CN102688264B - 钟花报春花或其提取物的新用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了钟花报春花或其提取物在制备抑制血管新生的药物中的用途。钟花报春花及其乙醇提取物和总黄酮，具有良好的血管形成抑制作用，可作为血管新生抑制剂，为临床癌症治疗用药提供了一种新的选择。同时，钟花报春花总黄酮、乙醇提取物的药效活性与钟花报春花内含有的单一化合物（如槲皮素、5-羟基黄酮）相当、甚至更好，因此，后期用药时无需再对单一化合物进行分离纯化，不仅节省了药物的生产成本，还提高了药材的利用率，有利于实现药物的工业化生产。

Description

钟花报春花或其提取物的新用途

技术领域

本发明涉及钟花报春花或其提取物的新用途，属于药物领域。

背景技术

原发肿瘤的生长和转移是依赖于血管新生（Augiogenesis）的。肿瘤自身具备启动和促进新生血管生成的能力，以满足自身的新陈代谢和营养物质供应的需要，并通过血管源源不断地向宿主输送转移细胞，并在机体的其他部位继续生长和诱导血管形成，导致肿瘤转移。如果没有血管生成，原发肿瘤的生长不会超过1-2mm，也不会出现浸润和转移。不仅实体肿瘤需要依赖血管生成，血液系统恶性肿瘤，如恶性淋巴瘤、白血病等，这些肿瘤的生长和转移也与血管生成密切相关。

不仅如此，血管新生（Augiogenesis）也是其他许多病理过程的基本事件之一，如风湿性关节炎、糖尿病性视网膜病、银屑病、动脉粥样硬化等。因此，以血管生成为靶点，开发血管新生抑制剂，不但可用于大多数肿瘤的阻断和治疗，还可以用于对其他与血管新生有关的疾病的预防和治疗。

钟花报春（Primula sikkmensis Hook），属于报春花科报春花属植物，花黄色，钟状，聚生于花葶顶端，主产于西藏东部及南部、青海东南部、四川西部、云南西北部；生于海拔3750—4500米的林缘湿草地、水沟边；分布于尼泊尔、锡金、不丹、缅甸。它是一种常见的藏药材，藏族民间用全草作止泻药，其疗效独特显著。具有清热解毒，泻肝胆火、止血等作用，还能用于心脉瘀阻、血脉不畅，疗效确切，在治疗小儿热痢方面，有效率达到80%，同时，由于钟花报春资源十分丰富，使其在甘孜藏族地区广泛被使用。

当前对钟花报春的研究多集中在报春花的系统分类、地理分布及资源调查等方面，也有研究人员对钟花报春花的总黄酮提取工艺进行了初步研究，他们利用正交试验研究了从钟花报春的花中提取总黄酮的优选工艺，并指出以60%乙醇，20倍溶媒用量，回流提取3次，每次1小时，提取得到的总黄酮含量较高，提取物中总黄酮含量可达到7%左右。（邱建平，等，正交设计优化钟花报春花总黄酮提取工艺，成都医学院学报，2009年4卷4期）。

目前，还未见将钟花报春花乙醇提取物或总黄酮用于抗血管新生的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供钟花报春花或其提取物的新用途。

本发明提供了钟花报春花或其提取物在制备抑制血管新生的药物中的用途。

进一步地，所述药物是抑制肿瘤血管新生的药物。

进一步地，所述钟花报春花提取物为钟花报春花的乙醇提取物。

更进一步地，所述钟花报春花乙醇提取物，是以钟花报春花为原料，采用50-70%V/V乙醇提取得到的提取物。

进一步优选地，所述乙醇浓度为60%V/V。具体地，是以钟花报春花为原料，加入20倍量60%乙醇，回流提取3次，每次1h。

其中，所述钟花报春花提取物为钟花报春花总黄酮，其中，黄酮的含量以芦丁计不得低于50%w/w。

进一步地，所述钟花报春花总黄酮中，黄酮的含量以芦丁计为50-60%w/w。

更进一步地，钟花报春花总黄酮是通过如下方法制备的：

（1）取钟花报春花，以50-70%V/V乙醇提取，合并提取液备用；

（2）将步骤（1）中的提取液回收乙醇后，用正丁醇萃取，将正丁醇层回收正丁醇后，上大孔吸附树脂，先用水洗脱至不发生三氯化铁反应和盐酸镁粉反应，再用30%-40%的乙醇洗脱，收集洗脱液，回收溶剂后，干燥，即得钟花报春总黄酮。

进一步优选地，步骤（1）中采用60%V/V乙醇提取；步骤（2）中选用30%V/V乙醇进行洗脱。具体地，步骤（1）中，是以钟花报春花为原料，加入20倍量60%乙醇，回流提取3次，每次1h。

进一步优选地，所述大孔吸附树脂为D101型大孔吸附树脂。

其中，所述的钟花报春花为报春花科报春花属植物钟花报春Primulasikkimensis Hook的干燥花。

钟花报春花及其乙醇提取物和总黄酮，具有良好的血管形成抑制作用，可作为血管新生抑制剂，为临床癌症治疗用药提供了一种新的选择。同时，钟花报春花总黄酮、乙醇提取物的药效活性与钟花报春花内含有的单一化合物（如槲皮素、5-羟基黄酮）相当、甚至更好，因此，后期用药时无需再对单一化合物进行分离纯化，不仅节省了药物的生产成本，还提高了药材的利用率，有利于实现药物的工业化生产。

具体实施方式

实施例1本发明钟花报春花乙醇提取物的制备

取钟花报春花粗粉，加入20倍量60%乙醇浸泡后，回流提取3次，每次1h，合并滤液，减压回收至干，得钟花报春花乙醇提取物。

实施例2本发明钟花报春花总黄酮的制备

取钟花报春花粗粉，加入20倍量60%乙醇浸泡后，加热回流提取3次，每次1h,合并滤液，减压回收至无醇味后，加入适量蒸馏水后，用正丁醇萃取，减压回收正丁醇溶液至无正丁醇味后，加入适量蒸馏水溶解，过滤后，滤液上经预处理的D101大孔吸附树脂，先用蒸馏水洗脱至不发生三氯化铁反应和盐酸镁粉反应，然后用30%乙醇洗脱，收集洗脱液，直至不发生三氯化铁反应和盐酸镁粉反应，合并洗脱液，回收溶剂后，干燥即得钟花报春花总黄酮，其中，黄酮以芦丁计含量为52.5%。

本发明钟花报春花总黄酮的制备方法不限于实施例中所述的方式，现有的黄酮提取方法均能用于对钟花报春花总黄酮的提取，如碱水提取等；对总黄酮的精制也可采用其他型号的大孔吸附树脂进行精制，洗脱溶剂除采用乙醇以外，也可以采用弱碱溶液进行洗脱，也可提高黄酮含量。

实施例3钟花报春花总黄酮制备方法的筛选

1.总黄酮含量测定方法

1.1对照品溶液的制备

取芦丁对照品0.01006g，置于50ml容量瓶中，加60%乙醇定容至刻度，制得浓度为0.2012mg/ml的对照品溶液，备用。

1.2样品溶液的制备

按照各制备方法制备得到的浸膏转移至100ml容量瓶中，并定容至刻度，从此溶液中精密移取10ml于100ml容量瓶中，并用60%乙醇定容至刻度，即制得样品溶液，备用。

1.3测定波长的确定

精密移取对照品溶液7ml和供试品溶液2ml，分别置于2支25ml容量瓶中，均加入60%乙醇稀释至7ml，混匀，加5%亚硝酸钠溶液1ml，摇匀，放置6min，再加10%硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6min，加氢氧化钠溶液10ml，再加60%乙醇至刻度，摇匀，放置15min，以相应试剂为空白，照紫外可见分光光度法（《药典》05年版附录VA），在200-800nm进行扫描，测得对照品溶液和样品溶液的最大吸收波长分别为506.51nm和498.67nm。两者的最大吸收波长接近，因此确定506nm为测定波长。

1.4标准曲线的制备

精密量取对照品溶液（0.2012mg/ml）0.0ml,1.0ml,2.0ml,3.0ml,4.0ml,5.0ml,6.0ml,7.0ml,分别置于25ml容量瓶中，各加60%乙醇至7.0ml，加5%亚硝酸钠溶液（0.050g/ml）1.0ml，摇匀，放置6min，再加10%硝酸铝溶液(0.09972g/ml)1.0ml，摇匀，放置6min.加氢氧化钠试液(0.04308g/ml)10ml，再加60%乙醇至刻度，摇匀，放置15min，以相应试剂为空白，找紫外可见分光光度法（《药典》05版附录ⅤA），在506nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

求得的标准曲线方程为Y=12.785X-0.001    R²=0.9992。

1.5样品液的测定

从供试品溶液中精密移取4ml于1支25ml容量瓶中，然后用60%乙醇溶液稀释至7.0ml，然后按照对照品溶液的显色方法显色。精密量取60％乙醇4ml,作为空白对照，后续显色处理同上述对照品。

在506nm处测定吸光度A，由标准曲线的回归方程计算总黄酮含量。

2、钟花报春花总黄酮提取方法考察

2.1单因素方法考察

本实验以不同乙醇浓度为考察因素，以钟花报春花总黄酮得率为考察指标，筛选钟花报春花总黄酮的最佳提取工艺条件。

2.1.1仪器与材料

（1）仪器与试药

UV-2500型紫外-可见分光光度计PerkinElmer Lambda 35UV/VISSpectrometer；热回流装置，超声仪，R-201旋转蒸发器（上海申顺生物科技有限公司），DZF-6021型真空干燥箱（上海精宏实验设备有限公司），瑞士PAG—160A电子天平，FA1104电子天平(上海精天电子仪器厂),电子恒温不锈钢水浴锅(上海宏兴机械仪器实业制造公司),DGG-9140B电热恒温鼓风干燥箱(上海森信实验仪器有限公司),SHE-Ⅲ循环水真空泵(上海亚荣生化仪器厂),芦丁对照品（中国药品生物制品检定所，供含量测定用，批号为10080-200707），95%乙醇，90%乙醇，80%乙醇，70%乙醇，60％乙醇，5%亚硝酸钠溶液；10%硝酸铝溶液；4.3%氢氧化钠溶液以上试剂均为分析纯。实验用水系重蒸水。

（2）实验药材

钟花报春花：由重庆中药研究所涂永勤博士鉴定为钟花报春Primulasikkimensis Hook的干燥花。

2.1.2方法与结果

(1)总黄酮的提取

取Ⅰ号内钟花报春花适量于托盘内铺开，同时取Ⅱ号内钟花报春花适量于另一托盘内铺开，一起放入烘箱中，30℃干燥过夜。将烘干的药材快速地用打粉机打成粗粉，然后平铺于托盘中，置于烘箱中30℃干燥一定时间（约2小时）然后用袋子封装好置于干燥器中保存备用。分别精密称取Ⅰ号药材粉末5.000g,4.998g，4.998g，4.996g，4.997g，置于5支250ml洁净的圆底烧瓶中，分别加入100ml的95%,90%，80%，70%，60%乙醇浸泡药材30分钟。分别精密称取Ⅱ号药材粉末4.997g，5.000g，4.998g，4.999g，5.002g，置于5支250ml洁净的圆底烧瓶中，然后同Ⅰ号药材粉末一样处理。将Ⅰ号和Ⅱ号中每两个所用乙醇浓度相同的样品置于同一水浴锅中回流提取2小时，60%，70%，80%，90%，95%乙醇的水浴温度分别为86℃，85℃，84.5℃，83.5℃，82.5℃，然后分别趁热抽滤，滤渣再加100ml同第一次提取的溶剂回流提取2次，每次1小时，然后合并滤液备用。（配制不同浓度乙醇温度为18℃）。洗10个大小基本一致的蒸发皿，置减压干燥箱中减压60℃干燥过夜备用。蒸发皿减压干燥后分别精密称重，重量如下所示：

表1  不同乙浓度干燥后的重量

将各自合并的滤液分别减压浓缩（旋转蒸发仪浓缩是的水浴温度为50℃）到一定程度，然后转移至相应的蒸发皿中，60℃水浴挥干，然后将含浸膏的蒸发皿置减压干燥器中60℃减压干燥过夜。含浸膏的蒸发皿经压干燥后，精密称定各含膏蒸发皿总重，结果如下表所示：

表2

由上表数据经处理得“不同浓度乙醇提取浸膏情况”，结果表明60%乙醇提取的浸膏量最多。

各浸膏用各自的提取溶剂溶解并定容于100ml容量瓶中，并超声处理，使其全部溶解，放冷至室温，备用。

2.1.3样品液的测定

分别从供试品溶液Ⅰ95%，90%，80%，70%，60%，Ⅱ95%，90%，80%，70%，60%中精密移取7ml，5ml，4ml，4ml，7ml，5ml，5ml，4ml，4ml于10支25ml容量瓶中，然后分别用各自相应浓度的乙醇溶液稀释至7ml，然后按照对照品溶液的显色方法显色。然后以各自试剂为空白对照，分别在500nm和506nm处测定吸光度A，结果如下表所示：

表3  各样品吸光度情况

由上表数据还得到“不同浓度醇提后总黄酮占浸膏比例”和“不同浓度乙醇提取黄酮的能力”

表4  不同浓度醇提后总黄酮占浸膏比例

表5  不同浓度醇提后总黄酮占浸膏比例

表6  不同浓度乙醇提取黄酮的能力

表7  不同浓度提取总黄酮含量

表8  以上显色剂的配制

结果表明：以60%乙醇为溶剂提取，提取钟花报春花总黄酮含量最高。

2.2正交实验方法考察

前面的实验中，对钟花报春花提取采用了单因素的方法，为进一步考察提取方法对总黄酮和总浸膏量的影响，运用正交实验法进行了系统研究。

2.2.1仪器与材料

实验药材：钟花报春花：由重庆中药研究所涂永勤博士鉴定为钟花报春Primula sikkimensis Hook的干燥花。

2.1.2方法与结果

由于乙醇作为提取溶剂具有选择性好，渗透性强，浸出率较高的优点，因此本实验选择一定浓度的乙醇溶液作为提取剂。根据预实验结果，选择溶剂浓度、溶剂用量、提取次数3个因素进行正交设计，选用L9(3⁴)正交表，因素水平表见下表。

表9  正交设计因素水平表

按下表所列各工艺组合制备样品：

表10  正交实验方案L9(3⁴)

表11  L9（3⁴）正交实验设计及结果

表12  方差分析结果

F_0.05（2,2）=19.00

从正交试验各组测得的总黄酮的含量来看，影响提取效果的主要因素为A（乙醇浓度）和C（提取次数），综合考虑后确定最佳提取条件为A₂B₂C₃，即

20倍量60%的乙醇回流提取3次，每次60min。

3.钟花报春花总黄酮纯化方法考察

3.1同一大孔吸附柱上用不同浓度的乙醇洗脱对总黄酮含量的考察

3.1.1试药与仪器

钟花报春花总黄酮粗提物（“2”项下最佳方法制备）；芦丁标准品(中国药品生物制品鉴定所，含量测定用，批号10080-200707)。

3.1.2方法与结果

（1）样品液的制备

将小60%最初定容余下的90ml减压浓缩（50℃）干（无水无醇味），然后用200ml蒸馏水超声溶解，用正丁醇萃取3次，每次200ml.减压回收正丁醇溶液至干（无正丁醇气味），用300ml蒸馏水超声溶解，然后抽滤制得的上D101型大孔树脂柱的样品，备用。

（2）大孔树脂的预处理

量取D101型大孔树脂约62ml（使用前用95%乙醇浸泡），装于直径约1.75cm的玻璃柱中，用95%乙醇洗柱，洗至洗脱液与水混合（1：3）不得浑浊为止，然后用蒸馏水洗至洗脱液无醇味为止，备用。

（3）样品液的上样洗脱

将上面制得的样品缓缓上于D101型大孔树脂柱上（上样速度为1d/s）,然后用240ml的蒸馏水洗脱，洗脱液与上样时流出的水溶液（300ml）合并，得水部位，然后依次分别用360ml 30%，65%，95%乙醇溶液洗脱，得到不同的洗脱部位。将洗脱下来的水部位，30%乙醇部位，65%乙醇部位，95%乙醇部位分别于50℃减压回收溶剂，然后水浴挥干（60℃），然后将装有浸膏的蒸发皿置于减压干燥箱中60℃减压干燥过夜。精密称定，求得各部位的浸膏重。然后用各自的洗脱溶剂按下表所示定容：

表13

按照对照品的显色方法和测定条件，照下表对各洗脱部位进行总黄酮含量测定：

表14

由上表数据求得各部位得到的浸膏中总黄酮的百分含量为：

表15

结果表明；在同一柱子上用不同浓度的乙醇洗脱，30%乙醇洗脱部位的总黄酮含量最高，为52.52066%。

3.2不同大孔吸附树脂柱上不同的乙醇浓度洗脱对总黄酮含量的考察

3.2.1方法与结果

（1）样品液的制备

取之前打粉干燥好的Ⅱ号（采自阿坝）钟花报春花粉末19.998g，置于1000ml圆底烧瓶中，加26℃配制的60%乙醇溶液400ml浸泡半小时，然后于85℃水浴回流2h，然后趁热抽滤，残渣再加400ml 60%乙醇溶液，同第一次一样加热回流1h，趁热抽滤，残渣同上一次一样处理，抽滤得滤液。将3次的滤液合并准备减压回收溶剂。将以上所得滤液减压浓缩（50℃）至小体积，然后转移至预先在60℃减压干燥过夜的蒸发皿中，60℃水浴挥干。然后置减压干燥箱中60℃减压干燥过夜。

精密称定含浸膏的蒸发皿总重为85.924g，根据蒸发皿的自重为76.839g，求得用60%乙醇从19.998g药材中提取得到的浸膏量为9.085g.用约800ml蒸馏水经超声处理将所得的9.085g浸膏溶解，然后用800ml正丁醇萃取。在50℃下减压回收正丁醇萃取液至小体积后，转移至一个60℃减压干燥过夜的蒸发皿（77.182g）中，水浴60℃挥干，然后置减压干燥箱中60℃减压干燥过夜。精密称定含正丁醇部位浸膏的蒸发皿总重（81.395g）求得正丁醇部位浸膏的重量为4.213g.

（2）大孔树脂的预处理

分别量取D101型大孔吸附树脂4份，每份均约为110±10ml，然后分别装于4根大小一致的直径为2cm的玻璃柱子中，用95%乙醇洗至洗脱液与水1：3混合不混浊为止，然后改用蒸馏水流至洗脱液基本上无醇味。

（3）样品液的上样洗脱

将正丁醇萃取得到的浸膏用1200ml蒸馏水溶解，超声，滤去沉淀，滤液均分为4份，每份为300ml，即制得上柱所需的4个样品。将4个样品分别缓缓上于已洗好的4根大孔树脂柱，然后均用200ml蒸馏水洗脱至几乎不发生三氯化铁反应和盐酸镁粉反应，然后4根柱子分别选用30%，40%，50%，60%乙醇中的其中一种单一洗脱至几乎不发生三氯化铁反应和盐酸镁粉反应。30%，40%，50%，60%乙醇洗脱的体积依次为1129ml，500ml，452ml，322ml。将30%，40%，50%，60%乙醇洗脱的溶液分别减压浓缩（50℃）至小体积，然后转移至小蒸发皿中（已于60℃减压干燥过夜），在60℃水浴上挥干，然后置于减压干燥箱中60℃减压干燥约10小时，然后置于干燥器中。精密称定各含浸膏的各蒸发皿中，取得各部位浸膏的重量。数据如下表所示：

表16  不同浓度制备的浸膏量

将各部位的浸膏用各自洗脱用的乙醇溶液定容于100ml容量瓶中，备用。按照对照品的显色方法和测定条件，照下表对各洗脱部位进行总黄酮含量测定：

表17  各洗脱部位进行总黄酮含量测定

结果表明：在不同柱上，用各自单一的乙醇浓度平行洗脱，30%浓度的乙醇洗脱下来的总黄酮含量最高，为52.52066%。

3.2.2结论

D101型大孔树脂富集后钟花报春花中总黄酮的纯度：经D101型大孔吸附树脂处理后的总黄酮得到了有效富集，总黄酮纯度最高可达52％。

以下通过试验例进一步证明本发明的有益效果。

试验例1药效试验

根据文献研究以及现有的资源，通过斑马鱼实验和鸡胚尿囊膜实验对分离得到的化合物进行药效学筛选，以初步确定药材某些功效的物质基础，也为含量测定的指标成分确定提供合理的依据。

1斑马鱼实验

斑马鱼（Danio rerio）为鲤科（Cyprinidae）短担尼鱼属（Danio）的一种硬骨鱼。其基因与人类基因的相似度高达85％，雌鱼一次可产卵200～300枚，其受精和胚胎发育过程均在体外进行，24小时内就可发育成形，且胚胎通体透明，便于观察体内器官组织的变化。诸多特点使其成为了是国际标准化组织认可的5种鱼类实验动物之一。目前，斑马鱼在人类疾病研究中得到广泛应用，用于心血管系统方面的研究尤为多。本实验主要通过斑马鱼平台筛选钟花报春花乙醇提取物及其总黄酮的抗肿瘤作用。

1.1实验样品及材料

实验样品：阳性对照  索菲替尼

ZHBC-1（5-羟基黄酮）

ZHBC-3（5,8-二羟基黄酮）

ZHBC-4（2'-羟基黄酮）

ZHBC-5（3’-羟基-黄酮-4’-O-β-D-吡喃葡萄糖苷）

ZHBC-6（2-苯基色原酮）

钟花报春花乙醇提取物（实施例1制备）

钟花报春花总黄酮（实施例2制备）

槲皮素

本发明实验样品中，ZHBC-1~ZHBC-6为发明人前期在钟花报春花中发现的化合物。

动物模型：初筛：24h WT斑马鱼胚胎

          复筛：24h WT斑马鱼胚胎

          第三次筛选：血管荧光（VEGFR2：GFP）转基因斑马鱼胚胎

1.2实验方法

施药时间：胚胎发育24h时(24hpf)

观察时间：胚胎发育48h时（48hpf）

观察方式：在倒置显微镜和荧光显微镜对斑马鱼胚胎体节间血管进行计数

1.3实验结果

实验结果见表18～20。

表18初步筛选实验

实验结果：钟花报春花乙醇提取物、钟花报春花总黄酮具有抑制节间血流的作用。

在上述试验的情况下，对ZHBC-1、钟花报春花乙醇提取、总黄酮、槲皮素进行进一步地活性测试，结果见表19、20。

表19WT斑马鱼实验结果

表20转基因斑马鱼实验结果

由上述结果可知，钟花报春花乙醇提取物组、钟花报春花总黄酮组有血流缺失的情况，表明钟花报春花乙醇提取物、钟花报春花总黄酮在20μg/ml和50μg/ml均表现出较强的抑制血管形成的作用。其中，在相同剂量下，钟花报春花总黄酮抑制血管新生的活性最强，显著优于其他受试药物；其次是钟花报春花乙醇提取物，其活性低于总黄酮，但在同等剂量下的活性与其他纯品化合物相当、甚至更好。

2鸡胚尿囊膜实验

新血管生成是肿瘤生长转移的基础，因此，抑制肿瘤生长、扩散的一个重要方法便是抑制肿瘤内血管的生长。鸡胚尿囊膜实验（CAM）基于此理论，通过研究尿囊膜上血管的生长情况来判断药物是否具有抗肿瘤活性。此法经济，简单，易操作，是抗肿瘤药物筛选的常用方法。

2.1实验样品及材料

实验样品：ZHBC-3（5,8-二羟基黄酮）

ZHBC-4（2'-羟基黄酮）

ZHBC-5（3’-羟基-黄酮-4’-O-β-D-吡喃葡萄糖苷）

ZHBC-6（2-苯基色原酮）

钟花报春花乙醇提取物（实施例1制备）

钟花报春花总黄酮（实施例2制备）

槲皮素

实验材料：种鸡蛋购自济南滋平家禽养殖有限公司；甲基纤维素片经过高压灭菌，备用；手术器具均常规灭菌待用。

3.2.2实验方法

操作条件为无菌状态。7日龄75只活胚蛋，随即分组为5组，每组15个，在照卵灯下寻找胚头中轴侧区域，划定1cm*1cm圆形开窗部位，用75%乙醇溶液消毒开窗部位，在鸡胚气室端钻孔2mm小孔并穿透壳膜。暴露出鸡胚尿囊膜，用移液枪将药品滴在甲基纤维素滤膜上，烘干后放置于尿囊膜上血管部位，4药物组分别为生理盐水20μg/个，加药完毕后用胶带密实封口，并继续放入38°C的孵箱内孵育72h。

新生血管数量计算：揭开透明胶带，加满4%多聚甲醛，室温下原位固定30min。待CAM上血管内的血液凝固后，揭去封窗的透明膜，剪除CAM水平以上的蛋壳，以滤膜载体为中心把CAM剪下，投入水中，使其舒展开，并将其在水中转移到载玻片上，自然干燥。拍照后用Photoshop选定照片上的一定面积(400×400像素)，计算3个面积内的平均血管数目计入统计。

3.2.3实验结果

实验样品处理鸡胚72小时后，5个实验组中可计入统计的数量分别为对照组6个、ZHBC-3（2个）、ZHBC-4（8个）、ZHBC-5（6个）、ZHBC-6（9个）、钟花报春花乙醇提取物（6个）、钟花报春花总黄酮（6个）、槲皮素（6个），见表21。

表21  鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成数目及抑制率的影响（x±s）

**p<0.01，*p<0.05

实验结果显示,对照组微孔滤膜周围CAM血管生长良好,呈树枝状、叶脉样、平行生长；而钟花报春花乙醇提取物、钟花报春花总黄酮具有良好的抑制血管生长趋势；其中，以钟花报春花总黄酮的活性最强，它在相同剂量下，其抑制血管新生活性明显优于其他受试药物；其次是钟花报春花乙醇提取物，药效活性低于总黄酮，但同等剂量下与其他纯品化合物活性相当、甚至更好。

综上所述，钟花报春花及其乙醇提取物和总黄酮，具有良好的血管形成抑制作用，可作为血管新生抑制剂，为临床癌症治疗用药提供了一种新的选择。同时，钟花报春花总黄酮、乙醇提取物的药效活性与钟花报春花内含有的单一化合物（如槲皮素、5-羟基黄酮）相当、甚至更好，因此，后期用药时无需再对单一化合物进行分离纯化，不仅节省了药物的生产成本，还提高了药材的利用率，有利于实现药物的工业化生产。

Claims (7)

1.钟花报春花提取物在制备抑制血管新生的药物中的用途；所述钟花报春花提取物为钟花报春花总黄酮，其中，黄酮的含量以芦丁计不得低于50%w/w；或者，钟花报春花提取物为钟花报春花乙醇提取物；

其中，所述钟花报春花总黄酮是通过如下方法制备的：

（1）取钟花报春花，以50-70%V/V乙醇提取，合并提取液备用；

（2）将步骤（1）中的提取液回收乙醇后，用正丁醇萃取，将正丁醇层回收正丁醇后，上大孔吸附树脂，先用水洗脱至不发生三氯化铁反应和盐酸镁粉反应，再用30%-40%的乙醇洗脱，收集洗脱液，回收溶剂后，干燥，即得钟花报春总黄酮；

所述钟花报春花乙醇提取物，是以钟花报春花为原料，采用50-70%V/V乙醇提取得到的提取物。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述药物是抑制肿瘤血管新生的药物。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述乙醇浓度为60%V/V。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述钟花报春花总黄酮中，黄酮的含量以芦丁计为50-60%w/w。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：步骤（1）中采用60%V/V乙醇提取；步骤（2）中选用30%V/V乙醇进行洗脱。

6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述大孔吸附树脂为D101型大孔吸附树脂。

7.根据权利要求1-6任意一项所述的用途，其特征在于：所述的钟花报春花为报春花科报春花属植物钟花报春Primula sikkimensis Hook的干燥花。