CN108285787A - 利用微波加热技术制备稀土荧光二氧化硅纳米颗粒的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用微波加热技术制备稀土荧光二氧化硅纳米颗粒的方法，所述方法包括利用油包水(W/O)微乳分散体系制备表面带有羟基的SiO₂纳米颗粒，依次将氨基硅烷试剂、Eu³⁺的BHHCT络合物采用微波加热的方法对SiO₂进行表面修饰，形成具有荧光的稀土络合物，经丙酮封闭反应体系后，洗涤，即得产物共价型荧光稀土二氧化硅纳米颗粒。该方法有效地缩短了反应时间，且荧光强度更高。

Description

利用微波加热技术制备稀土荧光二氧化硅纳米颗粒的方法

技术领域

本发明公开了一种利用微波加热技术制备稀土荧光二氧化硅纳米颗粒的方法，涉及一种二氧化硅荧光纳米微球的制备，尤其是涉及一种采用微波辅助加热的技术缩短制备荧光二氧化硅纳米颗粒的时间的方法。本发明还涉及利用该微波加热技术所制备的稀土荧光二氧化硅纳米颗粒及其用途。

背景技术

具有各种结构及荧光性质的荧光生物标记探针在基因组学、蛋白质组学及生物芯片等现代生命科学与生物技术中发挥着不可替代的重要作用，而现代生命科学与生物检测技术的发展与进步也在很大程度上依赖着荧光生物标记探针的使用及荧光检测方法学的发展与进步。目前已经发展的荧光免疫分析的标记物，包括量子点、有机荧光染料及稀土荧光二氧化硅纳米颗粒。尽管这些荧光纳米探针具有优良的光稳定性和强的荧光信号放大效应，但量子点的强毒性限制了其发展，有机荧光染料多为物理掺杂容易发生荧光泄露，且均受到检测灵敏度的限制。稀土荧光二氧化硅纳米探针作为近几年新兴荧光标记材料，包含多个荧光基团，起到信号放大的作用，同时，共价交联掺杂方式，很大程度上克服了荧光基团的泄露问题。

长春应化所和大连理工大学率先开展了纳米稀土荧光生物标记探针的制备与应用研究工作，初步建立了几种粒径在25-55纳米的稀土荧光生物标记探针的制备技术。稀土元素主要是Eu³⁺、Tb³⁺、Sm³⁺等，它们能与某些特定的配合物形成强荧光络合物。稀土络合物具有以下优异的荧光性质：(1)荧光寿命长。(2)激发光谱带较宽。(3)发射光谱带窄。(4)Stokes位移大。(5)激发波长具有配体的特性，即随配体的变化而变化，发射波长则具有稀土离子的性质，即不随配体的变化而变化。稀土络合物主要是Eu³⁺、Tb³⁺、Sm³⁺等与一些β-二酮化合物，如邻菲罗啉类化合物，水杨酸类化合物，联吡啶类化合物等所形成的络合物，其中对于分子上带有磺酰氨基等活性基团的稀土配体，可直接与硅纳米颗粒键合，但对于带有没有活性但可被活化的功能基团的稀土配体，需通过交联试剂(如EDC)进行稀土配合物的固定化。结果表明，纳米稀土荧光生物标记材料无论在荧光强度还是在光稳定性上都具有远优于稀土配合物荧光标记物的良好性能，预示了其在高灵敏度荧光标记生物分析技术中的良好应用前景。

中国专利CN101225306A公开了一种荧光稀土络合物硅纳米颗粒的制备方法，将稀土络合物循环键合在硅纳米颗粒表面，从而使键合在其表面的荧光稀土络合物数量大大增加，有效地提高了荧光二氧化硅纳米颗粒的荧光强度。但该种循环键合的方式操作繁琐、费时费力，不利于该种标记物的广泛应用。

中国专利CN102504808A公开了一种稀土荧光二氧化硅纳米颗粒的制备方法，采用油包水微乳体系合成空白二氧化硅纳米颗粒，并事先让带有功能团的硅烷试剂和稀土离子配合物充分反应而形成前驱体，然后直接在油包水微乳体系中加入前驱体，即可将大量的稀土离子配合体修饰到每个二氧化硅纳米颗粒的表面，再加入稀土离子与配合体螯合，该方法制备简单，颗粒大小均一，荧光强度高，但颗粒表面化学修饰过程用时较长。

以上专利所述制备的稀土荧光二氧化硅纳米颗粒具有荧光强度强、稳定好、易于标记等特点，但用时较长，因此在保留上述特点的前提下，如何缩短反应时间，提高反应效率，是待解决的一项问题。本发明通过微波加热的方式缩短了反应时间、提高了生产率、同时提高了产品质量，使制备的稀土荧光纳米颗粒的荧光寿命更长。而且利用微波加热技术辅助制备稀土荧光二氧化硅纳米颗粒的制备方法尚未见报道。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种制备时间更短、所制备的颗粒更均匀、荧光强度更强、荧光寿命更长的共价型荧光稀土硅纳米颗粒的制备方法，以及该方法制备的稀土荧光二氧化硅纳米颗粒。

本发明的技术方案是利用微波加热技术对裸二氧化硅进行表面氨基化修饰，再进一步将稀土络合物BHHCT-Eu³⁺化学键合到氨基化硅球表面，缩短反应时间且达到更高的荧光强度。

本发明包括以下步骤：

1)二氧化硅纳米颗粒的制备：将水、油、表面活性剂、助表面活性剂混合形成油包水(W/O)微乳液体系，再依次加入正硅酸酯和催化剂，制备出大小可控的二氧化硅纳米颗粒；

2)微波加热辅助二氧化硅纳米颗粒的表面功能化：微波加热，将带有功能性基团的硅烷试剂修饰到步骤1)所得的二氧化硅纳米表面，使二氧化硅纳米颗粒表面固定有用于化学键合的功能性基团；

3)荧光稀土络合物的制备：将稀土离子与稀土配体混合，反应，得荧光稀土络合物；

4)荧光稀土络合物的固定化：微波加热，将荧光稀土络合物化学键合到步骤2)所得的表面带有功能性基团的二氧化硅纳米颗粒表面，形成具有荧光性能的二氧化硅稀土络合物，经丙酮封闭反应体系后，洗涤，即得产物稀土荧光二氧化硅纳米颗粒。

反相微乳法制备的二氧化硅纳米颗粒大小可控，粒径均匀，可制备的纳米颗粒直径在20-100nm范围内。二氧化硅纳米粒径易受反应物的影响，如水和氨水的浓度、正硅酸酯的类型(例如选自正硅酸四甲酯、正硅酸四乙酯、正硅酸四丙酯)、不同的醇(例如选自甲醇、乙醇、丙醇、戊醇)、催化剂的种类(例如催化剂可为氨水等)及不同的温度等，对这些影响因素的调控，可以获得各类结构的二氧化硅纳米颗粒。

在步骤1)中，所述表面活性剂和助表面活性剂的质量比w在1-2的范围内，优选w为1.2-1.6，最优选的质量比w＝1.5；水选自超纯水，水的用量则可根据所要合成的二氧化硅纳米颗粒的大小进行调整；油选自环己烷、正己烷、正戊烷、正庚烷等；表面活性剂选自Triton X-100，二-乙基己基琥珀酸酯磺酸钠(AOT)、壬基酚聚氧乙烯醚等；助表面活性剂选自正己醇、正辛醇、正庚醇等。

在步骤2)中，所述带有功能性基团的硅烷试剂可选自3-氨丙基三甲氧基硅烷(APTMs)、巯丙基三甲氧基硅烷、5,3-甘油酸丙烷三甲氧基硅烷等，其可为二氧化硅纳米颗粒表面修饰上氨基、巯基、环氧基等功能性基团。

在步骤3)中，稀土配体可为螯合特定稀土离子的有机化合物，可选自β-二酮类化合物、邻菲罗啉类化合物、水杨酸类化合物、联吡啶类化合物等，优选为4,4'-二(1",1",1",2",2",3",3"-七氟-4",6"-己二酮-6”-基)-氯磺酰-邻-三联苯(BHHCT)；稀土离子可选自Eu³⁺、Tb³⁺、Sm³⁺等，它们能与特定的稀土配体螯合形成强荧光的稀土络合物。在一个具体实施方案中，所述稀土配体与稀土离子的摩尔比为1:2至3:1，优选为2：1。在一个具体实施方案中，所述稀土配体是带有活性基团的稀土配体，其包括分子上带有磺酰氨基、琥珀酰亚胺基或马来酰亚胺基基团的稀土配体，在微波作用下，直接与二氧化硅表面功能基团键合。在另一个具体实施方案中，其中所述稀土配体是带有没有活性但可被活化的功能基团的稀土配体，其包括分子上带有氨基、巯基或羧基基团的稀土配体，在微波作用下，通过相应的交联试剂与二氧化硅表面功能基团键合。

在步骤4)中，所述洗涤可采用50％的无水乙醇洗涤，其目的在于除去所得的稀土荧光二氧化硅纳米颗粒悬液中的有机溶剂、表面活性剂及其他杂质，最后一次洗涤用无水乙醇洗涤，离心，烘干，有利于缩短干燥时间。

所述微波加热技术应用在步骤2)和步骤4)中，微波条件优化为：反应温度70℃/59℃,反应时间20min，微波功率700W。

所述带有功能性基团的硅烷试剂与稀土配体(APTMs与BHHCT)的摩尔比为2.5:1至10:1，其中优选摩尔比为2.5:1。所述带有功能性基团的硅烷试剂与稀土配体的摩尔比与步骤4)中的产物的荧光强度成反比关系，荧光强度关系为：I_2.5：1〉I_5∶1〉I_10∶1〉I_15∶1〉I_20：1，其中2.5:1，5:1，10:1，15:1，20:1表示为带有功能性基团的硅烷试剂与稀土配体的摩尔比。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1)制备过程简单、省时省力。该种方法采用微波加热技术，对裸二氧化硅进行表面氨基化修饰，再进一步将稀土络合物BHHCT-Eu³⁺化学键合到氨基化硅球表面，制得共价式稀土荧光二氧化硅纳米颗粒，该方法缩短反应时间，同时所制得的纳米颗粒的质量提高了3～4倍。

2)制备的稀土荧光二氧化硅纳米颗粒荧光强度高。该种方法采用微波加热技术，具有良好选择加热性和高效性，制备的稀土荧光二氧化硅纳米颗粒具有更高的荧光强度。该方法制备的高强度的稀土荧光二氧化硅纳米颗粒作为标记物有望进一步提高分析灵敏度，并可广泛应用于生物分析、荧光成像和医学诊断等领域。

3)制备的稀土荧光二氧化硅纳米颗粒荧光寿命长。该种方法制备的稀土荧光二氧化硅纳米颗粒的荧光寿命为600μs，高于现有技术所制备的稀土荧光纳米颗粒的荧光寿命。

4)制备的稀土荧光二氧化硅纳米颗粒粒径分布均匀，可控性好，颗粒质量高。该种方法先制备硅纳米颗粒，再键合稀土络合物，稀土络合物不会干扰颗粒的形成过程，同时在微波加热技术的辅助下，使反应受热均匀，可以制备出大小均匀，尺寸可控的稀土荧光二氧化硅纳米颗粒。

综上所述，本发明提供了一种新的制备稀土荧光二氧化硅纳米颗粒的方法，即在油包水微乳体系中采用微波加热技术手段直接将大量的荧光稀土络合物化合键合到二氧化硅纳米颗粒表面。微波加热应用于共价式稀土荧光二氧化硅纳米颗粒制备反应时，反应速度比用传统方式快，缩短了反应时间，提高反应效率，该方法制备简单，省时省力，同时该种方法所制备的稀土荧光二氧化硅纳米颗粒稳定性好，荧光强度高，荧光寿命长，易于生物功能化，大小均一，可广泛应用于生物分析、荧光成像及医学诊断等领域。

附图说明

图1为二氧化硅纳米颗粒的透射电镜照片及粒径分布图。其中图1a和1c分别为未修饰荧光稀土络合物的二氧化硅纳米颗粒的透射电镜照片及粒径分布图；图1b和1d分别为本发明实施例5所制备的荧光稀土二氧化硅纳米颗粒的透射电镜照片及粒径分布图。

图2为二氧化硅纳米颗粒的能谱图。其中图2a为未修饰荧光络合物的二氧化硅纳米颗粒的能谱图；图2b为本发明实施例5所制备的荧光稀土二氧化硅纳米颗粒的能谱图。

图3为本发明实施例5，实施例6和实施例7所制备的稀土荧光二氧化硅纳米颗粒的荧光光谱图。其中曲线3a代表实施例5所制备的稀土荧光二氧化硅纳米颗粒的荧光光谱；曲线3b代表实施例6所制备的稀土荧光二氧化硅纳米颗粒的荧光光谱图；曲线3c代表实施例7所制备的稀土荧光二氧化硅纳米颗粒的荧光光谱图。

图4为荧光寿命谱图。其中曲线4a代表实施例5所制备的稀土荧光二氧化硅纳米颗粒的荧光寿命曲线；曲线4b代表游离BHHCT-Eu³⁺稀土络合物的荧光寿命曲线；曲线4c代表实施例7所制备的稀土荧光二氧化硅纳米颗粒的荧光寿命曲线。

图5为稀土荧光二氧化硅纳米颗粒的反应时间对荧光性能影响柱状示意图。

图6为稀土荧光二氧化硅纳米颗粒的反应温度对荧光性能影响柱状示意图，其中横坐标上标明的两个反应温度分别是步骤(2)和(4)的反应温度。

图7为稀土荧光二氧化硅纳米颗粒的微波功率对荧光性能影响柱状示意图。

图8为稀土荧光二氧化硅纳米颗粒的APTMs与BHHCT不同摩尔比对荧光性能影响柱状示意图。

具体实施方法

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的具体实施方式进行详细描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明并不局限于这些实施例中提到的材料、反应条件或参数，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

所用仪器和操作条件：

透射电镜为日本电子株式会社JEM-2000EX透射电镜；能谱图使用日本日立S-4800场发射扫描电子显微镜进行测定；荧光检测仪为日本日立F-4500FL Spectrophotometer荧光分光光度计，检测条件：扫描时间：20ms，激发波长：343.0nm，发射波长：610.0nm，延迟时间：1s，激发单元狭缝：5.0nm，发射单元狭缝：2.5nm；微波催化合成/萃取仪：北京祥鹄科技发展有限公司。

实施例1：利用微波加热技术制备Eu³⁺-BHHCT@SiO₂荧光稀土二氧化硅纳米颗粒，不同微波反应时间对荧光性能影响的研究试验

(1)二氧化硅纳米颗粒的制备：取环己烷6mL、Tx-100 2.13mL、正辛醇1.87mL和0.6mL超纯水加入锥形瓶中，磁力搅拌，待搅拌均匀后，依次加入100μL TEOS和60μL氨水，室温搅拌24h，得到SiO₂纳米微乳液。。

(2)二氧化硅纳米颗粒表面氨基化：取3μL 3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTMs)加入到(1)中得到的SiO₂纳米微乳液中，微波加热，微波功率700W，温度70℃，反应时间考察10min，20min，30min，40min。

(3)BHHCT-Eu³⁺荧光稀土络合物的合成：将5mg 4,4'-二(1",1",1",2",2",3",3"-七氟-4",6"-己二酮-6”-基)-氯磺酰-邻-三联苯(BHHCT)溶于700μL无水乙醇，加入 4.84μLEu³⁺(0.64mol/L)，制得荧光稀土络合物。

(4)BHHCT-Eu³⁺修饰的二氧化硅荧光纳米颗粒的制备：将步骤(3)中得到荧光络合物加入到(2)中微乳液体系，微波加热，微波功率700W，温度59℃，反应时间考察10min，20min，30min，40min。加入5mL丙酮，混匀，离心，再用乙醇/水(v：v，1:1)洗涤颗粒3次，最后用无水乙醇洗涤颗粒1次，离心，烘干，即得产物荧光稀土二氧化硅纳米颗粒。

所制备的荧光纳米颗粒的荧光强度柱状示意图如图5所示，随着反应时间的延长，荧光发射强度呈现先显著增强后减弱的趋势，最佳反应时间为20min时，达到最高。

实施例2：利用微波加热技术制备Eu³⁺-BHHCT@SiO₂荧光稀土二氧化硅纳米颗粒，不同微波反应温度对荧光性能影响的研究试验

(1)二氧化硅纳米颗粒的制备：同实施例1。

(2)二氧化硅纳米颗粒表面氨基化：取3μL APTMs加入到(1)中得到的SiO₂纳米微乳液中，微波加热，微波功率700W，考察温度70℃和60℃，反应时间20min。

(3)BHHCT-Eu³⁺荧光稀土络合物的合成：同实施例1。

(4)BHHCT-Eu³⁺修饰的二氧化硅荧光纳米颗粒的制备：将步骤(3)中得到荧光络合物加入到(2)中微乳液体系，微波加热，微波功率700W，温度59℃和50℃，反应时间20min。加入5mL丙酮，混匀，离心，再用乙醇/水(v：v，1:1)洗涤颗粒3次，最后用无水乙醇洗涤颗粒1次，离心，烘干，即得产物荧光稀土二氧化硅纳米颗粒。

所制备的稀土荧光二氧化硅纳米颗粒的荧光强度柱状示意图如图6所示，70℃(步骤(2)中的温度)，59℃(步骤(4)中的温度)温度下合成的稀土荧光纳米颗粒的发光强度最高，然后依次是60℃(步骤(2)中的温度)，59℃(步骤(4)中的温度)；70℃(步骤(2)中的温度)，50℃(步骤(4)中的温度)；60℃(步骤(2)中的温度)，50℃(步骤(4)中的温度)。

实施例3：利用微波加热技术制备Eu³⁺-BHHCT@SiO₂荧光稀土二氧化硅纳米颗粒，不同微波功率对荧光性能影响的研究试验

(1)二氧化硅纳米颗粒的制备：同实施例1。

(2)二氧化硅纳米颗粒表面氨基化：取3μL APTMs加入到(1)中得到的SiO₂纳米微乳液中，微波加热，微波功率考察600W，700W，800W，900W和1000W，考察温度70℃，反应时间20min。

(3)BHHCT-Eu³⁺荧光稀土络合物的合成：同实施例1。

(4)BHHCT-Eu³⁺修饰的二氧化硅荧光纳米颗粒的制备：将步骤(3)中得到荧光络合物加入到(2)中微乳液体系，微波加热，微波功率考察600W，700W，800W，900W和1000W，温度59℃，反应时间20min。加入5mL丙酮，混匀，离心，再用乙醇/水(v：v，1:1)洗涤颗粒3次，最后用无水乙醇洗涤颗粒1次，离心，烘干，即得产物荧光稀土二氧化硅纳米颗粒。

所制备的荧光纳米颗粒的荧光强度柱状示意图如图7所示，稀土荧光纳米颗粒的发光强度随着微波功率的增加呈现先增强后减弱的趋势，在微波功率达到700W时发光强度最高。

实施例4：利用微波加热技术制备Eu³⁺-BHHCT@SiO₂荧光稀土二氧化硅纳米颗粒，不同APTMs与BHHCT摩尔比对荧光性能影响的研究试验

(1)二氧化硅纳米颗粒的制备：同实施例1。

(2)二氧化硅纳米颗粒表面氨基化：同实施例1。

(3)BHHCT-Eu³⁺荧光稀土络合物的合成：BHHCT：Eu³⁺摩尔比保持2:1不变，改变BHHCT的质量，使得APTMs与BHHCT摩尔比2.5:1，5:1，10:1，15:1，20:1，制得荧光稀土络合物。

(4)BHHCT-Eu³⁺修饰的二氧化硅荧光纳米颗粒的制备：同实施例1。

所制备的荧光纳米颗粒的荧光强度柱状示意图如图8所示，随着APTMs与BHHCT的摩尔比的减少，即荧光稀土络合物量的增加，合成的稀土荧光纳米颗粒的荧光强度逐渐增强。在2.5：1时，荧光强度达到最强。

根据上面的实施例1-4，确定微波的最佳反应条件为：微波功率700W，温度70℃、59℃，反应时间20min，APTMs与BHHCT摩尔比为2.5:1。

实施例5：利用微波加热技术制备Eu³⁺-BHHCT@SiO₂荧光稀土二氧化硅纳米颗粒

该实施例描述了在油包水微乳体系中制备裸二氧化硅纳米颗粒，再采用微波加热技术，对裸二氧化硅进行表面氨基化修饰，再进一步将稀土络合物BHHCT-Eu³⁺化学键合到氨基化硅球表面，制得共价式稀土荧光二氧化硅纳米颗粒的过程。

(1)二氧化硅纳米颗粒的制备：取环己烷6mL、Tx-100 2.13mL、正辛醇1.87mL和0.6mL超纯水加入锥形瓶中，磁力搅拌，待搅拌均匀后，依次加入100μL TEOS和60μL氨水，室温搅拌24h，得到SiO₂纳米微乳液。

(2)二氧化硅纳米颗粒表面氨基化：取3μL APTMs加入到(1)中得到的SiO₂纳米微乳液中，微波加热，微波功率700W，温度70℃，反应时间 20min。

(3)BHHCT-Eu³⁺荧光稀土络合物的合成：将5mg BHHCT溶于700μL无水乙醇，加入4.84μL Eu³⁺(0.64mol/L)，制得荧光稀土络合物。

(4)BHHCT-Eu³⁺修饰的荧光二氧化硅纳米颗粒的制备：将步骤(3)中得到的荧光稀土络合物加入到(2)中的微乳液体系，微波加热，微波功率700W，温度59℃，反应时间20min。加入5mL丙酮，混匀，离心，再用乙醇/水(v：v，1:1)洗涤颗粒3次，最后用无水乙醇洗涤颗粒1次，离心，烘干，即得产物荧光稀土二氧化硅纳米颗粒。所制备的荧光稀土二氧化硅纳米颗粒的透射电镜、能谱、荧光光谱图见图1-3。

图1为二氧化硅纳米颗粒的透射电镜照片及粒径分布图。图1a为未修饰荧光稀土络合物的二氧化硅纳米颗粒，颗粒表面平整，分散性好，均一，图1c对应其粒径分布图，平均粒径为31.31nm；图1b为本发明实施例5所制备的荧光稀土二氧化硅纳米颗粒，颗粒表面有黑色斑点，即为荧光稀土络合物，说明荧光稀土络合物已被成功键合到颗粒的表面，图1d为对应其粒径分布图，平均粒径为36.96nm。

图2为二氧化硅纳米颗粒的能谱图。在图2b中，显示有少量Eu元素，说明BHHCT-Eu³⁺成功共价连接到SiO₂纳米颗粒，合成出BHHCT-Eu³⁺@SiO₂荧光纳米颗粒。

图3为荧光稀土二氧化硅纳米颗粒的荧光光谱图。在图3中，横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度。通过将制得的荧光稀土二氧化硅纳米颗粒悬浮于乙醇中，用FL 4500荧光分光光度计扫描获得荧光光谱图；在图3a中，激发波长为610nm，发射波长为343nm，该纳米颗粒具有较高的荧光强度，能满足荧光检测要求。

图4为荧光寿命谱图。为考察合成的荧光纳米颗粒在荧光寿命方面的性能，对游离的BHHCT-Eu³⁺和BHHCT-Eu³⁺修饰的SiO₂纳米颗粒进行荧光寿命测定，如图4所示。游离的BHHCT-Eu³⁺的荧光寿命为440μs(图4b)，而荧光纳米颗粒的荧光寿命为600μs(4a)。荧光寿命长，可能发生了荧光增强作用，为荧光纳米颗粒作为标记探针在时间分辨免疫分析和免疫层析方面的应用奠定基础。

实施例6：利用传统恒温机械搅拌方法制备Eu³⁺-BHHCT@SiO₂荧光稀土二氧化硅纳米颗粒

该实施例描述了在油包水微乳体系中制备裸二氧化硅纳米颗粒，水浴恒温机械搅拌，对裸二氧化硅进行表面氨基化修饰，再进一步将稀土络合物BHHCT-Eu³⁺化学键合到氨基化硅球表面，制得共价式稀土荧光二氧化硅纳米颗粒的过程。

(1)二氧化硅纳米粒子的制备：同实施例5。

(2)二氧化硅纳米粒子表面氨基化：取3μL APTMs加入到(1)中得到的SiO₂纳米微乳液中，恒温水浴，温度70℃，机械搅拌，反应时间 20min。

(3)BHHCT-Eu³⁺荧光稀土络合物的合成：同实施例5。

(4)BHHCT-Eu³⁺修饰的二氧化硅荧光纳米粒子的制备：将步骤(3)中得到的荧光稀土络合物加入到(2)中的微乳液体系，恒温水浴，温度59℃，机械搅拌，反应时间20min。加入5mL丙酮，混匀，离心，再用乙醇/水(v：v，1:1)洗涤颗粒3次，最后用无水乙醇洗涤颗粒1次，离心，烘干，即得产物荧光稀土二氧化硅纳米颗粒。所制备的荧光稀土二氧化硅纳米颗粒的荧光光谱图见图3b。

从图3中可以看出，利用传统恒温机械搅拌方法制备的纳米粒子发射光谱强度为1305(见图3b)，微波法合成的纳米粒子发射光谱强度为1775(见图3a)，提高了36％，且两种方法合成的荧光纳米粒子的光谱图并未出现显著改变；结果表明，微波加热对BHHCT-Eu³⁺修饰的二氧化硅荧光纳米粒子的合成起到催化作用，同时还增加了荧光强度。

实施例7：其他方法制备的Eu³⁺-BHHCT@SiO₂荧光稀土二氧化硅纳米颗粒(对比实施例)

该实施例按照专利CN102504808A中所述的制备稀土荧光纳米颗粒的方法进行。

(1)二氧化硅纳米颗粒的制备：搅拌状态下依次加入6mL环己烷、2mL正已醇、2mLTriton X-100，0.6mL超纯水，从而形成油包水微乳体系。待溶液混匀后，依次加入60μL氨水(25％～28％)和100μL TEOS，室温下反应24h。

(2)稀土离子配合物前驱体APTMs-BHHCT的制备：取7.2mg BHHCT溶于无水乙醇中，加入4.7μL APTMs，立即超声混匀，避光下反应0.5h。

(3)微乳中二氧化硅纳米颗粒表面稀土离子配合物BHHCT的修饰：将上述稀土离子配合物前驱体与20μL TEOS混匀后加入油包水微乳体系中，于搅拌下避光反应5h。

(4)Eu³⁺的螯合：在上述微乳体系中加入50μL Eu³⁺(0.64mol/L)，继续在避光下搅拌5h，Eu³⁺即螯合于二氧化硅纳米颗粒表面的BHHCT上而形成具有荧光的稀土络合物，最后经过50％的无水乙醇洗涤3～5遍，即得产物稀土荧光二氧化硅纳米颗粒。

实施例7所制备的稀土荧光二氧化硅纳米颗粒的荧光光谱图见图3c及荧光寿命谱图见图4c。

与实施例5所制备的稀土荧光二氧化硅纳米颗粒进行对比，如表1所示。在相同的稀土荧光二氧化硅纳米颗粒浓度下，实施例5的制备方法所制得的稀土荧光二氧化硅纳米颗粒的荧光强度略低，但仍能满足作为生物标记物的要求。但是本发明实施例5所制备的稀土荧光二氧化硅纳米颗粒的荧光寿命更长，且BHHCT、Eu³⁺用量明显减少，而且所获得的纳米颗粒产品质量明显增多，约3～4倍，从而获得了有效控制、节约成本的目的。

表1实施例5与实施例7所制备的稀土荧光纳米颗粒的荧光性能对比

实施例8：微乳液体系参数性能研究试验

该实施例描述了在油包水微乳体系中制备稀土荧光二氧化硅纳米颗粒，对微乳液体系不同参数设置对稀土荧光二氧化硅纳米颗粒的粒径大小及荧光寿命的影响进行研究试验的过程。

(1)二氧化硅纳米颗粒的制备：将水、油、表面活性剂、助表面活性剂混合，形成环己烷/Triton X-100/正辛醇/水，正己烷/Triton X-100/正辛醇/水，环己烷/AOT/正辛醇/水，环己烷/Triton X-100/正已醇/水，环己烷/Triton X-100/正庚醇/水微乳体系，磁力搅拌，待搅拌均匀后，依次加入100μL TEOS和60μL氨水，室温搅拌24h，得到SiO₂纳米微乳液。

(2)二氧化硅纳米颗粒表面氨基化：同实施例5。

(3)BHHCT-Eu³⁺荧光稀土络合物的合成：同实施例5。

(4)BHHCT-Eu³⁺修饰的二氧化硅荧光纳米颗粒的制备：同实施例5。

(5)将BHHCT-Eu³⁺修饰的二氧化硅荧光纳米颗粒进行粒径和荧光寿命的测定。

表2不同的油、表面活性剂、助表面活性剂对纳米颗粒粒径和荧光寿命的影响

已经提供了前述说明、具体实施方式和附图，并且其不意图限制所附权利要求的范围。本文中所示的实施方式中的许多变型对于本领域普通技术人员来说将是明晰的，并且仍然在本发明和它们的等同物的范围内。本领域普通技术人员应当理解在本发明的精神范围内和当前或未来的权利要求的范围内可以进行许多改变。

Claims (12)

1.一种稀土荧光二氧化硅纳米颗粒的制备方法，其包括以下步骤：

1)二氧化硅纳米颗粒的制备：将水、油、表面活性剂、助表面活性剂混合形成油包水(W/O)微乳液体系，再依次加入正硅酸酯和催化剂，制备出大小可控的二氧化硅纳米颗粒；

2)微波加热辅助二氧化硅纳米颗粒的表面功能化：微波加热，将带有功能性基团的硅烷试剂修饰到步骤1)所得的二氧化硅纳米表面，使二氧化硅纳米颗粒表面固定有用于化学键合的功能性基团；

3)荧光稀土络合物的制备：将稀土离子与稀土配体混合，反应，得到荧光稀土络合物；

4)荧光稀土络合物的固定化：微波加热，将荧光稀土络合物化学键合到步骤2)所得的表面带有功能性基团的二氧化硅纳米颗粒表面，形成具有荧光性能的二氧化硅稀土络合物，经丙酮封闭反应体系后，洗涤，即得产物稀土荧光二氧化硅纳米颗粒。

2.根据权利要求1的制备方法，其中在步骤1)中，所述正硅酸酯选自正硅酸四甲酯、正硅酸四乙酯、正硅酸四丙酯；所述油选自环己烷、正己烷、正戊烷、正己烷；所述水为超纯水；所述表面活性剂选自Triton X-100、二-乙基己基琥珀酸酯磺酸钠、壬基酚聚氧乙烯醚；所述助表面活性剂选自正辛醇、正庚醇、正己醇。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中在步骤1)中，所述表面活性剂和助表面活性剂的质量比w在1-2的范围内，优选w为1.2-1.6，最优选的质量比w＝1.5。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其中步骤1)中制备的二氧化硅纳米颗粒的直径在20-100nm范围内。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的制备方法，其中在步骤2)中，所述带有功能性基团的硅烷试剂选自：3-氨丙基三甲氧基硅烷、巯丙基三甲氧基硅烷或5,3-甘油酸丙烷三甲氧基硅烷。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的制备方法，其中在步骤2)和步骤4)中，微波加热条件为：反应温度70℃/59℃，反应时间20min，微波功率700W。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的制备方法，其中在步骤3)中，所述稀土配体为螯合特定稀土离子的有机化合物，选自β-二酮类化合物、邻菲罗啉类化合物、水杨酸类化合物、联吡啶类化合物，优选为4,4'-二(1",1",1",2",2",3",3"-七氟-4",6"-己二酮-6”-基)-氯磺酰-邻-三联苯；所述稀土离子选自Eu³⁺、Tb³⁺、Sm³⁺和Dy³⁺。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其中所述稀土配体与稀土离子的摩尔比为1:2至3:1，优选为2：1。

9.根据权利要求7或8的制备方法，其中所述稀土配体是带有活性基团的稀土配体，其包括分子上带有磺酰氨基、琥珀酰亚胺基或马来酰亚胺基基团的稀土配体，在微波作用下，直接与二氧化硅表面功能基团键合。

10.根据权利要求7或8的制备方法，其中所述稀土配体是带有没有活性但可被活化的功能基团的稀土配体，其包括分子上带有氨基、巯基或羧基基团的稀土配体，在微波作用下，通过相应的交联试剂与二氧化硅表面功能基团键合。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的制备方法，其中所述带有功能性基团的硅烷试剂与稀土配体的摩尔比为2.5:1至10:1，优选摩尔比为2.5:1。

12.根据权利要求1-11中任一项制备方法所制备的稀土荧光二氧化硅纳米颗粒。