CN102579519A - 翼首草总苷提取物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了翼首草总苷提取物，它来源于川续断科植物匙叶翼首草Pterocephalus hookeri(C.B.Clarke)Hoeck的干燥全草，该提取物中，总皂苷和总环烯醚萜苷的总含量不低于50％w/w，其中，含有马钱苷0.45-0.78％w/w，齐墩果酸0.2-0.45％w/w，熊果酸0.65-1.1％w/w。本发明还提供了该提取物的制备方法和用途。本发明翼首草总苷提取物具有良好的抗炎镇痛作用，对机体特异性细胞免疫有一定的抑制效果，并且能够通过降低类风湿性关节炎的促炎症因子水平和提高机体抗氧化能力，有效地治疗类风湿性关节炎，疗效确切，为临床用药提供了一种新的选择。

Description

翼首草总苷提取物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种翼首草总苷提取物及其制备方法和用途，属于药物领域。

背景技术

类风湿关节炎(Rheumatiod Arthritis，简称RA)是一种常见的以慢性多关节炎病变为主要表现的全身性免疫性疾病，全世界共有上亿病人。据统计，RA国外的患病率为1～2％，个别地区高达5％；我国发病率约为0.74％，现有病人1000万人左右。据调查表明，在正常人群中，类风湿性关节炎的发病率占正常人群的0.35％左右。本病致残率高，未及时诊治的类风湿性关节炎患者二年致残率50％，三年致残率达70％。而已经患类风湿性关节炎的患者，平均寿命缩短10～15年，所以RA严重影响劳动能力，研制RA的治疗药物，对于缓解该类疾病的临床症状，提高病人的生存质量，保障生产力，具有积极的意义。

藏药翼首草，为川续断科植物匙叶翼首草Pterocephalus hookeri(C.B.Clarke)Hoeck的干燥全草，具有清热解毒、祛风湿、止痛功效。翼首草为藏医常用藏药，又名“榜姿毒乌”，为藏药特征明显的典型民族药物，用药历史悠久，藏医历来将其主要用于治疗风湿性等疾病，除藏医及其密切相关的蒙医外，中医药和其它传统医药基本没有应用翼首草的历史。在藏医药理论指导下，以翼首草的临床应用为依据，对翼首草提取物抗风湿性关节炎作用及机理进行了试验研究，结果表明：翼首草提取物抗RA作用是肯定的，对于实验性佐剂关节炎动物模型原发性炎症及继发性关节炎均有较好的抗炎效果，并能减轻滑膜的病理改变，同时也有明显的镇痛作用，这与藏医临床以翼首草治疗风湿、类风湿关节炎应用相吻合。(沈芃，藏药翼首草抗类风湿性关节炎作用与机理研究，成都中医药大学，2002年.)

对翼首草的化学成分研究表明，翼首草中主要含有齐墩果烷型三萜类皂苷、环烯醚萜苷类化合物、生物碱、多糖等成分。对翼首草有效成分的研究表明，采用大鼠急性足肿胀实验、小鼠棉球肉芽肿实验、小鼠急性耳肿胀实验和小鼠急性渗出实验等方法，证明了翼首草正丁醇部位总皂苷具有显著的抗炎活性[关昕璐，等.翼首草的抗炎作用与急毒实验研究.北京中医药大学学报.2004，27(2)：71～73]。翼首草中环烯醚萜苷类的主要成分马钱素，具有明显的抗炎药理作用，但其结构类似物具有免疫增强作用。[庞伟.藏药翼首草的研究与应用.中国民族医药杂志.2007，(5)：63-65]。专利申请号：200910196870.x，该发明中提供了翼首草总皂苷有效部位提取物，其主要成分为齐墩果烷型五环三萜皂苷，总皂苷含量50-90％，该总皂苷提取物能显著抑制肿瘤细胞增殖，该总皂苷提取物中直接采用大孔树脂分离得到，提取物中含有环烯醚萜苷。

综合现有文献可知，目前仅有翼首草中总皂苷及马钱素具有抗炎镇痛作用、以及总皂苷抗肿瘤的报道，还未见翼首草总苷提取物治疗类风湿性关节炎的活性成分的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种翼首草总苷提取物及其制备方法和用途。本发明的另一目的在于提供了一种治疗类风湿性关节炎的药物组合物。

本发明提供了一种翼首草总苷提取物，它来源于川续断科植物匙叶翼首草Pterocephalus hookeri(C.B.Clarke)Hoeck的干燥全草，该提取物中，总皂苷和总环烯醚萜苷的总含量不低于50％w/w，其中，含有马钱苷0.45-0.78％w/w，齐墩果酸0.2-0.45％w/w，熊果酸0.65-1.1％w/w。

进一步地，该提取物中，含有马钱苷0.6-0.7％w/w，齐墩果酸0.3-0.4％w/w，熊果酸0.8-1.0％w/w。

本发明还提供了上述翼首草总苷提取物的制备方法，它包括如下步骤：

取翼首草，加水煎煮提取，滤过，滤液浓缩后，采用非极性或弱极性大孔吸附树脂上样，先以水洗去杂质后，弃去洗脱液；以60-85％v/v乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液后，回收溶剂，干燥，即得翼首草总苷提取物。

其中，大孔吸附树脂为D101、AB-8或HPD-300；洗脱用乙醇为65-75％v/v。

进一步地，选用D101型大孔吸附树脂；以70％v/v乙醇洗脱。

更进一步地，大孔吸附树脂洗脱的具体操作步骤如下：

将上样液的浓度配制为0.1-0.2g生药/ml，采用D101型大孔吸附树脂上样，上样流速为1-3BV/h，上样量以药材计为药材∶树脂＝(0.5-1.5)∶1w/w，以3-5BV水洗脱，流速为1-3BV/h，弃去洗脱液；以2-4BV的70％乙醇洗脱，洗脱流速为2-4BV/h。

进一步优选地，将上样液的浓度配制为0.1g生药/ml，采用D101型大孔吸附树脂室温下上样，上样流速为2BV/h，上样量为树脂用量的1倍(药材∶树脂＝1∶1)，以4BV水洗脱，流速为2BV/h，弃去洗脱液；以3BV的70％乙醇洗脱，洗脱流速为3BV/h。

本发明还提供了上述翼首草总苷提取物在制备抗炎、镇痛或治疗类风湿性关节炎的药物中的用途。

本发明还提供了一种治疗类风湿性关节炎的药物组合物，它是由上述的翼首草总苷提取物为活性成分，加上药学上常用的辅料制备而成的制剂。

本发明翼首草总苷提取物具有良好的抗炎镇痛作用，对机体特异性细胞免疫有一定的抑制效果，并且能够通过降低类风湿性关节炎的促炎症因子水平和提高机体抗氧化能力，有效地治疗类风湿性关节炎，疗效确切，为临床用药提供了一种新的选择。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。

凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1本发明翼首草提取物有效部位筛选工艺；

图2AA大鼠后肢原发性和继发性肿胀(左上A：正常组；中上B：模型对照组；右上C：尼美舒利组；左下D：翼首草总苷提取物高剂量组；中下E：翼首草总苷提取物中剂量组；右下F：翼首草总苷提取物低剂量组)

图3AA大鼠前肢继发性肿胀(分组如上图2)

具体实施方式

实施例1本发明翼首草总苷提取物的制备

取翼首草原药材1000g切段，加1600ml水润湿，6000ml水煎煮提取2次，每次1.5h，滤过，滤液浓缩后，离心除去沉淀，水提物稀释至0.1g生药/ml药液，采用D101型大孔吸附树脂室温下上样，上样流速为2BV/h，上样量为树脂用量的1倍(药材∶树脂＝1∶1)，以4BV水洗脱，流速为2BV/h，弃去洗脱液；以3BV的70％乙醇洗脱，洗脱流速为3BV/h，洗脱液减压回收乙醇至稠膏状，低温干燥或冷冻干燥，粉碎，过四号筛，即得总苷提取物。

实施例2翼首草总苷提取物的含量检测

一、提取物中总苷的含量测定

照比色法(《中华人民共和国药典》2010版一部附录VA)测定。

对照品溶液的制备：取马钱苷对照品适量，精密称定，加蒸馏水制成每100ml中含6mg的溶液，即得。

标准曲线的制备：取马钱苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成60μg/ml的溶液。分别精密量取对照品溶液0.6ml，0.8ml，1.0ml，1.2ml，1.4ml，1.6ml至比色管中，挥去溶剂，放冷。依次精密加入新鲜配制的5％香草醛-冰乙酸溶液0.2ml，高氯酸0.8ml，于60℃水浴中加热显色15min后，冰浴冷却5min，分别精密加入冰乙酸5ml混匀，备用。空白溶液的制备同上法。照比色法(《中华人民共和国药典》2010版一部附录VA)在535nm的波长处分别测定吸光度，以吸光度做纵坐标，浓度做横坐标，绘制标准曲线，得回归方程。

测定法：精密称取实施例1制备的提取物0.15g，置100ml于量瓶中，甲醇溶解，精密吸取100μl至比色管中，挥去溶剂，放冷。依次精密加入新鲜配制的5％香草醛-冰乙酸溶液0.2ml，高氯酸0.8ml，于60℃水浴中加热显色15min后，冰浴冷却5min，分别精密加入冰乙酸5ml混匀，作为供试品溶液。空白溶液的制备同上法。

按上文方法测定实施例1制备的3批翼首草提取物中总苷的含量，结果见表1。

表1样品含量测定结果(n＝2)

由上述结果可知，本提取物按干燥品计算，含总皂苷和总环烯醚萜苷总量以马钱苷(C₂₁H₂₂O₁₁)计，不得少于50％。

二、提取物中有效成分的含量测定

(一)马钱苷的测定

照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录VI D)测定。

色谱条件与系统适用性实验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(12∶88)为流动相；检测波长为240nm；理论塔板数按马钱苷峰计算应不低于3000。

对照品溶液的制备：精密称取马钱苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含60μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：取实施例1制备的提取物约0.1g，精密称定，置25ml量瓶中，加入甲醇适量使溶解，再加甲醇至刻度，摇匀。置3000r/min离心机中离心20min，微孔滤膜滤过，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品按干燥品计算，含马钱苷(C₂₁H₂₂O₁₁)不得少于0.30％。

表2样品含量测定结果(n＝2)

(二)熊果酸和齐墩果酸的含量测定

色谱条件与系统适用性实验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.1mol/L乙酸铵溶液(85∶15)作为流动相；检测波长为210nm；理论塔板数按熊果酸峰计算应不低于3000。

对照品溶液的制备：精密称取齐墩果酸对照品、熊果酸对照品适量，加甲醇制成每1ml含齐墩果酸0.1mg、熊果酸0.1mg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：取实施例1制备的提取物约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入90％甲醇溶液各50ml，再精密加入盐酸0.15ml，称定重量，80℃水浴回流30min，放冷，再称定重量，加甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品按干燥品计算，含齐墩果酸(C₃₀H₄₈O₃)、熊果酸(C₃₀H₄₈O₃)的总量不得少于1.00％。

表3样品含量测定结果(n＝2)

以下通过药理、药效试验证明本发明翼首草提取物的有益效果。

试验例1本发明翼首草有效提取部位的筛选

按图1的提取路径，制备出A、B、C三种不同的翼首草提取部位，考察各部位的抗炎镇痛作用。其中，大孔树脂纯化方法参见实施例1。

1.1、对角叉菜胶致小鼠足肿胀的影响

翼首草提取部位B、C及翼首草水提液对角叉菜胶致小鼠足肿胀均有显著抑制作用。其中B部位作用最强，但稍弱于消炎痛。

1.2、对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响

翼首草提取部位B及翼首草水提液对二甲苯致小鼠耳廓肿胀均有抑制作用。其中B部位作用较强，但稍弱于消炎痛。

1.3、对冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增加的影响

翼首草提取部位B、C及翼首草水提液对醋酸致小鼠腹腔通透性增强均有抑制作用。其中B部位作用较强，但稍弱于消炎痛。

1.4、对冰醋酸致小鼠扭体反应的影响

翼首草提取部位A、B、C及翼首草水提液对醋酸致小鼠扭体反应均有抑制作用，延长扭体潜伏期，减少扭体次数。其中B部位作用相对较强，但稍弱于消炎痛。

1.5、翼首草各提取部位抗炎镇痛作用比较

由表4可知，B、C及翼首草水提液具有抗炎镇痛作用，而B部位作用相比更明显。拟将B部位作为今后抗类风湿性关节炎药效实验的受试药物。

表4翼首草各提取物药效筛选比较

此外，翼首草水提液、适当浓缩、上样大孔树脂，70％乙醇冲洗得到样品，经验证试验结果表明与样品B的抗炎镇痛作用无显著性差异。因此，以70％乙醇洗脱物为基础，作进一步药效研究。

试验例2翼首草总苷提取物的药效研究

1、翼首草总苷提取物抗炎药效作用研究

1.1、受试药物

翼首草总苷提取物(TGP)按实施例1制备。翼首草总苷提取物试验用设计剂量为2.5、1.25、0.625g/kg(小鼠)，1.25、0.625、0.3125g/kg(大鼠)，均为折合成生药量。

1.2、动物、试剂、阳性药、仪器

动物：健康Sprague-Dawley(SD)大鼠，清洁级，全雄，体重180～220g，由四川省医学科学院实验动物研究所提供，动物合格证号：SCXK(川)2008-24；KM小鼠，普通级，雌雄各半，体重为18～22克，由四川省医学科学院实验动物研究所生产，动物合格证号：SCXK(川)2008-24；实验动物饲养在24±2℃，黑夜和白昼各12小时交替的环境中，自由摄取干净的食物和饮水；

试剂：角叉菜胶(Carrageenin)，Sigma Chemical，批号：073K0051；二甲苯(Xylene)，汕头市西陇化工厂，批号：021004；伊文思蓝(Evans blue)，Sigma Chemical，批号：GD4061465；冰醋酸(Acetic acid)，成都科龙化工试剂厂，批号：20090922；琼脂粉(Agar powder)，成都科龙化工试剂厂，批号：20091110；

阳性药：吲哚美辛肠溶片(Indomethacin)，重庆科瑞制药有限公司，国药准字：H50020263，批号：310001，规格：25mg/片，成人日用剂量：75mg/60kg，小鼠试验用剂量：25mg/kg，大鼠试验用剂量为12.5mg/kg，实验时采用蒸馏水稀释分别配制成2.5、1.25mg/ml的药液备用；

1.3、对角叉菜胶致大鼠足肿胀的影响

1.3.1、方法

健康雄性SD大鼠50只，按体重随机分为5组，分别为模型对照组、阳性对照组(吲哚美辛)和翼首草总苷提取物高、中、低剂量组。各组大鼠每天按设定剂量连续灌胃给药7天，模型对照组给予等体积溶媒。

试验前于右后足踝关节处作标记，按足容积测定法测定足容积两次，取平均值作为给药前正常足容积；末次给药后30min，于大鼠右后足跖部皮下注射1％角叉菜胶溶液0.1ml致炎，并分别于致炎后60、120、180、240min时，同法测定各鼠右后足容积，以足肿胀度(给药后足容积-给药前足容积)表示药物抗炎效应。

1.3.2、结果

大鼠右后足注射1％的角叉菜胶后，右后足产生明显肿胀；与模型对照组比较，翼首草总苷提取物各剂量组均能明显抑制角叉菜胶致大鼠足肿胀，提示翼首草总苷提取物对急性炎症有较强的抑制作用，其中尤以高剂量组作用最为明显，其作用于消炎痛相当。结果见表5。

表5翼首草总苷提取物对角叉菜胶致大鼠足肿胀的影响(

n＝10)

与模型对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。

1.4、对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响

1.4.1、方法

健康雄性KM小鼠50只，按体重随机分为5组，分别为模型对照组、阳性对照组(吲哚美辛)和翼首草总苷提取物高、中、低剂量组。各组每天按设定剂量连续灌胃给药5天，模型对照组给予等体积溶媒。

末次给药后1h，将20μl二甲苯涂于小鼠右耳廓两面致炎，左耳不涂为对照，致炎后1h处死小鼠，剪下小鼠双耳廓，用直径8mm的打孔器在两耳对称位置取下左右耳片称重，以左右耳片重量差作为耳廓肿胀度表示药物抗炎效应，并计算抑制率，抑制率＝100％×(给药组肿胀度-对照组肿胀度)÷对照组肿胀度。

1.4.2、结果

小鼠右耳涂抹二甲苯后，右耳产生明显肿胀；与模型组比较，翼首草总苷提取物各剂量组均能明显抑制二甲苯致小鼠耳肿胀，提示翼首草总苷提取物对二甲苯所致的急性炎症有较强抑制作用，其中尤以高剂量作用最为明显，其作用稍优于消炎痛。结果见表6。

表6翼首草总苷提取物对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响(

n＝10)

与模型对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。

1.5、对冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增加的影响

1.5.1、方法

健康雄性KM小鼠50只，按体重随机分为5组，分别为模型对照组、阳性对照组(吲哚美辛)和翼首草总苷提取物高、中、低剂量组。各组每天按设定剂量连续灌胃给药5天，模型对照组给予等体积溶媒；末次给药后1h，按0.15ml/10g(体重)小鼠尾静脉注射(iv)1％依文思兰溶液，同时腹腔注射(ip)0.7％醋酸溶液0.2ml/只。

20min后处死小鼠，用5ml蒸馏水冲洗小鼠腹腔，收集冲洗液，3000r/min离心5min，取上清液于分光光度计590nm处比色，以吸光度(OD)值判断小鼠腹腔毛细血管的通透性，并计算抑制率，抑制率＝100％×(给药组OD-对照组OD)÷对照组OD。

1.5.2、结果

小鼠接受醋酸腹腔注射后，腹腔毛细血管通透性明显增加，表现为OD值升高；与模型对照组比较，翼首草总苷提取物高、中剂量组均能明显抑制醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增加，提示翼首草总苷提取物对醋酸所致的急性炎性渗出有较强抑制作用，其中尤以高剂量作用最为明显，其作用稍弱于消炎痛。结果见表7。

表7翼首草总苷提取物对醋酸致小鼠腹腔通透性增加的影响(

n＝10)

与模型对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。

1.6、对琼脂致小鼠肉芽肿的影响

1.6.1、方法

健康雄性KM小鼠50只，按体重随机分为5组，分别为模型对照组、阳性对照组(吲哚美辛)和翼首草总苷提取物高、中、低剂量组。各组每天按设定剂量连续灌胃给药9天，模型对照组给予等体积溶媒。

于给药第1天，小鼠背中线皮下注射2％琼脂0.4ml/只；末次给药后第2天将各组动物处死。手术摘取完整肉芽组织，剔除脂肪组织，电子天平称重，并计算抑制率，抑制率＝100％×(给药组肉芽肿重量-对照组肉芽肿重量)÷对照组肉芽肿重量。

1.6.2、结果

与模型对照组比较，翼首草总苷提取物高剂量组能明显抑制琼脂致小鼠肉芽肿，而中剂量对肉芽肿也有抑制趋势，但无统计学意义，提示翼首草总苷提取物对琼脂所致的慢性炎症有较强抑制作用，其中尤以高剂量组作用最为明显，其作用与消炎痛相当。结果见表8。

表8翼首草总苷提取物对琼脂致小鼠肉芽肿的影响(

n＝10)

与模型对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。

1.7、小结

翼首草总苷提取物能明显减轻角叉菜胶所致大鼠足肿胀、二甲苯所致小鼠耳肿胀及琼脂所致小鼠肉芽肿的程度，降低醋酸所致的小鼠腹腔毛细血管通透性增加，对各种急慢性炎症均有良好的抑制作用。

2、翼首草总苷提取物镇痛药效作用研究

2.1、受试药物

翼首草总苷提取物由实施例1制备得到。翼首草总苷提取物试验用设计剂量为2.5、1.25、0.625g/kg(小鼠)，1.25、0.625、0.3125g/kg(大鼠)，均为折合成生药量。

2.2、动物、试剂、阳性药、仪器

动物：KM小鼠，普通级，雌雄各半，体重为18～22克，Sprague-Dawley(SD)大鼠，清洁级，全雄，体重180～220g，均由四川省医学科学院实验动物研究所生产，动物合格证号：SCXK(川)2008-24；实验动物饲养在24±2℃，黑夜和白昼各12小时交替的环境中，自由摄取干净的食物和饮水；

试剂：冰醋酸(Acetic acid)，成都科龙化工试剂厂，批号：20090922；琼脂粉(Agar powder)，成都科龙化工试剂厂，批号：20091110；完全弗氏佐剂(Freund’s adjuvant complete)，Sigma Chemical，批号：016K8900，规格：每毫升佐剂含1mg灭活结核杆菌；卡介苗冻干粉，北京生物制品研究所，批号：20100413，规格：60mg/支；完全弗氏佐剂中再次加入一定剂量灭活的卡介菌，制备成每毫升含10mg灭活结核杆菌的完全弗氏佐剂，4℃保存备用；

阳性药：吲哚美辛肠溶片(Indomethacin)，重庆科瑞制药有限公司，国药准字：H50020263，批号：310001，规格：25mg/片，成人日用剂量：75mg/60kg，小鼠试验用剂量：25mg/kg，实验时采用蒸馏水稀释分别配制成2.5mg/ml的药液备用；盐酸吗啡注射液(Morphine)，青海制药有限公司，国药准字：H63020013，批号：920502，规格：10mg/ml，成人日用剂量：10mg/60kg，试验用剂量：3.33mg/kg，实验时采用生理盐水稀释配制成0.33mg/ml的溶液备用；尼美舒利分散片(Nimesulide)，南昌市飞弘药业有限公司，国药准字：H20020196，批号：091010，规格：0.1g/片，成人日用剂量：0.2g/60kg，试验用剂量：33.33mg/kg，实验时采用蒸馏水稀释配制成3.33mg/ml的药液备用；

仪器：Sp YLS-6A智能热板仪，山东省医学科学院设备站；YLS-3E电子压痛仪，山东省医学科学院设备站。

2.3、对热刺激致小鼠疼痛反应的影响

2.3.1、方法

健康KM小鼠100只，全雌。实验前，每次放1只于热板仪(55±0.5℃)上，立刻计时，记录小鼠从置于热板上到出现舔后足所需要的时间(s)，作为该小鼠的正常痛阈值。凡舔后足时间小于5s或大于30s以及跳跃不安者，均弃之不用。

筛选出合格的小鼠50只，随机分为5组，分别为正常对照组、阳性对照组(盐酸吗啡)和翼首草总苷提取物高、中、低剂量组。各组每天按设定剂量连续灌胃给药3天，阳性对照组仅于末次给药时腹腔注射盐酸吗啡1次，正常对照组给予等体积溶媒。

末次给药后15、30、60、90min分别测定各只小鼠痛阈值1次，如60s内无反应的小鼠，应立即取出，以免烫伤，痛阈值按60s计算；并计算镇痛百分率，镇痛百分率＝100％×(给药后痛阈值-给药前痛阈值)÷给药前痛阈值。

2.3.2、结果

与正常组比较，翼首草总苷提取物2500mg/kg在给药后30min时显示出延长小鼠痛阈值的作用，而其余任何时间及任何剂量的翼首草总苷提取物均无明显延长痛阈值的作用，可见翼首草总苷提取物对热刺激引起的中枢性疼痛抑制作用较弱。结果见表9。

表9翼首草总苷提取物对热刺激致小鼠疼痛反应(痛阈值)的影响(

n＝10)

与正常对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。

2.4、对冰醋酸致小鼠扭体反应的影响

2.4.1、方法

取健康KM小鼠50只，雌雄各半，随机分为5组，分别为模型对照组、阳性对照组(吲哚美辛)和翼首草总苷提取物高、中、低剂量组。各组每天按设定剂量连续灌胃给药5天，模型对照组给予等体积溶媒。

末次给药后30min，小鼠腹腔注射0.7％醋酸溶液02.ml/只，观察小鼠出现扭体反应的潜伏期(min)及15min内扭体反应的次数。以小鼠腹部凹陷，双后肢伸展为扭体反应指标。

2.4.2、结果

小鼠腹腔注射0.7％醋酸溶液，可出现明显的扭体反应；与对照组比较，翼首草总苷提取物高、中剂量能明显延长醋酸致小鼠扭体反应潜伏期，而翼首草总苷提取物各剂量均能明显减少醋酸所致的扭体反应次数，提示翼首草总苷提取物对醋酸所致的炎性疼痛有较强抑制作用，其中尤以高剂量组作用最为明显。结果见表10。

表10翼首草总苷提取物对醋酸致小鼠扭体反应的影响(

n＝10)

与模型对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。

翼首草总苷提取物能明显延长醋酸所致小鼠扭体反应的扭体潜伏期，减少小鼠扭体次数，表现出较强的外周镇痛作用。

3、翼首草总苷提取物免疫调节药效作用研究

3.1、受试药物

翼首草总苷提取物由实施例1制备得到。翼首草总苷提取物试验用设计剂量为2.5、1.25、0.625g/kg(小鼠)，均为折合成生药量。

3.2、动物、试剂、阳性药、仪器

动物：KM小鼠，普通级，雌雄各半，体重为18～22克，由四川省医学科学院实验动物研究所生产，动物合格证号：SCXK(川)2008-24；实验动物饲养在24±2℃，黑夜和白昼各12小时交替的环境中，自由摄取干净的食物和饮水；

试剂：印度墨汁(India ink)，麦亘生物科技有限公司，批号：I8060；2，4-二硝基氯苯(2，4-dinitrochlorobenzene，DNCB)，四川西亚化工股份有限公司，批号：201002161；鸡红细胞悬液(CRBC)，鸡血取自成都市温江区天府菜市场，以艾氏液自行配制；

阳性药：醋酸地塞米松片(Dexamethasone)，成都市第一制药有限公司，国药准字：H50020263，批号：100402，规格：0.75mg/片，成人日用剂量：1.5mg/60kg，试验用剂量：0.5mg/kg，实验时采用蒸馏水稀释配制成0.05mg/ml的药液备用；

3.3、对正常小鼠炭粒廓清能力的影响

3.3.1、方法

取KM小鼠50只，雌雄各半，按体重随机分为5组，分别为正常对照组、阳性对照组(地塞米松)和翼首草总苷提取物高、中、低剂量组。各组连续给药7d，正常足给予等体积溶媒。末次给药后30min，各组小鼠按体重(0.1ml/10g)尾静脉注射(iv)20％的印度墨汁，并于注射后第2min、12min以毛细玻璃管于小鼠眼眶内眦静脉丛取血20μl，加入0.1％Na₂CO₃2ml中，摇匀，置分光光度计于波长600nm处比色，测定吸光度(A)。将小鼠脱颈椎处死，分别称取肝、脾重量，计算廓清指数K和校正廓清指数α，K＝(logA₁-logA₂)÷(t₂-t₁)×100％，

3.3.2、结果

与正常小鼠比较，给予翼首草总苷提取物治疗7天后的小鼠，其廓清指数K和校正廓清指数α均有一定程度的下降，但无统计学意义，说明其对机体非特异性免疫的抑制作用不明显。结果见表11。

表11翼首草总苷提取物对正常小鼠碳粒廓清的影响(

n＝10)

与正常对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。

3.4、对正常小鼠血清溶血素生成的影响

3.4.1、方法

取KM小鼠50只，雌雄各半，按体重随机分为5组，分别为正常对照组、阳性对照组(地塞米松)和翼首草总苷提取物高、中、低剂量组。各组每天按设定剂量连续灌胃给药8天，正常对照组给予等体积溶媒。

给药第1天，小鼠腹腔注射5％鸡红细胞悬液(CRBC)0.2ml/只，致敏后第8天进行试验。末次给药后60min，小鼠摘眼球取血，3000r/min离心10min，吸取血清10μl，加入1ml生理盐水中，加入5％CRBC悬液0.5ml，再加入10％补体0.5ml混合(取2只豚鼠血，3000r/min离心10min，取血清，加入生理盐水配制成10％溶液备用)，于37℃反应30min，冰浴终止反应，2000r/min离心10min，取上清液，于540nm处，以不加补体作为对照，测定吸光度值(A)作为血清素抗体含量指标。

3.4.2、结果

与正常组比较，翼首草总苷提取物对正常小鼠血清溶血素生成无明显影响，说明其对机体特异性体液免疫的抑制作用不明显。结果见表12。

表12翼首草总苷提取物对正常小鼠血清溶血素生成的影响(n＝10)

与正常对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。

3.5、对2，4-二硝基氯苯(DNCB)致小鼠皮肤迟发性过敏(DTH)反应的影响

3.5.1、方法

取KM小鼠50只，雌雄各半，按体重随机分为5组，分别为正常对照组、阳性对照组(地塞米松)和翼首草总苷提取物高、中、低剂量组。各组每天按设定剂量连续灌胃给药8天，正常对照组给予等体积溶媒。

给药第5天，小鼠腹部以8％的硫化钠溶液脱毛3×3cm²，以2.5％DNCB溶液(丙酮和麻油1∶1为溶剂新鲜配制)20μl均匀涂抹于小鼠腹部致敏；给药第7d，以1％的DNCB溶液20μl均匀涂于小鼠右耳，24h后脱颈椎处死动物，以8mm打孔器取两耳同一部位圆片，称重，并取脾脏、胸腺称重，计算耳肿胀度及脾、胸腺指数。脾/胸腺指数＝脾/胸腺(mg)÷体重(g)。

3.5.2、结果

与正常组比较，翼首草总苷提取物高剂量对DNCB诱导的小鼠DTH反应有一定的抑制作用，并对脾脏表现出一定的抑制作用，说明其对机体特异性细胞免疫有一定的抑制作用。结果见表13。

表13翼首草总苷提取物对DNCB诱导小鼠DHT的影响(n＝10)

与正常对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。

3.6、小结

翼首草总苷提取物对免疫功能的有一定调节能力，主要表现为对机体特异性细胞免疫有一定的抑制作用，而对机体特异性体液免疫及非特异性免疫功能抑制作用不明显。

4、翼首草总苷提取物抗类风湿性关节炎药效作用及机制研究

4.1、受试药物

翼首草总苷提取物由实施例1制备得到。翼首草总苷提取物试验用设计剂量为1.25、0.625、0.3125g/kg(大鼠)，均为折合成生药量。

4.2、动物、试剂、阳性药、仪器

动物：健康Sprague-Dawley(SD)大鼠，清洁级，全雄，体重180～220g，由四川省医学科学院实验动物研究所提供，动物合格证号：SCXK(川)2008-24；实验动物饲养在24±2℃，黑夜和白昼各12小时交替的环境中，自由摄取干净的食物和饮水；

试剂：完全弗氏佐剂(Freund’s adjuvant complete)，Sigma Chemical，批号：016K8900，规格：每毫升佐剂含1mg灭活结核杆菌；卡介苗冻干粉，北京生物制品研究所，批号：20100413，规格：60mg/支；完全弗氏佐剂中再次加入一定剂量灭活的卡介菌，制备成每毫升含10mg灭活结核杆菌的完全弗氏佐剂，4℃保存备用；超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)检测试剂盒均由南京建成生物技术研究所提供，批号：20101221；大鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、前列腺素E2(PGE2)为美国RD公司进口分装，均由上海活乐生物科技有限公司提供，批号：201012；

阳性药：尼美舒利分散片(Nimesulide)，南昌市飞弘药业有限公司，国药准字：H20020196，批号：091010，规格：0.1g/片，成人日用剂量：0.2g/60kg，试验用剂量：33.33mg/kg，实验时采用蒸馏水稀释配制成3.33mg/ml的药液备用；

4.3、完全弗氏佐剂致佐剂性关节炎(AA)大鼠模型建立

取健康雄性SD大鼠60只，按体重随机分为6组，分别为正常对照组、模型对照组、阳性对照组(尼美舒利)和翼首草总苷提取物高、中、低剂量组，每组10只。参照文献方法造模，于每只大鼠右后足趾皮内注射0.1ml弗氏完全佐剂(每毫升佐剂含10mg灭活结核杆菌)，建立佐剂性关节炎(AA)大鼠模型。注射完全弗氏佐剂后，大鼠右后足出现明显肿胀，大约24h后达到高峰，持续3～5天后逐渐消肿；造模后8～9天后再度出现的致炎侧关节和足跖肿胀，12天后逐渐出现非致炎侧及双前肢的关节和足跖肿胀，体重下降、皮色无光等症状，为造模成功的指标，具体见图2和3。致炎后，按照设定剂量连续给药30天，正常及模型对照组给予等体积蒸馏水。

4.4、对AA大鼠原发性肿胀的影响

4.4.1、方法

致炎前3天按设定剂量灌胃给药，正常及模型对照组给予等体积蒸馏水。采用容积法测定致炎前大鼠右后肢正常足容积(ml)，同时于致炎后6、12、24、36、48、72h测量致炎足容积，以致炎前后差值表示其肿胀度，观察药物对AA大鼠急性炎症的影响。

4.4.2、结果

与正常对照组比较，大鼠右后足注射完全弗氏佐剂后，右后足产生明显肿胀，在致炎后12～36h时肿胀达到峰值；翼首草总苷提取物高、中剂量能明显抑制完全弗氏佐剂所致AA大鼠原发性关节肿胀，但翼首草低剂量对原发性关节肿胀没有明显抑制作用。结果见表14。

表14翼首草总苷提取物对AA大鼠原发性足肿胀的影响(

n＝10)

与模型对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。

4.5、对AA大鼠继发性肿胀的影响

4.5.1、方法

采用容积法测定致炎前大鼠左后肢正常足容积(ml)，并分别于造模后第12、18、24、30天测定非致炎足(左足)的容积变化，以观察药物对AA大鼠继发性关节肿胀的影响。

4.5.2、结果

与正常对照组比较，大鼠右后足注射完全弗氏佐剂12d后，左后足产生明显继发性肿胀，在致炎后24d时肿胀达到峰值；翼首草总苷提取物高、中剂量均能明显抑制弗氏佐剂致大鼠继发性足肿胀，提示翼首草总苷提取物对免疫激发所致的继发性炎症有较强的抑制作用，其中尤以高剂量组作用最为明显，但其作用弱于尼美舒利。结果见表15。

表15翼首草总苷提取物对AA大鼠继发性足肿胀的影响(

n＝10)

与模型对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。

4.6、对AA大鼠关节炎评分指数的影响

4.6.1、方法

造模后第12、18、24、30天，对AA大鼠四肢关节分别进行1次关节炎评分，评分标准如下，0分：正常；1分：仅限于部分关节或脚趾的轻度发红或肿胀；2分：趾关节和足跖或踝关节出现中度肿胀；3分：踝关节严重肿胀或踝关节以下全部肿胀；4分：整个脚爪全部肿胀或关节严重变形。4个脚爪评分之和作为每只大鼠的关节炎评分，四肢关节炎指数得分每只大鼠最高不超过16分，以观察药物对AA大鼠关节病变的影响。数据采用非参数检验。

4.6.2、结果

由表16可知，大鼠接受完全弗氏佐剂注射12天后，四肢关节及足爪出现明显的肿胀，表现为关节炎评分指数的升高，且于致炎后24天达到高峰；与模型对照组比较，接受高、中剂量翼首草总苷提取物治疗的AA大鼠的关节炎评分指数明显降低，尤其是在致炎后18～30天时效果最为明显，并呈现一定的剂量依赖性；但翼首草总苷提取物改善关节炎评分指数的作用稍弱于尼美舒利。

表16翼首草总苷提取物对AA大鼠关节病变评分的影响(n＝10)

与模型对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。

4.7、对佐剂性关节炎(AA)大鼠机械压痛痛阈值的影响

4.7.1、方法

建立佐剂性关节炎大鼠模型后，按照设定剂量连续给药30天，正常及模型对照组给予等体积蒸馏水。分别于致炎前及致炎后第7、14、21、30天以电子压痛仪测量致炎足压力缩足反射阈(paw withdrawal threshold，PWT，单位g)2次，以大鼠注射足接触压痛仪至大鼠因压痛不能忍受而出现缩腿或嘶叫的时间为痛阈值，取其均值，计算各组大鼠痛阈值。

4.7.2、结果

与正常组比较，大鼠右后足接受弗氏佐剂皮下注射后，其痛阈值明显降低，且较稳定；与模型对照组比较，翼首草总苷提取物高、中、低剂量能明显增加AA大鼠压力缩足反射阈值，提示翼首草总苷提取物对佐剂性关节炎慢性疼痛具有镇痛作用，其中尤以高剂量组作用最为明显，且呈现明显的剂量依赖性。结果见表17。

表17翼首草总苷提取物对AA大鼠压力缩足痛阈值的影响(n＝10)

与模型对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。

4.8、小结

翼首草总苷提取物能明显提高AA大鼠机械压痛反射阈值，表现出对类风湿性关节炎较强的镇痛作用。

4.9、抗类风湿性关节炎机制研究

4.9.1、对AA大鼠血清促炎症因子及氧化应激水平的影响

4.9.1.1、方法

造模后30天，2.5中各组大鼠股动脉取血，3000r/min离心，取血清，采用双抗体夹心ABC-ELISA法，严格按照试剂盒要求，测定血清TNF-α、IL-1β、PGE₂含量，以化学比色法测定血清NO、SOD、MDA含量。

4.9.1.2、结果

由18表可知，类风湿性关节炎大鼠血清促炎症因子及炎症介质含量明显升高；与模型对照组比较，接受高、中剂量翼首草总苷提取物治疗的类风湿性关节炎大鼠血清TNF-α、IL-1β含量明显降低，但翼首草总苷提取物低剂量组对血清促炎症因子水平没有明显影响；此外，翼首草总苷提取物高剂量组大鼠血清PGE₂含量也明显下降；但作用均稍弱于尼美舒利。

由表19可知，类风湿性关节炎大鼠也呈现出明显的氧化应激反应，主要表现为血清SOD活力下降，MDA及NO含量增加。与模型组比较，经过翼首草总苷提取物治疗的类风湿性关节炎大鼠血清MDA、NO含量明显下降，同时血清SOD活力也有一定程度的提高。

表18翼首草总苷提取物对AA大鼠血清促炎症因子水平的影响(

n＝10)

与模型对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。

表19翼首草总苷提取物对AA大鼠血清氧化应激水平的影响(

n＝10)

与模型对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。

4.10、小结

翼首草总苷提取物对佐剂性关节炎具有明显的治疗效果，主要是通过降低AA大鼠各种促炎症因子水平，提高AA大鼠抗氧化能力而实现的，表明翼首草总苷提取物具有良好的类风湿性关节炎治疗作用。

综上所述，本发明翼首草总苷提取物具有良好的抗炎镇痛作用，对机体特异性细胞免疫有一定的抑制效果，并且能够通过降低类风湿性关节炎的促炎症因子水平和提高机体抗氧化能力，有效地治疗类风湿性关节炎，疗效确切，为临床用药提供了一种新的选择。

Claims (9)

1.一种翼首草总苷提取物，其特征在于：它来源于川续断科植物匙叶翼首草Pterocephalus hookeri(C.B.Clarke)Hoeck的干燥全草，该提取物中，总皂苷和总环烯醚萜苷的总含量大于50％w/w；其中，含有马钱苷0.45-0.78％w/w，齐墩果酸0.2-0.45％w/w，熊果酸0.65-1.1％w/w。

2.根据权利要求2所述的翼首草总苷提取物，其特征在于：该提取物中，含有马钱苷0.6-0.7％w/w，齐墩果酸0.3-0.4％w/w，熊果酸0.8-1.0％w/w。

3.权利要求1或2所述的翼首草总苷提取物的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：

取翼首草，加水煎煮提取，滤过，滤液浓缩后，采用非极性或弱极性大孔吸附树脂上样，先以水洗去杂质后，弃去洗脱液；以60-85％v/v乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液后，回收溶剂，干燥，即得翼首草总苷提取物。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：大孔吸附树脂为D101、AB-8或HPD-300；洗脱用乙醇为65-75％v/v。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：选用D101型大孔吸附树脂；以70％v/v乙醇洗脱。

6.根据权利要求3-5任意一项所述的制备方法，其特征在于：大孔吸附树脂洗脱的具体操作步骤如下：

将上样液的浓度配制为0.1-0.2g生药/ml，采用D101型大孔吸附树脂上样，上样流速为1-3BV/h，上样量以药材计为药材∶树脂＝(0.5-1.5)∶1w/w，以3-5BV水洗脱，流速为1-3BV/h，弃去洗脱液；以2-4BV的70％乙醇洗脱，洗脱流速为2-4BV/h。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：将上样液的浓度配制为0.1g生药/ml，采用D101型大孔吸附树脂室温下上样，上样流速为2BV/h，上样量以药材计为药材∶树脂＝1∶1，以4BV水洗脱，流速为2BV/h，弃去洗脱液；以3BV的70％乙醇洗脱，洗脱流速为3BV/h。

8.权利要求1或2所述的翼首草总苷提取物在制备抗炎、镇痛或治疗类风湿性关节炎的药物中的用途。

9.一种治疗类风湿性关节炎的药物组合物，其特征在于：它是由权利要求1或2所述的翼首草总苷提取物为活性成分，加上药学上常用的辅料制备而成的制剂。

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