CN102504808A

CN102504808A - 一种稀土荧光二氧化硅纳米颗粒的制备方法

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Publication number: CN102504808A
Application number: CN2011103202213A
Authority: CN
Inventors: 李庆阁; 王国磊; 许晔
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2011-10-19
Filing date: 2011-10-19
Publication date: 2012-06-20
Anticipated expiration: 2031-10-19
Also published as: CN102504808B

Abstract

一种稀土荧光二氧化硅纳米颗粒的制备方法，涉及一种纳米颗粒材料。将水、油、表面活性剂、助表面活性剂混合，自发形成各向异性、透明、热力学稳定的分散体系，得表面带有羟基的二氧化硅纳米颗粒；将带有功能基团的硅烷试剂与稀土离子配合物反应，得稀土离子配合物前驱体；将制得的稀土离子配合物前驱体与四乙氧基硅烷混合后加入所得的表面带有羟基的二氧化硅纳米颗粒中，稀土离子配合物即可键合至二氧化硅纳米颗粒表面；在油包水微乳体系中加入稀土离子，即可与固定在二氧化硅纳米颗粒表面的稀土离子配合物螯合而形成具有荧光的稀土络合物，经丙酮封闭反应体系后，洗涤，即得产物稀土荧光二氧化硅纳米颗粒。操作简单、易于实现，荧光强度更高。

Description

一种稀土荧光二氧化硅纳米颗粒的制备方法

技术领域

本发明涉及一种纳米颗粒材料，尤其是涉及一种高强度稀土荧光二氧化硅纳米颗粒的制备方法。

背景技术

免疫分析越来越广泛应用于生物标志物、细菌以及病毒等的检测。而用于免疫分析的纳米标记物在很大程度上决定着分析灵敏度与特异性。目前已经发展的各种类型的纳米颗粒，包括胶体金、碳黑、上转换荧光纳米颗粒、量子点、脂质体等，已经表现出了较为优秀的免疫分析效果。然而，这些纳米标记物仍存在着自身的缺点。对于胶体金、碳黑标记物等，它们仅仅依赖于颗粒聚集而产生光学信号，从而在免疫层析中表现出的灵敏度较低。尽管后来发展的荧光纳米标记物大大提高了免疫分析的灵敏度，但是它们也存在着一些缺陷，例如，染料掺杂的荧光纳米颗粒容易发生泄露、量子点具有毒性、脂质体稳定性较差等，并且它们的荧光强度有限，进一步提高免疫分析的灵敏度仍需做出巨大的努力。

近些年来发展的稀土荧光二氧化硅纳米颗粒吸引了广大研究者们的兴趣。二氧化硅具有物理刚性、化学稳定性、溶剂中可忽略的溶胀性以及光学透性，因而十分适用于生物分析。而稀土荧光络合物是由铕、铽、钐等稀土离子与β-二酮、联吡啶类化合物等特定的配合物形成的强荧光的络合物，它具有以下优异的荧光性质：①荧光寿命长。稀土荧光络合物的荧光寿命一般为10～1000μs，它比一般荧光物质以及背景荧光(约1～10μs)要高出5～6个数量级。②Stokes位移大，稀土络合物的最大激发波长通常在300～380nm的紫外区，最大发射波长在500nm以上，stokes位移达250～350nm，有利于排除各种背景荧光的干扰，增强检测的特异性。③激发光谱带较宽，有利于增加激发能，提高标记物的比活性。④发射光谱带窄。半峰宽小于15nm，有利于提高分辨率。⑤激发波长具有配体的特性，即随配体的变化而变化，发射波长则具有稀土离子的性质，即不随配体的变化而变化。这样就可能采用单一激发光，获得不同发射波长，从而实现多组分同时检测。因此，将二氧化硅纳米颗粒与长寿命的荧光稀土络合物结合，可以大大提高该种标记物的免疫分析性能。

目前，已有许多有关稀土荧光二氧化硅纳米颗粒的制备方法的报道。中国专利CN1400467公开一种荧光稀土络合物硅纳米颗粒类标记物及其制备方法，是通过物理掺杂或化学键合的手段，将荧光稀土络合物掺杂于硅纳米颗粒中，使单个硅纳米颗粒掺杂多个稀土络合物，从而具有较高的荧光强度。但该方法掺杂的稀土络合物数量有限(过多则会造成不规则状纳米颗粒的形成)，限制了荧光强度的继续提升。

中国专利CN101225306公开一种荧光稀土络合物硅纳米颗粒的制备方法，将稀土络合物循环键合在硅纳米颗粒表面，从而使键合在其表面的荧光稀土络合物数量大大增加，有效地提高了荧光二氧化硅纳米颗粒的荧光强度。但该种循环键合的方式操作繁琐、费时费力，不利于该种标记物的广泛应用。

发明内容

本发明的目的是针对现有的方法存在的上述缺点，提供一种不仅具有操作简单、易于实现等优点，而且荧光强度更高的稀土荧光二氧化硅纳米颗粒的制备方法。

本发明的技术方案是采用油包水微乳体系合成空白二氧化硅纳米颗粒，并事先让带有功能基团的硅烷试剂和稀土离子配合物充分反应而形成前驱体，然后直接在油包水微乳体系中加入前驱体，即可将大量的稀土离子配合体修饰到每个二氧化硅纳米颗粒的表面，再加入稀土离子与配合体螯合，即可形成高强度的稀土荧光二氧化硅纳米颗粒。

本发明包括以下步骤：

1)将水、油、表面活性剂、助表面活性剂混合，自发形成各向异性、透明、热力学稳定的分散体系，得表面带有羟基的二氧化硅纳米颗粒；

2)将带有功能基团的硅烷试剂与稀土离子配合物反应，得稀土离子配合物前驱体；

3)将步骤2)制得的稀土离子配合物前驱体与四乙氧基硅烷(TEOS)混合后加入步骤1)所得的表面带有羟基的二氧化硅纳米颗粒(油包水微乳体系)中，稀土离子配合物即可键合至二氧化硅纳米颗粒表面；

稀土离子配合物前驱体含有硅氧键，能够键合至二氧化硅纳米颗粒表面，另外，四乙氧基硅烷(TEOS)可以与二氧化硅纳米颗粒表面剩余未参与反应的硅羟基继续枝接而生长出更多的表面硅羟基，以利于其进一步与稀土离子配合物前驱体发生反应。

4)在油包水微乳体系中加入稀土离子，即可与固定在二氧化硅纳米颗粒表面的稀土离子配合物螯合而形成具有荧光的稀土络合物，经丙酮封闭反应体系后，洗涤，即得产物稀土荧光二氧化硅纳米颗粒。

在步骤1)中，所述油、表面活性剂、助表面活性剂的质量比可为3∶1∶1，水的用量则根据所要合成的二氧化硅纳米颗粒的大小进行调整；所述水可选自超纯水等；所述油可选自环己烷、正戊烷、正己烷、正庚烷、正癸烷等中的一种；所述表面活性剂可选自Triton X-100、二-乙基己基琥珀酸酯磺酸钠(AOT)、壬基酚聚氧乙烯醚(NP-n)等中的一种；所述助表面活性剂可选自正己醇等。

在步骤2)中，所述带有功能基团的硅烷试剂可选自3-氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)、巯丙基三甲氧基硅烷(MPTMS)、5，3-甘油酸丙烷三甲氧基硅烷(MPTMS)等中的一种，可为二氧化硅纳米颗粒表面修饰上氨基、巯基、环氧基等功能性基团；所述稀土离子配合物可为螯合特定稀土离子的有机化合物，所述稀土离子配合物可选自β-二酮类化合物、邻菲咯啉类化合物、水杨酸类化合物、联吡啶类化合物等中的一种。

在步骤4)中，所述稀土离子可选自铕、铽、钐、镝等中的一种，它们能与特定的稀土离子配合物螯合而形成强荧光的络合物；所述洗涤可采用50％的无水乙醇洗涤，其目的在于除去所得纳米颗粒悬液中的有机溶剂、表面活性剂及其他杂质等。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1)制备过程简单，省时省力。该种方法采用直接在油包水微乳体系中修饰稀土荧光络合物的方法，操作简单，易于制备。而之前报道的将稀土荧光络合物循环键合在二氧化硅纳米颗粒表面的方式则存在操作繁琐，耗时耗力的问题。

2)制备的稀土荧光二氧化硅纳米颗粒荧光强度高。该种方法直接在微乳中修饰，每个水核中所形成的单一的二氧化硅纳米颗粒其表面的空间位阻小，因而可以直接与大量的稀土荧光络合物发生键合，而不需要循环键合便可制备出高荧光强度的二氧化硅纳米颗粒。因而该法制备的高强度的稀土荧光二氧化硅纳米颗粒作为标记物有望进一步提高分析灵敏度，并可广发应用于生物分析、荧光成像、医学诊断等领域。

3)制备的稀土荧光二氧化硅纳米颗粒表面易于生物功能化。该法将带有功能基团的硅烷试剂与稀土离子配合物事先反应形成前驱体，在此反应中，带有功能基团的硅烷试剂是过量的，因而较多的尚未参与前驱体反应的带有功能基团的硅烷试剂随后则键合至二氧化硅纳米颗粒表面，使其能够和其他生物分子交联而易于被生物功能化，从而有利于其在生物分析等方面的应用。

4)制备的稀土荧光二氧化硅纳米颗粒大小均一，可控性好，可以合成20nm-100nm范围内不同大小的稀土荧光二氧化硅纳米颗粒。该法通过调节烷烃分子的种类、表面活性剂种类以及水的用量等便可合成20nm-100nm范围内不同大小的稀土荧光二氧化硅纳米颗粒，方便科研工作者们选取合适大小的荧光纳米颗粒应用于荧光成像、生物分析等方面。

综上所述，本发明提供了一种高强度稀土荧光二氧化硅纳米颗粒的简易制备方法，即在油包水微乳体系中采用直接修饰的方式将大量的稀土荧光络合物交联至二氧化硅纳米颗粒表面。该方法制备简单，省时省力，所制备的稀土荧光二氧化硅纳米颗粒荧光强度高，易于功能化，大小均一，可广泛应用于生物分析、荧光成像以及医学诊断等领域。

附图说明

图1为本发明实施例1的稀土荧光二氧化硅纳米颗粒的透射电子显微镜照片。在图1中，标尺为0.2μm；制得稀土荧光二氧化硅纳米颗粒后悬浮于乙醇中，调整浓度为0.2mg/mL，在电镜下观察并拍照；照片中的稀土荧光二氧化硅纳米颗粒粒径大小为60nm；由照片上可以看到二氧化硅纳米颗粒表面凸凹不平，且具有较多暗点，表明二氧化硅纳米颗粒表面键合了较多的荧光稀土络合物。

图2为本发明实施例1所制备的稀土荧光二氧化硅纳米颗粒(实线部分)及游离稀土荧光络合物(虚线部分)的光谱图。在图2中，横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度；制得稀土荧光二氧化硅纳米颗粒后悬浮于乙醇中，浓度稀释至5×10^-3mg/mL，于Varian CaryEclipse荧光分光光度计扫描光谱；从图2中可以看出，当稀土荧光络合物与二氧化硅纳米颗粒交联后，其光谱图并未出现显著改变。其光谱激发光谱带较宽，有利于有利于增加激发能，发射光谱带较窄，半峰宽小于15nm，有利于提高分辨率。

图3为本发明实施例1所制备的稀土荧光二氧化硅纳米颗粒在不同浓度下的荧光拍摄图片。将所制备的稀土荧光二氧化硅纳米颗粒悬于无水乙醇中，稀释至不同的浓度，在紫外激发下采用带有滤光片的相机进行荧光拍摄，可获得二氧化硅纳米颗粒的荧光亮度图片；图3中a、b、c、d各管的质量浓度分别为15mg/mL、1.5mg/mL、0.15mg/mL、0.015mg/mL，可以看出在很低的质量浓度下，稀土荧光二氧化硅纳米颗粒仍然具有强烈的荧光，说明该法制备的稀土荧光二氧化硅纳米颗粒具有很高的荧光强度。

图4为本发明实施例2的免疫分析工作曲线。在图4中，横坐标为乙肝表面抗原(IU/mL)，左纵坐标为荧光强度，右纵坐标为变异系数(％)；该体系对一系列不同浓度的阳性质控品进行检测后，采用荧光纸条检测仪读值，然后根据所得数值作出工作曲线；从图4中可以看出，该体系的检测范围很广，且检测灵敏度很高。

图5为本发明实施例2的免疫分析线性范围曲线。在图5中，横坐标为乙肝表面抗原(IU/mL)，纵坐标为荧光强度；Y＝0.9570X+1.45827，R＝0.9993；由图5可以看出，该检测体系在0.025～50IU/mL范围内具有良好的线性关系(R＝0.9977)。根据阴性对照加3倍的标准偏差定义为检测限，可计算出该检测体系的检测限度为0.039IU/mL，说明其检测灵敏度极高。

图6为本发明实施例2的免疫层析结果。该体系对一系列不同浓度的阳性质控品进行检测后，在紫外激发下采用带有滤光片的相机进行荧光拍摄，可获得较为直观的检测结果；从图6中试纸条的控制带处可以看到高亮度的条带，在检测带处，HBsAg浓度越高则条带越亮。该检测体系的灵敏度可达0.1IU/mL。

具体实施方式

以下实施例将对本发明作进一步的说明，这些实施例只是说明而不表示本发明所有的可能性。本发明并不局限于这些实施例中提到的材料、反应条件或参数，任何在相关领域具备经验的人，都可以按照本发明的原理和技术方案，利用其它类似材料或反应条件实现本发明所描述的免疫层析技术或制备出检测试剂盒。这些并不脱离本发明描述的基本概念。因此，这些修改或者不同的应用都在本发明的覆盖范围之内。

实施例1：BHHCT-Eu二氧化硅纳米颗粒的制备

该实施例描述了在油包水微乳体系中制备空白二氧化硅纳米颗粒，再直接在微乳体系中加入事先反应好的稀土配合物前驱体APTMS-BHHCT进行颗粒表面的修饰，再以Eu³⁺为稀土离子使其与稀土离子配合物BHHCT螯合，从而制备出稀土荧光二氧化硅纳米颗粒的过程。

(1)油包水微乳体系中空白二氧化硅纳米颗粒的制备：取带有磁石的锥形瓶，于搅拌状态下依次加入6mL环己烷、2mL正己醇、2mL Triton X-100、0.6ml超纯水，从而形成油包水微乳体系。待溶液混匀后依次加入60μL氨水(25％～28％)和100μL TEOS，室温下反应24h。在氨水的催化下，TEOS在水核中发生聚合而形成空白二氧化硅纳米颗粒。

(2)稀土离子配合物前驱体APTMS-BHHCT的制备：取7.2mg BHHCT溶于无水乙醇中，加入4.7μL APTMS，立即超声混匀，避光下反应0.5h。此过程中BHHCT的磺酰氯基团同APTMS的氨基发生反应而得到稀土离子配合物前驱体。

(3)微乳中二氧化硅纳米颗粒表面稀土离子配合物BHHCT的修饰：将上述稀土离子配合物前驱体与20μL四乙氧基硅烷(TEOS)混匀后加入油包水微乳体系中，于搅拌下避光反应5h，稀土离子配合物即键合至二氧化硅纳米颗粒表面；

(4)Eu³⁺的螯合：在上述微乳中加入50μL Eu³⁺(0.64mol/L)，继续在避光条件下搅拌5h，Eu³⁺即螯合于二氧化硅纳米颗粒表面的BHHCT上而形成具有荧光的稀土络合物，最后经50％的无水乙醇洗涤3～5遍，即得产物稀土荧光二氧化硅纳米颗粒。所制备的稀土荧光二氧化硅纳米颗粒的透射电镜照片、荧光光谱图及荧光强度图片见图1～3。

实施例2：稀土荧光二氧化硅纳米颗粒在快速免疫层析检测中的应用

该实施例描述了以稀土荧光二氧化硅纳米颗粒为标记物，以乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)为检测模型的快速免疫层析检测体系的实施过程。

(1)稀土荧光二氧化硅纳米颗粒的制备：同实施例1。

(2)抗体的标记：取0.3mg抗-乙肝表面抗原单克隆抗体对0.05M醋酸钠缓冲液(pH5.2)透析6h，之后与抗体中加入NaIO₄至其终浓度为0.01M，室温下反应20min，使抗体糖链分子的羟基氧化为醛基。然后加入甘油至其终浓度为30mM，混匀，摇10min，以中止氧化反应。再次对抗体采用0.05M醋酸钠缓冲液(pH5.2)透析6h，取出后采用0.01M碳酸钠溶液调pH至9.0左右。取2mg稀土荧光二氧化硅纳米颗粒，对25mM碳酸盐缓冲液(pH9.5)洗涤两遍，悬浮于100μL 50mM碳酸盐缓冲液(pH9.5)，与上述透析后的抗体混匀，4℃下反应12h后，用0.5M硼氰化钠还原6h，再加等体积的封闭液(0.05mol/L Tris 7.8，含2％BSA、4％蔗糖)封闭6h。最后用10mM Tris7.8洗涤上述颗粒标记物3遍，再悬浮于100μL 0.05mol/LTris7.8(含0.9％NaCl、0.2％BSA、0.1％NaN₃)备用。

(3)标记抗体的固相化：将制备好的颗粒标记物采用10mM Tris7.8(含2％酪蛋白)按1∶500稀释，然后喷洒于作为标记物垫的玻璃纤维上，冻干备用。

(4)捕获抗体的包被：取与标记抗体配对的抗-乙肝表面抗原单克隆抗体用0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)，稀释至2mg/mL，用点膜仪在硝酸纤维素膜上划成带状，作为检测带；在距检测带0.5cm的膜上，用1mg/mL的兔抗鼠IgG再划一条，作为控制线。置于37℃恒温干燥箱中烘干6h。

(5)试纸条的装配：在一长方形聚氯乙烯(PVC)底板的中部贴上已包被抗-HBsAg单克隆抗体的硝酸纤维素膜，在膜的一侧贴上加样垫和标记物垫，在膜的另一侧贴上吸水纸，然后切成宽度为4mm的HBsAg检测试纸条，装入纸条卡槽中，再封装入铝箔袋，室温下保存备用。

(6)免疫层析：在试纸条的样品垫上加70μL待检样品，层析30min后，将试纸卡插入荧光纸条检测仪进行荧光信号采集，实现定量分析。若膜上检测带与控制带处的荧光读值都大于10，则说明为阳性结果，检测带的荧光读值越高则样品中HBsAg的含量越高；若只有控制带处的荧光读值大于10，则说明待测样本中没有HBsAg，为阴性结果；若检测带与控制带处的荧光信号读值都小于10，则说明检测无效，需重新试验。采用荧光纸条检测仪进行定量检测的方法检测限度为0.039IU/mL。另外，还可通过荧光拍摄的方式判定检测结果，即将试纸条放于紫外灯下，再采用带有滤光片的相机进行拍摄即可获得试纸条的荧光拍摄图片，若检测带与控制带均出现荧光条带，则为阳性结果，检测带的荧光条带越亮则样品中HBsAg的含量越高；若只有控制带处出现荧光条带，则说明待测样本中没有HBsAg，为阴性结果；若检测带与控制带处均无荧光条带，则说明检测无效，需重新试验。采用紫外光激发下荧光成像的方法检测灵敏度为0.1IU/mL。在本实施例中既可通过荧光纸条检测仪进行定量检测也可采用紫外光激发下进行荧光拍摄来获取结果，两种方式既可以单独使用，也可结合起来使用以共同判定检测结果。该检测体系对不同浓度质控品的免疫层析工作曲线、线性范围曲线和荧光拍摄结果见图4～6。

Claims

1.一种稀土荧光二氧化硅纳米颗粒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

3)将步骤2)制得的稀土离子配合物前驱体与四乙氧基硅烷混合后加入步骤1)所得的表面带有羟基的二氧化硅纳米颗粒中，稀土离子配合物即可键合至二氧化硅纳米颗粒表面；

2.如权利要求1所述的一种稀土荧光二氧化硅纳米颗粒的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述油、表面活性剂、助表面活性剂的质量比为3∶1∶1。

3.如权利要求1所述的一种稀土荧光二氧化硅纳米颗粒的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述水选自超纯水。

4.如权利要求1所述的一种稀土荧光二氧化硅纳米颗粒的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述油选自环己烷、正戊烷、正己烷、正庚烷、正癸烷中的一种。

5.如权利要求1所述的一种稀土荧光二氧化硅纳米颗粒的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述表面活性剂选自Triton X-100、二-乙基己基琥珀酸酯磺酸钠、壬基酚聚氧乙烯醚中的一种。

6.如权利要求1所述的一种稀土荧光二氧化硅纳米颗粒的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述助表面活性剂选自正己醇。

7.如权利要求1所述的一种稀土荧光二氧化硅纳米颗粒的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述带有功能基团的硅烷试剂选自3-氨丙基三甲氧基硅烷、巯丙基三甲氧基硅烷、5，3-甘油酸丙烷三甲氧基硅烷中的一种。

8.如权利要求1所述的一种稀土荧光二氧化硅纳米颗粒的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述稀土离子配合物为螯合特定稀土离子的有机化合物，所述稀土离子配合物最好选自β-二酮类化合物、邻菲咯啉类化合物、水杨酸类化合物、联吡啶类化合物中的一种。

9.如权利要求1所述的一种稀土荧光二氧化硅纳米颗粒的制备方法，其特征在于在步骤4)中，所述稀土离子选自铕、铽、钐、镝中的一种。

10.如权利要求1所述的一种稀土荧光二氧化硅纳米颗粒的制备方法，其特征在于在步骤4)中，所述洗涤，采用50％的无水乙醇洗涤。