CN102549009A - 在玉蜀黍中功能性表达改组酵母硝酸盐转运蛋白(ynt1)以改善低硝酸盐环境下的硝酸盐吸收 - Google Patents

在玉蜀黍中功能性表达改组酵母硝酸盐转运蛋白(ynt1)以改善低硝酸盐环境下的硝酸盐吸收 Download PDF

Info

Publication number
CN102549009A
CN102549009A CN2010800370634A CN201080037063A CN102549009A CN 102549009 A CN102549009 A CN 102549009A CN 2010800370634 A CN2010800370634 A CN 2010800370634A CN 201080037063 A CN201080037063 A CN 201080037063A CN 102549009 A CN102549009 A CN 102549009A
Authority
CN
China
Prior art keywords
plant
polynucleotide
variant
polypeptide
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2010800370634A
Other languages
English (en)
Inventor
刘璐
H·吉昂
D·F·卢塞尔
王海音
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
EIDP Inc
Original Assignee
EI Du Pont de Nemours and Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by EI Du Pont de Nemours and Co filed Critical EI Du Pont de Nemours and Co
Publication of CN102549009A publication Critical patent/CN102549009A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0036—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供涉及改变植物中的NT活性、氮利用效率和/或吸收的方法和组合物。本发明涉及用于产生在低氮肥力下产量得到保持或增加的植物的方法。本发明提供分离的硝酸盐转运蛋白变体(NT变体)核酸及它们编码的蛋白质。本发明还提供重组表达盒、宿主细胞和转基因植物。用编码所述NT变体酶的核苷酸序列转化的植物显示出改善的性质，例如产量增加。

Description

在玉蜀黍中功能性表达改组酵母硝酸盐转运蛋白(YNT1)以改善低硝酸盐环境下的硝酸盐吸收
技术领域
本公开内容的领域主要涉及分子生物学。具体而言，本发明涉及用于改善植物中的氮利用效率和/或氮吸收的方法和组合物。
背景技术
硝酸盐是植物从土壤吸收的主要氮源。为满足食物、饲料、纤维和燃料的全球供应的需求，农民们往往施加过量的氮肥以增加作物如玉蜀黍的谷粒产量。为避免硝酸盐污染和减少耕作成本，需要能更有效地吸收/利用硝酸盐的植物特别是玉蜀黍(maize)，以保持粮食供应并保护我们的环境。
硝酸盐从土壤吸收至植物根细胞中，是一个逆着质膜的电化学势梯度的主动过程。硝酸盐一旦在根细胞中就会：1)被细胞质酶硝酸盐还原酶还原成亚硝酸盐，接着被叶绿体中的亚硝酸盐还原酶还原成氨，然后掺入到氨基酸中；2)被吸收和贮存在液泡中；3)被转运到木质部以供长距离运输到叶中；和4)被排出根细胞。硝酸盐移动的所有步骤都由硝酸盐转运蛋白来推动。
根据对硝酸盐的亲和力，硝酸盐转运蛋白可分成两类：低亲和力硝酸盐转运蛋白系统和高亲和力硝酸盐转运蛋白系统。低亲和力硝酸盐转运蛋白系统(LATS)在土壤硝酸盐浓度大于1mM时起作用，而高亲和力硝酸盐转运蛋白系统(HATS)在土壤硝酸盐浓度低于1mM时发挥主要作用。
根据硝酸盐转运蛋白的功能发挥是否需要硝酸盐转运蛋白相关蛋白，还可将高亲和力硝酸盐转运蛋白系统分成两组。单组分HATS含有具有典型的运载体类型的结构的蛋白质，该结构具有12个跨膜结构域，而双组分HATS则包括额外的具有2个跨膜结构域的小相关蛋白(Tong Y等人，Plant J.，(2005)41：442-450)。单组分HATS见于真菌和红藻，而双组分HATS据报道存在于绿藻和植物中。
植物硝酸盐转运蛋白的表达可以是组成型的或者由硝酸盐诱导。植物硝酸盐转运蛋白充当硝酸盐响应性信号传导途径的组分，而不依赖于硝酸盐吸收的根生长调节已被报道(Little等人，PNAS(2005)102：13693-13698)。改善植物的氮利用效率和硝酸盐吸收将是合乎需要的；然而，通过过表达烟草内源高亲和力硝酸盐转运蛋白来改善硝酸盐吸收的尝试却失败了(Fraisier等人，Plant J.，(2000)23：489-496)。
发明内容
如本文所述，来自安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)的硝酸盐转运蛋白(NT)的变体即YNT1当在拟南芥(Arabidopsis)和玉蜀黍植物体内表达时以及在体外测定法中，已显示参与氮吸收。本发明提供NT变体多核苷酸、经密码子优化的NT变体基因编码序列、相关的变体多肽以及本发明NT变体序列的所有保守修饰变体。
在另一方面，本发明涉及已用下面表3中所示置换中的一者或多者进行置换的NT变体多核苷酸、编码包含已用表2中所示置换中的一者或多者进行置换的氨基酸序列的多肽的多核苷酸、编码任何SEQ ID NO：4、6、8和10的多肽的多核苷酸；具有任何SEQ ID NO：3、5、7、9和11的序列的多核苷酸；在严格条件下与前述多核苷酸任一者杂交的长度上至少30个核苷酸的多核苷酸。在另一方面，本发明包括与任何SEQ ID NO：3、5、7、9和11的序列具有至少80％序列同一性的多核苷酸。
本文中在本发明的另一个方面中提供的是由于密码子的简并性而从本发明的NT变体任一者得到的分离的多核苷酸。在另一方面，分离的多核苷酸与本发明的NT变体中任一者的多核苷酸互补。在另一方面，本发明涉及编码可增加植物的氮利用效率、产量或NT活性的NT变体多肽的分离的多核苷酸。
在又一个方面，本发明涉及包含重组表达盒的转基因植物，该重组表达盒包含可操作地连接至任何本发明的分离多核苷酸的在植物中有功能的启动子。本发明还提供来自转基因植物的转基因种子。在另一个方面，本发明涉及转染了重组表达盒的宿主细胞，该重组表达盒包含可操作地连接至任何本发明的分离多核苷酸的在植物中有功能的启动子。
在进一步的方面，本发明涉及具有NT活性的分离的NT变体多肽。该NT变体多肽可具有已用至少一个下表2中所示氨基酸置换进行置换的氨基酸序列、与任何SEQ ID NO：4、6、8和10中所列氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；或由任何SEQ ID NO：3、5、7、9和11所列多核苷酸编码的多肽。在又一个方面，本发明涉及重组表达盒的转基因植物，所述表达盒包含可操作地连接至分离的多核苷酸的在植物中有功能的启动子，所述分离的多核苷酸编码具有与任何SEQ ID NO：4、6、8和10中所列氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列并且具有NT活性的多肽。本发明还提供来自转基因植物的转基因种子。在另一个方面，本发明涉及转染了重组表达盒的宿主细胞，该重组表达盒包含可操作地连接至任何编码本发明多肽的分离的多核苷酸的在植物中有功能的启动子。
在进一步的方面，本发明涉及调节NT变体蛋白在植物细胞中的水平的方法。在一个方面，本方法包括用可操作地连接至启动子的NT变体多核苷酸转化植物细胞。
该多核苷酸可以是有义或反义取向。本方法还包括表达该多核苷酸持续足以调节NT变体蛋白在植物细胞中的水平的时间量。
在另一方面，本发明提供了调节NT变体蛋白在植物中的活性的方法。该方法包括用可操作地连接至在植物细胞中有功能的启动子的有义或反义取向的NT变体多核苷酸稳定转化植物细胞。该方法包括使转化的植物细胞再生为转化植物，该转化植物以足以调节NT变体蛋白在植物中的活性的量表达NT变体多核苷酸。
在另一方面，本发明涉及增加植物的产量或植物的NUE或这二者的方法。在一个方面，该方法包括将包含编码本发明的NT变体的多核苷酸的构建体引入植物细胞中。可将该多核苷酸可操作地连接至在植物中有功能的启动子以产生转化的植物细胞。使转化的植物细胞再生成转基因植物。该NT变体在转基因植物的细胞中以足以增加NT活性的水平表达。在一个方面，该NT变体在转基因植物的细胞中以足以增加植物的产量或NUE的水平表达。
在另一个方面，本发明涉及编码玫瑰紫菜(Porphyra perforata)硝酸盐还原酶(PPNR)的多核苷酸，特别是编码其中氨基酸位置551处的丙氨酸已被甘氨酸置换的PPNR(A551G)和其中氨基酸位置551处的丙氨酸已被甘氨酸置换且氨基酸位置561处的丝氨酸已被天冬氨酸置换的PPNR(A551GS561D))的多核苷酸。这种硝酸盐还原酶(NR)多核苷酸包括但不限于经密码子优化的多核苷酸，例如经玉蜀黍密码子优化的编码PPNR A551G S561D的多核苷酸(其在本文中称为PPNR A551G S561D MO)。本发明的NR多核苷酸可单独地，或者与一条或多条本发明的NT变体多核苷酸堆叠(stacked)用于转化植物，并用于旨在改善植物中的NUE、硝酸盐吸收、氮同化、根生物量或者它们的组合方法中。
本发明还提供包含至少一条本发明的NT变体多核苷酸或NR多核苷酸的表达盒。在另一个方面，本发明涉及转染了重组表达盒的宿主细胞，所述重组表达盒包含可操作地连接至任何编码本发明多肽的分离的多核苷酸的在植物中有功能的启动子。还提供的是包含至少一个本发明表达盒的转化的植物、植物部分、植物细胞和种子。
由以下描述，本发明的其他目标、特征和优点及各方面对于技术人员将变得显而易见。但是，应理解，以下描述和具体实施例虽然指示了本发明的优选实施方案，不过仅以示例的方式给出。本领域技术人员阅读了以下描述和阅读了本公开内容的其他部分，各种落入本公开的发明的精神和范围内的变化形式和修改形式将会是显而易见的。
附图说明
由以下“具体实施方式”以及构成本申请的一部分的附图和序列表，将能更充分地理解本发明。
图1A-1D示出了YNT1开放阅读框和变体的核苷酸序列比较。
图2A-2B示出了YNT1和变体中的氨基酸序列比较。
图3为含有ZM-RM2:ADHI内含子：YNT1R3FS(PHP32101)的玉蜀黍转基因植物在常氮(NN)条件下的3个地点的田间产量试验结果的图示。在3个位置测试了八个事件，仅在1个位置测试了事件8。这里示出了相对于无效事件(null)的相对产量(％)。
图4为含有ZM-RM2:ADHI内含子：YNT1R3FS(PHP32101)的玉蜀黍转基因植物在低氮(LN)条件下的3个地点的田间产量试验结果的图示。在3个位置测试了八个事件，仅在1个位置测试了事件8。图中示出了相对于无效事件的相对产量(％)。
图5为归一化的测定条件下野生型(wt)NT和四种改组变体的硝酸盐吸收动力学比较的图示。在这个情况下，最一致的动力学参数为最大吸收速度。
图6A-6E示出了野生型玫瑰紫菜硝酸盐还原酶(PPNR)开放阅读框(SEQID NO：13)、玫瑰紫菜硝酸盐还原酶(PPNR)A551G开放阅读框(SEQ IDNO：12)和玫瑰紫菜硝酸盐还原酶(PPNR)A551G S561D MO开放阅读框(SEQID NO：16)的DNA序列比较。
图7A-7B示出了野生型玫瑰紫菜硝酸盐还原酶(PPNR)(SEQ IDNO：15)、玫瑰紫菜硝酸盐还原酶(PPNR)A551G(SEQ ID NO：14)和玫瑰紫菜硝酸盐还原酶(PPNR)A551G S561D MO(SEQ ID NO：17)的氨基酸序列比较。
序列简述
本申请提供了下面表1-3中所示的NT序列和NT变体等的细节。
表1：NT、NR、NT变体和NR变体序列的细节。
Figure BPA00001514709400051
表2：NT变体中的氨基酸置换。
(相对于NT YNT1野生型序列SEQ ID NO：2进行编号)
Figure BPA00001514709400062
表3.NT变体中的核苷酸置换。
(相对于NT YNT1野生型序列SEQ ID NO：1进行编号)
Figure BPA00001514709400063
Figure BPA00001514709400071
具体实施方式
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。除非另外提出，否则本文所采用或所考虑的技术是本领域普通技术人员所熟知的标准方法。材料、方法和实例仅为示例性的而不是限制性的。如下内容以举例说明的方式给出而无意于限制本发明的范围。
下文将参考附图更完整地描述本发明，其中示出了本发明的一些但并非全部实施方案。确实，这些发明可以以许多不同的形式来体现，不应被认为局限于本文给出的实施方案；而是，提供这些实施方案是为了使本公开内容能满足适用的法律要求。类似的编号在全文中是指类似的要素。
借助前面的描述和随附的附图中给出的教导，本发明所属领域的技术人员将会想到本发明的许多修改形式和其他实施方案。因此，应当了解，本发明不限于所公开的特定实施方案，并旨在将修改形式和其他实施方案包括在所附权利要求的范围内。虽然本文采用了特定术语，但它们仅以一般性和描述性含义使用而不出于限制目的。
除非另外指明，否则本发明的实施将采用植物学、微生物学、组织培养、分子生物学、化学、生物化学和重组DNA技术的常规技术，这些技术处于本领域技能范围内。这类技术在文献中有完全的解释。参见例如Langenheim和Thimann，(1982)Botany：Plant Biology and Its Relation toHuman Affairs，John Wiley；Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants，第1卷，Vasil(编辑)(1984)；Stanier等人，(1986) The Microbial World，第5版，Prentice-Hall；Dhringra和Sinclair，(1985)Basic Plant PathologyMethods，CRC Press；Maniatis等人，(1982)Molecular Cloning：A LaboratoryManual；DNA Cloning，第I和II卷，Glover(编辑)(1985)；OligonucleotideSynthesis，Gait(编辑)(1984)；Nucleic Acid Hybridization，Hames和Higgins(编辑)(1984)；以及Methods in Enzymology系列，Colowick和Kaplan(编辑)，Academic Press，Inc.，San Diego，CA。
定义
单位、前缀和符号可以以其国际单位制(SI)接受的形式表示。除非另外指明，否则分别地，核酸以5′至3′取向从左向右书写；氨基酸序列以氨基向羧基取向从左向右书写。数值范围包括限定该范围的数字。氨基酸在本文中可通过它们通常知道的三字母符号表示或通过IUPAC-IUB生化命名委员会(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母符号表示。同样，核苷酸可通过它们通常接受的单字母密码表示。下面定义的术语通过参考本说明书整体进行更完整的定义。
在描述本发明时，将采用下面的术语，并且旨在如下文所指出的进行定义。
所谓“微生物”意指任何微生物(包括真核微生物和原核微生物)，如真菌、酵母、细菌、放线菌、藻类和原生动物以及其他单细胞结构。
所谓“扩增”意指构建核酸序列的多个拷贝或与该核酸序列互补的多个拷贝，该构建是利用所述核酸序列中的至少一者作为模板进行。扩增系统包括聚合酶链反应(PCR)系统、连接酶链反应(LCR)系统、基于核酸序列的扩增(NASBA，Cangene，Mississauga，Ontario)、Q-β复制酶系统、基于转录的扩增系统(TAS)和链置换扩增(SDA)。参见例如Diagnostic MolecularMicrobiology：Principles and Applications，Persing等人(编辑)，AmericanSociety for Microbiology，Washington，DC(1993)。扩增的产物称为扩增子。
术语“保守修饰的变体”同时适用于氨基酸序列和核酸序列二者。就特定核酸序列而言，保守修饰的变体指编码氨基酸序列的相同的或保守修饰的变体的那些核酸。由于遗传密码的简并性，大量功能上相同的核酸编码任何给定蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU全部编码丙氨酸这种氨基酸。因而，在每个由密码子规定丙氨酸的位置，可将该密码子变更为所描述的相应密码子中的任一种而不会改变所编码的多肽。这种核酸变异为“沉默变异”，代表保守修饰变异的一种。本文中编码多肽的每种核酸序列还描述了该核酸的每种可能的沉默变异。普通技术人员将认识到，可修饰核酸中的每种密码子(AUG除外，其通常为甲硫氨酸的唯一密码子；一个例外是红色微球菌(Micrococcus rubens)，对于其来说GTG是甲硫氨酸密码子(Ishizuka等人，(1993) J.Gen.Microbiol.139：425-32)以产生功能上相同的分子。因此，编码本发明多肽的核酸的每种沉默变异均隐含在每种所描述的多肽序列中并以引用的方式并入本文。
至于氨基酸序列，技术人员会认识到，对核酸、肽、多肽或蛋白序列的各个单独置换、缺失或添加(其使被编码的序列中的单个氨基酸或一小部分氨基酸变更、添加或缺失)在该变更导致氨基酸被化学上相似的氨基酸置换时，为“保守修饰变体”。因而，还可变更选自1至15的整数的任何数目的氨基酸残基。因而，例如，可作出1、2、3、4、5、7或10个变更。
保守修饰的变体通常提供与它们所源自的未经修饰的多肽序列类似的生物活性。例如，底物特异性、酶活性或配体/受体结合通常为天然蛋白质对于其天然底物的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，优选60-90％。提供功能上相似的氨基酸的保守置换表是本领域所熟知的。
下面的六个组各含有对彼此而言是保守置换的氨基酸：
1)  丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
还可参见Creighton，Proteins，W.H.Freeman and Co.(1984)。
本文所用的“基本上由......组成”意指在如下情况下目标多核苷酸可包括额外的序列：该额外的序列在严格杂交条件下不会选择性地杂交至与该多核苷酸所杂交的cDNA相同的cDNA，且该杂交条件包括在0.1X SSC和0.1％十二烷基硫酸钠中在65℃下进行的洗涤步骤。
就指定的核酸而言，所谓“编码”意指包含翻译成指定蛋白质的信息。编码蛋白质的核酸可在该核酸的翻译区内包含非翻译序列(例如内含子)，或可缺少这种居间的非翻译序列(例如，如在cDNA中)。据以编码蛋白质的信息是通过使用密码子来确定的。通常，氨基酸序列由核酸利用“通用”遗传密码来编码。然而，可使用如在某些植物、动物和真菌线粒体、细菌山羊支原体(Mycoplasma capricolum)(Yamao等人，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：2306-9)或纤毛虫大核中存在的通用密码的变体，当用这些生物体表达该核酸时。如本文提到的，当用合成法制备或变更该核酸时，可利用要表达该核酸的预定宿主的已知的密码子偏好性。例如，宿主细胞包括但不限于玉蜀黍、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、番茄和稷的细胞。尽管本发明的核酸序列在单子叶植物物种和双子叶植物物种中都可表达，但可对序列进行修饰以考虑单子叶植物或双子叶植物的特定密码子偏好性和GC含量偏好性，因为这些偏好性已被证实不同(Murray等人，(1989)Nucleic Acids Res.17：477-98，将其以引用的方式并入本文)。因而，具体氨基酸的玉蜀黍优选密码子可由来自玉蜀黍的已知基因序列得出。关于来自玉蜀黍植物的28种基因的玉蜀黍密码子使用在Murray等人(出处同上)的表4中列出。
如本文所用，指涉核酸的“异源”为起源于外来物种的核酸，或者，如果起源于相同物种的话，则为通过蓄意的人为干预对其天然形式在组成和/或基因座方面进行实质性修饰的核酸。例如，可操作地连接至异源结构基因的启动子是来自不同于衍生该结构基因的物种的物种，或者如果是来自相同的物种，则对一者或二者对其初始形式进行了实质性的修饰。异源蛋白质可起源于外来物种，或者，如果起源于相同物种，则通过蓄意的人为干预对其天然形式进行了实质修饰。
所谓“宿主细胞”意指包含本发明的异源核酸序列、含有载体并能支持该表达载体的复制和/或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌，或者真核细胞如酵母、昆虫、植物、两栖动物或哺乳动物细胞。优选地，宿主细胞是单子叶植物或双子叶植物细胞，包括但不限于玉蜀黍、高粱、向日葵、大豆、小麦、苜蓿、水稻、棉花、卡诺拉油菜、大麦、稷和番茄。特别优选的单子叶宿主细胞是玉蜀黍宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是非人宿主细胞。
术语“杂交复合体”包括指由两条相互选择性杂交的单链核酸序列形成的双链核酸结构。
在将核酸插入细胞的语境中，术语“引入”意指“转染”或“转化”或“转导”，包括指核酸掺入进真核或原核细胞中，其中该核酸可掺入进细胞的基因组(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中，转化成自主复制子或瞬时表达(例如，转染的mRNA)。
术语“分离的”指诸如核酸或蛋白质之类的物质，该物质实质上或基本上不含在其天然存在的环境中发现的通常与其相伴随或与其相互作用的组分。分离的物质任选包含未发现在其天然环境中与其一起的物质。本文所定义的“分离的”核酸也称为“异源”核酸。除非另有规定，否则术语“NT核酸”意指包含编码完全长度或部分长度NT多肽的多核苷酸(“NT多核苷酸”)的核酸。除非另有规定，否则术语“NT变体核酸”意指包含编码完全长度或部分长度NT变体多肽的多核苷酸(“NT变体多核苷酸”)的核酸。术语“NT多肽”指一条或多条氨基酸序列。该术语还包括其片段、变体、同源物、等位基因或前体(例如原前蛋白或前蛋白)。“NT蛋白”包含NT多肽。术语“NT变体多肽”指一条或多条氨基酸序列。“NT变体蛋白”包含NT变体多肽。该术语还包括其片段、变体、同源物、等位基因或前体(例如原前蛋白或前蛋白)。
如本文所用，“核酸”包括指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另外限制，否则涵盖在以下方面具有天然核苷酸的基本性质的已知类似物：其以与天然存在的核苷酸(例如肽核酸)相似的方式杂交至单链核酸。
所谓“核酸文库”意指分离的DNA或RNA分子的集合，其包含且实质上代表指定生物体的基因组的整个被转录的部分。示例性的核酸文库(如基因组文库和cDNA文库)的构建在例如如下的标准分子生物学参考文献中有教导：Berger和Kimmel，(1987)Guide To Molecular CloningTechniques，Methods in Enzymology系列，第152卷，Academic Press，Inc.，San Diego，CA；Sambrook等人，(1989)Molecular Cloning：A LaboratoryManual，第2版，第1-3卷；和Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等人(编辑)，Current Protocols，a joint venture between GreenePublishing Associates，Inc.and John Wiley & Sons，Inc.(1994年增补本)。
本文所用的“可操作地连接”包括指第一序列(如启动子)和第二序列之间的功能连接，其中该启动子序列引发和介导对应于该第二序列的DNA的转录。一般来讲，可操作地连接意指被连接的核酸序列是连续的，并且如果有必要连接两个蛋白质编码区的话，是连续的且在相同的阅读框内。
如本文所用，术语“植物”包括指整个植株、植物器官(例如叶、茎、根等)、种子和植物细胞和它们的子代。本文所用的植物细胞包括但不限于种子、悬浮培养物、胚、分生组织区、愈伤组织、叶、根、苗、配子体、孢子体、花粉和小孢子。可用于本发明方法的植物类型通常与适用于转化技术的高等植物类型一样宽泛，包括单子叶植物和双子叶植物，包括来自如下属的种：南瓜属(Cucurbita)、玫瑰属(Rosa)、葡萄属(Vitis)、胡桃属(Juglans)、草莓属(Fragaria)、百脉根属(Lotus)、苜蓿属(Medicago)、驴食草属(Onobrychis)、三叶草属(Trifolium)、胡芦巴属(Trigonella)、豇豆属(Vigna)、柑桔属(Citrus)、亚麻属(Linum)、老鹳草属(Geranium)、木薯属(Manihot)、胡罗卜属(Daucus)、拟南芥属(Arabidopsis)、芸苔属(Brassica)、萝卡属(Raphanus)、白芥属(Sinapis)、颠茄属(Atropa)、辣椒属(Capsicum)、曼陀罗属(Datura)、天仙子属(Hyoscyamus)、番茄属(Lycopersicon)、烟草属(Nicotiana)、茄属(Solanum)、碧冬茄属(Petunia)、毛地黄属(Digitalis)、Majorana、菊苣属(Ciahorium)、向日葵属(Helianthus)、莴苣属(Lactuca)、雀麦属(Bromus)、天门冬属(Asparagus)、金鱼草属(Antirrhinum)、萱草属(Heterocallis)、Nemesis、天竺葵属(Pelargonium)、黍属(Panieum)、狼尾草属(Pennisetum)、毛茛属(Ranunculus)、千里光属(Senecio)、蛾蝶花属(Salpiglossis)、黄瓜属(Cucumis)、布洛华丽属(Browaalia)、大豆属(Glycine)、豌豆属(Pisum)、菜豆属(Phaseolus)、黑麦草属(Lolium)、稻属(Oryza)、燕麦属(Avena)、大麦属(Hordeum)，、黑麦属(Secale)、葱属(Allium)和小麦属(Triticum)。本发明的植物包括但不限于水稻、小麦、花生、甘蔗、高粱、玉米、棉花、大豆、蔬菜、观赏植物、针叶树、苜蓿、菠菜、烟草、番茄、马铃薯、向日葵、卡诺拉油菜、大麦或稷、芸苔属物种(Brassicasp.)、红花、甘薯、木薯、咖啡、椰子、菠萝、柑橘树、可可、茶、香蕉、棕榈、鳄梨、无花果、番石榴、芒果、橄榄、番木瓜、腰果、澳大利亚坚果、杏树、糖用甜菜、甘蔗、荞麦、黑小麦、斯佩耳特小麦、亚麻子、甘蔗、油籽油菜、卡诺拉油菜、水芹、拟南芥、卷心菜、大豆、豌豆、菜豆、茄子、铃状椒、万寿菊、莴苣、金盏草、甜瓜、南瓜和夏南瓜或燕麦植物。特别优选的植物是玉米(Zea mays)。
本文所用的“产量”可包括指收获时每英亩谷类作物的蒲式耳数目(针对谷粒水分进行了调整，例如玉蜀黍的水分通常为15％)，和指所产生的生物量的体积(对于草料作物如苜蓿而言，以及复种作物的植株根大小)。谷粒水分是在收获时的谷粒中测量。谷粒的经调整的测试重量确定为针对收获时的谷粒水分水平进行了调整的重量，单位为磅/蒲式耳。生物量被测量为所产生的可收获植物材料的重量。
本文所用的“多核苷酸”包括指具有天然核苷酸的必要性质的脱氧核糖多核苷酸、核糖多核苷酸或其类似物，它们具有该必要性质是因为它们能在严格杂交条件下杂交至与天然核苷酸所杂交的核苷酸序列实质上相同的核苷酸序列，和/或容许翻译成与天然核苷酸所翻译成的氨基酸相同的氨基酸。多核苷酸可以是天然或异源结构基因或调控基因的全长序列或其子序列。除非另外指明，否则该术语包括指指定的序列及其互补序列。因而，为了稳定性或为了其他原因对主链进行了修饰的DNA或RNA是如该术语在本文所意指的“多核苷酸”。此外，包含稀有碱基(如肌苷)或修饰碱基(如三苯甲基化的碱基)(仅举两个实例)的DNA或RNA是多核苷酸(如该术语在本文所用的)。应当理解，已对DNA和RNA进行了很多种修饰，这些修饰起到本领域技术人员已知的许多有用目的。本文所用的术语多核苷酸涵盖多核苷酸的这类经化学修饰、酶修饰或代谢修饰的形式，以及病毒和细胞(包括特别是简单细胞和复杂细胞)特征性的DNA和RNA的化学形式。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基为相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。
本文所用的“启动子”包括指DNA的在转录起始的上游并涉及RNA聚合酶和其他蛋白质的识别和结合以起始转录的区域。“植物启动子”是能够引发在植物细胞中的转录的启动子。示例性的植物启动子包括但不限于从植物、植物病毒和包含在植物细胞中表达的基因的细菌(如农杆菌属(Agrobacterium)或根瘤菌属(Rhizobium))获得的那些启动子。例如，在某些组织如叶、根、种子、纤维、木质部导管、管胞或厚壁组织中优先启动转录的启动子。这种启动子称为“组织偏好的”。“细胞类型”特异性的启动子主要驱动在一种或多种器官中的某些细胞类型(例如根或叶中的维管细胞)中的表达。“诱导型”或“调控型”启动子是处于环境控制下的启动子。可实现通过诱导型启动子进行的转录的环境条件的实例包括无氧条件或光的存在。另一类型的启动子是发育调节启动子，例如在花粉发育过程中驱动表达的启动子。组织偏好的启动子、细胞类型特异性启动子、发育上调节的启动子和诱导型启动子构成“非组成型”启动子类别。“组成型”启动子是在大多数环境条件下都有活性的启动子，例如泛素基因启动子Ub1(GenBank登录号S94464)。
如本文所用，“重组的”包括指已通过引入异源核酸进行修饰的细胞或载体，或者源于经这样修饰过的细胞的细胞。因此，例如，重组细胞可由于蓄意人为干预而表达不以同样形式存在于天然(非重组)形式的该细胞内的基因或者表达原本被异常表达、低表达或不被表达的自然基因；或者可具有减低了的或消除了的天然基因表达。本文所用的术语“重组的”不涵盖通过天然发生的事件(例如自发突变、天然转化/转导/转座)进行的细胞或载体的变更，所述事件为例如在没有蓄意人为干预的情况下发生的那些。
本文所用的“重组多核苷酸”是通过重组DNA技术(例如本文所公开的改组的多核苷酸)产生的多核苷酸。“重组多肽”是由重组多核苷酸编码的多肽。优选地，本发明的重组多核苷酸不具有与天然多核苷酸相同的核苷酸序列。优选地，本发明的多肽不具有与天然多肽相同的氨基酸序列。
本文所用的“重组表达盒”是具有一系列规定核酸元件的通过重组法或合成法产生的核酸构建体，其允许特定核酸在靶细胞中转录。重组表达盒可掺入质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。通常，表达载体的重组表达盒部分包括待转录的核酸和启动子等序列。
术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”在本文中可互换使用，指被掺入蛋白质、多肽或肽(统称“蛋白质”)中的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，除非另外进行限制，否则可涵盖可以以与天然存在的氨基酸类似的方式发挥功能的天然氨基酸的已知类似物。
术语“选择性杂交”包括指在严格杂交条件下核酸序列与指定的核酸靶序列杂交的程度比其与非靶序列杂交的程度可检测地更高(例如，至少2倍于背景)，并且基本上排除非靶核酸。选择性杂交序列通常相互间具有至少40％序列同一性，优选60-90％序列同一性，最优选100％序列同一性(即互补性)。
术语“严格条件”或“严格杂交条件”包括指探针与其靶序列杂交的程度将比它与其他序列杂交的程度可检测地更高(例如，至少2倍于背景)的条件。严格条件是序列依赖性的，在不同的环境中将会不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可鉴别与探针可最高达100％互补的靶序列(同源探测)。或者，可调节严格性条件以允许序列中有一些错配，以使得检测到较低程度的相似性(异源探测)。优选地，探针长为大约500个核苷酸，但长度可变化很大，从小于500个核苷酸到等于靶序列的整个长度。
通常，严格条件将为其中盐浓度低于约1.5M钠离子，通常为约0.01至1.0M钠离子浓度(或其他盐)，pH为7.0至8.3，对短探针(例如，10至50个核苷酸)而言温度为至少30℃，对长探针(例如超过50个核苷酸)而言温度为至少约60℃的那些条件。严格条件还可通过添加去稳定剂如甲酰胺或Denhardt’s来实现。示例性的低严格性条件包括在37℃下用30至35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液进行杂交，并在50至55℃下在1X至2X SSC(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中洗涤。示例性的中等严格性条件包括在40至45％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中在37℃下杂交和在0.5X至1X SSC中在55-60℃下洗涤。示例性的高严格性条件包括在50％甲酰胺、1M NaCl、1％ SDS中在37℃下杂交和在0.1X SSC中在60至65℃下洗涤。特异性通常决定于杂交后的洗涤，关键因素为最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交体，可根据Meinkoth和Wahl，(1984)Anal.Biochem.，138：267-84的公式估计Tm：Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L，其中M为单价阳离子的摩尔浓度，％GC为DNA中鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸的百分数，％form为杂交溶液中甲酰胺的百分数，L为杂交体的长度(单位为碱基对)。Tm为50％的互补靶序列杂交至完全匹配的探针时的温度。每1％错配，Tm减少约1℃，因而，可调节Tm、杂交和/或洗涤条件以杂交至所需同一性的序列。例如，如果寻求具有≥90％同一性的序列，则可将Tm降低10℃。通常，将严格条件选择为比特定序列及其互补序列在确定的离子强度和pH下的热解链温度(Tm)低约5℃。然而，极严格条件可采用在低于热解链温度(Tm)1、2、3或4℃下杂交和/或洗涤；中等严格条件可采用在低于热解链温度(Tm)6、7、8、9或10℃下杂交和/或洗涤；低严格条件可采用在低于热解链温度(Tm)11、12、13或14、15或20℃下杂交和/或洗涤。利用该公式，杂交和洗涤组成以及所需的Tm，普通技术人员将认识到，杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化固有地得到了描述。如果所需的错配程度导致Tm低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则优选增加SSC浓度以使得可使用较高的温度。有关核酸的杂交的详尽指南见于以下文献：Tijssen，Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridizationwith Nucleic Acid Probes，第I部分，第2章，“Overview of principles ofhybridization and the strategy of nucleic acid probe assays，”Elsevier，New York(1993)；和Current Protocols in Molecular Biology，第2章，Ausubel等人(编辑)，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York(1995)。除非另有规定，否则在本申请中，高严格性定义为在4X SSC、5X Denhardt′s(5g Ficoll，5g聚乙烯吡咯烷酮，5g牛血清白蛋白于500ml水中)、0.1mg/ml煮沸的鲑精DNA和25mM磷酸钠中在65℃下杂交，和在0.1XSSC、0.1％SDS中在65℃下洗涤。
如本文所用，“转基因植物”包括指在其基因组内包含异源多核苷酸的植物。一般来讲，异源多核苷酸稳定地整合在基因组内使得该多核苷酸得以传递到连续世代。异源多核苷酸可单独整合进基因组中，或者作为重组表达盒的一部分整合进基因组中。“转基因”在本文中用来包括任何其基因型已因异源核酸的存在而被变更的细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括那些最初如此变更的转基因以及那些通过从最初的转基因进行有性杂交或无性繁殖而产生的转基因在内。本文所用的术语“转基因”不涵盖通过常规植物育种方法或通过自然发生的事件(如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变)进行的基因组(染色体或染色体外)变更。
如本文所用，“载体”包括指用于转染宿主细胞并可在其中插入多核苷酸的核酸。载体常常是复制子。表达载体容许插入其中的核酸的转录。
以下术语用来描述两个或多个核酸或多核苷酸或多肽之间的序列关系：(a)“参考序列”、(b)“比较窗口”、(c)“序列同一性”、(d)“序列同一性的百分数”和(e)“实质同一性”。
本文所用的“参考序列”是用作序列比较基准的确定的序列。参考序列可以是指定序列的子集或全体；例如，作为全长cDNA或基因序列的区段，或者完全的cDNA或基因序列。
如本文所用，“比较窗口”意指包括指多核苷酸序列的连续和指定的区段，其中该比较窗口中的该多核苷酸序列相比于参考序列(不包含添加或缺失)可包含添加或缺失(即空位)，以便两个多核苷酸的最佳比对。通常，比较窗口长度为至少20个连续的核苷酸，任选可为30、40、50、100个或更长。本领域技术人员认识到，为避免由于在多核苷酸序列中加入空位所致的与参考序列的高度相似性，通常引入空位罚分并从匹配数扣除空位罚分。
将核苷酸和氨基酸序列进行比对以作比较的方法是本领域公知的。Smith和Waterman，(1981)Adv.Appl.Math 2：482的局部同源算法(BESTFIT)可对用于比较的序列进行最佳比对；通过Needleman和Wunsch，(1970)J.Mol.Biol.48：443-53的同源比对算法(GAP)；通过Pearson和Lipman，(1988)Proc.Natl.Acad. Sci.USA 85：2444的相似性搜索算法(Tfasta和Fasta)；通过这些算法的计算机化执行，包括但不限于：Intelligenetics(Mountain View，California)的PC/Gene程序中的CLUSTAL、Wisconsin Genetics软件包，第8版(可得自Genetics Computer Group(程序(Accelrys，Inc.，San Diego，CA))中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。如下文献详细描述了LUSTAL程序：Higgins和Sharp，(1988)Gene 73：237-44；Higgins和Sharp，(1989)CABIOS 5：151-3；Corpet等人，(1988)Nucleic Acids Res.16：10881-90；Huang等人，(1992)Computer Applications in the Biosciences8：155-65以及Pearson等人，(1994)Meth.Mol.Biol.24：307-31。用于多序列的最佳全局比对的优选程序是PileUp(Feng和Doolittle，(1987)J.Mol.Evol.，25：351-60，其类似于Higgins和Sharp，(1989)CABIOS 5：151-53描述的方法，将文献以引用的方式将其并本文)。可用于数据库相似性搜索的BLAST家族程序包括：BLASTN，用于核苷酸查询序列针对核苷酸数据库序列进行查询；BLASTX，用于核苷酸查询序列针对蛋白质数据库序列进行查询；BLASTP，用于蛋白质查询序列针对蛋白质数据库序列进行查询；TBLASTN，用于蛋白质查询序列针对核苷酸数据库序列进行查询；以及TBLASTX，用于核苷酸查询序列针对核苷酸数据库序列进行查询。参见Current Protocols in Molecular Biology，第19章，Ausubel等人(编辑)，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York(1995)。
GAP利用Needleman和Wunsch(出处同上)的算法来寻找两个完整序列的比对，该比对使匹配数最大而使空位数最小。GAP会考虑所有可能的比对和空位位置，并产生具有最大数目的匹配碱基和最少的空位的比对。其允许提供以匹配碱基数为单位的空位产生罚分和空位延伸罚分。GAP对于其插入的每个空位，都必须利用匹配的空位产生罚分数。如果选择大于零的空位延伸罚分，GAP对于每个插入的空位必须另外利用空位长度乘以空位延伸罚分。Wisconsin Genetics软件包第10版中的默认空位产生罚分值和空位延伸罚分值分别为8和2。空位产生和空位延伸罚分可以以选自0-100的整数来表示。因而，例如，空位产生和空位延伸罚分可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或更大。
GAP给出具有最好的比对的家族中的一个成员。这个家族可能存在许多成员，但其他成员没有更好的品质。GAP显示关于比对的四个品质因素：品质(quanlity)、比率(ratio)、同一性(identity)和相似性(similarity)。品质是为了比对序列而被最大化的指标(metric)。比率是品质除以较短区段中的碱基数。同一性百分数是实际匹配的符号的百分数。相似性百分数是相似的符号的百分数。将对应于空位的符号忽略。当一对符号的打分矩阵值大于或等于0.50(相似性阈值)时，对相似性打分。Wisconsin Genetics软件包第10版中所用的打分矩阵为BLOSUM62(参见Henikoff和Henikoff，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)。
除非另外指明，否则本文所提供的序列同一性/相似性值指用BLAST2.0程序包，采用默认参数获得的值(Altschul等人，(1997)Nucleic AcidsRes.25：3389-402)。
如本领域普通技术人员将会理解的，BLAST搜索假定蛋白质可以随机序列建模。然而，许多真实蛋白质包含非随机序列区，该非随机序列可为同聚段、短周期重复或富含一种或多种氨基酸的区域。这种低复杂性区域可在不相关的蛋白质之间比对，尽管该蛋白质的其他区域完全不相似。可采用多种低复杂性过滤程序来减少这种低复杂性比对。例如，可单独使用或联合使用SEG(Wooten和Federhen，(1993)Comput.Chem.17：149-63)和XNU(Claverie和States，(1993)Comput.Chem.17：191-201)低复杂性过滤程序。
在两条多核苷酸或多肽序列的情形中，本文所用的“序列同一性”或“同一性”是指当在指定的比较窗口上进行比对以获得最大对应时两个序列中相同的残基。当序列同一性百分数针对蛋白质使用时，应认识到，不相同的残基位置往往差别在于保守氨基酸置换，其中氨基酸残基被其他具有相似的化学性质(例如电荷或疏水性)的氨基酸残基置换，因此不会改变分子的功能性质。如果序列差别在于保守置换，则可上调百分数序列同一性以校正置换的保守性质。差别在于这种保守置换的序列被说成具有“序列相似性”或“相似性”。作出这个调整的方法是本领域技术人员所熟知的。通常，这涉及将保守置换打分为部分错配而不是完全错配，从而提高序列同一性百分数。因而，例如，如果相同的氨基酸给予1分，非保守置换给予0分，则保守置换给予0至1之间的分数。例如，根据Meyers和Miller，(1988)Computer Applic.Biol.Sci.4：11-17的算法计算保守置换的分数，例如如在程序PC/GENE(Intelligenetics，Mountain View，California，USA)中所实现的。
本文所用的“序列同一性百分数”意指通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列所确定的数值，其中多核苷酸序列在比较窗口中的部分与参考序列(不包含添加或缺失)相比包含添加或缺失(即空位)，以便两个序列的最佳比对。该百分数是这样计算的：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较窗口中的位置的总数目，然后将结果乘以100以得到序列同一性百分数。
术语多核苷酸序列的“实质同一性”意指包含这样的序列的多核苷酸，该序列与参考序列相比具有50-100％序列同一性，优选至少50％序列同一性，优选至少60％序列同一性，优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％，所述数值是使用所描述的比对程序中的一种并采用标准参数获得的。技术人员将会认识到，可通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等等适当调整这些值以确定两个核苷酸序列所编码的蛋白质的相应同一性。出于这些目的，氨基酸序列的实质同一性通常意指55-100％之间，优选至少55％，优选至少60％，更优选至少70％、80％、90％，最优选至少95％的序列同一性。
核苷酸序列实质上相同的另一指示是两个分子在严格条件下是否彼此杂交。遗传密码的简并性允许许多氨基酸置换，这种氨基酸置换在编码相同氨基酸的核苷酸序列中导致多样化，因而有可能该DNA序列可编码相同多肽但在严格条件下不彼此杂交。例如，当利用遗传密码所允许的最大密码子简并性产生一个核酸拷贝时，这可能会发生。两条核酸序列是实质上相同的一个指示是，第一核酸编码的多肽与第二核酸所编码的多肽发生免疫交叉反应。
“受试植物或植物细胞”是其中已针对所关注基因进行了遗传变更(如转化)的植物或植物细胞，或者是从经如此变更的植物或细胞遗传下来并包含该变更的植物或植物细胞。“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供测量受试植物或植物细胞的表型变化的参考点。
“对照植物或植物细胞”可包括例如：(a)野生型植物或细胞，即其基因型与用于进行导致产生该受试植物或细胞的遗传变更的起始材料相同的野生型植物或细胞；(b)其基因型与该起始材料相同但已用无效构建体(即用已知对所关注性状没有作用的构建体(如包含标志基因的构建体)进行了转化的植物或植物细胞；(c)为受试植物或植物细胞的子代当中的非转化分离子的植物或植物细胞；(d)在遗传上与该受试植物或植物细胞相同但不被暴露于会引发所关注基因表达的条件或刺激的植物或植物细胞；或者(e)处于所关注基因不被表达的条件下的该受试植物或植物细胞本身。
在肽的情形中，术语“实质相同”指肽包含在指定比较窗口上与参考序列具有55-100％之间的序列同一性；优选与参考序列具有至少55％的序列同一性，优选60％，优选70％，更优选80％，最优选至少90％或95％的序列同一性。优选地，利用Needleman和Wunsch(出处同上)的同源比对算法进行最佳比对。两条肽序列是实质上相同的指示是，一种肽可与针对第二种肽产生的抗体发生免疫反应。因而，例如，如果某种肽与第二种肽差别仅在于保守置换的话，则这两种肽实质上相同。此外，当某种肽与第二种肽差别在于非保守变化时，如果抗体识别的表位实质上相同，则它们实质上相同。“实质上相似的”肽共有如上所述的序列，例外的是不相同的残基位置差别可在于保守氨基酸变化。
“变体”旨在包括实质上相似的序列。对于多核苷酸，变体包含亲本多核苷酸(例如来自真菌或植物的天然多核苷酸)内的一个或多个位点处的一个或多个核苷酸的缺失和/或添加，可能经过密码子优化的，和/或亲本多核苷酸中的一个或多个位点处的一个或多个核苷酸的置换。本文所用的“天然”多核苷酸或多肽分别包含天然的核苷酸序列或氨基酸序列。对于多核苷酸，保守变体包括那些这样的序列，其由于遗传密码的简并性而编码本发明的NT变体多肽中的一者的氨基酸序列。诸如这些的天然存在的变体可用公知的分子生物学技术进行鉴定，例如用下文所述的聚合酶链反应(PCR)和杂交技术来鉴定。变体多核苷酸还包括合成法获得的多核苷酸，如那些例如通过使用定点诱变产生但仍编码本发明中采用的NT变体蛋白的多核苷酸。通常，本发明的特定多核苷酸的变体将与特定的参考多核苷酸(例如天然NT多核苷酸或模板NT多核苷酸)具有至少约50％、55％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性，这通过本文别处描述的序列比对程序和参数进行测定。因此，设想到与SEQ ID NO：3、5、7、9或11具有50％、55％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的NT变体多核苷酸。
本发明中采用的特定多核苷酸(即参考或亲本多核苷酸)的变体，还可通过比较由变体多核苷酸编码的多肽与由该参考或亲本多核苷酸编码的多肽之间的序列同一性来进行评估。因此，例如，设想到编码与SEQ ID NO：2、4、6、8或10的多肽中的任何一者具有给定序列同一性百分数的多肽的分离的多核苷酸。任何两个多肽之间的序列同一性百分数，可用本文别处描述的序列比对程序和参数来计算。在任何给定的本发明多核苷酸对是通过比较它们编码的两个多肽所共享序列同一性百分数进行评估的情况中，两个被编码的多肽之间的序列同一性百分数为至少约50％、55％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。
“变体”蛋白质旨在包括通过在天然或亲本蛋白质中的一个或多个位点处缺失、置换或添加一个或多个氨基酸和/或在天然或亲本蛋白质中的一个或多个位点处置换一个或多个氨基酸而从天然或亲本蛋白质衍生的蛋白质。本发明所涵盖的蛋白质变体是具有生物活性的，也即它们继续拥有天然或亲本蛋白质的所需生物活性，即本文所述的NT活性。这种变体可例如由遗传多态性或由人类操纵而得到。本发明的生物活性NT变体将与变体蛋白质的氨基酸序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性，这通过本文别处描述的序列比对程序和参数进行测定。本文所涵盖的是与SEQ ID NO：4、6、8或10的多肽具有50％、55％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的NT变体多肽。
本发明的蛋白质的生物活性变体可与该蛋白质相差50个或更多个氨基酸残基、30-50个残基、15-30个氨基酸残基、少至1-15个氨基酸残基、少至1-10个如6-10个、少至5个、少至5、3、2个或者甚至1个氨基酸残基。本文所用的术语“硝酸盐转运蛋白变体”或“NT变体”包括但不限于本文所公开的序列或多态性、它们的保守修饰变体(不管来源如何)以及任何其他的保持或增加本文所公开的NT或NT变体的生物学性质(例如NT活性)的变体。
本发明涉及硝酸盐转运蛋白变体在植物中的表达。虽然其他的旨在通过过表达硝酸盐转运蛋白来改善植物中的硝酸盐吸收的尝试遭遇了失败(参见例如Fraisier等人，Plant J.，(2000)23：489-496)，但本文证实由根偏好启动子驱动而表达酵母硝酸盐转运蛋白(YNT1)的玉蜀黍转基因株系，在田地中低氮产量试验下其产量比非转基因同胞株系(无效株系)有改善，在温室低氮条件下其产量潜力比无效株系有改善。分别参见图1和2以及实施例7-9。
因此，表达本文所述NT变体的植物当在正常或有限的氮肥力下生长时可具有改善的硝酸盐吸收，或者可以增强植物的氮利用效率(NUE)。有利地，表达本文所述NT变体的植物可通过降低输入成本或者在显著减少所施氮肥的情况下提高产量或者通过这两方面，来给消费者提供增加的收入。此外，即使在非有利的生长条件下，例如在氮供应有限的情况下，表达本文所述NT变体的植物其产量也得到保持或提高。
如本文别处所述，该方法包括在植物中表达本文所述NT变体多核苷酸。本文所用的术语“硝酸盐转运蛋白变体(NT变体)”包括但不限于本文所公开的序列，如表1-3中所述的NT变体、它们的保守修饰变体(不管来源如何)以及任何其他的保持本文所公开NT的生物学性质(例如NT活性)的变体。这类多核苷酸包括编码NT变体的那些、NT变体的经密码子优化的NT变体编码序列以及这些序列的保守变体。例如，适用于本文所述方法的NT变体包括NT变体序列经优化以在特定植物(如玉蜀黍)中表达的编码部分。可使用瞬时表达测定法，例如玉蜀黍瞬时表达测定法如实施例26中所描述的玉蜀黍瞬时表达测定法，针对同源NT变体蛋白的表达水平对包括源自自酵母NT、特定植物优化的和部分优化的NT变体的那些在内的NT变体进行测试。使用本发明的玉蜀黍优化的NT变体多核苷酸，与非优化的NT变体多核苷酸相比，NT变体蛋白的表达水平可提高至少约2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍。
本文所述的NT变体的表达水平和/或活性的调节，将提供操纵植物的氮利用效率(NUE)的机制。因此，本发明提供方法、多核苷酸和多肽，用来产生在有限的氮供应或正常氮条件或两者的情况下产量得到保持或得到改善的植物。在一个方面，该方法包括将一种或多种编码本文所述的具有NT活性的NT变体多肽的多核苷酸引入植物细胞、植物组织或植株中。这可通过向植物核基因组引入由合适的启动子例如组成型启动子或根偏好启动子驱动的NT变体多核苷酸来完成。示例性的合适的启动子在本文的其他地方进行了描述。
本文所公开的是具有保持的或增加的NT活性的NT变体。“NT活性”、“NT的生物活性”或“NT的功能活性”在本文中可互换使用，指NT蛋白、多肽或其部分所表现出的活性，这种活性是按照标准的技术在体内或体外测出的。在一个实施方案中，NT活性为如下活性中至少一种或多种：(a)与对照的硝酸盐吸收相比，保持或增加硝酸盐的吸收、(b)与野生型NT如YNT1的Km、Vmax或周转率相比，保持或增加硝酸盐特异性(例如，对硝酸盐的Km降低)、保持或增加硝酸盐吸收的速度(Vmax)、保持或增加硝酸盐的周转率等等、(c)与对照植物的氮利用效率(NUE)相比，保持或增加植物的NUE、(d)与对照植株的生产率/产量相比，保持或增加植物生产率/产量或(e)任何(a)至(d)的活性。可将本发明的NT的活性与适当的对照进行比较，例如在表达单个功能性植物NT的酵母系统中进行体外比较，或者在体内进行比较，例如在具有本发明的NT的植株中与对照植株进行比较，对照植株为非本发明NT的转基因植株和/或用无效构建体转化的植株。如下面的实施例2中和图5中所示，与野生型YNT1相比，YNT1R2AL、YNT1R2C7、YNT1R3FS和YNT1R3LS NT变体具有高2至5倍的催化效率。
NT变体多肽的表达水平可例如通过用Western法在植物中测量NT变体多肽的水平来直接测量，或者例如通过测量植物中的NT变体多肽的NT活性来间接测量。用于测定NT活性的方法可用已知的方法来确定，如用已知的NT进行的突变体互补，包括在多种表达系统例如爪蟾卵母细胞的表达系统(参见Miller，A.J.和Zhou，J.J.，Xenopus Oocytes as an Expression Systemfor Plant Transporters，Biochimica et Biophysica Acta.(2000)1465：343-358.)中或在系列号为12/136,173的美国专利申请中描述的巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)的酵母系统中评价推定的NT基因或活性的表达。参见例如Accumulation of nitrate in the shoot acts as a signal to regulate shoot：rootallocation in tobacco.Plant J.11：671-691。还可参见例如系列号为12/166,476的美国专利申请、第2009/0011516号美国专利申请公布中的用于测量硝酸盐吸收的基于pH染料的系统。用于测定硝酸盐向亚硝酸盐的还原、硝酸盐还原率(nitrate reduction rate)和/或对硝酸盐的特异性的方法，可用标准的技术如Griess反应比色测定法以及如下文献中描述的那些技术来测定：Hageman等人，Methods Enzymol.(1971)23：491-503、Tucker DE，Allen DJOrt DR(2004).Control of nitrate reductase by circadium and diurnal rhythms intomato.Planta 219：277-285以及Scheible WR，Lauerer M，Schultze ED，Caboche M，Stitt M(1997)，Fiddler RM，Collaborative Study of Modified AOACMethod of Analysis for Nitrite in Meat and Meat Products，J.AOAC，60，594-99，(1977)。
NT活性还可包括评估表型变化，如在硝酸盐限制条件(如较低的氮肥力)下生长的植株的产量或NUE提高或得到保持。表型变化的例子包括但不限于玉蜀黍穗大小增加、苗生物量增加、穗生长速率增加、生物量增加、谷粒产量更高、同步开花使得花粉散出与抽穗丝大约同时、根生长增强、根结构增强、种子大小增加、种子重量增加、种子胚大小增加、叶大小增加、籽苗活力增加、穗丝露出增强和叶绿素含量更高(更绿)。
可通过评估NUE的多种构成组分(component)来推断或确定NUE，所述NUE的构成组分包括但不限于氮的再动员、种子灌浆期、持绿性(叶绿素含量)、衰老、氮吸收量、在非限制或受限制氮条件下的氮吸收率。用于确定NUE的各个方面的测定法在实施例7-15以及在系列号为12/136,173的美国专利申请中进行了描述，包括但不限于Icoria Root NUE、拟南芥属的NUE土壤测定法、系列号为61/227,276的美国专利申请中所描述的TTC测定法、生物量评价和叶绿素含量(SPAD)测定法。另外的用于测量NUE的各方面的测定法将是本领域技术人员已知的。
在一个方面，本发明包括分离的或重组的多肽，所述多肽相对于参与硝酸盐转运的天然存在的酶(例如野生型NT酶)而言具有提高的NT活性。通常，这种多肽是NT。例如，本发明分离的或重组的多肽的NT活性为天然存在的(天然的或野生型的)酶(以YNY1 NT的SEQ ID NO：2为例，或者如本文别处所述)的至少约1倍、1.5倍、2.0倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍、5.0倍、5.5倍、6.0倍、6.5倍、7.0倍、7.5倍、8.0倍、8.5倍、9.0倍、9.5倍、10.0倍、11倍、11.5倍、12.0倍、12.5倍、13倍、13.5倍、14.0倍、14.5倍、15.0倍、15.5倍、16.0倍、16.5倍、17.0倍、17.5倍、18.0倍、18.5倍、19.0倍、19.5倍、20.0倍、21倍、21.5倍、22.0倍、22.5倍、23倍、23.5倍、24.0倍、24.5倍、25.0倍、25.5倍、26.0倍、26.5倍、27.0倍、27.5倍、28.0倍、28.5倍、29.0倍、29.5倍、30.0倍或更大。
例如，NT变体多核苷酸保持的或增加的NT活性可通过NT底物如硝酸盐的结合的改变或者NT底物如硝酸盐的转化活性的改变来赋予。例如，具有增加的NT活性的本发明多肽可具有比任何天然存在的酶例如由SEQID NO：2(YNT1)示例的或通过其实现的酶高的kcat。作为另外一种选择或除此之外，本发明的多肽可具有比任何天然存在的酶例如SEQ ID NO：2低或降低的KM。组合物包括具有改变的NT变体水平和/或NT酶活性的植物。另外提供的是具有改变水平的NT变体多肽或其活性变体或片段和/或保持或增加的NT活性的植物。还包括的是较于野生型或密码子优化的NT如YNT1的活性具有保持的或增加的活性的NT变体。在一个方面，植物包含由具有一个或多个表3所示置换的或用任何本发明方法产生的多核苷酸编码的NT变体多肽。
在特定的组合物中，植物具有改变水平的本发明NT变体多肽或其活性变体或片段。这些包括但不限于具有一个或多个表2所示氨基酸置换或它们的组合的NT变体多肽。与野生型的或天然的NT相比，所述变体可具有保持或增加的NT活性，例如导致植物具有增加的产量或NUE或这二者的变体。在另一方面，当通过本发明方法产生的本发明NT变体多肽或其活性变体或片段在植物细胞中表达时，所述植物具有改变的NT活性水平。可如本文别处所述对所述变体进行测试来确定NT活性。
可用改组或定点诱变或本领域技术人员已知的其他方法产生NT变体。可体外或体内测定所述变体(包括NT变体多肽或多核苷酸)的NT活性。
在一个方面，可在如第12/136,173号美国专利申请所述的巴斯德毕赤酵母宿主中或任何其他合适的宿主中针对NT活性筛选改组基因变体。然后可将具有NT活性或增加的NT活性的变体用于转化植物细胞来测试对例如产量或NUE的影响。
此外，本发明提供了用于调节(例如增加或降低)NT蛋白在植物细胞或植物中的表达水平或活性的新组合物和方法。具体地讲，可将本发明的变体多核苷酸和多肽用于产生表达本发明的NT变体的转基因植物。调节本发明的NT变体将提供增加植物的氮吸收、NUE、产量或它们的组合的机制。因而，一个实施方案提供了使用本发明的或通过本发明方法产生的NT变体多核苷酸和多肽调节(例如增加或降低)植物的氮吸收、NUE或产量。编码具有氨基酸置换和保持的或增加的NT活性的本发明的NT多核苷酸的变体可通过多种方法(包括但不限于改组、定点诱变等)产生。这类方法和技术在本文别处进行描述。
产量的保持或提高可通过本文所述的NT变体来实现。因此，用本文所述的NT变体调节植物细胞中的NT活性提供了保持或增加在受限氮供应或氮肥力较低的情况下生长的植株的产量或NUE的新策略。
因此，本发明还提供了当在受限氮肥力的情况下生长时产量得到提高或产量得到保持的植物。在一些实施方案中，当在受限氮肥力的情况下生长时产量得到提高或保持的植株具有受调节的NT表达水平或NT活性或同时具有这两者。
组合物
核酸
本发明特别提供了包含NT变体多核苷酸的RNA、DNA及它们的类似物和/或嵌合体的分离的核酸。本发明还包括为在不同生物体中表达而经优化的变体多核苷酸。例如，对于变体多核苷酸在玉蜀黍植物中的表达，可变更该序列以考虑特定的密码子偏好性和改变GC含量，如根据Murray等人(出处同上)所述。密码子优化在下面进行了描述。
核酸的构建
可用(a)标准的重组方法、(b)合成技术或二者的组合产生分离的本发明核酸。在一些实施方案中，本发明的多核苷酸将从真菌或细菌克隆、改组、扩增或以别的方式构建。改组或其它技术可用于置换NT多核苷酸中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55个核苷酸以便所得的NT变体多核苷酸与由亲本或模板NT或NT变体多核苷酸编码的多肽不同。
便利的是所述核酸可包含除本发明的变体多核苷酸之外的序列。例如，可将包含一个或多个内切核酸酶限制性位点的多克隆位点插入核酸中以助于该多核苷酸的分离。另外，可插入可翻译序列以助于所翻译的本发明变体多核苷酸的分离。例如，六组氨酸标记序列提供了便利的手段来纯化本发明的蛋白质。本发明的核酸(排除所述变体多核苷酸序列)任选为用于本发明的变体多核苷酸的克隆和/或表达的载体、衔接子或接头。可将另外的序列添加至这种克隆和/或表达序列来优化它们在克隆和/或表达中的功能，以助于所述多核苷酸的分离，或改善所述多核苷酸向细胞内的导入。通常，本发明核酸的长度减去其本发明多核苷酸的长度为小于20千碱基对，往往小于15kb，常常小于10kb。克隆载体、表达载体、衔接子和接头的使用是本领域已知的。示例性的核酸包括诸如以下的载体：M13、λZAP Express、λZAP II、λgt10、λgt11、pBK-CMV、pBK-RSV、pBluescript II、λDASHII、λEMBL 3、λEMBL 4、pWE15、SuperCos 1、SurfZap、Uni-ZAP、pBC、pBS+/-、pSG5、pBK、pCR-Script、pET、pSPUTK、p3’SS、pGEM、pSK+/-、pGEX、pSPORTI和II、pOPRSVI CAT、pOPI3 CAT、pXT1、pSG5、pPbac、pMbac、pMC1neo、pOG44、pOG45、pFRTβGAL、pNEOβGAL、pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pRS413、pRS414、pRS415、pRS416、λMOSSlox和λMOSElox。任选用于本发明的载体包括但不限于λZAP II和pGEX。有关多种核酸的描述，参见例如StratageneCloning Systems，Catalogs 1995，1996，1997(La Jolla，CA)和Amersham LifeSciences，Inc，Catalog’97(Arlington Heights，IL)。
构建核酸的合成方法
本发明的分离的核酸还可用诸如如下的方法通过直接化学合成来制备：Narang等人，(1979)Meth.Enzymol.68：90-9的磷酸三酯法；Brown等人，(1979)Meth.Enzymol.68：109-51的磷酸二酯法；Beaucage等人，(1981)Tetra.Letts.22(20)：1859-62的二乙基亚膦酰胺法；Beaucage等人，(出处同上)描述的固相亚磷酰胺三酯法，例如使用自动合成仪，例如，如Needham-VanDevanter等人，(1984)Nucleic Acids Res.12：6159-68中所描述的；以及第4,458,066号美国专利的固相载体法。化学合成通常产生单链寡核苷酸。这可通过与互补序列杂交或通过将该单链作为模板用DNA聚合酶进行聚合来转变为双链DNA。技术人员将会认识到，虽然DNA的化学合成局限于约100个碱基的序列，但可通过连接较短的序列来获得较长的序列。
UTR和密码子偏好性
一般而言，已发现翻译效率受RNA的5′非编码区或非翻译区(5′UTR)中的特定序列元件的调控。正序列基序包括翻译起始共有序列(Kozak，(1987)Nucleic Acids Res.15：8125)和5<G>7甲基GpppG RNA帽结构(Drummond等人，(1985)Nucleic Acids Res 13：7375)。负元件包括稳定的分子内5′UTR茎-环结构(Muesing等人，(1987)Cell 48：691)和5′UTR中的AUG序列或前面有适当AUG的短开放阅读框(Kozak(出处同上)、Rao等人，(1988)Mol.and Cell.Biol.8：284)。因此，本发明提供了用于调节异源编码序列的翻译的5′和/或3′UTR区。
如上面提到的，可将本发明的变体多核苷酸的多肽编码区段进行修饰以改变密码子使用。可采用改变了的密码子使用，来改变翻译效率和/或优化编码序列在所需宿主中的表达或为了在玉蜀黍中表达而优化异源序列中的密码子使用。还可通过对该变体多核苷酸序列进行工程改造使得它能使用特定植物偏好的密码子，来对该特定植物优化表达。本文所用的“偏好的密码子”是指特定宿主细胞在使用核苷酸密码子来确定给定的氨基酸方面所表现的偏好。特定宿主的氨基酸的偏好密码子是最常编码该宿主中的该氨基酸的单一密码子。特定氨基酸的玉蜀黍偏好密码子可由来自玉蜀黍的已知基因序列得出。例如，当植物为玉蜀黍时，可通过评估来自玉蜀黍植株的已知基因并确定特定密码子的使用频率，来确定偏好的密码子使用。还可参见Murray等人，Nucleic Acids Research，17：477-498(1989)的表4。例如，丙氨酸的玉蜀黍偏好密码子是GCC，因为根据Murray等人(出处同上)中的26种玉蜀黍基因的汇集序列，该密码子有36％概率编码丙氨酸，相比之下GCG为24％，GCA为13％，GCT为27％。将Murray等人的表4复制于下。
在一些情况中，将使用玉蜀黍偏好的密码子对NT变体序列中的每个密码子进行优化以便在玉蜀黍中进行表达，例如在所述多核苷酸的NT变体序列包含该特定NT变体多肽的100％玉蜀黍偏好密码子序列的情况中。例如，SEQ ID NO：9(YNT1R3FSMO)的NT变体多核苷酸具有这样的核苷酸序列，其包含100％的玉蜀黍偏好密码子序列并编码具有与YNT1R3FS蛋白(SEQ ID NO：8)所产生的氨基酸序列相同的氨基酸序列的多肽。因此，对NT变体多核苷酸的序列进行修饰以便优化玉蜀黍表达。在一些情况中，可对NT变体多核苷酸序列进行修饰，使得多核苷酸开放阅读框的总G+C含量为编码NT变体的开放阅读框的序列的总长度的60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或更多。在另一个方面，可对NT变体序列进行修饰，使得限制性位点、隐蔽型内含子供体或受体位点或二者、RNA不稳定性位点及长同源碱基段或它们的组合被消除。
在一些方面，可针对NT变体多核苷酸要在其中进行表达的植物细胞对其进行部分优化。例如，当NT变体多核苷酸要在玉蜀黍中表达时，玉蜀黍NT变体多核苷酸由为了在玉蜀黍中表达而经过部分优化的序列组成。该经过部分地优化的NT变体多核苷酸以足以提高NT活性(例如提高植物的产量)的水平表达NT变体蛋白，且这种表达的水平可高于对照多核苷酸所能实现的水平，所述对照多核苷酸例如是这样的相应的野生型NT或NT变体多核苷酸序列，其序列还未为了在玉蜀黍中表达而进行了修饰以包含玉蜀黍偏好密码子。经过部分地植物优化的序列包括这样的序列：相对于序列的整个长度而言，该序列含有至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的植物偏好密码子。因此，当经过部分地植物优化的序列用于玉蜀黍植物时，该序列可包括含有至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的玉蜀黍偏好密码子的总序列。
本发明多核苷酸的编码区中的密码子使用可用可商购获得的软件包(如可得自University of Wisconsin Genetics Computer Group的“CodonPreference”)进行统计分析。参见Devereaux等人，(1984)Nucleic AcidsRes.12：387-395)；或MacVector 4.1(Eastman Kodak Co.，New Haven，Conn.)。因而，本发明提供了本发明变体多核苷酸中至少一者的编码区特征性的密码子使用频率。可用于确定密码子使用频率的多核苷酸的数目(每个氨基酸3个核苷酸)可以为从3至本文所提供的本发明多核苷酸的数目的任何整数。任选地，多核苷酸将为全长序列。用于统计分析的序列的示例性数目可以为至少1、5、10、20、50或100。
序列改组
本发明提供了使用本发明的多核苷酸进行序列改组的方法以及由此得到的组合物。序列改组在PCT公开No.96/19256中进行了描述。还可参见Zhang等人，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4504-9；和Zhao等人，(1998) Nature Biotech 16：258-61。一般来讲，序列改组提供出用于产生具有所需特性的多核苷酸的文库的手段，可对该文库进行选择或筛选。NT变体多核苷酸可通过任何合适的改组方法，例如从一条或多条亲本NT序列或它们的组合产生。改组可任选包括诱变、体外操纵、体内操纵一条或多条序列或者计算机操纵序列。可将所得的改组的多核苷酸引入合适的宿主细胞中，通常以表达盒的形式，在所述表达盒中可将编码NT变体的改组的多核苷酸序列可操作地连接至转录调控序列和确保所编码的NT变体蛋白的转录、翻译和加工的任何必要序列。
在一个方面，亲本或模板多核苷酸对真菌生物体或植物而言是内源性的。亲本或模板多核苷酸可以是野生型真菌NT，例如来自真菌如安格斯毕赤酵母的NT多核苷酸，如YNT1。另外，可从其他微生物鉴定和分离YNT1序列的推定同源物或直系同源物并用于基因改组来增加序列多样性。
在改组前或改组后，可针对具体植物(例如玉蜀黍或大豆)对NT多核苷酸进行密码子优化。
每一这种表达盒或其改组的NT变体编码序列可称为构成改组NT变体序列的文库的“文库成员”。在一个方面，可由单一基因改组或半合成改组或它们的组合(其中将所述寡核苷酸“掺杂”以含有不同于植物细胞内源性的野生型NT的氨基酸置换)构建大肠杆菌或巴斯德毕赤酵母文库。参见本文所描述的实施例2。可将该文库引入一群宿主细胞中，使得各个宿主细胞实质上接受到文库成员的一种或几种，以形成表达改组NT变体种类的文库的一群改组宿主细胞。
多种NT基因组、cDNA、mRNA来源是已知的并且可用于本文的重组处理。多种物种的NT的编码序列在文献、Genbank以及其他公开来源中公开，并且可通过克隆、PCR获得或从保藏的材料获得。例如，如所说明的，本文多篇参考文献描述了这类基因。参见例如Tsay YF等人，Nitratetransporters & Peptide Transporters，2007，FEBS lett.581：2290-2300以及其中的参考文献。
得到特别重视的具有硝酸盐转运蛋白活性的蛋白质为安格斯毕赤酵母的YNT1。考虑遗传密码子的简并性，存在也可用于本发明目的大量编码硝酸盐转运蛋白的核苷酸序列。包括NT来源的公开数据库的实例包括：Genbank：ncbi.nlm.nih.gov/genbank/；EMBL：ebi.ac.uk.embl/；以及例如蛋白质数据库Brookhaven Laboratories；威斯康星大学生物技术中心(University ofWisconsin Biotechnology Center)；日本DNA数据库(DNA databank ofJapan)；日本遗传信息研究实验室(Laboratory of genetic Information Research，Misuina，Shizuda，Japan)。就NT序列而言，仅在Genbank中就有超过100种不同的NT同源物可用，包括但不限于来自构巢曲霉(Asprgillus nidulans)(XP_658612)、波氏块菌(Tuber borchii)(AAQ04819)、粗糙脉孢菌(Neurospora Crassa)(CAD71077)等的确认的和推定的NT序列。上述数据库中的许多NT序列可用作用于改组目的的多样性输入。
下面的出版物描述了可掺入这类程序(例如用于NT多核苷酸和/或片段的改组)的多种递归重组程序和/或方法。Stemmer等人，(1999)“Molecular breeding of viruses for targeting and other clinical properties.TumorTargeting”4：1-4；Ness等人，(1999)“DNA Shuffling of subgenomicsequences of subtilisin”Nature Biotechnology 17：893-896；Chang等人，(1999)“Evolution of a cytokine using DNA family shuffling”Nature Biotechnology17：793-797；Minshull和Stemmer(1999)“Protein evolution by molecularbreeding”Current Opinion in Chemical Biology 3：284-290；Christians等人，(1999)“Directed evolution of thymidine kinase for AZT phosphorylation usingDNA family shuffling”Nature Biotechnology 17：259-264；Crameri等人，(1998)“DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directedevolution”Nature 391：288-291；Crameri等人，(1997)“Molecular evolution ofan arsenate detoxification pathway by DNA shuffling，”Nature Biotechnology15：436-438；Zhang等人，(1997)“Directed evolution of an effective fucosidasefrom a galactosidase by DNA shuffling and screening”Proceedings of theNational Academy of Sciences，U.S.A.94：4504-4509；Patten等人，(1997)“Applications of DNA Shuffling to Pharmaceuticals and Vaccines”CurrentOpinion in Biotechnology 8：724-733；Crameri等人，(1996)“Construction andevolution of antibody-phage libraries by DNA shuffling”Nature Medicine 2：100-103；Crameri等人，(1996)“Improved green fluorescent protein by molecularevolution using DNA shuffling”，Nature Biotechnology 14：315-319；Gates等人，(1996)“Affinity selective isolation of ligands from peptide libraries throughdisplay on a lac repressor `headpiece dimer`” Journal of Molecular Biology255：3732 386；Stemmer(1996)“Sexual PCR and Assembly PCR”，TheEncyclopedia of Molecular Biology.VCH Publishers，New York.第447-457页；Crameri和Stemmer(1995)“Combinatorial multiple cassette mutagenesiscreates all the permutations of mutant and wildtype cassettes”BioTechniques18：194-195；Stemmer等人，(1995)“Single-step assembly of a gene and entireplasmid form large numbers of oligodeoxyribonucleotides”Gene，164：49-53；Stemmer(1995)“The Evolution of Molecular Computation”Science 270：1510；Stemmer(1995)“Searching Sequence Space”Bio/Technology 13：549-553；Stemmer(1994)“Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling”Nature370：389-391；以及Stemmer(1994)“DNA shuffling by random fragmentationand reassembly：in vitro recombination for molecular evolution.”Proceedings ofthe National Academy of Sciences.U.S.A.91：10747-10751。
此外，关于DNA改组的细节和方式可在多个PCT和外国专利申请公开中找到，包括：Stemmer和Crameri，“DNA Mutagenesis by RandomFragmentation and Reassembly”WO95/22625；Stemmer和Lipschutz“EndComplementary Polymerase Chain Reaction”WO96/33207；Stemmer和Crameri“Methods for Generating Polynucleotides Having Desired Characteristicsby Iterative Selection and Recombination”WO97/0078；Minshul和Stemmer，“Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering”WO97/35966；Punnonen等人，“Targeting of Genetic Vaccine Vectors”WO99/41402；Punnonen等人，“Antigen Library Immunization”WO99/41383；Punnonen等人，“Genetic Vaccine Vector Engineering”WO99/41369；Punnonen等人，“Optimization of ImmunomodulatoryProperties of Genetic Vaccines”WO99/41368；Stemmer和Crameri，“DNAMutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly”EP 0934999；Stemmer“Evolving Cellular DNA Uptake by Recursive SequenceRecombination”EP 0932670；Stemmer等人，“Modification of Virus Tropismand Host Range by Viral Genome Shuffling”WO99/23107；Apt等人，“Human Papillomavirus Vectors”WO99/21979；Del Cardayre等人，“Evolution of Whole Cells and Organisms by Recursive SequenceRecombination”WO98/31837；Patten和Stemmer，“Methods andCompositions for Polypeptide Engineering”WO98/27230；以及Stemmer等人，“Methods for Optimization of Gene Therapy by Recursive SequenceShuffling and Selection”WO98/13487。
如对上述出版物、专利、公开的专利申请和美国专利申请的综述所揭示的，可通过多种确立的方法来进行对多核苷酸的递归重组和选择以提供具有保持的或增加的NT活性的新NT变体多核苷酸。任何这些方法可适于本发明来演化NT或NT变体编码多核苷酸或同源物以产生具有保持的或增加的NT活性的新NT变体多肽。本发明涵盖制备这类酶的方法和由这些方法产生的酶编码文库二者。
多种不同的通用类别的重组方法可用于产生本发明的NT变体。首先，可通过上面参考文献中论述的多种技术任一种对多核苷酸进行体外重组，包括例如DNA酶消化待重组的多核苷酸，然后对该多核苷酸进行连接和/或PCR再组装。其次，可体内对多核苷酸进行递归重组，例如通过在细胞中让重组在多核苷酸之间发生。第三，可使用全细胞基因组重组方法，在该方法中使细胞全基因组进行重组，任选包括对基因组或重组混合物进行掺杂使得它们编码被证实可产生功能性NT酶的所需氨基酸置换。参见实施例2。第四，可使用合成重组方法，在该方法中合成对应于不同NT同源物的寡核苷酸并在包括对应于不止一种亲本多核苷酸的寡核苷酸的PCR或连接反应中再组装，从而产生新的重组多核苷酸。寡核苷酸可通过标准的核苷酸添加方法产生，或可例如通过三核苷酸合成方法产生。第五，可实现计算机重组方法，在该方法中在计算机中使用遗传算法来重组对应于NT同源物的序列字符串。所得的重组序列字符串任选通过合成对应于该重组序列的多核苷酸而转化为多核苷酸，例如，与寡核苷酸合成/基因再组装技术一致。任何前述一般重组方式可以反复的方式进行实施以产生多样性更高的重组多核苷酸组。
可将体外和体内改组的组合用于增强组合多样性。如前面提到的，可将“计算机”改组用于产生NT变体多核苷酸，在计算机中使用遗传算子用计算机算法来进行“虚拟”改组。计算机改组可能在如下文献中进行了详细描述：Selifonov和Stemmer，“Methods for Making Character Strings，Polynucleotides & Polypeptides Having Desired Characteristics”，1999年2月5日提交的美国专利系列号为60/118854；和Selifonov等人，“Methods forMaking Character Strings，Polynucleotides & Polypeptides Having DesiredCharacteristics”，1999年10月12号提交(美国专利系列号为09/416375)。
寡核苷酸介导的重组的一个优点可能是能够重组具有低序列相似性的同源多核苷酸，或甚至非同源多核苷酸。在这些低同源性寡核苷酸改组方法中，对一组或多组片段化多核苷酸(例如，对应于多个NT多核苷酸的寡核苷酸)进行重组，例如用一组交换家族多样性寡核苷酸(crossover familydiversity oligonucleotide)进行。这些交换寡核苷酸每一者具有多个序列多样性域，这些多个序列多样性域对应于来自具有低序列相似性的同源或非同源多核苷酸的多个序列多样性域。可使片段化的寡核苷酸(其通过与一条或多条同源或非同源多核苷酸比较而得来)杂交至所述交换寡核苷酸的一个或多个区域，从而利于重组。
当重组同源多核苷酸时，使交叠家族基因改组寡核苷酸组(其通过比较同源多核苷酸、通过合成相应的寡核苷酸而得来)杂交并延伸(例如，通过再组装PCR或连接)，从而提供一群重组多核苷酸，可针对所需的性状或性质对其进行选择。交叠家族改组基因寡核苷酸组包括多个寡核苷酸成员类型，这些类型具有源自多条同源靶标多核苷酸的共有区子序列。
在一个方面，通过比对同源多核苷酸序列来选择保守的序列同一性区域和序列多样性区域，从而提供包括一条或多条NT多核苷酸的家族基因改组寡核苷酸。可合成多条对应于至少一个序列多样性区域的家族基因改组寡核苷酸(逐次合成或平行合成)。
用于寡核苷酸改组方法的片段组或片段亚组可通过切割一条或多条同源多核苷酸(例如用DNA酶)，或者更通常地，通过合成一组对应于至少一条多核苷酸的多个区域的寡核苷酸来提供(通常，对应于全长多核苷酸的寡核苷酸可作为多核苷酸片段组的成员提供)。可将切割片段例如在一个或多个重组反应中与家族基因改组寡核苷酸一起使用以产生重组NT多核苷酸。
改组的另一方法可在1998年9月29日提交的(系列号为60/102,362的美国专利)、1999年1月29日提交的(系列号为60/117,729的美国专利)和1999年9月29日提交的(PCT/US99/22588)Patten等人的“Shuffling ofCodon Altered Genes”中找到。一种在一组要进行改组的多核苷酸(即，本发明所适用的是，NT多核苷酸)中产生多样性的方式，可以是通过合成其中编码某些氨基酸残基的核苷酸被改变的多核苷酸来提供含有突变来降低KM、增加Kcat的“掺杂”多核苷酸，有可能在随后对该多核苷酸进行突变后实现完全不同的突变谱。这可增加用于改组方案的起始多核苷酸的序列多样性，其改变了强制进化程序的速率和结果。可将密码子修饰程序用于修饰任何NT多核苷酸或改组的多核苷酸，例如，在进行DNA改组前。
上面的参考文献提供了这些以及其他基本的重组方式以及这些方式的许多修改形式。无论可使用的方式如何，可将本发明的变体多核苷酸(相互之间或与相关的或甚至不相关的多核苷酸)重组以产生一组多样性的重组多核苷酸，包括同源多核苷酸。
因而，在一般的方面，序列改组方法可用于产生含有重组NT多核苷酸的文库或细胞，可针对NT活性，例如，NT活性增加对这些文库或细胞进行筛选。从一群包含具有实质序列同一性并可在体外或体内进行同源重组的序列区的相关序列多核苷酸产生重组多核苷酸的文库。在该方法中，将至少两个种类的相关序列多核苷酸在适于产生序列重组多核苷酸的重组系统中组合，其中所述序列重组多核苷酸包含至少一条第一种类的相关序列多核苷酸的一部分与至少一条第二种类的相关序列多核苷酸的至少一个邻接部分。适合于产生序列重组多核苷酸的重组系统可以是：(1)用于通过扩增或其他方式进行同源重组或序列改组的体外系统或(2)用于同源重组或位点特异性重组的体内系统。
序列重组NT变体多核苷酸群体包含疑似编码具有NT活性，优选具有增加的NT活性的多肽的多核苷酸的亚群。可使所选的序列重组多核苷酸接受至少一个递归循环，其中至少一条所选的序列重组多核苷酸可与至少一条不同种类的相关序列多核苷酸(其可能本身是所选的序列重组多核苷酸)在适合于产生序列重组多核苷酸的重组系统中进行组合，使得从所选的通过所采用的选择或筛选方法获得的序列重组多核苷酸产生序列重组多核苷酸序列的另外的代。这样，递归序列重组可产生文库成员，这些成员为具有增加的NT活性的序列重组NT多核苷酸。
多核苷酸序列改组可能是用于NT多核苷酸片段或多核苷酸(例如，来自真菌生物体的基因或其部分)的集合的体外或体内同源或非同源重组的方法。使相关NT多核苷酸序列或多核苷酸的混合物随机或伪随机片段化，并再组装而产生具有NT活性的重组多核苷酸或多肽的文库或混合群体。在一个实施方案中，所述多核苷酸为真菌NT多核苷酸或它们的组合。
本发明可涉及用于产生所选的NT多核苷酸序列或所选的多核苷酸序列的群体(通常以扩增的和/或克隆的多核苷酸的形式)的方法，从而所述所选的多核苷酸编码可被选择的NT变体多肽，从而所选的多肽序列具有NT活性，例如，具有保持的或增加的活性。
在一个一般的方面，本发明提供用于产生重组多核苷酸的文库的方法，所述重组多核苷酸的文库具有编码具有保持的或增加的NT活性的NT变体蛋白的文库成员的亚群。可从一群相关序列NT多核苷酸产生重组多核苷酸的文库，所述相关序列NT多核苷酸包含具有实质序列同一性并可在体外或体内进行同源重组的序列区。在另一个方面，可对该文库进行“掺杂”以含有野生型植物NT中未存在的以及被发现可产生功能性NT酶和/或增加的NT活性的突变。
在一个方面，将NT多核苷酸在适合于产生序列重组多核苷酸的重组系统中进行组合。在一个方面，该方法包括宿主细胞内源性的NT作为模板，例如，改组模板。在一个方面，该模板为来自毕赤酵母属或者毕赤酵母属的种的NT基因或cDNA或其他核苷酸序列，或其他真菌基因，如NT变体。在一个优选的实施方案中，该多核苷酸来自安格斯毕赤酵母。另外，可将从其他微生物鉴定和分离的该安格斯毕赤酵母序列的推定同源物用于基因改组以增加序列多样性。如果需要，该多核苷酸可来自不同的生物体或物种。适合于产生序列重组多核苷酸的重组系统可以是(1)用于通过本文描述的扩增或其他方式进行的同源重组或序列改组的体外系统，或(2)用于本文所述的同源重组或位点特异性重组，或逆转录病毒基因组复制事件的模板转换的体内系统。序列重组的多核苷酸的群体包含具有所需的或有利的酶特性并且可通过合适的选择或筛选方法来选择的NT多核苷酸的亚群。然后可使所选的序列重组多核苷酸(其可以是相关序列NT多核苷酸)接受至少一个递归循环，其中至少一条所选的序列重组NT多核苷酸可与另一相关序列NT多核苷酸(其可能本身是所选的序列重组多核苷酸)在适合于产生具有NT活性的序列重组多核苷酸的重组系统中进行组合，使得从所选的通过所采用的选择或筛选方法获得的序列重组多核苷酸产生序列重组多核苷酸序列的另外的代。这样，递归序列重组可产生文库成员，这些成员为具有保持的或增加的NT活性的序列重组多核苷酸。
在一个方面，可使NT多核苷酸(例如文库成员)片段化并通过PCR体外同源重组。片段产生可通过核酸酶消化、部分延伸PCR扩增、PCR滑移(stuttering)或其他合适的片段化手段，如本文所中以及在1995年8月24日公布的WO95/22625和在共同拥有的1996年3月25日提交的系列号为08/621,859的美国专利、1996年4月18日提交的PCT/US96/05480中描述的，将上述参考文献以引用的方式并入本文。滑移可能是通过模板的不完全的聚合酶延伸所产生的片段化。可采用基于十分短的PCR延伸时间的重组方式来产生部分PCR产物，其在下一个(并且是随后的)循环中继续延伸过不同的模板，并实现事实上片段化。可以使用能实现多个NT序列相关的多核苷酸之间的序列改组的模板转换和其他方式。对本领域技术人员来说这种备选的形式是显而易见的。
在一个方面，可体外使NT多核苷酸(例如文库成员)片段化，将所得的片段转移进宿主细胞或生物体中并进行同源重组以体内形成改组的多核苷酸。在一个方面，可在游离复制型载体上克隆或扩增NT多核苷酸(例如文库成员)，可将多个所述载体转移进细胞中并进行同源重组以体内形成NT多核苷酸，例如文库成员。
在一个方面，可不将NT多核苷酸(例如，文库成员)片段化，而是可将其作为直接重复或间接(或反向)重复在游离复制型载体上克隆或扩增，其各重复包含不同种类的所选NT多核苷酸序列，可将所述载体转移进细胞中并通过载体内或载体间重组进行同源重组以体内形成改组的文库成员。
在一个方面，提供体外和体内改组的组合以增强组合多样性。可由实施者以任何所需次序进行重组循环(体外或体内)。在一个方面，可使第一多个所选文库成员片段化并体外通过PCR进行同源重组。片段产生可通过核酸酶消化、部分延伸PCR扩增、PCR滑移或其他合适的片段化手段，如本文中以及以引用的方式并入本文的文献中所述的。滑移可能是通过模板的不完全的聚合酶延伸所产生的片段化。
在一个方面，可体外使NT多核苷酸(例如文库成员)片段化，将所得的片段转移进宿主细胞或生物体中并进行同源重组以体内形成改组的多核苷酸(例如文库成员)。在一个方面，宿主细胞可以是单细胞光合作用真核生物或植物细胞。在一个方面，将植物细胞进行工程改造以含有增强的重组系统，例如用于一般同源重组的增强的系统(例如，表达recA蛋白或来自转基因或植物病毒的植物重组酶的植物)或位点特异性重组系统(例如转基因或植物病毒上编码的cre/LOX或frt/FLP系统)。
在一个方面，可在游离复制型载体上克隆或扩增NT多核苷酸(例如文库成员)，可将多个所述载体转移进细胞中并进行同源重组以在植物细胞、藻类细胞、真菌、酵母或细菌细胞中体内形成改组的文库成员。如果需要，可使用其他细胞类型。
可不将NT多核苷酸(例如，文库成员)片段化，而是可将其作为直接重复或间接(或反向)重复在游离复制型载体上克隆或扩增，其各重复包含不同种类的NT多核苷酸序列，可将所述载体转移进细胞中并通过载体内或载体间重组进行同源重组以在植物细胞或微生物中体内形成改组的文库成员。
至少一条亲本多核苷酸序列编码真菌的NT变体或NT，例如但不限于具有NT活性的多核苷酸序列，例如来自安格斯毕赤酵母等等的基因或cDNA序列。可使该亲本NT或NT变体多核苷酸接受诱变和/或改组或它们的组合，以产生一群与该亲本NT或NT变体多核苷酸序列具有实质性的序列同一性的经诱变处理的NT多核苷酸。可将该经诱变处理的多核苷酸的群体转移进一群宿主细胞中，其中所述经诱变处理的多核苷酸得以表达并可针对NT活性(保持的或增加的NT活性)或其表型对所得的转化宿主细胞群体(转化体)进行选择或筛选。这种性质的增加可以占野生型值的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90、100％、110％、120％、130％、140％、150％或更高。
对于本领域技术人员而言多种适合于改组或确定NT序列的宿主细胞将是显而易见的。可使用任何合适的宿主细胞，只要该宿主细胞允许所述NT正确折叠和加工。该宿主细胞可以是植物细胞，例如，拟南芥、大豆或藻类细胞、真菌细胞、酵母细胞或细菌细胞。
重组表达盒
本发明还提供包含本发明的核酸的重组表达盒。可将编码所需的本发明变体多核苷酸的核酸序列，例如编码长度足以编码本发明的活性蛋白质的多肽的cDNA或基因组序列用于构建重组表达盒，可将该表达盒引入所需的宿主细胞。重组表达盒将通常包含可操作地连接至转录起始调控序列的本发明多核苷酸，所述转录起始调控序列将指导所述多核苷酸在预期的宿主细胞(如转化植物的组织)中的转录。
例如，植物表达载体可包含(1)处于5′和3′调控序列的转录控制下的克隆的植物基因和(2)显性选择性标志物。这种植物表达载体还可含有(如果需要的话)启动子调节区(例如赋予诱导型或组成型表达、环境调节型或发育调节型表达或者细胞或组织特异性/选择性表达的调节区)、转录起始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点和/或聚腺苷酸化信号。
可将多种启动子用于实施本发明，包括所关注作物的内源NT多核苷酸序列的天然启动子。启动子可基于所需的结果来选择。可将核酸与组成型启动子、组织偏好启动子、诱导型启动子或其他启动子进行组合，以在植物中表达。
可采用能指导本发明的变体多核苷酸在再生植物的所有组织中表达的植物启动子或启动子片段。这种启动子在本文中称为“组成型”启动子并且在大多数环境条件和发育或细胞分化状态下是活跃的。组成型启动子的实例包括源于根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的T-DNA的1′-或2′启动子、Smas启动子、肉桂醇脱氢酶启动子(第5,683,439号美国专利)、Nos启动子、rubisco启动子、GRP1-8启动子、来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子，如Odell等人，(1985)Nature 313：810-2中所述；水稻肌动蛋白启动子(McElroy等人，(1990)Plant Cell 163-171)；泛素启动子(Christensen等人，(1992)Plant Mol.Biol.12：619-632和Christensen等人，(1992)Plant Mol.Biol.18：675-89)；pEMU(Last等人，(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-8)；MAS(Velten等人，(1984)EMBO J.3：2723-30)和玉蜀黍H3组蛋白启动子(Lepetit等人，(1992)Mol.Gen.Genet.231：276-85；和Atanassvoa等人，(1992)Plant Journal 2(3)：291-300)；ALS启动子，如第WO 96/30530号PCR申请中所述；以及技术人员已知的来自多种植物基因的其他转录起始区。为了本发明，根偏好启动子、玉蜀黍泛素启动子或病毒启动子如香蕉条纹病毒启动子截短型(BSV(TR)PRO)和全长型(BSV PRO)是用于单子叶植物中的表达的优选启动子。
组织偏好启动子可用来靶向特定的植物组织内的增强的NT变体表达。所谓“组织偏好的”旨在指该表达主要是在特定的组织中，尽管未必专门在该组织中。组织偏好启动子包括Yamamoto等人，(1997)Plant J.12(2)：255-265；Kawamata等人，(1997)Plant Cell Physiol.38(7)：792-803；Hansen等人，(1997)Mol.Gen Genet.255(3)：337-353；Russell等人，(1997)TransgenicRes.6(2)：157-168；Rinehart等人，(1996)Plant Physiol.112(3)：1331-1351；Van Camp等人，(1996)Plant Physiol.112(2)：525-535；Canevascini等人，(1996)Plant Physiol.112(2)：513-525；Yamamoto等人，(1995)Plant CellPhysiol.35(5)：773-778；Lam(1995) Results Probl.Cell Differ.20：181-196；Orozco等人，(1993)Plant Mol Biol.23(6)：1129-1138；Matsuoka等人，(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA 90(20)：9586-9590；和Guevara-Garcia等人，(1993)Plant J.5(3)：595-505。如有必要，可对这种启动子进行修饰以用于弱表达。另参见美国专利申请No.2003/0074698，将其以引用方式并入本文。
叶肉细胞偏好启动子包括但不限于诸如已知的磷酸烯醇式丙酮酸脱羧酶(PEPC)启动子或推定的PEPC启动子之类的启动子，所述启动子来自多种物种，例如玉米(Zea mays)、水稻(Oryza sativa)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)、大豆(Glycine max)或高粱(Sorghum bicolor)。实例包括GenBank登录号为gi：116268332 HTG AC190686(图12)和gCAT GSS复合序列(图17)的玉米PEPC；GenBank登录号为gi|20804452|dbj|AP003052.3|(图13)的水稻PEPC；GenBank登录号为gi|5541653|dbj|AP000370.1|AP000370(图14)、gi：7769847(图15)或gi|20198070|gb|AC007087.7(图16)的拟南芥PEPC；大豆(GSS叠连群)(图18-19)；或高粱(JGI assemblyscaffold_832，89230bp.，JGI assembly scaffold_1632，图20-21)。(1997)Plant J.12(2)：255-265；Kwon等人，(1995) Plant Physiol.105：357-67；Yamamoto等人，(1995)Plant Cell Physiol.35(5)：773-778；Gotor等人，(1993)Plant J.3：509-18；Orozco等人，(1993)Plant Mol.Biol.23(6)：1129-1138；Baszczynski等人，(1988)Nucl.Acid Res.16：5732；Mitra等人，(1995)PlantMolecular Biology 26：35-93；Kayaya等人，(1995)Molecular and GeneralGenetics 258：668-675；和Matsuoka等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(20)：9586-9590。衰老调节的启动子也有用，如SAM22(Crowell等人，(1992)Plant Mol.Biol.18：559-566)。还可参见美国专利No.5,589,052，将其以引用方式并入本文。
苗偏好启动子包括苗分生组织偏好启动子，如Weigal等人，(1992)Cell 69：853-859中公开的启动子；登录号AJ131822；登录号Z71981；登录号AF059870、ZAP启动子(美国专利申请No.10/387,937)、玉蜀黍tb1启动子(Wang等人，(1999)Nature 398：236-239)和McAvoy等人，(2003)Acta Hort.(ISHS) 625：379-385中公开的苗偏好启动子。
根偏好的启动子是已知的，可选自许多可从文献得到的启动子，或者从多种相容物种从头分离。示例性的根偏好的启动子包括但不限于根偏好的启动子、例如玉蜀黍根金属硫蛋白启动子(ZM-RM2 PRO)、玉蜀黍NAS2启动子以及病毒启动子如香蕉条纹病毒启动子截短型(BSV(TR)PRO)和全长型(BSV(FL)PRO)。参见美国专利No.7,214,855(2007年5月8日公布)的ZM-RM2启动子和系列号为61/184,043的美国专利申请(2009年6月4日提交)的BSV TR(BSV截短启动子)，将这些专利以引用方式全文并入本文。还可参见例如Hire等人，(1992)Plant Mol.Biol.20(2)：207-218(大豆根特异性谷氨酰胺合成酶基因)；Keller和Baumgartner(1991)Plant Cell3(10)：1051-1061(法国菜豆的GRP 1.8基因中的根特异性控制元件)；Sanger等人，(1990)Plant Mol.Biol.15(3)：533-553(根瘤农杆菌的甘露氨酸合酶(MAS)基因的根特异性启动子)；和Miao等人，(1991)Plant Cell3(1)：11-22(编码胞质谷氨酰胺合成酶(GS)的全长cDNA克隆，该酶在大豆的根和根瘤中表达)。另参见Bogusz等人(1990)Plant Cell 2(7)：633-651，其中描述了从来自固氮非豆科榆科山黄麻(Parasponia andersonii)和相关的非固氮非豆科山麻黄(Trema tomentosa)的血红蛋白基因分离的两种根特异性启动子。将这些基因的启动子连接至β-葡糖醛酸酶报道基因并引入非豆科植物烟草(Nicotiana tabacum)和豆科植物百脉根(Lotus corniculatus)二者中，在这两种情况中根特异性启动子活性得以保持。Leach和Aoyagi(1991)描述了他们对毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的高度表达的rolC和rolD根诱导基因的分析(参见Plant Science(Limerick)79(1)：69-76)。他们得出结论认为，增强子和组织组织偏好的DNA决定子在那些启动子中是分离的。Teeri等人(1989)使用与lacZ的基因融合表明，编码章鱼氨酸合酶的农杆菌T-DNA基因在根尖的表皮中特别活跃，且TR2′基因在完整植物中是根特异性的并且通过叶组织中的创伤刺激，这是与杀昆虫或杀幼虫基因一起使用的特别理想的特性组合(参见EMBO J.8(2)：353-350)。与nptII(新霉素磷酸转移酶II)融合的TR1′基因显示了相似的特性。另外的根偏好启动子包括VfENOD-GRP3基因启动子(Kuster等人，(1995)Plant Mol.Biol.29(5)：759-772)；rolB启动子(Capana等人，(1995)Plant Mol.Biol.25(5)：681-691)；和具有ADH第一内含子的CRWAQ81根偏好启动子(美国专利No.7,411,112，于2003年10月9日提交，以引用的方式将其并入本文)。还可参见美国专利No.5,837,876、No.5,750,386、No.5,633,363、No.5,559,252、No.5,501,836、No.5,110,732和No.5,023,179。
或者，植物启动子可指导本发明的多核苷酸在特定组织中的表达或者可另外在更精确的环境或发育控制下。这种启动子在本文中称为“诱导型”启动子。可通过诱导型启动子实现转录的环境条件包括病原体攻击、厌氧条件或光线的存在。诱导型启动子的实例为Adh1启动子(其可由低氧或冷应激诱导)、Hsp70启动子(其可由热应激诱导)和PPDK启动子(其可由光诱导)。
处于发育控制下的启动子的实例包括只在或者优先在某些组织如叶、根、果实、种子或花中引发转录的启动子。取决于启动子在基因组的位置，启动子的操作也可以变化。因而，诱导型启动子在某些位置可变为完全或部分组成型的。
如果多肽表达是所需的，则通常期望在多核苷酸编码区的3′-端包括多腺苷酸化区。该多腺苷酸化区可源于多种植物基因，或源于T-DNA。待添加的3′端序列可源于(例如)胭脂氨酸合酶或章鱼氨酸合酶基因，或作为另一种选择，源于另一植物基因，或较不优选地，源自任何其他真核基因。这种调控元件的实例包括但不限于3′终止区和/或多腺苷酸化区，如根瘤农杆菌胭脂氨酸合酶(nos)基因(Bevan等人，(1983)Nucleic Acids Res.12：369-85)；马铃薯蛋白酶抑制剂II(PINII)基因(Keil等人，(1986)Nucleic AcidsRes.14：5641-50；和An等人，(1989)Plant Cell：115-22)；和CaMV 19S基因(Mogen等人，(1990)Plant Cell 2：1261-72)的那些3’末端区域和/或聚腺苷酸化区域。
可将内含子序列添加至部分编码序列的5′非翻译区或编码序列以增加在胞质溶胶中积聚的成熟信息(mature message)的量。在植物表达构建体和动物表达构建体二者中的转录单位中包括可剪接内含子，已证实能在mRNA水平和蛋白质水平二者上使基因表达增加高达1000倍(Buchman和Berg，(1988)Mol.Cell Biol.8：4395-4405；Callis等人，(1987)Genes Dev.1：1183-200)。当设置在接近转录单位的5′端时，基因表达的这种内含子增强通常是最大的。玉蜀黍内含子Adh1-S内含子1、Adh1-S内含子2和Adh1-S内含子6、Bronze-1内含子的使用是本领域已知的。一般参见The MaizeHandbook，第116章，Freeling和Walbot(编辑)，Springer，New York(1994)。
植物信号序列可用于本发明，它们包括但不限于：编码信号肽的DNA/RNA序列，其将蛋白质靶向至植物细胞的胞外基质(Dratewka-Kos等人，(1989) J.Biol.Chem.264：4896-900)，例如皱叶烟草(Nicotianaplumbaginifolia)扩张基因(DeLoose等人，(1991)Gene 99：95-100)；将蛋白质靶向液泡的信号肽，如甘薯sporamin基因(Matsuka等人，(1991)Proc.Natl.Acad. Sci.USA 88：834)和大麦凝集素基因(Wilkins等人，(1990)PlantCell，2：301-13)；造成蛋白质被分泌的信号肽，如PRIb的信号肽(Lind等人，(1992)Plant Mol.Biol.18：47-53)或大麦α-淀粉酶(BAA)的信号肽(Rahmatullah等人，(1989)Plant Mol.Biol.12：119，将其以引用的方式并入本文)，或者将蛋白质靶向质体的信号肽，如油菜籽烯酰ACP还原酶的信号肽(Verwaert等人，(1994)Plant Mol.Biol.26：189-202)。
包含来自本发明多核苷酸的序列的载体将通常包含标志基因，其对植物细胞赋予选择性表型。通常，选择性标志基因将编码抗生素抗性，合适的基因包括编码对壮观霉素这种抗生素的抗性的基因(例如aada基因)、编码链霉素抗性的链霉素磷酸转移酶(SPT)基因、编码卡那霉素或遗传霉素抗性的新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因、编码潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶(HPT)基因、编码对起到抑制乙酰乳酸合酶(ALS)的作用的除草剂，特别是磺酰脲类除草剂的抗性的基因(例如含有导致这种抗性的突变特别是S4和/或Hra突变的乙酰乳酸合酶(ALS)基因)、编码对起到抑制谷氨酰胺合酶的作用的除草剂如草胺膦或basta的抗性的基因(例如bar基因)，或本领域已知的其他这种基因。bar基因编码对除草剂basta的抗性，ALS基因编码对除草剂氯磺隆的抗性。另外的选择性标志物包括表型标志物如β-半乳醣苷酶和荧光蛋白如红色荧光蛋白(RFP)、绿荧光蛋白(GFP)(Su等人，(2005)Biotechnol Bioeng 85：610-9和Fetter等人，(2005)Plant Cell 16：215-28)、青色荧光蛋白(CYP)(Bolte等人，(2005)J.Cell Science 117：953-55和Kato等人，(2002)Plant Physiol 129：913-52)和黄色荧光蛋白(来自Evrogen的PhiYFP，参见Bolte等人，(2005)J.Cell Science 117：953-55)。
可用于基因在高等植物中的表达的典型载体是本领域所熟知的，包括源于根瘤农杆菌的肿瘤诱导(Ti)质粒的载体，这类载体由Rogers等人，(1987)，Meth.Enzymol.153：253-77进行了描述。这些载体是植物整合型载体，因为在转化时，这些载体将载体DNA的一部分整合进宿主植物的基因组中。可用于本发明的示例性根瘤农杆菌载体为Schardl等人，(1987)Gene61：1-11和Berger等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：8402-6的质粒pKYLX6和pKYLX7。本发明中可用的另一种载体是质粒pBI101.2，其可得自CLONTECH Laboratories，Inc.(Palo Alto，CA)。
蛋白质在宿主细胞中的表达
使用本发明的核酸，可在重组工程细胞如细菌、酵母、昆虫、哺乳动细胞物或优选的植物细胞中表达本发明的变体蛋白质。所述细胞在非自然条件下(例如在数量、组成、地点和/或时间方面)产生该蛋白质，因为它们已被通过人为干预进行了遗传变更使其能做到这一点。
预期的是，本领域的技术人员会知道多种可用于表达编码本发明的蛋白质的核酸的表达体系。无意于详细描述已知用于在原核生物或真核生物中表达蛋白质的各种方法。
简单概括而言，编码本发明变体蛋白质的分离核酸的表达通常将通过使例如DNA或cDNA可操作地连接至启动子(组成型或诱导型)，然后掺入进表达载体中来实现。该载体可适合于在原核生物或真核生物中复制和整合。典型的表达载体含有可用于调节编码本发明变体蛋白质的DNA的表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。为获得克隆基因的高水平表达，需要构建至少含有用于引导转录的强启动子(如泛素)、用于起始翻译的核糖体结合位点以及转录/翻译终止子的表达载体。组成型启动子被分类为可提供一系列组成型表达。因此，一些是弱的组成型启动子，其他是强的组成型启动子。一般来讲，所谓“弱启动子”意指驱动编码序列以低水平表达的启动子。所谓“低水平”意指处于约1/10,000个转录物至约1/100,000个转录物至约1/500,000个转录物的水平。相反，“强启动子”以“高水平”或者约1/10个转录物至约1/100个转录物至约1/1,000个转录物来驱动编码序列的表达。
技术人员将认识到，可对本发明的变体蛋白质进行修饰而不减少其生物活性。可作出一些修饰，以促进靶向分子的克隆、表达和掺入到融合蛋白中。这种修饰是本领域技术人员熟知的，包括例如在氨基末端添加甲硫氨酸以提供起始位点，或者将另外的氨基酸(例如聚His)设置于任一末端以产生方便定位的限制性位点或终止密码子或纯化序列。
在原核生物中的表达
原核细胞可用作表达的宿主。原核生物最通常由大肠杆菌的各种菌株代表；然而，也可使用其他微生物株。在本文中定义为包括用于转录起始的启动子(任选具有操纵子)以及核糖体结合位点序列的常用原核生物控制序列，包括诸如以下的常用启动子：β-内酰胺酶(青霉素酶)启动子系统和乳糖(lac)启动子系统(Chang等人，(1977)Nature 198：1056)、色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel等人，(1980)Nucleic Acids Res.8：4057)和λ衍生PL启动子之类的常用启动子和N-基因核糖体结合位点(Shimatake等人，(1981)Nature 292：128)。在转染进大肠杆菌中的DNA载体中包含选择标志物也是有用的。这种标志物的实例包括确定对氨苄青霉素、四环素或氯霉素的抗性的基因。
对载体进行选择以使得将所关注基因引入到适当的宿主细胞中。细菌载体通常是质粒或噬菌体起源的。将适当的细菌细胞用噬菌体载体颗粒转染或用裸噬菌体载体DNA转染。如果使用质粒载体，则将细菌细胞用质粒载体DNA转染。使用芽孢杆菌属(Bacillus sp.)和沙门氏菌属(Salmonella)，可获得用于表达本发明蛋白质的表达系统(Palva等人，(1983)Gene 22：229-35；Mosbach等人，(1983)Nature 302：543-5)。来自Pharmacia的pGEX-4T-1质粒载体是本发明的优选大肠杆菌表达载体。
在真核生物中的表达
多种真核表达系统如酵母、昆虫细胞系、植物和哺乳动物细胞是本领域技术人员已知的。如下面简单解释的，本发明可在这些真核系统中表达。在一些实施方案中，将转化的/转染的植物细胞(如下文所论述的)用作表达系统，用于产生本发明的变体蛋白质。
异源蛋白质在酵母中的合成是众所周知的。Sherman等人，(1982)Methods in Yeast Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory是描述多种可用于在酵母中产生蛋白质的方法的广泛认可的著作。两种广泛采用的用于产生真核蛋白质的酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。用于在酿酒酵母和毕赤酵母中进行的表达的载体、菌株和方案是本领域已知的，可从商业供应商(例如Invitrogen)获得。根据需要，合适的载体通常具有表达控制序列如启动子(包括3-磷酸甘油酸激酶或醇氧化酶启动子)和复制起始区、终止序列等等。
本发明的变体蛋白质，一旦表达，可通过裂解细胞并向溶胞产物或离心沉淀物应用标准蛋白质分离技术来从酵母分离。可通过使用蛋白质印记技术或其他标准免疫测定技术的放射免疫测定法来完成对纯化过程的监测。
还可将编码本发明的变体蛋白质的序列连接至各种用于转染例如哺乳动物、昆虫或植物来源的细胞培养物的表达载体。哺乳动物细胞系统通常会是单层细胞的形式，但也可使用哺乳动物细胞悬浮液。本领域已经开发了多种能够表达完整蛋白质的合适的细胞系，包括HEK293、BHK21和CHO细胞系。用于这些细胞的表达载体可包括表达控制序列，如复制起始区、启动子(例如CMV启动子、HSV tk启动子或pgk(磷酸甘油酸激酶)启动子)、增强子(Queen等人，(1986)Immunol.Rev.89：49)和必要的加工信息位点如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多腺苷酸化位点(例如SV40大T Ag多聚A添加位点)和转录终止子序列。可用于产生本发明变体蛋白质的其他动物细胞可从(例如)美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection)的细胞系和杂交瘤目录(Catalogue of Cell Lines andHybridomas，第7版，1992)获得。
用于在昆虫细胞中表达本发明的变体蛋白质的适当载体通常源于SF9杆状病毒。合适的昆虫细胞系包括蚊幼虫、蚕、行军虫、蛾和果蝇属(Drosophila)细胞系如Schneider细胞系(参见例如Schneider，(1987)J.Embryol.Exp.Morphol.27：353-65)。
如使用酵母一样，当采用高等动物或植物宿主细胞时，通常将多腺苷酸化或转录终止子序列整合进载体中。终止子序列的实例是来自牛生长激素基因的多聚腺苷酸化序列。其他可用的用于实施本发明的终止子包括但不限于pinII(参见An等人，(1989)Plant Cell 1(1)：115-122)、glb1(参见Genbank登录号L22345)、gz(参见gzw64a终止子，Genbank登录号S78780)和来自农杆菌的nos终止子。
还可包括用于转录物的精确剪接的序列。剪接序列的一个实例为来自SV40的VP1内含子(Sprague等人，J.Virol.45：773-81(1983))。另外，可将控制在宿主细胞中的复制的基因序列掺入进载体(如牛乳头瘤病毒类型的载体中存在的那些)(Saveria-Campo，“Bovine Papilloma Virus DNA aEukaryotic Cloning Vector”，DNA Cloning：A Practical Approach，第II卷，Glover(编辑)，IRL Press，Arlington，VA，第213-38页(1985))。
另外，可将置于适当植物表达载体中的NT变体多核苷酸用于转化植物细胞。然后可从植物愈伤组织分离多肽或可将转化的细胞用于再生转基因植物。可收获这种转基因植物，将适当的组织(例如，种子或叶)进行大规模蛋白质提取和纯化技术。
植物转化方法
有多种用于将外来基因引入植物中的方法是公知的并可用来将NT变体多核苷酸插入植物宿主中，包括生物学和物理学的植物转化方案。参见例如Miki等人，“Procedure for Introducing Foreign DNA into Plants”，Methods inPlant Molecular Biology and Biotechnology，Glick和Thompson(编辑)，CRC Press，Inc.，Boca Raton，第67-88页(1993)。所选用的方法随宿主植物而变，包括化学转染方法，如磷酸钙、微生物介导的基因转移如农杆菌(Horsch等人，Science 227：1229-31(1985))、电穿孔、显微注射和基因枪轰击。
用于植物细胞或组织转化和植物再生的表达盒和载体以及体外培养方法是已知的并可获得。参见例如，Gruber等人，“Vectors for PlantTransformation”，Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology(出处同上)，第89-119页。
可通过一种或多种通常用于直接递送进细胞的技术将分离的多核苷酸或多肽引入植物中。取决于要进行基因修饰的生物体、细胞、植物或植物细胞的类型(即单子叶植物或双子叶植物)，这种方案可不同。转化植物细胞的合适方法包括显微注射(Crossway等人，(1986)Biotechniques 4：320-334；和美国专利6,300,543)、电穿孔(Riggs等人，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5602-5606)、直接基因转化(Paszkowski等人，(1984)EMBO J.3：2717-2722)和弹道粒子加速(参见例如Sanford等人，美国专利No.4,945,050；WO 91/10725；和McCabe等人，(1988)Biotechnology 6：923-926)。还可参见Tomes等人，“Direct DNA Transfer into Intact Plant CellsVia Microprojectile Bombardment”。第197-213页，Plant Cell，Tissue andOrgan Culture，Fundamental Methods.O.L.Gamborg & G.C.Phillips(编辑)。Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York，1995；美国专利5,736,369(分生组织)；Weissinger等人，(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477；Sanford等人，(1987)Particulate Science and Technology 5：27-37(洋葱)；Christou等人，(1988)Plant Physiol.87：671-674(大豆)；Datta等人，(1990)Biotechnology 8：736-740(水稻)；Klein等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：4305-4309(玉蜀黍)；Klein等人，(1988)Biotechnology 6：559-563(玉蜀黍)；WO 91/10725(玉蜀黍)；Klein等人，(1988)Plant Physiol.91：440-444(玉蜀黍)；Fromm等人，(1990)Biotechnology 8：833-839；和Gordon-Kamm等人，(1990)Plant Cell 2：603-618(玉蜀黍)；Hooydaas-VanSlogteren & Hooykaas(1984)Nature(London)311：763-764；Bytebierm等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5345-5349(百合科(Liliaceae))；De Wet等人，(1985)，The Experimental Manipulation of Ovule Tissues，G.P.Chapman等人(编辑)，第197-209页，Longman，NY(花粉)；Kaeppler等人，(1990)Plant Cell Reports 9：415-418；和Kaeppler等人，(1992)Theor.Appl.Genet.84：560-566(晶须介导的转化)；美国专利No.5,693,512(超声处理)；D’Halluin等人，(1992)Plant Cell 4：1495-1505(电穿孔)；Li等人，(1993)Plant Cell Reports 12：250-255；以及Christou和Ford，(1995)Annals of Botany 75：407-413(水稻)；Osjoda等人，(1996)Nature Biotech.14：745-750；农杆菌介导的玉蜀黍转化(美国专利5,981,840)；碳化硅晶须方法(Frame等人，(1994)Plant J.6：941-948)；激光方法(Guo等人，(1995)Physiologia Plantarum 93：19-24)；超声处理方法(Bao等人，(1997)Ultrasound in Medicine & Biology 23：953-959；Finer和Finer，(2000)Lett ApplMicrobiol.30：406-10；Amoah等人，(2001)J Exp Bot 52：1135-42)；聚乙二醇方法(Krens等人，(1982)Nature 296：72-77)；单子叶植物和双子叶植物细胞的原生质体可用电穿孔(Fromm等人，(1985)Proc.Natl.Acad. Sci.USA82：5824-5828)和显微注射(Crossway等人，(1986)Mol.Gen.Genet.202：179-185)进行转化；将这些文献全部以引用的方式并入本文。
农杆菌介导的转化
将表达载体引入植物中的最广泛使用的方法是基于农杆菌的天然转化系统。根瘤农杆菌和毛根农杆菌是植物病原性土壤细菌，其能遗传转化植物细胞。根瘤农杆菌和毛根农杆菌各自的Ti和Ri质粒携带负责植物的遗传转化的基因。参见例如Kado，(1991)Crit.Rev.Plant Sci.10：1。有关农杆菌介导的基因转移的农杆菌载体系统和方法的描述在以下文献中提供：Gruber等人(出处同上)；Miki等人(出处同上)；和Moloney等人，(1989)PlantCell Reports 8：238。
相似地，可将基因插入源于根瘤农杆菌或毛根农杆菌各自的Ti或Ri质粒的T-DNA区。因而，可使用这些质粒，如上构建表达盒。已知有许多控制序列，其在偶联至异源编码序列并转化进宿主生物体中时，在初始编码序列的组织/器官特异性方面显示出基因表达的保真性。参见例如Benfey和Chua，(1989)Science 244：174-81。用于这些质粒中的特别合适的控制序列是用于基因在各种靶植物中的组成型叶特异性表达的启动子。其他可用的控制序列包括来自胭脂氨酸合酶基因(NOS)的启动子和终止子。NOS启动子和终止子存在于质粒pARC2中，该质粒可得自美国典型培养物保藏中心，指定的ATCC存放号为67238。如果使用这种系统，则来自Ti或Ri质粒的毒力(vir)基因必须也存在，要么与T-DNA部分一起存在，要么通过双元系统存在，在该系统中该vir基因存在于一另外的载体上。这类系统、在其中使用的载体以及转化植物细胞的方法在以下专利和文献(均以引用方式全文并入本文)中有描述：美国专利No.4,658,082；1986年10月1日提交的美国专利申请No.913,914，如在1993年11月16日公布的美国专利申请No.5,262,306中引用的；和Simpson等人，(1986)Plant Mol.Biol.6：403-15(也在‘306专利中引用)。
一旦构建，可将这些质粒置于毛根农杆菌或根瘤农杆菌中并将这些载体用于转化植物物种的细胞，所述植物物种的细胞通常对镰孢属(Fusarium)或链格孢属(Alternaria)感染而言是易感的。本发明还可以想到若干其他转基因植物，包括但不限于大豆、玉米、高粱、苜蓿、水稻、三叶草、卷心菜、香蕉、咖啡、芹菜、烟草、豇豆、棉花、甜瓜和胡椒。根瘤农杆菌或者毛根农杆菌的选择将取决于用其转化的植物。通常，根瘤农杆菌是用于转化的优选生物体。多大数双子叶植物、一些裸子植物和少数单子叶植物(例如百合目(Liliales)和天南星目(Arales)的某些成员)对根瘤农杆菌感染是易感的。毛根农杆菌也具有广泛的宿主，包括大多数双子叶植物和一些裸子植物，其包豆科(Leguminosae)、菊科(Compositae)和藜科(Chenopodiaceae)的成员在内。单子叶植物现在可以一定的成功率进行转化。欧洲专利申请No.604 662 A1公开了用农杆菌转化单子叶植物的方法。欧洲专利No.672 752 A1公开了采用不成熟胚的盾片用农杆菌转化单子叶植物的方法。Ishida等人论述了通过使未成熟胚暴露于根瘤农杆菌来转化玉蜀黍的方法(Nature Biotechnology14：745-50(1996))。
一旦转化，可将这些细胞用于再生转基因植物。例如，整个植株可通过使该植株产生伤口，然后将载体引入该伤口位点来用这些载体进行感染。可使植株的任何部分产生伤口，包括叶、茎和根。或者，可将外植体形式的植物组织如子叶组织或叶圆片用这些载体接种，并在可促进植物再生的条件下培养。可将通过用毛根农杆菌或根瘤农杆菌(含有编码伏马毒素降解酶的基因)接种植物组织而转化的根或苗用作植物来源，以通过体细胞胚胎发生或器官发生来再生伏马毒素抗性转基因植物。用于再生植物组织的这类方法的实例在如下专利和文献中进行了公开：Shahin，(1985)Theor.Appl.Genet.69：235-40；美国专利No.4,658,082；Simpson等人(出处同上)；和第913,913和913,914号美国专利申请，二者均于1986年10月1日提交，如1993年11月16日公布的第5,262,306号美国专利中所引用的，将上述专利和文献的全部公开内容以引用的方式并入本文。
直接基因转移
尽管农杆菌介导的转化的宿主范围广泛，但一些主要的谷类作物物种和裸子植物总体上对该基因转移模式而言是顽拗的，尽管最近已在稻中获得了一定的成功(Hiei等人，(1994)The Plant Journal 6：271-82)。已开发了几种植物转化的方法(统称为直接基因转移)作为对农杆菌介导的转化的替代方案。
一般适用的植物转化方法是微抛射体(microprojectile)介导的转化，其中DNA携带在约1至4μm的微抛射体的表面上。用基因枪装置将表达载体引入植物组织中，该基因枪装置将微抛射体加速至300至600m/s的速度，该速度足以穿透植物细胞壁和膜(Sanford等人，(1987)Part.Sci.Technol.5：27；Sanford，(1988)Trends Biotech 6：299；Sanford，(1990)Physiol.Plant79：206；和Klein等人，(1992)Biotechnology 10：268)。
物理递送DNA至植物的另一种方法是如Zang等人，(1991)BioTechnology 9：996中所述的对靶细胞的超声处理。或者，脂质体或原生质球融合已用于将表达载体引入植物中。参见例如Deshayes等人，(1985)EMBO J.4：2731；和Christou等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：3962。利用CaCl2沉淀、聚乙烯醇或聚-L-鸟氨酸直接将DNA摄入原生质体中也已有报道。参见例如Hain等人，(1985)Mol.Gen.Genet.199：161；和Draper等人，(1982)Plant Cell Physiol.23：451。
原生质体和完整细胞和组织的电穿孔也已有描述。参见例如Donn等人，(1990)Abstracts of the VIIth Int’l.Congress on Plant Cell and TissueCulture IAPTC，A2-38，第53页；D’Halluin等人，(1992)Plant Cell 4：1495-505；和Spencer等人，(1994)Plant Mol.Biol.24：51-61。
增加NT变体多肽的活性和/或水平
提供了用于提高本发明的NT变体多肽的活性和/或水平的方法。可通过将NT变体多肽提供给植物，来实现本发明的NT变体多肽的水平和/或活性的增加。NT变体多肽可通过如下方式来提供：将编码该NT变体多肽的氨基酸序列引入该植物中、将该编码NT变体多肽的核苷酸序列引入该植物中，或者修饰基因组座位以插入编码本发明的NT变体多肽的多核苷酸。
如本文别处所论述的，本领域已知有多种方法用于将多肽提供给植物，包括但不限于将多肽直接引入植物中、将编码具有增加的NT活性的本发明多肽的多核苷酸构建体引入植物中(暂时引入或稳定引入)。还应认识到，本发明的方法可采用不能够在转化的植物中引导蛋白质或RNA的表达的多核苷酸。因此，可通过改变基因组以编码NT变体多肽来增加NT变体多肽的水平和/或活性。
降低NT多肽的活性和/或水平
提供了用于降低或消除植物细胞中的内源NT的活性的方法，该方法涉及使用NT多核苷酸变体或多肽变体并结合使用(但不限于)转基因表达、反义抑制、共抑制、RNA干扰、使用转录因子和/或阻遏物进行的基因激活或抑制、诱变(包括转座子标签法、定点诱变和位点特异性诱变)、染色体工程(参见Nobrega等人，Nature 431：988-993(04))、同源重组和TILLING。
根据本发明，如果NT多肽的蛋白水平为该同一NT多肽在未经过遗传修饰或诱变以抑制该NT多肽的表达的植物中的蛋白水平的不到70％，则NT多肽的表达被抑制。在本发明的具体实施方案中，该NT多肽在根据本发明的经修饰的植物中的蛋白水平，为该同一NT多肽在不属于突变体的植物或者未经过遗传修饰以抑制该NT多肽的表达的植物中的蛋白水平的不到60％、不到50％、不到40％、不到30％、不到20％、不到10％、不到5％或不到2％。NT多肽的表达水平可例如通过测定在植物细胞或植物中表达的NT多肽的水平来直接测量，或者例如通过测量该NT多肽在植物细胞或植物中的氮吸收活性或通过测量植物中的表型变化来间接测量。用于这种这种测定的技术和方法在本文别处有描述，而且是本领域技术人员所熟悉的。
增加植物中的NT多肽的水平和/或活性的方法在本文其他地方进行了论述。简而言之，这种方法包括提供本发明的NT多肽给植物，从而增加该NT变体多肽的水平和/或活性。在其它实施方案中，可通过这样来提供编码NT变体多肽的NT变体核苷酸序列：向植物中引入包含本发明NT变体核苷酸序列的多核苷酸，表达该NT变体序列，从而增加该NT变体多肽的活性，并因此降低植物或植物部分中的组织细胞的数目。在其他的实施方案中，引入植物中的NT变体核苷酸构建体被稳定掺入植物的基因组中。
如上面论述的，技术人员将认识到用于调节植物中的NT的水平/活性的适当启动子。在本文其他地方已经公开了这个实施方案的示例性启动子。
在其它实施方案中，这种植物已在其基因组中稳定掺入了核酸分子，所述核酸分子包含可操作地连接至驱动在该植物细胞中的表达的启动子的本发明NT变体核苷酸序列。
调节根发育
提供了用于调节植物中的根发育的方法。所谓“调节根发育”意指在与对照植物比较时植物根的发育的任何改变。根发育的这种改变包括但不限于初生根的生长速率的改变、新鲜根重量、侧根和不定根形成程度、维管系统、分生组织发育或径向增大。
提供了用于调节植物中的根发育的方法。该方法包括调节植物中NT变体多肽的水平和/或活性。在一种方法中，将本发明的NT变体序列提供给植物。在另一种方法中，通过这样来提供NT变体核苷酸序列：将包含本发明NT变体核苷酸序列的多核苷酸引入植物中，表达该NT变体序列，从而修饰根发育。在其他的方法中，引入植物中的NT变体核苷酸构建体被稳定掺入植物的基因组中。
在另外的方法中，通过改变植物中的NT变体多肽的水平或活性来调节根发育。NT活性的改变可导致以下对根发育的改变中的至少一项或多项：包括但不限于根生物量的改变和长度的改变。
本文所用的“根生长”涵盖单子叶植物和双子叶植物中构成根系的不同部分在根系发育的不同阶段的生长的所有方面。应当理解，根生长增强可由其各部分(包括初生根、侧根、不定根等)中的一者或多者的生长增强引起。
测量根系中的这种发育改变的方法是本领域已知的。参见例如美国专利申请No.2003/0074698和Werner等人，(2001)PNAS 18：10487-10492，将这二者以引用的方式并入本文。
如上面所论述的，技术人员将会认识用于调节植物中的根发育的适当启动子。用于这个实施方案的示例性启动子包括组成型启动子和根偏好的启动子。示例性的根偏好的启动子已在本文别处公开。
此外，由于NT活性所致的较高的根生物量生产对产量具有直接的作用，并对根细胞或转基因根细胞或所述转基因根细胞的细胞培养物所产生的化合物的生产具有间接作用。在根培养物中产生的令人感兴趣的化合物的一个实例是紫草素(shikonin)，其产量可通过所述方法有利地增强。
因此，本发明还提供了与对照植物的根发育相比较时具有受调节的根发育的植物。在一些实施方案中，本发明的植物具有增加的本发明NT变体多肽的水平/活性，并且具有增加的根生长和/或根生物量。在其它实施方案中，这种植物已在其基因组中稳定掺入了核酸分子，所述核酸分子包含可操作地连接至驱动在该植物细胞中的表达的启动子的本发明NT变体核苷酸序列。
调节苗和叶发育
还提供了用于调节植物中的苗和叶发育的方法。所谓“调节苗和/或叶发育”其意指植物苗和/或叶的发育的任何改变。根和/或叶发育的这种改变包括但不限于苗分生组织发育、叶数量、叶大小、叶和茎脉管系统、节间长度和叶衰老的改变。本文所用的“叶发育”和“苗发育”涵盖在单子叶植物和双子叶植物中分别构成叶系统和苗系统的不同部分在它们系统发育的不同阶段中的生长的所有方面。测量苗和叶系统中的这种发育改变的方法是本领域已知的。参见例如Werner等人，(2001)PNAS 98：10487-10492和美国申请No.2003/0074698，将它们各自以引用的方式并入本文。
调节植物中的苗和/或叶发育的方法包括调节本发明的NT变体多肽的活性和/或水平。在一个实施方案中，提供了本发明的NT变体序列。在其他实施方案中，可通过这样来提供NT变体核苷酸序列：向植物中引入包含本发明NT变体核苷酸序列的多核苷酸、表达该NT变体序列，从而修饰苗和/或叶发育。在其他的实施方案中，引入植物中的NT变体核苷酸构建体被稳定掺入植物的基因组中。
在具体的实施方案中，通过改变植物中的NT变体多肽的水平和/或活性来调节苗或叶发育。NT活性的变化可导致与对照植物相比，苗和/或叶发育的以下改变中的至少一项或多项：(包括但不限于)叶数量的变化、叶表面的改变、脉管系统的改变、节间和植株生长以及叶衰老的改变。
如上面所论述的，技术人员将会认识到用于调节植物的苗和叶发育的适当启动子。用于这个实施方案的示例性启动子包括组成型启动子、苗偏好启动子、苗分生组织偏好启动子和叶偏好启动子。示例性的启动子已在本文别处公开。
增加植物中的NT活性和/或水平可导致节间和生长的改变。因此，本发明的方法可用于产生经修饰的植物。另外，如上所讨论，植物中的NT活性同时调节根和苗生长。因而，本发明还提供了用于改变根/苗比的方法。可通过改变植物中的NT变体多肽的水平和/或活性来进一步调节苗或叶发育。
因此，本发明还提供了与对照植物相比较时具有受调节的苗和/或叶发育的植物。在一些实施方案中，本发明的植物具有增加的本发明NT变体多肽的水平/活性。在其他实施方案中，本发明的植物具有降低的本发明NT变体多肽的水平/活性。
调节繁殖组织发育
提供了用于调节繁殖组织发育的方法。在一个实施方案中，提供了用于调节植物中的花发育的方法。所谓“调节花发育”意指与其中NT变体多肽的活性或水平还未受调节的对照植株相比，植株的繁殖组织的结构的任何改变。“调节花发育”还包括与其中NT变体多肽的活性或水平还未受调节的对照植株相比，植株的繁殖组织的发育的时间安排的任何改变(即花发育的时间安排的延迟或加速)。宏观改变可包括繁殖器官的大小、形状、数量或位置的变化，这些结构成形的发育时间周期的改变，或者在存在环境胁迫的时候维持或继续进行开花过程的能力的改变。微观改变可包括构成繁殖器官的细胞的类型或形状的改变。
调节植物中的花发育的方法包括调节植物中的NT活性。在一种方法中，提供了本发明的NT变体序列。可通过这样来提供NT变体核苷酸序列：向植物中引入包含本发明NT变体核苷酸序列的多核苷酸，表达该NT变体序列，从而修饰花发育。在其他的实施方案中，引入植物中的NT变体核苷酸构建体被稳定掺入植物的基因组中。
在特定的方法中，通过降低植物中的NT变体多肽的水平或活性来调节花发育。NT活性的变化可导致与对照植株相比，花发育的以下改变中的至少一项或多项：(包括但不限于)开花的改变、花数量的变化、雄性不育的修饰和结籽的改变。诱导开花延迟或抑制开花可用于增强诸如苜蓿之类的饲料作物的产量。用于测量花发育的这种发育改变的方法是本领域已知的。参见例如Mouradov等人，(2002) The Plant Cell S111-S130，将该献以引用的方式并入本文。
如上面所论述的，技术人员将会认识用于调节植物中的花发育的适当启动子。用于这个实施方案的示例性启动子包括组成型启动子、诱导型启动子、苗偏好启动子和花偏好启动子。
在其他方法中，通过改变本发明的NT变体序列的水平和/或活性来调节花发育。这种方法可包括将NT变体核苷酸序列引入植物中并改变NT变体多肽的活性。在其他的方法中，引入植物中的NT变体核苷酸构建体被稳定掺入植物的基因组中。改变本发明的NT变体序列的表达可调节胁迫期间的花发育。这种方法在本文别处进行了描述。因此，本发明还提供了与对照植株的花发育相比具有受调节的花发育的植物。组合物包括具有改变了的本发明NT变体多肽的水平/活性且具有改变了的花发育的植物。组合物还包括具有经修饰的本发明NT变体多肽的水平/活性的植物，其中该植物在胁迫期间保持或继续进行通过开花过程。
还提供了使用本发明的NT变体序列来增加种子大小和/或重量的方法。该方法包括增加植物或植物部分(如种子)中的NT变体序列的活性。种子大小和/或重量的提高包括种子的大小或重量的提高，和/或一个或多个种子部分(包括例如胚、胚乳、种皮、糊粉或子叶)的大小或重量的提高。
如上面所论述的，技术人员将认识到用于增加种子大小和/或种子重量的适当启动子。这个实施方案的示例性启动子包括组成型启动子、诱导型启动子、种子偏好启动子、胚偏好启动子和胚乳偏好启动子。
用于改变植物中的种子大小和/或种子重量的方法包括提高植物中的NT活性。在一个实施方案中，可通过这样来提供NT变体核苷酸序列：向植物中引入包含本发明NT变体核苷酸序列的多核苷酸，表达该NT变体序列，从而降低种子重量和/或尺寸。在其他的实施方案中，引入植物中的NT变体核苷酸构建体被稳定掺入植物的基因组中。
还认识到，增加种子大小和/或重量可以还伴随有籽苗生长速度的增加或早期活力的增加。本文所用的术语“早期活力”是指植物在早期发育过程中快速生长的能力，涉及到萌发之后发育良好的根系和发育良好的光合器的成功建立。此外，当与对照比较时，种子大小和/或重量的增加还可导致植物产量的增加。
因此，本发明还提供了当与对照植物比较时具有增加的种子重量和/或种子大小的植物。在其它实施方案中，还提供了具有增加的活力和植物产量的植物。在一些实施方案中，本发明的植物具有经修饰的本发明NT变体多肽的水平/活性和具有提高了的种子重量和/或种子大小。在其它实施方案中，这种植物已在其基因组中稳定掺入了核酸分子，所述核酸分子包含可操作地连接至驱动在该植物细胞中的表达的启动子的本发明NT变体核苷酸序列。
NT变体多核苷酸、表达盒和另外的多核苷酸的使用方法
在某些实施方案中，本发明的核酸序列可与各所关注多核苷酸序列的任何组合进行堆叠，以产生具有所需表型的植物。所产生的所述各组合可包括任何一种所关注多核苷酸的多个拷贝。例如，本发明的变体多核苷酸可与本发明的任何其他变体多核苷酸进行堆叠。本发明的变体多核苷酸可与任何基因或基因的组合堆叠以产生具有多种所需性状组合的植物，包括但不限于对动物饲料而言理想的性状如高油基因(例如，美国专利No.6,232,529)；平衡的氨基酸(例如hordothionin类(第5,990,389号；第5,885,801号；第5,885,802号和第5,703,409号美国专利)；大麦高赖氨酸(Williamson等人，(1987) Eur.J.Biochem.165：99-106；和WO 98/20122)；和高甲硫氨酸蛋白质(Pedersen等人，(1986)J.Biol.Chem.261：6279；Kirihara等人，(1988) Gene 71：359；和Musumura等人，(1989)Plant Mol.Biol.12：123))；增加的消化性(例如经修饰贮藏蛋白(于2001年11月7日提交的系列号为10/053,410的美国申请)和硫氧还蛋白(于2001年12月3日提交的系列号为10/005,429的美国专利申请))，将上述文献的公开内容以引用的方式并入本文。本发明的多核苷酸还可与昆虫、病害或除草剂抗性所需的性状进行堆叠(例如苏芸金杆菌(Bacillus thuringiensis)毒蛋白(第5,366,892号、第5,747,450号、第5,737,514号、第5723,756号、第5,593,881号美国专利；Geiser等人(1986)Gene 48：109)；凝集素(Van Damme等人，(1994)PlantMol.Biol.24：825)；伏马毒素解毒基因(第5,792,931号美国专利)；无毒性和病害抗性基因(Jones等人，(1994)Science 266：789；Martin等人，(1993) Science 262：1432；Mindrinos等人，(1994)Cell 78：1089)；导致除草剂抗性的乙酰乳酸合酶(ALS)突变体，如S4和/或Hra突变；谷氨酰胺合酶的抑制剂，如草胺膦或basta(例如bar基因)和草甘膦抗性(EPSPS基因))，以及对加工或工艺产品而言理想的性状如高油(例如第6,232,529号美国专利)；经修饰的油(例如脂肪酸去饱和酶基因(第5,952,544号美国专利；WO 94/11516))；经修饰的淀粉(例如ADPG焦磷酸化酶(AGP酶)、淀粉合酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)和淀粉脱支酶(SDBE))和聚合物或生物塑料(例如第5.602,321号美国专利；β-酮硫解酶、聚羟基丁酯合酶和乙酰乙酰辅酶A还原酶(Schubert等人，(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847)有利于聚羟基链烷酸酯(PHA)表达)，将上述文献中的公开内容以引用的方式并入本文。还可以将本发明的变体多核苷酸与影响诸如雄性不育(例如参见美国专利No.5.583,210)、茎秆强度、开花时间之类的农艺性状或诸如细胞周期调控或基因打靶(例如WO 99/61619；WO 00/17364；WO99/25821)之类的转化技术性状的多核苷酸组合，将上述文献以引用的方式并入本文。
在一个实施方案中，可将本发明的变体多核苷酸可与一种或多种可改善NUE、硝酸盐吸收、氮同化、根生物量或它们的组合的多核苷酸堆叠。这种多核苷酸包括(包括但不限于)硝酸盐转运蛋白、硝酸盐还原酶和/或根基因的基因或编码区。示例性的硝酸盐转运蛋白包括但不限于YNT1、经优化或部分优化的YNT1及其变体，例如本文公开的那些。示例性的硝酸盐还原酶包括但不限于YNR1和PPNR A551G(在本文别处有描述)示例性的根基因包括但不限于细胞分裂素氧化酶/脱氢酶基因的玉蜀黍基因组克隆(ZM-CKXg)。
在一个实施方案中，所关注序列可改善植物生长和/或作物产量。例如，所关注序列包括可导致初生根系或侧根系改善的农艺上重要的基因。这类基因包括但不限于营养物质/水转运蛋白和生长诱导。这类基因的实例包括但不限于玉蜀黍质膜H+-ATP酶(MHA2)(Frias等人，(1996)Plant Cell8：1533-44)；AKT1，拟南芥中的钾吸收器的组件(Spalding等人，(1999) JGen Physiol 113：909-18)；激活根顶端细胞中的细胞分裂周期的RML基因(Cheng等人，(1995)Plant Physiol 108：881)；玉蜀黍谷氨酰胺合成酶基因(Sukanya等人，(1994)Plant Mol Biol 26：1935-46)和血红蛋白(Duff等人，(1997)J.Biol.Chem 27：16749-16752，Arredondo-Peter等人，(1997)Plant Physiol.115：1259-1266；Arredondo-Peter等人，(1997)Plant Physiol114：493-500以及其中的参考文献)。所关注序列还可用于表达负面影响根发育的基因的反义核苷酸序列。
另外，除了使用传统的育种方法之外，还可用遗传法对农艺上重要的性状如油含量、淀粉含量和蛋白质含量进行改变。修饰包括提高油酸、饱和油和不饱和油的含量，提高赖氨酸和硫的水平，提供必需氨基酸以及修饰淀粉。第5,703,049号、第5,885,801号、第5,885,802号和第5,990,389号美国专利中描述了Hordothionin蛋白修饰，将这些文献以引用的方式并入本文。另外的实例是美国专利第No.5,850,016中描述的由大豆2S白蛋白编码的富含赖氨酸和/或硫的种子蛋白质和Williamson等人，(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106中描述的来自大麦的胰凝乳蛋白酶抑制剂，将上述参考文献的公开内容以引用的方式并入本文。
可通过定点诱变产生编码序列的衍生物来增加预选的氨基酸在所编码的多肽中的水平。例如，编码大麦高赖氨酸多肽(BHL)的基因源自大麦抗胰凝乳蛋白酶抑制剂，系列号为08/740,682的美国申请(1996年11月1日提交)和WO 98/20133，将它们的公开内容以引用方式并入本文。其他蛋白质包括富含甲硫氨酸的植物蛋白质，如来自向日葵籽(Lilley等人，(1989)Proceedings of the World Congress on Vegetable Protein Utilization in HumanFoods and Animal Feedstuffs，Applewhite(编辑)(American Oil ChemistsSociety，Champaign，Illinois)，第497-502页；以引用的方式并入本文)；玉米(Pedersen等人，(1986)J.Biol.Chem.261：6279；Kirihara等人，(1988)Gene 71：359；将这两篇文献以引用的方式并入本文)；和水稻(Musumura等人，(1989)Plant Mol.Biol.12：123，以引用的方式并入本文)。其他农艺上重要的基因编码胶乳、Floury 2、生长因子、种子贮藏因子和转录因子。
昆虫抗性基因可编码对严重影响产量的害虫的抗性，所述害虫例如根虫、切根虫、欧洲玉蜀黍螟等。这种基因包括例如苏芸金芽胞杆菌毒蛋白基因(美国专利No.5,366,892；No.5,747,450；No.5,736,514；No.5,723,756；No.5,593,881；和Geiser等人，(1986)Gene 48：109)等等。
编码病害抗性性状的基因包括解毒基因，如抗伏马毒素(美国专利No.5,792,931)；无毒性(avr)和疾病抗性(R)基因(Jones等人，(1994)Science266：789；Martin等人，(1993)Science 262：1432；和Mindrinos等人，(1994)Cell 78：1089)等等。
除草剂抗性性状可包括编码对能抑制乙酰乳酸合酶(ALS)的作用的除草剂的抗性的基因，特别是磺酰脲型除草剂(例如含有导致这种抗性的突变特别是S4和/或Hra突变的乙酰乳酸合酶(ALS)基因)；编码对能抑制谷氨酰胺合酶的作用的除草剂的抗性的基因，如草胺膦或basta(例如bar基因)；或者本领域知道的其他此类基因。bar基因编码对除草剂basta的抗性，nptII基因编码对抗生素卡那霉素和遗传霉素的抗性，ALS基因突变体编码对除草剂氯磺隆的抗性。
不育基因也可编码在表达盒中，为物理去雄提供另选方案。以这种方式使用的基因的实例包括雄性组织偏好的基因和具有雄性不育表型的基因(如QM)，在美国专利No.5,583,210中有描述。其他基因包括激酶和编码对雄性或雌性配子体发育有毒的化合物的那些。
谷粒的质量反映在诸如以下的性状：饱和及不饱和油的含量和类型、必需氨基酸的质量和数量、纤维素的含量。在玉米中，经修饰的hordothionin蛋白在美国专利No.5,703,049、No.5,885,801、No.5,885,802和No.5,990,389中有描述。
还可在(一种或多种)基因上编码商业性状，所述基因可增加例如用于乙醇生产的淀粉，或提供蛋白质的表达。经转化的植物的另一个重要商业应用是生产聚合物和生物塑料，如美国专利No.5,602,321中描述。诸如β-酮硫解酶、PHB酶(聚羟基丁酸酯合酶)和乙酰乙酰辅酶A还原酶之类的基因(参见Schubert等人，(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847)可促进聚羟基链烷酸酯(PHA)的表达。
外源产物包括植物酶和产物以及来自包括原核生物和其他真核生物在内的其他来源的那些。这类产物包括酶、辅因子、激素等等。可增加蛋白质，特别是具有改善的氨基酸分布以改善植物营养价值的修饰蛋白质的水平。这可通过表达具有提高的氨基酸含量的这类蛋白质来实现。
与本文所述的NT变体进行堆叠的基因或编码序列可由任何合适的启动子驱动，所述启动子使所述多核苷酸在植物或植物细胞中以所需的时间、空间模式和水平表达。硝酸盐同化途径(例如硝酸盐还原酶和/或根基因)中的基因表达的修饰与NT一起，可更有效地改进NUE。示例性的堆叠构建体包括但不限于以下所示的那些：
表4：示例性的堆叠构建体
Figure BPA00001514709400631
1玉蜀黍根金属硫蛋白启动子＝ZM-RM2；玉蜀黍NAS2启动子，香蕉条纹病毒启动子截短型启动子＝BSV(TR)，玉蜀黍磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶启动子＝ZM-PEPC；玉蜀黍泛素启动子＝UBI(玉蜀黍泛素启动子(Christensen等人，Plant Mol.Biol.12：619-632(1989)和Christensen等人，Plant Mol.Biol.18：675-689(1992))；ADHI内含子＝醇脱氢酶1基因的内含子；细胞分裂素氧化酶/脱氢酶基因的玉蜀黍基因组克隆＝ZM-CKXg；PPNR A551G，也称A7G PPNR＝野生型红藻硝酸盐还原酶(玫瑰紫菜)，其中在位置551处野生型PPNR的推定过敏原位点中的第七个丙氨酸已被甘氨酸置换。PPNR A551G S561D MO＝玉蜀黍经密码子优化的野生型红藻硝酸盐还原酶(玫瑰紫菜)，其中在位置551处野生型PPNR的推定过敏原位点中的第七个丙氨酸已被甘氨酸置换，且位置561处的丝氨酸残基已被天冬氨酸置换以敲除推定的磷酸化位点。参见图6和7。野生型PPNR含有推定的过敏原肽，该肽具有8个氨基酸残基，Val后跟着7个Ala，即Val Ala1 Ala2 Ala3 Ala4 Ala5 Ala6 Ala7。参见图7。在一个优选的实施方案中，该构建体包括与PPNR A551G的硝酸盐还原酶基因堆叠的YNT1R3FS。
PPNR A551G或A7G PPNR和PPNR A551G S561D MO具有“NR活性”，该活性是指根据标准技术在体内或体外测定的硝酸盐还原酶(NR)蛋白、多肽或其部分所发挥的活性。在一个方面，NR活性是硝酸盐向亚硝酸盐的还原。在一个方面，NR活性包括但不限于与所关注作物的内源NR的NR活性相比，硝酸盐还原率和/或提高和/或对硝酸盐的特异性提高，例如对硝酸盐和NADH的Km降低，硝酸盐还原的速率(Vmax)提高等等。在另一个方面，NR活性包括但不限于与对照植物相比提高NUE和/或植物生产率/产量。NUE可由从土壤或培养基的氮吸收量和/或吸收速率来推断。在另一个方面，NR活性包括但不限于保持NR活性(例如与野生型NR相比)，同时通过敲除推定的丝氨酸残基(例如PPNR的Ser 561)来使翻译后调节失活，当与对照植物(例如表达野生型NR)相比被消耗时。测试NR活性的方法和技术将是本领域技术人员知道的，在2008年6月13日提交的系列号为12/138,477的美国专利申请(将其以引用方式整体并入本文)中也有描述。
本发明的多核苷酸可用于转化任何植物物种，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物在内。所关注植物物种的实例包括但不限于玉米(Zea mays)、芸苔属物种(Brassica sp.)(例如甘蓝型油菜(B.napus)、芜菁(B.rapa)、芥菜(B.juncea))，特别是可用作种子油来源的那些芸苔属物种、苜蓿(Medicagosativa)、稻(Oryza sativa)、黑麦(Secale cereale)、高粱(Sorghum bicolor，Sorghum vulgare)、稷(例如珍珠粟(Pennisetum glaucum)、黄米(Panicummiliaceum)、谷子(Setaria italica)、龙爪稷(Eleusine coracana))、向日葵(Helianthus annuus)、红花(Carthamus tinctorius)、小麦(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotiana tabacum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、落花生(Arachis hypogaea)、棉花(海岛棉(Gossypium barbadense)、陆地棉(Gossypium hirsutum))、甘薯(Ipomoea batatus)、木薯(Manihot esculenta)、咖啡(Coffea spp.)、椰子(Cocos nucifera)、菠萝(Ananas comosus)、柑橘树(Citrusspp.)、可可(Theobroma cacao)、茶(Camellia sinensis)、橡胶(Musa spp.)、鳄梨(Persea americana)、无花果(Ficus casica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica)、橄榄(Olea europaea)、木瓜(Carica papaya)、腰果(Anacardium occidentale)、澳洲坚果(Macadamia integrifolia)、杏树(Prunusamygdalus)、糖用甜菜(Beta vulgaris)、甘蔗(Saccharum spp.)、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物和针叶树。
蔬菜包括番茄(Lycopersicon esculentum)、莴苣(例如Lactuca sativa)、青豆(Phaseolus vulgaris)、利马豆(Phaseolus limensis)、豌豆(Lathyrus spp.)和黄瓜属(Cucumis)的成员如黄瓜(C.sativus)、香瓜(C.cantalupensis)和甜瓜(C.melo)。观赏植物包括杜鹃花(Rhododendron spp.)、八仙花(Macrophyllahydrangea)、朱槿(Hibiscus rosasanensis)、玫瑰(Rosa spp.)、郁金香(Tulipaspp.)、水仙花(Narcissus spp.)、矮牵牛花(Petunia hybrida)、康乃馨(Dianthuscaryophyllus)、一品红(Euphorbia pulcherrima)和菊花。
可用于实施本发明的针叶树包括例如松树，如厚皮刺果松(Pinus taeda)、沼泽松(Pinus elliotii)、美国黄松(Pinus ponderosa)、黑松(Pinus contorta)和辐射松(Pinus radiata)；黄杉(Pseudotsuga menziesii)；西铁杉(Tsuga canadensis)；北美云杉(Picea glauca)；红杉(Sequoia sempervirens)；枞树(true firs)如银枞(Abiesamabilis)和胶枞(Abies balsamea)；和雪松如西部红雪松(Thuja plicata)和阿拉斯加黄雪松(Chamaecyparis nootkatensis)。在具体的实施方案中，本发明的植物是作物植物(例如玉米、苜蓿、向日葵、芸苔、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、稷、烟草等等)。在其它实施方案中，玉米和大豆以及甘蔗植物是优选的，在另外的实施方案中玉米植物是优选的。
所关注其他植物包括提供所关注种子的谷物植物、油料种子植物和豆科植物。所关注种子包括谷物种子，如玉米、小麦、大麦、水稻、高粱、黑麦等等。油料种子植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔属植物、玉蜀黍、苜蓿、棕榈、椰子等等。豆科植物包括荚果类和豆类。豆包括瓜尔豆、刺槐豆、胡芦巴、大豆、青刀豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等。
可根据常规方式将已转化的细胞培育成植株。参见例如McCormick等人，(1986)Plant Cell Reports 5：81-84。然后可使这些植物生长，用相同的转化植株或不同的植株进行授粉，所得的子代具有所鉴定的所需表型特征的组成型表达。可培养两代或更多代以确保所需表型特性的表达得到稳定保持和遗传，然后收获种子以确保所需表型特征的表达已得到实现。以此方式，本发明提供在其基因组中稳定掺入了本发明的多核苷酸(例如本发明的表达盒)的转化种子(也称为“转基因种子”)。
参考如下非限制性实施方案可更好地理解本发明。本领域技术人员将会理解，可在不脱离本文所公开的并受权利要求书保护的发明的精神和范围的情况下实施本发明的其他实施方案。
以下实施例进一步说明本发明，其中份和百分数是以重量计，度是指摄氏度，除非另有规定。本文给出的每个参考文献的公开内容以引用方式整体并入本文。
实施例
本说明书中的所有出版物和专利申请表明了本发明所属领域的普通技能水平。所有出版物和专利申请均以引用的方式并入本文，所引用的程度就如同每个单独的出版物或专利申请被具体地和独立地指出以引用的方式并入本文一样。
已参考了各种具体的和优选的实施方案和技术描述了本发明。但是，应理解，在保持在本发明的精神和范围内的前提下可作出许多变化和修改。
实施例1：从安格斯毕赤酵母克隆酵母硝酸盐转运蛋白(YNT1)编码序 列并在巴斯德毕赤酵母中测试其功能性
根据公布的数据(Perez MD等人，Biochem.J.，(1997)15：397-403)将PCR用于从安格斯毕赤酵母基因组DNA获得YNT1基因的编码序列，在5′-和3′端分别具有BamH I和EcoRI限制性位点。将该片段克隆进pCR-BluntTOPO载体中以用于测序。使用在先锋国际良种公司(Pioneer Hi-Bred Int′l)开发的巴斯德毕赤酵母系统(系列号为12/136,173的美国专利申请)验证YNT1的功能性。使用具有正确序列的克隆通过BamHI和EcoRI位点制备酵母表达载体pGAPZA-YNT1。将携带p3.5GAP-YNR1(由整合进His4基因座中的pGAP启动子驱动的酵母硝酸盐还原酶)的巴斯德毕赤酵母株KM71(Invitrogen)通过用pGAPZA-YNT1整合进pGAP启动子区中进行转化，以产生同时携带YNT1和YNR1基因表达盒的KM71株。通过体内硝酸盐吸收测定法(系列号为12/136,173的美国专利)鉴定功能性转化体。
实施例2：巴斯德毕赤酵母中的YNT1 DNA改组和功能筛选
通过掺入来自现有真菌和植物高亲和力硝酸盐转运蛋白基因的寡核苷酸掺杂多样性(oligo spiked diversities)来构建多轮YNT1改组文库。野生型的和改组的YNT1变体的表达处于巴斯德毕赤酵母启动子(pYPT)的控制下。(GenBank登录号为AF027960)将该改组的文库转化进巴斯德毕赤酵母宿主中，在该宿主中YNR(巴斯德毕赤酵母硝酸盐还原酶)得到表达。(GenBank登录号为Z49110)掺入YNR将使得硝酸盐能转化为亚硝酸盐。可通过称为Griess反应的比色测定法定量亚硝酸盐。使用Griess反应针对完整细胞悬浮液的硝酸盐吸收活性增强对来自改组文库的变体进行筛选。通过三轮的改组和筛选，我们鉴定了具有显著增强的硝酸盐吸收活性的几个变体(最高达5倍，见图5)。
野生型的和改组的NT变体中的硝酸盐吸收动力学比较-将野生型NT和四种改组NT变体的毕赤酵母转化株在30℃下在基本培养基(MD：1.34％的来自Qbiogen的酵母氮源基础以及2％葡萄糖和4×10-5％生物素)中培养过夜。将该酵母细胞用水洗涤两次，并以二分之一的最初培养物体积再次悬浮于20mM MOPS(3-(N-吗啉代)丙磺酸)、1％葡萄糖pH 6.5中。根据600nm下的光学密度将细胞密度进行归一化。通过将50μL悬浮的细胞与50μL硝酸钠溶液(用上述MOPS缓冲液制备)合并并在室温下振荡温育30分钟或更长时间，来在96孔v底板进行吸收测定法。通过得自Promega(Madison，MI)的Griess试剂盒按照生产商的说明书测定亚硝酸盐浓度。用UV-max板分光光度计(Molecular Device，Sunnyvale，CA)测量最终反应物在545nm下的光密度。
实施例3：修饰YNT1R3FS编码序列以用于玉蜀黍表达
为了增强在玉蜀黍中的表达潜力，将变体YNT1R3FS编码序列之一的密码子进行优化。去除稀有密码子。将GC组成定为少于60％，优选少于54-58％，在开放阅读框的长度上相对较均匀地分布。同时，去除了几个不需要的特征，包括隐蔽型内含子供体或受体位点、RNA不稳定性位点、长同源碱基段和不需要的限制酶在内。该玉蜀黍密码子优化的YNT1R3FS(YNT1R3FS MO)的序列在SEQ ID NO：9中示出。简而言之，通过标准克隆技术制备由根偏好启动子例如ZM-RM2启动子和BSV(TR)启动子驱动的YNT1R3FS MO的玉蜀黍表达构建体。
实施例4：植物表达载体的制备
对于各YNT1变体产生了由不具有ADHI内含子的玉蜀黍ZM-RM2启动子(较弱的启动子)和具有ADHI内含子的玉蜀黍ZM-RM2启动子(较强的启动子)驱动的两种表达载体用于良种玉蜀黍系转化。它们是PHP32096、32097、32098、32099、32101、32103、3210373和32374。产生了更多的由不同启动子驱动的YNT1R3FS的构建体用于玉蜀黍转化。它们为PHP40510(BSV(TR):ADHI内含子：YNT1R3FS)和PHP(BAV(FL):YNT1R3FS)。
还产生了数种含有YNTR3FS MO的构建体用于玉蜀黍转化。它们为PHP35503(ZM-RM2:ADHI内含子：YNT1R3FS)、PHP40509(BSV(TR):ADHI内含子：YNT1R3FS)和新的PHP(BAV(FL):YNT1R3FS)。将制备包含用于改善氮吸收和同化的硝酸盐转运蛋白基因YNT1R3FS和硝酸盐还原酶基因PPNR A551G的堆叠构建体用于良种品系转化以证明该设想。
实施例5：用NT进行农杆菌介导的玉蜀黍转化
基本上如Zhao等人，Meth.Mol.Biol.318：315-323(2006)描述的进行农杆菌介导的玉蜀黍转化(还可参见Zhao等人，Mol.Breed.8：323-333(2001)和1999年11月9日公布的美国专利No.5,981,840，以引用方式并入本文中)。转化过程涉及细菌接种、共培养、静息、选择和植物再生。
1.未成熟胚制备
从颖果切取不成熟胚并将其放在装有2mL PHI-A培养基的2mL微型管中。
2.胚的农杆菌感染和共培养
2.1感染步骤
用1mL微量移液器移除PHI-A培养基并添加1mL农杆菌悬浮液。将管轻轻地倒转进行混合。将混合物在室温下温育5分钟。
2.2共培养步骤
用1mL微量移液器从感染步骤移除农杆菌悬浮液。使用无菌刮刀，将胚从管刮脱并转移至100×15mm培养皿中的PHI-B培养基平板。将胚以胚轴向下定向在培养基的表面上。将带有胚的平板在黑暗中20℃下培养3天。L-半胱氨酸可用于共培养阶段。对于标准双元载体，提供有100-400mg/L L-半胱氨酸的共培养培养基对回收稳定的转基因事件是关键的。
3.推定的转基因事件的选择
向100×15mm平皿中的每个PHI-D培养基板转移10个胚，保持取向，用石蜡膜(Parafilm)将平皿密封。将各平板在黑暗中于28℃温育。活跃生长的推定事件预计在6-8周可见，为浅黄色胚性组织。不产生事件的胚可能是褐色的并且坏死，极少看到脆性组织生长。取决于生长速率，以2-3周的间隔将推定的转基因胚性组织分培至新鲜的PHI-D平板。记录事件。
4.T0植株的再生
在100×25mm培养皿中将PHI-D培养基上繁殖的胚性组织分培至PHI-E培养基(体细胞胚成熟培养基)并在黑暗中于28℃下温育，直至体细胞胚成熟，持续约10-18天。将具有明确盾片和胚芽鞘的单独的成熟体细胞胚转移至PHI-F胚萌发培养基并在光照(约80μE，来自冷白色荧光灯或等同的荧光灯)下于28℃下温育。在7-10天后，将再生的植株(约10cm高)盆栽于园艺混合物(horticultural mix)中并用标准的园艺方法使之茁壮。
用于植物转化的培养基
1.PHI-A：4g/L CHU基础盐、1.0mL/L 1000X Eriksson维生素混合物、0.5mg/L盐酸硫胺素、1.5mg/L 2，4-D、0.69g/L L-脯氨酸、68.5g/L蔗糖、36g/L葡萄糖，pH 5.2。在使用前添加100μM乙酰丁香酮，过滤灭菌。
2.PHI-B：无葡萄糖的PHI-A，增加2，4-D至2mg/L，减少蔗糖至30g/L，补加0.85mg/L硝酸银(过滤灭菌)、3.0g/L脱乙酰吉兰糖胶(gelrite)、100μM乙酰丁香酮(过滤灭菌)，5.8。
3.PHI-C：无脱乙酰吉兰糖胶的PHI-B和乙酰丁香酮，减少2，4-D至1.5mg/L，补加8.0g/L琼脂、0.5g/L Ms-吗啉乙磺酸(MES)缓冲剂、100mg/L羧苄西林(过滤灭菌)。
4.PHI-D：补加3mg/L双丙氨膦的PHI-C(过滤灭菌)。
5.PHI-E：4.3g/L的Murashige和Skoog(MS)盐(Gibco，BRL 11117-074)、0.5mg/L烟酸、0.1mg/L盐酸硫胺素、0.5mg/L盐酸吡哆辛、2.0mg/L甘氨酸、0.1g/L肌醇、0.5mg/L玉米素(Sigma目录号为Z-0164)、1mg/L吲哚乙酸(IAA)、26.4μg/L脱落酸(ABA)、60g/L蔗糖、3mg/L双丙氨膦(过滤灭菌)、100mg/L羧苄西林(过滤灭菌)、8g/L琼脂，pH 5.6。
6.PHI-F：无玉米素、IAA、ABA的PHI-E；蔗糖减少至40g/L；用1.5g/L脱乙酰吉兰糖胶代替琼脂；pH 5.6。
可通过首先将组织簇转移至补充有0.2mg/L 2，4-D的N6培养基来从转基因愈伤组织再生植株。两个星期后，可将组织转移至再生培养基(Fromm等人，(1990)Bio/Technology 8：833-839)。
可进行对转基因T0植株和T1植株的表型分析。
可分析T1植株的表型变化。使用图像分析，可分析T1植株在植株面积、体积、生长速率方面的表型变化，且在植株生长过程中的多个时间进行颜色分析。可如本文所述测定根构型的改变。
随后可分析农艺特性的变化，以确定含有本文所述的NT变体多核苷酸的植株与不含该NT变体多核苷酸的对照(或参照)植株相比，是否有至少一个农艺特性改进。还可在各种环境条件下研究这些改变。
含有该NT变体多核苷酸并导致根或苗生物量显著改变、绿颜色改善、花期穗更大或产量更高的表达构建体，将被认为是该NT变体多核苷酸在玉蜀黍中起到改变氮利用效率或硝酸盐吸收的作用的证据。
实施例6：采用粒子轰击法用NT转化玉蜀黍(假想实施例)
可将玉蜀黍植株转化以表达或过表达本文所述的NT变体多核苷酸以便检查所得的表型。
该基因在玉蜀黍中的表达可处于组成型启动子如玉蜀黍泛素启动子(Christensen等人，Plant Mol.Biol.12：619-632(1989)和Christensen等人，Plant Mol.Biol.18：675-689(1992))的控制下。
然后可通过以下程序将以上所述的重组DNA构建体引入玉蜀黍细胞中。可从由玉蜀黍近交系H99和LH132的杂交得到的发育中的颖果切取玉蜀黍不成熟胚。在授粉后十到十一天在胚达到1.0-1.5mm长时将胚分离。然后将胚以轴侧朝下放置接触琼脂糖固化的N6培养基(Chu等人，Sci.Sin.Peking 18：659-668(1975))。将胚在27℃下保持在暗处。从这些不成熟胚的盾片增生出由未分化的细胞团组成的脆性胚性愈伤组织，在胚柄结构上具有体细胞原胚状体和胚状体。从原代外植体分离的胚性愈伤组织可在N6培养基上进行培养并每隔两到三周在此培养基上分培。
可将质粒p35S/Ac(获自Peter Eckes博士，Hoechst Ag，德国法兰克福)用于转化实验以提供选择性标志物。此质粒含有编码草胺膦乙酰转移酶(PAT)的pat基因(参见欧洲专利公布0 242 236)。PAT酶赋予对除草的谷氨酰胺合成酶抑制剂如草胺膦的抗性。p35S/Ac中的pat基因处于来自花椰菜花叶病毒的35S启动子(Odell等人，Nature 313：810-812(1985))和来自根瘤农杆菌的Ti质粒的T-DNA的胭脂氨酸合酶基因的3′区的控制下。
可使用粒子轰击方法(Klein等人，Nature 327：70-73(1987))将基因转移至愈伤组织培养细胞。根据该方法，用以下技术给金粒子(直径1μm)包被上DNA。将10μg质粒DNA加至50μL的金粒子悬浮液(60mg/mL)。将氯化钙(50μL的2.5M溶液)和亚精胺游离碱(20μL的1.0M溶液)添加至该粒子。在加入这些溶液的过程中将悬浮液旋涡混合。十分钟后，将管子稍作离心(15,000rpm下5秒)，除去上清液。将粒子重悬于200μL的无水乙醇中，再次离心，除去上清液。再次进行乙醇清洗，将粒子重悬于最终体积30μL的乙醇中。可将包被DNA的金粒子的等分试样(5μL)置于KaptonTM飞碟(flying disc)(Bio-Rad Labs)的中央。然后用PDS-1000/He(Bio-Rad Instruments，Hercules CA)，以1000psi的氦压力、0.5cm的间隙距离和1.0cm的飞行距离，将粒子加速进玉蜀黍组织中。
为了进行轰击，将胚性组织置于覆盖琼脂糖固化的N6培养基的滤纸上。将组织安排成稀草坪(thin lawn)，覆盖大约直径5cm的圆形区域。可将含有组织的培养皿放在PDS-1000/He的腔室中，离终止屏大约8cm。然后将腔室中的空气抽真空至28英寸Hg。使用可裂膜(rupture membrane)以氦冲击波将该巨载体进行加速，该膜在冲击管中的氦压力达到1000psi时破裂。
在轰击后七天，可将组织转移至含有双丙氨膦(5mg/l)而缺乏酪蛋白或脯氨酸的N6培养基。组织在此培养基上继续缓慢生长。再过两个星期，可将组织转移至含有双丙氨膦的新鲜N6培养基。六个星期后，可在一些含有补加了双丙氨膦的培养基的板上鉴定到直径约1cm的活跃生长的愈伤组织区域。这些愈伤组织当在选择性培养基上分培时可继续生长。
可通过首先将组织簇转移至补充有0.2mg/L 2，4-D的N6培养基来从转基因愈伤组织再生植株。两个星期后，可将组织转移至再生培养基(Fromm等人，Bio/Technology 8：833-839(1990))。可再生出转基因T0植株并按照HTP程序确定它们的表型。可收集T1种子。
可使T1植株生长并分析表型变化。可使用图像分析来定量以下参数：植株面积、体积、生长速率，可收集颜色分析并进行定量。与合适的对照植株相比导致了根构型或以上所列农艺特性中的任何一者的改变的表达构建体，可认为是该NT变体多核苷酸在玉蜀黍中起到改变根构型或植株构型的作用的证据。
此外，含有本文所述的NT变体多核苷酸的重组DNA构建体可通过直接转化引入到玉蜀黍株系中，或者通过从单独转化的株系渗入(introgression)来引入到玉蜀黍系中。
转基因植株，无论是近交的还是杂交的，都可进行更严酷的大田实验，以在各种环境条件下(例如营养物和水可获得性的变化)研究根或植株构型、产量提升和/或根倒伏抗性。
随后还可进行产量分析以确定含有NT变体多核苷酸的植株与不含NT变体多核苷酸的对照(或参考)植株相比是否有产量性能的改进。含有NT变体多核苷酸的植株相对于对照植株而言会改善产量，优选在不利的环境条件下产量损失减少50％，或者在不同的环境条件下相对于对照植株而言会具有提高的产量。
实施例7：根瘤农杆菌LBA4404的电穿孔(假想实施例)
将电穿孔感受态细胞(40μL)如根瘤农杆菌LBA4404(含有PHP10523)在冰上解冻(20-30分钟)。PHP10523含有供进行T-DNA转移的VIR基因、农杆菌低拷贝数质粒复制起点、四环素抗性基因和用于体内DNA生物分子重组的cos位点。同时，将电穿孔杯(electroporation cuvette)在冰上冷冻。将电穿孔仪设置调整为2.1kV。
将DNA等分试样(0.5μL JT(US 7,087,812)亲本DNA，浓度为0.2μg-1.0μg，在低盐缓冲液或双蒸H2O)中与解冻了的、仍在冰上的农杆菌细胞进行混合。将混合物转移到电穿孔杯的底部并在冰上静置1-2分钟。按Eppendorf电穿孔仪2510的“Pulse”按键两次(理想地实现4.0毫秒(msec)脉冲)将细胞进行电穿孔。随后将0.5ml 2xYT培养基(或SOC培养基)添加至电穿孔杯并转移至15ml Falcon管。将细胞在28-30℃、200-250rpm下温育3小时。
将250μL等分试样涂布至#30B(YM+50μg/mL壮观霉素)平板上，在28-30℃下温育3天。为增加转化体的数目，可进行以下两个任选的步骤之
选项1：用30μl 15mg/ml利福平覆盖平板。LBA4404具有针对利福平的染色体抗性基因。这个额外的选择消除了当使用较差的LBA4404感受态细胞制备物时所观察到的某些污染性菌落。
选项2：该电穿孔重复进行两次，以补偿较差的电感受态细胞。
转化体的鉴别：
挑选四个独立菌落并划线接种于AB基本培养基加50mg/mL壮观霉素平板(#12S培养基)以分离单一菌落。将平板在28℃下温育2-3天。
对每一推定的共整合子挑选单个菌落并接种4ml具有50mg/l壮观霉素的#60A。将混合物在28℃下振荡温育24小时。用Qiagen Miniprep从4ml培养物分离质粒DNA，任选用PB洗涤。将DNA在30μL中洗脱。将2μL等分试样用于如上所述对20μL的DH10b+20μL的双蒸H2O进行电穿孔。
任选地，可将15μl等分试样用于转化75-100μl InvitrogenTM LibraryEfficiency DH5α。将细胞铺展于LB培养基加50mg/mL壮观霉素平板(#34T培养基)上，并在37℃下温育过夜。
对每种推定的共整合子挑选三至四个独立的菌落并接种4ml具有50μg/ml壮观霉素的2xYT(#60A)。将细胞在振荡下在37℃下温育过夜。
用
Figure BPA00001514709400741
Miniprep从4ml培养物分离质粒DNA，任选进行PB洗涤(在50μl中洗脱)，并将8μl用于SalI消化(将JT亲本和PHP10523用作对照)。对代表2种具有正确Sall消化模式(使用亲本DNA和PHP10523作为对照)的推定共整合子的4个质粒，使用限制性内切酶BamHI、EcoRI和HindIII再进行三次消化。为了比较，推荐电子凝胶(electronic gel)。
实施例8：采用吸收测定法在拟南芥中进行转基因植株评价
将野生型和改组YNT变体克隆进处于pTUB启动子(一种根偏好的拟南芥启动子)控制下的拟南芥表达载体(pMAXY5295)中。按照标准的农杆菌转化，恢复了多个事件。
简言之，将含有pTUB:YNT1的构建体转化进根瘤农杆菌菌株C58中，在LB中在25℃下生长至OD600～1.0。然后将细胞离心沉淀，重悬于等体积的5％蔗糖/0.05％ Silwet L-77(OSI Specialties，Inc)中。在抽苔早期，将土壤培育的拟南芥生态型Col-0浸入农杆菌悬浮液中。然后让植株正常结籽。将所得的T1种子播在土壤上，通过使T1种子生长在具有卡那霉素的培养基上选择转基因籽苗。将抗性籽苗移植到土壤中。从抗卡那霉素选择的T1平板收集T2植株。收集T2种子。
通过RT-PCR和蛋白质印迹分析来分析转基因的存在。使用2007年7月3日提交的系列号为12/166,473的美国专利申请中详细说明的方案，对那些转化体事件进行基于pH染料的硝酸盐吸收籽苗测定。来自pTUB-YNT1-R3FS构建体的多个事件(8个中有3个)证明与野生型YNT构建体的硝酸盐吸收相比，硝酸盐吸收有统计学上显著的提升。
实施例9：在GS3 x Gaspe中进行低硝酸盐测定法以确定苗和穗干重 (假想实施例)
转基因植物将含有两或三剂量的带一剂量GS3的Gaspe Flint-3(GS3/(Gaspe-3)2X或GS3/(Gaspe-3)3X)并对显性转基因1∶1分离。
将转基因GS3xGaspe T1种子种植在装有Turface的4英寸盆中，用含有1mM硝酸盐作为唯一氮源的营养溶液(表5)浇灌2周。
表5.营养溶液
  营养物   浓度
  KNO3   1mM
  KCl   3mM
  MgSO4   2mM
  CaCl2   2mM
  KH2PO4   0.5mM
  螯合离子   8.3g 100l-1
  MnSO4   0.5μM
  ZnSO4   0.5μM
  H3BO4   1.5μM
  CuSO4   0.05μM
  H2MoO4   0.05μM
将PHP32103(ZM-RM2:ADHI内含子：YNT1R3LS变体)、PHP32097(ZM-RM2:YNT1R2C7变体)和PHP32099(ZM-RM2:YNT1R3LS变体)的三个转基因以及它们各自的无效对照在各自的地块栽培。请指明这些变体中哪一个与上面的PHP号：YNT1-R2AL、YNT1R2C7、YNT1R3FS或YNT1R3LS对应。
每天更换营养物4次，以保持恒定的营养物浓度。在出土后，对植株取样以确定哪些是转基因的，哪些是无效的。在花期，收获植株并在70℃炉中干燥72小时，测定苗和穗的干重。计算转基因平均值并与总平均值、地块平均值和它们各自的无效对照平均值进行比较(参加下面的表6)。对照植株在1mM KNO3培养基中培养。进行统计分析以确定各处理之间观察到的差异是否显著。花期生物量和穗大小的改善表示氮耐受性增加。
实施例10：进行温室低硝酸盐测定法以确定根干重、苗干重、根/苗 比、总植株重量、总氮浓度和总植株氮
将转基因T1/T2植株在含有1mM硝酸盐作为唯一氮源的营养培养基(表5)中栽培2周。2周后，收获植株，测定根干重、苗干重、根/苗比、总植株重量、总氮浓度和总植株氮。用最近邻分析对数据进行分析以评估方差。将转基因平均值与实验总平均值、与地块平均值(在所讨论的平均值从地块平均值估计值除去之后)和与相应的转基因无效对照平均值进行比较。表6-8示出了将转基因平均值与相应的无效对照平均值比较的T检验概率。T检验概率为0.1或更小的任何平均值在表中列出，而T检验概率大于0.1的任何数值列为不显著(NS)。转基因平均值的T检验概率大于无效对照平均值以星号(*)指明。这里汇总了来自PHP32103(ZM-RM2：ADHI内含子：YNT1R3LS变体)、PHP32097(ZM-RM2:YNT1R2C7变体)和PHP32099(ZM-RM2:YNT1R3LS变体)的数据：
表6.PHP32103的GH LN测定
Figure BPA00001514709400761
表7.PHP32097的GH LN测定
Figure BPA00001514709400763
Figure BPA00001514709400771
表8.PHP32099的GH LN测定
Figure BPA00001514709400773
Figure BPA00001514709400774
实施例11：在氮胁迫和常氮条件下进行田地试验以确定含有NT变体 转基因的事件的谷粒产量、开花时间和持绿性
将含有转基因的玉米杂种在氮胁迫和常氮条件下在田地中的三个地点种植。在常氮下，以尿素硝酸铵(UAN)的形式施加总共250磅的氮。通过在不添加氮的情况下种植玉米两年耗竭土壤氮储备来实现氮胁迫。监测土壤硝酸盐储备来评估耗竭水平。为实现目标胁迫水平，在V2和VT之间通过加肥灌溉或一侧施肥施加UAN达总共50-150磅氮。
将来自构建体的事件与无效事件套种在一起以使田地变化的空间效应减至最低；在低氮中种植了6个重复，在常氮中种植了4个重复。将含有转基因的事件的谷粒产量与转基因无效事件的产量进行比较。还监测了开花时间和持绿性。进行统计分析来评估与转基因无效对照相比产量是否存在显著改善，行和列的空间效应考虑在内。
从这三个地点所得的PHP32101(ZM-RM2:ADHI内含子：YNT1R3FS)的相对于无效事件的产量数据汇总于图1(常氮下)和图2(低氮下)中。
实施例12：在氮限制条件下筛选候选基因(假想实施例)
对于通过选择性标志物的存在而选出的转基因种子，还可筛选它们在氮限制条件下生长的耐受性。将表达本文所述的NT的转基因个体接种在低氮培养基(0.5x无氮Hoagland’s、0.4mM硝酸钾、0.1％蔗糖、1mM MES和0.25％ PhytagelTM)上，使得在一个平板上有32个转基因个体在32个野生型个体旁边生长。在第10、11、12和13天对植株进行评估。如果某个株系与对照相比显示统计学上显著的差异，则认为该株系是经验证的氮缺陷耐受株系。在遮盖平板图像以去除背景颜色后，对每个个体收集两个不同的测量值：总莲座型叶丛面积(total rosetta area)和落入绿颜色仓(green color bin)的颜色的百分数。使用色调、饱和度、亮度数据(HIS)，绿颜色仓由色调50-66组成。总莲座型叶丛面积用作植物生物量的度量，而绿颜色仓已被剂量响应研究证实为氮同化的指标。
实施例13：进行筛选以鉴定具有改变了的根构型的品系(假想实施 例)
可将在非氮限制条件下生长的拟南芥籽苗与早期发育过程中的对照籽苗进行比较，以分析改变了的根系构型。
将得自本公司内筛选的转基因NT变体籽苗进行垂直板测定，以评估增强了的根生长。结果用如下所述的进行验证。T2种子用50％家用漂白剂.01％ triton X-100溶液进行灭菌，然后接种在含有以下培养基的平板上：0.5x无氮Hoagland’s、60mM KNO3、0.1％蔗糖、1mM MES和1％PhytagelTM，密度为4颗种子/板。将各板在4℃下保持三天以对种子进行层积处理(stratify)，然后在22℃光照和20℃黑暗下垂直保持11天。光周期为16小时；8小时黑暗，平均光强度为～160μmol/m2/s。将各板垂直放入具有10个板的架子的八个中央位置，第一个和最后一个位置放空白板。每隔一天旋转架子和架子内的板。对每个板拍两组照片。第一组照片是在第1 4-16天拍摄，此时大多数株系的初生根达到板的底部，第二组照片是在两天后更多侧根发育后拍摄。后一组照片通常用于进行数据分析。用
Figure BPA00001514709400791
软件(Regent Instruments Inc)分析这些在垂直板上生长的籽苗的根生长情况，该软件是一种专门设计用来进行根的测量的图像分析系统。
Figure BPA00001514709400792
使用像素对比度来将浅色根与较深色的背景相区分。为在不拾取背景的情况下鉴定到最大数量的根，像素分级为150-170，使用过滤特征来除去长宽比小于10.0的目标。各板上被分析的区域是从植物叶的边缘至离板底部约1cm处。使用完全相同的
Figure BPA00001514709400793
设置和分析区域来分析一个批次内的所有板。将
Figure BPA00001514709400794
给某板赋予的总根长度分数除以萌发并向下生长至板的一半处的植株的数目。每个株系生长八个板，将它们的分数取平均值。然后将这个平均值与同时生长的含有野生型种子的八个板的平均值进行比较。
具有增强的根生长特性的株系预期位于根面积分布的上端。使用滑窗方法来评估给定的架子的根面积的方差，假定该架子最多可有两个离群值(outlier)。各个因素的环境变化，包括生长培养基、温度和湿度在内，可造成根生长的显著变化，特别是在播种日期之间。因此，将各株系按播种日期和架层(shelf)进行分组以进行数据分析。然后按平均根面积对特定的播种日期/架层组中的架子进行分类。通过将某架子的数据ri与下一层架子的数据(ri-1和上一层架子的平均根面积ri+1进行组合，执行滑窗的根面积分布。
然后使用Grubbs型方法(Barnett等人，Outliers in Statistical Data，JohnWiley & Sons，第3版(1994)对组合的分布的方差进行分析以鉴定ri中的离群值。
实施例14：NUE测定植物生长(假想实施例)
将拟南芥(对照和转基因品系)Columbia生态型的种子进行表面灭菌(Sánchez等人，2002)，然后接种到含有0.8％(w/v)Bacto-Agar(Difco)的Murashige和Skoog(MS)培养基上。将平板4℃下黑暗中温育3天以打破休眠(层积)，随后转移至20℃下处于16小时光照/8小时黑暗周期的生长室(Conviron，Manitoba，Canada)。平均光强度为120μE/m2/s。使籽苗生长12天，然后转移至土壤盆。将盆栽的植株如上所述在生长室中在各个1.5英寸盆(拟南芥系统；Lehle Seeds，Round Rock，TX，USA)中在无营养物的土壤LB2 Metro-Mix 200(Scott’s Sierra Horticultural Products，Marysville，OH，USA)上生长。给植物浇注基于Murashige和Skoog(无氮MS)培养基的营养溶液中的0.6或6.5mM硝酸钾。相对湿度保持在70％左右。16-18天后，收集植株苗进行生物量和SPAD读数的评价。能改进NUE的植株在高或低硝酸盐浓度下都可具有改善的生物量。
实施例15：蔗糖生长测定法(假想实施例)
拟南芥的Columbia系获自拟南芥生物资源中心(Arabidopsis BiologicalResource Center(Columbus，OH))。对于早期分析(Columbia和T3转基因株系)，将种子用70％乙醇进行表面灭菌5分钟，然后用40％Clorox进行表面灭菌5分钟，用无菌去离子水清洗。将经表面灭菌的种子播到含有95mL无菌培养基的方形培养皿(25cm)上，该培养基的组成为：0.5 Murashige和Skoog(1962)盐(Life Technologies)和4％(w/v)phytagel(Sigma)。该培养基不含补充的蔗糖。将蔗糖以0.1％、0.5％和1.5％浓度添加至培养基。将各板垂直安排在塑料架子中，在4℃冷室中放置3天以使萌发同步。然后将具有经冷层积处理的种子的架子转移至生长室(Conviron，Manitoba，Canada)，日温和夜温分别为22和20℃。在从冷室移走(播种后3天)开始直到在第14天收获籽苗，在16小时光周期发育过程中将莲座型叶丛水平上(at the levelof the rosette)的平均光强度保持在110mol/m2/sec1。拍取图像，测量根和苗的总鲜重。将进行两个实验。如果本文所述的NT变体多核苷酸的表达或过表达改变碳和氮平衡，则数据可表明该NT变体多核苷酸过表达转基因植株与野生型拟南芥相比在不同的蔗糖浓度下根生物量和/或叶生物量增加或降低。
实施例16：用本文描述的NT变体多核苷酸转化Gaspe Flint衍生的玉 蜀黍系(假想实施例)
可如实施例4-6中所述转化玉蜀黍系，并过表达NT(例如使用本文所述的那些)以检验所得的表型。包括但不限于微管蛋白启动子(pTUB)、玉蜀黍泛素启动子(ZM UBI)、玉蜀黍根金属硫蛋白启动子(ZM-RM2)、脂质转移蛋白2启动子(LTP2)、香蕉条纹病毒启动子截短型启动子(BSV(TR))、玉蜀黍NAS2启动子(ZM-NAS2)和香蕉条纹病毒启动子(全长型)(BAV(FL)及其它启动子在内的启动子可用于引导NT在玉蜀黍中的表达。此外，多种终止子，例如但不限于PINII终止子，可用于实现所关注基因在Gaspe Flint衍生的玉蜀黍系中的表达。
受体植物
受体植物细胞可来自生活周期短(快速循环)、大小降低且转化潜力高的一致的玉蜀黍株系。对于玉蜀黍而言典型的这些植物细胞是来自任何可公开获得的Gaspe Flint(GF)株系品种的植物细胞。一种可能的候选植物株系品种是Tomes等人的美国专利申请公开No.2003/0221212中公开的GF×QTM(快速周转玉蜀黍，一种可公开获得的Gaspe Flint形式，被选择用于在温室条件下生长)的F1杂种。从这个株系获得的转基因植株其大小减小，使得它们可在四英寸盆中生长(为正常大小的玉蜀黍植株所需的空间的1/4)并不到2.5个月就成熟。(传统上，一旦转基因植株适应了温室，需要3.5个月才能获得转基因T0种子。)另一个合适的株系是GS3(高度可转化的株系)X Gaspe Flint的双单倍体株系。再另一个合适的株系是携带会造成开花早、株高降低或者同时造成这两方面的转基因的可转化良种近交系。
转化方案
任何合适的方法都可用于将转基因引入玉蜀黍细胞中，包括但不限于如实施例3中所述的使用基于农杆菌的载体的接种型方法。可在受体(目标)植株的不成熟胚上进行转化。
精确生长和植株跟踪
使用改进的随机区组设计，将从转化的玉蜀黍胚得到的转基因(T0)植株的事件群体(event population)在受控的温室环境中生长，以减少或消除环境误差。随机区组设计是植株布局，其中将实验植株分成组(例如每组三十棵植株)，这些组成为“区组”，每棵植株随机分配区组的位置。
对于一组三十棵植株，将二十四棵转化的实验植株和六棵对照植株(具有规定的表型的植株)(统称“复制组”)放在各盆中，将这些盆在位于温室内的桌子上排成阵列(即复制组或区组)。每棵植株，无论是对照植株还是实验植株，都随机分配区组的位置，其被定位到独特的物理温室位置以及到复制组。多个三十棵植株的复制组各自可在单个实验中在相同的温室中生长。应确定各复制组的布局(安排)以使空间需求以及温室内的环境效应减至最低。这种布局可称为压缩的温室布局。
代替加入特定的对照组的一种方式是鉴定那些不表达所关注基因的转基因植株。有多种技术如RT-PCR可应用于定量评估所引入的基因的表达水平。可将不表达转基因的T0植株与那些表达转基因的T0植株进行比较。
鉴定事件群体中的每棵植株并在整个评估过程中进行跟踪，将从该植株收集的数据自动地与该植株建立关联，使得收集的数据可与该植株携带的转基因建立关联。例如，每个植株容器可具有机器可读标签(如通用产品代码(UPC)条形码)，该标签包括关于植株身份的信息，而该信息又与温室位置相关，使得从植株获得的数据可自动地与该植株建立关联。
或者，可使用任何有效的机器可读植物识别系统，如二维矩阵码或甚至射频识别标签(RFID)，其中数据由射频接收器/处理器接受和解析。参见公布的美国专利号2004/0122592(将其以引用方式并入本文)。
使用三位成像技术进行表型分析
对T0事件群体中的每棵温室植株(包括任何对照植株在内)分析所关注农艺特性，并记录或保存每棵植株的农艺数据，使得该数据与该植株的识别数据(见上)建立关联。可用与以上所述类似的实验设计，在T1代中完成对表型(基因效应)的确认。
在植物的整个温室生活周期内，使用定量的非破坏性成像技术在表型水平上对T0植株进行分析，以评估所关注性状。优选地，使用数字成像分析仪来对全体植株进行自动多维分析。成像可在温室内进行。使用两个照相机系统(位于顶部和侧面)及植株旋转装置从所有侧面对植株进行观察和成像。从每棵植株的顶部、前部和侧面获取图像。所有三个图像一起提供足够的信息以评估每棵植株的生物量、大小和形态。
由于从第一片叶自土壤长出的时间到植株处于其发育末期的时间植株的大小有变化，因此植物发育的早期阶段最好用较高的放大倍数从顶部记录。这可通过使用完全由成像软件控制的机动化变焦透镜系统来实现。
在单个成像分析操作中，出现以下事件：(1)将植株传输到分析仪区域内，旋转360度使得可读取其机器可读标签，然后让其静放直到其叶停止运动；(2)获取侧面图像并输入数据库；(3)将植株旋转90度，再次让其静放直到其叶停止运动；和(4)将植株转运出分析仪。
每二十四小时周期给植株至少六小时黑暗，以具有正常的日/夜周期。
成像仪器
任何合适的成像仪器都可使用，包括但不限于可从LemnaTec GmbH(德国Wurselen)市售获得的光谱数字成像仪器。用具有1/2″ITProgressive Scan IEE CCD成像装置的LemnaTec Scanalyzer HTS LT-0001-2获取图像并进行分析。成像照相机可装备有自动变焦、自动光圈和自动对焦。所有照相机设置均用LemnaTec软件作出。优选地，成像分析仪的仪器方差对于大构成(major component)而言小于约5％，对于小构成(minorcomponent)而言小于约10％。
软件
成像分析系统包括用于颜色和构型分析的LemnaTec HTS Bonit软件程序和用于保存来自约500,000个分析的数据(包括分析日期在内)的服务器数据库。将原始的图像和经分析的图像一起保存以让使用者能按需进行尽可能多的再分析。可将数据库连接到成像硬件以进行自动数据收集和保存。有多种市售的软件系统(例如Matlab及其它)可用于对成像数据进行定量解析，任何这些软件系统都可应用于图像数据集。
传输系统
可使用具有植物旋转装置的传输系统来将植物转运到成像区域并在成像过程中将其旋转。例如，将最多四棵植株(每棵最大高度为1.5m)装载到车上，该车在循环的传输系统上行进经过成像测量区域。在这个情况中，组件(成像分析仪和传输环)的总占地面积为约5m×5m。
可将传输系统放大以一次容纳更多的植株。植株与传输环一起被转运到成像区域并每棵植株分析最多50秒。获取植株的三个视图。传输系统以及成像设备应能够用于温室环境条件。
照明
任何合适的照明方式都可用于图像采集。例如，可采用在黑色背景上的顶光。或者，可采用使用白色背景的顶光和背光组合。照明区域应关在房屋里以确保恒定的照明条件。房屋应比测量区域长，使得不需要开门关门就存在恒定的光条件。或者，可改变照明以造成转基因荧光团(例如绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP))或内源荧光团(例如叶绿素)的激发。
基于三维成像的生物量估计
为很好地估计生物量，应从至少三个轴获取植物图像，优选顶部和两侧(侧面1和2)视图。然后分析这些图像以将植株与背景、盆和花粉对照袋(如适用的话)分开。植株的体积可通过以下计算来估计：
Figure BPA00001514709400841
在以上公式中，体积和面积的单位是“任意单位”。任意单位完全足以检测这个系统中基因对植株大小和生长的效应，因为所需要的是检测与实验平均值或对照平均值的差异(正差异(更大)和负差异(更小))。可通过给成像过程加入物理参照物，将大小(例如面积)的任意单位容易地(trivially)转换成物理测量。例如，可在顶部和侧面成像过程中包括已知面积的物理参照物。基于这些物理参照物的面积，可确定换算系数以便于从像素换算成面积单位如平方厘米(cm2)。物理参照物可以是或不是独立的样品。例如，具有已知的直径和高度的盆可充当恰当的物理参照物。
颜色分类
成像技术还可用于测定植株颜色并将植株颜色指派到各种颜色类别。将图像颜色指派到颜色类别是LemnaTec软件的固有特征。对于其他图像分析软件系统，可通过多种计算方法确定颜色分类。
为测定植株大小和生长参数，有用的分类方案是定义简单的颜色方案，其包括两个或三个色度的绿色，另外如果出现萎黄病、坏死和脱色情况的话，还包括针对这些情况的颜色类别。还使用背景颜色类别，其包括图像中的非植株颜色(例如盆和土壤颜色)，将这些像素特地排除出对大小的测定。在受控的恒定照明下分析植株，使得在一棵植株内随时间推移出现的任何变化或者各植株或不同批次的植株之间的任何变化(例如季节差异)可定量。
颜色分类除了可用于确定植株大小生长之外，还可用于评估其他产量构成性状。对于这些其他的产量构成性状，可使用另外的颜色分类方案。例如，被称为“持绿性”的性状(已将其与产量的改进相关联)可通过将绿色色调与黄色和棕色色调(其表示衰老组织)分开的颜色分类来评估。通过将这个颜色分类应用于在接近T0或T1植株的生活周期结束时获取的图像，可鉴定出绿色颜色数量相对于黄色和棕色颜色增加(例如以绿色/黄色比表示)的植株。具有此绿色/黄色比的显著差异的植株可被鉴定为携带有影响这个重要农艺性状的转基因。
植物生物学技术人员会认识到，会出现可指示植株健康或应激应答的其他植株颜色(例如花青素)，且其他的颜色分类方案可提供关于基因在与这些应答相关的性状中的作用的进一步度量。
植株构型分析
也可用本发明来鉴定会改变植株构型参数的转基因，包括诸如以下的参数在内：最大高度和宽度、节间距离、叶和茎之间的角度、在节处长出的叶的数量和叶长度。可如下使用LemnaTec系统软件来确定植株构型。在第一个程序步骤中将植株简化至其主要几何构型，然后基于这个图像可进行不同构型参数的参数化识别。可通过应用之前所描述的统计方法，鉴定各种单独地或组合在一起修饰任何这些构型参数的转基因。
花粉散出日期
花粉散出是要在被转化植株中分析的一个重要参数，可通过活性(active)雄花在植株上的第一次出现来确定。为找到雄花目标，将茎的上末端按颜色进行分类以检测黄色或紫色花粉囊。然后用这个颜色分类分析来确定活性花，而活性花可用来计算花粉散出日期。
或者，可由负责进行植株看护的人员记录花粉散出日期和其他容易目视检测的植株属性(例如授粉日期、第一抽丝日期。为使数据完整性和过程效率最大化，通过采用由LemnaTec光谱数字分析装置所采用的相同条形码来跟踪这个数据。可使用带条形码读取器的计算机、掌上型装置或笔记本电脑，以方便观察的数据采集记录时间、植株检验者和采集数据的操作者。
植株的取向
以模拟商业种植的密度生长的成熟玉蜀黍植株常常具有平坦的构型。也即，植株具有明显可看到的宽侧面，还有窄侧面。从宽侧测定了植株的图像。给每棵植株分配明确的基本取向，以获得宽侧图像和边侧图像之间的最大差异。用顶部图像来确定植株的主轴，并用另外的旋转装置来转动植株至适当的取向后再开始主图像采集。
实施例17：转基因玉蜀黍植株(假想实施例)
产生了含有在启动子控制下的NT变体构建体的T0转基因玉蜀黍植株。将这些植株在FASTCORN系统下在温室条件中生长，如美国专利申请公开2003/0221212、美国专利申请No.10/367,417中所详细描述的。
按以下方式对每棵植株分析以下特性中的一项或多项的可测量的改变：
对源自每个含有单拷贝的每种NT变体构建体的T0植株的自花受精、被发现对于转基因事件1∶1分离的T1子代，分析低KNO3下的生长速率的改善。对生长进行监测直至花期，此时对转基因阳性事件、转基因无效事件和非转化对照事件测定累积植株生长、生长速率和穗重量。将各个单独植株的表型的分布与对照组的分布和与所有其余处理组的分布进行比较。计算每组的方差并用F检验进行比较，将事件方差与非转基因对照组方差和与实验中其余事件的合并方差进行比较。对KNO3的应答越大，事件组内的方差越大，F值也越大。要将阳性结果与事件内的转基因的分布进行比较，以证实响应与转基因分离。
实施例18：田间小区的转基因事件分析(假想实施例)
在因减少施肥达30％或更多而造成产量受限的田间小区中评价转基因事件。用这些氮肥力减少的小区中的转基因植株和非转基因植株之间产量、产量组成或其他农艺性状的改善，来评估由转基因事件的表达所贡献的氮利用的改善。在补充推荐的氮肥力率(nitrogen fertility rate)的小区中进行了类似的比较。有效的转基因事件是那些在氮限制实验和常氮实验中实现相似的产量的事件。
实施例19：用于确定玉蜀黍的根构型的改变的测定法
测定转基因玉蜀黍植物在籽苗阶段、花期或成熟期时根构型的变化。用于测量玉蜀黍植物的根构型的改变的测定法包括但不限于下面列出的方法。为了便于对根构型改变的人工或自动测定，可将玉米植物栽培于透明盆中。
1.根质量(干重)将植株在Turface中生长，Turface是一种能让根容易分开的生长培养基。将烘箱干燥的苗和根组织称重并计算根/苗比。
2.侧根分支的水平通过对整个根系进行二次抽样，用平板扫描仪或数字相机成像并用WinRHIZOTM软件(Regent Instruments Inc.)分析，确定侧根分支的程度(例如侧根数量、侧根长度)。
3.根带宽度测量根带为随植物成熟而在温室盆的底部形成的根的带或群体。在成熟期测量根带的毫米厚度作为对根质量的粗略估计值。
4.节根计数可在将根与载体培养基(例如盆栽混合物)分开后，确定从上茎节脱落的冠根的数量。另外，可测量冠根和/或支柱根的角度。对节根和节根分支量进行的数字分析，构成对上述人工方法的另一个扩充。
将所有在根表型上获取的数据都进行统计分析，通常是t检验，以将转基因根与非转基因同胞植株的根进行比较。在多个事件和/或构建体参与该分析的情形中，还可使用单因素方差分析。
实施例20：大豆胚转化(假想实施例)
如下用含有可操作地连接至泛素启动子的反义NT变体序列的质粒轰击大豆胚。为诱导体细胞胚，将从大豆栽培种A2872的经表面灭菌的不成熟种子切取的3-5mm长的子叶在适当的琼脂培养基中，在26℃下在光照或黑暗中培养六到十周。然后切取产生次级胚的体细胞胚并置于合适的液体培养基中。在反复选择作为早期球状阶段的胚繁殖的体细胞胚的簇之后，如下所述维持悬浮物。
大豆胚发生悬浮培养物可在旋转振荡器上在150rpm、26℃下维持在35ml液体培养基中，以荧光灯按16∶8小时白日/黑夜时间表进行维持。每隔两周，通过将大约35mg的组织接种到35ml的液体培养基中，将培养物进行分培。
然后可通过粒子枪轰击方法(Klein等人，(1987)Nature(London)327：70-73，美国专利No.4,945,050)转化大豆胚性悬浮培养物。可使用DuPont Biolistic PDS1000/HE仪器(氦改型)进行这些转化。
可用来促进大豆转化的选择性标志基因，是由来自花椰菜花叶病毒的35S启动子(Odell等人，(1985)Nature 313：810-812)、来自质粒pJR225(来自大肠杆菌；Gritz等人，(1983)Gene 25：179-188)的潮霉素磷酸转移酶基因和来自根瘤农杆菌Ti质粒T-DNA的胭脂氨酸合酶基因的3′区所组成的转基因。包含可操作地连接到泛素启动子的本文所述NT变体序列的表达盒，可作为限制性片段分离。然后可将这个片段插入携带标记基因的载体的独特限制性酶切位点中。
向50μL的60mg/ml 1μm金粒子悬浮液加入(按顺序)：5μl DNA(1μg/μl)、20μl亚精胺(0.1M)和50μl CaCl2(2.5M)。然后将粒子制备物搅动三分钟，在微量离心机中离心10秒，移除上清液。然后将DNA包被的粒子在400μl 70％乙醇中洗涤一次并再悬浮于40μl无水乙醇中。可将DNA/粒子悬浮液超声处理三次，每次1秒。然后将五微升DNA包被的金粒子加载至每个巨载体盘上。
将大约300-400mg两周龄悬浮培养物置于空的60×15mm培养皿中，用移液管将残余液体从组织移除。对于每次转化实验，通常轰击大约5-10个板。将膜破裂压力设定为1100psi，将室抽至28英寸汞柱的真空。将组织距离阻滞屏(retaining screen)大约3.5英寸放置，轰击三次。轰击后，可将组织一分为二并放回进液体中，如上所述进行培养。
轰击后五至七天，可将液体培养基用新鲜培养基更换，轰击后十二天用含有50mg/ml潮霉素的新鲜培养基更换。可每周更新这个选择培养基。轰击后七至八周，可观察到绿色的转化组织从未转化的坏死的胚发生簇长出来。移出分离的绿色组织并接种进单独的烧瓶中以产生新的、克隆繁殖的、转化的胚发生悬浮培养物。可将每一新品系当作独立的转化事件。然后可将这些悬浮物分培，并作为未成熟胚簇维持或者通过使各单独体细胞胚成熟和发芽而再生成完整植株。
实施例21：向日葵分生组织转化(假想实施例)
如下用含有可操作地连接至泛素启动子的本文所述NT变体序列的表达盒转化向日葵分生组织(还可参见第EP 0 486233号欧洲专利(以引用方式并入本文)和Malone-Schoneberg等人，(1994)Plant Science 103：199-207)。用单小麦头脱粒机(single wheat-head thresher)将成熟的向日葵种子(Helianthus annuus L.)脱壳。将种子在20％ Clorox漂白溶液(每50mL溶液加入两滴Tween 20)中进行表面灭菌30分钟。将种子在无菌蒸馏水中清洗两次。
通过Schrammeijer等人所描述的程序(Schrammeijer等人，(1990)PlantCell Rep.9：55-60)的修改方案制备分裂胚轴外植体。在表面灭菌程序后，将种子在蒸馏水中浸60分钟。然后将每个种子的子叶折断，在胚轴的平面产生整齐的断裂。在切除根尖后，将外植体在初叶之间纵向对切。将两半以切面朝上放置在GBA培养基上，该培养基由Murashige和Skoog矿物元素(Murashige等人，(1962)Physiol.Plant.，15：473-497)、Shepard维生素添加物(Shepard，(1980)，Emergent Techniques for the Genetic Improvement ofCrops(University of Minnesota Press，St.Paul，Minnesota))、40mg/l硫酸腺嘌呤、30g/L蔗糖、0.5mg/l 6-苄基-氨基嘌呤(BAP)、0.25mg/l吲哚-3-乙酸(IAA)、0.1mg/l赤霉酸(GA3)，pH 5.6和8g/l Phytagar组成。
将外植体进行微粒轰击后再进行农杆菌处理(Bidney等人，(1992)Plant Mol.Biol.18：301-313)。将三十至四十个外植体放在60×20mm板的中央的圆圈中进行这个处理。将大约4.7mg的1.8mm钨微射弹悬浮在25ml的无菌TE缓冲液(10mM Tris HCl，1mM EDTA，pH 8.0)中，每次轰击使用1.5ml等分试样。每个板通过150mm nytex屏轰击两次，该屏在PDS
Figure BPA00001514709400891
粒子加速装置中放置在样品上方2cm处。
在所有的转化实验中使用卸甲(disarmed)根瘤农杆菌菌株EHA105。如Holsters等人，(1978)Mol.Gen.Genet.163：181-187所述，通过冷冻-解冻将包含含有可操作地连接至泛素启动子的NT变体多核苷酸的表达盒的双元质粒载体引入农杆菌菌株EHA105中。此质粒还包含卡那霉素选择性标记基因(即nptII)。将用于植物转化实验的细菌在液体YEP培养基(10g/l酵母膏、10g/l细菌蛋白胨和5g/l NaCl，pH 7.0)中生长过夜(28℃和100RPM连续搅拌)，该培养基含有维持细菌菌株和双元质粒所需的适当抗生素。当悬浮液达到约0.4-0.8的OD600时进行使用。使农杆菌细胞沉淀并将其以0.5的最终OD600重悬于由12.5mm MES pH 5.7、1gm/l NH4Cl和0.3g/l MgSO4组成的接种培养基中。
将刚轰击的外植体放在农杆菌悬浮液中，混合并让其不受干扰地放置30分钟。然后将外植体转移到GBA培养基，并以切面朝下在26℃下进行共培养18小时。在三天的共培养后，将外植体转移到374B(缺乏生长调节物且蔗糖含量减低为1％的GBA培养基)，该374B补加有250mg/l头孢噻肟和50mg/l硫酸卡那霉素。将外植体在选择上培养两到五周，然后转移到缺乏卡那霉素的新鲜374B培养基进行一到两周的连续发育。将具有分化的、耐抗生素的生长区域(未产生适合切除的苗)的外植体转移到含有250mg/l头孢噻肟的GBA培养基进行第二次3天植物激素处理。对得自绿色的耐卡那霉素的苗的叶样品，通过ELISA分析是否存在NPTII，并通过分析分生组织发育的调节(即苗和花分生组织的大小和外观的改变)来分析是否存在转基因表达。
将NPTII阳性苗嫁接到hybrid 6440试管生长的向日葵籽苗根茎。使经表面灭菌的种子在48-0培养基(半浓度Murashige和Skoog盐、0.5％蔗糖、0.3％脱乙酰吉兰糖胶，pH 5.6)中萌发，并在针对外植体培养所描述的条件下生长。除去籽苗的上部分，在下胚轴中作出1cm垂直切片，将转化的苗插入到切口中。将整个区域用石蜡膜包裹以保护苗。在玻璃器内培养一周后，可将嫁接的植株转移到土壤。将土壤中的嫁接物维持在高湿度条件下，然后慢慢适应温室环境。在温室中成熟的T0植株(亲代)的转化部分(sector)通过NPTII ELISA和/或通过硝酸盐吸收、叶提取物的NT或NUE活性分析来进行鉴定，而从NPTII阳性T0植株收获的转基因种子通过硝酸盐吸收、少量干燥种子子叶的NT或NUE活性分析来进行鉴定。
另选的向日葵转化方案使得可以不使用化学选择压力就能恢复转基因后代。将种子脱壳并在20％ Clorox漂白溶液(每100mL溶液加入两到三滴Tween 20)中进行表面灭菌20分钟，然后用蒸馏水清洗三次。将经灭菌的种子在用水湿润的滤纸上在暗处26℃下吸水20小时。除去子叶和根(rootradical)，将分生组织外植体在374E(由MS盐、Shepard维生素、40mg/l硫酸腺嘌呤、3％蔗糖、0.5mg/l 6-BAP、0.25mg/l IAA、0.1mg/l GA和0.8％Phytagar(pH 5.6)组成的GBA培养基)上在暗处培养24小时。除去初生叶以暴露顶端分生组织，将大约40个外植体以圆形顶部朝上放置在374M(含1.2％ Phytagar的GBA培养基)的中央的2cm圆圈中，然后在该培养基上在暗处培养24小时。
将大约18.8mg的1.8μm钨粒子重悬在150μl无水乙醇中。超声处理后，取8μl滴在巨载体的表面的中央上。每个板用在第一架子中在26mm Hg的氦枪真空下用650psi可裂圆片(rupture disc)轰击两次。
如之前所述通过冷冻-解冻将所关注质粒引入根瘤农杆菌菌株EHA105中。将在液体YEP培养基(10g/L酵母膏、10g/L细菌蛋白胨和5g/L NaCl，pH 7.0)中在50μg/L卡那霉素存在下在28℃下过夜生长的细菌离心沉淀，然后重悬于接种培养基(12.5mM 2-mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸、MES、1g/LNH4Cl和0.3g/LmgSO4，pH 5.7)中以达到OD 600下4.0的终浓度。将经粒子轰击的外植体转移到GBA培养基(374E)，将一小滴细菌悬浮液直接放到分生组织的顶部上。将外植体在培养基上进行共培养4天，然后将外植体转移到374C培养基(具有1％蔗糖而不含BAP、IAA、GA3且补加250μg/ml头孢噻肟的GBA)。将小植株在培养基上在16小时白日和26℃温育的条件下培养约两周。
对来自374C培养基中的两星期培养物的外植体(大约2cm长)筛选分生组织发育的调节(即苗和花分生组织的大小和外观的改变)。鉴定出阳性外植体后，弃去未能显示修饰的NT活性的苗，将每个阳性外植体细分成节外植体。一个节外植体含有至少一个潜在的节。将各节段在GBA培养基上培养三到四天以促进从每个节形成腋芽。然后将它们转移到374C培养基并让其再发育四周。分离发育中的芽，在374C培养基上再培养四周。通过适当的蛋白质活性测定法，对来自每个新恢复的苗的汇集的叶样品再次进行筛选。此时，从单个节恢复的阳性苗将通常已富集了在节培养之前在初始测定中检测到的转基因部分。
将对经修饰的NT变体表达而言呈阳性的已恢复的苗嫁接到Pioneerhybrid 6440玻璃器内生长的向日葵籽苗根茎。根茎按以下方式制备。将种子脱壳并在20％Clorox漂白溶液(每100mL溶液加入两到三滴Tween 20)中进行表面灭菌20分钟，然后用蒸馏水清洗三次。使经灭菌的种子在用水湿润的过滤器上萌发三天，然后将它们转移到48培养基(半浓度MS盐、0.5％蔗糖、0.3％脱乙酰吉兰糖胶，pH 5.0)并在26℃下在暗处生长三天，然后在16小时白日培养条件下温育。除去选定的籽苗的上部分，在每个下胚轴中作出垂直切片，将转化的苗插入到V型切口中。将切口区域用石蜡膜包裹。在培养基上培养一周后，将嫁接的植株转移到土壤。在前两周，将它们维持在高湿度条件下以使其适应温室环境。
实施例22：水稻组织转化(假想实施例)
一个可供本领域技术人员利用的将DNA转化进高等植物细胞中的方法，是使用包被了所关注核酸构建体的金属粒子进行的高速弹道轰击(参见Klein等人，Nature(1987)(London)327：70-73，以及参见美国专利No.4,945,050)。将Biolistic PDS-1000/He(BioRAD Laboratories，Hercules，CA)用于这些互补实验。使用粒子轰击技术，用DNA片段转化NT变体突变体和野生型水稻。
使用来自吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的能赋予对抗生素的抗性的细菌潮霉素B磷酸转移酶(Hpt II)基因，作为水稻转化的选择性标志物。在载体pML18中，Hpt II基因被工程连接上来自花椰菜花叶病毒的35S启动子和来自根瘤农杆菌的章鱼氨酸合酶基因的终止信号和聚腺苷酸化信号。pML18在1997年12月18日公布的WO 97/47731中有描述，藉此将该专利的公开内容以引用方式并入本文。
衍自萌发的水稻种子的盾片的胚发生愈伤组织培养物用作转化实验的原始材料。该材料是通过使无菌水稻种子在愈伤组织引发培养基(MS盐、Nitsch和Nitsch维生素、1.0mg/l 2，4-D和10μM AgNO3)中于暗处27-28℃下萌发来产生的。将从胚的盾片增殖的胚性愈伤转移至CM培养基(N6盐、Nitsch和Nitsch维生素、1mg/l 2，4-D，Chu等人，1985，Sci.Sinica 18：659-668)。将愈伤组织培养物通过以两个星期时间间隔进行常规分培维持在CM上，并在引发的10个星期内用于转化。
将0.5-1.0mm块体相隔大约1mm排列在放置于CM培养基上的Whatman #541纸的圆圈中央约4cm直径的圆形区域中进行分培，以制备愈伤组织供进行转化。将具有愈伤组织的板在暗处于27-28℃下温育3-5天。在轰击之前，将具有愈伤组织的过滤器转移到补加有0.25M甘露醇和0.25M山梨醇的CM，置于暗处3小时。然后在无菌罩中将平皿盖保持微开20-45分钟，以让组织上的水分散发。
将每个基因组DNA片段与含有用于水稻转化的选择性标志物的pML18一起共沉淀到金粒子的表面上。为实现这一点，将总共10μg的DNA以性状DNA∶选择性标志物DNA为2∶1的比例加到以60mg ml-1的浓度重悬的50μl金粒子等分试样。然后将氯化钙(50μl 2.5M溶液)和亚精胺(20μl0.1M溶液)加到该金-DNA悬浮液，同时将管漩涡混合3分钟。将金粒子在微量离心机中离心1秒钟，除去上清液。然后将金粒子用1ml无水乙醇洗涤两次，接着重悬于50μl无水乙醇中，超声处理(浴超声器)1秒钟以使金粒子分散。将金分散液在-70℃下温育五分钟，如果需要的话进行超声处理(浴超声器)以使粒子分散。然后将6μl的包被DNA的金粒子装载到聚酯薄膜巨载体圆片(mylar macrocarrier disk)上，让乙醇蒸发。
在干燥时间结束时，将含有组织的培养皿放在PDS-1000/He的腔室中。然后将腔室中的空气抽真空成28-29英寸Hg。使用可裂膜以氦冲击波将该巨载体进行加速，该膜在冲击管中的氦压力达到1080-1100psi时破裂。将组织放置在离终止屏大约8cm处，将愈伤组织轰击两次。用包被DNA的金粒子以此方式轰击两个至四个板的组织。在轰击之后，将愈伤组织转移到没有补加山梨醇或甘露醇的CM培养基。
在轰击后3-5天内，将愈伤组织转移到SM培养基(含有50mg/l潮霉素的CM培养基)。为实现这一点，将愈伤组织从各板转移到无菌的50ml圆锥形管并称重。加入40℃熔化的顶层琼脂，采用2.5ml顶层琼脂/100mg愈伤组织。将愈伤组织团块通过反复分配穿过10ml移液管来破碎成小于2mM直径的碎块。将3ml的愈伤组织悬浮液等分试样接种到新鲜SM培养基上，将各板在暗处于27-28℃下温育4个星期。4个星期后，鉴定转基因愈伤组织事件，转移到新鲜的SM板，在暗处于27-28℃下再生长2个星期。
将生长的愈伤组织转移到RMl培养基(MS盐、Nitsch和Nitsch维生素、2％蔗糖、3％山梨糖醇、0.4％脱乙酰吉兰糖胶+50ppm潮霉素B)在25℃下暗处保持2个星期。2个星期后，将愈伤组织转移到RM2培养基(MS盐、Nitsch和Nitsch维生素、3％蔗糖、0.4％脱乙酰吉兰糖胶+50ppm潮霉素B)并在冷白光(约40μEm-2s-1)下放置，光照周期为12小时，温度25℃，湿度30-40％。在光线下2-4个星期后，愈伤组织开始器官化并形成苗。将苗从周围的愈伤组织/培养基移取，小心转移到phytatray(Sigma ChemicalCo.，St.Louis，MO)中的RM3培养基(1/2×MS盐、Nitsch和Nitsch维生素、1％蔗糖+50ppm潮霉素B)，用之前的步骤中所描述的相同条件继续进行温育。
在2-3个星期后当出现充分的根和苗生长时，将植株从RM3转移到含有Metro mix 350的4英寸盆。对从转基因植株获得的种子检查该NT变体突变与含有该NT变体多核苷酸的野生型基因组DNA的遗传互补情况。
实施例23：NUE测定
使用系列号为61/227,276的美国专利申请详细描述的方案，可使用转因玉蜀黍株系进行氯化三苯基四唑(TTC)测定以评估NUE的基因，例如根中转运活性的增加。
实施例24：NT变体序列的变体(假想实施例)
A.不改变所编码的氨基酸序列的NT变体蛋白的变体核苷酸序列
用本文所述的NT变体核苷酸序列产生变体核苷酸序列，这些变体核苷酸序列所具有的开放阅读框核苷酸序列与相应的SEQ ID NO：3、5、7、9或11的起始的未改变的开放阅读框核苷酸序列相比具有约70％、75％、80％、85％、90％和95％核苷酸序列同一性。这些功能变体是用标准的密码子表产生。虽然变体的核苷酸序列被改变，但开放阅读框所编码的氨基酸序列没有改变。
B.NT变体多肽的变体氨基酸序列
产生了NT变体多肽的变体氨基酸序列。在这个实施例中，变更一个氨基酸。具体而言，观察开放阅读框以确定适当的氨基酸变更。通过考虑蛋白质比对(与其他直系同源物或来自各种物种的其他基因家族成员的比对)来选择氨基酸进行改变。选择出这样的氨基酸，其被认为不处在高选择压力下(不高度保守)，且相当容易地被具有相似的化学特性(即相似的功能侧链)的氨基酸置换。利用蛋白质比对，可以改变适当的氨基酸。一旦鉴别出目标氨基酸，就随后进行如下C部分中所述的程序。用这个方法产生了具有约70％、75％、80％、85％、90％和95％核酸序列同一性的变体。
C.NT变体多肽的另外的变体氨基酸序列
在该实施例中，产生出相对于参考蛋白质序列而言具有80％、85％、90％和95％同一性的人工蛋白质序列。这后一尝试要求从比对鉴别保守区和可变区，然后明智地应用氨基酸置换表。这些部分将在下文中作更详细的讨论。
很大程度上，根据NT变体蛋白当中或其他NT变体多肽当中的保守区域，作出哪些氨基酸序列要进行改变的决定。基于序列比对，NT变体多肽的可能进行改变的不同区域以小写字母表示，而保守区域以大写字母表示。应认识到，可在以下保守区域中作出保守置换而又不改变功能。另外，本领域技术人员将认识到，本发明的NT变体序列的功能性变体可在保守结构域中具有微小的非保守氨基酸改变。
然后产生出与原始序列在同一性上相差80-85％、85-90％、90-95％和95-1 00％范围内的人工蛋白质序列。目标定在这些范围的中点，正负偏差近似幅度例如为1％。氨基酸置换将通过定制的Perl脚本来实现。置换表在下表9中提供。
表9.置换表
Figure BPA00001514709400951
首先，鉴定出蛋白质中不应改变的任何保守氨基酸并“作上记号”以隔离开来不作置换。起始甲硫氨酸当然将自动被加到这个名单。接着，作出改变。
H、C和P在任何情况下都不改变。该改变将首先以异亮氨酸开始，从N端扫描至C端。然后是亮氨酸，如此按列表往下直至达到所需的目标。可作出中数置换(interim number substitution)，以便不造成改变的逆转。名单的顺序是1-17，因此按需以尽可能多的异亮氨酸变化开始，然后是亮氨酸，一直到甲硫氨酸。显然，按此方式，许多氨基酸将不需要改变。L、I和V将涉及两个交替的最佳置换的50∶50置换。
将变体氨基酸序列作为输出写出。用Perl脚本计算同一性百分数。使用这个程序，产生出与SEQ ID NO：3、5、7、9或11的起始的未改变的开放阅读框核苷酸序列具有约80％、85％、90％和95％氨基酸同一性的NT变体多肽的变体。
实施例25：用于确定玉蜀黍中与野生型YNT1相比YNT1变体的表达 水平和活性的硝酸盐吸收测定
将含有转基因的玉米种子种植在小盆中，用含有硝酸盐作为唯一氮源的营养物溶液浇灌。将带有籽苗的盆转移到装有相同营养溶液的较大容器中。移取营养溶液的等分试样测定硝酸盐的量。转移后两个星期，收获植株测量生物量和总还原氮。用硝酸盐从营养物溶液的损失来测定硝酸盐吸收。
实施例26：用于确定蛋白质表达水平的玉蜀黍瞬时表达测定(假想实 施例)
可通过在玉蜀黍中进行农杆菌介导的瞬时表达测定，来测量蛋白质表达水平。将包含含有由玉蜀黍泛素启动子或PEPC启动子驱动的NT多核苷酸的表达盒的双元质粒载体通过如实施例6中所述的电穿孔引入农杆菌菌株LBA4404中。通过浸润或真空使玉蜀黍籽苗、嫩叶组织或悬浮细胞感染携带NT表达盒的农杆菌培养物。将受感染的植物材料在所需的条件(例如温室或生长室，带营养物/培养基)下恢复几天。从受感染的组织提取蛋白质，按照标准的程序进行蛋白质印迹分析。
本文所用的词语“一个”和“一种”指一个(种)或不止一个(种)(即，指至少一个(种))该词语的语法对象。举例说，“一个要素”是指一个或多个要素。
在本说明书通篇中，词语“包含”及其语法变体要被理解为暗示包括规定的元件、整数或步骤或者元件组、整数组或步骤组，但不排除任何其他元件、整数或步骤或者元件组、整数组或步骤组。
本说明书中的所有出版物和专利申请表明了本发明所属领域的普通技能水平。所有出版物和专利申请均以引用的方式并入本文，所引用的程度就如同每个单独的出版物或专利申请被具体地和独立地指出以引用的方式并入本文一样。
已参考了各种具体的和优选的实施方案和技术描述了本发明。但是，应理解，在保持在本发明的精神和范围内的前提下可作出许多变化和修改。
Figure IPA00001514708800011
Figure IPA00001514708800021
Figure IPA00001514708800051
Figure IPA00001514708800061
Figure IPA00001514708800071
Figure IPA00001514708800081
Figure IPA00001514708800091
Figure IPA00001514708800101
Figure IPA00001514708800121
Figure IPA00001514708800131
Figure IPA00001514708800141
Figure IPA00001514708800151
Figure IPA00001514708800161
Figure IPA00001514708800181
Figure IPA00001514708800191

Claims (105)

1.一种分离的或重组的核酸，所述核酸包含硝酸盐转运蛋白(NT)变体多核苷酸，所述硝酸盐转运蛋白变体多核苷酸包含选自如下的成员：
(a)包含已被置换的核苷酸的NT变体多核苷酸，其中所述核苷酸置换为表3所示置换中的一者或多者，并且其中所述多核苷酸编码具有NT活性的多肽，
(b)编码包含已被置换的氨基酸序列的多肽的NT变体多核苷酸，其中所述氨基酸置换为表2所示置换中的一者或多者，并且其中所述多肽具有NT活性，
(c)编码包含SEQ ID NO：4、6、8或10中所示氨基酸序列的多肽的多核苷酸，
(d)包含SEQ ID NO：3、5、7、9或11中所示核苷酸序列的多核苷酸，
(e)在严格条件下与至少一条选自(a)、(b)、(c)和(d)的核苷酸序列的互补序列杂交的、包含长度上至少30个核苷酸的多核苷酸，其中所述条件包括在37℃下在40至45％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交并在55至60℃下在0.5X至1X SSC中洗涤，并且其中所述多核苷酸编码具有NT活性的多肽，
(f)与至少一条选自SEQ ID NO：3、5、7、9和11的核苷酸序列具有至少80％序列同一性的多核苷酸；其中所述序列同一性百分数是基于整个编码区并且通过BLAST 2.0在默认参数下测定，并且其中所述多核苷酸编码具有NT活性的多肽，
(g)由于遗传密码的简并性从(a)至(f)中任一者得到的多核苷酸，和
(h)与(a)至(g)中任一者的多核苷酸互补的多核苷酸。
2.根据权利要求1所述的分离的或重组的多核苷酸，其中所述NT变体多核苷酸编码NT变体多肽，相对于不含有所述NT变体多肽的对照植物所述NT变体多肽可增加植物的产量。
3.根据权利要求1或2所述的分离的或重组的多核苷酸，所述多核苷酸编码与野生型NT的活性相比具有保持的或增加的NT活性的NT变体多肽。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的分离的或重组的多核苷酸，所述多核苷酸编码具有为SEQ ID NO：2的多肽的NT活性至少2倍的NT活性的NT变体多肽。
5.根据权利要求4所述的分离的或重组的多核苷酸，其中NT活性为硝酸盐吸收。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的分离的或重组的多核苷酸，所述多核苷酸编码能使植物在较低肥力下氮利用效率(NUE)提高的NT变体多肽。
7.一种载体，所述载体包含至少一条根据权利要求1-5中任一项所述的多核苷酸。
8.一种表达盒，所述表达盒包含至少一条可操作地连接至启动子的根据权利要求1-5中任一项所述的多核苷酸。
9.根据权利要求8所述的表达盒，其中所述多核苷酸以有义取向可操作地连接至所述启动子。
10.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含至少一个根据权利要求8或9所述的表达盒。
11.根据权利要求10所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为植物细胞。
12.根据权利要求11所述的宿主细胞，其中所述植物细胞为单子叶或双子叶植物细胞。
13.一种转基因植物，所述转基因植物包含稳定掺入在其基因组中的至少一个根据权利要求8或9所述的表达盒。
14.根据权利要求13所述的转基因植物，其中所述植物选自：拟南芥、玉蜀黍、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、稷、花生、甘蔗和可可。
15.一种得自根据权利要求13或14所述的转基因植物的种子，其中所述种子包含所述表达盒。
16.一种分离的或重组的NT变体多肽，所述NT变体多肽选自：
(a)包含已被置换的氨基酸序列的多肽，其中所述氨基酸置换为表2所示置换中的一者或多者，并且其中所述NT变体多肽具有NT活性；
(b)具有NT活性的多肽，其中所述多肽由SEQ ID NO：3、5、7、9或11中所示的核苷酸序列编码，并且其中所述NT变体多肽具有NT活性；
(c)具有NT活性并且与选自SEQ ID NO：4、6、8和10的氨基酸序列中的至少一者具有至少80％序列同一性的多肽。
17.根据权利要求16所述的分离的或重组的NT变体多肽，其中与野生型NT的活性相比所述NT变体多肽具有保持的或增加的NT活性。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述野生型NT为YNT1。
19.根据权利要求16-18中任一项所述的分离的或重组的NT变体多肽，其中所述NT活性选自：a)相比于对照的硝酸盐吸收，保持或增加硝酸盐的吸收，(b)相比于天然的或野生型的NT酶对硝酸盐的Km，保持或降低该Km，(c)相比于天然的或野生型的NT酶的硝酸盐吸收速度(Vmax)，保持或增加该Vmax，(d)相比于天然的或野生型的NT酶的硝酸盐周转率，保持或增加硝酸盐周转率，(e)相比于对照植物的氮利用效率(NUE)，保持或增加植物的氮利用效率(NUE)和(f)保持或增加植物生产率/产量或它们的任何组合。
20.一种转化的宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求16-19中任一项所述的NT变体多肽。
21.根据权利要求20所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为植物细胞。
22.根据权利要求21所述的宿主细胞，其中所述转化的植物细胞为单子叶或双子叶植物细胞。
23.根据权利要求21或22所述的宿主细胞，其中所述植物细胞为作物细胞。
24.根据权利要求21-23中任一项所述的宿主细胞，其中所述植物细胞为拟南芥、玉蜀黍、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、稷、花生、甘蔗或可可植物细胞。
25.一种转化的植物，所述植物从根据权利要求21-24中任一项所述的宿主细胞再生得到。
26.一种转化的种子，所述种子来自根据权利要求25所述的植物。
27.一种调节植物细胞中的NT蛋白的水平的方法，所述方法包括：
(a)用可操作地连接至驱动在植物中的表达的启动子的根据权利要求1所述的NT变体多核苷酸转化植物细胞；以及
(b)使所述转化的植物细胞再生成转化植物，所述转化植物能以足以调节所述植物中的NT蛋白的水平的量表达所述NT变体多核苷酸。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述植物为拟南芥、玉蜀黍、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、稷、花生、甘蔗或可可植物。
29.根据权利要求27或28所述的方法，其中所述NT变体蛋白的水平得到提高。
30.一种调节植物细胞中的NT活性的方法，所述方法包括：
(a)用可操作地连接至驱动在植物中的表达的启动子的根据权利要求1所述的NT变体多核苷酸稳定转化植物细胞；以及
(b)使所述多核苷酸表达一段时间，所述时间足以调节所述植物细胞中的所述NT活性。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述植物细胞为拟南芥、玉蜀黍、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、稷、花生、甘蔗或可可植物细胞。
32.根据权利要求30或31所述的方法，其中当与未用所述NT变体多核苷酸转化的对照植物细胞相比时在所述转化的植物细胞中所述NT活性得到保持或提高。
33.根据权利要求30-32中任一项所述的方法，其中根据权利要求17所述的NT变体多肽，其中所述NT活性选自：a)相比于对照的硝酸盐吸收，保持或增加硝酸盐的吸收，(b)相比于天然的或野生型的NT酶对硝酸盐的Km，保持或降低该Km，(c)相比于天然的或野生型的NT酶的硝酸盐吸收速度(Vmax)，保持或增加该Vmax，(d)相比于天然的或野生型的NT酶的硝酸盐周转率，保持或增加硝酸盐周转率，(e)保持或将硝酸盐还原为亚硝酸盐，(f)保持或增加硝酸盐还原率，(g)保持或增加硝酸盐还原速度(Vmax)，(e)相比于对照植物的氮利用效率(NUE)，保持或增加植物的氮利用效率(NUE)和(f)保持或增加植物生产率/产量或它们的任何组合。
34.根据权利要求30-33中任一项所述的方法，其中所述野生型NT为YNT1。
35.根据权利要求30-34中任一项所述的方法，其中相比于野生型NT的活性所述NT变体多肽具有增加到至少2倍的NT活性。
36.一种调节植物细胞中的氮利用效率(NUE)的方法，所述方法包括：
(a)将包含可操作地连接至驱动在植物中的表达的启动子的根据权利要求1所述的NT变体多核苷酸的重组表达盒引入植物细胞中；以及
(b)在植物细胞生长条件下培养所述植物细胞；其中所述植物细胞中的氮吸收得到调节。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述植物细胞来自选自以下的植物：拟南芥、玉蜀黍、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、稷、花生和可可。
38.具有受调节的氮利用效率(NUE)的植物，所述植物通过如下方法产生：
(a)将包含可操作地连接至启动子的根据权利要求1所述的多核苷酸的重组表达盒引入植物细胞中；
(b)在植物细胞生长条件下培养所述植物细胞；以及
(c)从所述植物细胞再生植物；其中所述植物中的氮吸收得到调节。
39.根据权利要求38所述的植物，其中当与非转化的对照植物相比时，所述植物中的所述NUE得到提高。
40.根据权利要求38所述的植物，其中当与非转化的对照植物相比时，所述植物显示出增强的根生长。
41.根据权利要求38所述的植物，其中当与非转化的对照植物相比时，所述植物显示出增加的持绿性。
42.根据权利要求38所述的植物，其中当与非转化的对照植物相比时，在所述植物在受限氮肥力下生长时所述植物具有增加的鲜重。
43.根据权利要求38所述的植物，其中当与非转化的对照植物相比时，所述植物具有增加的根构型。
44.根据权利要求38-43中任一项所述的植物，其中所述植物选自：拟南芥、玉蜀黍、大豆、高粱、卡诺拉油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、稷、花生、甘蔗和可可。
45.一种增加植物中的产量的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将包含可操作地连接至在植物细胞中有功能的启动子的根据权利要求1所述的NT变体多核苷酸的构建体引入植物细胞中，以产生转化的植物细胞；以及
(b)从所述转化的植物细胞再生出转基因植物，其中所述NT变体在所述转基因植物的细胞中以足以增加在所述转基因植物中的产量的水平表达。
46.根据权利要求45所述的方法，其中产量增加包括根生长增强、种子大小增加、种子重量增加、种子的胚大小增加、叶大小增加、籽苗活力增加、穗丝露出增强、穗大小增加或叶绿素含量增加。
47.根据权利要求45或46所述的方法，其中所述植物在受限的氮肥力下生长。
48.根据权利要求45-47中任一项所述的方法，其中所述植物的氮利用效率增加。
49.根据权利要求45-48中任一项所述的方法，其中与非所述NT变体多核苷酸转基因的植株的氮吸收相比，所述NT变体多核苷酸转基因的植株的氮吸收增加。
50.根据权利要求45-49中任一项所述的方法，其中所述NT变体多核苷酸的表达由根偏好启动子驱动。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述根偏好启动子选自微管蛋白启动子(pTUB)、玉蜀黍泛素启动子(ZM UBI)、玉蜀黍根金属硫蛋白启动子(ZM-RM2)、脂质转移蛋白2启动子(LTP2)、香蕉条纹病毒启动子截短型启动子(BSV(TR))、玉蜀黍NAS2启动子(ZM-NAS2)和香蕉条纹病毒启动子全长型(BAV(FL)。
52.根据权利要求45-49中任一项所述的方法，其中编码所述NT变体的所述多核苷酸被组成型表达。
53.根据权利要求45-49中任一项所述的方法，其中编码所述NT变体的所述多核苷酸被诱导型表达。
54.根据权利要求45-49中任一项所述的方法，其中编码所述NT变体的所述多核苷酸以细胞特异性、组织特异性或器官特异性的方式表达。
55.根据权利要求45-54中任一项所述的方法，其中所述构建体还包含第二多核苷酸，其中所述第二多核苷酸编码硝酸盐转运蛋白、硝酸盐还原酶或根蛋白质，并且其中所述第二多核苷酸可操作地连接至在植物细胞中有功能的第二启动子。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述第二多核苷酸选自YNT1、优化的或部分优化的YNT1、YNR1、PPNR A551G和ZM-CKXg。
57.根据权利要求55或56所述的方法，其中所述第二启动子选自玉蜀黍根金属硫蛋白启动子(ZM-RM2)、玉蜀黍NAS2启动子、香蕉条纹病毒启动子截短型启动子(BSV(TR))、香蕉条纹病毒启动子全长型(BSV(FL))、玉蜀黍磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶启动子(ZM-PEPC)和玉蜀黍泛素启动子(ZM-UBI)。
58.根据权利要求45-57中任一项所述的方法，其中所述植物为双子叶植物。
59.根据权利要求45-57中任一项所述的方法，其中所述植物为单子叶植物。
60.根据权利要求45-57中任一项所述的方法，其中所述植物为水稻、小麦、花生、甘蔗、高粱、玉米、棉花、大豆、蔬菜、观赏植物、针叶树、苜蓿、菠菜、烟草、番茄、马铃薯、向日葵、卡诺拉油菜、大麦或稷、芸苔属物种、红花、甘薯、木薯、咖啡、椰子、菠萝、柑橘树、可可、茶、香蕉、棕榈、鳄梨、无花果、番石榴、芒果、橄榄、番木瓜、腰果、澳大利亚坚果、杏树、糖用甜菜、甘蔗、荞麦、黑小麦、斯佩耳特小麦、亚麻子、甘蔗、油籽油菜、卡诺拉油菜、水芹、拟南芥、卷心菜、黄豆、豌豆、菜豆、茄子、铃状椒、万寿菊、莴苣、金盏草、甜瓜、西葫芦、南瓜和夏南瓜或者燕麦植物。
61.根据权利要求45所述的方法，其中将所述植物的产量与对照植物相比较，其中所述对照植物不含所述NT多核苷酸。
62.一种植物，所述植物通过权利要求45-61中任一项所述的方法产生。
63.一种在植物中使硝酸盐信号转导与硝酸盐吸收解偶联的方法，所述方法包括在植物中表达微生物硝酸盐转运蛋白。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述微生物硝酸盐转运蛋白为真菌、酵母、细菌、放线菌、藻类或原生动物硝酸盐转运蛋白。
65.根据权利要求63或64所述的方法，其中所述微生物硝酸盐转运蛋白由根据权利要求1所述的NT多核苷酸编码。
66.一种分离的或重组的硝酸盐还原酶(NR)多核苷酸，所述多核苷酸包含选自以下的成员：
(a)编码SEQ ID NO：14或17的多肽的多核苷酸，
(b)包含SEQ ID NO：12或16中所示序列的多核苷酸，
(c)在严格条件下与至少一条选自(a)和(b)的核苷酸序列的互补序列杂交的、包含长度上至少30个核苷酸的多核苷酸，其中所述条件包括在40-45％甲酰胺、1M NaCl、1％ SDS中在37℃下杂交和在0.5X至1X SSC中在55至60℃下洗涤，其中所述多核苷酸编码具有NR活性并包含A561G置换、S561D置换或A561和S561 D置换的多肽，
(d)与至少一条选自SEQ ID NO：12和16的核苷酸序列具有至少70％序列同一性的多核苷酸，其中所述序列同一性百分数是基于整个编码区并通过BLAST 2.0在默认参数下测定，并且其中所述多核苷酸编码具有NR活性并包含A561G置换、S561D置换或A561和S561 D置换的多肽，
(e)由于遗传密码的简并性从(a)至(d)中任一者得到的分离的多核苷酸，
(f)与(a)至(e)中任一者的多核苷酸互补的多核苷酸。
67.根据权利要求66所述的NR多核苷酸，其中所述NR多核苷酸编码能使植物在较低肥力下产量或氮利用效率提高的NR多肽。
68.一种载体，所述载体包含至少一条根据权利要求66或67所述的多核苷酸。
69.一种表达盒，所述表达盒包含至少一条可操作地连接至启动子的根据权利要求66或67所述的多核苷酸。
70.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含至少一个根据权利要求69所述的表达盒。
71.根据权利要求70所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为植物细胞。
72.一种转基因植物，所述转基因植物包含至少一个根据权利要求69所述的表达盒。
73.根据权利要求72所述的转基因植物，其中所述植物选自：拟南芥、玉米、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、甘蔗和稷。
74.一种种子，所述种子来自根据权利要求72或73所述的转基因植物。
75.根据权利要求74所述的种子，其中所述种子为拟南芥、玉米、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、甘蔗或稷种子。
76.一种分离的或重组的NR多肽，所述NR多肽选自：
(a)包含SEQ ID NO：14或17的多肽；
(b)由SEQ ID NO：12或16的多核苷酸编码的多肽；
(c)与至少一条选自SEQ ID NO：14和17的氨基酸序列的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽，其中所述多肽具有NR活性并且包含A561G置换、S561D置换或者A561和S561D置换；
(d)由包含与至少一条选自SEQ ID NO：12和16的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列的核酸分子编码的多肽，其中所述多肽具有NR活性并且包含A561G置换、S561D置换或者A561和S561 D置换；
(e)由核酸分子编码的多肽，所述核酸分子在至少一次在0.2X SSC中在55℃下洗涤20分钟后与由选自SEQ ID NO：12和16的核苷酸序列组成的核酸探针或其互补序列杂交，其中所述多肽具有NR活性并且包含A561G置换、S561D置换或者A561和S561 D置换；和
(f)包含SEQ ID NO：14或17的至少200个连续氨基酸的片段，其中所述多肽具有NR活性并且其中所述片段包含A561G置换、S561D置换或者A561和S561 D置换；
77.一种重组表达盒，所述表达盒包含可操作地连接至启动子的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码根据权利要求76所述的NR多肽。
78.一种转化的宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求76所述的NR多肽。
79.根据权利要求78所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为植物细胞。
80.根据权利要求79所述的宿主细胞，其中所述植物细胞选自拟南芥、高粱、玉蜀黍、水稻、小麦、大豆、向日葵、卡诺拉油菜、苜蓿、大麦、甘蔗和稷。
81.一种转化的植物，所述植物从根据权利要求79或80所述的宿主细胞再生。
82.根据权利要求81所述的植物，其中所述植物为拟南芥、高粱、玉蜀黍、水稻、小麦、大豆、向日葵、卡诺拉油菜、苜蓿、大麦、甘蔗或稷。
83.一种转化的种子，所述种子来自根据权利要求81或82所述的植物。
84.一种分离的多肽，所述多肽由SEQ ID NO：12的多核苷酸编码。
85.根据权利要求84所述的分离的多肽，其中相比于对照植物，NR在植物中的表达导致该植物中的产量增加，其中所述对照植物不含有编码所述NR的所述多核苷酸。
86.一种调节植物细胞中的NR蛋白的水平的方法，所述方法包括：
(a)用可操作地连接至驱动在植物中的表达的启动子的根据权利要求66所述的NR多核苷酸转化植物细胞，其中所述多核苷酸处于有义取向；以及
(b)使所述多核苷酸表达一段时间，所述时间足以调节所述植物细胞中的所述NR蛋白。
87.根据权利要求86所述的方法，其中所述植物为拟南芥、玉米、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、甘蔗或稷。
88.根据权利要求86或87所述的方法，其中NR蛋白得到增加。
89.根据权利要求86或87所述的方法，其中NR蛋白得到降低。
90.一种调节植物中的NR蛋白的水平的方法，所述方法包括：
(a)用可操作地连接至驱动在植物中的表达的启动子的根据权利要求66所述的NR多核苷酸稳定转化植物细胞，其中所述多核苷酸处于有义取向；以及
(b)使所述转化的植物细胞再生成转化植物，所述转化植物能以足以调节所述植物中的NR蛋白的水平的量表达所述NR变体多核苷酸。
91.根据权利要求90所述的方法，其中所述植物为拟南芥、玉米、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、甘蔗或稷。
92.根据权利要求90或91所述的方法，其中相比于不含有所述NR多核苷酸的对照植物，NR蛋白得到增加。
93.根据权利要求90或91所述的方法，其中相比于不含有所述NR多核苷酸的对照植物，NR蛋白得到降低。
94.一种增加植物中的产量的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)用可操作地连接至驱动在植物中的表达的启动子的根据权利要求1所述的NR多核苷酸稳定转化植物细胞，其中所述多核苷酸处于有义取向；以及
(b)使所述转化的植物细胞再生成转化植物，所述转化植物能以足以调节所述植物中的NR蛋白的水平的量表达所述NR变体多核苷酸。
95.根据权利要求94所述的方法，其中产量增加包括根生长增强、种子大小增加、种子重量增加、胚大小增加、叶大小增加、籽苗活力增加、穗丝露出增强、穗大小增加或叶绿素含量增加。
96.根据权利要求94或95所述的方法，其中所述植物在受限的氮肥力下生长。
97.根据权利要求94-96中任一项所述的方法，其中所述植物的氮利用效率提高。
98.根据权利要求94-97中任一项所述的方法，其中相比于所述植物内源性的NR的活性，所述NR多核苷酸的NR活性增加。
99.根据权利要求94-98中任一项所述的方法，其中所述NR多核苷酸的表达由磷酸烯醇式丙酮酸脱羧酶(PEPC)启动子驱动。
100.根据权利要求94-99中任一项所述的方法，其中编码所述NR的所述多核苷酸被组成型表达。
101.根据权利要求94-99中任一项所述的方法，其中编码所述NR的所述多核苷酸被诱导型表达。
102.根据权利要求94-99中任一项所述的方法，其中编码所述NR的所述多核苷酸以细胞特异性、组织特异性或器官特异性的方式表达。
103.根据权利要求94-102中任一项所述的方法，其中所述植物为双子叶植物。
104.根据权利要求94-102中任一项所述的方法，其中所述植物为单子叶植物。
105.根据权利要求94-104中任一项所述的方法，其中将所述植物的产量与对照植物相比较，其中所述对照植物不含有编码所述NR的所述多核苷酸。
CN2010800370634A 2009-08-20 2010-08-20 在玉蜀黍中功能性表达改组酵母硝酸盐转运蛋白(ynt1)以改善低硝酸盐环境下的硝酸盐吸收 Pending CN102549009A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US23560109P 2009-08-20 2009-08-20
US61/235601 2009-08-20
PCT/US2010/046092 WO2011022597A1 (en) 2009-08-20 2010-08-20 Functional expression of shuffled yeast nitrate transporter (ynti) in maize to improve nitrate uptake under low nitrate environment

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102549009A true CN102549009A (zh) 2012-07-04

Family

ID=42989306

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2010800370634A Pending CN102549009A (zh) 2009-08-20 2010-08-20 在玉蜀黍中功能性表达改组酵母硝酸盐转运蛋白(ynt1)以改善低硝酸盐环境下的硝酸盐吸收

Country Status (7)

Country Link
US (2) US8592649B2 (zh)
EP (1) EP2467395A1 (zh)
CN (1) CN102549009A (zh)
CA (1) CA2770854A1 (zh)
IN (1) IN2012DN01359A (zh)
MX (1) MX2012002113A (zh)
WO (1) WO2011022597A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105481955A (zh) * 2015-12-10 2016-04-13 中国农业科学院生物技术研究所 速生水生植物硝酸盐转运蛋白GeNRT2.1及其编码基因与应用
CN115606383A (zh) * 2022-11-10 2023-01-17 南京农业大学 一种确定复合肥与单肥的分步精准组合施肥的方法及应用

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150324975A1 (en) * 2012-12-20 2015-11-12 Pioneer Hi-Bred International Inc. Non-destructive imaging of crop plants

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009009142A2 (en) * 2007-07-10 2009-01-15 Monsanto Technology, Llc Transgenic plants with enhanced agronomic traits
CN101395275A (zh) * 2005-08-15 2009-03-25 纳幕尔杜邦公司 硝酸盐转运组分

Family Cites Families (79)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US227276A (en) 1880-05-04 locke
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4658082A (en) 1984-07-25 1987-04-14 Atlantic Richfield Company Method for producing intact plants containing foreign DNA
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
EP0242236B2 (en) 1986-03-11 1996-08-21 Plant Genetic Systems N.V. Plant cells resistant to glutamine synthetase inhibitors, made by genetic engineering
JPH0293088A (ja) 1988-09-29 1990-04-03 Permelec Electrode Ltd 水電解方法及び装置
US5023179A (en) 1988-11-14 1991-06-11 Eric Lam Promoter enhancer element for gene expression in plant roots
US5110732A (en) 1989-03-14 1992-05-05 The Rockefeller University Selective gene expression in plants
US5262306A (en) 1989-09-26 1993-11-16 Robeson David J Methods for identifying cercosporin-degrading microorganisms
CA2074355C (en) 1990-01-22 2008-10-28 Ronald C. Lundquist Method of producing fertile transgenic corn plants
WO1991016433A1 (en) 1990-04-26 1991-10-31 Plant Genetic Systems N.V. New bacillus thuringiensis strains and their genes encoding insecticidal toxins
NZ239977A (en) 1990-11-14 1993-08-26 Pioneer Hi Bred Int Transforming plants by the use of agrobacterium
US5277905A (en) 1991-01-16 1994-01-11 Mycogen Corporation Coleopteran-active bacillus thuringiensis isolate
ES2124738T3 (es) 1991-08-02 1999-02-16 Mycogen Corp Nuevo microorganismo e insecticida.
JPH06511152A (ja) 1991-10-04 1994-12-15 ノースカロライナ　ステイト　ユニバーシティー 病原体耐性トランスジェニック植物
DK0616644T3 (da) 1991-12-04 2003-10-27 Du Pont Fedtsyredesaturase-gener fra planter
US5341001A (en) 1992-02-13 1994-08-23 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. Sulfide-selenide manganese-zinc mixed crystal photo semiconductor and laser diode
EP0604662B1 (en) 1992-07-07 2008-06-18 Japan Tobacco Inc. Method of transforming monocotyledon
DK0668919T3 (da) 1992-11-17 2003-09-15 Du Pont Gener for mikorsomale delta-12-fedtsyredesaturaser og beslægtede enzymer fra planter
WO1994012014A1 (en) 1992-11-20 1994-06-09 Agracetus, Inc. Transgenic cotton plants producing heterologous bioplastic
AU6162294A (en) 1993-01-13 1994-08-15 Pioneer Hi-Bred International, Inc. High lysine derivatives of alpha-hordothionin
US5583210A (en) 1993-03-18 1996-12-10 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for controlling plant development
WO1995006722A1 (fr) 1993-09-03 1995-03-09 Japan Tobacco Inc. Procede permettant de transformer une monocotyledone avec un scutellum d'embryon immature
US5470353A (en) 1993-10-20 1995-11-28 Hollister Incorporated Post-operative thermal blanket
JPH07177130A (ja) 1993-12-21 1995-07-14 Fujitsu Ltd エラーカウント回路
US5559252A (en) 1994-02-16 1996-09-24 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Process for the preparation of diamine intermediates useful in the synthesis of HIV protease inhibitors
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US6117679A (en) 1994-02-17 2000-09-12 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
US6335160B1 (en) 1995-02-17 2002-01-01 Maxygen, Inc. Methods and compositions for polypeptide engineering
US5834252A (en) 1995-04-18 1998-11-10 Glaxo Group Limited End-complementary polymerase reaction
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
US5593881A (en) 1994-05-06 1997-01-14 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis delta-endotoxin
US5633363A (en) 1994-06-03 1997-05-27 Iowa State University, Research Foundation In Root preferential promoter
US5501836A (en) 1994-07-11 1996-03-26 Hewlett Packard Company Entrapped non-enzymatic macromolecules for chemical sensing
US5736369A (en) 1994-07-29 1998-04-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Method for producing transgenic cereal plants
US5792931A (en) 1994-08-12 1998-08-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Fumonisin detoxification compositions and methods
CA2160529A1 (en) 1994-10-14 1996-04-15 Toshihiko Iizuka Bacillus strain and harmful organism controlling agents
US5549551A (en) 1994-12-22 1996-08-27 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Adjustable length balloon catheter
US5659026A (en) 1995-03-24 1997-08-19 Pioneer Hi-Bred International ALS3 promoter
CN1192239A (zh) 1995-06-02 1998-09-02 先锋高级育种国际公司 α-hordothionin的高甲硫氨酸衍生物
EP0828835A1 (en) 1995-06-02 1998-03-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. HIGH THREONINE DERIVATIVES OF $g(a)-HORDOTHIONIN
US5837876A (en) 1995-07-28 1998-11-17 North Carolina State University Root cortex specific gene promoter
US5737514A (en) 1995-11-29 1998-04-07 Texas Micro, Inc. Remote checkpoint memory system and protocol for fault-tolerant computer system
US5703049A (en) 1996-02-29 1997-12-30 Pioneer Hi-Bred Int'l, Inc. High methionine derivatives of α-hordothionin for pathogen-control
US5693512A (en) 1996-03-01 1997-12-02 The Ohio State Research Foundation Method for transforming plant tissue by sonication
US5850016A (en) 1996-03-20 1998-12-15 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Alteration of amino acid compositions in seeds
US6096548A (en) 1996-03-25 2000-08-01 Maxygen, Inc. Method for directing evolution of a virus
ATE347604T1 (de) 1996-06-14 2006-12-15 Du Pont Suppressi0n spezifischer klassen von soja- sojasamenproteingenen
AU3495297A (en) 1996-07-08 1998-02-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Transformation of zygote, egg or sperm cells and recovery of transformed plants from isolated embryo sacs
JP2001504325A (ja) 1996-09-27 2001-04-03 マキシジェン，インコーポレイテッド 回帰的配列シャフリングおよび選択による遺伝子治療の最適化のための方法
JP3441899B2 (ja) 1996-11-01 2003-09-02 理化学研究所 完全長ｃＤＮＡライブラリーの作成方法
CA2270289C (en) 1996-11-01 2005-09-27 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Proteins with enhanced levels of essential amino acids
US6232529B1 (en) 1996-11-20 2001-05-15 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods of producing high-oil seed by modification of starch levels
DE69835360T2 (de) 1997-01-17 2007-08-16 Maxygen, Inc., Redwood City EVOLUTION Prokaryotischer GANZER ZELLEN DURCH REKURSIVE SEQUENZREKOMBINATION
US5981840A (en) 1997-01-24 1999-11-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for agrobacterium-mediated transformation
US6399383B1 (en) 1997-10-28 2002-06-04 Maxygen, Inc. Human papilloma virus vectors
WO1999023107A1 (en) 1997-10-31 1999-05-14 Maxygen, Incorporated Modification of virus tropism and host range by viral genome shuffling
AU757672B2 (en) 1997-11-18 2003-02-27 Pioneer Hi-Bred International, Inc. A method for directional stable transformation of eukaryotic cells
WO1999041368A2 (en) 1998-02-11 1999-08-19 Maxygen, Inc. Optimization of immunomodulatory properties of genetic vaccines
JP2002507393A (ja) 1998-02-11 2002-03-12 マキシジェン， インコーポレイテッド 抗原ライブラリー免疫
CA2329056A1 (en) 1998-05-22 1999-12-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Cell cycle genes, proteins and uses thereof
US6518487B1 (en) 1998-09-23 2003-02-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Cyclin D polynucleotides, polypeptides and uses thereof
DE69939944D1 (de) 1999-09-30 2009-01-02 Japan Tobacco Inc Vektoren zum transformieren von pflanzen
CN102174540B (zh) 2000-06-16 2013-08-07 托马斯·施穆林 改变植物形态学、生物化学和生理学的方法
EP2295553A1 (en) 2002-02-08 2011-03-16 Novozymes A/S Phytase variants
US7928287B2 (en) 2002-02-19 2011-04-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for large scale functional evaluation of nucleotide sequences in plants
US20090183270A1 (en) * 2002-10-02 2009-07-16 Adams Thomas R Transgenic plants with enhanced agronomic traits
US7403855B2 (en) 2002-12-19 2008-07-22 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Method and apparatus for tracking individual plants while growing and/or after harvest
US7411112B2 (en) 2003-10-09 2008-08-12 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize promoter named CRWAQ81
US7214855B2 (en) 2003-12-22 2007-05-08 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize metallothionein 2 promoter and methods of use
WO2006138005A2 (en) * 2005-05-10 2006-12-28 Monsanto Technology, Llc Genes and uses for plant improvement
MX2008002115A (es) * 2005-08-15 2008-04-17 Du Pont Componentes de transporte de nitrato.
AR067014A1 (es) * 2007-06-15 2009-09-30 Pioneer Hi Bred Int Nitrato reductasas de algas rojas, composiciones y metodos de uso de las mismas
US20090011516A1 (en) 2007-07-03 2009-01-08 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and Assays for the Detection of Nitrogen Uptake by a Plant and Uses Thereof
US8783382B2 (en) 2009-01-15 2014-07-22 Schlumberger Technology Corporation Directional drilling control devices and methods
CN105940441B (zh) 2014-01-29 2018-10-19 夏普株式会社 图像显示装置
KR102193685B1 (ko) 2014-05-02 2020-12-21 삼성전자주식회사 수직 구조의 비휘발성 메모리 소자
US11624505B2 (en) 2020-03-17 2023-04-11 Weber-Stephen Products Llc Ignition-based protocols for pellet grills
CN114873745B (zh) 2022-07-08 2022-09-16 金科环境股份有限公司 一种具有高暂时性硬度的反渗透浓水的处理系统及方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101395275A (zh) * 2005-08-15 2009-03-25 纳幕尔杜邦公司 硝酸盐转运组分
WO2009009142A2 (en) * 2007-07-10 2009-01-15 Monsanto Technology, Llc Transgenic plants with enhanced agronomic traits

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NAVARRO ET AL: "Phosphorylation of the yeast nitrate transporter Ynt1 is essential for delivery to the plasma membrane during nitrogen limitation", 《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》, vol. 283, no. 45, 7 November 2008 (2008-11-07), pages 31208 - 31217 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105481955A (zh) * 2015-12-10 2016-04-13 中国农业科学院生物技术研究所 速生水生植物硝酸盐转运蛋白GeNRT2.1及其编码基因与应用
CN105481955B (zh) * 2015-12-10 2018-11-13 中国农业科学院生物技术研究所 速生水生植物硝酸盐转运蛋白GeNRT2.1及其编码基因与应用
CN115606383A (zh) * 2022-11-10 2023-01-17 南京农业大学 一种确定复合肥与单肥的分步精准组合施肥的方法及应用
CN115606383B (zh) * 2022-11-10 2023-10-20 南京农业大学 一种确定氮磷复合肥与单肥的分步精准组合施肥的方法及应用

Also Published As

Publication number Publication date
EP2467395A1 (en) 2012-06-27
US20110047647A1 (en) 2011-02-24
US20140090115A1 (en) 2014-03-27
MX2012002113A (es) 2012-08-08
IN2012DN01359A (zh) 2015-06-05
US8592649B2 (en) 2013-11-26
CA2770854A1 (en) 2011-02-24
WO2011022597A1 (en) 2011-02-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20200113147A1 (en) Manipulation of glutamine synthetases (gs) to improve nitrogen use efficiency and grain yield in higher plants
CN102395674B (zh) 调节acc合酶改善低氮条件下的植物产量
US7994398B2 (en) Secondary wall forming genes from maize and uses thereof
CN104093842B (zh) 改善植物耐旱性、氮利用效率和产量
AU2005336142A1 (en) A transgenic plant having enhanced drought tolerance
US8252979B2 (en) Manipulation of ammonium transporters (AMTS) to improve nitrogen use efficiency in higher plants
CN104869808A (zh) 控制玉蜀黍和高粱的光周期敏感性的基因以及所述基因的用途
CN101484465A (zh) 控制植物生长和器官大小的玉米基因及其在改良作物植物中的应用
CN104812902A (zh) 用于作物改良的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶的操纵
CN101589147A (zh) 改善农作物的植物生长、蒸腾效率和耐旱性的玉米erecta基因
US8975474B2 (en) Functional expression of yeast nitrate transporter (YNT1)and a nitrate reductase in maize
CN104703998A (zh) 植物中雄性育性的遗传减少
CN101784656B (zh) 来自紫菜属的硝酸还原酶,组成及其使用方法
CN102549009A (zh) 在玉蜀黍中功能性表达改组酵母硝酸盐转运蛋白(ynt1)以改善低硝酸盐环境下的硝酸盐吸收
CN102471779A (zh) 使用二聚化结构域组分堆叠以调节植株构造
CN101142318B (zh) 细胞数目多核苷酸和多肽以及使用其的方法
CN102202497A (zh) 涉及改变的硝酸盐吸收效率的新的Atlg67330基因
CN102186980A (zh) 植物中氮应答的改进
MX2008010196A (en) Genes for enhancing nitrogen utilization efficiency in crop plants

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C12 Rejection of a patent application after its publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20120704