CN102507774A - 对谷类中雪腐镰刀菌烯醇的提取纯化检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种对谷类中雪腐镰刀菌烯醇的提取纯化及检测方法。采用水提取样品，提取液经乙醇沉淀并结合固相萃取的方法去除杂质的干扰，净化后的样品在高效液相色谱-紫外检测器上完成定性定量分析。本发明所建立的方法准确度高、重现性好，杂峰干扰少，无需经常更换保护柱，成本低，并且极大地减少了有机溶剂的使用，适用于谷类中雪腐镰刀菌烯醇的大批量检测。

Description

对谷类中雪腐镰刀菌烯醇的提取纯化检测方法
技术领域
本发明涉及谷类中雪腐镰刀菌烯醇的提取纯化检测方法，属于分析测试领域。
背景技术
由镰刀菌引起的赤霉病是禾谷类作物上非常重要的病害之一，严重影响了世界粮食安全。镰刀菌毒素是镰刀菌产生的一类次生代谢产物。单端孢霉烯族毒素包含有200余种化合物，是镰刀菌毒素中非常重要的一类。脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON），雪腐镰刀菌烯醇（Nivalenol，NIV）及其衍生物属于单端孢霉烯族B类，基本结构为四环的倍半萜，以C8位上的羰基为特征。其中，DON对谷物污染率和污染水平居于镰刀菌毒素之首，给人、家畜的健康造成巨大威胁。近年研究表明，NIV可能与人类食管癌、IgA肾病、大骨节病有关，对人畜健康构成严重威胁。NIV较为耐热，需超过200℃才能被破坏，对酸和碱也较稳定，因此，经过通常烹调加工难以破坏其活性。检测NIV在粮食中存在情况，并进行监控，对保证人类食品的安全是非常必要的。现有的净化单端孢霉烯族毒素的方法主要是使用免疫亲和柱和多功能净化柱Mycosep，这两种小柱的价格较高。
对于DON及其衍生物15-ACDON和3-ACDON的提取纯化检测方法我们已经申请了专利，在现有的研究基础上，对原方法进行了修改，用于检测谷类中NIV的含量。
申请人于2011年4月8日向中国专利局申请了名称为“对谷类中B型单端孢霉烯族毒素的提取纯化检测方法”的发明专利，其申请号为：201110089957.4，该专利申请公开了提取纯化检测谷类中B型单端孢霉烯族毒素DON，3-ACDON和15-ACDON的方法，虽然DON及其衍生物3-ACDON、15-ACDON与NIV都属于单端孢霉烯族B类，在先申请公开的方法并不能适用于对NIV的提取纯化检测，因为NIV的理化特性与上述B型单端孢霉烯族毒素DON，3-ACDON和15-ACDON有很大的区别： NIV的极性相对较强，在去除水溶性杂质干扰的过程中（加入15ml乙腈-H2O，乙腈和H2O的体积比为2:1，再加入NaCL，漩涡振荡后静止乙腈和H2O分层，在80℃水浴中加热2min，冷却后弃水相，向乙腈相中加入无水硫酸钠脱水，取5ml乙腈相旋转蒸干），NIV在水相中被损失掉，而DON，3-ACDON和15-ACDON的极性相对较弱，当加入NaCL后进入乙腈相，此外，在使用Waters OASIS HLB固相萃取小柱进一步纯化时，乙酸乙酯也不能完全洗脱出NIV。
利用Waters OASIS HLB固相萃取小柱对谷类中雪腐镰刀菌烯醇的提取纯化检测，目前未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对紫外检测器检测中存在杂质峰较多，受基质干扰严重，净化方法成本高，在先申请的201110089957.4不适用于对雪腐镰刀菌烯醇的提取纯化和检测的实际问题，提供的一种适用于对雪腐镰刀菌烯醇的提取纯化及检测方法。
本发明是这样实现的：所述的对谷类中雪腐镰刀菌烯醇的提取纯化检测方法，首先将被测谷类样品粉碎后用水振荡提取，然后对提取液进行纯化，再采用高效液相色谱-紫外检测法进行检测，可对谷类样品中的雪腐镰刀菌烯醇进行定性定量分析，其特征在于：
所述的对谷类中雪腐镰刀菌烯醇的提取纯化检测方法，其特征在于：称取粉碎后的谷类样品5.0g于50ml的离心管中，加入25ml的H2O振荡提取20min，提取液在3000rpm下离心10min，弃沉淀，取10ml上清液加入等体积的无水乙醇4℃沉淀1h，在10000rpm下离心15min，弃沉淀，取上清液在50℃下旋转蒸干，1.0ml H2O分两次振荡提取，合并提取液2.0ml，经规格为3ml/60mg的Waters OASIS HLB固相萃取小柱进一步纯化，按照小柱使用说明书的要求对小柱进行活化和上样，用3.0ml H2O洗涤，然后在真空下抽气干燥20 min；再用2.0 ml甲醇洗脱小柱，收集洗脱液，均自然流速，将洗脱液在50℃下旋转蒸干后，用0.5ml水溶解，最后过0.22μm微孔滤膜，上机待测。
在本发明中，所述的对谷类中雪腐镰刀菌烯醇的提取纯化检测方法，其特征在于：色谱柱：C18；流动相：10%乙腈水溶液；流速：0.8ml/min；柱温：35℃；进样量：10μl；紫外检测器：224nm。
在本发明中，所述的对谷类中雪腐镰刀菌烯醇的提取纯化检测方法，所述的谷类是指：玉米或麦类。
在本发明中，所述的对谷类中雪腐镰刀菌烯醇的提取纯化检测方法，其特征在于：所述的对被测谷类中雪腐镰刀菌烯醇进行定性定量分析是指：在高效液相色谱图中，将雪腐镰刀菌烯醇标样与被测谷类样品进行对比，根据标样的出峰时间定性，根据峰面积定量分析。
本发明的优点在于：所采用的提取纯化方法使图谱的杂峰干扰少，无需经常更换保护柱；极大地减少了有机溶剂的使用；净化方法成本低；同荧光检测法相比可省去繁琐的衍生化操作步骤，适用于谷类中雪腐镰刀菌烯醇的大批量检测。
附图说明
图1是小麦样品和标准品的高效液相色谱图；
图2是玉米样品和标准品的高效液相色谱图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步的说明，但不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容作出一些非本质的改进和调整。
实施例1  
1、标样的选择：
标样购于Sigma-Aldrich公司（下同）。
2、小麦中雪腐镰刀菌烯醇的提取纯化方法： 
（1）样品制备：称取粉碎后的小麦样品5.0g于50ml的离心管中，加入25ml的H2O振荡提取20min，提取液在3000rpm下离心10min，弃沉淀，取10ml上清液加入等体积的无水乙醇4℃沉淀1h，在10000rpm下离心15min，弃沉淀，取上清液在50℃下旋转蒸干，1.0ml H2O分两次振荡提取，合并提取液2.0ml，经规格为3ml/60mg的Waters OASIS HLB固相萃取小柱进一步纯化：
（2）OASIS固相萃取小柱的使用步骤如下：
ａ.小柱的活化：2ml甲醇淋洗后，再加入2ml H2O淋洗，均为自然流速，之后真空抽干；ｂ.上样：上样量为2.0ml，自然流速，然后用3.0ml H2O洗涤，真空抽干20min；ｃ.洗脱：2.0 ml甲醇洗脱小柱，收集洗脱液，自然流速，将洗脱液在50℃下旋转蒸干后，用0.5ml水溶解，最后过0.22μm微孔滤膜，上机待测。
3、采用HPLC-UV进行检测，其检测条件：
色谱柱：C18（250mm×4.6, 5μm）；流动相：10%乙腈水溶液；流速：0.8ml/min；柱温：35℃；进样量：10μl；紫外检测器：224nm。
4、图谱分析
由图1 可见：
在标样中：标准品纯度NIV≥98.6%（购于Sigma-Aldrich）。图谱中NIV的出峰时间为9.82min。NIV在0.5-5.0mg/L范围内浓度和峰面积之间的回归方程为y = 0.276 3x - 0.016 4（r2 = 0.997）。根据回归方程计算样品1中NIV的含量为668μg/kg。
实施例2  
1、玉米中雪腐镰刀菌烯醇的提取纯化方法： 
（1）样品制备：称取粉碎后的玉米样品5.0g于50ml的离心管中，加入25ml的H2O振荡提取20min，提取液在3000rpm下离心10min，弃沉淀，取10ml上清液加入等体积的无水乙醇4℃沉淀1h，在10000rpm下离心15min，弃沉淀，取上清液在50℃下旋转蒸干，1.0ml H2O分两次振荡提取，合并提取液2.0ml，经规格为3ml/60mg的Waters OASIS HLB固相萃取小柱进一步纯化：
（2）OASIS固相萃取小柱的使用步骤如下：
ａ.小柱的活化：2ml甲醇淋洗后，再加入2ml H2O淋洗，均为自然流速，之后真空抽干；ｂ.上样：上样量为2.0ml，自然流速，然后用3.0ml H2O洗涤，真空抽干20min；ｃ.洗脱：2.0 ml甲醇洗脱小柱，收集洗脱液，自然流速，将洗脱液在50℃下旋转蒸干后，用0.5ml水溶解，最后过0.22μm微孔滤膜，上机待测。
3、采用HPLC-UV进行检测，其检测条件：
色谱柱：C18（250mm×4.6, 5μm）；流动相：10%乙腈水溶液；流速：0.8ml/min；柱温：35℃；进样量：10μl；紫外检测器：224nm。
4、图谱分析
由图2 可见：
在标样中：标准品纯度NIV≥98.6%（购于Sigma-Aldrich）。图谱中NIV的出峰时间为9.82min。NIV在0.5-5.0mg/L范围内浓度和峰面积之间的回归方程为y = 0.276 3x - 0.016 4（r2 = 0.997）。根据回归方程计算样品2中NIV的含量为198μg/kg。

Claims (4)

1.一种对谷类中雪腐镰刀菌烯醇的提取纯化检测方法，首先将被测谷类样品粉碎后用水振荡提取，然后对提取液进行纯化，再采用高效液相    色谱-紫外检测法对谷类样品中的雪腐镰刀菌烯醇进行定性定量分析，其特征在于：称取粉碎后的谷类样品5.0g于50ml的离心管中，加入25ml的H2O振荡提取20min，提取液在3000rpm下离心10min，弃沉淀，取10ml上清液加入等体积的无水乙醇4℃沉淀1h，在10000rpm下离心15min，弃沉淀，取上清液在50℃下旋转蒸干，1.0ml H2O分两次振荡提取，合并提取液2.0ml，经规格为3ml/60mg的Waters OASIS HLB固相萃取小柱进一步纯化，按照小柱使用说明书的要求对小柱进行活化和上样，用3.0ml H2O洗涤，然后在真空下抽气干燥20 min；再用2.0 ml甲醇洗脱小柱，收集洗脱液，均自然流速，将洗脱液在50℃下旋转蒸干后，用0.5ml水溶解，最后过0.22μm微孔滤膜，上机待测。
2.根据权利要求1所述的对谷类中雪腐镰刀菌烯醇的提取纯化检测方法，其特征在于：高效液相色谱-紫外检测法的条件为：色谱柱：C18；流动相：10%乙腈水溶液；流速：0.8ml/min；柱温：35℃；进样量：10μl；紫外检测器：224nm。
3.根据权利要求1所述的对谷类中雪腐镰刀菌烯醇的提取纯化检测方法，其特征在于：所述的谷类是指：玉米或麦类。
4.根据权利要求1~3之一所述的对谷类中雪腐镰刀菌烯醇的提取纯化检测方法，其特征在于：所述的对谷类样品中的雪腐镰刀菌烯醇进行定性定量分析是指：在高效液相色谱图中，雪腐镰刀菌烯醇标样与被测谷类样品进行对比，根据标样的出峰时间定性，根据峰面积进行定量分析。
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