CN107923886A - 真菌毒素的分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种具有分离步骤、检测步骤和鉴定步骤的真菌毒素的分析方法。在分离步骤中，利用色谱柱(3)使液体试样所含的各成分分离。在检测步骤中，用PDA(7)和荧光检测器(8)来检测由分离步骤分离出的各成分。在鉴定步骤中，基于来自荧光检测器(8)的检测信号来鉴定总黄曲霉毒素，并且基于来自PDA(7)的检测信号来鉴定脱氧雪腐镰刀菌烯醇。

Description

真菌毒素的分析方法
技术领域
本发明涉及在食品、饮料等中产生的真菌毒素(霉菌毒素)的分析方法。
背景技术
例如在食品、饮料等中有时会产生对人或动物有毒性的真菌毒素。真菌毒素是霉产生的二次代谢产物中给人或动物带来健康危害的化合物，作为其分析方法，提出了各种方法(例如参照下述专利文献1)。尤其是，作为真菌毒素的一种的黄曲霉毒素作为天然物质中具有最强的致癌性的物质之一而被知晓，世界大多数国家、地区都进行严格的限制。
在小麦等谷类中，除了上述黄曲霉毒素的5成分(B1，B2，G1，G2，M1)中的4成分(B1，B2，G1，G2)之外，有时还产生赭曲霉素、玉米赤霉烯酮、单端孢霉烯系(脱氧雪腐镰刀菌烯醇、雪腐镰刀菌烯醇)这样的真菌毒素。黄曲霉毒素的5成分中的B1、B2、G1、G2这4成分被称为总黄曲霉毒素。
关于上述那样的真菌毒素的各成分，分别确立了单独的分析方法。例如，作为总黄曲霉毒素的分析方法，使用具有荧光检测器或质谱仪的高速液相色谱仪来分析液体试样的方法，已收到厚生劳动省或国际食品标准委员会的通知。另外，作为脱氧雪腐镰刀菌烯醇的分析方法，使用具有紫外分光光度型检测器的高速液相色谱仪来分析液体试样的方法，同样已收到厚生劳动省或国际食品标准委员会的通知。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本国特开2015－25680号公报
发明内容
发明要解决的技术问题
上述的真菌毒素的各成分的分析方法都是在不同的条件下进行的。为此，在对多种成分进行分析的情况下，需要改变条件来进行多次的分析，从而作业繁杂。
另外，上述的真菌毒素的各成分的分析方法是不仅能够进行液体试样中的各成分的鉴定、而且还能进行定量的方法。为此，即使在只要能够确认在液体试样中是否包含真菌毒素的各成分就够了的情况下，也需要进行直到各成分的定量为止都进行的详细的分析，从而存在作业耗时的问题。
本发明是鉴于上述实情而完成的，其目的在于提供一种真菌毒素的分析方法，能够易于在短时间内确认液体试样中的真菌毒素的多个成分的有无。
用于解决上述技术问题的方案
(1)本发明的真菌毒素的分析方法具有分离步骤、检测步骤和鉴定步骤。在所述分离步骤中，利用色谱柱使液体试样所含的各成分分离。在所述检测步骤中，利用至少2个检测器来检测由所述分离步骤分离出的各成分。在所述鉴定步骤中，基于所述检测步骤的检测结果来鉴定各成分。所述至少2个检测器包括荧光检测器。在所述鉴定步骤中，基于来自所述荧光检测器的检测信号来鉴定总黄曲霉毒素，并且基于来自所述荧光检测器以外的检测器的检测信号来鉴定脱氧雪腐镰刀菌烯醇。
根据这样的构成，能够基于来自至少2个检测器的检测信号以1次分析来进行总黄曲霉毒素和脱氧雪腐镰刀菌烯醇的鉴定。对于总黄曲霉毒素来说，基于来自灵敏度高的荧光检测器的检测信号，即使是小含量，也能够良好地进行鉴定。另外，对于脱氧雪腐镰刀菌烯醇来说，与总黄曲霉毒素相分离，基于来自荧光检测器以外的检测器的检测信号，能够良好地进行鉴定。
由此，能够以1次分析来确认液体试样中的真菌毒素的多个成分(总黄曲霉毒素和脱氧雪腐镰刀菌烯醇)的有无。因此，与按每个成分改变条件来进行多次分析的情况相比，能够易于在短时间内确认液体试样中的真菌毒素的多个成分的有无。
(2)所述至少2个检测器包括光电二极管阵列检测器。在此情况下，在所述鉴定步骤中，可以基于来自所述光电二极管阵列检测器的检测信号来鉴定脱氧雪腐镰刀菌烯醇。
根据这样的构成，基于来自光电二极管阵列检测器的检测信号，能够获得波长和吸光度的关系作为光谱。因此，通过将获得的光谱与预先制成的光谱库进行比较，能够良好地鉴定脱氧雪腐镰刀菌烯醇等的各种成分。
(3)在所述检测步骤中，可以在预先设定的时机切换由所述荧光检测器检测的荧光的波长。
根据这样的构成，通过由荧光检测器检测特定的波长的荧光，能够良好地鉴定总黄曲霉毒素，并且，通过切换由荧光检测器检测的荧光的波长，也能够基于来自荧光检测器的检测信号对其它成分良好地进行鉴定。因此，能够确认液体试样中的更多成分的有无。
(4)在所述分离步骤中，可以将缓冲液和有机溶剂的混合液作为流动相而供给到所述色谱柱。
根据这样的构成，通过使用缓冲液和有机溶剂的混合液作为流动相，能够在液体试样通过色谱柱的过程中将总黄曲霉毒素和脱氧雪腐镰刀菌烯醇良好地进行分离。因此，能够更高精度地确认液体试样中的总黄曲霉毒素和脱氧雪腐镰刀菌烯醇的有无。
(5)在所述分离步骤中，可以一边使所述混合液中的有机溶剂的混合率随着时间经过而上升一边作为流动相而供给到所述色谱柱。
根据这样的构成，通过使作为流动相而供给到色谱柱的混合液的有机溶剂的混合率随着时间经过而上升，能够在液体试样通过色谱柱的过程中将总黄曲霉毒素和脱氧雪腐镰刀菌烯醇更良好地进行分离。因此，能够更高精度地确认液体试样中的总黄曲霉毒素和脱氧雪腐镰刀菌烯醇的有无。
发明效果
根据本发明，能够以1次分析来确认液体试样中的真菌毒素多个成分(总黄曲霉毒素和脱氧雪腐镰刀菌烯醇)的有无，所以易于在短时间内确认。
附图说明
图1是表示用于本发明的一实施方式的分析方法的液相色谱仪的构成例的框图。
图2是表示分析中的控制部的处理的一个例子的流程图。
图3A是实施例中从荧光检测器的检测信号获得的色谱图。
图3B是实施例中从PDA的检测信号获得的色谱图。
具体实施方式
1.液相色谱仪的构成
图1是表示用于本发明的一实施方式的分析方法的液相色谱仪1的构成例的框图。该液相色谱仪1是高速液相色谱仪(HPLC)，一边使用泵2将流动相供给到色谱柱3内，一边将液体试样导入色谱柱3内，从而在液体试样通过色谱柱3内的过程中将液体试样中的各成分分离。
液相色谱仪1除了上述的泵2和色谱柱3之外，还具有例如多个流动相容器4、混合器5、注射器6、光电二极管阵列检测器(PDA)7、荧光检测器8、控制部9和显示部10等。
在多个流动相容器4中分别收容着不同的流动相。例如使用缓冲液和有机溶剂作为流动相。作为缓冲液，能够例示出由磷酸钠的水溶液构成的液体，但不限于此，也可以是包括其它磷酸盐的溶液，还可以是由磷酸盐以外的有缓冲作用的溶液构成的液体。另外，作为有机溶剂，能够例示出乙腈和甲醇等，但不限于这些。
在该例中，设有分别收容着磷酸钠缓冲液、乙腈和甲醇的3个流动相容器4。并且，收容于这些流动相容器4中的流动相在混合器5中以设定的混合率混合，并由泵2送往色谱柱3。色谱柱3例如由反相色谱柱构成，能够例示出以表面由ODS(十八烷基硅烷)基修饰了的硅胶作为固定相的C18色谱柱等，但不限于此。
注射器6例如使用微量调节注射器等，将作为分析对象的液体试样注入到从泵2送往色谱柱3的流动相中。包含在液体试样中的各成分在与流动相一起通过色谱柱3的过程中被分离(分离步骤)，并由设置于色谱柱3的下游侧的PDA7和荧光检测器8检测出来(检测步骤)。这样，在本实施方式中，分离出的液体试样中的各成分由2个检测器7、8检测出来。
泵2、混合器5、注射器6、PDA7和荧光检测器8分别与控制部9电连接。控制部9基于已设定的分析条件来控制泵2、混合器5和注射器6的动作。在本实施方式中，一边使混合器5中的多个流动相的混合率随着时间经过而变化一边进行分析，从而进行梯度分析。
另外，控制部9基于来自PDA7和荧光检测器8的检测信号而使显示部10显示其检测结果。显示部10例如由液晶显示器构成，作业者基于显示在显示部10的检测结果而能够鉴定液体试样中的各成分(鉴定步骤)。
根据来自PDA7的检测信号，能够得到各波长下的吸光度作为光谱，该光谱的时间上的变化作为以时间、波长和吸光度为3轴的3维数据而获得。因此，若预先制成目标成分的光谱库，则通过求出该光谱库和根据分析而获得的光谱的一致度而能够鉴定目标成分。
荧光检测器8通过用特定的激发波长的激发光来激发液体试样中的成分而使之发出荧光，来检测特定的荧光波长的荧光。激发波长和荧光波长能够切换，通过在适当的时机切换这些波长而能够以1次分析来检测激发波长和荧光波长不同的多个成分。
2.分析中的液相色谱仪的动作
图2是表示分析中的控制部9的处理的一个例子的流程图。在分析中，控制部9基于预先设定的分析条件来控制各部的动作，从而能够同时并行地取得来自PDA7和荧光检测器8的检测信号。
在分析中，控制部9首先以作为初始混合率而预先设定的混合率使各流动相容器4内的流动相混合，并将该混合液连续地供给到色谱柱3(步骤S101)。然后，控制部9监视是否是切换流动相的混合率的时机(步骤S102)、以及是否是切换荧光检测器8的波长的时机(步骤S104)。
然后，在到了作为切换流动相的混合率的时机而被设定的时机的情况下(步骤S102中为“是”)，控制部9切换成作为该时机下的混合率而被预先设定的混合率(步骤S103)。由此，将以切换了的混合率混合了的混合液连续地供给到色谱柱3直到此后到达切换流动相的混合率的时机为止。
在本实施方式中，控制部9在多个时机切换流动相的混合率。具体地说，控制部9每当到了切换流动相的混合率的时机(步骤S102中为“是”)时就切换混合率(步骤S103)，从而一边使混合液中的有机溶剂的混合率随着时间经过而上升一边使之作为流动相而供给到色谱柱3。
另一方面，在到了作为切换荧光检测器8的激发波长和荧光波长的时机而被预先设定的时机的情况下(步骤S104中为“是”)，控制部9将荧光检测器8的波长(激发波长和荧光波长)切换成预先设定的波长(步骤S105)。由此，切换由荧光检测器8检测的荧光的波长，以使得液体试样中的成分被不同波长的激发光所激发而使与该波长相对应的成分发出荧光，并能够检测该荧光。
3.液体试样中的各成分的鉴定
在上述那样的梯度分析完成时(步骤S106中为“是”)，基于来自PDA7和荧光检测器8的检测信号而在显示部10显示作为检测结果的色谱图。基于来自PDA7的检测信号的色谱图、以及基于来自荧光检测器8的检测信号的色谱图分别单独地在显示部10显示，作业者使用这些色谱图来鉴定液体试样中的各成分。
此时，作业者使用基于来自PDA7的检测信号的色谱图来鉴定液体试样中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇。另外，作业者使用基于来自荧光检测器8的检测信号的色谱图来鉴定液体试样中的总黄曲霉毒素。
脱氧雪腐镰刀菌烯醇的鉴定使用基于来自PDA7的检测信号的各波长的色谱图、即以时间、波长和吸光度作为3轴的3维数据来进行。具体地说，将表示各峰值处的波长和吸光度的关系的光谱与预先制成的目标成分(脱氧雪腐镰刀菌烯醇)的光谱库进行比较，求出其一致度，从而基于求出的一致度来判定是否是目标成分的峰值。在上述光谱库中，不仅登记着脱氧雪腐镰刀菌烯醇的光谱，还登记着被分类到真菌毒素的其它各种成分(雪腐镰刀菌烯醇、棒曲霉素等)的光谱。
总黄曲霉毒素的鉴定通过判定由荧光检测器8检测的特定的荧光波长的峰值的有无来进行。具体地说，通过比较从标准试样获得的总黄曲霉毒素的各成分的保持时间和从作为分析对象的液体试样获得的各峰值的保持时间，来判定液体试样中的总黄曲霉毒素的各成分的有无。
4.作用效果
(1)在本实施方式中，能够基于来自PDA7和荧光检测器8的检测信号以1次分析来进行总黄曲霉毒素和脱氧雪腐镰刀菌烯醇的鉴定。对于总黄曲霉毒素来说，基于来自灵敏度高的荧光检测器8的检测信号，即使是小含量，也能够良好地进行鉴定。另外，对于脱氧雪腐镰刀菌烯醇来说，与总黄曲霉毒素相分离，通过比较基于来自PDA7的检测信号而获得的光谱和预先制成的光谱库，能够良好地进行鉴定。
由此，能够以1次分析来确认液体试样中的真菌毒素的多个成分(总黄曲霉毒素和脱氧雪腐镰刀菌烯醇)的有无。因此，与按每个成分改变条件来进行多次分析的情况相比，能够易于在短时间内确认液体试样中的真菌毒素的多个成分的有无。
(2)另外，在本实施方式中，通过由荧光检测器8检测特定的波长的荧光，能够良好地鉴定总黄曲霉毒素，并且，通过切换由荧光检测器8检测的荧光的波长(图2的步骤S104和S105)，也能够基于来自荧光检测器8的检测信号对例如玉米赤霉烯酮或赭曲霉素等其它成分良好地进行鉴定。因此，能够确认液体试样中的更多成分的有无。
(3)另外，在本实施方式中，通过使用缓冲液和有机溶剂的混合液作为流动相，能够在液体试样通过色谱柱3的过程中将总黄曲霉毒素和脱氧雪腐镰刀菌烯醇良好地进行分离。因此，能够更高精度地确认液体试样中的总黄曲霉毒素和脱氧雪腐镰刀菌烯醇的有无。
(4)另外，在本实施方式中，通过使作为流动相而供给到色谱柱3的混合液的有机溶剂的混合率随着时间经过而上升(图2的步骤S102和S103)，能够在液体试样通过色谱柱3的过程中将总黄曲霉毒素和脱氧雪腐镰刀菌烯醇更良好地进行分离。因此，能够更高精度地确认液体试样中的总黄曲霉毒素和脱氧雪腐镰刀菌烯醇的有无。
5.实施例
下面，对使用上述实施方式的液相色谱仪1来筛选液体试样中的真菌毒素的各成分的有无的结果进行说明。筛选的对象成分是黄曲霉毒素的5成分(B1，B2，G1，G2，M1)、雪腐镰刀菌烯醇、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、赭曲霉素、玉米赤霉烯酮和棒曲霉素。
作为液相色谱仪1，使用具有PDA7的「Nexera－i 3D」(株式会社岛津制作所制造)，并追加「RF－20Axs」(株式会社岛津制作所制造)作为荧光检测器8。另外，作为色谱柱3，使用作为反相色谱柱的「Shim－pack GIST」(株式会社岛津制作所制造)。在色谱柱3中，固定相为C18，长度为50cm、内径为3.0mm、填充物粒子径为2μm。
作为流动相，使用磷酸钠缓冲液、乙腈和甲醇。对于磷酸钠缓冲液来说，磷酸的浓度为20mmol/L，pH值为2.5。色谱柱3中的流动相的流速为1.0mL/min，色谱柱3的温度为55℃，从注射器6注入的液体试样的注入量为5μL。需要说明的是，从分析时间的缩短化的观点来看，色谱柱3的温度被设定为比一般的分析时要高的温度，优选被设定在例如50～80℃的范围内。
梯度分析中的各流动相的混合率的时间上的变化如下。
磷酸钠缓冲液：90％(0.00－0.50min)→70％(0.51min)→60％(2.65min)→50％(2.66－5.10min)→90％(5.11－7.00min)
乙腈：10％(0.00－0.50min)→15％(0.51－2.65min)→35％(2.66－5.10min)→10％(5.11－7.00min)
甲醇：0％(0.00－0.50min)→15％(0.51min)→25％(2.65min)→15％(2.66－5.10min)→0％(5.11－7.00min)
在PDA7中检测的2道波长是与雪腐镰刀菌烯醇和脱氧雪腐镰刀菌烯醇相对应的220nm、以及与棒曲霉素相对应的276nm。在荧光检测器8中，从与黄曲霉毒素的5成分相对应地用365nm的激发波长来检测450nm的荧光波长期间(0.00－4.29min)切换到与赭曲霉素和玉米赤霉烯酮相对应地用320nm的激发波长检测465nm的荧光波长期间(4.30－7.00min)。
图3A是实施例中从荧光检测器8的检测信号获得的色谱图。图3B是实施例中从PDA7的检测信号获得的色谱图。这些色谱图是通过1次分析而同时并行地取得的，分别表现不同的目标成分的峰值。
在图3A的色谱图中，出现黄曲霉毒素的5成分(AFB1，AFB2，AFG1，AFG2，AFM1)、赭曲霉素(OTA)和玉米赤霉烯酮(ZON)的峰值。这样，能够基于来自荧光检测器8的检测信号来鉴定总黄曲霉毒素。需要说明的是，在图3A的色谱图中，在4.30min的时机T切换激发波长和荧光波长。
另外，在图3B的色谱图中，在波长220nm时出现雪腐镰刀菌烯醇(NIV)和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的峰值，在波长276nm时出现棒曲霉素(PAT)的峰值。这样，能够基于来自PDA7的检测信号来鉴定脱氧雪腐镰刀菌烯醇。
在图3A和图3B的例子中，保持时间较长的成分基于来自荧光检测器8的检测信号而被鉴定(参照图3A)，保持时间较短的成分基于来自荧光检测器8以外的检测器(PDA7)的检测信号而被鉴定(参照图3B)。如图3A和图3B那样，检测到各目标成分为止的时间是5～6分钟，能够在短时间内进行筛选。
6.变形例
在上面的实施方式中，对基于来自荧光检测器8的检测信号来鉴定总黄曲霉毒素、基于来自PDA7的检测信号来鉴定脱氧雪腐镰刀菌烯醇那样的真菌毒素的分析方法进行了说明。但是，不限于这样的方法，例如也可以基于来自PDA7以外的检测器的检测信号来鉴定脱氧雪腐镰刀菌烯醇。另外，不限于使用PDA7和荧光检测器8这2个检测器那样的构成，也可以基于来自包括荧光检测器8在内的3个以上的检测器的检测信号来鉴定总黄曲霉毒素和脱氧雪腐镰刀菌烯醇。而且，配置各检测器的顺序也不限于图1所示那样的顺序。
附图标记说明
1 液相色谱仪
2 泵
3 色谱柱
4 流动相容器
5 混合器
6 注射器
7 PDA(光电二极管阵列检测器)
8 荧光检测器
9 控制部
10 显示部

Claims (5)

1.一种真菌毒素的分析方法，具有：
利用色谱柱使液体试样所含的各成分分离的分离步骤；
利用至少2个检测器来检测由所述分离步骤分离出的各成分的检测步骤；以及
基于所述检测步骤的检测结果来鉴定各成分的鉴定步骤；
所述至少2个检测器包括荧光检测器；
在所述鉴定步骤中，基于来自所述荧光检测器的检测信号来鉴定总黄曲霉毒素，并且基于来自所述荧光检测器以外的检测器的检测信号来鉴定脱氧雪腐镰刀菌烯醇。
2.如权利要求1所述的真菌毒素的分析方法，其特征在于，所述至少2个检测器包括光电二极管阵列检测器；
在所述鉴定步骤中，基于来自所述光电二极管阵列检测器的检测信号来鉴定脱氧雪腐镰刀菌烯醇。
3.如权利要求1所述的真菌毒素的分析方法，其特征在于，在所述检测步骤中，在预先设定的时机切换由所述荧光检测器检测的荧光的波长。
4.如权利要求1-3中任一项所述的真菌毒素的分析方法，其特征在于，在所述分离步骤中，将缓冲液和有机溶剂的混合液作为流动相而供给到所述色谱柱。
5.如权利要求4所述的真菌毒素的分析方法，其特征在于，在所述分离步骤中，一边使所述混合液中的有机溶剂的混合率随着时间经过而上升一边作为流动相而供给到所述色谱柱。
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