CN102526515A

CN102526515A - 一种提取竹叶黄酮的方法

Info

Publication number: CN102526515A
Application number: CN2011104064954A
Authority: CN
Inventors: 谢捷; 王平; 苏为科; 李峰; 汪菊娟; 朱兴一
Original assignee: ZHEJIANG SUICHANG LIMIN PHARMACEUTICAL CO Ltd; Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: ZHEJIANG SUICHANG LIMIN PHARMACEUTICAL CO Ltd; Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2011-12-08
Filing date: 2011-12-08
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2031-12-08
Also published as: CN102526515B

Abstract

本发明公开了一种提取竹叶黄酮的方法，所述方法为：将干燥竹叶与固相试剂都投入球磨机中研磨均匀，取出球磨粉末，向所述球磨粉末中加入水，室温搅拌均匀，过滤，得滤液A，浓缩，加入无机酸调pH值；过滤，得滤液B，滤液B经大孔树脂层析柱，先用水作为洗脱剂洗脱，再用50％～80％的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，浓缩蒸去溶剂，干燥，得到竹叶黄酮提取物；所述的固相试剂为氢氧化钠、碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化钾、碳酸氢钾、碳酸钾、氢氧化钙、碳酸钙、磷酸氢二钠、氯化钠、硫酸钠、硅胶或硼砂中的一种或两种以上的任意组合；所述的干燥竹叶与固相试剂的质量比为5～25∶1。本发明具有提取率高，产品质量好，用时短、提取温度低、操作方便、易于产业化等优点。

Description

一种提取竹叶黄酮的方法

(一)技术领域

本发明涉及植物提取技术领域，特别涉及到应用机械化学技术提取竹叶黄酮的方法。

(二)背景技术

黄酮类化合物具有广泛的药理活性，分布广泛，种类繁多，是天然产物中一类重要的化合物。竹叶黄酮是竹叶提取物的主要活性成分之一，在竹叶中的含量占1-2％，主要以荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷等黄酮碳苷为主，同时，还含有木犀草素、芹菜素等黄酮苷元。与氧苷黄酮相比，竹叶黄酮结构稳定、不易降解、食用安全性强。因具备较强的自由基清除能力，从而具有良好的消炎、抗菌、降血脂、抗辐射、抗癌、抗衰老、改善心血管系统和脑神经系统等功能。因此，在食品添加剂、天然药物、功能性食品及护肤化妆品等领域市场前景广阔。

竹叶黄酮的传统提取方法以有机溶剂提取法为主，提取率高，提取成本也较高，且提取溶液含有叶绿素等杂质，后处理繁琐。近年来以总黄酮为主要成分的竹叶提取物逐步实现产业化。专利CN102068630A以水为提取溶剂，在60-100℃下提取1-3小时，再冷却浸提2-5小时，滤液经大孔树脂层析纯化，干燥后所得产品中竹叶总黄酮的含量达到30～50％。该方法提取时间较长，提取率较低。专利CN101921345A公开了一种采用挤压法提取竹叶多糖和黄酮的方法，该方法溶剂使用量少、快速，但也存在目标产物提取不完全、提取温度较高等问题。

机械化学是研究物质在机械力诱发和作用下发生的物理化学性质和结构变化的一门学科。机械化学技术是利用机械能来破坏物质的内结合力，使其产生新的界面，并在局部区域产生物理化学反应。如：晶型改变、溶解性改变、物理和化学吸附性能改变、外来离子进入晶体结构，引起化学组成改变、分子间的作用力增强，生成复合分子等。利用机械化学效应，将动植物原料与固相试剂共研磨，可以实现动植物有效成分的高效提取。该提取技术的特点是：动植物原料受机械力作用而被粉碎时，颗粒尺寸变小，细胞壁被破坏，有效成分大量释放；目标产物与固相试剂生成易溶于水的复合分子，通过加水室温溶解，实现高效提取及与其他冷水不溶性杂质的粗分离。提取过程无需有机溶剂，提取率和产品质量都较好。该技术是一种高效、环保的提取方法，有望取代传统提取法。目前还未见应用机械化学技术提取竹叶总黄酮的报道，该法将有利于植物酚酸、生物碱、黄酮和多糖等有效成分的传统提取工艺的改造。

(三)发明内容

本发明的主要目的是克服现有竹叶黄酮提取工艺中存在的提取率较低、时间较长、使用有机溶剂、提取杂质较多等问题，提供一种高效、简单、成本较低、并易于工业化生产的竹叶黄酮提取工艺，促进黄酮类天然抗氧化剂的开发和利用。

本发明应用机械化学技术提取竹叶黄酮，其基本原理是：利用机械化学效应，将干燥竹叶与固相试剂共研磨粉碎，植物细胞壁在反复应力作用下破裂，释放出黄酮酚酸等有效成分，并与固相试剂反应生成易溶于水的盐类复合分子。加水溶解，即可在常温下快速、高效地提取出黄酮类复合物，而诸如叶绿素、多糖、蛋白质、生物碱等杂质则不能被提取出来。最后，酸化即得竹叶总黄酮。

本发明采用的技术方案如下：

一种提取竹叶黄酮的方法，所述方法为：将干燥竹叶与固相试剂都投入球磨机中研磨均匀，取出球磨粉末，向所述球磨粉末中加入水，搅拌均匀，过滤，得滤液A，滤液A浓缩至所述滤液体积的1/4～1/8，加入无机酸调pH值至2.0～7.0，优选为4.0～6.0；过滤，得滤液B，滤液B过大孔树脂层析柱，先用水洗脱除盐等杂质，再以50％～80％的乙醇水溶液为洗脱剂洗脱，收集洗脱液，浓缩蒸去溶剂，干燥，得到竹叶黄酮提取物；所述的固相试剂为氢氧化钠、碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化钾、碳酸氢钾、碳酸钾、氢氧化钙、碳酸钙、磷酸氢二钠、氯化钠、硫酸钠、硅胶或硼砂中的一种或两种以上的任意组合；所述干燥竹叶与固相试剂的质量比为5～25∶1；所述球磨粉末与所加入的水的质量比为1∶10～35；所述的无机酸为盐酸、冰醋酸或磷酸的水溶液；所述的大孔树脂为非极性或弱极性树脂。

本发明所述的干燥竹叶是指禾本科竹类植物的干燥叶，如刚竹属淡竹(Phyllostachys glauca)、毛竹(Phyllostachys heterocycla cv.Pubescens)和紫竹(Phyllostachys nigra)及簕竹属孝顺竹(Bambusamultiplex)的干燥叶。

进一步，本发明所述球磨机的转速为500～2500rpm，优选为1000～2000rpm。

本发明所述的球磨时间为5～30min，优选为10～20min。

本发明优选干燥竹叶与固相试剂的质量比为10～20∶1。

本发明优选的固相试剂选自下列之一：氢氧化钠与硼砂质量比3∶1的混合、碳酸氢钠与硅胶质量比1∶1的混合、碳酸钠与硼砂质量比2∶1的混合或碳酸氢钾。

本发明所述球磨粉末加入水后，在20～30℃温度条件下搅拌均匀。

本发明所述球磨粉末加入水后，搅拌时间为15～90min，优选为20～60min。

本发明优选的大孔树脂为RS-4、LXA-8、AB-8、PAD-610、ADS-17、D-101或LX-28。

本发明所述的水洗除杂过程中，水的用量优选为0.5～1.5倍柱体积。

本发明所述的洗脱剂50％～80％的乙醇水溶液用量优选为2～3倍柱体积。

具体地，本发明推荐所述方法按照如下步骤进行：将干燥竹叶与固相试剂按质量比为10～20∶1一起投入球磨机中，以转速1000～2000rpm球磨10～20min，取出球磨粉末，向所述球磨粉末中加入质量为所述球磨粉末质量15～25倍的水，在20～30℃下搅拌20～60min，过滤，得滤液A，滤液A浓缩至所述滤液体积的1/4～1/8，加入冰醋酸调pH值至4.0～6.0；过滤，得滤液B，滤液B过AB-8大孔树脂层析柱，先用0.5～1.5倍柱体积的水洗脱除盐等杂质，再用2～3倍柱体积50％～80％的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，浓缩蒸去溶剂，干燥，得到竹叶黄酮提取物；所述的固相试剂选自下列之一：氢氧化钠与硼砂质量比3∶1的混合、碳酸氢钠与硅胶质量比1∶1的混合、碳酸钠与硼砂质量比2∶1的混合或碳酸氢钾。

本发明与现有技术相比，其有益效果体现在：

(1)对目标成分选择性好：基于机械化学效应的提取技术使目标成分黄酮类化合物与固相试剂反应生成易溶于水的复合分子，加水常温溶解后，可实现快速、高效的提取，再酸化得到竹叶总黄酮。提取过程避免了叶绿素、蛋白质、多糖等其他杂质的同时提取，粗提物中的黄酮含量相对较高，有利于后续处理；

(2)提取率高：反复的应力作用使植物细胞壁破碎，活性成分更易被释放出来，有利于提取。另外，固相试剂与黄酮类物质发生物理化学反应，使极性小的黄酮苷元极性增大。因此，与乙醇回流法相比，应用机械化学技术能将极性分布较广的黄酮类物质一起用水直接提取出来(见附图)，这些特点使黄酮得率显著提高；

(3)提取过程不使用有机溶剂；

(4)与传统工艺相比，提取时间短，常温提取，效率高；

(5)操作简单，成本较低，产品质量较高，易于产业化；

综上，本发明具有提取率高，产品质量好，用时短、提取温度低、操作方便、易于产业化等优点，具有良好的推广应用前景。

(四)附图说明

图1是根据实施例16中乙醇回流法提取得到竹叶黄酮提取液的高效液相色谱图。

图2是根据本发明实施例16中的应用机械化学技术提取得到的竹叶黄酮提取液的高效液相色谱图。

图3是异荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷标准品的高效液相色谱图。

(五)具体实施方式

以下以具体实施例来说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于此。

所述竹叶黄酮提取物中竹叶总黄酮的含量测定：精密称取20～30mg竹叶黄酮提取物于25mL容量瓶，蒸馏水定容。吸取样品溶液6.0mL，于25mL容量瓶中，加入5％亚硝酸钠溶液1.0mL，反应6min；然后，加入10％硝酸铝1.0mL，反应6min；再加入4％氢氧化钠溶液10.0mL，蒸馏水定容至刻度。反应15min后，在510nm处，1cm比色皿测定吸光度值，依据芦丁标准曲线，计算得到竹叶黄酮提取物中竹叶总黄酮的含量。

以下实施例中所述竹叶黄酮提取物中总黄酮得率(％)＝(提取物质量×提取物中总黄酮的含量)/竹叶干重×100。

所述竹叶黄酮提取物的抗氧化活性测定。①DPPH法：吸取5.0mL DPPH·贮备液(13×10^-4mol/L)，定容于100mL容量瓶中摇匀待测。反应液的配制如下(表1)，根据SA(％)＝[A₁-(A₂-A₃)]/A₁×100，求得消除率。绘制样品浓度对DPPH·清除率的曲线，读取DPPH·清除率为50％时的样品浓度(IC₅₀，μg/mL)。用该法评价抗氧化剂V_C，测得IC₅₀值为11.44μg/mL。②ABTS法：用无水乙醇将ABTS⁺自由基储备液(5mL 7mmol/L ABTS和88μL 140mmol/L过硫酸钾混合液)稀释成工作液，要求在4mL的工作液中加入1mL无水乙醇时其在30℃、734nm波长下的吸光度为0.51±0.02。取1mL的样品，加入4mL ABTS⁺工作液(A₁)，以5mL无水乙醇为空白，混合10s，30℃静置6min，在734nm波长下测吸光度。SA(％)＝(1-A₁/0.51)×100，求得消除率。绘制样品浓度对ABTS⁺清除率的曲线，读取ABTS⁺清除率为50％时的样品浓度(IC₅₀，μg/mL)。用该法评价抗氧化剂V_C，测得IC₅₀值为3.78μg/mL。

表1 DPPH法实验加样表

A₁	4mL DPPH·溶液+1mL水
		A₂	4mL DPPH·溶液+1mL样品溶液
A₃	1mL样品溶液+4mL水

实施例1

将20.0g淡竹的干燥叶与1.5g氢氧化钠和0.5g硼砂混合，置于球磨机中并以转速1000rpm研磨20min；研磨后取出粉末，向其中加入550mL水，在20℃下搅拌60min；过滤，滤液浓缩至90mL，加入盐酸调pH值至2.0；静置2h，过滤，得滤液94mL。滤液过AB-8大孔吸附树脂(由安徽三星树脂科技有限公司生产)，先用300ml水、以2mL/min流速冲洗树脂，再用600mL50％乙醇水溶液、以1.5mL/min流速冲洗树脂，洗脱结束后收集洗脱液400mL，浓缩，干燥得到竹叶黄酮提取物0.81g。提取物中总黄酮含量为40.2％，得率为1.63％。DPPH法和ABTS法评价提取物的抗氧化能力，其IC₅₀值分别为16.92μg/mL和5.92μg/mL。

实施例2

将20.0g淡竹的干燥叶与0.5g碳酸钙和0.5g硼砂混合，置于球磨机中并以转速1820rpm研磨15min；研磨后取出粉末，向其中加入425mL水，在25℃下搅拌40min；过滤，滤液浓缩至70mL，加入冰醋酸调pH值至4.0；静置2h，过滤，得滤液97mL。滤液过AB-8大孔吸附树脂(由安徽三星树脂科技有限公司生产)，先用100ml水、以2mL/min流速冲洗树脂，再用600mL50％乙醇水溶液、以1.5mL/min流速冲洗树脂，洗脱结束后收集洗脱液380mL，浓缩，干燥得到竹叶黄酮提取物0.74g。提取物中总黄酮含量为36.5％，得率为1.35％。DPPH法和ABTS法评价提取物的抗氧化能力，其IC₅₀值分别为18.89μg/mL和6.78μg/mL。

实施例3

将20.0g淡竹的干燥叶与0.9g碳酸钠和0.4g硼砂混合，置于球磨机中并以转速1290rpm研磨10min；研磨后取出粉末，向其中加入320mL水，在30℃下搅拌20min；过滤，滤液浓缩至53mL，加入冰醋酸调pH值至6.0；静置2h，过滤，得滤液60mL。滤液过ADS-17大孔吸附树脂(由安徽三星树脂科技有限公司生产)，先用100ml水、以2mL/min流速冲洗树脂，再用600mL50％乙醇水溶液、以1.5mL/min流速冲洗树脂，洗脱结束后收集洗脱液370mL，浓缩，干燥得到竹叶黄酮提取物0.78g。提取物中总黄酮含量为39.4％，得率为1.54％。DPPH法和ABTS法评价提取物的抗氧化能力，其IC₅₀值分别为16.38μg/mL和5.99μg/mL。

实施例4

将20.0g毛竹的干燥叶与1.5g氢氧化钙和0.5g硅胶混合，置于球磨机中并以转速2220rpm研磨20min；研磨后取出粉末，向其中加入550mL水，在20℃下搅拌50min；过滤，滤液浓缩至135mL，加入盐酸调pH值至4.0；静置2h，过滤，得滤液137mL。滤液过AB-8大孔吸附树脂(由安徽三星树脂科技有限公司生产)，先用200ml水、以2mL/min流速冲洗树脂，再用500mL 60％乙醇水溶液、以1.5mL/min流速冲洗树脂，洗脱结束后收集洗脱液250mL，浓缩，干燥得到竹叶黄酮提取物0.71g。提取物中总黄酮含量为32.9％，得率为1.16％。DPPH法和ABTS法评价提取物的抗氧化能力，其IC₅₀值分别为21.55μg/mL和7.44μg/mL。

实施例5

将20.0g毛竹的干燥叶与0.9g碳酸钾和0.4g硅胶混合，置于球磨机中并以转速1820rpm研磨15min；研磨后取出粉末，向其中加入425mL水，在25℃下搅拌40min；过滤，滤液浓缩至105mL，加入冰醋酸调pH值至5.0；静置2h，过滤，得滤液135mL。滤液过AB-8大孔吸附树脂(由安徽三星树脂科技有限公司生产)，先用200ml水、以2mL/min流速冲洗树脂，再用500mL60％乙醇水溶液、以1.5mL/min流速冲洗树脂，洗脱结束后收集洗脱液270mL，浓缩，干燥得到竹叶黄酮提取物0.78g。提取物中总黄酮含量为36.7％，得率为1.44％。DPPH法和ABTS法评价提取物的抗氧化能力，其IC₅₀值分别为18.55μg/mL和6.73μg/mL。

实施例6

将20.0g毛竹的干燥叶与0.5g碳酸氢钠和0.5g硅胶混合，置于球磨机中并以转速1820rpm研磨10min；研磨后取出粉末，向其中加入320mL水，在30℃下搅拌30min；过滤，滤液浓缩至50mL，加入冰醋酸调pH值至6.0；静置2h，过滤，得滤液57mL。滤液过D101大孔吸附树脂(由郑州勤实科技有限公司生产)，先用300ml水、以2mL/min流速冲洗树脂，再用500mL60％乙醇水溶液、以1.5mL/min流速冲洗树脂，洗脱结束后收集洗脱液280mL，浓缩，干燥得到竹叶黄酮提取物0.67g。提取物中总黄酮含量为45.7％，得率为1.53％。DPPH法和ABTS法评价提取物的抗氧化能力，其IC₅₀值分别为14.45μg/mL和4.89μg/mL。

实施例7

将20.0g淡竹的干燥叶与2.0g氢氧化钠混合，置于球磨机中并以转速500rpm研磨20min；研磨后取出粉末，向其中加入550mL水，在20℃下搅拌60min；过滤，滤液浓缩至70mL，加入盐酸调pH值至4.5；静置2h，过滤，得滤液72mL。滤液过AB-8大孔吸附树脂(由安徽三星树脂科技有限公司生产)，先用200ml水、以2mL/min流速冲洗树脂，再用400mL70％乙醇水溶液、以1.5mL/min流速冲洗树脂，洗脱结束后收集洗脱液200mL，浓缩，干燥得到竹叶黄酮提取物0.70g。提取物中总黄酮含量为34.2％，得率为1.20％。DPPH法和ABTS法评价提取物的抗氧化能力，其IC₅₀值分别为20.03μg/mL和6.98μg/mL。

实施例8

将20.0g毛竹的干燥叶与1.3g碳酸钠混合，置于球磨机中并以转速1820rpm研磨15min；取出研磨后所得粉末，向其中加入430mL水，在25℃下搅拌40min；过滤，滤液浓缩至55mL，加入冰醋酸调pH值至5.0；静置2h，过滤，得滤液70mL。滤液过LXA-8大孔吸附树脂(由西安蓝晓科技有限公司生产)，先用100ml水、以2mL/min流速冲洗树脂，再用500mL60％乙醇水溶液、以1.5mL/min流速冲洗树脂，洗脱结束后收集洗脱液250mL，浓缩，干燥得到竹叶黄酮提取物0.64g。提取物中总黄酮含量为30.5％，得率为0.98％。DPPH法和ABTS法评价提取物的抗氧化能力，其IC₅₀值分别为22.67μg/mL和7.90μg/mL。

实施例9

将20.0g箬竹的干燥叶与1.0g碳酸氢钠混合，置于球磨机中并以转速750rpm研磨10min；研磨后取出粉末，向其中加入320mL水，在30℃下搅拌20min；过滤，滤液浓缩至40mL，加入磷酸调pH值至7.0；静置2h，过滤，得滤液41mL。滤液过RS-4大孔吸附树脂(由西安朴天生物科技有限公司生产)，先用200ml水、以2mL/min流速冲洗树脂，再用600mL50％乙醇水溶液、以1.5mL/min流速冲洗树脂，洗脱结束后收集洗脱液370mL，浓缩，干燥得到竹叶黄酮提取物0.67g。提取物中总黄酮含量为31.9％，得率为1.07％。DPPH法和ABTS法评价提取物的抗氧化能力，其IC₅₀值分别为21.93μg/mL和7.85μg/mL。

实施例10

将20.0g孝顺竹的干燥叶与2.0g氢氧化钾混合，置于球磨机中并以转速1000rpm研磨20min；研磨后取出粉末，向其中加入550mL水，在20℃下搅拌30min；过滤，滤液浓缩至90mL，加入冰醋酸调pH值至4.0；静置2h，过滤，得滤液135mL。滤液过LX-28大孔吸附树脂(由西安蓝晓科技有限公司生产)，先用200ml水、以2mL/min流速冲洗树脂，再用400mL70％乙醇水溶液、以1.5mL/min流速冲洗树脂，洗脱结束后收集洗脱液200mL，浓缩，干燥得到竹叶黄酮提取物0.78g。提取物中总黄酮含量为36.2％，得率为1.42％。DPPH法和ABTS法评价提取物的抗氧化能力，其IC₅₀值分别为19.12μg/mL和6.81μg/mL。

实施例11

将20.0g孝顺竹的干燥叶与1.3g碳酸钾混合，置于球磨机中并以转速1820rpm研磨15min；研磨后取出粉末，向其中加入430mL水，在25℃下搅拌40min；过滤，滤液浓缩至70mL，加入冰醋酸调pH值至5.0；静置2h，过滤，得滤液95mL。滤液过D101大孔吸附树脂(由郑州勤实科技有限公司生产)，先用200ml水、以2mL/min流速冲洗树脂，再用500mL60％乙醇水溶液、以1.5mL/min流速冲洗树脂，洗脱结束后收集洗脱液270mL，浓缩，干燥得到竹叶黄酮提取物0.76g。提取物中总黄酮含量为38.6％，得率为1.46％。DPPH法和ABTS法评价提取物的抗氧化能力，其IC₅₀值分别为17.63μg/mL和6.14μg/mL。

实施例12

将20.0孝顺竹的干燥叶与1.0g碳酸氢钾混合，置于球磨机中并以转速2000rpm研磨10min；研磨后取出粉末，向其中加入320mL水，在30℃下搅拌50min；过滤，滤液浓缩至50mL，加入冰醋酸调pH值至6.0；静置2h，过滤，得滤液55mL。滤液过AB-8大孔吸附树脂(由安徽三星树脂科技有限公司生产)，先用300ml水、以2mL/min流速冲洗树脂，再用600mL50％乙醇水溶液、以1.5mL/min流速冲洗树脂，洗脱结束后收集洗脱液390mL，浓缩，干燥得到竹叶黄酮提取物0.66g。提取物中总黄酮含量为50.1％，得率为1.65％。DPPH法和ABTS法评价提取物的抗氧化能力，其IC₅₀值分别为12.13μg/mL和3.91μg/mL。

实施例13

将20.0g箬竹的干燥叶与1.3g磷酸氢二钠混合，置于球磨机中并以转速2500rpm研磨15min；研磨后取出粉末，向其中加入430mL水，在25℃下搅拌80min；过滤，滤液浓缩至70mL，加入冰醋酸调pH值至3.0；静置2h，过滤，得滤液125mL。滤液过PAD-610大孔吸附树脂(由漂莱特中国有限公司生产)，先用200ml水、以2mL/min流速冲洗树脂，再用600mL50％乙醇水溶液、以1.5mL/min流速冲洗树脂，洗脱结束后收集洗脱液380mL，浓缩，干燥得到竹叶黄酮提取物0.68g。提取物中总黄酮含量为37.8％，得率为1.29％。DPPH法和ABTS法评价提取物的抗氧化能力，其IC₅₀值分别为18.12μg/mL和6.45μg/mL。

实施例14

将20.0g淡竹的干燥叶与4.0g氯化钠混合，置于球磨机中并以转速2000rpm研磨30min；研磨后取出粉末，向其中加入840mL水，在30℃下搅拌90min；过滤，滤液浓缩至105mL，加入冰醋酸调pH值至6.0；静置2h，过滤，得滤液120mL。滤液过AB-8大孔吸附树脂(由安徽三星树脂科技有限公司生产)，先用100ml水、以2mL/min流速冲洗树脂，再用400mL80％乙醇水溶液、以1.5mL/min流速冲洗树脂，洗脱结束后收集洗脱液210mL，浓缩，干燥得到竹叶黄酮提取物0.58g。提取物中总黄酮含量为30.2％，得率为0.88％。DPPH法和ABTS法评价提取物的抗氧化能力，其IC₅₀值分别为22.87μg/mL和7.95μg/mL。

实施例15

将20.0g毛竹的干燥叶与0.8g硫酸钠混合，置于球磨机中并以转速1820rpm研磨5min；研磨后取出粉末，向其中加入210mL水，在30℃下搅拌15min；过滤，滤液浓缩至35mL，加入磷酸调pH值至6.0；静置2h，过滤，得滤液35mL。滤液过AB-8大孔吸附树脂(由安徽三星树脂科技有限公司生产)，先用100ml水、以2mL/min流速冲洗树脂，再用600mL50％乙醇水溶液、以1.5mL/min流速冲洗树脂，洗脱结束后收集洗脱液320mL，浓缩，干燥得到竹叶黄酮提取物0.57g。提取物中总黄酮含量为33.6％，得率为0.96％。DPPH法和ABTS法评价提取物的抗氧化能力，其IC₅₀值分别为21.41μg/mL和7.06μg/mL。

实施例16

高效液相条件：Waters Sunfire C₁₈色谱柱(5μm，4.6×150mm)；柱温25℃；流速1.0ml/min；检测波长354nm；进样量：5μl；梯度洗脱：流动相由甲醇、乙腈和磷酸缓冲液(pH 2.8)组成；0-5min 15％甲醇和7％乙腈；5-30min 15％-30％甲醇，7％-10％乙腈；30-60min30％甲醇和10％乙腈。

应用机械化学技术提取竹叶黄酮的方法按实施例6中实验步骤进行。将20.0g毛竹的干燥叶与0.5g碳酸氢钠和0.5g硅胶混合，置于球磨机中并以转速1820rpm研磨10min；研磨后取出粉末，向其中加入320mL水，在30℃下搅拌30min，过滤，加入盐酸调pH值至中性，滤液浓缩至50mL，加入2倍体积石油醚萃取直至石油醚相无色。精确移取萃余相0.5mL，蒸馏水定容至25mL，按总黄酮含量测定法，在510nm波长处测定吸光度，A＝0.356。根据芦丁标准曲线C(mg/mL)＝0.3434A+0.0032(r²＝0.9997)，计算得竹叶总黄酮得率为1.57％。

以现有技术乙醇回流法为对照，将20.0g毛竹的干燥叶粗粉碎至平均长度约1-2cm，加入320mL 80％乙醇，加热回流3h，过滤，滤液浓缩至50mL，加入2倍体积石油醚萃取直至石油醚相无色。精确移取萃余相0.5mL，蒸馏水定容至25mL，按总黄酮含量测定法，在510nm波长处测定吸光度，A＝0.252。根据芦丁标准工作曲线，计算得竹叶总黄酮得率为1.12％。比较可知，应用机械化学技术可显著提高竹叶黄酮得率。

Claims

1.一种提取竹叶黄酮的方法，所述方法为：将干燥竹叶与固相试剂都投入球磨机中研磨均匀，取出球磨粉末，向所述球磨粉末中加入水，搅拌均匀，过滤得滤液A，滤液A浓缩至所述滤液A体积的1/4～1/8，加入无机酸调pH值至2～7，过滤，得滤液B，滤液B经大孔树脂层析柱，先用水作为洗脱剂洗脱，再以50％～80％的乙醇水溶液为洗脱剂洗脱，收集洗脱液，浓缩蒸去溶剂，干燥，得到竹叶黄酮提取物；所述的固相试剂为氢氧化钠、碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化钾、碳酸氢钾、碳酸钾、氢氧化钙、碳酸钙、磷酸氢二钠、氯化钠、硫酸钠、硅胶或硼砂中的一种或两种以上的任意组合；所述的干燥竹叶与固相试剂的质量比为5～25∶1；所述球磨粉末与所加入的水的质量比为1∶10～35；所述的无机酸为盐酸、冰醋酸或磷酸的水溶液；所述的大孔树脂为非极性或弱极性树脂。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述球磨机的转速为500～2500rpm，球磨时间为5～30min。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的水洗过程中，水的用量为0.5～1.5倍柱体积。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的固相试剂选自下列之一：氢氧化钠与硼砂质量比3∶1的混合、碳酸氢钠与硅胶质量比1∶1的混合、碳酸钠与硼砂质量比2∶1的混合或碳酸氢钾。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述球磨粉末加入水后，在温度为20～30℃条件下搅拌均匀。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述球磨粉末加入水后，搅拌时间为15～90min。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的大孔树脂为RS-4、LXA-8、AB-8、PAD-610、ADS-17、D-101或LX-28。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的加入无机酸调节pH值至4.0～6.0。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的洗脱剂的用量为2～3倍柱体积。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法按照如下步骤进行：将干燥竹叶与固相试剂按质量比为10～20∶1一起投入球磨机中，以转速1000～2000rpm，球磨10～20min，取出球磨粉末，向所述球磨粉末中加入质量为所述球磨粉末质量15～25倍的水，在20～30℃下搅拌20～60min，过滤，得滤液A，取滤液A浓缩至所述滤液A体积的1/4～1/8，加入冰醋酸调pH值至4.0～6.0；过滤，得滤液B，滤液B经AB-8大孔树脂层析柱，先用0.5～1.5倍柱体积的水作为洗脱剂洗脱，再用2～3倍柱体积的50％～80％的乙醇水溶液为洗脱剂来洗脱，收集洗脱液，浓缩蒸去溶剂，干燥，得到竹叶黄酮提取物；所述的固相试剂选自下列之一：氢氧化钠与硼砂质量比3∶1的混合、碳酸氢钠与硅胶质量比1∶1的混合、碳酸钠与硼砂质量比2∶1的混合或碳酸氢钾。