CN105969338B - 一种SiO2–DNA纳米材料及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于纳米荧光探针领域,具体涉及一种SiO2–DNA纳米材料及其制备方法和应用。所述SiO2–DNA纳米材料中DNA单链包覆在氨基化SiO2纳米球表面,所述氨基化SiO2纳米球的粒径为60~200nm,所述DNA的序列为5'‑ATGCTATAATATTAAT‑3'。其具有良好的生物相容性、绿色无污染、发光强度高且不容易发生荧光猝灭等特点,从而可应用于生物体系,对荧光信号进行测定。
Description
技术领域
本发明属于纳米荧光探针领域,具体涉及一种SiO2–DNA纳米材料及其制备方法和应用。
背景技术
荧光检测技术具有高灵敏度、低噪音以及较宽的动态范围等众多优点,但是,以前的荧光探针往往存在着某些缺点,比如说它们往往随着浓度的不同表现出微小的stokes位移导致其荧光强度为非线性变化,或者在聚集时发生聚集荧光猝灭现象,影响其检测过程,这些缺点的存在大大缩少了普通荧光探针的应用范围,聚集诱导发光(AIE)现象的发现为解决这一问题提供了一种途径。首先,具有AIE性能的分子其在聚集状态不会发生荧光猝灭;其次,大部分AIE分子的荧光光谱并不会随着其浓度的变化而发生位移;再次,AIE荧光探针采用的是一种turn-on的机理,其敏感性相对较高。荧光纳米材料在新功能材料研发、生物医药、环境保护与污染治理等方向都有显著地应用前景。
另外,SiO2-AIE具有良好的生物相容性,优异的化学惰性,稳定的光学性质,发光强度高。在生物医学工程、电子学、催化工程等方面一直被广泛应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术的缺陷,提供一种新型SiO2–DNA纳米材料及其制备方法和应用。
本发明采用的技术方案如下:
一种SiO2–DNA纳米材料,DNA单链包覆在氨基化SiO2纳米球表面,所述氨基化SiO2纳米球的粒径为60~200nm,所述DNA的序列为5'-ATGCTATAATATTAAT-3'。
一种所述SiO2–DNA纳米材料的制备方法,包括如下步骤:
(1)取正硅酸乙酯TEOS加入氨水和无水乙醇的混合体系中,室温搅拌12~48小时,再加入氨丙基三乙氧基硅烷APTES,剧烈搅拌10~20小时,离心、洗涤得氨基化二氧化硅纳米球;
(2)将氨基化二氧化硅纳米球分散,加入ss-DNA,经孵育后加入缓冲溶液进行离心处理,所得上清液去除分散的ss-DNA后,再加入缓冲溶液重新分散即可。
所述步骤(1)中TEOS与氨水的体积比为1~2:1,TEOS与无水乙醇的体积比为0.05~ 0.2:1,TEOS与APTES的体积比为1:20~200。
所述步骤(1)中洗涤为采用乙醇与去离子水洗涤多次。
所述步骤(2)中氨基化二氧化硅纳米球的浓度为0.2~0.5mg/mL,ss-DNA的浓度为50~ 150nM,氨基化二氧化硅纳米球与ss-DNA的体积比为1.5~2.5:1。
所述步骤(2)中孵育温度为10~50℃,时间为10~60分钟,离心时间为5~30分钟。
一种所述SiO2–DNA纳米材料在荧光生物传感器中的应用,将其用于检测前列腺抗原 PSA。先在含SiO2–DNA纳米材料的缓冲溶液中加入一系列浓度的PSA进行培养,再加入AIE分子进行培育,然后放入荧光仪中进行检测。该荧光生物传感器是利用PSA与DNA链进行特异性结合,使得SiO2球表面暴露出正电荷,带负电荷的AIE分子聚集到SiO2球表面,实现聚集诱导发光,对体系的荧光信号进行测定。
其中,合成AIE分子的具体过程参见文献:H.Tong,Y.Hong,Y.Q.Dong,M.H.1ussler,Z. Li,J.W.Y.Lam,Y.Dong,H.H.-Y.Sung,I.D.Williams,and B.Z.Tang,J.Phys.Chem.B.,2007, 111,11817-11823.
本发明所述纳米材料具有良好的生物相容性、绿色无污染、发光强度高且不容易发生荧光猝灭等特点,从而可作为荧光探针应用于生物体系,由于DNA链包覆在SiO2纳米球表层,前列腺抗原与DNA链进行碱基互补配对,可实现荧光探针定量检测前列腺抗原。
本发明基于聚集诱导发光原理设计了一种新型荧光生物传感器用于灵敏检测PSA。其中, SiO2球带正电荷,DNA单链带负电荷,由于正负电荷相互吸引DNA链包覆到SiO2球表面。当体系中不存在PSA时,由于DNA的包覆作用,使得SiO2和AIE分子不能相互靠近,从而不能实现聚集诱导发光。当加入PSA时,PSA表现出抗原的活性。PSA与DNA特定位点进行特异性结合,使得硅球表面暴露的正电荷,从而聚集上去的AIE分子,对SiO2-AIE的荧光信号变化进行测定。随着PSA加入量的增加,聚集到硅球表面的AIE分子也随之增加。不同浓度PSA所对应的荧光信号也会随之发生变化。
附图说明
图1是本发明实施例的SiO2–DNA纳米材料制备及应用过程的示意图;
图2是本发明实施例SiO2的透射电镜图;
图3是本发明实施例制备的AIE分子的质谱图;
图4是本发明实施例缓冲溶液(a),SiO2(b),SiO2-DNA(c),SiO2-AIE(d)的紫外光谱图;
图5是本发明实施例SiO2-AIE(a),AIE-DNA(b),SiO2-DNA-AIE(c),AIE(d)的荧光曲线;
图6是本发明实施例制备的PSA传感器的荧光曲线;
图7是本发明实施例制备的PSA传感器的线性结论;
图8是本发明实施例制备的PSA传感器的选择性对照。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
一种SiO2–DNA纳米材料,DNA单链包覆在氨基化SiO2纳米球表面,所述氨基化SiO2纳米球的粒径为60~200nm,所述DNA的序列为5'-ATGCTATAATATTAAT-3'。
以下通过具体的实施例来说明上述SiO2–DNA纳米材料的制备方法和应用,请参阅图1。
实施例1:
将4mL TEOS加入3.3mL氨水和47mL无水乙醇的混合体系中,室温搅拌24小时,再加入300mL APTES,剧烈搅拌至少10小时,离心并用乙醇与去离子水洗涤多次,获得所述氨基化80nm SiO2纳米球,图2是其透射电镜图。
实施例2:
AIE分子合成第一步:四苯乙烯衍生物(TPE)1合成,在斜三颈烧瓶中,依次加入对甲氧基二苯甲酮(1.06g,5.0mmol),1.34倍当量的TiCl3/AlCl3(5.81g,6.7mmol),25倍当量的锌粉(8.01g,122.0mmol),100ml THF(易干燥除水),加热回流20h。将反应混合液冷却至室温然后过滤。将滤液蒸干,将粗产物经柱层析分离纯化(洗脱液:正己烷/二氯甲烷为3:1),收率91%。
AIE分子合成第二步:四苯乙烯衍生物(TPE)2合成,向100ml斜三颈烧瓶中加入1.40 g(3.56mmol)产物1和20ml二氯甲烷,然后将烧瓶放置在丙酮-液氮的容器中,容器内温度可达-78℃。在搅拌下缓慢加入3.59g(14.3mmol)三溴化硼与10ml二氯甲烷的混合液。反应体系在室温条件下搅拌过夜。反应产物用20ml水震荡水解。将有机相分离,用旋转蒸发仪浓缩,再用四氢呋喃和甲醇重结晶,得白色固体2,产量1.26g,收率97%。
AIE分子合成第三步:AIE分子合成,在氮气保护下,向100ml圆底烧瓶中加入0.5g(1.37 mmol)产物2和20ml无水乙醇,将混合物搅拌直至所有固体消失。向液体中逐滴加入20ml 无水乙醇和乙醇钠(0.20g,3.0mmol)的混合液并搅拌1h,使得溶液的颜色由无色变为橘红色。向溶液中加入20ml无水乙醇和0.35g(2.88mmol)1,3-丙磺酸内酯的混合液,搅拌反应 12h,期间有白色固体产物从溶液中析出。反应结束后,过滤,用无水乙醇和丙酮洗涤两次,得白色固体,产量0.55g,收率61%。
实施例3:首先在20uL 0.4mg/mL的氨基化二氧化硅球溶液中加入9uL ss-DNA分散在溶液体系中的浓度为130nM,在37℃下孵育30分钟后加入缓冲溶液12000rpm转速下离心20 分钟,所得上清液去除分散的ss-DNA后,再加入缓冲溶液重新分散待用。然后加入一系列浓度的PSA(0-180ng/mL)在25℃下培养30分钟,再加入AIE分子(最终浓度为5.5ug/mL),最后加入缓冲溶液使总体积达到100uL,在25℃下培育15分钟,放入荧光仪中进行检测。
对比实施例1:
将5mL TEOS加入5mL氨水和100mL无水乙醇的混合体系中,室温搅拌24小时,再加入300mL APTES,剧烈搅拌至少10小时,离心并用乙醇与去离子水洗涤多次。
对比实施例3:
首先在15uL 0.5mg/mL的氨基化二氧化硅球中加入15uL 100nM的ss-DNA,在37℃下孵育30分钟后加入缓冲溶液12000rpm转速下离心20分钟,所得上清液去除分散的ss-DNA后,再加入缓冲溶液重新分散待用。然后加入一系列浓度的PSA(0-180ng/mL)在25℃下培养30 分钟,再加入实施例2中得到的AIE分子(最终浓度为2.5ug/mL),最后加入缓冲溶液使总体积达到100uL,在25℃下培育15分钟,放入荧光仪中进行检测。与实施例3相比检测效果略差一些,但总体趋势有荧光逐渐增强的效果。
图1是将SiO2球氨基化,然后加入DNA单链,DNA将球氨基化SiO2球包覆起来,再加入PSA抗原,PSA抗原与DNA链进行特异性结合,使得SiO2球表面暴露出正电荷,带负电荷的AIE分子聚集到SiO2球表面,实现聚集诱导发光,对体系的荧光信号进行测定。
图2为对氨基化二氧化硅球的大小和形态通进行的表征,由图清晰可见,本实验合成的氨基化二氧化硅球呈现较规则的球型,平均尺寸约为80nm,且分散较均匀。因此,可以证明本实验合成的材料属于单分散的氨基化二氧化硅球。
图3是AIE分子合成及表征示意图MS(TOF)m/e:631.1[(M+2H)+-Na,calcd 631.1],609.2[(M+3H)+-2Na,calcd 609.1]。
图4是本发明为了验证氨基化二氧化硅球是否已经包覆上ss-DNA,对其进行了紫外检测, a是pH缓冲溶液,b是SiO2,c是SiO2包覆上DNA链后在260nm处突出一吸收峰,说明ss-DNA 已经成功包覆在二氧化硅球表面,d是SiO2球成功吸附上AIE分子。
如图5所示,设计了如下四组实验:d是AIE、c是SiO2+DNA+AIE、b是AIE+DNA、a 是SiO2+AIE,分别进行测定荧光检测,AIE、SiO2+DNA+AIE、AIE+DNA有较弱的荧光信号,这是因为在这四组实验当中都含有AIE分子,AIE分子由于其庞大的共轭结构发射出较弱的荧光信号。而SiO2+AIE显示出了非常强烈的荧光信号,这是因为氨基化的二氧化硅球表面带有正电荷,AIE分子带有负电荷,两相结合发射出强烈的荧光信号。
图6是本发明在最优条件下,加入不同浓度的PSA进行检测。当体系中不含有PSA时,该体系的背景信号较小,随着PSA的加入,荧光信号与PSA的浓度呈现较好的线性关系(图 7)。线性范围0-60ng/mL,检测下限0.2ng/mL。
图8以牛血清蛋白(BSA)、人类免疫球蛋白(IgG)、上皮性卵巢癌糖蛋白(CA125)、甲胎蛋白(AFP)作为干扰物,测试该传感器对PSA的选择性,这表明其他蛋白质对该生物传感器的测定结果没有影响,可用于实际样品的检测。
为了评估荧光传感器的临床应用潜能,在人血清中对PSA进行了检测,不同浓度的PSA 加入到人血清样本中,运用所述荧光传感器检测,该传感器测得的样品回收率为91.7%~ 99.44%,结果令人满意。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种SiO2–DNA纳米材料,其特征在于,DNA单链包覆在氨基化SiO2纳米球表面,所述氨基化SiO2纳米球的粒径为60~200nm,所述DNA的序列为5'-ATGCTATAATATTAAT-3'。
2.一种如权利要求1所述SiO2–DNA纳米材料的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)取正硅酸乙酯TEOS加入氨水和无水乙醇的混合体系中,室温搅拌12~48小时,再加入氨丙基三乙氧基硅烷APTES,剧烈搅拌10~20小时,离心、洗涤得氨基化二氧化硅纳米球;
(2)将氨基化二氧化硅纳米球分散,加入ss-DNA,经孵育后加入缓冲溶液进行离心处理,所得上清液去除分散的ss-DNA后,再加入缓冲溶液重新分散即可。
3.根据权利要求2所述SiO2–DNA纳米材料的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中TEOS与氨水的体积比为1~2:1,TEOS与无水乙醇的体积比为0.05~0.2:1,TEOS与APTES的体积比为1:20~200。
4.根据权利要求2或3所述SiO2–DNA纳米材料的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中洗涤为采用乙醇与去离子水洗涤多次。
5.根据权利要求2所述SiO2–DNA纳米材料的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中氨基化二氧化硅纳米球的浓度为0.2~0.5mg/mL,ss-DNA的浓度为50~150nM,氨基化二氧化硅纳米球与ss-DNA的体积比为1.5~2.5:1。
6.根据权利要求2或5所述SiO2–DNA纳米材料的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中孵育温度为10~50℃,时间为10~60分钟,离心时间为5~30分钟。
7.一种如权利要求1所述SiO2–DNA纳米材料在荧光生物传感器中的应用,其特征在于,将其用于检测前列腺抗原PSA:
先在含SiO2–DNA纳米材料的缓冲溶液中加入一系列浓度的PSA进行培养,再加入四苯乙烯衍生物TPE分子进行培育,然后放入荧光仪中进行检测。
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