CN102526141A - 翼首草总环烯醚萜苷提取物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种翼首草总环烯醚萜苷提取物，它来源于川续断科植物匙叶翼首草Pterocephalus hookeri(C.B.Clarke)Hoeck的干燥全草，该提取物中，总环烯醚萜苷含量大于50％w/w。本发明还提供了该提取物的制备方法和用途。本发明提供的翼首草总环烯醚萜苷提取物，具有明显的抗佐剂性关节炎作用，抗炎镇痛作用良好，表明该翼首草总环烯醚萜苷提取物能够有效治疗类风湿性关节炎，为临床用药提供了新的选择。

Description

翼首草总环烯醚萜苷提取物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种翼首草总环烯醚萜苷提取物及其制备方法和用途，属于药物领域。

背景技术

类风湿关节炎(Rheumatiod Arthritis，简称RA)是一种常见的以慢性多关节炎病变为主要表现的全身性免疫性疾病，全世界共有上亿病人。据统计，RA国外的患病率为1～2％，个别地区高达5％；我国发病率约为0.74％，现有病人1000万人左右。据调查表明，在正常人群中，类风湿性关节炎的发病率占正常人群的0.35％左右。本病致残率高，未及时诊治的类风湿性关节炎患者二年致残率50％，三年致残率达70％。而已经患类风湿性关节炎的患者，平均寿命缩短10～15年，所以RA严重影响劳动能力，研制RA的治疗药物，对于缓解该类疾病的临床症状，提高病人的生存质量，保障生产力，具有积极的意义。

藏药翼首草，为川续断科植物匙叶翼首草Pterocephalus hookeri(C.B.Clarke)Hoeck的干燥全草，具有清热解毒、祛风湿、止痛功效。翼首草为藏医常用藏药，又名“榜姿毒乌”，为藏药特征明显的典型民族药物，用药历史悠久，藏医历来将其主要用于治疗风湿性等疾病，除藏医及其密切相关的蒙医外，中医药和其它传统医药基本没有应用翼首草的历史。在藏医药理论指导下，以翼首草的临床应用为依据，对翼首草提取物抗风湿性关节炎作用及机理进行了试验研究，结果表明：翼首草提取物抗RA作用是肯定的，对于实验性佐剂关节炎动物模型原发性炎症及继发性关节炎均有较好的抗炎效果，并能减轻滑膜的病理改变，同时也有明显的镇痛作用，这与藏医临床以翼首草治疗风湿、类风湿关节炎应用相吻合。(沈芃，藏药翼首草抗类风湿性关节炎作用与机理研究，成都中医药大学，2002年.)

对翼首草的化学成分研究表明，翼首草中主要含有齐墩果烷型三萜类皂苷、环烯醚萜苷类化合物、生物碱、多糖等成分。对翼首草有效成分的研究表明，采用大鼠急性足肿胀实验、小鼠棉球肉芽肿实验、小鼠急性耳肿胀实验和小鼠急性渗出实验等方法，证明了翼首草正丁醇部位总皂苷具有显著的抗炎活性[关昕璐，等.翼首草的抗炎作用与急毒实验研究.北京中医药大学学报.2004，27(2)：71～73]。翼首草中环烯醚萜苷类的主要成分马钱素，具有明显的抗炎药理作用，但其结构类似物具有免疫增强作用。[庞伟.藏药翼首草的研究与应用.中国民族医药杂志.2007，(5)：63-65]。专利申请号：200910196870.x，该发明中提供了翼首草总皂苷有效部位提取物，其主要成分为齐墩果烷型五环三萜皂苷，总皂苷含量50-90％，该总皂苷提取物能显著抑制肿瘤细胞增殖，该总皂苷提取物中直接采用大孔树脂分离得到，提取物中含有环烯醚萜苷。

综合现有文献可知，目前仅有翼首草中总皂苷及马钱素具有抗炎镇痛作用、以及总皂苷抗肿瘤的报道，还未见翼首草环烯醚萜苷治疗类风湿性关节炎的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种翼首草总环烯醚萜苷提取物及其制备方法。本发明的另一目的是提供了治疗类风湿性关节炎的药物组合物及其制备方法和用途。

本发明提供了一种翼首草总环烯醚萜苷提取物，它来源于川续断科植物匙叶翼首草Pterocephalus hookeri(C.B.Clarke)Hoeck的干燥全草，该提取物中，总环烯醚萜苷含量大于50％w/w。

其中，该提取物中，总环烯醚萜苷含量大于80％w/w。

进一步地，该提取物中，总环烯醚萜苷含量为80-90％w/w。

本发明还提供了上述翼首草总环烯醚萜苷提取物的制备方法，它包括如下操作步骤：

a、取翼首草，加水提取，滤过，滤液浓缩后，采用非极性或弱极性大孔吸附树脂上样，先以水洗去杂质后，弃去洗脱液；以60-85％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液后；

b、取步骤a的乙醇洗脱液，减压回收溶剂后，加入醋酸铅溶液，搅拌，滤过，取滤液，浓缩后，正丁醇萃取，取正丁醇层，回收溶剂后，干燥，即得翼首草总环烯醚萜苷提取物。

其中，步骤a中选用D101、AB-8或HPD-300型大孔吸附树脂；以65-75％v/v乙醇洗脱；步骤b中，取步骤a的乙醇洗脱液，减压回收溶剂后，复溶于30-95％v/v乙醇中，加入饱和中性醋酸铅溶液。

进一步地，步骤a中选用D101型大孔吸附树脂；以70％v/v乙醇洗脱；步骤b中，乙醇浓度为60-85％v/v。

更进一步地，步骤b中，乙醇浓度为65-75％v/v。

更进一步地，大孔吸附树脂洗脱的具体操作步骤如下：

将上样液的浓度配制为0.1-0.2g生药/ml，采用D101型大孔吸附树脂上样，上样流速为1-3BV/h，上样量以药材计为药材∶树脂＝(0.5-1.5)∶1w/w，以3-5BV水洗脱，流速为1-3BV/h，弃去洗脱液；以2-4BV的70％乙醇洗脱，洗脱流速为2-4BV/h。

优选地，将上样液的浓度配制为0.1g生药/ml，采用D101型大孔吸附树脂室温下上样，上样流速为2BV/h，上样量以药材计为药材∶树脂＝1∶1，以4BV水洗脱，流速为2BV/h，弃去洗脱液；以3BV的70％乙醇洗脱，洗脱流速为3BV/h。

本发明还提供了上述的翼首草总环烯醚萜苷提取物在制备抗炎、镇痛或治疗类风湿性关节炎的药物中的用途。

本发明还提供了一种治疗类风湿性关节炎的药物组合物，它是由上述的翼首草总环烯醚萜苷提取物为活性成分，加上药学上常用的辅料制备而成的制剂。

本发明提供的翼首草总环烯醚萜苷提取物，具有明显的抗佐剂性关节炎作用，抗炎镇痛作用良好，表明该翼首草总环烯醚萜苷提取物能够有效治疗类风湿性关节炎，为临床用药提供了新的选择。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1AA大鼠后肢原发性肿胀症状，左为正常对照组，右为模型对照组；

图2AA大鼠前肢继发性肿胀症状，左为正常对照组，右为模型对照组。

具体实施方式

实施例1本发明翼首草总环烯醚萜苷提取物的制备

取翼首草原药材1000g切段，加1600ml水润湿，再加6000ml水煎煮提取2次，每次1.5h，滤过，滤液浓缩，离心除去沉淀，水提物稀释至0.1g生药/ml药液，采用D101型大孔吸附树脂室温下上样，上样流速为2BV/h，上样量为树脂用量的1倍(药材∶树脂＝1∶1)，以4BV水洗脱，流速为2BV/h，弃去洗脱液；以3BV的70％乙醇洗脱，洗脱流速为3BV/h，洗脱液减压回收乙醇，溶于80％v/v乙醇中，加入过量饱和的中性醋酸铅溶液，搅拌，使得翼首草总皂苷完全沉淀，滤过，取滤液，减压回收乙醇至稠膏状，加水溶解，正丁醇萃取三次，取正丁醇液，减压回收溶剂至稠膏状，干燥，即得总环烯醚萜苷提取物。

以马钱苷为对照品，采用比色法测定提取物中总环烯醚萜苷的含量，结果见表1。

表1

翼首草总环烯醚萜苷中，环烯醚萜苷含量以马钱苷计，不应低于50％w/w，本发明中选用环烯醚萜苷含量不低于80％w/w的翼首草总环烯醚萜苷提取物。

本发明中，利用醋酸铅将翼首草三萜皂苷和环烯醚萜苷分离，原理参见《中药化学》，肖崇厚主编，上海科学技术出版社，1997年第1版，389页，440页。

实施例2本发明翼首草总环烯醚萜苷提取物的制备

取翼首草原药材1000g切段，加1600ml水润湿，再加6000ml水煎煮提取2次，每次1.5h，滤过，滤液浓缩，离心除去沉淀，水提物稀释至0.1g生药/ml药液，采用D101型大孔吸附树脂室温下上样，上样流速为2BV/h，上样量为树脂用量的1倍(药材∶树脂＝1∶1)，以4BV水洗脱，流速为2BV/h，弃去洗脱液；以3BV的70％乙醇洗脱，洗脱流速为3BV/h，洗脱液减压回收乙醇，溶于60％v/v乙醇中，加入过量饱和的中性醋酸铅溶液，搅拌，使得翼首草总皂苷完全沉淀，滤过，取滤液，减压回收乙醇至稠膏状，加水溶解，正丁醇萃取三次，取正丁醇液，减压回收溶剂至稠膏状，干燥，即得总环烯醚萜苷提取物。

实施例3本发明药物组合物的制备

取实施例1制备的总环烯醚萜苷提取物100g，并加入适当淀粉，湿法制粒后，干燥，即得本发明药物组合物颗粒剂。

实施例4本发明药物组合物的制备

取实施例1制备的总环烯醚萜苷提取物50g，并加入适当微晶纤维素，混匀后，装胶囊，即得本发明药物组合物胶囊剂。

以下通过药理、药效试验证明本发明翼首草总环烯醚萜苷提取物的有益效果。

试验例1翼首草总环烯醚萜苷提取物的药效研究

1.1实验动物

健康Sprague-Dawley(SD)大鼠，清洁级，全雄，体重180～220g；健康动物合格证号：SCXK(川)2008-24，均由四川省医学科学院实验动物研究所生产提供；实验动物饲养在24±2℃，黑夜和白昼各12小时交替的环境中，自由摄取干净的食物和饮水，动物适应环境3天后进行实验；动物饲养及实验操作过程严格遵守实验动物伦理及福利的相关规则(NIH guide for thecare and use of laboratory animals)。

1.2试验用药的配制

根据《中华人民共和国药典》2010版及《中华人民共和国卫生部藏药部颁标准》记载，成人日用量为3g/60kg(以原药材计)，因此，将翼首草环烯醚萜苷提取物B(实施例1制备)的大鼠给药剂量调整为1250mg原生药/kg。

1.3药品与试剂

尼美舒利分散片(Nimesulide)，南昌市飞弘药业有限公司，国药准字：H20020196，批号：091010，规格：0.1g/片，成人日用剂量：0.2g/60kg，试验用剂量：33.33mg/kg，实验时采用蒸馏水稀释配制成3.33mg/ml的药液备用；

吲哚美辛肠溶片(Indomethacin)，重庆科瑞制药有限公司，国药准字：H50020263，批号：310001，规格：25mg/片，成人日用剂量：75mg/60kg，试验用剂量：12.5mg/kg，实验时采用蒸馏水稀释分别配制成2.5、1.25mg/ml的药液备用；

完全弗氏佐剂(Freund’s Adjuvant Complete)，Sigma Chemical，批号：016K8900，规格：每毫升佐剂含1mg灭活结核杆菌；卡介苗冻干粉，北京生物制品研究所，批号：20100413，规格：60mg/支；1mg/ml的完全弗氏佐剂中再次加入一定剂量灭活的卡介菌，制备成每毫升含10mg灭活结核杆菌的完全弗氏佐剂，4℃冷藏保存备用。

角叉菜胶(Carrageenin)，Sigma Chemical，批号：073K0051。

1.4统计方法

采用SPSS 11.5统计软件进行统计分析。计量资料以Mean±SD表示结果，数据用单因数方差分析进行组间比较，方差齐则采用LSD检验，方差不齐则采用Tamhane’s T2检验；等级资料采用非参数检验进行组间比较；p＜0.05时，认为其组间差异有显著性。

2.对角叉菜胶致大鼠足肿胀的影响

2.1实验方法

健康雄性SD大鼠30只，按体重随机分为5组，分别为模型对照组、阳性对照组(吲哚美辛)和翼首草总环烯醚萜苷提取物B组。各组大鼠每天按设定剂量连续灌胃给药7天，模型对照组给予等体积溶媒。

试验前于右后足踝关节处作标记，按足容积法测定足容积两次，取平均值作为给药前正常足容积；末次给药后30min，于大鼠右后足跖部皮下注射1％角叉菜胶溶液0.1ml致炎，并分别于致炎后60、120、180、240min时，同法测定各组大鼠右后足容积，以足肿胀度(给药后足容积-给药前足容积)表示药物的抗炎效应。

2.2实验结果

大鼠右后足注射1％的角叉菜胶后，足爪出现明显的肿胀；与模型对照组比较，翼首草总环烯醚萜苷提取物B组能抑制角叉菜胶致大鼠足肿胀，表明翼首草总环烯醚萜苷提取物对急性炎症有一定的抑制作用。结果见表2。

 表2翼首草总环烯醚萜苷提取物对角叉菜胶致大鼠足肿胀的影响(

n＝10)

注：与模型对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。

3翼首草总环烯醚萜苷提取物对完全弗氏佐剂致大鼠佐剂性关节炎(AA)模型的影响

3.1AA大鼠模型的建立及给药方案

取健康雄性SD大鼠40只，按体重随机分为4组，分别为正常对照组、模型对照组、阳性对照组(尼美舒利)和翼首草总环烯醚萜苷提取物B组，每组10只大鼠。

参照文献方法造模，于每只大鼠右后足趾皮内注射0.1ml弗氏完全佐剂(每毫升佐剂含10mg灭活结核杆菌)，建立佐剂性关节炎大鼠模型；正常对照组大鼠右后足趾皮内注射0.1ml生理盐水。

大鼠皮内注射完全弗氏佐剂后，右后足出现明显肿胀，大约24h后达到高峰，持续3～5天后逐渐消肿，为急性炎症反应；造模后8～9天后再度出现的致炎侧关节和足跖肿胀，12天后逐渐出现非致炎侧及双前肢的关节和足跖肿胀，体重下降、皮色无光等症状，为继发性免疫性炎症反应，并视为佐剂性关节炎模型造模成功的指标，具体见下图1、图2。

致炎后，各组大鼠按照设定剂量连续给药30天，正常对照组及模型对照组大鼠给予等体积蒸馏水。

3.2对AA大鼠原发性关节肿胀的影响

3.2.1实验方法

各组大鼠于致炎前3天按设定剂量灌胃给药，正常及模型对照组给予等体积蒸馏水。采用容积法测定致炎前大鼠右后足足容积(ml)2次，取其平均值作为致炎前正常足容积；同时于致炎后6、12、24、36、48、72h测量致炎足容积，以致炎前后差值表示其肿胀度，观察翼首草总环烯醚萜苷提取物对AA大鼠急性原发性炎症的影响。

3.2.2.实验结果

与正常对照组比较，大鼠右后足注射完全弗氏佐剂后，右后足产生明显肿胀，在致炎后12～36h时肿胀达到峰值；与模型对照组比较，翼首草总环烯醚萜苷提取物B组能明显抑制完全弗氏佐剂所致AA大鼠原发性关节肿胀，表明翼首草总环烯醚萜苷提取物对原发性关节肿胀有明显抑制作用，结果见表3。

表3翼首草总环烯醚萜苷提取物对AA大鼠原发性足肿胀的影响(

n＝10)

注：与模型对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。

3.3对AA大鼠继发性关节肿胀的影响

3.3.1实验方法

采用容积法测定致炎前大鼠左后足(非致炎足)足容积(ml)2次，取其平均值，作为致炎前的正常足容积；并分别于致炎后第12、18、24、30天测定非致炎足(左足)的足容积变化，以观察翼首草总环烯醚萜苷提取物对AA大鼠继发性关节肿胀的影响。

3.3.2实验结果

与正常对照组比较，大鼠右后足注射完全弗氏佐剂12d后，左后足产生明显继发性肿胀，在致炎后24d时肿胀达到峰值；与模型组比较，翼首草总环烯醚萜苷提取物B组能明显抑制AA大鼠继发性足肿胀，表明翼首草总环烯醚萜苷提取物对完全弗氏佐剂免疫激发所致的继发性炎症有较强的抑制作用，结果见表4。

表4翼首草总环烯醚萜苷提取物对AA大鼠继发性足肿胀的影响(

n＝10)

注：与模型对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。

4.结论

翼首草总环烯醚萜苷提取物可明显抑制角叉菜胶致大鼠足肿胀、可明显降低AA大鼠原发性、继发性关节肿胀度，表明翼首草总环烯醚萜苷提取物可用于治疗类风湿性关节炎。

综上所述，本发明提供的翼首草总环烯醚萜苷提取物，具有明显的抗佐剂性关节炎作用，抗炎镇痛作用良好，表明该翼首草总环烯醚萜苷提取物能够有效治疗类风湿性关节炎，为临床用药提供了新的选择。

Claims (10)

1.一种翼首草总环烯醚萜苷提取物，其特征在于：它来源于川续断科植物匙叶翼首草Pterocephalus hookeri(C.B.Clarke)Hoeck的干燥全草，该提取物中，总环烯醚萜苷含量大于50％w/w。

2.根据权利要求1所述的翼首草总环烯醚萜苷提取物，其特征在于：该提取物中，总环烯醚萜苷含量大于80％w/w。

3.根据权利要求2所述的翼首草总环烯醚萜苷提取物，其特征在于：该提取物中，总环烯醚萜苷含量为80-90％w/w。

4.权利要求1-3任意一项所述翼首草总环烯醚萜苷提取物的制备方法，其特征在于：它包括如下操作步骤：

a、取翼首草，加水提取，滤过，滤液浓缩后，采用非极性或弱极性大孔吸附树脂上样，先以水洗去杂质后，弃去洗脱液；以60-85％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液后；

b、取步骤a的乙醇洗脱液，减压回收溶剂后，加入醋酸铅溶液，搅拌，滤过，取滤液，浓缩后，正丁醇萃取，取正丁醇层，回收溶剂后，干燥，即得翼首草总环烯醚萜苷提取物。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤a中选用D101、AB-8或HPD-300型大孔吸附树脂；以65-75％v/v乙醇洗脱；

步骤b中，取步骤a的乙醇洗脱液，减压回收溶剂后，复溶于30-95％v/v乙醇中，加入饱和中性醋酸铅溶液。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤a中选用D101型大孔吸附树脂；以70％v/v乙醇洗脱；步骤b中，乙醇浓度为60-85％v/v。

7.根据权利要求4-6任意一项所述的制备方法，其特征在于：大孔吸附树脂洗脱的具体操作步骤如下：

将上样液的浓度配制为0.1-0.2g生药/ml，采用D101型大孔吸附树脂上样，上样流速为1-3BV/h，上样量以药材计为药材∶树脂＝(0.5-1.5)∶1w/w，以3-5BV水洗脱，流速为1-3BV/h，弃去洗脱液；以2-4BV的70％乙醇洗脱，洗脱流速为2-4BV/h。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：将上样液的浓度配制为0.1g生药/ml，采用D101型大孔吸附树脂室温下上样，上样流速为2BV/h，上样量以药材计为药材∶树脂＝1∶1，以4BV水洗脱，流速为2BV/h，弃去洗脱液；以3BV的70％乙醇洗脱，洗脱流速为3BV/h。

9.权利要求1-3任意一项所述的翼首草总环烯醚萜苷提取物在制备抗炎、镇痛或治疗类风湿性关节炎的药物中的用途。

10.一种治疗类风湿性关节炎的药物组合物，其特征在于：它是由权利要求1-3任意一项所述的翼首草总环烯醚萜苷提取物为活性成分，加上药学上常用的辅料制备而成的制剂。

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