CN101225306A

CN101225306A - 一种荧光稀土络合物硅纳米颗粒的制备方法

Info

Publication number: CN101225306A
Application number: CNA2008100706090A
Authority: CN
Inventors: 李庆阁; 许晔
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2008-02-02
Filing date: 2008-02-02
Publication date: 2008-07-23
Anticipated expiration: 2028-02-02
Also published as: CN101225306B

Abstract

一种荧光稀土络合物硅纳米颗粒的制备方法，涉及一种荧光硅纳米颗粒的制备，尤其是涉及一种将稀土络合物循环键合在硅纳米颗粒表面的制备荧光稀土络合物硅纳米颗粒的方法。提供一种可控性好，易实现，所制备的颗粒均匀，荧光强度高的荧光稀土络合物硅纳米颗粒的制备方法。将荧光稀土络合物键合在硅纳米颗粒的表面，并通过硅烷的循环枝接，多层修饰的策略，使得键合到硅纳米颗粒表面的络合物的数量达到最大，进而获得荧光强度高、稳定性好、易标记的荧光稀土络合物硅纳米颗粒。具体方法为制备纳米颗粒载体后，进行纳米颗粒表面的功能化；光稀土络合物的化学键合后，进行粒表面基团的枝接，再环枝接与多层修饰，最后光硅纳米颗粒表面的再次功能化。

Description

一种荧光稀土络合物硅纳米颗粒的制备方法

技术领域

本发明涉及一种荧光硅纳米颗粒的制备，尤其是涉及一种将稀土络合物循环键合在硅纳米颗粒表面的制备荧光稀土络合物硅纳米颗粒的方法。

背景技术

常用的荧光标记物的荧光寿命短，难以克服背景荧光的干扰，检测灵敏度低。利用具有长寿命荧光的稀土络合物作为标记物，采用时间分辨检测技术，可以消除背景荧光的干扰，使灵敏度提高几个数量级，这种称作时间分辨荧光检测的技术，已成为目前生物医学研究和临床生化检测中的很有前途的超微量分析方法。

现有的荧光稀土络合物标记物，其稀土离子主要是Eu³⁺、Tb³⁺、Sm³⁺等同一些有机配合物，如β-二酮化合物、邻菲咯啉类化合物等所形成的络合物，虽然目前已得到不同程度的应用，但是都难以同时满足如下要求：①具有很强的荧光；②稳定性好；③易与生物活性物质交联并在交联后同时保持标记物的高荧光强度和被标记物的生物活性；④易合成，价格低。

稀土络合物的纳米化为解决上述问题提供了可能。由于纳米颗粒可以通过掺杂或键合荧光稀土络合物，将多个络合物分子固定其中，当作为标记物使用时，荧光信号大大增强，并且使稳定性也有所提高。

姚云峰等(姚云峰，等，中国稀土学报，2000，18(4)305-308)报道了将MCM-41介孔分子筛与Eu³⁺/噻吩甲酰三氟乙酰丙酮发光稀土络合物组装成介孔复合体。

中国专利CN98116430提供了一种含稀土有机/无机纳米杂化发光材料的合成方法，采用Sol-Gel方法将前体化合物N-(丙基-γ-三乙氧基硅酯)-4-羧基-邻苯二甲酰亚胺在盐酸催化下形成溶胶，再将稀土离子或稀土离子及有机染料N-(丙基-γ-三乙氧基硅酯)-4，4’-联苯四甲酸双酰亚胺加入该溶胶中，旋涂成膜，凝胶化，获得能发出红、绿、黄及白色荧光的有机/无机纳米杂化光学透明固体薄膜。

中国专利CN01133257公开了一种高聚物/稀土化合物纳米杂化发光材料的合成方法，采用Sol-Gel反应，将无机组分的前驱体正硅酸乙酯、乙烯基单体和稀土配合物都加入到溶胶体系中，在弱酸存在下水解和缩合，搅拌混合成为均相溶胶，然后凝胶化。之后利用热聚合方法引发单体聚合，从而获得有机/无机纳米杂化发光材料。

以上报道或专利申请都未考虑这些杂化材料作为医学诊断标记物的可能性，而且，上述专利申请中，虽然提及“纳米”材料，但是其终产物实际上都是块状材料。

中国专利CN1651437A公开了一种稀土配合物纳米颗粒的制备方法，是将稀土配合物溶解在相应易溶溶剂中，再将该稀土配合物溶液加入到该配合物的难溶溶剂中，通过沉淀析出稀土配合物纳米颗粒。该专利同样没有考虑其纳米颗粒作为标记物的可能性，同时该纳米颗粒的表面也没有可用于交联的活性基团。

美国专利US 4,283,382公开了将稀土铕络合物掺入乳胶颗粒的方法，可作为医学诊断标记物。所述方法乃是通过降低溶剂的疏水性，将溶解在有机溶剂中的Eu³⁺络合物嵌入一种特殊的称作“可负载的聚合物乳胶颗粒”中。所谓的“可负载的聚合物乳胶颗粒”属有机高分子材料，乳胶颗粒尺寸没有明确的描述。

美国专利US 5,442,021公开了一种可作为医学诊断标记物使用的发光共聚物，采用了可聚合的稀土离子配合物，该配合物含有和稀土离子配合的部分，同时含有双键。前者可以和Eu³⁺形成荧光稀土络合物，后者可以生成高分子聚合物。该标记物仍属于有机高分子材料，并且获得的颗粒直径都大于100nm。

中国专利CN1186634C公开了一种荧光稀土络合物硅纳米颗粒类标记物及其制备方法，是通过物理掺杂或化学键合的手段，将荧光稀土络合物掺杂到硅纳米颗粒中，制备了一种荧光强度高、稳定性好和易标记的荧光稀土络合物硅纳米颗粒。该颗粒可应用于生物分析和医学诊断领域。中国专利CN1298807C公开了一种与上述专利类似的制备方法，但仅采用了物理掺杂的手段将荧光稀土络合物掺杂到硅纳米颗粒中。

以上专利申请所公开的制备方法都是将荧光稀土络合物掺杂在载体纳米颗粒的内部，而将荧光稀土络合物键合在硅纳米颗粒载体的表面，特别是通过循环枝接，多层修饰的方法将稀土络合物键合于硅纳米颗粒表面的制备方法尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种可控性更好，更易于实现，所制备的颗粒更均匀，荧光强度更高的荧光稀土络合物硅纳米颗粒的制备方法。

本发明的技术方案是将荧光稀土络合物以键合的方式固定于硅纳米颗粒的表面，并且通过循环枝接和多层修饰的方法使荧光纳米颗粒的荧光达到最大。

本发明包括以下步骤：

1)硅纳米颗粒载体的制备：通过Stober方法或者反相微乳法制备出大小可控的硅纳米颗粒；

2)硅纳米颗粒表面的功能化：采用带有功能基团的硅烷试剂修饰硅纳米颗粒，使硅纳米颗粒表面固定有用于化学键合的功能基团；

3)荧光稀土络合物的化学键合：将稀土配体键合于颗粒表面，然后加入稀土离子，与固定在硅纳米颗粒表面的稀土配体形成具有荧光的稀土络合物；

4)颗粒表面基团的枝接：用四乙氧基硅烷(TEOS)修饰上述荧光硅纳米颗粒，利用颗粒表面剩余的硅羟基，枝接生长出更多的表面硅羟基，以用于进一步的循环功能化及键合稀土络合物；

5)循环枝接与多层修饰：重复步骤2)～4)，用于增强荧光硅纳米颗粒的荧光强度；

6)荧光硅纳米颗粒表面的再次功能化：使用带有功能基团的硅烷试剂再一次修饰经过循环枝接与多层修饰制备好的荧光硅纳米颗粒，补充其表面因键合而减少的功能基团，得产物荧光稀土络合物硅纳米颗粒。

在采用Stober法或者反相微乳法制备硅纳米颗粒载体时，虽然Stober步骤简单，可制备的颗粒直径的范围较大，但是所制备的颗粒的均一性相对较差；而反相微乳法则可以在直径20～100nm范围内，制备出大小均匀的硅纳米颗粒。

带有功能基团的硅烷试剂选自氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)、巯丙基三甲氧基硅烷(MPTMS)或5.3-甘油酸丙烷三甲氧基硅烷(GPTMS)等，可为硅纳米颗粒表面修饰上氨基、巯基、环氧基等功能性基团。

所述的稀土配体包括带有活性基团的稀土配体和没有活性但带有可被活化的功能基团的稀土配体，带有活性基团的稀土配体可直接于硅纳米颗粒表面的功能基团反应，键合于颗粒表面；而对于没有活性但带有可被活化的功能基团的稀土配体可通过交联试剂，键合于颗粒表面。

所述的带有活性基团的稀土配体指的是分子上带有，如磺酰氯基、琥珀酰亚胺基或马来酰亚胺基等基团的稀土配体，可直接与硅纳米颗粒表面的功能基团键合。

所述的没有活性但带有可被活化的功能基团的稀土配体指的是分子上带有，如氨基、巯基或羧基等基团的稀土配体，可通过相应的交联试剂与硅纳米颗粒表面的功能基团键合。

所述的循环枝接与多层修饰，指的是利用TEOS对被修饰后的颗粒表面的剩余硅羟基进行枝接，以生长出更多的硅羟基，进而有利于对颗粒表面进行再一次的功能化及荧光稀土络合物的键合。如此，反复枝接及修饰，可使荧光硅纳米颗粒的荧光强度逐次增强，在一定次数的反复枝接和修饰后，荧光硅纳米颗粒的荧光强度达到最大值。循环枝接与多层修饰的次数，依不同的稀土配体而定，与配体本身的物理化学性质有关，如疏水性等。

所述的重复步骤2)～4)的重复次数最好为3～5次。

由于每一次的化学键合都会使荧光硅纳米颗粒表面的功能基团减少，为了更有利于颗粒与待标记的活性物质交联，需要在制备过程的最后一步，对颗粒再进行一次功能化修饰。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

(1)以硅纳米颗粒为载体，以共价键合的方式固定荧光稀土络合物，荧光稀土络合物不易脱落，稳定性好。而之前报道的聚苯乙烯荧光纳米颗粒和部分荧光硅纳米颗粒采用的是物理掺杂或包裹的方式，则存在络合物脱落泄漏的问题。

(2)将荧光稀土络合物键合于硅纳米颗粒的表面，荧光稀土络合物不影响硅纳米颗粒的内部结构，而且键合的数量不受颗粒内部空间的局限。之前的报道几乎都是将稀土络合物键合或掺杂在颗粒的内部。由于颗粒内部可掺杂的空间有限，使得所能掺入的荧光物质的量有限，最终导致得到的纳米颗粒的荧光强度有限。另外，对于在制备硅纳米颗粒的同时掺入稀土络合物的方法来说，内部掺杂的荧光物质达到一定量后，会影响硅纳米颗粒的形成，导致颗粒的均一性下降，甚至无法形成颗粒。而将荧光稀土络合物键合在硅纳米颗粒的表面则避免了上述问题。并且由于以Sol-Gel方法制备的硅纳米颗粒是表面多孔的结构，因而其具有极大的表面积，可与大量的荧光稀土络合物键合。

(3)从制备过程来看，本发明采用的是先制备硅纳米颗粒，再键合稀土络合物的方式。稀土络合物不会干扰颗粒的形成过程，可以制备出大小均匀，尺寸可控的荧光硅纳米颗粒。

(4)采用循环枝接与多层修饰的制备策略。最大限度地提高颗粒表面所能键合的荧光稀土络合物的数量，进而最大限度地提高颗粒的荧光强度。本发明制备的荧光稀土络合物硅纳米颗粒所键合的稀土络合物的数量可比以往报道的方法提高一到两个数量级。

综上所述，本发明提供了一种新的制备荧光稀土络合物硅纳米颗粒的方法，采用在硅纳米颗粒表面循环枝接与多层修饰的策略键合稀土络合物。该方法易于实现，可控性好，所制备的荧光硅纳米颗粒稳定性好，荧光强度高，可广泛应用于生物学分析、医学诊断等领域。

附图说明

图1为本发明实施例1的荧光稀土络合物硅纳米颗粒制备过程的示意图，首先用带有功能基团的硅烷APTMS修饰硅纳米颗粒载体，使其表面带有大量的氨基，然后与带有活性磺酰氯基团的稀土配体键合并络合铕离子，完成第一次修饰。而后再用TEOS枝接颗粒表面残留的硅羟基，得到更多的表面硅羟基，从而进入下一个修饰和枝接的循环。经过共5次的枝接和修饰的循环，颗粒的荧光强度达到最大值。

图2为本发明实施例1的硅纳米颗粒的透射电镜照片，图2a为修饰荧光络合物前的硅纳米颗粒载体。颗粒表面平整，均一。图2b为经过表面循环枝接，多层修饰制备出的荧光稀土络合物硅纳米颗粒。颗粒表面有许多黑色的突起，说明荧光稀土络合物已被成功键合到颗粒的表面。在图2中，标尺均为20nm。

图3为本发明实施例1所制备的荧光稀土络合物硅纳米颗粒的光谱图，在图3中，横坐标为波长wavelength，纵坐标为相对强度intensity。

图4为本发明实施例4的免疫分析工作曲线。在图4中，横坐标为HbsAg(ng/mL)，左纵坐标为Fluorescence(counts)，右纵坐标为CV(％)。该检测体系的分析灵敏度可达0.01ng/mL，线性范围为0.05～110ng/mL。

图5为本发明实施例5的免疫层析结果。在图5中，分别给出检测带和控制带。在层析时间为30min的条件下，该检测体系的检测灵敏度可达0.1～0.2ng/mL。

具体实施方式

以下实施例描述了本发明的特殊实施例子，以便对本发明作进一步的说明，这些实施例只是说明而不表示本发明所有的可能性。本发明并不局限于这些实施例中提到的材料、反应条件或参数，任何在相关领域具备经验的人，都可以按照本发明的原理和技术方案，利用其它类似材料或反应条件实现本发明所描述的免疫层析技术或制备出检测试剂盒。这些并不脱离本发明描述的基本概念。因此，这些修改或者不同的应用都在本发明的覆盖范围之内。

实施例1：BHHCT-Eu硅纳米颗粒的制备

该实施例描述了以反相微乳法制备硅纳米颗粒载体，以APTMS在颗粒表面修饰氨基，以带有磺酰氯基团的BHHCT为键合稀土配体，以Eu³⁺为稀土离子的荧光稀土络合物硅纳米颗粒的制备过程。

(1)硅纳米颗粒载体的制备：取环己烷30mL、Tx-100 10mL、正己醇10mL加入三角烧瓶，置于磁粒搅拌器搅拌，待搅拌均匀后，依次加入2mL超纯水、300μL氨水、800μLTEOS，搅拌24h后，加入等体积丙酮，混匀，离心分离颗粒，再用超纯水和无水乙醇洗涤颗粒数次，除去表面活性剂及其他未反应的试剂，最后得到直径50～60nm，颗粒均匀，分散良好的硅纳米颗粒。

(2)硅纳米颗粒表面的氨基化：取1mL浓度为36mg/mL，悬浮于无水乙醇中的硅纳米颗粒，加入3μL APTMS，室温搅拌2h，随后加热到69度，并持续加热5min，最后用无水乙醇洗涤3遍，并悬浮于1mL无水乙醇中，备用。

(3)荧光稀土络合物的化学键合：取上述表面修饰有氨基的硅纳米颗粒1mL，浓度为36mg/mL，加入0.8mg BHHCT(4，4’-二(1”，1”，1”，2”，2”，3”，3”-七氟-4”，6”-己二酮-6”-基)-氯磺酰-邻-三联苯)，室温搅拌2h，乙醇洗2遍后，以1mL Tris-Hcl(0.05M，pH 7.8)悬浮，加入50μL Eucl₃(40mL)，室温避光搅拌30min，最后以无水乙醇洗涤3遍，并悬浮于1mL无水乙醇中。

(4)颗粒表面基团的枝接：取上述键合有稀土络合物的硅纳米颗粒1mL，浓度为36mg/mL，加入20μL TEOS，室温避光搅拌2h，随后加热到69度，并持续加热5min，最后用无水乙醇洗涤1遍，并悬浮于1mL无水乙醇中。

(5)循环枝接，多层修饰：重复步骤(2)～(4)4次。

(6)对上述颗粒再次氨基化，同步骤(2)。颗粒制备完成。

实施例2：BC-EDTA-Eu硅纳米颗粒的制备

该实施例描述了以反相微乳法制备硅纳米颗粒载体，以APTMS在颗粒表面修饰氨基，以BC-EDTA为键合稀土配体，以Eu³⁺为稀土离子的荧光稀土络合物硅纳米颗粒的制备过程。

(1)硅纳米颗粒载体的制备：同实施例1。

(2)硅纳米颗粒表面的氨基化：同实施例1。

(3)荧光稀土络合物的化学键合：取表面修饰有氨基的硅纳米颗粒1mL，浓度为15mg/mL，以0.05mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)，pH＝6.8，洗两遍，超声悬浮在1mL0.05mol/L的PBS中。另取3.4mg BC-EDTA(2，9-双[N，N-双(羧甲基)氨甲基]-4，7二苯基-1，10-邻二氮菲)，0.4mg NHS，3.9mg EDC，溶解在200μL 0.05mol/L的PBS中，避光反应30min，与上述颗粒悬浮液混合，避光反应2h，以0.05mol/L的PBS洗三遍，超声悬浮于1ml 0.01mol/LTris-HCl缓冲液中(pH＝7.8)。加入200μL 0.04mol/L EuCl₃溶液，避光反应30min。最后以无水乙醇洗涤3遍，并悬浮于1mL无水乙醇中。

(4)颗粒表面基团的枝接：同实施例1。

(5)循环枝接，多层修饰：重复步骤(2)～(4)3次。

(6)对上述颗粒再次氨基化，同步骤(2)。颗粒制备完成。

实施例3：BBCAP-Eu硅纳米颗粒的制备

该实施例描述了以反相微乳法制备硅纳米颗粒载体，以APTMS在颗粒表面修饰氨基，以BBCAP为键合稀土配体，以Eu³⁺为稀土离子的荧光稀土络合物硅纳米颗粒的制备过程。

(1)硅纳米颗粒载体的制备：同实施例1。

(2)硅纳米颗粒表面的氨基化：同实施例1。

(3)荧光稀土络合物的化学键合：取表面修饰有氨基的硅纳米颗粒1mL，浓度为15mg/mL，以0.05mol/L的碳酸盐缓冲液(CB)，pH＝9.5，洗两遍，超声悬浮在1mL0.05mol/L的CB中。另取2.6mg BBCAP(2，9-双[N，N-双(羧甲基)氨甲基]-1，10-菲洛啉)，0.4mgNHS，3.9mg EDC，溶解在200μL 0.05mol/L的CB中，避光反应30min，与上述颗粒悬浮液混合，避光反应2h，以0.05mol/L的CB洗三遍，超声悬浮于1ml 0.01mol/L Tris-HCl缓冲液中(pH＝7.8)。加入200μL 0.04mol/L EuCl₃溶液，避光反应30min。最后以无水乙醇洗涤3遍，并悬浮于1mL无水乙醇中。

(4)颗粒表面基团的枝接：同实施例1。

(5)循环枝接，多层修饰：重复步骤(2)～(4)2次。

(6)对上述颗粒再次氨基化，同步骤(2)。颗粒制备完成。

实施例4：BHHCT-Eu硅纳米颗粒在固相免疫分析中的应用

该实施例描述了以BHHCT-Eu硅纳米颗粒为标记物，以乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)为检测模型的时间分辨免疫检测体系的实施过程。

(1)BHHCT-Eu硅纳米颗粒的制备：同实施例1。

(2)抗体的定向标记：取亲和纯的抗-HBsAg单克隆抗体500μL(3.6mg/mL)，对0.01mol/L pH 5.2醋酸钠缓冲液，4℃透析6h；然后加入NaIO4，对抗体进行氧化，20min后，再次对0.01mol/L pH5.2醋酸钠缓冲液透析；然后加入表面带有氨基的BHHCT-Eu颗粒500μL(18mg/mL)，混匀，4℃过夜；加入NaBH4，终浓度为0.005mol/L，反应2h；再加入等体积的封闭液(0.05mol/Ltris 7.8，含2％BSA、4％蔗糖)，封闭12h或4℃过夜；最后用0.05mol/L tris 7.8洗涤标记好的抗体3遍，然后用500μL 0.05mol/L tris 7.8(含0.9％NaCl、0.2％BSA、0.1％NaN₃)悬浮备用。

(3)抗体包被：取与标记抗体配对的抗-HBsAg单克隆抗体用0.015mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)，pH＝7.4，稀释至5μg/mL，向白色微孔板中，每孔加入100μL，37℃包被16hr。用0.01mol/LPBST洗一遍，扣干。每孔加入200μL封闭液(含1％BSA，1％蔗糖的0.01mol/LPBS 7.4)，4℃封闭16hr。备用。

(4)免疫分析：将微孔板扣干后，每孔同时加入50μL HBsAg标准样品或血清样品，37℃温育1hr。用洗涤液(含0.05％Tween-20的0.05mol/L Tris-HCl，pH＝9.1)洗5遍，扣干后，每孔加入50μL稀释后的铕纳米颗粒标记抗体，37℃温育1.5hr。用洗涤液洗5遍，扣干后于1420 Victor2 Multiple Counter进行固相测定，测定条件设为：340nm激发，615nm荧光测定。

结果见图4。

实施例5：BHHCT-Eu硅纳米颗粒在快速免疫层析中的应用

该实施例描述了以BHHCT-Eu硅纳米颗粒为标记物，以乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)为检测模型的快速免疫层析检测体系的实施过程。

(1)BHHCT-Eu硅纳米颗粒的制备：同实施例1。

(2)抗体的定向标记：同实施例4。

(3)标记抗体的固相化：将制备好的标记颗粒用以10mM Tris 7.8缓冲液配制的2％的酪蛋白稀释液按1∶1000稀释；然后将作为标记物垫的玻璃纤维浸入其中，以浸湿为准，然后冻干备用。

(4)捕获抗体的包被：在硝酸纤维素薄膜上，用点膜器将1mg/mL单克隆抗-HBs点成线状或带状，其包被体积为0.75μL/cm作为检测带；在距检测带0.5cm的膜上，用1mg/mL的兔抗鼠IgG再划一条对照线.用PBS漂洗2次，再用50mg/mL BSA封闭2h.取出后再加蛋白稳定剂处理3min凉干备用。

(5)试纸条的装配：在一长方形聚氯乙稀底衬的中部贴上已包被单克隆抗-HBs的硝酸纤维素薄膜，在膜的一侧贴上玻璃纤维，并在于膜交接的一端铺上标记物垫，在层析膜的另一端贴上吸水纸。然后切成75mm×3mm条形的HBsAg检测试纸条。

(6)免疫层析：在试纸条的样品垫上加60μL的待测样品，20min后，在紫外光下观察结果或通过时间分辨荧光检测仪测量度数。如果样品中HBsAg含量较低，则需适当延长时间。阳性结果呈现两条红色的带，而阴性结果只呈现一条红色的带。层析反应30min，在紫外光激发荧光成像的检测灵敏度为0.2ng/mL。在本实施例中，以Canon Powershot A-80进行辅助观察并记录结果。该方法检测的结果还可以通过时间分辨荧光检测仪进行读数。

结果见图5。

Claims

1.一种荧光稀土络合物硅纳米颗粒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)硅纳米颗粒载体的制备：通过Stober方法或反相微乳法制备出大小可控的硅纳米颗粒；

4)颗粒表面基团的枝接：用四乙氧基硅烷修饰上述荧光硅纳米颗粒，利用颗粒表面剩余的硅羟基，枝接生长出更多的表面硅羟基，以用于进一步的循环功能化及键合稀土络合物；

2.如权利要求1所述的一种荧光稀土络合物硅纳米颗粒的制备方法，其特征在于带有功能基团的硅烷试剂选自氨丙基三甲氧基硅烷、巯丙基三甲氧基硅烷或5.3-甘油酸丙烷三甲氧基硅烷，为硅纳米颗粒表面修饰上氨基、巯基、环氧基功能性基团。

3.如权利要求1所述的一种荧光稀土络合物硅纳米颗粒的制备方法，其特征在于所述的稀土配体包括带有活性基团的稀土配体和没有活性但带有可被活化的功能基团的稀土配体，带有活性基团的稀土配体可直接于硅纳米颗粒表面的功能基团反应，键合于颗粒表面；而对于没有活性但带有可被活化的功能基团的稀土配体可通过交联试剂，键合于颗粒表面。

4.如权利要求3所述的一种荧光稀土络合物硅纳米颗粒的制备方法，其特征在于所述的带有活性基团的稀土配体指的是分子上带有磺酰氯基、琥珀酰亚胺基或马来酰亚胺基基团的稀土配体，直接与硅纳米颗粒表面的功能基团键合。

5.如权利要求3所述的一种荧光稀土络合物硅纳米颗粒的制备方法，其特征在于所述的没有活性但带有可被活化的功能基团的稀土配体指的是分子上带有氨基、巯基或羧基基团的稀土配体，通过相应的交联试剂与硅纳米颗粒表面的功能基团键合。

6.如权利要求1所述的一种荧光稀土络合物硅纳米颗粒的制备方法，其特征在于所述的循环枝接与多层修饰指的是利用TEOS对被修饰后的颗粒表面的剩余硅羟基进行枝接。

7.如权利要求1所述的一种荧光稀土络合物硅纳米颗粒的制备方法，其特征在于所述的重复步骤2)～4)的重复次数为3～5次。