos:

Um polinucleotídeo isolado compreendendo: (i) uma sequância de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo que apresenta uma sequência de aminoácido de pelo menos 50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%,

85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência, com base no método Clustal V de alinhamento, em comparação com SEQ ID NO: 27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 ou 87; ou (ii) um complemento inteiro da sequência de ácido nucléico de (1), em que o complemento inteiro e a sequência de ácido nucléico de (i) consiste do mesmo número de nucleotídeos e são 100% complementares.

Qualquer dos polinucleotídeos isolados anteriores podem ser utilizados em quaisquer construções de DNA recombinantes da presente invenção.

O polipeptídeo é preferivelmente um polipeptídeo DTP21; Um polipeptídeo isolado que apresenta uma sequência de aminoácido de pelo menos 50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência, com base no método Clustal WVde alinhamento, em comparação com SEQ ID NO: 27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 ou 87. O polipeptídeo é preferivelmente um polipeptídeo DTP21; Um polipeptídeo isolado, em que a sequência de aminoácido é derivada de SEQ ID NO: 27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 ou 87 pela alteração de um ou mais aminoácidos através de pelo menos um método selecionado do grupo que consiste em: deleção, substituição, adição e inserção ; e (c) um polipeptídeo em que a sequência de aminoácido do polipeptídeo compreende SEQ ID NO: 27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 ou 87. O polipeptídeo é preferivelmente um polipeptídeo DTP21; Um polinucleotídeo isolado compreendendo (i) uma sequência de ácido nucléico de pelo menos 50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 Y%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência, com base no método Clustal V de alinhamento, em comparação com SEQ ID NO: 26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 ou 86; ou (ii) um complemento inteiro da sequência de ácido nucléico de (i). Qualquer um dos polinucleotídeos isolados anteriores podem ser utilizados em quaisquer construções de DNA recombinante da presente invenção. O polinucleotídeo codifica preferivelmente um polipeptideo DTP21; Um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo com atividade de tolerância à seca, em que a sequência nucleotídica é hibridizável sob condições estringentes com a molécula de DNA compreendendo o complemento inteiro de SEQ ID NO: 26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 ou 86; Um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo com atividade de tolerância à seca, em que a sequência nucleotídica é derivada de SEQ ID NO: 26, 31, 44, 55, 59, —63,80,82,84 ou86 pela alteração de um ou mais nucleotídeos através de pelo menos um método selecionado do grupo que consiste em: deleção, substituição, adição e inserção.

Construções de DNA recombinante:

Em um aspecto da presente invenção inclui construções de DNA recombinante. Em uma concretização, uma construção de DNA recombinante compreende um polinucleotídeo ligado operativamente a pelo menos uma sequência reguladora (por exemplo, um promotor funcional em uma planta), em que o polinucleotídeo compreende (i) uma sequência de ácido nucléico que codifica uma sequência de aminoácido de pelo menos 50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência, com base no método Clustal V de alinhamento, em comparação com SEQ ID NO: 27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 ou 87; ou (ii) um complemento inteiro da sequência de ácido nucléico de (i).

Em outra concretização, uma construção de DNA recombinante compreende um polinucleotídeo ligado operativamente a pelo menos uma sequência reguladora (por exemplo, um promotor funcional em uma planta), em que o dito polinucleotídeo compreende (i) uma sequência de ácido nucléico de pelo menos 50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 58%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência, com base no método Clustal V de alinhamento, em comparação com SEQ ID NO: 26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 ou 86; ou (ii) um complemento inteiro da sequência de ácido nucléico de (i).

Em outra concretização, uma construção de DNA recombinante compreende um polinucleotídeo ligado operativamente a pelo menos uma sequência reguladora (por exemplo, um promotor funcional em uma planta), em que o dito polinucleotídeo codifica um polipeptíideo DTP21. O polipeptídeo DTP21 pode ser derivado de Arabidopsis thaliana, Zea mays, Glycine max, Glycine tabacina, Glycine soja e Glycine tomentella. Obviamente, como o versado na técnica poderá avaliar, que a invenção compreende mais do que as sequências específica apresentadas a título de exemplo. Alterações de um fragmento de ácido nucléico que resulta na produção de um de um aminoácido quimicamente equivalente em um determinado sítio, mas não afeta as propriedades funcionais do polipeptídeo codificado, são bem conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, um códon para a alanina de aminoácido, um ácido hidrofóbico, pode ser substituído por um códon que codifica um outro resíduo menos hidrofóbico, tais como glicina, ou um resíduo mais hidrofóbico tais como valina, leucina, ou isoleucina. Similarmente, alterações que resultam em substituição de um resíduo negativamente carregado por outro, tais como ácido aspártico por ácido glutâmico, ou um resíduo positivamente carregado por outro, tais como lisina por arginina, também podem ser esperadas para produzir um produto funcionalmente equivalente. Mudanças de nucleotideo que resultam em alteração das porções N-terminais e C-terminais da molécula de polipeptídeo não devem ser também esperadas para alterar a atividade do polipeptídeo. Cada uma das modificações propostas está perfeitamente dentro do estado da técnica, uma vez que é determinação de retenção de atividade biológica dos produtos codificados.

A proteína da presente invenção também pode ser uma proteína que compreende uma sequência de aminoácido, que inclui deleção, substituição, adição e/ou inserção de um ou mais aminoácidos em uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 27,32, 41 , 42, 45, 46, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64 e 66. A substituição pode ser conservadora, o que significa a substituição de um determinado resíduo de aminoácido por outro que apresenta características físicas e químicas similares. Exemplos de caráter não restritivo de substituição conservadora incluem substituição entre resíduos de aminoácido contendo grupo alifático tais como lie, Val, Leu ou Ala, e substituição entre resíduos polares tais como — substituição Lys-Arg, Glu-Asp ou GIn-Asn.

Proteínas derivadas por deleção de aminoácido, substituição, inserção e/ou adição podem ser preparadas quando DNAs que codificam suas protéinas tipo selvagem são submetidos, por exemplo, a mutagêneses sítio-direcionadas bem conhecidas (vide, por exemplo, Nucleic Acid Research, Vol. 10, No, 20, p.6487-6500, 1982, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade). Conforme aqui usado, o termo "um ou mais aminoácidos" é previsto para significar um possível número de aminoácidos que podem ser deletados, substituídos, inseridos e/ou adicionados por mutagênese sítio- direcionada.

Mutagênese sítio-direcionada pode ser realizada, por exemplo, como segue utilizando-se um primer de oligonucleotídeo sintético que é complementar ao DNA fago de fita única a ser mutado, exceto ter um pareamento — incompatível específico (ie, uma mutação desejada). Nomeadamente, o oligonucleotídeo sintético acima é usado como um primer para promover a síntese de uma fita complementar por fagos, e o DNA duplex resultante é então usado para transformar células hospedeiras. A cultura bacteriana transformada é colocado sobre agar, por meio do qual placas são deixadas para derivar células simples contendo fago. Consequentemente, teoricamente, 50% de novas colônias contém fagos com a mutação como uma fitaúnica, enquanto os 50% remanescentes apresentam a sequência original. À uma temperatura que permite hibridização com DNA completamente idêntico a um que apresenta a mutação acima desejada, mas não com DNA com fita original, as placas resultantes são deixadas hibridizar com uma amostra sintética marcada pelo tratamento quinase. Subsequentemente, placas hibridizadas com a amostra são captadas e cultivadas para que seu DNA seja coletado.

Técnica que permitem deleção, substituição, inserção e/ou adição de aminoácidos na sequência de aminoácidos depeptídeos biologicamente ativos tais como enzimas, enquanto retém sua ativida, incluem mutagênese síitio-direcionada acima mencionada, assim como outras técnicas tais como aquelas para tratamento de um gene com uma mutagene que trata um gene com um mutagene, e aquele no qual um gene é seletivamente clivado para remover, substituir, inserir ou adicionar um nucleotídeo ou nucleotídeos selecionados, e em seguida ligado.

A proteína da presente invenção também pode ser uma proteína que é codificada por um ácido nucléico compreendendo uma sequência nucleotídica que inclui deleção, substituição, inserção e/ou adição de um ou mais nucleotídeos em uma sequência nucleotídica selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 26, 31, 39, 40, 43, 44, 51 , 53, 55, 57, 59, 60, 63 e 65. Deleção de nucleotídeo, substituição, inserção e/ou adição podem ser realizadas por mutagênese sítio-direcionada ou outras técnicas conforme acima mencionado, A proteína da presente invenção também pode ser uma proteína que é codificada por um ácido nucléico que compreende uma sequência nucleotídica hibridizável sob condições estringentes com a fita complementar de uma sequência nucleotídica selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 26, 31, 39, 40, 43, 44, 51 , 53, 55, 57, 59, 60, 63 e 65.

O termo "sob condições estringentes " significa que duas sequências hibridizam sob condições moderadamente ou altamente estringentes. Mais especificamente, condições moderadamente estringentes podem ser prontamente determinadas pelos versados na técnica, por exemplo,

dependendo do — comprimento do DNA. As condições básicas são estabelecidas por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, terceira edição, capítulos 6 e 7, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001 e incluem o uso de uma solução de pré-lavagem para filtros de nitrocelulose 5xSSC,0.5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0), condições de hibridização de aproximadamente 50% de formamida, 2xS8SSC a 6xSSC sob aproximadamente 40-50 ºC (ou outras soluções de hibridização similares tais como solução de Stark, em aproximadamente 50% de formamida sob aproximadamente 42 ºC) e condições de lavagem de, por exemplo, aproximadamente 40- 60 ºC, 0,5- 6xSSC, 0,1% de SDS. Preferivelmente, são condições moderadamente estringentes (e lavagem) sob aproximadamente 50 ºC e 6xSSC. Condições altamente —estringentes também podem ser prontamente determinadas pelo versado na técnica, dependendo do comprimento do DNA.

Geralmente, tais soluções incluem hibridização e/ou lavagem sob temperatura mais elevada e/ou concentração de sal mais baixa (tal como hibridização sob aproximadamente 65 ºC, 6xSSC a 0,2xSSC, preferivelmente 6xSSC, mais preferivelmente —2xSSC, o mais preferivelmente 0,2xSSC), comparado com as condições moderadamente estringentes. Por exemplo, condições altamente estringentes podem incluir hibridização conforme acima definido, e lavagem sob aproximadamente 65-68 ºC, 0,2x8SC, 0,1 % SDS, SSPE (| xSSPE é 0,15 M NaCl, 10 mM NaH2P04, e 1,25 mM EDTA, pH 7,4) pode ser substituído por SSC (1 xSSC é NaCl 0,15 M e citrato de sódio 15 mM) nos tampões de hibridização e de lavagem; lavagem é feita por 15 minutos após hibridização ser concluída.

Também é possível usar um kit de hibridização comercialmente disponível que não utiliza substância radioativa como uma amostra. Exemplos específicos incluem hibridização com um sistema de marcação & detecção ECL “ECL direct labeling & detection system” (Amersham). Condições estringentes incluem, por exemplo, hibridização sob 42 ºC por 4 horas utilizando-se o tampão de hibridização incluído no kit, que é suplementado com reagente de bloqueio 5% (w/v) e NaCl 0,5 M, e lavagem duas vezes em SDS a 0,4%, 0,5x8SC sob 55 “ºC por 20 minutos e uma vez em 2xSSC sob temperatura ambiente por 5 minutos.

A proteína da presente invenção é preferivelmente uma proteína com atividade de tolerância à seca. "Construção de DNA de supressão" é uma construção de DNA recombinante, que quando transformado ou estavelmente integrado no genoma da planta, resulta em um "silenciamento" de um gene-alvo na planta.

O gene- alvo pode ser endógeno ou transgênico para a planta, "Silenciamento”" conforme aqui usado com relação ao gene-alvo em geral refere-se à supressão dos níveis de MRNA ou proteína/enzima expressada pelo gene-alvo, e/ou o nível da atividade da enzima ou funcionalidade da proteína.

Os termos "supressão", "suprimindo" e "silenciamento”, usados aqui de forma intercambiável, incluem diminuição, redução, declínio, descréscimo, inibição, eliminação ou impedimento, "Silenciamento" ou "silenciamento gênico" não específica o mecanismo e é inclusive, e não limitado, anti-senso, co- supressão, supressão viral, supressão por —hairpin, supressão de haste-e- loop, métodos com base em RNAi e métodos com base em pequenos RNA.

Uma construção de RNA de supressão pode compreender uma região derivada de um gene-alvo de interesse e pode compreender toda ou parte da sequência de ácido nucléico da fita senso (ou fita antissenso) do gene-alvo de interesse.

Dependendo do método a ser utilizado, a região pode ser100% idêntica ou menos de 100% idêntica (por exemplo, pelo menos 50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%,

89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 968%, 97%, 98%, ou 99% idêntica) a toda ou parte da fita senso (ou fita anti-senso) do gene de interesse.

Construções de DNA de supressão são bem conhecidos no estado da técnica, são prontamente construídos uma vez que o gene-alvo d interesse é selecionado, e inclui, sem limitação, construções de cosupressão, construções anti-senso, construções de supressão viral, construções de supressão por hairpin, construções de supressão haste-e-loop, construções produtoras de RNA de fita dupla, e mais genericamente, construções RNAi (RNA de interferência) e construções de RNA tais como construções sIRNA (RNA pequenos de interferência) e construções miRNA (microRNA).

"Inibição anti-senso " refere-se à produção de transcritos de RNA anti-senso capaz de suprimir a expressão do gene-alvo ou produto-alvo."RNA anti-senso" refere-se a um transcrito RNA que é complementar a todo ou parte do transcrito primário alvo ou mRNA e que bloqueia a expressão de um fragmento de ácido nucléico isolado alvo (pedido de patente amerícana No. 5,107,065). A complementariedade de um RNA anti-senso pode estar com qualquer parte do transcrito gênico específico, i.e, na sequência não coficadora 5, — sequência não-codificadora 3', intróns, ou a sequência codificadora.

"Cosupressão" refere-se à produção de transcritos de RNA senso capazes de suprimir a expressão do gene-alvo ou produto gênico. RNA "senso" refere-se ao transcrito RNA que inclui o MRNA e pode ser tranladado para a proteína dentro de uma célula ou in vitro. Construções de cosupressão em plantas foram previamente designados por focalização de superexpressão de uma sequência de ácido nucléico que apresenta homologia a um mRNA nativo, na orientação senso, que resulta na redução de todo RNA que apresenta homologia à sequência de superexpressão (vide Vaucheret et al., Plant J. 16:651 -659 (1998); e Gura, Nature 404:804-808 (2000)).

Outra variação descreve o uso de sequências virais de planta para direcionar a supressão de sequências codificadoras de MRNA proximais (publicação PCT No. WO 98/36083 publicada em 20 de agosto de 1998).

Sequências Reguladoras: Uma construção de DNA recombinante da presente invenção pode compreender pelo menos uma sequência reguladora.

Uma sequência reguladora pode ser um promotor.

Um número de promotores pode ser usado em construções de DNA recombinantes da presente invenção. Os promotores podem ser selecionados com base no resultado desejado e pode incluir promotores constitutivos, tecido-específicos, induzíveis ou outros promotores para expressão do organismo hospedeiro.

Promotores que fazem com que um gene seja expressado na maioria dos tipos celulaaes são comumente chamados de "promotores constitutivos”, Expressão constitutive de elevado nível do gene candidato sob controle do 358 ou promotor UBI pode apresentar efeitos pleiotrópicos, embora a eficácia de gene candidato possa ser estimada quando dirigido por um promotor constitutivo. O uso de promotores tecido-específicos e/ou estresse-específicos pode eliminar efeitos indesejados mas retém a habilidade de aumentar a tolerância à seca. Este efeito foi observado em Arabidopsis (Kasuga et al. (1999) Nature Biotechnol. 17:287-91 ). Promotores constitutivos adequados para uso em uma célula hospedeira de — planta inclui, por exemplo, o promotor núcleo do promotor Rsyn7 e outros promotores constitutivos descritos no pedido de patente WO 99/43838 e no pedido de patente americano No. 6,072,050; o promotor CaMV núcleo 358 (Odell et al., Nature 313:810-812 (1985)); actina de arroz (McElroy et al., Plant Cell 2:163-171 (1990)); ubiquitina (Christensen et al., Plant Mol.

Biol. 12:619-632 (1989) e Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18:675-689 (1992)); pEMU (Last et al., Theor. Appl. Genet. 81 :581 -588 (1991 )); MAS (Velten et al., EMBO J. 3:2723- 2730 (1984)); promotor ALS (U.S. Patent No. 5,659,026), e similares. Outros promotores constitutivos incluem, por exemplo, aqueles descritos nos pedidos de patente americanos Nos. 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121 ; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; 5,608,142; e 6,177,611.

Ao selecionar um promotor para usar nos métodos da invenção, pode ser desejável usar um promotor regulado de forma desenvolvemental ou tecido-específico. t Um promotor regulado de forma desenvolvemental ou tecido- específico é uma sequência de DNA que regula a expressão de uma sequência de DNA seletivamente nas células/tecidos de uma planta crítica ao desenvolvimento de pendão, colocação de semente, ou ambos e limita a — expressão de tal sequência de DNA ao período de desenvolvimento de pendão ou maturação de semente na planta. Qualquer promotor identificável pode ser usado nos métodos da presente invenção que causa a expressão temporal e espacial desejada. Í Promotores, que são sementes ou embriões específicos e podem serúteis na invenção incluem inibidor de tripsina Kunitz em sementes de soja (Kti3, Jofuku and Goldberg, Plant Cell 1 :1079-1093 (1989)), patatina (tubérculos de batata) (Rocha-Sosa, M., et al. (1989) EMBO J. 8:23-29), convicilina, vicilina, e legumina (cotiledôneas de ervilha) (Rerie, W.G., et al. (1991 ) Mol. Gen, Genet. 259: 149-157; Newbigin, E.J., et al. (1990) Planta 180:461-470; Higgins, T.J.V., et al. (1988) Plant. Mol. Biol. 1 1 :683-695), zein (endosperma do milho) (Schemthaner, J. P., et al. (1988) EMBO J. 7:1249- 1255), faseolina (cotiledônea de feijão) (Segupta-Gopalan, C, et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. U.-S.A. 82:3320-3324), fitohemaglutinina (cotiledônea de feijão) (Voelker, T. et al. (1987) EMBO J. 6:3571 -3577), B-conglicinina e glicinina (cotiledônea de soja) (Chen, Z-L, et al. (1988) EMBO J. 7:297- 302), glutelina (endosperma de arroz), hordeina (endosperma de cevada) (Marris, C, et al. (1988) Plant Mol. Biol. 10:359-366), glutenina e gliadina (endosperma do trigo) (Colot, V,., et al. (1987) EMBO J. 6:3559-3564), e esporamina (raiz tuberosa da bata doce) (Hattori, T., et al. (1990) Plant Mol. Biol. 14:595-604). Promotores de genes semente-específicos operativamente ligados aregiões codificadoras heterólogas em construções gênicas quiméricas mantém seu padrão de expressão temporal e espacial em plantas transgênicas. Tais exemplos incluem promotor de gene de proteína de armazenamento de semente Arabidopsis thaliana 28 para expressar peptídeos enkefalina em sementes Arabidopsis e Brassica napus (Vanderkerckhove et al, Bio/Technology 7:L929-932 (1989)), promotores de lecitina de soja e de beta- faseolina de soja para expressar luciferase (Riggs et al., Plant Sci. 63:47-57 —(1989)), e promotores de glutenina de trigo para expressar acetiltransferase do cloranfenicol (Colot et al., EMBO J 6:3559- 3564 (1987)).

Promotores induzíveis seletivamente expressam uma sequência de DNA operativamente ligada em resposta à presença de um estímulo endógeno ou exógeno, por exemplo através de compostos químicos (indutores químicos) ou em resposta ao ambiente, a sinais hormonais, químicos e/ou desenvolvementais, Promotores induzíveis ou regulados incluem, por exemplo, promotores regulados pela luz, calor, estresse, inundação ou seca, fitohormônios, ferimento ou produtos químicos tais como etanol, jasmonato, ácido salicílico ou agentes protetores.

Promotores para uso na presente invenção incluem o seguinte : 1) promotor RD29A estresse-induzível (Kasuga et al. (1999) Nature Biotechnol. 17:287-91 ); 2) o promotor de cevada, B22E; expressão de B22E é específico ao pedicelo no desenvolvimento de grão de ceral de milho ("Primary Structure of a Novel Barley Gene Differentially Expressed in Immature Aleurone Layers". Klemsdal, S.S. et al., Mol. Gen. Genet. 228(1 /2):9-16 (1991 )); e 3) promotor de milho, Zag2 ("Identification and molecular characterization of ZAG1 , the maize homolog of the Arabidopsis floral homeotic gene AGAMOUS", Schmidt, RJ. et al, Plant Cell 5(7):729-737 (1993); "Structural characterization, chromosomal localization and phylogenetic evaluation of two pairs of AGAMOUS-Wke MADS-box genes from maize", Theissen et al. Gene 156(2): 155- 166 (1995); NCBI GenBank Accession No. X80206)). Transcritos Zag2 podem ser detectados 5 dias antes da polinação a 7 a 8 dias após polinação ("DAP"), e direciona expressão no carpelo de desenvolvimento inflorescências femininas e Ciml que é específico ao núcleo de desenvolvimento de cernes de milho. Transcrito Ciml é detectado 4 a 5 dias após polinação a 6 a 8 DAP. Outros promotores úteis incluem qualquer promotor que possa ser derivado de um gene cuja expressão seja maternalmente associada ao desenvolvimento deflorzinhas fêmeas.

Promotores adicionais para regulação da expressão da sequência nucleotídicas da presente invenção em plantas são promotores colmos- específicos. Tais promotores colmos-específicos incluem os promotores alfalfa S2A (GenBank Accession No. EFO30816; Abrahams et al., Plant Mol, Biol.

27:513-528 (1995)) e promotor S2B (GenBank Accession No. EFO030817) e similares, aqui incorporados por referência.

Promotores podem ser derivados em sua totalidade de um gene nativo, ou ser composto de diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados na natureza ou mesmo compreender segmentos de —DNA sintéticos.

Promotores para uso na presente invenção podem incluir: RIP2, ml IP15, ZMCORI , Rabi7, CaMV 358, RD29A, B22E, Zag2, sintetase SAM, ubiquitina, CaMV 198, nos, Adh, sucrose sintase, R-allele, promotores preferidos de tecido vascular S2A (número de acesso ao Banco de Genes EFO30816) e S2B (número de acesso ao Banco de Genes EFO030817), e o promotor constitutivo GOS2 de Zea mays. Outros promotores incluem promotores preferidos de raiz, tais como o promotor NAS2 de milho, o — promotor Cyclode milho (US 2006/0156439, publicado em 13 de julho, 2006), o promotor ROOTMET2 de milho (WOO05063998, publicado em 14 de julho de 2005), o promotor CR1 BIO (WO0O6055487, publicado em 26 de maio de 2006), o CRWAQ81 (WOO05035770, publicado em 21 de abril de 2005) e o promotor ZRP2.47 de milho (número de acesso NCBI: U38790; GI No.

1063664).

Construções de DNA recombinantes da presente invenção também podem incluir outras sequências reguladoras, incluindo mas não limitada a, sequências líderes de translação, intróns, e reconhecimento de poliadenilação. Em outra concretização da presente invenção, a construção de DNA recombinante da presente invenção compreende ainda uma melhorador ou silenciador.

Uma sequência intrón pode ser adicionada à região não transladada 5', a região codificadora de proteína ou a região não transladada 3' para aumentar a mensagem de maturidade que acumula no citosol. Inclusão de intron encaixável na unidade de transcrição tanto em construções de expressão vegetal como animal foi mostrada para aumentar expressão gênica tanto em níveis de mMRNA como em níveis de proteína até 1000-vezes. Buchman e Berg, Mol. Cell Biol. 8:4395-4405 (1988); Callis et al., Genes Dev. 1 1183-1200 (1987).

Qualquer planta pode ser selecionada para a identificação de sequências reguladoras e genes de polipeptíideo DTP21 s serem usados nas construções de DNA recombinantes da presente invenção. Exemplos de alvos de planta adequados para o isolamento de genes e sequências reguladoras devem incluir mas não estão limitados a alfalfa, maça, damasco, Arabidopsis, alcachofra, arugula, aspargo, abacate, banana, cevada, beterraba, amora- preta, vacínio, brócolis, couve de bruxelas, repolho, canola, cantalupo, cenoura, cassava, mamona, couveflor, aipo, cereja, chicória, cilantro, planta cítrica, —Clementinas, trevo, côco, café, milho, algodão, uva-do-monte, pepino, conífera norte-americana “Douglas fir", berinjela, endívia, escarola, eucalipto, erva-doce, figo, alho, abóbora, uva, grapefíruit, melão, jicama, kiwi, alface, alho-poró, limão, lima, pinheiro teda, semente de linho, manga, melão, cogumelo, nectarina, noz, aveia, óleo de palma, óleo de colza, quiabo, oliva, cebola, laranja, planta ornamental, palma, mamão papaya, salsa, pastinaca, ervilha, pêssego, amendoim, pêra, pimenta, caqui, pinho, abacaxi, banana-da-terra, ameixa, romã, álamo, batata, abobora-moranga, marmelo, pinho radiata, chicória, rabanete, semente de colza, framboesa, arroz, centeio,cereal, pinus do Sul, feijão de soja, espinafre, morango, beterraba, cana de açúcar, girassol, batata — doce, liquidâmbar, tangerina, chá, tabaco, tomate, triticale, turfa, nabo, vinha, melancia, trigo, inhame e abóbora italiana.

Composições: Uma composição da presente invenção é uma planta que compreende em seu genoma qualquer uma das construções de DNA —recombinantes da presente invenção (tais como qualquer uma das construções acima mencionadas). Composições também incluem qualquer progênie da planta, e qualquer semente obtida da planta ou sua progênie, em que progênie ou semente compreende dentro de seu genoma a construção de DNA recombinante.

Progênie inclui gerações subsequentes obtidas por auto- —polinação ou cruzamento não relacionado de uma planta.

Progênie também inclui híbridos e inatos.

Em culturas propagadas por semente híbrida, plantas transgênicas maduras podem ser auto polinadas para produzir uma planta inata homozigosa. A planta inata produz semente contendo a construção de DNA recombinante mais recentemente construído. Essas sementes podem ser cultivadas para produzir plantas que exibam uma característica agronômica alterada (por exemplo, uma característica agronômica alterada opcionalmente sob condições hídricas limitantes),) ou usada em um programa de melhoramento para produzir uma semente híbrida, que possa ser cultivada para produzir plantas que exibam uma tal característica agronômica alterada. As sementes podem ser sementes de milho. A planta pode ser uma planta monocotiledônea ou dicotiledônea, por exemplo, um milho, arroz ou planta de soja, tais como uma planta híbrida de milho ou uma planta inata de milho. A planta pode ser também girassol, sorgo, canola, trigo, alfalfa, algodão, arroz, cevada, painço, cana de açúcar, switchgrass, tabaco, batata e beterraba. A construção de DNA recombinante pode ser estavelmente integrado no genoma da planta. Concretizações específicas incluem, mas não estão limitadas aos seguintes ítens:

1. Uma planta (por exemplo, uma planta de milho, arroz ou de soja) compreendendo em seu genoma uma construção de DNA recombinante que compreende um polinucleotídeo ligado operativamente a pelo menos uma sequência reguladora, em que o dito polinucleotídeo codifica um polipeptídeo que apresenta uma sequência de aminoácido de pelo menos 50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência, com base no método Clustal V de alinhamento, em comparação com SEQ ID NO: 27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 ou 87, e em que a dita planta exibe uma tolerância à seca aumentada em comparação com uma planta controle que não compreende a dita construção de DNA recombinante. A planta pode ainda exibir uma alteração de pelo menos uma característica agronômica em comparação com a planta controle.

2. Uma planta (por exemplo, uma planta de milho, arroz ou de soja) compreendendo em seu genoma uma construção de DNA recombinante que compreende um polinucleotídeo ligado operativamente a pelo menos uma sequência reguladora, em que o dito polinucleotídeo codifica um polipeptídeo DTP21, e em que a dita planta exibe uma tolerância à seca aumentada em “comparação com uma planta controle que não compreende a dita construção de DNA recombinante. A planta pode ainda exibir uma alteração de pelo menos uma característica agronômica em comparação com a planta controle.

3. Uma planta (por exemplo, uma planta de milho, arroz ou de soja) compreendendo em seu genoma uma construção de DNA recombinante — que compreende um polinucleotídeo ligado operativamente a pelo menos uma sequência reguladora, em que o dito polinucleotídeo codifica um polipeptídeo DTP21, e em que a dita planta exibe uma alteração de pelo menos uma característica agronômica em comparação com uma planta controle que não compreende a dita construção de DNA recombinante.

4. Uma planta (por exemplo, uma planta de milho, arroz ou de soja) compreendendo em seu genoma uma construção de DNA recombinante que compreende um polinucleotídeo ligado operativamente a pelo menos um elemento regulador, em que o dito polinucleotídeo codifica um polipeptídeo que apresenta uma sequência de aminoácido de pelo menos 50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência, com base no método Clustal V de alinhamento, em comparação com SEQ ID NO: 27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 ou 87, e em que a dita planta exibe uma alteração de pelo menos uma característica agronômica em comparação com uma planta controle que não compreende a dita construção —de DNA recombinante.

5. Uma planta (por exemplo, uma planta de milho, arroz ou de soja) compreendendo em seu genoma uma construção de DNA recombinante que compreende um polinucleotídeo ligado operativamente a pelo menos um elemento regulador, em que o dito polinucleotídeo compreende uma sequência —nucleotídica que codifica um polipeptídeo com atividade de tolerância à seca, em que o sequência nucleotídica é: (a) hibridizável sob condições estringentes com a molécula de DNA compreendendo o complemento inteiro de SEQ ID NO: 26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 ou 86; ou (b) derivado de SEQ ID NO: 26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 ou 86 pela alteração de um ou mais nucleotídeos através de pelo menos um método selecionado do grupo que consiste em: deleção, substituição, adição e inserção; e em que a dita planta exibe tolerância à seca quando aumentada comparado com uma planta controle que não compreende a dita construção de DNA recombinante.

6. Uma planta (por exemplo, uma planta de milho, arroz ou de soja) compreendendo em seu genoma uma construção de DNA recombinante que compreende um polinucleotídeo ligado operativamente a pelo menos um elemento regulador, em que o dito polinucleotídeo compreende uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo com atividade de tolerância à Seca, em que o sequência nucleotídica é: (a) hibridizável sob condições estringentes —com uma molécula de DNA compreendendo o complemento inteiro de SEQ ID NO: 26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 ou 86; ou (b) derivado de SEQ ID NO: 26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 ou 86 pela alteração de um ou mais nucleotídeos através de pelo menos um método selecionado do grupo que consiste em:

deleção, substituição, adição e inserção; e em que a dita planta exibe uma alteração de pelo menos uma caracteristica agronômica em comparação com uma planta controle que não compreende a dita construção de DNA recombinante.

7. Uma planta (por exemplo, uma planta de milho, arroz ou de soja) compreendendo em seu genoma uma construção de DNA recombinante que compreende um polinucleotideo, em que o dito polinucleotídeo compreende pelo menos uma sequência nucleotídica selecionada do grupo que consiste em : (a) Fragmento genômico IS125; (b) Sub2 de fragmento genômico IS125; (c) Sub3 de fragmento genômico 18125; (d) Sub5 de fragmento genômico 18125; (e) Sub7 de fragmento genômico 18125; (f) Sub8 de fragmento genômico 18125; e (g) fragmento genômico 18127.

8. Qualquer progênie das plantas acima em concretizações 1 -7, quaisquer sementes das plantas acima em concretizações 1 -7, quaisquer sementes de progênie das plantas acima em concretizações 1-7, e células de qualquer uma das plantas acima em concretizações 1 -6 e progênie destas.

Em qualquer das concretizações a seguir 1 -8 ou quaisquer outras concretizações da presente invenção, o polipeptíideo DTP21 pode ser de Arabidopsis thaliana, Zea mays, Glicina max, Glicina tabacina, Glicina soja ou Glicinatomentella. : Em qualquer uma das concretizações a seguir 1 -8 ou quaisquer outras concretizações da presente invenção, a construção de DNA recombinante pode compreender pelo menos um promotor funcional em uma planta como uma sequência reguladora.

Em qualquer uma das concretizações a seguir 1 -8 ou quaisquer outras concretizações da presente invenção, a alteração de pelo menos uma característica agronômica seja um aumento ou decréscimo.

Em qualquer uma das concretizações a seguir 1 -B8 ou qua ou quaisquer outras concretizações da presente invenção, pelo menos uma característica agronômica pode ser selecionada do grupo que consiste em verdor, rendimento, taxa de crescimento, biomassa, peso fresco de maturação, peso seco na maturação, rendimento de fruto, rendimento de semente, conteúdo total de nitrogênio da planta, conteúdo de nitrogênio de fruto, conteúdo de nitrogênio de semente, conteúdo de nitrogênio em um tecido vegetativo, conteúdo total de aminoácido livre, conteúdo de aminoácido livre no fruto, conteúdo de aminoácido livre na semente, contéudo de aminoácido livre em um tecido vegetativo, conteúdo total de proteína de planta, conteúdo de proteína de fruto, conteúdo de proteína de semente, contéudo de proteína em um tecido vegetativo, tolerância à seca, absorção de nitrogênio, acamamento de raíz, índice cultivado, tombamento dos colmos, altura de planta, altura, altura de espiga, tolerância ao sal, vigor de da plântula precoce e emergência de plântula sob estresse a baixas temperaturas. Por exemplo, a alteração de pelo menos uma característica agronômica pode ser um aumento em rendimento, verdor ou biomassa.

Em qualquer uma das concretizações a seguir 1 -8 ou quaisquer outras concretizações da presente invenção, a planta pode exibir a alteração de pelo menos uma característica agronômica em comparação, sob condições hídricas limitantes, a uma planta controle que não compreende a dita construção de DNA recombinante.

"Seca" refere-se a um decréscimo na disponibilidade de água para uma planta que, especialmente quando prolongado, pode causar dano à planta ou impedir seu crescimentos corretamente (por exemplo, limita o crescimento da planta ou rendimento de semente).

"Tolerância à seca" é um traço de uma planta que sobrevive sob condições de seca por períodos prolongados de tempo sem exibir deterioração fisiológica ou física substancial.

"Tolerância à seca aumentada" de uma planta é medida com relação a uma planta de referência ou de controle, e é um traço da planta para sobreviver sob condições de seca por períodos prolongados de tempo, sem exibir o mesmo grau de deterioração fisiológica ou física com relação à planta de referência ou de controle desenvolvida sob condições de seca similares. Tipicamente, quando uma planta transgênica compreendendo uma construção de DNA recombinante em seu genoma exibe tolerância à seca aumentada com relação à planta de referência ou de controle, a planta de referência ou de controle não compreende em seu genoma a construção de DNA recombinante.

Um versado na técnica está familiarizado com protocolos de simulação de condições de seca e de avaliação da tolerância à seca de plantas que foram submetidas a condições de seca simuladas ou de ocorrência natural. Por exemplo, pode-se estimular condições de seca fornecendo às plantas menos água do que normalmente seria necessário ou nenhum água porum período de tempo, e pode-se avaliar a tolerância à seca procurando diferenças em condições fisiológicas e/ou físicas, incluindo (mas não limitada a) vigor, crescimento, tamanho, ou comprimento de raíz, ou particularmente, cor da olha ou tamanho da área da folha. Outras técnicas de avaliação da tolerância à seca incluem medição da florescência de clorofila, taxas fotossintéticas e taxas de troca gasosa.

Um teste de estresse em relação à seca pode abranger um estresse crônico (i.e., baixa velocidade de secagem “slow dry down") e/ou pode abranger dois estresses agudos (i.e, remoção abrupta de água) separados por um dia ou dois de recuperação. Estresse crônico pode durar de 8-10 dias. Estresse agudo pode durar de 3 - 5 dias. As variáveis seguintes podem ser medidas durante o estresse à seca e tratamentos bem regados de plantas transgênicas e plantas de controle relevantes: A variável “% mud. área crônica inicial - aguda2" é uma medida da mudança em porcento em uma área total determinada pelo imageamento de espectro visível remoto entre o primeiro dia de estresse crônico e o dia do segundo estresse agudo.

A variável “% mud. área cr i-cr f' é uma medida da mudança em porcento na área total determinada pelo imageamento de espectro visível remoto entre o primeiro dia de estresse crônico e o último dia de estresse crônico.

A variável "% mud. área cr i-colh" é a medida da mudança em porcento na área total determinada pelo imageamento do espectro visível remoto entre o primeiro dia de estresse crônico e o dia de colheita.

A variável "% mud. área. cr i-rec24hs" é uma medida da mudança em porcento na área total determinada pelo imageamento do espectro visível remoto entre o primeiro dia de estresse crônico e 24 horas na recuperação (24horas após estresse agudo 2).

A variável "psii aguda1" é uma medida da eficiência de Fotosistema || (PSI!) no final do primeiro período de estresse agudo. Ela prove uma estimative da eficiência na qual a luz é absorvida por PSI | antennae e está diretamente relacionada à assimilação de dióxido de carbono dentro da folha.

A variável "psii aguda2" é uma medida da eficiência de Fotosistema || (PSII) no final do segundo período de estresse agudo. Ela prove uma estimative da eficiência na qual a luz é absorvida por PSI! antennae e está diretamente relacionada à assimilação de dióxido de carbono dentro da folha.

A "fvfm aguda1 " variável é uma medida do rendimento optimum quantum (FvFm) ano final do primeiro estresse agudo - (diferença de fluorescência variável entre a fluorescência máxima e mínima / fluorescência máxima).

A variável "fv/fm aguda2" é uma medida do rendimento optimum quantum (FvFm) no final do segundo estresse agudo - (diferença de fluorescência variável entre a fluorescência mínima e máxima/ fluorescência máxima).

A variável "colheita enrolamento de folha" é uma medida da razão de imageamento de topo com relação ao imageamento lateral no dia da colheita, A variável "enrolamento folha rec24hs" é uma medida da razão de imageamento de topo com relação ao imageamento lateral em 24 horas na recuperação.

A variável "Taxa de Crescimento Específica (SGR)" representa a mudança na área superfície da planta total (como medido pelo Instrumento Lemna Tec) durane um único dia (Y() = r “trt YO'e). Y(W = YO0'e é equivalente a mudança em % para Y/A t onde os termos individuais são como segue: Y(t)= área de superfície total em t; YO = área de superfície total inicial - 1 (estimada); r = dia de taxa de crescimento específico > e t = dias após o plantio ("DAP").

A variável "peso em seco de broto" é uma medida do peso de broto 96 horas após ser colocado em um forno a 104 ºC.

A variável "peso fresco de broto " é uma medida do peso de broto imediatamente após ser cortado da planta.

Os exemplos abaixo descrevem alguns protocolos representativos e técnicas de simulação de condições de seca e/ou avaliação da tolerância à seca.

Pode-se também avaliar a tolerância à seca através da habilidade de uma planta em manter um rendimento suficiente (pelo menos 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100%

de rendimento) em teste de campo sob condições de seca de ocorrência natural (por exemplo, pela medição de rendimento substancialmente equivalente sob condições de seca comparado com condições de não-seca ou pela medição de menos perda de rendimento sob condições de seca comparado com uma planta controle ou de referência).

O versado na técnica reconhecerá prontamente um controle adequado ou planta de referência a ser utilizada quando avaliada ou medida uma característica agronômica ou fenótipo de uma planta transgênica em qualquer concretização da presente invenção, na qual uma planta controle é utilizada (por exemplo, composições ou métodos conforme aqui descritos). Por exemplo, a título de ilustrações não limitativas: 1 . Progênie de uma planta transformada que é hemizigosa com relação a uma construção de DNA recombinante, de forma que a progênie vá se segregando em plantas que compreendam ou não compreendem a construção de DNA recombinante: a progênie que compreende a construção de DNA recombinante deve ser medida com relação à progênie que não compreende a construção de DNA recombinante (i.e.,,a progênie que não compreende a construção de DNA recombinante é a planta controle ou de referência).

2. Introgressão de uma construção de DNA recombinante em uma linhagem inata, tais como milho, ou em uma variedade tais como em soja: a linhagem introgressada deve ser tipicamente medida com relação à linhagem inata parental ou linhagem de variedade (i.e., a linhagem inata parental ou linhagem de variedade é a planta controle ou de referência).

3. Duas linhagens híbridas, em que a primeira linhagem híbrida é produzida a partir de duas linhagens inatas parentais, e a segunda linhagem híbrida é produzida a partir das mesmas duas linhagens inatas parentais exceto aquela uma das linhagens inatas parentais que contém uma construção de DNA recombinante: a segunda linhagem híbrida deve ser tipicamente medida com relação à primeira linhagem híbrida (i.e., a primeira linhagem híbrida é a planta controle ou de referência).

4. Uma planta compreendendo uma construção de DNA recombinante: a planta pode ser avaliada ou medida com relação a uma planta controle que não compreende a construção de DNA recombinante, mas que tenham um background genético comparável em relação à planta (por exemplo, compartilhando pelo menos 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência de material genético nuclear comparado com a planta que compreende a construção de DNA recombinante. Existem muitas técnicas com base em laboratório disponíveis para a análise, comparação e caracterização de backgrounds genéticos de plantas; entre eles temos lIsoenzima Eletroforese, Polimorfismo de Comprimento de Fragmento de Restrição (RFLPs), DNAs polimórficos ampliados randomicamente (RAPDs), Reação em cadeia de polimerase com primers arbitrários (AP-PCR), Impressão digital da amplificação do DNA (DAF), Regiões Amplificadas de Sequência Caracterizada (SCARs), Polimorfismos de Comprimento de Fragmento Amplificado (AFLPOs), e Repetições de Sequência Simples (SSRs) que também são chamados de microsatélites.

Além disso, o versado na técnica deverá reconhecer prontamente que uma planta controle ou de referência adequada a ser utilizada quando da avaliação ou medição de uma característica agronômica ou fenótipo de uma planta transgênica não deve incluir uma planta que tenha sido previamente selecionada, via mutagênese ou transformação, para a característica —agronômica desejada ou fenótipo.

Métodos: Métodos incluem mas não são limitados a métodos para aumentar a tolerância à seca em uma planta, métodos para avaliação da tolerância à seca em uma planta, métodos para alteração de uma característica agronômica em uma planta, métodos para determinação de uma alteração de uma característica agronômica em uma planta, e método de produção de semente. A planta pode ser uma planta monocotiledônea ou dicotiledônea, por exemplo, um milho, arroz, ou planta de soja. A planta também pode ser um girassol, sorgo, canola, trigo, alfalfa, algodão, cevada ou painço. A semente pode ser uma semente de milho, arroz, ou semente de soja, por exemplo, uma semente híbrida de milho ou semente inata de milho. Métodos incluem mas não estão limitados ao seguinte: Um método para transformação de uma célula que compreende a transformação de uma célula com qualquer um dos polinucleotídeos isolados da presente invenção, A célula transformada por este método também é incluído. Em concretizações específicas, a célula é uma célula eucariótica, por exemplo, uma levedura, inseto ou célula de planta, ou procariótica, por exemplo, uma célula bacteriana.

Um método para produção de uma planta transgênica compreendendo a transformação de uma célula de planta com qualquer um dos polinucleotídeos isolados ou construções de DNA recombinante da presente invenção e regeneração de uma planta transgênica a partir da célula de plantatransformada. A invenção também é direcionada à planta transgênica produzida por este método, e semente transgênica obtida a partir dessa planta transgênica, Um método para isolar um polipeptídeo da invenção a partir de uma célula ou meio de cultura da célula, em que a célula compreende uma construção de DNA recombinante que compreende um polinucleotíideo da invenção ligado operativamente a pelo menos uma sequência reguladora, e em que a célula hospedeira transformada é cultivada sob condições que são adequadas para a expressão da construção de DNA recombinante.

Um método de alteração do nível de expressão de um polipeptídeo da invenção em uma célula hospedeira compreendendo: (a) transformar uma célula hospedeira com uma construção de DNA recombinante da presente invenção; e (b) cultivar a célula hospedeira transformada sob condições que são adequadas para expressão da construção de DNA recombinante em que a expressão da construção de DNA recombinante resulta na produção de níveis alterados do —polipeptídeo da invenção na célula hospedeira transformada.

Um método para aumentar a tolerância à seca em uma planta, compreendendo: (a) introduzir uma célula de planta regenerável de uma construção de DNA recombinante, que compreende um polinucleotídeo ligado operativamente a pelo menos uma sequência reguladora (por exemplo, um promotor funcional em uma planta), em que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo que apresenta uma sequência de aminoácido de pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% identidade de sequência, com base no método Clustal V de alinhamento, em comparação com SEQ ID NO: 27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 ou 87; e (b) regenerar uma planta transgênica a partir da célula de planta regenerável após etapa (a), em que a planta transgênica compreende em seu genoma a construção de DNA recombinante e exibe tolerância à seca aumentada, em comparação com uma planta controle que não compreende a construção de — DNA recombinante.

O método pode ainda compreender (c) obter uma progênie de planta derivada da planta transgênica, em que a dita progênie de planta compreende em seu genoma a construção de DNA recombinante e exibe tolerância à seca em comparação com uma planta controle que não compreende a construção de DNA recombinante.

Um método para aumentar a tolerância à seca em uma planta, compreendendo: (a) introduzir em uma célula de planta regenerável uma construção de DNA recombinante, compreendendo um polinucleotídeo — operativamente ligado a pelo menos um elemento regulador, em que o dito polinucleotíideo compreende uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo com atividade de tolerância à seca, em que o sequência nucleotídica é: (a) hibridizável sob condições estringentes com uma molécula de DNA compreendendo o complemento inteiro de SEQ ID NO: 26, 31, 44, 55, 59,63,80, 82,84 ou 86; ou (b) derivada de SEQ ID NO: 26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 ou 86 pela alteração de um ou mais nucleotídeos através de pelo menos um método selecionado do grupo que consiste em: deleção, substituição, adição e inserção; e (b) regenerar uma planta transgênica a partir da célula de planta regenerável após etapa (a), em que a planta transgênica compreende em seu genoma a construção de DNA recombinante e exibe tolerância à seca aumentada, em comparação com uma planta controle que não compreende a construção de DNA recombinante. O método pode ainda compreender (c) obter uma progênie de planta derivada da planta transgênica, em que a dita progênie de planta compreende em seu genoma a construção de — DNA recombinante e exibe tolerância à seca em comparação com uma planta controle que não compreende a construção de DNA recombinante.

Um método de avaliação da tolerância à seca em uma planta, compreendendo (a) obter uma planta transgênica, em que a planta transgênica compreende em seu genoma uma construção de DNA recombinante compreendendo um polinucleotídeo ligado operativamente a pelo menos uma sequência reguladora (por exemplo, um promotor funcional em uma planta), em que o dito polinucleotideo codifica um polipeptideo que apresenta uma sequência de aminoácido de pelo menos 50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%,

56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%; ou 100% de identidade de sequência, com base —nométodo Clustal V de alinhamento, em comparação com SEQ ID NO: 27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 ou 87; (b) obter uma progênie de planta derivada de a dita planta transgênica, em que a progênie de planta compreende em seu genoma a construção de DNA recombinante; e (c) avaliar a progênie de planta quanto à tolerância à seca comparada com uma planta controle que não compreender a construção de DNA recombinante.

Um método de avaliação da tolerância à seca em uma planta, compreendendo (a) obter uma planta transgênica, em que a planta transgênica compreende em seu genoma uma construção de DNA recombinante compreendendo um polinucleotídeo operativamente ligado a pelo menos um — elemento regulador, em que o dito polinucleotídeo compreende uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo com atividade de tolerância à seca, em que o sequência nucleotídica é: (a) hibridizável sob condições estringentes com uma molécula de DNA compreendendo o complemento inteiro de SEQ ID NO: 26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 ou 86; ou (b) derivado de SEQ ID NO: 26, 31,44,55,59,63,80, 82,84 ou 86 pela alteração de um ou mais nucleotídeos através de pelo menos um método selecionado do grupo que consiste em: deleção, substituição, adição e inserção; (b) obter uma progênie de planta derivada de a dita planta transgênica, em que a progênie de planta compreende em seu genoma a construção de DNA recombinante; e (c) avaliar a progênie de planta quanto à tolerância à seca comparada com uma planta controle que não compreender a construção de DNA recombinante.

Um método para determinação e uma alteração de uma característica agronômica em uma planta, compreendendo (a) obter uma planta transgênica, em que a planta transgênica compreende em seu genoma uma construção de DNA recombinante compreendendo um polinucleotídeo ligado operativamente a pelo menos uma sequência reguladora (por exemplo, um promotor funcional em uma planta), em que o dito polinucleotídeo codifica um —polipeptideo que apresenta uma sequência de aminoácido de pelo menos 50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência, com base no método Clustal V de alinhamento, em comparação com SEQ ID NO: 27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 ou 87; (b) obter uma progênie de planta derivada da dita planta transgênica, em que a progênie de planta compreende em seu genoma a construção de DNA recombinante; e (c) determinar se a progênie de planta exibe uma alteração em pelomenos uma característica agronômica em comparação, opcionalmente sob condições hídricas limitantes, a uma planta controle que não compreende a construção de DNA recombinante.

Um método para determinação e alteração de uma característica agronômica em uma planta, compreendendo (a) obter uma planta transgênica, em que a planta transgênica compreende em seu genoma uma construção de DNA recombinante compreendendo um polinucleotídeo operativamente ligado a pelo menos um elemento regulador, em que o dito polinucleotídeo compreende uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo com atividade de tolerância à seca, em que o sequência nucleotídica é: (a) hibridizável sob condições estringentes com uma molécula de DNA compreendendo o complemento inteiro de SEQ ID NO: 26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 ou 86; ou (b) derivada de SEQ ID NO: 26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 ou 86 pela alteração de um ou mais nucleotídeos através de pelo menos um método selecionado do grupo que consiste em: deleção, substituição, adição e inserção; (b) obter uma progênie de planta derivada da dita planta transgênica, em que a progênie de planta compreende em seu genoma a construção de DNA recombinante; e (c) determinar se a progênie de planta exibe uma alteração em uma pelo menos uma característica agronômica em comparação, opcionalmente sob condições hídricas limitantes, a uma planta controle que não compreende a construção de DNA recombinante.

Um método de produção de semente, por exemplo, semente que pode ser vendida como produto tolerante à seca, compreendendo qualquer um dos métodos anteriores, e compreendendo ainda a obtenção de sementes derivadas da dita progênie de planta, em que ditas sementes compreendem em seu genoma a dita construção de DNA recombinante.

Em qualquer um dos métodos anteriores ou quaisquer outras concretizações de métodos da presente invenção, em dita etapa de introdução dita célula de planta regenerável pode compreender uma célula calosa, uma célula calosa embriogênica, uma célula gamética, uma célula meristemática, ou uma célula de um embrião imaturo.

As células de planta regeneráveis podem derivar de uma planta de milho inata.

Em qualquer um dos métodos anteriores ou quaisquer outras concretizações de métodos da presente invenção, a dita etapa de regeneração pode compreender o seguinte: (i) cultivo das ditas células de planta transformadas — em um meio compreendendo um hormônio promotor embriogênico até ser observada uma organização calosa; (ii) transferência das ditas células de planta transformadas da etapa (1) para um primeiro meio que inclui uma organização tecidual que promove — hormônio; e (iii) subcultivo das ditas células de planta transformadas após a etapa (ii) em um segundo meio para permitir elongação de broto, desenvolvimento de raiz ou ambos.

Em qualquer um dos métodos anteriores ou quaisquer outras concretizações de métodos da presente invenção, pelo menos uma característica agronômica pode ser selecionada a partir do grupo consistindo em verdor, rendimento, taxa de crescimento, biomassa, peso fresco de maturação, peso seco na maturação, rendimento de fruto, rendimento de semente, conteúdo total de — nitrogênio da planta, conteúdo de nitrogênio de fruto, conteúdo de nitrogênio de semente, conteúdo de nitrogênio em um tecido vegetativo, conteúdo total de aminoácido livre, conteúdo de aminoácido livre no fruto, conteúdo de aminoácido livre na semente, contéudo de aminoácido livre em um tecido vegetativo, conteúdo total de proteína de planta, conteúdo de proteína de fruto, conteúdo de proteina de semente, contéudo de proteína em um tecido vegetativo, tolerância à seca, absorção de nitrogênio, acamamento de raíz, índice cultivado, tombamento dos colmos, altura de planta, altura, altura de espiga, tolerância ao sal, vigor de da plântuia precoce e emergência de plântulia sob estresse à baixas temperaturas. A alteração de pelo menos uma característica agronômica pode ser um aumento em rendimento, verdor ou biomassa.

Em qualquer um dos métodos anteriores ou quaisquer outras concretizações de métodos da presente invenção, a planta pode exibir a alteração de pelo menos uma característica agronômica em comparação, sob condições hídricas limitantes, a uma planta controle que não compreende a dita construção de DNA recombinante.

Em qualquer um dos métodos anteriores ou quaisquer outras concretizações de métodos da presente invenção, existem alternativas para introduzir em uma célula de planta regenerável uma construção de DNA recombinante compreendendo um polinucleotídeo ligado operativamente a pelo menos uma sequência reguladora. Por exemplo, pode-se introduzir um uma célula de planta regenerável uma sequência reguladora (tais como um ou mais melhoradores, opcionalmente como parte de um elemento transponível), e em seguida identificar um evento, no qual a sequência reguladora é operativamente ligada um gene endógeno que codifica um polipeptídeo da presente invenção.

A introdução de construções de DNA recombinantes da presente invenção em plantas pode ser feita por qualquer técnica adequada, incluindo mas não limitado a uma captação direta de DNA, tratamento químico, —eletroporação, microinjeção, fusão celular, infecção, transferência de DNA vetor-mediada, bombardeamento, ou transformação agrobactéria-mediada. Técnica para transformação de planta e regeneração é descrita na publicação de pedido internacional WO 2009/006276, os conteúdos da qual são aqui incorporados por referência.

O desenvolvimento ou regeneração de plantas contendo o fragmento de ácido nucléico isolado exógeno estranho que codifica uma proteína de interesse é bem conhecido no estado da técnica. As plantas regeneradas podem ser auto- polinadas para prover plantas transgênicas homozigosas. Pelo contrário, pólens obtidos a partir de plantas regeneradas são cruzados formando plantas derivadas de semente de linhagens agronomicamente importantes, Conversely, pollen from plants of these important lines is used to pollinate regenerated plants. A planta transgênica da presente invenção contendo um polipeptídeo desejado é cultivada utilizando-se métodos bem conhecidos ao versado na técnica.

EXEMPLOS A presente invenção é ainda ilusrtada nos exemplos seguintes, em que partes e porcentagens são indicados em peso e graus são Celsius, salvo indicação diferente. Naturalmente que esses exemplos, enquanto indicam concretizações preferidas da invenção, são fornecidos a título meramente ilustrativo. A partir dessa discussão e esses exemplos, o versado na técnica poderá verificar as características essenciais desta invenção, e sem abandonar o espírito e escopo da mesma, poderá efetuar várias modificações da invenção para adaptá-la a vários usos e condições. Desse modo, várias modificações da invenção, adicionalmente àquelas mostradas e descritas aqui, serão evidentes ao versado na técnica a partir da descrição a seguir. Tais modificações são também destinadas a se enquadrarem dentro do escopo das reivindicações anexas. EXEMPLO 1

CRIAÇÃO DE UM BANCO DE COSMÍDEOS DE CAPIM SUDÃO Sementes de Sorgo sudanense cv. Sugar Slim (capim Sudão) foram comprados da Kaneko Seeds Co., Ltd. E plantados para cultivo em uma estufa. O DNA genômico foi extraído de folhas das plantas. O DNA genômico extraído foi submetido a digestão parcial com enzima de restrição Taq|l e, em seguida, frações contendo DNA de 30 kb a 50 kb foram preparadas por centrifução por gradiente de densidade sucrose. O DNA daquelas frações foi clonado no vetor cosmídeo pSB200 que havia sido digerido por Nsp(7524)V (também denominado aqui "NspV") para construir um Banco de DNA genômico.

O vetor de clonagem pSB200 foi construído a partir de pSB1 1 (Komari et al. Plant J. 10:165-174, 1996). Especificamente, um promotor da ubiquitina de milho foi colocado antes de um gene de resistência à higromicina e o sinal terminal 3' do gene NOS. Um sítio de clivagem Nsp(7524)V foi adicionado à construção, que foi então inserida em pSB1 1, para desse modo construir pSB200. Com o uso de pSB200, pode-se construir um banco de DNA genômico que apresenta um comprimento de fragmento médio de aproximadamente 40 kb. O vetor pSB200 também é um vetor de transformação para plantas mais altas e contém o gene de resistência à higromicina para uso como um marcador de seleção, À maior parte dos fragmentos de DNA clonados no banco apresentou tamanhos de aproximadamente 30 kb a aproximadamente 50 kb e o número total de clones foi de aproximadamente 30,000. As cepas de E. coli usadas foram DH5a"" e GENEHOGSO,.

EXEMPLO 2

TELAS PARA IDENTIFICAR LINHAGENS DE ARROZ TRANSGÊNICO COM TOLERÂNCIA

AUMENTADA À SECA Cultivar sementes originais de arroz Yukihikari que foram adquiridas de um varejista no setor alimentício, e as sementes por progênie foram cultivadas em estufas. Sementes originais de cultivar de arroz Suweon 287 foram obtidas do Instituto Nacional de Pesquisas Agrobiológicas do Japão, e as sementes por progênie foram colhidas em estufas. A capacidade de plantas de arroz para sobreviver à severa escassez de água em pequenos recipientes foi examinada pelo seguinte método.

1) Seis plantas transgênicas e cada uma das plantas de controle Suweon 287 e Yukihikari foram cultivadas juntas em solo em um pequeno pote (10,5 cm de diâmetro, 9 cm de altura, 570 ml de volume).

Suweon 287 é um cultivar de controle tolerante à seca, e Yukihikari é um cultivar de controle susceptível à seca. Sob essa condição, raízes são contidas em um espaço limitado de forma que a diferença de capacidade em se estender a raízes profundas no solo não é um fator no teste. À condição total de plantas neste método é absolutamente uniforme pois a variação em conteúdo de água no solo dentro de um pote é muito pequena.

2) Quando a sexta folha é estendida, a rega é suspensa entre três e quatro dias até as folhas de Yukihikari de controle perderem qualquer sinal aparente de viabilidade. O nível de desidratação pode variar de um pote para outro até certo ponto, mas a aparência de Yukihikari de controle fornece uma boa indicação do nível de estresse à seca no pote.

3) para facilitar a classificação, as plantas foram regadas e examinadas no dia seguinte.

4) No dia seguinte, as plantas foram visualmente examinadas e classificadas de acordo com os critérios descritos na tabela 1. TABELA 1

CRITÉRIOS DE CLASSIFICAÇÃO EM TESTE DE SECA EM ARROZ Aparência das quatro folhas de topo de uma planta, que foi regada novamente após estresse devido à seca Classificação — Parte viável de Parte viável de área bainha lamina exposta de foliar o Nenhuma Nenhuma 1 Nenhuma Menos da metade da soma das quatro folhas 2 Nenhuma Metade ou mais da soma das quatro folhas 3 Uma folha Três quartos ou mais da soma das 4 folhas 4 Duas folhas Três quartos ou mais da soma das 4 folhas Três ou quatro 5 Todas folhas Esse teste é simples e altamente reproduzível. As pontuações de mais da metade de plantas Suweon 287 psão usualmente 2 ou superior neste teste embora as pontuações de plantas susceptíveis raramente ultrapassem 2. Portanto, quando as pontuações de duas ou mais plantas em uma linhagem testada forem 2ousuperior, a linhagem é registrada como tolerante à seca. EXEMPLO 3

IDENTIFICAÇÃO DE COSMÍDEOS DE CAPIM SUDÃO QUE CONFEREM TOLERÂNCIA À SECA AO ARROZ. Os clones que constituem o banco de DNA genômico a partir do capim Sudão descrito no exemplo 1 foram transferidos para cepa de agrobactéria LBA4404(pSB1 ) (Komari et al. Plant J. 10:165-174,1996). O método usado para transferir foi conjugação triparental (Ditta et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77:7347- 7351 , 1980). Os fragmentos de DNA genômico nas linhagens de agrobactéria resultantes que portam os genes foram individualmente introduzidos —no cultivar de arroz Yukihikari. O método de transformação foi feito de acordo com Hiei et al. (Plant J. 6:271 -282, 1994) e baseado na inoculação de embriões imaturos com agrobactéria. Um gene de resistência à higromicina foi usado como gene marcador de seleção. Os embriões imaturos do cultivar Yukihikari foram obtidos de plantas cultivadas em uma estufa. Sementes originais de cultivar de arroz Yukihikari foram adquiridas de um varejista no setor alimentício, e as sementes por progênie colhidas em estufa foram usadas.

Plantas transgênicas foram obtidas, que continham fragmentos de DNA genômico individuais a partir do capim Sudão. Para cada fragmento de DNA genômico, uma ou duas plantas individuais de eventos de transformação independentes foram obtidas. A seguir, as plantas transgênicas da geração inicial serão denominadas plantas de geração TO e sua progênie como geração T1, geração T2 e assim por diante, de acordo com a regra geral.

Plantas por progênie T1 derivadas das plantas transgênicas foram examinadas quanto a tolerância à seca. Para cada um dos transformantes TO acima descritos, seis plantas T1 foram testadas. Um total de 1045 dos fragmentos genômicos do capim Sudão foram desse modo ordenados de acordo com as pontuações no primeiro teste T1, e 128 deles foram selecionados do topo da lista para outro ensaio T1. Subsequentemente, 25 fragmentos foram selecionados para estudo posterior.

Sementes T2 foram obtidas de plantas T1 resistentes à higromicina derivadas de arroz transformado com cada um dos 25 fragmentos. A parti de cada uma das 25 linhagens T2, 12 plantas resistentes à higromicina foram examinadas —quantoatolerância à seca. O teste T2 foi repetido.

A linhagem por progênie de cultivar de arroz Yukihikari transformada com um fragmento genômico particular a partir do capim Sudão, que foi chamado de "IS125" genômico, foi detectada repetidamente como sendo tolerante à seca nos testes T1 e T2, O evento de arroz transgênico contendo fragmento genômico IS125, — conforme rastreado a partir desses testes, foi chamado de "Evento IS125 No. 1".

As tabelas 2, 3 e 4 mostram os resultados dos testes de tolerância à seca do evento IS125 de arroz transgênico No.1 nas gerações T1, T2, e T3, respectivamente. No teste T3, 12 plantas de cada um dos fenótipos resistentes à higromicina ou sensíveis à higromicina foram examinadas.

Conforme claramente demonstrado nestas tabelas, a característica de tolerância à seca conferida pelo fragmento genômico 18125 foi repetidamente detectada e estavelmente herdada ate a geração T3 e as características de tolerância à seca e resistência à higromicina co- segregadas.

TABELA 2 TESTE DE SECA T1 DE UMA LINHAGEM DE ARROZ TRANSFORMADA COM FRAGMENTO GENÔMICO IS125 Total No. de plantas No. de plantas Teste No.

Linhagem testadas classif. 2 ou superior — Resposta à seca 1 Yukihikari 6 o Susceptível 1 Suweon 287 6 5 Tolerante 1 18125 Evento No. 1 6 2 Tolerante 2 Yukihikari 6 o Susceptível 2 Suweon 287 6 3 Tolerante 2 18125 Evento No. 1 6 4 Tolerante TABELA3 TESTE DE SECA T2 DE UMA LINHAGEM DE ARROZ TRANSFORMADA CM FRAGMENTO GENÔMICO IS125 Total No. de plantas No. de plantas Teste No.

Linhagem testadas classif. 2 ou superior Resposta à seca 1 Yukihikari 12 o Susceptível 1 Suweon 287 12 6 Tolerante 1 18125 Evento No. 1 12 E) Tolerante 2 Yukihikari 12 o Susceptível 2 Suweon 287 12 10 Tolerante 2 18125 Evento No. 1 12 10 Tolerante TABELA 4 TESTE DE SECA T3 DE UMA LINHAGEM DE ARROZ TRANSFORMADA COM FRAGMENTO GENÔMICO IS125 Total No. de plantas No. de plantas Teste No.

Linhagem testadas classif. 2 ou superior — Resposta à seca 1 Yukihikari 12 o Susceptível 1 Suweon 287 10 6 Tolerante 1 Progênie resistente à 12 8 Tolerante higromicina a partir de IS 125 Evento No.1 1 Progênie resistente a 12 1 Susceptível higromiícina a partir de IS 125 Evento No.1 2 Yukihikari 12 o Susceptível 2 Suweon 287 12 3 Tolerante 2 Progênie resistente à 12 n Tolerante higromícina a partir de IS 125 Evento No. 1 2 Progênie resistente à 12 o Susceptível higromicina a partir de 1S 125 Evento No.1

Adicionalmente, o cultivar de arroz Yukihikari foi novamente transformado com fragmento genômico I1S125 conforme acima e os eventos adicionais foram examinados quanto a tolerância à seca na geração T1. Um dos eventos de arroz transgênico chamado de "IS125 Evento No. 3", foi — claramente tolerante à seca na geração T1 (tabela 5).

TABELAS TESTE T1 DE SECA DE LINHAGENS DE ARROZ ADICIONAIS TRANSFORMADAS COM FRAGMENTO GENÔMICO IS125 No, de plantas Total No, de plantas classif. 2 ou Respostas à Linhagem testadas superior seca Yukihikari 12 o Susceptível Suweon 287 12 8 Tolerante 18125 Event No, 2 12 o Susceptível 18126 Event No. 3 12 10 Tolerante 18125 Event No. 4 12 o Susceptivel 18125 Event No, 5 12 1 Susceptível A linhagem de progênie de cultivar de arroz Yukihikari transformada com um fragmento genômico diferente a partir do capim Sudão, que foi chamada de fragmento genômico "IS127", também foi detectada repetidamente como tolerante à seca nos testes T1 e T2. O evento de arroz transgênico de fragmento genômico I1S127 rastreado a partir desses testes foi chamado de "IS127 Evento No. 1". A tabela 6 mostra os resultados do teste de tolerância à seca de arroz transgênico 18127 Evento No.1 na geração T3. Desse modo, foi claramente demonstrado que a tolerância à seca conferida pelo fragmento genômico 18127 foi repetidamente detectada e estavelmente herdada até a geração T3. TABELA 6 TESTE DE SECA T3 DE UMA LINHAGEM DE ARROZ TRANSFORMADA COM FRAGMENTO GENÔMICO IS127 No. de plantas Total No. de plantas classif. 2 ou Respostas à Linhagem testadas superior seca 1 Yukihikari 12 o Susceptível 1 Suweon 287 12 3 Tolerante 1 18127 Event No. 1 12 10 Tolerante 2 Yukihikari 12 o Susceptível 2 Suweon 287 12 3 Tolerante 2 18127 Event No. 1 12 8 Tolerante

Adicionalmente, o cultivar de arroz Yukihikari foi novamente transformado com fragmento genômico IS127 conforme descrito acima e os eventos adicionais foram examinados quanto a tolerância à seca na geração T1. Todos os 3 eventos de arroz transgênico testados, chamados I1S127 —EventoNo, 2","IS127 Evento No. 3" e "IS127 Evento No. 4", foram claramente tolerantes à seca na geração T1 (tabela 7). TABELA 7 TESTE T1 DE SECA DE LINHAGENS DE ARROZ ADICIONAIS TRANSFORMADAS COM FRAGMENTO GENÔMICO IS127 No. de plantas Total No. de plantas classif, 2 ou Respostas à Linhagem testadas superior seca 1 Yukihikari 12 o Susceptível 1 Suweon 287 12 8 Tolerante 1 18127 Evento No. 2 12 4 Tolerante 2 18127 Evento No. 3 12 7 Toierante 2 18127 Evento No. 4 12 6 Tolerante EXEMPLO 4 IDENTIFICAÇÃO DE DTP21 comO CANDIDATO DE GENE TOLERANTE À SECA Conforme mostrado no exemplo 3, verificou-se que o fragmento genômico IS125 do capim Sudão foi capaz de fornecer ao cultivar de arroz Yukihikari a tolerância à seca.

Fragmento genômico IS125 foi totalmente —sequenciado por um procedimento padrão a fim de obter a sequência de SEQ ID NO: 1 consistindo em 42,104 nucleotídeos.

Análise PCR foi conduzida para identificar as regiões de fragmento genômico IS125 que estão presentes na linhagem de arroz transgênico, IS125 Evento No. 3. Seis pares de primers PCR (M1 , M2, M3, M4, M5 e M6) foram designados com base na sequência de fragmento genômico IS125 conforme apresentado na figura 1. Adicionalmente, um par de primer M-Hpt é derivado da sequência do gene marcador selecionável, HPT.

Amostras de DNA foram isoladas de plantas por progênie T2 derivadas de uma progênie de planta T1 tolerante à seca de IS125 Evento No, 3 e examinadas pelos pares de primer listados na figura 1. Pares de primer M 1, M2 e M-Hpt foram — capazes de amplificar os fragmentos de DNA esperados a partir de toda a progênie.

Porém, pares de primer M3, M4, M5 e M6 falharam na amplificação dos produtos esperados. Esses resultados são consistentes com a hipótese de que o segmento entre M1 e M2 está presente no IS125 Evento No. 3 embora o segmento entre M3 e MG6 não. Desse modo, é possível que o gene de tolerância à seca fique localizado naregioMieM2. Em seguida, fragmentos foram subclonados a partir do fragmento genômico 18125 (FIG. 2) e introduzidos no cultivar de arroz Yukihikari para confimar a hipótese acima descrita. Tabela 8 mostra o resumo do teste de tolerância à seca de arroz transformado com fragmento genômico IS125 e vários subfragmentos de

18125. TABELA 8

TESTE DE TOLERÂNCIA À SECA DE ARROZ TRANSFORMADO COM FRAGMENTO GENÔMICO IS125 E VÁRIOS SUBERAGMENTOS Fragmento DNA Tamanho De Para Evento(s) (BP) 18125 40,040 10 40,049 sim Sub5 12,938 1,659 14,596 sim Sub2 8,068 2,343 10,410 sim Sub4 6,833 7,738 14,570 Não Sub3 3,158 2,868 6,025 sim Sub8 2,083 3,735 5,817 sim Sub? 1,210 4,608 5,817 Sim Um fragmento de subclone, o fragmento 12.9-kb Pvull-BstZ17| f a seguir chamado de "Sub5" e que cobre a maior parte da região M 1 -M3 (figura 2), foi inserido em pSB200 e as sequências nas regiões de junção foram confirmadas. O plasmídeo resultante foi introduzido na cepa de agrobactéria LBA4404 (pSB1 ) por conjugação tri-parental, A agrobacteria foi usada para transformar cultivar de arroz Yukihikari, conforme descrito no exemplo 3. Cultivar de arroz Yukihikari também foi transformado com agrobactéria LBA4404 que portava pSB134 (Hiei and Komari, Plant Cell Tissue and Organ Cult. 85:271 -283, 2006), que continha um generesistente à higromicina e um gene GUS. Arroz transformado com Sub5S foi testado quanto a tolerância à seca nas gerações TO e T1. Para a geração TO, dez de 48 regenerantes de transformantes Sub5 pontuaram 2 ou mais, enquanto nove de 48 regenerantes de transformantes GUS, que eram plantas de controle susceptíveis à seca, não pontuaram (tabela 9). Portanto, Sub5 foi suficiente para gerar eventos de transformação de arroz tolerante à seca TABELA 9

TESTE DE TOLERÂNCIA À SECA DOS REGENERANTES DE ARROZ TRANSFORMADO COM SuB5 DNA usado na No. total de No. de regenerantes Regenerantes tolerantes transformação regenerantes Classif. 2 ou superior A seca testados GUS (Control) 48 o Não Sub5 48 10 Sim A tabela 10 mostra os resultados de testes de tolerância à seca da geração Ti de arroz transformado com subfragmento Sub5 do fragmento genômico I1S125. Sete linhagens (chamadas de "Sub5 Evento No.1 " - "Sub5 Evento No.7") derivadas de sete eventos que pontuaram 2 ou mais na geração TO foram testadas. Seis das sete linhagens mostraram claramente tolerância à seca. Arroz transgênico IS125 Evento No. 3 na geração T5. também foi testado nesses testes de avaliação de subfragmento e foi distintamente tolerante à seca em cada um dos testes. Consequentemente, a tolerância à seca conferida por fragmento genômico IS125 foi estavelmente herdada até a geração T5 e esta série de testes de tolerância à seca foi bem controlada. TABELA 10 TESTE DE TOLERÂNCIA À SECA DA GERAÇÃO T1 DE SETE LINHAGENS DE ARROZ TRANSGÊNICO TRANSFORMADAS COM SUB5 Teste Linhagem TO Total No. No. plantas Resposta No. Classif. plantas Classif. 2 ou À seca testadas superior 1 Yukihikari — 12 o Susceptível 1 18125 Evento No. 3 (T5). — 112 12 Tolerante 1 Sub5 Evento No.1 2 12 1 Susceptível 1 Sub5 Evento No.2 3 12 8 Tolerante 1 Sub5 Evento No.3 3 12 2 Tolerante 2 Yukihikari — 12 o Susceptível 2 18125 Evento No. 3 (T5) — 12 1 Tolerante 2 Sub5 Evento No.4 2 12 5 Tolerante 2 Sub5 Evento No.5 3 12 ER Tolerante 2 Sub5 Evento No.6 4 12 s Tolerante 2 Sub5 Evento No.7 3 12 10 Tolerante

Para definer melhor a região contendo o gene de tolerância à seca, pequenos subfragmentos foram testados. O pequeno fragmento 8.1-kb (doravante denominado "Sub2"), o fragmento 3.2-kb Hindi Il (doravante denominado "Sub3"), e o fragmento 6.8-kb BstBI (doravante denominado "Sub4"), cada um deles é um subfragmento de Sub5, foram inseridos no pSB200 que foi pré-tratado com EcoRV, Hind 111 e BstBl, respectivamente, e depois com CIAP. De maneira similar descrita para Sub5, cada um dos três subfragmentos foi introduzido no cultivar de arroz Yukihikari pelo método de transformação agrobactéria-mediado.

Dezesseis eventos de arroz transformado com subfragmento Sub2 foram examinados quanto a tolerância à seca na geração T1 (tabela 11). Seis eventos (Sub2 Eventos No. 5, No. 7, No. 9, No. 12, No. 15 e No. 16) foram claramente tolerantes à seca.

TABELA 11 — TESTE DETOLERÂNCIAÀSECADA GERAÇÃO T1 DE DEZESSEIS LINHAGENS DE ARROZ TRANSGÊNICO TRANSFORMADAS COM SUB2 Teste No. Linhagem Total No. plantas No. de plantas Resposta à seca testadas classif 2 ou superior 1 Yukihikari 12 o Susceptível 1 18125 Evento No. 1 (T5) 12 8 Tolerante 1 Sub2 Evento No.1 12 o Susceptível 1 Sub2 Evento No.2 12 1 Susceptivel 1 Sub2 Evento No.3 12 1 Susceptível 1 Sub2 Evento No4 2 o Susceptível 2 Yukihikari 12 o Susceptível 2 18125 Evento No. 1 (T5) 12 12 Tolerante 2 Sub2 Evento No.5 12 4 Tolerante 2 Sub2 Evento No.6 12 1 Susceptível 2 Sub2 Evento No.7 12 2 Tolerante 2 Sub2 Evento No.8 12 1 Susceptivel 3 Yukihikari 12 o Susceptivel 3 18125 Evento No. 3 (T5) 12 12 Tolerante 3 Sub2 Evento No.9 12 5 Tolerante 3 Sub2 Evento No. 10 12 o Susceptível 3 Sub2 Evento No. 11 12 o Susceptíivel 3 Sub2 Evento No.12 12 4 Tolerante 4 Yukihikari 12 o Susceptível 4 18125 Evento No. 3 (T5) 12 12 Tolerante

4 Sub2 Evento No. 13 12 o Susceptível 4 Sub2 Evento No. 14 12 o Susceptível 4 Sub2 Evento No.15 12 5 Tolerante 4 Sub2 Evento No,16 1n 5 Tolerante Dezesses eventos de arroz transformado com subfragmento Sub3 foram examinados quanto a tolerância à seca na geração T1 (tabela 12). Oito eventos (Sub3 Eventos No. 3, No. 4, No. 6, No. 7, No. 9, No. 10, No. 12 e No, 16) foram claramente tolerantes à seca.

TABELA 12 TESTE DE TOLERÂNCIA À SECA DA GERAÇÃO T1 DEZESSEIS LINHAGENS DE ARROZ TRANSGÊNICO TRANSFORMADAS COM SUB3 Teste No.

Linhagem Total No. plantas No. de plantas Resposta à seca testadas classif 2 ou superior 1 Yukihikari 12 o Susceptivel 1 18125 Evento No. 1 (T5) 12 6 Tolerante 1 Sub3 Evento No. 1 12 o Susceptível 1 Sub3 Evento No.2 12 1 Susceptível 1 Sub3 Evento No.3 12 2 Tolerante 1 Sub3 Evento No.4 12 3 Tolerante 2 Yukihikari 12 o Susceptível 2 18125 Evento No. 1 (T5) 12 8 Tolerante 2 Sub3 Evento No.5 12 o Susceptível 2 Sub3 Evento No.6 12 5 Tolerante 2 Sub3 Evento No.7 12 4 Tolerante 2 Sub3 Evento No.8 12 1 Susceptiível 3 Yukihikari 12 o Susceptível 8 18125 Evento No. 1 (T5) 12 7 Tolerante 3 Sub3 Evento No.9 12 6 Tolerante 3 Sub3 Evento No.10 12 7 Tolerante 3 Sub3 Evento No. 11 12 1 Susceptível 3 Sub3 Evento No. 12 12 6 Tolerante 4 Yukihikari 12 o Susceptível 4 18125 Evento No. 1 (T5) 12 9 Tolerante 4 Sub3 Evento No. 13 12 o Susceptível 4 Sub3 Evento No. 14 10 o Susceptível 4 Sub3 Evento No. 15 12 1 Susceptível 4 Sub3 Evento No.16 12 5 Tolerante E———— . —---—-—/] "—""—=s=—A < —— — $ CCC nna== Dezesseis eventos de arroz transformado com subfragmento Sub4 foram examinados quanto a tolerância à seca na geração T1 (tabela 13). Nenhuma dos Sub4 Eventos foram tolerantes à seca.

TABELA 13 TESTE DE TOLERÂNCIA À SECA DA GERAÇÃO T1 DE DEZESSEIS LINHAGENS DE ARROZ TRANSGÊNICO TRANSFORMADAS COM SUB4 Teste No.

Linhagem Total No. plantas No. de plantas Resposta à seca testadas classif 2 ou superior 1 Yukihikari 12 o Susceptível 1 18125 Evento No. 1 (T5) 112 6 Tolerante 1 Sub4 Evento No.1 12 o Susceptível 1 Sub4 Evento No.2 12 o Susceptível 1 Sub4 Evento No.3 12 o Susceptível 1 Sub4 Evento No.4 12 o Susceptível 2 Yukihikari 12 o Susceptível 2 18125 Evento No. 1 (T5) 12 10 Tolerante 2 Sub4 Evento No.5 12 o Susceptível 2 Sub4 Evento No.6 12 o Susceptivel 2 Sub4 Evento No.7 12 o Susceptível 2 Sub4 Evento No.8 12 o Susceptível 3 Yukihikari 12 o Susceptível 3 18125 Evento No. 3 (T5) 12 nu Tolerante 3 Sub4 Evento No.9 12 o Susceptível 3 Sub4 Evento No. 10 12 o Susceptível 3 Sub4 Evento No. 11 12 o Susceptível 3 Sub4 Evento No, 12 112 o Susceptível 4 Yukihikari 12 o Susceptível 4 18125 Evento No. 3 (T5) 12 1 Tolerante 4 Sub4 Evento No. 13 12 o Susceptível 4 Sub4 Evento No. 14 12 o Susceptivel 4 Sub4 Evento No. 15 12 o Susceptível 4 Sub4 Evento No. 16 12 o Susceptível Para definir mais precisamente a região do gene tolerante à seca, dois subfragmentos de Sub3 foram criados como segue.

PCR com Pyrobest DNA Polimerase (TAKARA- BIO) foi feita utilizando-se DNA de plasmídeo Subs como um padrão e primess SEQ |D NO: 18 (5 - TACCTTGTTAACCTCATAGGTTCTTCTCAG -3) e SEQ ID NO: 17 (5 - TCCCATGGAGAGTTAACGCCCGACCTT -3'), depois os produtos PCR foram —digeridos com Hpal para produzir um fragmento 2,1 -kb (doravante denominado "Sub8"). De modo similar, primess SEQ I|D NO: 18 (5 - CCCCATACTTGTTAACTGCTTTCTTGC -3) e SEQ ID NO: 19 (5 - TCCCATGGAGAGTTAACGCCCGACCTT -3') foram usados em PCR, e depois os produtos PCR foram digeridos com Hpal, para fornecer um fragmento 1 .2-kb (doravante denominado "Sub7"). Sub7 é um sub-segmento de Sub8. Sub8 e Sub7 foram inseridos em pSB200 que havia sido digerido com EcoRV e depos pré-tratados com CIAP. Após serem confirmadas as sequências das regiões PCR-amplificadas e das regiões de junção, Sub8 e Sub7 foram introduzido no cultivar de arroz Yukihikari pelo método de — transformação agrobactéria-mediado conforme acima descrito.

Avaliação da resposta à seca de arroz transformado com Sub8 e Sub7 foi conduzida na geração TO. Dezessete dos 48 eventos Sub8 foram claramente tolerantes à seca embora nenhum dos eventos de transformação GUS fossem tolerantes à seca (tabela 14). Três dos 48 eventos Sub7 foram claramente tolerantes à seca embora nenhum dos eventos de transformação GUS fossem tolerantes às seca (tabela 15). TABELA 14 TESTE DE TOLERÂNCIA À SECADA GERAÇÃO DE ARROZ TRANSFORMADO COM SUB8 DNA usado em Total No, de eventos test. No.ev.class.2 sup. Eventos tolerantes a transformação sup. seca GUS (Control) 48 o Não Sub8 48 17 Sim TABELA 15

TESTE DE TOLERÂNCIA À SECA DA GERAÇÃO DE ARROZ TRANSFORMADO COM SUB7 DNA usado em Total No. de eventos test. No.ev.class.2 sup. Eventos tolerantes a transformação sup. seca GUS (Control) 48 o Não Sub7 48 17 Sim Desses resultados, naturalmente que o gene de tolerância à seca no clone genômico IS125 está presente naregião do subfragmento Sub7.

A presença de transcritos codificados pela Sub7 foi examinada por RT-PCR. Utilizando-se o mini kit RNEASYO Mini Kit (QIAGEN), RNA total foi preparado a partir de uma planta inteira transgênica TO eu continha subfragmento Sub5 e mostrava tolerância à seca. RNA de uma planta de arroz transgênico que portava um gene GUS e um gene HPT foi usado como um controle negativo. As amostras de RNA foram submetidas a síntese de cCDNA com sistema de síntese de primeira-

fita Superscript'yY ||| para RT-PCR (Invitrogen). RT-PCR foi realizado com dois primers, SEQ ID NO: 20 (5 - TCCCTAATCTTCTTGTTGGCACTG -3) e SEQ |D NO: 21 (5 - TTAGTTCCTTGCTGCTCCAATGGC -3'), que foram designados com base na sequência de Sub7. Consequentemente, um fragmento de aproximadamente 0,6 kb foi amplificado a partir do cDNA do transformante Sub5 mas não do cDNA do transformante GUS (figura 3; tabela 16). Além disso, a amplificação não foi observada quando uma transcriptase reversa não estava incluída na reação, indicando que o fragmento foi amplificado a partirdo RNA.

Análise de sequência do fragmento 0,6-kb confirmou que o produto RT-PCR era derivado da sequência Sub7. TABELA 16 RT-PCR DE TRANSCRITOS CONTENDO NUCLEOTÍDEOS No. 4,827 A No. 5,459 DA SEQ ID NO: 1 Fonte de RNA para Pre-tratado com Amplificação de 0.6-kb padrão Transcriptase reversa DNA SubsS Transformante Sim sim Subs5 Transformante Não Não GUS Transformante sim Não GUS Transformante Não Não Testes que empregam RACE 5' e 3' (rápida amplificação de extremidades de cDNA) foram realizados com kit GENERACERTY (Invitrogen) para caracterização do gene que codifica o polipeptídeo tolerante à seca (doravante denominado o polipeptídeo "SS-DTP21 -1"), Para 5' RACE, o primer SEQ ID NO: 22 (5 - COCOTTTGGAGGGATGAAACGGACTTTG -3') foi combinado com um primer GENERACER'!" 5, SEQ |D NO: 74 (5- CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3'), e então o primer SEQ ID NO: 23 (5 - TGATCTCACCGCTCCGGTTGGTCTTG -3') foi combinado com um primer embutido GENERACERTY 5', SEQ ID NO: 75 (5 - G G AC ACTG ACATG G ACTG AAG G AG TA-3 ' ). Para 3! RACE, o primer SEQ ID NO: 24 (5 - TCCTTGCTGCTCCAATGGCCGAGAAG -3') foi combinado com um primer GENERACER'Y 3, SEQ ID NO: 76 (5 -

GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3'), e depois o primer SEQ ID NO: 25 (5 - ACCTCAGCATGGAGCCTGTGGAAGAC -3') foi combinado com um primer embutido GENERACER'Y 3', SEQ ID NO: 77 (5- CG CTACGTAACG G CATG ACAGTG-3' ) . Os fragmentos amplificados dos PCRs embutidos foram inseridos em pCR&O4-TOPOO (Invitrogen) e submetidos a análise de sequência. Uma iniciação de transcrição simples foi identificada no nucleotídeo No. 5,499 da SEQ ID NO: 1 , e sete sítios terminais 3' foram encontrados nos nucleotídeos No. 4,655, No. 4,652, No. 4,471 , No. 4,464, No. 4,069, No. 4,01 1 e No. 3,956 da SEQ ID NO: 1 (FIG. 3), indicando que 7 tipos de transcritos estavam presentes no arroz tolerante à seca. Todavia, todos os transcritos pareciam codficar a mesma proteína pois a diversidade estava dentro da região 3- não transladada. A sequência nucleotídica que codifica o polipeptideo SS-DTP21 -1 é apresentada como SEQ ID NO: 26. A sequência de aminoácido de SS- DTP21 -1 é apresentada como SEQ ID NO: 27, Com base nesses resultados, dois primers SEQ ID NO: 28 (5"- TGCGAGGTTGTCGAGCACTTGCTCCT -3') e SEQ ID NO: 29 (5- C AAG CCTTCTCTTCTTC AG TTAG AG C -3') foram designados e RT-PCR foi feito utilizando-se RNA do transformante Sub5 e do transformante GUS acima descrito. Uma banda do tamanho esperado (1 .5 kb) foi observada somente quando o RNA do transformante Sub5 foi tratado com transcriptase reversa (tabela 17), que confirmou a existência de transcritos que abrangem os dois primers.

TABELA 17 RT-PCR DE TRANSCRITOS CONTENDO NUCLEOTÍDEOS No. 4,019 A No. 5,489 DA SEQ ID NO: 1 Fonte de RNA para padrão Pre-tratado com Amplificação de 1,5-kb Transcriptase reversa DNA Sub5 Transformante Sim Sim Sub5 Transformante Não Não GUS Transformante Sim Não GUS Transformante Não Não

EXEMPLO 5 IDENTIFICAÇÃO DO GENE SS-DTP21 -2 COMO UM CANDIDATO DE GENE TOLERANTE À

SECA Conforme descrito no exemplo 3, fragmento genômico 18127 a partir do capim Sudão também foi capaz de conferir tolerância à seca ao cultivar de arroz Yukihikarii Fragmento genômico 18127 foi totalmente sequenciado — através de um procedimento padrão e uma sequência nucleotídicas 34,231 foi elucidada (SEQ ID NO: 30). Fragmento genômico 18127 (SEQ ID NO: 30) contém uma região que é altamente homóloga ao subfragmento Sub8 do fragmento genômico

18125. Essa região homóloga 1S127 contém região homóloga homologous region contains a sequência nucleotídica (SEQ ID NO: 31 ) que codifica a polipeptídeo (SEQ ID NO: 32), doravante denominado o — polipeptídeo "SS- DTP21 -2", que é homólogo ao polipeptideo SS-DTP21 -1. Esta região foi —subclonada como segue. A região homóloga foi amplificada com dois primers derivados do fragmento genômico 18127, SEQ ID NO: 33 (5 - AT AC CTTG TTAACCTC ATAG G TTCTCTC AG -3) e SEQ ID NO: 34 (5 - CCECTTCCCATGGAGAGTTAACGCCCGACACT -3'), e o fragmento resultante g PCR foi em seguida subclonado em pSB200 através dos métodos acima descritos. EXEMPLO 6

IDENTIFICAÇÃO DE GENES DO SORGO QUE CODIFICAM POLIPEPTÍDEOS HOMÓLOGOS A SS-DTP21 -1 Com o uso de métodos de análise de sequência de DNA padrões, foram identificados genes bicolor do sorgo que codificam polipeptídeos homólogos a SS-DTP21 -1. Uma análise TBLASTN de sequência nucleotídicas publicamente disponível indicou que a sequência de aminoácido de SS-DTP21 -1 , SEQ ID NO: 27, é altamente homóloga à sequência de aminoácidos codificada por: nucleotídeos 25530-24904 de clone BAC genômico bicolor de Sorgo SB BBcO073F19 (NCBI GI No. 124359063); e nucleotídeos 441 14- 44740 de clone BAC genômico bicolor de Sorgo SB BBc0109L12 (NCBI GI No. 124359064). Uma análise TBLASTN de sequências EST de sorgo — publicamente disponível indicou que sub-fragmentos de SEQ ID NO: 27 são altamente homólogos à sequência de aminoácidos codificado oeloseguinte: duas sequências EST de sorgo obtidas de plantas com escassez de água, i.e, plantas de 5 semanas nos dias 7 e 8 após a água ser retirada (NCBI Gl No. 7659303; NCBI GI No. 7659212); e uma sequência EST obtida de ovários de estágios imaturos variáveis de plantas com 8 semanas (NCBI GI No. 1 192221 1).

A região que codifica SS-DTP21 -1 no subclone Sub8 do fragmento genômico IS 125 foi substituída com várias regiões codificadoras de proteína de genes bicolor de sorgo que codificam polipeptídeos homólogos a SS-DTP-21-1. O sistema de clonagem Clontech IN-FUSION'Y PCR no qual as pontas de um PCR fragmento são fundidas às pontas homólogas de um vetor linearizado, foi utilizado para construção de vetor.

O vetor linearizado foi preparado como segue. Amplificação de PCR foi executada com o seguinte: enzima PRIMESTARO Max (TAKARA- BIO); o plasmídeo que contém o subfragmento Sub8 em pSB200, que foi construído no exemplo 4, como um padrão, e os dois seguintes primers: 5'- GCTCTAACTGAAGAAGAGAAGGCTTGGTGGCTTGGTGTTTG -3' (SEQ ID NO:35); -GCTATCATTTAAATCGGTTTAGGTTTACTATTATCATCAG-3' (SEQ ID NO: 36).

—Os produtos PCR foram auto-ligados com kit de ligação de DNA "Mighty Mix" (TAKARA- BIO) após tratamento com T4 polinucleotídeo quinase (TAKARA- BIO). O DNA resultante foi usado para transformar E. coli MACHITV-T1 R (Invitrogen) por eletroporação. Entre as colônias recombinantes que surgiram em placas LB contendo espectinomicina (50 g/ml), uma colônia foi selecionada com base nos resultados da colônia PCR e análise de sequência do plasmídeo com relação às regiões de junção. Plasmídeos da colônia selecionada foi digeridos com Swal e Afel, e a digestão foi tratada com BAP (TAKARA-BIO) e purificada a partir de um gel de agarose após eletroforese. As regiões codificadoras de protéina de gebes bicolor de Sorgo (Gold sorgho) que codificam polipeptídeos homólogos a SS-DTP21 -1 foram preparadas por amplificação PCR utilizando-se o seguinte: enzima PRIMESTARO Max (TAKARA-BIO); DNA genômico de sorgo bicolor (Gold sorgho) como padrão e os seguintes dois primers: 5"- TTCTTCAGTTAGAGCTTGATTAGTTCCTTGCTGCTCCAATG-3' (SEQ |D NO: 37); es-

AAACCTAAACCGATTTTAAAGATAGATAACTAAGATGCATTGC CTCAATGTCTAATCTAGATAAATTA -3' (SEQ ID NO: 38). Os produtos PCR foram purificados a partir de gel de agorose após eletroforese. O vetor linearizado e produtos PCR que codificam polipeptídeos homólogos a SS-DTP21 -1, cada um dos pares de base 15-16 compartilhados de identidade de sequência nas regiões terminais, foram fundidos entre si utilizando-se um kit de clonagem IN-FUSIONTY Advantage PCR (Clontech) de acordo com o manual de instrução. O DNA resultante foi usado para transformar E. coli MACHI'V-T1 R (Invitrogen) por eletroporação. Entre as colônias recombinantes que surgiram em placas LB — contendo espectinomicina (50 ug/ml), duas colônias foram selecionadas com base nos resultados de colônia PCR e análise de sequência dos plasmídeos. A sequência nucleotídicas das regiões codificadoras das colônias selecionadas foram apresentadas como SEQ ID NO: 39 (que codificam o polipeptídeo SB-DTP21 - 1) e a SEQ ID NO: 40 (que codifica o polipeptídeo SB-DTP21 -2). A sequência de aminoácidos correspondente das duas proteínas foram apresentadas como SEQ ID NO: 41 (SB-DTP21 - 1) e SEQ ID NO: 42 (SB-DTP21 -2), respectivamente.

As colônias foram usadas em conjugação triparental junto com a cepa de agrobactéria LBA4404 (pSB1 ) e cepa helper E. coli HB101 (pRK2013), e as cepas de agrobactéria resultantes foram usadas para transformar uma variedade de arroz conforme acima descrito.

De modo similar, as regiões codificadoras de proteína de dois genes homólogos a SS-DTP21-1 foram obtidas do Sorgo bicolor (B35). As duas sequência nucleotídicas de Sorgo bicolor (B35) homólogas foram apresentadas como SEQ ID NO: 43 (que codifica o polipeptídeo SB- DTP21 -3) e SEQ ID NO: 44 (que codifica o polipeptídeo SB- DTP21 -4). As sequências de aminoácidos correspondentes das duas proteínas foram apresentadas como SEQ ID NO: 45 (SB-DTP21 -3) e SEQ ID NO; 46 (SB- DTP21 4), respectivamente. ExEMPLO 7

IDENTIFICAÇÃO DE GENES ADICIONAIS QUE CODIFICAM POLIPEPTÍDEOS HOMÓLOGOS A SS-DTP21 1 De modo similar aos exemplos acima, as regiões codificadoras de proteína de outros genes homólogos a SS-DTP21 -1 foram identificadas a partir do capim Sudão (Sorghum sudanense), gramínea Johnson (Sorghum halepense), cana de açúcar (Saccharum officinarum), e sorgo (Sorghum bicolor (Gold sorgho); Sorgo bicolor (B35); e Sorgo bicolor (hoki).A SEQID NOs para a sequência de aminoácidos para SS-DTP21 - 1 e as várias proteinas homólogas, assim como as sequências nucleotídicas correspondentes codificadoras de SS-DTP21 -1 e as várias proteínas homólogas foram apresentadas na seguinte tabela.

TABELA 18 SS-DTP21 -1 E PROTEÍNA HOMÓLOGAS DE VÁRIOS ORGANISMOS Designação aminoácido ID de protéina Organismo Nucleotídeo SEQ ID NO NO SS-DTP21-1 Capim Sudão 26 27 SS-DTP21-2 Capim Sudão 3H 32 SB-DTP21-1 Sorghum bicolor 39 41 (Gold sorgho) SB-DTP21-2 Sorghum bicolor 40 42 (Gold sorgho) SB-DTP21-3 Sorghum bicolor 43 45 (B35) SB-DTP21-4 Sorghum bicolor 424 46 (835) SS-DTP21-3 Capim Sudão 51 52 SS-DTP21-4 Capim Sudão 53 54 SS-DTP21-5 Capim Sudão 55 56 SS-DTP21-7 Capim Sudão E 58 SH-DTP21-1 Johnson grass 59 60 SH-DTP21-2 Johnson grass 61 62 SO-DTP21-1 Cana de açúcar 63 64 SO-DTP21-2 Cana de açúcar 65 66 SS-DTP21-6 Capim Sudão 78 79 SB-DTP21-5 Sorghum bicolor 80 81 (Gold sorgho) SB-DTP21-6 Sorghum bicolor 82 83 (535) SB-DTP21-9 Sorghum bicolor 84 85 (hoki) SB-DTP21-10 Sorghum bicolor 86 87 (hoki) ExEMPLO 8 CARACTERIZAÇÃO DE POLIPEPTÍDEOS HOMÓLOGOS A SS-DTP21 -1 Figuras 4A - 4E apresentam um alinhamento das sequências de aminoácidos estabelecidas na n SEQ ID NOs:27, 32, 41 , 42, 45, 46, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 79, 81, 83, 85 e 87, para polipeptideos DTP21 a partir do capim Sudão, sorgo, gramínea Johnson e cana de açúcar.

A figura 5 apresenta as identidades de sequência em porcento e valores de divergência —paracada par de sequência apresentado nas figuras 4A - 4E.

Alinhamentos de sequência e calculus de identidade em porcento foram realizados utilizando-se o programa de MEGALIGN & program of the LASERGENEPG bioinformatics computing suite (DNASTARG Inc., Madison, W)).

O alinhamento múltiplo das sequências foi realizado utilizando-se o método Clustal V de alinhamento (Higgins and Sharp (1989) CABIOS. 5:151 -153) com os parâmetros default (GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=10). Os parâmetros default para alinhamentos aos pares utilizando o método Clustal foram KTUPLE=1,GAP PENALTY=3, WINDOW=5 e DIAGONALS SAVED=5. A sequência de aminoácido de SS-DTP21 -1 apresenta a seguinte identidade de sequência em porcento com os homólogos apresentados nas figuras 4A - 4E: 91 .4% (SS- DTP21 -2); 88.5% (SB-DTP21 -1 ); 84.6% (SB- DTP21 -2); 83.3% (SB-DTP21 -3); 93.3% (SB-DTP21 4); 92.8% (SS-DTP21 - 3); 923% (SS-DTP21 -4); 91 .4% (SS- DTP21 -5); 84.7% (SS-DTP21 -7); 91 9% (SH-DPT21 -1 ); 93.3% (SH-DTP21 -2); 63.8% (SO-DTP21 -1 ), 63.8% (SO-DTP21 -2), 91 .4% (SS-DTP21 -6), 91 .9% (SB- DTP21 -5), 93.3% (SB- DTP21 -6), 92.8% (SB-DTP21 -9) e 92.3% (SB-DTP21 -10). EXEMPLO 9 ELETROPORAÇÃO DE AGROBACTERIUM TUMEFACIENS LBA4404 Células competentes por eletroporação (40 u1í), tais como Agrobacterium tumefaciens LBA4404 contendo PHP10523 ("pSB1 "; Komari et al., Plant J. 10:165-174 (1996); Identificador geral NCBI No. 59797027), foram descongeladas em gelo (20-30 min). PHP10523 contém genes VIR para transferência de T-DNA, uma origem de replicação de plasmídeo de baixo número de cópias em agrobacteria, um gene de resistência a tetraciclina, e um sítio Cos spara recombinação bimolecular de DNA in vivo.

Neste ínterim a cuveta de eletroporação foi resfriada em gelo.

As configurações de eletroporador foram ajustadas para 2,1 kV.

Uma alíquota de DNA (0,5 pl DNA parental em uma concentração de 0,2 ug -1,0 ug em solução salina diluída ou H > O duas vezes diluído) foi misturada com as células congeladas Agrobacterium tumefaciens LBA4404 enquanto ainda em gelo.

A mistura foi transferida para o fundo da cuveta de eletroporação e mantida em descando em gelo por 1 -2 minutos. As células são eletroporadas (eletroporador Eppendorf 2510) apertando a tecla de "pulso" duas vezes (obtendo de forma ideal um pulso de 4,0 milisegundos). Subsequentemente, 0,5 mL do meio 2xYT sob temperatura ambiente (ou meio SOC) foram adicionados à cuveta e transferidos para um tubo de15 mL tipo snap-cap (por exemplo, tubo FALCON''Y), As células foram incubadas a 28-30 ºC, 200-250 rpm por 3 hs.

Alíquotas de 250 um foram espalhadas em placas contendo o meio YM e 50 ug/mL de espectinomicina e incubadas três dias sob 28-30 ºC. Para aumentar o número de transformantes pode ser realizada uma das duas etapas opcionais: Opção 1 : Placas de revestimento com 30 ul de 15 mg/ml de rifampicina. LBA4404 apresenta um gene de resistência cromossomal para rifampicina. Essa seleção adicional elimina algumas colônias contaminantes observadas quando da utilização de preparações mais pobres de células competentes LBA4404.

Opção 2: realização de dois replicados de eletroporação para compensar células eletrocompetentes mais pobres.

Identifiação de transformantes: Quatro colônias independentes são captadas e esfregadas em placas contendo meio mínimo AB e 50 pg/ml de espectinomicina para isolamento de colônias individuais. As placas foram incubadas sob 28 ºC por dois a três dias. Uma colônia simples para cada cointegrado putativo é arrancada e inoculada com 4 mL de 10 g/L bactopeptona, 10 g/L de extrato de levedura, 5 g/L de cloreto de sódio e 50 mg/L de espectinomicina. A mistura é —incubada por 24 hs sob 28"C sob agitação. O DNA de plasmídeo de 4 mL de cultura é isolado utilizando-se QIAGENÔ Miniprep e um tampão opcional PB de lavagem, O DNA foi eluído em 30 uL. Alíquotas de 2 ul. foram usadas para eletroporar 20 ul. de DH 10b + 20 ul de H 2 O duas vezes destilado conforme acima. Opcionalmente uma alíquota de 15 ul. pode ser usada para transformar 75-100 pl de INVITROGENTY Library Efficiency DH5a, As células foram espalhadas sobre placas contendo meio LB e 50 ug/mL de espectinomicina e incubadas sob 37 ºC durante a noite. Três ou quatro colônias independentes foram captadas para cada cointegrado putativo e 4ml inoculado de meio 2xYT (10 g/L de bactopeptona, 10 g/L de extrato de levedura, 5 g/L de cloreto de sódio) com 50 pug/mL de espectinomicina. As células foram incubadas sob 37 ºC durante a noite sob agitação. Em seguida, isolar o DNA de plasmídeo de 4 mL de cultura utilizando-se QIAPREPG& Miniprep com lavagem com o tampão PB(eluirem 50 ul ). Uso 8 uL para digestão com Sall (utilizando DNA parental adicional e PHP10523 como controles). Três outras digestões utilizando enzimas de restrição BamHl, EcoRlI, e Hindlll foram realizadas para 4 plasmídeos 4 que representam 2 conintegrados putativos com modelo de digestão Sall correto (utilizando-se DNA parental e PHP10523 como controles) Géis eletrônicos são recomendados para comparação. EXEMPLO 10 TRANSFORMAÇÃO DE MILHO COM FRAGMENTO GENÔMICO IS 125 UTILIZANDO-SE

CONJUGAÇÃO TRIPARENTAL DE AGRABACTÉIA Devido ao grande tamanho do fragmento genômico 18125, o milho pode ser transformado via conjugação triparental com agrobactéria utilizando-se o seguinte protocolo (Ditta et al. Proc. Natl, Acad. Sci. USA. 77:7347-7351 , 1980). Dia 1 : Esfregar Cepa de agrobactéria LBA4404 (pAL4404, pSB1 ) em agardemeio mínimo mais tetraciclina (10 g/ml) e incubar sob 28 ºC por 3 dias. Dia 2: inocular cepa E, coli GENEHOGSO com I18S125- contendo DNA em agar LB com espectinomicina (100 g/ml) e incubar 2 dias sob 25 ºC.

Dia 3: esfregar E. coli (oRK2013) em agar LB mais canamicina (50 g/ml) e incubar durante a noite sob 37 ºC. Dia 4: misturar uma alça de cada uma das 3 cepas em uma placa de agar Nutrient e incubar durante a noite sob 28 ºC. Dia 5: esfregar a mistura em um agar de meio mínimo mais placa de espectinomicina (50 g/ml) e incubar sob 28 ºC por 3 dias. Dia 8: captar uma colônia simples, esfregá-la no mesmo meio e incubar sob 28 ºC por 3 dias. Dia 11 : captar uma colônia simples, esfregar sobre o meio e incubarsob 28 ºC por 3 dias. Dia 14: captar colônias simples e iniciar 2ml de cultura 2XYT Broth com espectinomicina (100 g/ml) sob 28 ºC durante a noite por 1 dia. Dia 15: minipreparar o DNA da cultura durante a noite. Usar 1 ul para eletroporar 20 ul de céluias GENEHOGSO . Dia 16: Captar colônias simples e iniciar 1.2 ml de cultura 2XYT Broth com espectinomícina (100 g/ml) sob 37 ºC durante a noite. Dia 17: minipreparar DNA da cultura durante a noite e executar análise de restrição com BamHI, EcoRI, e Hind | 1l. EXEMPLO 11 TRANSFORMAÇÃO DE MILHO UTILIZANDO-SE AGROBACTÉRIA Transformação agrobactéria-mediada de milho é realizada essencialmente conforme descrito por Zhao et al. in Meth. Mol. Biol. 318:315- 323 (2006) (vide também Zhao et al., Mol. Breed, 8:323-333 (2001 ) e pedido americano de patente No. 5,981,840 publicado em 9 de novembro de 1999, incorporado aqui por referência). O processo de transformação — envolve inoculação de bactéria, co-cultivo, repouso, seleção e regeneração de planta.

1. Preparação de embrião imaturo: Embriões de milho imaturos são dissecados a partir de cariopses e colocados em um microtubo de 2 mL contendo 2 mL de meio PHI-A.

2. Infecção por agrobactéria e co-cultivo de embriões imaturos:

2.1 Etapa de infecção: Meio PHI-A de (1 ) é removido com micropipetador de 1 mL, e 1 mL de suspensão de agrobactéria é adicionado. O tubo é suavemente invertido para misturar. A mistura é incubada por 5 minutos sob temperatura ambiente.

2.2 Etapa de co-cultura: A suspensão de agrobactéria é removida da etapa de infecção com um micropipetador de 1 mL. Com o uso de uma espátulo esterilizada os embriões são raspados do tubo e transferidos para uma placa de meio PHI-B em um disco de Petri 100x15 mm. Os embriões são orientados com o eixo embriônico na superfície do meio. Placas com os embriões são cultivadas sob 20 ºC, no escuro por três dias. L- Cisteina pode ser usada na fase de co- cultivo, Com o vetor binário padrão, o meio de co-cultivo fornecido com 100- 400mg/Lde L-cisteina é crítico para recuperar eventos transgênicos estáveis.

3. Seleção de eventos transgênicos putativos: Para cada placa de meio PHI-D em um disco de Petri de 100x15 mm 10 embriões foram transferidos, mantendo orientação e os discos foram vedados com PARAFILMO. As placas foram incubadas no escuro sob 28 ºC. Eventos putativos em crescimento ativo, como tecido embriônico amarelo pálido puderam ser visíveis em seis a oito semanas. Embriões que não produzem eventos podem ser marrons e necróticos, e o crescimento de tecido ligeiramente friável fica evidente. Tecido embriônico transgênico putative é subcultivado para placas PHI- D frescas em intervalos de duas-a-três semanas —dependendo da taxa de crescimento. Os eventos foram registrados.

4. Regeneração de plantas TO: Tecido embriônico propagado em meio PHI-D é sub-cultivado para meio PHI-E (meio de maturação de embrião somático), em discos de Petri de 100x25 mm e incubado sob 28 ºC, no escuro, até embriões somáticos amadurecerem por aproximadamente 10 a onze dias. Embriões somáticos maduros com escutelo bem-definido e coleoptilo são transferidos para meio de germinação de embrião —PHI-F e incubados sob 28 ºC sob claridade (aproximadamente 80 VE de lâmpadas fluorescentes branco frio ou equivalente). Em sete a dez dias, plantas regeneradas de aproximadamente cm de altura, foram colocadas em pote em mistura horticulítural e endurecidas utilizando-se métodos horticulturais padrões.

Meios para transformação de planta: 10 1. PHI-A: 49/L de sais basais CHU, 1,0 mL/L de mix de vitamina 1000X Eriksson's, 0,5 mg/L de HC! tiamina, 1,5 mg/L de 2,4-D, 0.69 g/L de L- prolina, 68,5 g/L de sucrose, 36 g/L de glucose, pH 5,2. Adição d 100 UM de acetosiringona (esterilizada por filtro).

2 PHI-B: PH I-A sem glucose, aumento de 2,4-D para 2 mg/L, redução de sucrose para 30 g/L e suplemento com 0,85 mg/L de nitratode prata (esterilizado por filtro), 3,0 g/L de GELRITE &, 100 uM de acetosiringona (esterilizada por filtro), pH 5,8.

3 PHI-C: PHI-B sem GELRITE & e acetosiringona, redução de 2,4- D para 1,5 mg/L e suplemento com 8,0 g/L de agar, 0,5 g/L de tampão de ácido 2-[N- morfolinoJmetano-sulfônico(MES), 100 mg/L de carbenicílina (esterilização por filtro), 4 PHI-D: PHI-C suplementado com 3 mg/L de bialafos (esterilização por filtro). 5 PHI-E: 4,3 g/L de sais Murashige e Skoog (MS), (Gibco, BRL11117-074), 0,5 mg/L de ácid nicotínico, 0,1 mg/L de HCl tiamina, 0,5 mg/L de HCI piridoxina, 2,0 mg/L de glicina, 0,1 g/L de mio-inositol, 0,5 mg/L de zeatina (Sigma, Cat. No. Z-0164), 1 mg/L de ácido indol acético (IAA), 26,4 ug/L de ácido abscísico (ABA), 60 g/L de sucrose, 3 mg/L de bialafos (esterilizaçao por filtro), 100 mg/L de carbenicilina (esterilização por filtro), 8 g/L de agar, pH 5,6.

6. PHI-F: PHI-E sem zeatina, IAA, ABA; redução de sucrose para 40 g/L; substituição de agar por 1,5g/L de GELRITE &; pH 5,6.

Plantas podem ser regeneradas a partir do calo transgênico através da primeira transferência de grupos de tecido para o meio N6 suplementado com 0,2 mg por litro de 2,4-D. Após duas semanas o tecido pode ser transferido para o meio de regeneração (Fromm et al, Bio/Technology 8:833-839 (1990)).

Plantas TO transgênicas podem ser regeneradas e seu fenótipo determinado. Semente T1 pode ser coletada. PlantasT1, e/ou sua progênie podem ser desenvolvidas e seu fenótipo determinado.

ExEMPLO 12

TRANSFOMAÇÃO DE LINHAGENS DE MILHO DERIVADAS DE GASPE FLINT COM UM

GENES GUIA TOLERANTES À SECA Genes-guia tolerantes à seca validados Plantas de milho podem ser transformadas para superexpressar os genes-guia tolerante à seca ou os homólogos correspondentes de outras espécies a fim de examinar o fenótipo resultante.

Plantas de recipiente: Células de planta de recipiente podem ser derivadas de uma linhagem de milho uniforme que apresenta um ciclo de vida curto ("fast ceycling"), uma tamanho reduzido, e elevado potencial de transformação, Típico dessas celulas de planta para milho são células de planta de qualquer uma das variedades de linhagem Gaspe Flint (GBF) disponíveis. Uma variedade de linhagem de planta candidata possível é o híbrido F1 de GBF x QTM (milho de rápida resposta, um publicamente disponível de Gaspe Flint selecionado para crescimento sob condições de estufa) descrito em Tomes et al, Pedido de

Patente Americano No. 2003/0221212. Plantas transgênicas obtidas desta linhagem são de um tal tamanho reduzido que elas podem ser desenvolvidas em potes de quatro polegadas (1/4 do espaço necessário para uma planta de milho de tamanho normal) e madura inferior a 2,5 meses. (Tradicionalmente 3,5 meses são necessários para obter semente TO transgênica uma vez queas plantas transgênicas são aclimatadas à estufa.) Outra linhagem adequada é uma linhagem haplóide dupla de GS3 (uma linhagem altamente transformável) X Gaspe Flint.Uma outra linhagem adequada é a linhagem inata de elite transformável que carraga um transgene que casusa o florescimento precoce, estatura reduzida ou ambos.

Protocolo de transformação: Qualquer método adequado pode ser usado para introduzir os transgenes nas células de milho, incluindo mas não limitado a, procedimentos do tipo inoculação com uso de vetores agrobactéria. A transformação pode ser feitaem embriões imaturos da planta recipiente (alvo).

Crescimento de precisão e rastreamento de planta: A população de evento de plantas transgênicas (TO) resultante dos embriões de milho transformados é cultivada em um ambiente de estufa controlado utilizando-se uma configuração de bloco randomizada modificada para reduzir ou eliminar o erro ambiental. Uma configuração de bloco randomizada é um layout de planta no qual as plantas de teste são divididas em grupos (por exemplo, trinta plantas por grupo), chamadas de blocos e cada planta é randomicamente atribuída a um local com o bloco.

Para um grupo de trinta plantas, vinte e quatro plantas de teste transformadas e seis plantas de controle (plantas com um fenótipo de ajuste) (coletivamente, um "grupo de replicado ") são colocadas em potes que ficam dispostos em um arranjo (a.k.a. um grupo de replicado ou bloco) em uma bancada localizada dentro de uma estufa. Cada planta, controle ou teste, é randomicamente atribuído a um local com o bloco que é mapeado para um único local de estufa físico assim como para o grupo de replicado. Múltiplos grupos de replicados de trinta plantas podem ser desenvolvidos em um único teste. O layout (arranjo) dos grupos de replicados deve ser determinado para minimizar as exigências de espaço assim como efeitos ambientais dentro da estufa. Tal layout pode ser chamado de layout de estufa comprimido.

Uma alternativa à adição de um grupo de controle específico é identificar aquelas plantas transgênicas que não expressam os genes de interesse. Uma variedade de técnicas tais como RT-PCR pode ser aplicada para avaliação quantitativa do nível de expressão dos genes introduzidos. Plantas TO que não expressam os transgenes podem ser comparadas àquelas que expressam.

Cada planta na população de evento é identificada e rastreada através do processo de avaliação e os dados coletados daquela planta são automaticamente associados àquela planta de forma que os dados coletados podem ser associados aos transgenes carregados pela planta. Por exemplo, cada recipiente de planta pode apresentar uma marcação legível por máquina (tais como código de produto universal (UPC) — código de barra) que inclui informação sobre a identidade de planta que por sua vez é correlacionada a um local de estufa de forma que os dados obtidos da planta podem ser automaticamente associados àquela planta.

Alternativamente qualquer sistema de identificação de planta legível por máquina —pode ser usado tais como códidos de matriz bi- dimensionalou mesmo marcas de identificação por frequência de rádio (RFID) —nasquaisos dados são recebidos e interpretados por um receptor/processador de rádio-frequência. Vide pedido de patente americano No. 2004/0122592, aqui incorporado por referência.

Análise fenotípica utilizando-se imageamento tridimensional;

Cada planta de estuda na população de evento TO incluindo quaisquer plantas de controle, é analisada por características agronômicas de interesse e os dados agronômicos para cada planta são registrados ou armazenados de forma que sejam associados com os dados de identificação (vide acima) para aquela planta.

A confirmação de um fenótipo (efeito gênico) pode ser feita na geração TI com um design de teste similar àquele acima descrito.

As plantas TO são analisadas no nível fenotípico utilizando-se a tecnlogia de imageamento não-destrutiva, quantitativa através de todo o ciclo de vida da estufa para analisar os traços de interesse.

Um analisador de imageamento digital pode ser usado para a análise mutli-dimensional automática de todas as plantas.

O imageamento pode ser feito dentro da estufa.

Dois sistemas de câmera, localizados no topo e lateral, e um aparelho para girar a planta, são usados para visualizar e imagear plantas de todos os lados.

Imageamentos são obtidos do topo, de frente e de lado de cada planta.

Todos os três imageamento juntos fornecem informação suficiente para avaliar a biomassa, tamanho e morfologia de cada planta.

Devido à mudança em tamanho das plantas desde o momento que que surge a primeira folha do solo até o momento em que as plantas estão no fim de seu desenvolvimento, os estágios precoces de desenvolvimento de planta são os mais bem documentados com uma magnificação mais elevada do topo.

Isso pode ser feito utilizando-se sistemas de lentes zoom que é totalmente controlado pelo software de imageamento.

Em uma operação de análise por imageamento simples, ocorrem os — seguintes eventos: (1 ) a planta é transportada para dentro da área do analisador, girada em 360 graus de forma que sua marca legível por máquina, possa ser lida e é deixada descansar até suas folhas pararem de se movimentar; (2) o imagemento lateral é realizado e inserido em um banco de dados; (3) a planta é girada 90 graus e novamente deixada descansar até suas folhas pararem de se movimentar, e (4) a planta é transportada para fora do analisador.

As plantas são deixadas pelo menos seis horas na escuridão por um periodo de 24 horas a fim de apresentar um ciclo normal de dia/noite.

Instrumentação de imageamento: Qualquer instrumentação de imageamento adequada pode ser usada, incluindo mas não limitado a, instrumentação de imageamento digital por espectro de luz comercialmente disponível pela LemnaTec GmbH da Wurselen, Alemanha. Os imageamentos são feitos e analisados com um LemnaTec Scanalyzer HTS LT-0001 -2 que apresenta um dispositivo de imageamento 1/2" IT Progressive Scan IEE CCD. As cameras de imageamento podem ser equipadas com um zoom motorizado, abertura motorizada e foco motorizado. Todas as configurações de camera podem ser feitas utilizando-se o software LemnaTec. Por exemplo, a variação instrumental do analisador de imagens é inferior a 5% para componentes maiores e inferior a 10% para componentes menores.

Software: O sistema de análise de imageamento compreende um programa de software LemnaTec HTS Bonit para análise a cores e de arquitetura e um banco de dados de servidor para o armazenamento de dados a partir de aproximadamente 500.000 análises, incluindo dados de análise. As imagens originais e imagens analisadas são armazenadas juntas para permitir que o usuário faça quantas reanalises desejar. A base de dados pode ser conectada ao hardware de imageamento para coleta automática de dados e armazenamento. Uma variedade de sistemas de software comercialmente disponíveis (por exemplo Matlab, ou outros) pode ser usada para interpretação quantitativa dos dados de imageamento e qualquer um desses sistemas de software pode ser aplicado ao jogo de dados de imagens.

Sistema transportador: Um sistema transportador com um dispositivo giratório de planta pode ser usado para transportar as plantas para a área de imageamento e | girá-las durante o imageamento. Por exemplo, até quatro plantas, cada uma com uma alturamáxima de 1,5 m, são carregadas sobre carros que trafegam sobre um sistema transportador circulante e através da área de medição de imageamento. Neste caso, o espaço ocupado total da unidade (analisador de imageamento e loop transportador) é de aproximadamente 5 m x 5 m. O sistema transportador pode ser ampliado para acomodar mais plantas de cada vez. As plantas são transportadas ao longo do loop transportador até a área de imageamento e são analisadas em até 50 segundos por planta, São tiradas três vistas da planta. O sistema transportador assim como o equipamento de imageamento, deve ser capaz de ser usado em condições ambientais de estufa. Iluminação: Qualquer modo adequado de iluminação pode ser usado para a aquisição de imagem. Por exemplo, pode ser usada uma luz de topo acima de uma plano de fundo preto. Alternativamente, uma combinação de retroiluminação — utilizando-se um fundo branco pode ser usada. A area iluminada deve ser alojada para assegurar condições constants de iluminação. O alojamento deve ser mais longo do que a area de medição de forma que prevaleçgam — condições de iluminação constantes sem precisar de fechamentos ou aberturas ou de portas. Alternativamente, a iluminação pode ser variada para provocar excitação de outros transgenes (por exemplo, proteína fluorescente verde (GFP), proteína fluorescente vermelha (RFP)) ou fluoróforos endógenos (por exemplo Clorofila).

Estimativa de biomassa com base em imageamento tri- dimensional:

Para a melhor estimativa de biomassa as imagens de planta devem ser feitas de pelo menos três eixos, por exemplo, o topo e duas vistas laterais (lados 1 e 2). Essas images são em seguida analisadas para separar a planta do segundo plano, sacola de controle de pote e pólen (se aplicável). O volume da planta pode ser estimado pelo cálculo: Volume (voxels) =| Top Area (pixels) x] SideXArea (pixels) x YVSide2 Area (pixels) Na equação acima as unidades de volume e área são "unidades arbitrárias". Unidades arbitrárias são totalmente suficientes para detectar efeitos gênicos em tamanho de planta e crescimento neste sistema pois o que se pretende é detectar diferenças (tanto maiores-positivas como menores- negativas) do meio de teste, ou meio de controle.

As unidades arbitrárias de tamanho (por exemplo area) podem ser convertidas trivialmente —* para medições físicas pela adição de uma referência física ao processo de imageamento.

Por exemplo, uma referência física de área conhecida pode ser incluída tanto em processos de imageamnto de topo como lateral, Baseado na area dessas referências físicas um fator de conversão pode ser determinado para permitir a conversão de pixels a uma unidade de área tais como centimetros quadrados (cm ? ). A referência física pode ou não ser uma amostra independente.

Por exemplo, o pote, com um diâmetro e altura conhecidos, deve servir como uma referência física adequada.

Classificação de cor: A tecnologia de imageamento também pode ser usada para determinar a cor de planta e atribuir cores de planta a várias classes de cor.

À — atribuição de cores de imagem a classes de cor é uma característica inerente do software LemnaTec.

Com um sistema de software de análise de imagem a classificação de cor pode ser determinada poe uma variedade de métodos computacionais.

Para a determinação do tamanho de planta e parâmetros de crescimento, um esquema de classificação útil é definir um esquema de cor simples incluindo duas ou três sombras de verde e, adicionalmente, uma classe de cor para clorose, necrose e branqueamento, essas condições — deveriam ocorrer. Uma classe de cor em segundo plano que não inclui cores de planta na imagem (por exemplo cores de pote e solo) também é usada e esses pixels são especificamente excluídos da determinação de tamanho. As plantas são analisadas sob iluminação constante controlada de forma que qualquer mudança dentro de uma planta durante a linha de tempo, ou entre plantas ou diferentes bateladas de plantas (por exemplo diferenças sasonais) pode ser quantificada.

Adicionalmente à sua utilidade em detemrinar o crescimento de tamanho de planta, a classificação de cor pode ser usada para analisar outros traços de componente de rendimento. Para esses outros traçoes de componente de rendimento podem ser usados esquemas de classificação de cor adicional. Por exemplo, o traço conhecido como "continue verde", que havia sido associado com melhoramentos em rendimento, pode ser analisado através de uma classificação de cor que sepra sombras de verde de sombras de amarelo e marrom (que são indicativas de envelhecimento de tecidos).

Através da aplicação dessa classificação de cor para imagens tiradas mais para o fim do ciclo de plantas TO ou T1, plantas que apresentam quantidades aumentadas de cores verdes com relação às cores amarelo e marrom (expressas, por exemplo, como razão verde/amarelo) podem ser identificadas. Plantas com uma significativa diferença nesta razão verde/amarelo podem ser identificadas como transgenes condutores que impactam este traço agronômico importante.

O biolólog especializado em plantas reconhecerá que outras cores de planta surgirão que podem indicar a saúde da planta ou resposta ao estresse (por exemplo antocianinas), e que outros esquemas de classificação de cor podem fornecer outras medidas de ação gênica em traços relacionados a essas respostas. Análise de arquitetura de planta: Transgenes que modificam parametros de arquitetura de planta também podem ser identificados utilizando-se a presente invenção, incluindo tais parâmetros como altura e largura máximos, distâncias intermodais, ângulo entre folhas e caule, número de folhas que iniciam em nós e comprimento de folha. O software de sistema LemnaTec pode ser usado para determinar a arquitetura de planta como segue. A planta é reduzida à sua arquitetura geométrica principal em uma primeira etapa de imageamento e em seguida, baseada nesta imagem, identificação parameterizada dos diferentes parâmetros de arquitetura pode ser executada. Transgenes que modificam qualquer um desses parâmetros de arquiteturaseja individualmente ou em combinação podem ser identificados mediante aplicação dos métodos estatísticos anteriormente descritos.

Dados de rendimento de pólen: Dados de rendimento de pólen é um importante parâmetro a ser analisado em uma planta transformada e pode ser determinado pela primeira aparição na planta de uma flor macho ativa. Para encontrar o objeto flor macho a extremidade superior do caule é classificada pela cor para detectar anteras amarela ou violeta. Essa análise de classificação de cor é então usada para definir uma flor ativa, que por sua vez pode ser usada para calcular os dados de rendimento de pólen.

Alternativamente, os dados de rendimento de pólen e outros atributos de planta visualmente detectados (por exemplo dados de polinação, primeiros dados “silk”) podem ser registrados pela equipe responsável pela realização do tratamento de plantas. Para maximizar a integridade dos dados e a eficiência do processo esses dados são rastreados pela utilização dos mesmos códigos de barra utilizados pelo dispositivo de análise digital por espectro de luz LemnaTec. Um computador com um leitor de código de barras, um dispositivo Palm ou um PC notebook podem ser usados para facilitar o registro por captura de dados do tempo de observação, identificador de plantae o operador quem capturou os dados. Orientação das plantas: O crescimento de plantas de milho maduras em densidades que aproximam o plantio comercial muitas vezes apresenta uma arquitetura planar.

Istoé, a planta apresenta um lado amplo claramente discernível e um lado estreito. A imagem da planta do lado amplo é determinada. Para cada planta é atribuída uma diferença máxima entre o lado amplo e imagens de perfil. À imagem de too é usada para determiner o eixo principal da planta, e um dispositivo de rotação adicional é usado para girar a planta para a orientação apropriada antes de iniciar a aquisição de imagem principal.

EXEMPLO 13

AVALIAÇÃO DE LINHAGENS DE MILHO DERIVADAS DE GASPE FLINT PARA

TOLERÂNCIA À SECA Linhagens de milho derivadas de Gaspe Flint transgênicas contendo o gene tolerante à seca candidato podem ser identificadas e quantificadas quanto à tolerância ao estresse à seca da seguinte maneira. Plantas de milho transgênicas são submetidas a condições de boa rega (controle) e a condições de estresse à seca. Plantas de milho transgênicas são identificadas e quantificadas no estágio T1 ou posterior.

Quanto ao crescimento de planta, a mistura de solo consiste de areia Vz TURFACEO, Vz SB300 e Vz. Todos os potes são preenchidos com a mesma quantidade de terra + 10 gramas. Potes são levados até a capacidade de campo de 100% ("FC") mediante rega manual. Todas as plantas são mantidas em 60% de FC utilizando-se uma solução de nutriente 20-10-20 (N- P-K) 125 ppm N. O teste de pH é monitorado pelo menos tres vezes por semana para cada bancada. Iniciando em 13 dias após o plantio (DAP), o tste pode ser dividido em dois grupos de tratamento, um bem regado o outro com rega reduzida. Todas as plantas compreendendo o tratamento de rega reduzida são mantidas sob 40% de FC, enquanto as plantas no tratamento de bem regadas são mantidas sob 80% de FC. As plantas de rega reduzida foram cultivadas por 10 dias sob condições de estresse à seca (40% FC). Todas as plantas foram imageadas diariamente por todo o period de estresse crônico. As plantas forma retiradas para amostra para análises de definição de perfil metabólicas no final do período de seca crônico, 22 DAP. Na conclusão do período de estresse crônico todas as aplantas foram imageadas e medidas quanto à fluorescência de clorofila. Plantas de rega reduzida foram submetidas a um período de estresse à seca severo seguido por um período de recuperação, 23 - 31 DAP e 32 - 34 DAP respectivamente. Durante o estresse à seca severo, água e nutrientes foram retirados até as plantas atingirem 8% de FC, Na conclusão dos períodos de estresse à seca severo e de recuperação todas as plantas foram novamente imageadas e medidas quanto à fluorescência de clorofila, A probabilidade de um teste t de Student maior é calculada para cada meio transgênico comparado ao meio zero apropriado (seja zero segregante ou zero contrução). Um nivel mínimo (P<t) de 0,1 foi usado como um corte quanto ao resultado significante estatisticamente.

EXEMPLO 14

TRANSFORMAÇÃO E AVALIAÇÃO DE LINHAGENS DE MILHO DERIVADAS DE GASPE FLINT TRANSFORMADAS coM PHP29675 Uma linhagem de milho derivada de Gaspe Flint foi transformada via agrobactéria utilizando-se DNA de plasmídeo PHP29675, contendo o fragmento de DNA genômico de capim Sudão IS125. Quatro eventos de transformação para construção de plasmídeo foram avaliados quanto à tolerância à seca de modo similar àquela descrita no exemplo 13. As tabelas 19-20 mostram as variáveis para cada evento transgênico que foram significativamente alterados em comparação aos zeros segregantes. Um "efeito positivo" foi definido como melhoramento estatisticamente significativo naquela variável para evento transgênico relativo ao controle zero. Um "efeito negativo" foi definido como melhoramento estatisticamente significativo naquela variável para o controle zero relativo ao evento transgênico. A tabela 19 apresenta o número de variáveis com uma “mudança significativa para eventos individuais transformados com construções de DNA de plasmídeo. A tabela 20 apresenta o número de eventos para a construção que mostrou uma mudança significativa para cada variável individual. TABELA 19 NÚMERO DE VARIÁVEIS COM UMA MUDANÇA SIGNIFICANTE * PARA EVENTOS

INDIVIDUAIS TRANSFORMADOS COM PHP29675 CcoNTENDO FRAGMENTO GENÔMICO |IS125 Rega reduzida Bem regado Evento Efeito positivo / negativo Efeito positivo/ negativo EA2393.324.2.1 3 1 2 3 EA2393.324.3.2 1 1 o 2 EAZ393.324.4.2 o 1 o 1 EA2393.324.5.1 3 1 2 o *valor P inferir ou igual a 0,1 TABELA 20 NÚMERO DE EVENTOS TRANSFORMADOS COM PHP29675 COM UMA MUDANÇA

SIGNIFICANTE * PARA VARIÁVEIS INDIVIDUAIS Rega reduzida Bem regado Evento Efeito positivo / negativo Efeito posítivo/ negativo % area cho. start 1 o o 2 Chronic-end chronic 80 % area chg. start chronic 1 o o 1 - harvest % area chg. start chronic o o o o - recovery24hr % area chg. start chronic o o o o - recovery48hr fvwfm acute1 fv/fm acute? 2 o 2 1 leaf rolling, recovery24hr o o o o leaf rolling recovery48hr psii acute1 o 1 o o psii acute2 sor-r2>0.9 shoot dry weight o o o o shoot fresh weight 2 o 1 o o o o o o 2 o 2 [ 1 o o *Valor P inferior ou igual a 0,1. Para a construção analisada, PHP29675, o valor estatístico associado a cada variável melhorada está indicado nas Tabelas A.1, A.2, B.1 e B.2. Um resultado positivo significante apresentou um valor-P inferior a 0,1. Os resultados para linhagens de milho transformadas individuais estão indicados —nasTabelas A.1eA.2.A avaliação sumária para a construção PHP30853 está indicada nas Tabelas B.1 e B.2. Conforme mostrado na tabela 18 e Tabelas A.1 e A.2, sob condições de agua reduzida, eventos de transformação de milho EA2Z393.324,2.1 e EA2393.324.5.1 apresentaram valores positivos importantes para três das trinta variáveis listadas.

Nm

1 8 eras E ds o ES; = E 5 2 = Ss 82 Ss 1 2 8 = o as E o a. lo ” 8 + | dE j8 88 $3$:s 3 88 Ss Ss nn | ES la So aa 2? Ô & o o o sã SlS2ie SS Sos dos Ô : E EPs oo cols a | Ss o E ns E Ed a 2 =) . > E $ a a mm a &s 8 Ss q“ Nos o Ê 8 s o So ON TO s | E 2) Ê& P. ra OO o Í 8/8 < 8 2 O ooo ã i =| E 6 À > Sosco > - S & egeeee " | BB XX, a E 8 ! Fi go e El.

E | E E" FE a | > e i S ” Ss =| $ e o = e. o | & F = E 1! 2 1 o s u rr oz s - E u FS a s | = Ss = E 2 ' + jo & £| 88 8 81 Sã "ss é SS 3,8 = É 8) = & | sis = e e so o | = d eco ú [O] = 2 À & |o co = nm Ss se S É o s = z To ez Fi Ss Bl = RR ç 22/25 s Tg Ee) 8 FT 2 Es | Ss 8s/ 27) 8 3 ” à| E : ww | E OS 2 2 Ss à Ss a FrálxZ| O e : Sl os o À É 3 S|sSE s E “o 2 ss seo FÊ E o 8 Ss 3 a = Ss no E e ms FE) £ 52 ê 2 Io No = 2 E s Bless Ss - 2elsa 2 5 | E STS Oo o Es v Õ * Í & 88 S =] £&0 Ss Í 2 | ES 8 o õ = E o É | E xs |º ese 5 vu | Sm o E ! =| 2 8 | E£| > a Sã E | ES s o a 2 Ss ú TmNaNTTaANT!s ã& =NaoTr-aN=) Ss - dai ooo ss Ss cin focos s ; Else FT TTTT ETF ZS o ET tTTTIIIA) E PTS INSNSNNSISNAN E f£E/ vol NISSAN E 2 | 29 nmNNaMmAnMo | EE ANN NMDORAO| É ss O o co co co O co Sin oosSSOONN| E 3/S3 opcao S | PT ST BOSSBADA | | g/º"ÉSSSSSSSOS 8)” SSSSSSSS e: v S 2 S CALL LDS| co & DALTLLLL| 5 S o WWWwWw 22 É u wwuuw| 88 SC as > ES ! 2 E 2 < So S&S o = sos. dm | | 2 ESSE Sã E /E8SSScsoo E i < E SRS ESSS | O E) ESSSTSS So ; SS BIERSSSS| 07 É ESTES SHES ES i É FEST ZEZ| So E / ESTE ZLIZ de E FRETE EE |232 gi egezédas 38 t Fi ESSEESES | 2 SSBSSSãS cs ' w 2 2 2382$S$S| o =. ESSAS 2 E PPESSSTSSD à & 222 ã = = ! 8 1x 52 * o

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EXEMPLO 15

ANÁLISE DE RENDIMENTO DE LINMHAGENS DE MILHO TRANSFORMADAS COM GENES

GUIA TOLERANTES À SECA Uma construção de DNA recombinante contendo um gene tolerante à seca validado pode ser introduzido em uma linhagem inata de milho elite seja por transformação direta ou introgressão de uma linhagem transformada separadamente.

Plantas transgênicas, seja inatas ou híbridas, podem passar por testes campo-baseados mais vigorosos para estudar melhoramento de rendimento e/ou estabilidade sob condições de boa rega ou com limitação de rega.

Subsequentemente, análise de rendimento pode ser feita para determinar se plantas que contém o gene guia tolerante à seca validado apresentam um melhoramento em desempenho de rendimento sob condições de restrição de água, em comparaçãos com as plantas de controle que não contém o gene guia tolerante à seca validado. Especificamente, condições de seca podem ser impostas durante o florescimento e/ou período de crescimento de grão para plantas que contém o gene guia tolerante à seca validado e as plantas de controle. A redução em rendimento pode ser medida para ambas, As plantas contendo o gene guia tolerante à seca validado apresenta menos perda de rendimento com relação às plantas de controle, por exemplo, pelo menos 25% menos de perda de rendimento sob condições de restrição de água, ou deveria apresentar rendimentos aumentados com relação às plantas de controle sob condições de não retrição de água.

O método acima pode ser usado para selecionar plantas transgênicas com rendimento aumentado, sob condições de restrição de água e/ou condições de boa rega, em comparação com uma planta controle que não compreende a dita construção de DNA recombinante.

EXEMPLO 16

IDENTIFICAÇÕES E QUANTIFICAÇÕES PARA IDENTIFICAR LINHAGENS ARABIDOPSIS

TRANSGÊNICAS COM TOLERÂNCIA À SECA AUMENTADA Identificação e quantificação de seca quantitativa: para cada linhagem Arabidopsis transgênica, nove plantas T2 resistentes a glufosinato foram semeadas, cada uma em um pote individual em terra SCOTTSEO METRO-MIXO 200. Planos foram configurados com 8 potes quadrados respectivamente. Cada um dos potes quadrados foi preenchido até o topo com terra. Cada pote (ou célulajà foi semeada para produzir 9 sementeiras resistentes a glufosinato em um arranjo 3x3.

A terra foi regada para saturação e em seguida as plantas foram cultivadas sob condições padrão (i.e., 16 horas de luz, 8 horas de ciclo escuro; 22ºC; -60% de umidade relativa). Não foi colocada água adicional.

Imagens digitais das plantas foram feitas no início de sintomas de estresse à seca visíveis. Imagens foram feitas uma vez ao dia (no mesmo tempo do dia), até as plantas parecerem dessecadas. Tipicamente, quatro dias consecutivos de dados foram capturados.

Análise de cor foi empregada para identificação de linhagens tolerantes à seca. A análise de cor pode ser usada para medir o aumento na porcentagem da área de folha que recai em um agrupamento de cor amarela. Com o uso de dados de matiz, dados de saturação e de intensidade ("HSI"), o agrupamento de cor amarela consiste de matizes 35 a 45.

Manutenção da área de folha também é usada como outro critério para identificar linhagens tolerantes à seca em potencial, uma vez que folhas de Arabidopsis murcham durante o estresse à seca. Manutenção de area de folha pode ser medida como redução de area de folha de roseta no serão.

Área de folha é medida em termos do número de pixels verdes

Lobtidos com o uso do sistema de imageamento LemnaTec.

Plantas ativação- marcadas e de controle (por exemplo, tipo selvagem) foram cultivadas lado a lado em planos que continham 72 plantas (9 plantas/pote) Quando começaram a murchar, imagens foram medidas para um número de dias a fim de monitorar o processo de murchamento.

Perfis que murcharam a partir dessa data foram detemrinados com base nas contagens de pixel verde obtidas por quatro dias consecutivos para plantas ativação-marcadas e de controle de acompanhamento.

O perfil foi selecionado de uma série de medições pelo período de quatro dias que indica o grau mais amplo de murchamento.

A capacidade em resistir à seca fi medida pela tendência de plantas ativação-marcadas em resitir ao murchamento em comparação com plantas de controle.

O software LemnaTec HTSBonitUV foi usado para analisar imagens CCD.

Foram feitas estimativas da area de folha das plantas —Arabidopsis em termos do número de pixels verdes.

Os dados para cada imagem é ponderado para obter estimativas de média e desvio padrão para as contagens de pixel verde para plantas ativação-marcadas e plantas tipo selvagem.

Parâmetros para uma função de ruído foram obtidos por regressão de linhagem linear do desvio quadrático versus a contagem de pixel média utilizando-se dados para todas as imagens em uma batelada.

Estimativas de erro para os dados de contagem de pixel média foram calculadas utilizando-se parâmetros de ajuste para a função de ruído.

As contagens de pixel medias para plantas ativação-marcadas e tipo selvagem foram somadas para obter um exame de toda a área de folha para cada imagem.

O intervalo de quatro dias com murchamento máximo foi obtido pela seleção do interval que corresponde à diferença máxima em crescimento de planta.

As repostas de murchamento individuais das plantas ativação-marcadas e tipo selvagem foram obtidas por normalização dos dados utilizando-se o valor da contagem de pixel verde do primeiro dia no intervalo. A tolerância à seca das plantas ativação-marcadas compara com as plantas tipo selvagem foi classificada pela soma da diferença ponderada entre resposta ao murchamento de plantas ativação-marcadas e plantas tipo selvagem durante o dia dois ao dia quatro; os — pesos foram estimados pela propagação do erro nos dados. Uma classificaçaõ positive de tolerância à seca corresponde a uma planta ativação-marcada com murchamento mais lento em comparação com a planta tipo selvagem. Significância da diferença em resposta ao murchamento entre plantas ativação-marcadas e tipo selvagem foi obtida a partir da soma ponderada dos desvios quadráticos.

Linhagens com um atraso significante em acumulação da cor amarela e/ou com manutenção significativa de área de folha de roseta, em comparação com a média do plano inteiro foram designadas de hits de fase 1. Hits de fase 1 foram re-identificados e re-quantificados em duplicata sob as mesmas condições de teste. Quando um ou ambos replicados da fase 2 mostraram uma diferença sifnificativa (classificação superior a 0,9) de toda a média plana, a linhagem foi então considerada uma linhagem tolerante à seca validada.

EXEMPLO 17 VALIDAÇÃO DE SS-DTP21-1vIA TRANSFORMAÇÃO EM ARABIDOOSIS O gene candidato que codifica SS-DTP21 -1 (SEQ ID NO: 27) foi testado quanto à sua capacidade em conferir tolerância à seca em Arabidoosis da seguinte maneira.

Um T-DNA 16.8-kb baseado no vetor binário, chamado amarelo —pBC foi construído com um promotor 1.3-kb 35S imediatamente a montante do insetor de conversão INVITROGENTY GATEWAYO C1. O vetor também contém o promotor RD29a que dirige a expressão do gene para amarelo ZS (INVITROGENTY), que confere fluorescência amarela à semente transformada.

A região codificadora de proteina SS-DTP21-1 foi amplificada do DNA genômico a partir do capim Sudão por RT-PCR com os seguintes primers: (1 ) primer anterior SS-DTP21 -1-5'attB (SEQ ID NO: 67): GG G

GACAAGTITG TACAAAAAMAG C AG G CTATG G CCG AG AAG TACC A

CGAAG (2) primer reverso SS-DTP21 -1 -3'attB (SEQ |D NO: 68):

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTAGCGGCGCTCTAATTCCCT AATC.

Oo primer anterior contém a sequência attB1 (ACAAGTTTGTACAAAAAAG CAG GCT; SEQ ID NO: 69) adjacente aos primeiros 22 nucleotídeos da região codificadora de proteína iniciando com códon d epartida ATG.

O primer reverso coném a sequência attB2 (ACC ACTTTG TAC AAG AAAG CTG G GT ; SEQ ID NO: 70) adjacente ao complemento reverso dos últimos 25 nucleotídeos da região codificadora de protéina, iniciando com o complemento reverso do códon de parada.

Com o uso da tecnologia INVITROGEN'Y GATEWAYO CLONASE'"", uma reação de recombinação BP foi realizada com pDONR'Y/Zeo. Esse processo removeu o gene ccdB letal a bactéria assim como o gene de resistência a cloramfenicol (CAM) de pDONR" Zeo e clonou direcionalmente o produto PCR flanqueador com sítios attB1 e attB2 que criam um clone inteiro, pPDONR'Y/Zeo-SS-DTP21 -1 . Esse clone de inserção foi usado para uma reaçao de recombinação LR subsequente com um vetor de destinação como segue. Um vetor a base de 16.8-kb T-DNA (vetor de destinação), chamado amarelo pBC (SEQ ID NO: 71 ), foi construído com um promotor 1.3-kb 35S imediatamente a montante do inserto de conversão INVITROGENTY GATEWAYO C1, que contém o gene ccdB letal a bactéria assim como o gene de resistência a cloramfenicol (CAM) flanqueado por sequências attiR1 e attR2. O vetor também contém o promotor RD29a que dirige a expressão do gene para amarelo ZS-Yellow (INVITROGENTY), que confere fluorescência amarela à semente transformada. Com o uso da tecnologia INVITROGENTY GATEWAYGO, uma reação de recombinação LR foi realizada no clone de inserção pPDONR'Y/Zeo-SS-DTP21-1 contendo o produto PCR direcionalmente clonado e amarelo pBC. Isso permitiu uma clonagem rápida e direcionaldo gene candidato atrás do promotor 358 em amarelo pBC para criar o promotor 358 :: construção de expressão SS-DTP21 -1, pBC- amarelo-SS-DTP21-1. O promotor 35S promoter:: construção de expressão SS-DTP21 - 1 foi então introduzido no ecotipo Arabidopsis selvagem Col-0 utilizando-se um procedimento de transformação agrobactéria-mediado de planta inteira (pedido iunternacional de patente WO 2009/006276, os conteúdos desta são aqui incorporados por referência). Sementes T1 transgênicas foram selecionadas por fluorescência amarela e sementes T1 foram transferidas para placas próximas a sementes tipo selvagem e foram cultivadas sob condições de restrição de água. Condições de crescimento e análise de imageamento foram como descritas no exemplo16. Plantas Arabidopsis transgênicas que foram transformadas com uma construção onde SS-DTP21 -1 foi diretamente expressado pelo promotor 358 se mostraram tolerantes à seca, A classificação de tolerância à seca, conforme determinado pelo método do exemplo 16, foi

1.0. EXEMPLO 18 VALIDAÇÃO DE SS-DTP21 -2 VIA TRANSFORMAÇÃO EM ARABIDOPSIS O gene candidato que codifica SS-DTP21 -2 (SEQ ID NO: 32) foi testado quanto à sua capacidade em conferir tolerância à seca em Arabidopsis da seguinte maneira.

Um T-DNA 16.8-kb baseado no vetor binário, chamado amarelo pBC foi construído com um promotor 1.3-kb 35S imediatamente a montante do insetor de conversão INVITROGENTY GATEWAYO C1. O vetor também contém o promotor RD29a que dirige a expressão do gene para amarelo ZS —(INVITROGENTY), que confere fluorescência amarela à semente transformada. A região codificadora de proteina SS-DTP21-2 foi amplificada do DNA genômico a partir do capim Sudão por RT-PCR com os seguintes primers: (3) primer anterior SS-DTP21 -2-5'attB (SEQ ID NO: 72): CG GG G

AC AAG TTTG TACAAAAAMAG C AG G CTATG G CCG AG AAG TACC A

CCATG (4) primer reverso SS-DTP21 -2-3'attB (SEQ ID NO: 73): GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTAGCGGTGCTCTAATTCCTT. O primer anterior contém a sequência attB1 15º (ACAAGTTTGTACAAAAAAG CAG GCT; SEQ ID NO: 69) adjacente aos primeiros 22 nucleotídeos da região codificadora de proteína iniciando com o códon de partida ATG. O primer reverso contém a sequência attB2 (ACC ACTTTG TAC AAG AAAG CTG G GT ; SEQ ID NO: 70) adjacente ao complemento reverso dosúltimos 22 nucleotídeos da região codificadora de proteína iniciando com o códon reverso do códon de parada. Com o uso da tecnlogia INVITROGENTY GATEWAYO CLONASETY, uma reaçao de recombinação BP foi realizada com pDONR'Y/Zeo, para criar um clone de inserção, pPDONRTY/Zeo-SS-DTP21 -2. Uma reação de recombinação LR foi então realizada no clone de inserção — pDONR'Y/Zeo-SS-DTP21 -2 contendo o produtoPCR direcionalmente clonado e o vetor de destinação amarelo pBC (SEQ ID NO: 71 ; Exemplo 17). Isso permitiu uma clonagem rápida e direcionaldo gene candidato atrás do promotor 358 no amarelo pBC para criar o promotor 35S::construção de expressão SS-

DTP21 -2, pBC-amarelo-SS-DTP21 -2.

O promotor 35S::construção de expressão SS-DTP21 -2 então introduzido no ecotipo Arabidopsis tipo selvagem Col-0 utilizando-se um procedimento de transformação agrobactéria-mediado de planta inteira (pedido internacional de patente WO 2009/006276, os conteúdos deste são aqui incorporados por referência). Sementes T1 transgênicas foram selecionadas por fluorescência amarela, e sementes T1 foram transferidas para placas próximas a sementes tipo selvagem e foram cultivadas, sob condições de restrição de água. Condições de crescimento e análise de imageamento foram como descritas no exemplo 16. Plantas Arabidopsis transgênicas foram transformadas com uma construção onde SS-DTP21 -2 foi diretamente expressado pelo promotor 35S, mostraram-se toleantes à seca. A classificação de tolerância à seca conforme determinada pelo método do exemplo 16 foi 2.2. EXEMPLO 19 TESTE DE TOLERÂNCIA À SECA DE HOMÓLOGOS SS-DTP21-1 EM ARROZ Homólogos SS-DTP21 -1 descritos no exemplo 7 foram introduzidos em um cultivar de arroz Yukihikari por transformação agrobactéria- mediada conforme descrito no exemplo 3. Para esses testes a região codificadora de proteina SS-DTP21 -1 no subclone Sub8 do fragmento genômico 18125 foi substituída com as regiões codificadoras de proteina de vários genes que codificam polipeptídeos homólogos a SS-DTP21-1.Plantas de arroz transgênicas foram testadas quanto à tolerância à seca na geração TO. Detalhes do teste de tolerância à seca foram descritos no exemplo 2. Mais de uma plantatransgênicados 36,42 ou 48 regenerantes de oito homólogos (SS- DTP21 -5, SB-DTP21 4, SB-DTP21 -5, SB-DTP21 -6, SB-DTP21 -9, SB- DTP21 -10, SH-DTP21 -1 , SO-DTP21 - 1 ) foi classificada com 2 ou mais embora nenhum dos 42 regenerantes de Yukihikari não transgênico tenham sido (tabela 21 )., Portanto, cada um desses homólogos foramsuficientes para produzir arroz transgênico tolerante à seca. TABELA 21

TESTE DE TOLERÂNCIA À SECA DE REGENERANTES TRANSFORMADOS COM HoMÓLOGOS SS-DTP21 -1 Controle DNA* Homélogo — Total No.? No. >2º Resposta à seca

SEQ ID NO Yukihikari (Controle) - 42 o Suscetível SS-DTP21-3 52 36 o Suscetivel SS-DTP21-4 54 36 o Suscetível SS-DTP21-5 56 36 7 Tolerante SS-DTP21-6 79 48 o Suscetível SS-DTP21-7 58 36 o Suscetível SB-DTP21-1 41 36 o Suscetível SB-DTP21-2 42 36 o Suscetível SB-DTP21-3 45 36 o Suscetível SB-DTP21-4 46 36 117 Tolerante SB-DTP21-5 81 42 12 Tolerante SB-DTP21-68 83 42 9 Tolerante SB-DTP21-9 85 42 16 Tolerante SB-DTP21-10 87 42 9 Tolerante SH-DTP21-1 60 48 21 Tolerante SH-DTP21-2 62 36 o Suscetível SO-DTP21-1 64 36 6 Tolerante SO-DTP21-2 66 36 o Suscetível * DNA usado na tranformação. 2Numero total de regenerantes testados. 3Número de regenerantes que pontuam 2 ou mais. EXEMPLO 20 TESTE DE TOLERÂNCIA À SECA DA GERAÇÃO T1 DE LINHAGENS DE TABACO TRANSFORMADAS COM SS-DTP21 -1 A região de promotor do subfragmento Sub8 do fragmento genômico IS125, que codifica SS-DTP21 -1, foi substituída com promotor 35S como segue. PCR com Pyrobest DNA Polimerase (TAKARA-BIO) foi feita utilizando-se DNA de plasmídeo Sub8 como um apadrão e um par de primer, SEQ ID NO; 88 (5 - ACCT ATCCTCAAAGCTTCTTCTCAGA-3') e SEQ ID NO: 89 (5 - ACCCCTG ACCTCAATTGTCAAACACCÇAAG C-3' ) , e em seguida os produtos PCR foram inseridos em pCR4 Blunt-TOPO (Invitrogen). Após a confirmação da sequência da região PCR-amplificada, o plasmídeo resultante foi digerido com Hindlll e Mfel fornecendo um fragmento 1.8-kb. De modo similar, PCR foi realizada utilizando-se DNA de plasmídeo pSB31 (Ishida et al. 1996 Nature Biotechnology 14:745-750) como um padrão e um par de primer, SEQ ID NO: 90 (5 - GGGCGTCGTTCTGGGTCAATTGTTATAGAG-3') e SEQ 1IDNO 91(5-GGACGTTTTTAAGGTACCGAATTCCAATCC-3'), e em seguida os produtos PCR foram inseridos em pCR4 Blunt-TOPO, seguido pelo tratamento com Kpnl e Mfel para fornecer um fragmento 1.4-kb. Os dois fragmentos (fragmentos 1.8-kb e 1.4-kb) foram inseridos em pSB200 que tinham sido digeridos com Hindlll e Kpnl e em seguida pré-tratados com CIAP (fosfatase alcalina de intestino de bezerro). O gene quimérico resultante (doravante chamado de "promotor 35S+Sub8" ou "35S::construção SS-DTP21 -1" (esses termos usados de modo intercambiável aqui) foi introduzido em variedade de tabaco SR1 por transformação agrobactéria-mediada. As plantas de Tabaco transgênicas foram testadas quanto à tolerância à seca na geração

1. TI As plantas geneticamente modificadas e plantas tipo selvagem foram cultivadas em potes de 12 cm e plantas geneticamente modificadas resistentes a higromicina foram usadas para o teste de tolerância à seca. Durante o tratamento de secano qual a rega foi suspensa, fotos foram tiradas do topo utilizando-se Scanalyzer (LemnaTec GmbH) e a área de folha foi medida em unidades de números de pixel. As áreas de folha com relação às áreas de folha medidas no primeiro dia do tratamento de seca foram estatisticamente = examinadas. As folhas das plantas tipo selvagem encolheram rapidamente após o tratamento de seca embora uma das nove linhagens T1 manteve o tamanho de folha mesmo 3 dias após o tratamento de seca conforme mostrado na tabela a seguir. Esta linhagem, linhagem T1 No. 9, também foi estatisticamente diferente das plantas tipo selvagem no dia 6 na área de folha relativa. Portanto, linhagem T1 No. 9, uma linhagem de tabaco transgênica contendo o promotor 35S::construção SS-DTP21 -1 que foi claramente tolerante à seca.

TABELA 22 RAZÃO (%) DE ÁREA DE FOLHA COM RELAÇÃO À ÁREA DE FOLHA DO PRIMEIRO DIA Pa Pe pg [mae | so [me | so [mes] so [mal | [riposevagem | 024 [102 [542 [| 73 [467 [ 62 [365 | 38]

Claims (21)

REIVINDICAÇÕES

1. — MÉTODO PARA AUMENTAR A TOLERÂNCIA À SECA, em uma planta, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) introduzir em uma célula de planta regenerável uma construção de DNA recombinante compreendendo um polinucleotídeo operativamente ligado a pelo menos um elemento regulador, em que o dito polinucleotídeo compreende uma sequência nucleotídica selecionada a partir do grupo que consiste em: (i) uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo com atividade de tolerância à seca, em que o polipeptídeo apresenta uma sequência de aminoácido de pelo menos 80% de identidade de sequência, com base no método Clustal V de alinhamento com parâmetros padrão de alinhamento de pares KTUPLE=1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 e DIAGONALS SAVED=5, em comparação com SEQ ID NO: 27, 32, 46, 56, 60, 64,81,83,850ou87; (ii) uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo com atividade de tolerância à seca, em que a sequência nucleotídica é hibridizável sob condições estringentes com uma molécula de DNA compreendendo o complemento inteiro de SEQ ID NO: 26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 ou 86; (iii) uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptíideo com atividade de tolerância à seca, em que a sequência nucleotídica é derivada de SEQ ID NO: 26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 ou 86 pela alteração de um ou mais nucleotídeos através de pelo menos um método selecionado do grupo que consiste em: deleção, substituição, adição e inserção; (iv) uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo, em que a sequência de aminoácido do polipeptíideo compreende SEQ ID NO: 27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 ou 87; e (v) uma sequência nucleotídica compreendendo SEQ ID NO: 26,

31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 ou 86; e (b) regenerar uma planta transgênica a partir da célula de planta regenerável após etapa (a), em que a planta transgênica compreende em seu genoma a construção de DNA recombinante e exibe tolerância à seca aumentada, em comparação com uma planta controle que não compreende a construção de DNA recombinante.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: (c) obter uma progênie de planta derivada da planta transgênica, emquea dita progênie de planta compreende em seu genoma a construção de DNA recombinante e exibe tolerância à seca aumentada em comparação com uma planta controle que não compreende a construção de DNA recombinante.

3. — MÉTODO PARA AVALIAR A TOLERÂNCIA À SECA, em uma planta, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) obter uma planta transgênica, em que a planta transgênica compreende em seu genoma uma construção de DNA recombinante compreendendo um polinucleotídeo operativamente ligado a pelo menos um elemento regulador, em que o dito polinucleotíideo compreende uma sequência nucleotídica selecionada do grupo que consiste em: (i) uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo com atividade de tolerância à seca, em que o polipeptídeo apresenta uma sequência de aminoácido de pelo menos 80% de identidade de sequência, com base no método Clustal V de alinhamento com parâmetros padrão de alinhamento de pares KTUPLE=1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 e —DIAGONALS SAVED=5, em comparação com SEQ ID NO: 27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 ou 87; (ii) uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo com atividade de tolerância à seca, em que a sequência nucleotídica é hibridizável sob condições estringentes com uma molécula de DNA compreendendo o complemento inteiro de SEQ ID NO: 26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 ou 86; (iii) uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo com atividade de tolerância à seca, em que a sequência nucleotídica é derivada de SEQID NO: 26,31,44,55, 59,63, 80, 82, 84 ou 86 pela alteração de um ou mais nucleotídeos através de pelo menos um método selecionado do grupo que consiste em: deleção, substituição, adição e inserção; (iv) uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo, em que a sequência de aminoácido do polipeptídeo compreende SEQ ID NO: 27, 32,46,56,60,64,81,83,850U87;e (v) uma sequência nucleotídica compreendendo SEQ ID NO: 26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 ou B6; e (b) obter uma progênie de planta derivada da planta transgênica de (a), em que a progênie de planta compreende em seu genoma a construção de DNA recombinante; e (c) avaliar a progênie de planta quanto à tolerância à seca em comparação com uma planta controle que não compreende a construção de DNA recombinante.

4. MÉTODO PARA DETERMINAR UMA ALTERAÇÃO DE UMA CARACTERÍSTICA AGRONÔMICA, em uma planta, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) obter uma planta transgênica, em que a planta transgênica compreende em seu genoma uma construção de DNA recombinante compreendendo um polinucleotídeo operativamente ligado a pelo menos um — elemento regulador, em que o dito polinucleotídeo compreende uma sequência nucleotídica selecionada do grupo que consiste em: (i) uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo com atividade de tolerância à seca, em que o polipeptídeo apresenta uma sequência de aminoácido de pelo menos 80% identidade de sequência, com base no método Clustal V de alinhamento com parâmetros padrão de alinhamento de pares KTUPLE=1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 e DIAGONALS SAVED=5, em comparação com SEQ ID NO: 27, 32, 46, 56, 60, — 64,81,83,850ou87, (li) uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptíideo com atividade de tolerância à seca, em que a sequência nucleotídica é hibridizável sob condições estringentes com uma molécula de DNA compreendendo o complemento inteiro de SEQ ID NO: 26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 ou 86; (li) uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo com atividade de tolerância à seca, em que a sequência nucleotídica é derivada de SEQ ID NO: 26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 ou 86 pela alteração de um ou mais nucleotídeos através de pelo menos um método selecionado do grupo que consiste em: deleção, substituição, adição e inserção; (iv) uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo, em que a sequência de aminoácido do polipeptídeo compreende SEQ ID NO: 27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 ou 87; e (v) uma sequência nucleotídica compreendendo SEQ ID NO: 26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 ou 86; e (b) obter uma progênie de planta derivada da planta transgênica da etapa (a), em que a progênie de planta compreende em seu genoma a construção de DNA recombinante; e (c) determinar se a progênie de planta exibe uma alteração de pelo menos uma característica agronômica em comparação com uma planta controle que não compreende a construção de DNA recombinante.

5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma característica agronômica é rendimento e ainda em que a dita alteração é um aumento.

6. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que a dita etapa de determinação (c) compreende determinar se a planta transgênica exibe uma alteração de pelo menos uma característica agronômica em comparação, sob condições hídricas limitantes, a 5 uma planta controle que não compreende a construção de DNA recombinante.

7. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a planta é uma monocotiledônia ou uma dicotiledônia.

8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelofatode que a planta é selecionada do grupo que consiste em: milho, soja, girassol, sorgo, canola, trigo, alfalfa, algodão, arroz, cevada, painço, cana de açúcar, switchgrass, tabaco, batata e beterraba.

9. CONSTRUÇÃO DE DNA RECOMBINANTE, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma sequência reguladora —operativamente ligada a um polinucleotídeo isolado, em que o polinucleotídeo isolado compreende uma sequência nucleotídica selecionada do grupo que consiste em: (a) uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptideo com atividade de tolerância à seca, em que o polipeptídeo apresenta uma sequência de aminoácido de pelo menos 60% identidade de sequência, com base no método Clustal V de alinhamento com parâmetros padrão de alinhamento de pares KTUPLE=1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 e DIAGONALS SAVED=5, em comparação com SEQ ID NO: 27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 ou 87; (b) uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo com atividade de tolerância à seca, em que a sequência nucleotídica é hibridizável sob condições estringentes com uma molécula de DNA compreendendo o complemento inteiro de SEQ ID NO: 26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 ou 86;

(c) uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo com atividade de tolerância à seca, em que a sequência nucleotídica é derivada de SEQ ID NO: 26, 31, 44, 55, 59, 63, 80, 82, 84 ou 86 pela alteração de um ou mais nucleotídeos através de pelo menos um método selecionado do grupo que consisteem: deleção, substituição, adição e inserção; (d) uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo, em que a sequência de aminoácido do polipeptídeo compreende SEQ ID NO: 27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 ou 87; e (e) uma sequência nucleotídica compreendendo SEQ ID NO: 26, 31,44,55,59,63,80, 82,84 ou 86.

10. CONSTRUÇÃO DE DNA RECOMBINANTE, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma sequência reguladora operativamente ligada a um polinucleotideo isolado, que compreende o complemento inteiro da sequência nucleotídica,y conforme definida na reivindicação 9, em que o complemento inteiro e a sequência nucleotídica, conforme definidos na reivindicação 9, consistem do mesmo número de nucleotídeos e são 100% complementares.

11. CONSTRUÇÃO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo da parte (a) apresenta uma sequência de aminoácido de pelo menos 80% de identidade de sequência, com base no método Clustal V de alinhamento com parâmetros padrão de alinhamento de pares, em comparação com SEQ ID NO: 27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 ou 87.

12. CONSTRUÇÃO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo da parte (a) apresenta uma sequência de aminoácido de pelo menos 85% de identidade de sequência, com base no método Clustal V de alinhamento com parâmetros padrão de alinhamento de pares, em comparação com SEQ ID NO: 27, 32, 46, 56, 60, 64,

81, 83, 85 ou 87,

13. “CONSTRUÇÃO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo da parte (a) apresenta uma sequência de aminoácido de pelo menos 90% de identidade de sequência, com base no método Clustal V de alinhamento com parâmetros padrão de alinhamento de pares, em comparação com SEQ ID NO: 27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 ou 87.

14. CONSTRUÇÃO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo da parte (a) apresenta uma sequência de aminoácido de pelo menos 95% de identidade de sequência, com base no método Clustal V de alinhamento com parâmetros padrão de alinhamento de pares, em comparação com SEQ ID NO: 27, 32, 46, 56, 60, 64, 81, 83, 85 ou 87.

15. — MICRO-ORGANISMO TRANSGÊNICO, caracterizado pelo fato de que compreende a construção de DNA recombinante, conforme definida em uma das reivindicações 9 a 14.

16. MICRO-ORGANISMO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo é Agrobacterium.

17. MÉTODO PARA ISOLAR UM POLIPEPTÍDEO, codificado pela construção de DNA recombinante, conforme definida em uma das reivindicações 9 a 14, caracterizado pelo fato de que compreende o seguinte: (a) transformar uma célula com a construyçêão de DNA recombinante, conforme definida em uma das reivindicações 9 a 14; (b) cultivar a célula transformada da etapa (a) sob condições adequadas para expressão da construção de DNA recombinante; e (c) isolar o polipeptídeo da célula transformada da etapa (b).

18. VETOR, caracterizado pelo fato de que compreende a construção de DNA recombinante, conforme definida em uma das reivindicações 9 a 14.

19. MÉTODO PARA PRODUZIR UMA PLANTA TRANSGÊNICA, caracterizado pelo fato de que compreende transformar uma célula de planta com à construção de DNA recombinante, conforme definida emuma das reivindicações 9 a 14, e regenerar uma planta transgênica a partir da célula de planta transformada.

20. — MÉTODO, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a planta é uma monocotiledônia ou uma dicotiledônia.

21. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a planta é selecionada a partir do grupo que consiste em milho, soja, girassol, sorgo, canola, trigo, alfalfa, algodão, arroz, cevada, painço, cana de açúcar, switchgrass, tabaco, batata e beterraba.