CN102482313B - 乳清成分的分离和纯化 - Google Patents

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Abstract

一种用于从乳清，尤其是乳酪乳清分离和/或纯化所需成分，尤其是3′唾液酸乳糖的方法，所述方法包括以下步骤：任选地对乳清进行超滤以提供蛋白质浓缩物和乳清渗透物；将乳清或乳清渗透物与至少一个系列的离子交换树脂接触以将乳清渗透物脱矿质，所述系列包括第一弱酸阳离子交换树脂、第一弱碱阴离子交换树脂、第二强酸阳离子交换树脂、第二弱碱阴离子交换树脂；使该脱矿质渗透物与两个最终离子交换树脂接触，所述最终离子交换树脂包括强酸阳离子交换树脂和最终弱碱阴离子交换树脂，其中所述所需成分，如3′唾液酸乳糖，被吸在最终阴离子交换树脂上；以及将所述所需成分从所述最终阴离子交换树脂洗脱。

Description

乳清成分的分离和纯化
本发明涉及用于乳清成分的分离和纯化的方法，具体地但是非排他地从乳清渗透物分离乳清的成分，尤其是唾液酸乳糖(sialyllactose)，特别是3′唾液酸乳糖(或者称作3′-SL或3-SL或3精华)的分离。
乳酪生产通常包括：或者通过酶对乳的作用或者通过使用合适的酸降低乳的pH，使得乳蛋白(酪蛋白)凝聚，以将乳固体物和乳脂捕获在凝乳基体中。之后将该凝乳基体固化以榨出液体级分，即乳酪乳清。乳酪乳清含有未被约束在凝乳基体中的乳固体物，尤其是乳的糖类和可溶性蛋白质。乳清占乳酪制造过程中使用的乳的总体积的80-90％，并且含有超过一半的来自原始全乳的固体物，包括20％的蛋白质和大部分的乳糖并且具有非常高的有机质含量。
由于其高有机质含量，乳清的处理对于乳品加工业经常是一个问题。现在可以从乳清回收可溶性蛋白质以及来自乳糖的有价值物，并且明显需要的是回收尽可能多的有机质内含物以降低流出流的有机负荷量并从乳清获得更高的利润。为开发对于该物品的使用，奶酪加工公司正在进行大量的努力。
在商业中对于乳清进行超滤(UF)以提供蛋白质浓缩物和乳清渗透物已经变得普遍。已经发现蛋白质浓缩物在动物饲料、肥料、发酵以及作为食品填料中的应用。然而，富乳糖渗透物通常保持为废产物，这归因于不能满意地将渗透物的单独成分分离并纯化，以使得它们适合于进一步使用。
富乳糖渗透物包括多种低聚糖、如3′-唾液酸乳糖。已经发现它在例如药品和婴儿食品应用中具有有价值的应用，但是必需以足够纯的形式提供该成分。
US6323008(Pelletier)提供了用于由乳品源和奶酪加工废物流制备唾液低聚糖的方法，所述方法通过使用α(2-3)反式-唾液酸酶的催化活性以利用在奶酪加工废料中天然存在的高浓度的乳糖和唾液酸糖苷，以推动α(2-3)唾液酸-乳糖的酶催化合成。将通过该酶作用制备的唾液酸乳糖通过使混合物通过阳离子交换树脂之后通过强阴离子交换树脂而纯化。唾液酸乳糖被吸在阴离子交换树脂上并且使用适当的溶液将其洗脱。该方法确实纯化了唾液酸乳糖但是受到以下缺点的困扰：阳离子交换树脂仅移除一些阳离子并有剩余的正电荷物种与唾液酸乳糖形成盐。这之后需要强阴离子交换树脂以将盐分开并且使得唾液酸乳糖能够结合至树脂。然而，实际上结合至柱的唾液酸乳糖的量将依赖于废料中存在的其它阴离子相对于唾液酸乳糖的量，并且这将从而需要将富含其它阴离子的洗脱物的净化。
本发明的目标是提供用于乳清成分的分离和纯化的方法，尤其是3′-唾液酸乳糖，特别地但非排他地从乳清渗透物分离乳清成分，所述方法克服或至少减轻了上述缺点。
因此，本发明的第一方面提供一种用于将乳清的所需成分，如3′-唾液酸乳糖，从乳清分离和/或纯化的方法，所述方法包括以下步骤：
使乳清与至少一个系列的离子交换树脂接触以将乳清脱矿质，所述系列包括第一阳离子交换树脂、第一阴离子交换树脂、第二阳离子交换树脂和第二阴离子交换树脂；
使该脱矿质乳清与两个另外的或最终离子交换树脂接触，所述两个另外的或最终离子交换树脂包括强酸阳离子和最终弱碱阴离子交换树脂，其中将所述所需成分吸在所述阴离子交换树脂上；以及
使用合适的洗脱剂将所需成分从最终阴离子交换树脂洗脱。
在本发明的优选实施方案中，在使原料乳清与离子交换树脂接触之前对其进行超滤，所述超滤步骤提供蛋白质浓缩物和乳清渗透物，其中所述乳清渗透物与离子交换树脂接触。然而，原料乳清或脱矿质乳清可以被用于该方法。
所需成分优选为3′-唾液酸乳糖。其他成分可以包括渗透物中存在的6′-唾液酸乳糖和/或其它阴离子性低聚糖。
优选地，第一阳离子交换树脂是弱酸阳离子交换树脂。优选的是第二阳离子交换树脂为强酸阳离子交换树脂。如果第二阳离子交换树脂为弱酸阳离子交换树脂，应该将进入该树脂的物质的pH保持在高于pH5，优选高于pH5.5。
优选地，第一和第二碱阴离子(交换树脂)包括弱碱阴离子(交换树脂)。
本发明的第二方面针对根据本发明的第一方面的方法从乳清分离和纯化的所需成分，尤其是3′-唾液酸乳糖。
可以使超滤(UF)乳清渗透物直接通过离子交换树脂，或者可以使用如渗析、电渗析、纳米过滤或者以上的任意组合的技术对其进行完全或者更优选部分预脱矿质步骤以最优化成本效率和/或技术效率。
在本发明的一个实施方案中，在将浓缩物与如在本发明的第一方面中所定义的树脂系列接触之前，使用纳米过滤将UF乳清渗透物浓缩。在该实施方案中，优选的是使浓缩物与两个系列的树脂接触，即弱酸阳离子交换树脂、碱阴离子交换树脂、强酸阳离子交换树脂、碱阴离子交换树脂的第一系列，之后是弱酸阳离子交换树脂、碱阴离子交换树脂、强酸阳离子交换树脂、碱阴离子交换树脂的第二系列。碱阴离子交换树脂可以是强的或弱的，但是优选为弱的以最小化损失并最优化洗脱。
可以通过电渗析对渗透物进行部分脱矿质。这之后通过一系列的阳离子和阴离子交换树脂以使得完全净化并且之后3-SL结合至最终阴离子交换树脂上。
在本发明的一个实施方案中，在与根据本发明的第一方面的树脂系列接触之前，可以通过离子渗透色谱(或离子排斥色谱)提高浓缩UF乳清渗透物中的相对3′-SL含量。优选地，在升高的温度下进行离子渗透色谱，所述升高的温度为优选至少50℃，优选50℃至80℃。洗脱物包含：含有带电荷的分子(包括3′-唾液酸乳糖)的第一级分，之后是含有不带电荷的分子如乳糖的第二级分。之后使含有3′-唾液酸乳糖的第一级分与树脂系列接触，使3′-唾液酸乳糖被吸在阴离子交换树脂上。
色谱分离树脂优选为由Rohm&Haas提供的CR1310K。然而存在其他合适的树脂。其实例包括，但是不限于，CR1310Ca&Na或CR1320Ca、K或Na，陶氏(Dow)的DOWEXMonosphere99Ca/320或者三菱(Mitsubishi)的DiaionUBK530或者Purolite的PCR145K。
使用碱、盐、缓冲溶液或酸的适当稀释溶液将3′-唾液酸乳糖从阴离子交换树脂洗脱。所使用的碱包括氢氧化铵、NaOH、KOH；盐溶液包括NaCl、KCl、氯化铵、乙酸铵、甲酸铵、碳酸铵等；并且酸包括稀HCl、乙酸、甲酸，和/或含有足以将3′-唾液酸乳糖从阴离子交换树脂洗脱的抗衡阴离子的缓冲溶液，或者以上各项的适当的混合物。然而，铵盐是优选的，因为它们倾向于挥发。
可以对使用合适的碱或盐从阴离子交换树脂洗脱的3′-唾液酸乳糖使用脱盐树脂如SephadexG25进行盐移除。例如，可以使用纳米过滤将洗脱产物浓缩至～20-30％固体物并且将所得到的物质在SephadexG25(或者市场上可得的其他这样的脱盐树脂)上层析。洗脱的第一物质为与一些较大分子在一起的3′-唾液酸乳糖，之后是较小的分子如NPN类和盐。如果要使用含有大离子如乙酸根、甲酸根等的溶液，这些分子通过SephadexG25或其等价树脂的移除略差。然而可以通过调整树脂床深度和流速提高纯度。在这种情况下，可以选择使用合适的阴离子交换树脂(强碱或弱碱阴离子交换树脂)移除杂质之后通过弱酸阳离子交换树脂将pH调节至中性。也可以将盐通过渗滤、纳米过滤、电渗析、渗析或其他方法移除。
可以将净化的洗脱物通过纳米过滤和/或蒸发进一步浓缩并且优选将其干燥以形成白色产物。
在本发明的方法中可以使用任何合适的强和弱阳离子和阴离子交换树脂。第一弱酸阳离子交换树脂为优选聚丙烯酸类弱酸阳离子交换树脂，优选在商品名IMACHP336下提供的聚丙烯酸类弱酸阳离子交换树脂。备选的聚丙烯酸类弱阳离子交换树脂包括由RohmandHaas提供的PWC11、由陶氏(Dow)提供的DOWEXMAC-3或者由三菱(Mitsubishi)提供的DiaionWK10和WK40。第一弱阴离子交换树脂优选为丙烯酸类弱碱阴离子交换树脂，优选在商品名FPA55下提供的丙烯酸类弱碱阴离子交换树脂。备选的丙烯酸类弱碱阴离子交换树脂包括由三菱(Mitsubishi)提供的DiaionWA10、WA20、WA21J和WA30，或者由Purolite提供的A847或PFA847。也可以使用苯乙烯弱碱阴离子交换树脂。也可以使用强碱阴离子交换树脂但是这可能导致用于后继的树脂清洗的再生剂的使用增加。
第二强酸阳离子交换树脂为优选苯乙烯-DVB强酸阳离子交换树脂，更优选在商品名HP1110下出售的苯乙烯-DVB强酸阳离子交换树脂。备选的强酸阳离子交换树脂包括由RohmandHaas提供的FPC23、由陶氏(Dow)提供的DOWEX88、DOWEX88MB、DOWEXMonosphere88，由三菱(Mitsubishi)提供的DiaionSK1B、SK104、SK110、SK112、SK116、PK208、PK212、PK216、PK220、PK228或HPK25，或者由Purolite提供的PFC100或PFC150。
第二弱碱阴离子交换树脂优选为苯乙烯-DVB弱碱阴离子交换树脂，更优选为在商品名FPA51下出售的弱碱阴离子交换树脂。备选的弱碱阴离子交换树脂包括由陶氏(Dow)提供的DOWEX66、DOWEXMonosphere66或DOWEXMonosphere77，或者由三菱(Mitsubishi)提供的DiaionWA10、WA20、WA21J和WA30。
可以将弱碱阴离子交换树脂用强阴离子交换树脂代替，虽然弱碱阴离子交换树脂是优选的。这样的树脂包括，但不限于，来自Rohm&Haas的FPA42、FPA90；来自Purolite的A600、A400E、A420和A850以及来自陶氏化学公司(DowChemicalCo.)的DowexA、Dowex1、Dowex22、DowexSAR。
在另外的方面，本发明还提供一种用于制备富集有乳清的所需成分的乳制品的方法，所述方法包括根据本发明的第一方面的方法制备乳清的所需成分。乳清的所需成分可以任选地为3′唾液酸乳糖，并且该方法可以任选地用于制备富集有3′唾液酸乳糖的乳制品。任选地，乳制品为奶制品，但是可以使用需要富集有乳清的所需成分的任何乳制品。可以通过使洗脱的所需成分与乳制品流接触制备富集有乳清的所需成分的乳制品。洗脱的所需成分和乳制品流可以各自独立地为液体或固体。任选地，洗脱的所需成分和乳制品流各自独立地为液体。任选地，用于制备乳制品的方法还包括浓缩乳制品的步骤。浓缩步骤可以包括纳米过滤、蒸发和干燥乳制品的任意一种，或其组合。
现在将更具体地描述本发明，附随的实施例仅是示例的方式，其中实施例1描述了使用本发明的方法将3′-唾液酸乳糖从UF乳清渗透物直接分离；实施例2描述了使用本发明的方法将3′-唾液酸乳糖从浓缩UF乳清渗透物分离，其中首先使用纳米过滤将UF乳清渗透物浓缩；并且实施例3至7描述了使用本发明的方法将唾液酸乳糖从浓缩UF乳清渗透物分离，其中将UF乳清渗透物首先使用纳米过滤浓缩，之后通过离子渗透色谱，并且参考附图进行描述，其中：
图1是说明包括在实施例1的方法中的步骤的流程图；
图2是说明包括在实施例2的方法中的步骤的流程图；并且
图3是说明包括在实施例3的方法中的步骤的流程图。
实施例1
在本发明中对于所有实施例第一步是超滤(UF)步骤，借此将乳酪乳清中大部分蛋白质移除。UF步骤可以包括乳清蛋白质浓缩物(WPC)35、60、80和85的生产。该过程的副产品是～4至7％固体物的乳清渗透物，所述固体物由以下各项成分组成：大约90至95％乳糖、1至5％蛋白质(NPN类和真蛋白质)、4至7％灰分和0.05至0.25％3′-唾液酸乳糖(3-SL)。在一年的某些时间，3-SL的比例可能显著地更高，高至固体物的0.5重量％。
在本实施例中，将UF渗透物直接与一系列树脂接触并且3-SL最终被吸在阴离子交换树脂上。附图的图1中概述了所述步骤。
将1,035升的～5％固体物和～60ppm3′-SL的UF乳清渗透物在200mm直径的柱中泵送通过，使其直接与串联的以下树脂接触：
·15升的IMACHP336(聚丙烯酸类弱酸阳离子交换树脂)；
·22升的FPA55(丙烯酸类弱碱阴离子交换树脂)；
·23升的HP1110(苯乙烯-DVB强酸阳离子交换树脂)；
·23升的FPA51(苯乙烯-DVB弱碱阴离子交换树脂)；
·17升HP1110(苯乙烯-DVB强酸阳离子交换树脂)；
·17升的FPA51(苯乙烯-DVB弱碱阴离子交换树脂)。
3-SL被吸在最后的阴离子交换树脂上，用28升的4.4％氢氧化铵之后用50升脱矿质水将其洗脱。洗脱物含有大约6至15重量％的3’-唾液酸乳糖。接下来将它与30升的IMACHP336(聚丙烯酸类弱酸阳离子交换树脂)接触之后通过23升的FPA51(苯乙烯-DVB弱碱阴离子交换树脂)以移除过量的氨，并将最终产物的pH调节到7至9.5。
所得到的产品含有大约占固体物12至50重量％的非常高纯度形式的3′-唾液酸乳糖。最终物中的灰分含量＜10％，其余是蛋白质。大约20至50％的蛋白质价为NPN。因而，在该实施例中通过以固定的流速泵送3-SL使渗透物直接接触通过串联的以下树脂：阳离子交换树脂-阴离子交换树脂-阳离子交换树脂-阴离子交换树脂-阳离子交换树脂-阴离子交换树脂。这使得能够移除不想要的和干扰分子，并且之后致使3-SL被特异性吸在最后的阴离子交换树脂柱上。具体地，以下顺序给出具有3-SL最大回收率的最佳结果：
·弱酸阳离子交换树脂(WAC)-弱碱阴离子交换树脂(WBA)-
强酸阳离子交换树脂(SAC)-弱碱阴离子交换树脂(WBA)-
强酸阳离子交换树脂(SAC)-弱碱阴离子交换树脂(WBA)。
3-SL与少量的蛋白质(真蛋白质+NPN类)和一些阴离子一起被吸在最后的阴离子柱上。之后使用氢氧化铵(也可以成功地使用氨、钾、钠、镁或钙的氯化物盐或其组合)各3-SL洗脱。
跨越多个床的压降可能会过大，可以在合适的位置使用断流水箱以收集处理过的渗透物，之后将所述渗透物泵送通过余下的柱。
之后将洗脱的3-SL在阳离子交换树脂之后是阴离子交换树脂上净化，以移除盐。可以备选地通过渗滤、NF、电渗析、渗析或其他方法移除盐。使用树脂技术的更多益处在于还移除了某些不想要的NPN。
所得到的物质具有7至42重量％3-SL的3-SL含量，可以通过NF和/或蒸发将其浓缩并且最终将其干燥以产生具有非常高浓度3-SL的白色产物。
3′-SL从渗透物吸附在最终的弱碱阴离子交换树脂上的吸附率接近于100％，并洗脱率为所有吸附的3′-SL的85至100％。在以上方法中可能的是离子交换树脂技术领域的技术人员可以考虑变更氢氧化铵的浓度或体积或两者，以最优化洗脱并从而在折衷或不折衷产率的情况下获得最高纯度。也可以选择通过使用较低浓度的氢氧化铵洗脱阴离子交换树脂的一些不想要的物质作为预备步骤并且之后用最优浓度的氢氧化铵洗脱以获得3-SL的最高纯度和产率。
实施例2
再一次对乳清渗透物进行如上面在实施例1中所述的超滤(UF)步骤。之后使用纳米过滤(NF)将UF渗透物浓缩至30％的固体含量，并且使浓缩物与根据本发明的一系列树脂接触，其中3-SL最终被吸在阴离子交换树脂上。这些步骤概述在附图的图2中。
通过纳米过滤浓缩UF渗透物以产生～15至25％固体物并且含有186至208ppm的3′-唾液酸乳糖的NF保留物。通过将2,500ml的以上NF保留物在25-mm直径柱中泵送使其通过/泵送通过串联的以下树脂：
·120ml的IMACHP336(聚丙烯酸类弱酸阳离子交换树脂)；
·180ml的FPA55(丙烯酸类弱碱阴离子交换树脂)；
·180ml的HP1110(苯乙烯-DVB强酸阳离子交换树脂)；
·180ml的FPA51(苯乙烯-DVB弱碱阴离子交换树脂)；
·100ml的IMACHP336(聚丙烯酸类弱酸阳离子交换树脂)；
·150ml的FPA55(丙烯酸类弱碱阴离子交换树脂)；
·150ml的HP1110(苯乙烯-DVB强酸阳离子交换树脂)；
·150ml的FPA51(苯乙烯-DVB弱碱阴离子交换树脂)。
再一次，在第四柱之后成功地使用断流水箱以避免压降问题。
3-SL被吸在最后的阴离子交换树脂上，将其用180ml的4.4％氢氧化铵之后用300ml的脱矿质水洗脱。洗脱物含有大约6至18重量％的3′-唾液酸乳糖。然后将其与250ml的IMACHP336(聚丙烯酸类弱酸阳离子交换树脂)之后是120ml的FPA51(苯乙烯-DVB弱碱阴离子交换树脂)接触，以移除过量的氨并调节最终产物的pH到7至9.5。所得到的产品含有大约占固体物的20至50重量％的非常高纯度形式的3′-唾液酸乳糖。最终物中的灰分含量＜10％，其余是蛋白质。大约20至50％的蛋白质价为NPN。
实施例3
再一次对乳清渗透物进行如上面关于实施例1和2所述的超滤步骤。之后使用纳米过滤将UF渗透物浓缩至20至30％(优选25％)的固体含量并且之后在50至80℃的升高的温度下对渗透物进行离子渗透色谱(换言之经常称作离子排斥色谱)。将该洗脱物分为两个级分-含有带电荷分子的初始级分，所述带电荷分子包含大部分的蛋白质(包括NPN类)、矿物质和3-SL，之后是含有不带电荷的分子如乳糖的级分。之后使含有3-SL的初始级分与如实施例1中所示的一系列树脂接触并且3-SL最终被吸在阴离子交换树脂上。附图的图3中概述了这些步骤。
更详细地，离子渗透步骤包括使用色谱柱，所述色谱柱含有650升的CR1310K以给出用工艺用水标定的3米的床高。评价+4至75℃之间的操作温度，在升高的温度下获得最好的结果。通过纳米过滤浓缩UF渗透物以产生～22至25％固体物并含有118至304ppm(平均220ppm)3′-唾液酸乳糖的NF保留物。之后通过泵送纳米过滤过的物质之后是水通过离子排斥树脂床，以对该物质进行离子排斥过程。对于最优的结果，将每循环的树脂与NF保留物装料比保持在1∶0.1之后是0.9bv的水(这里1bv＝总树脂体积，即650升)。评价0.3至0.86bv/小时之间的恒定流速。对于所获得的色谱图的性质，流速上的变化没有显著的影响。将洗脱物分为两个级分-含有与矿物质&蛋白质(包括NPN类)一起的3′-唾液酸乳糖的初始级分，之后是含有几乎纯净形式的乳糖的第二级分。每循环获得的3′-唾液酸乳糖富集级分的净体积为135升。固体含量在0.5至1％之间变化并且3′-唾液酸乳糖水平为固体物的0.5至1.3重量％。3′-唾液酸乳糖的回收率在80至100％的范围内，95个操作循环的平均回收率为85％。
之后使950升的3-SL富集级分通过串联的以下树脂：
·15升的IMACHP336(聚丙烯酸类弱酸阳离子交换树脂)；
·22升的FPA55(丙烯酸类弱碱阴离子交换树脂)；
·17升的HP1110(苯乙烯-DVB强酸阳离子交换树脂)；
·17升的FPA51(苯乙烯-DVB弱碱阴离子交换树脂)。
3-SL被吸在最后的阴离子交换树脂上，将它用28升的4.4％铵之后通过用50升脱矿质水洗脱。洗脱物含有大约6至15重量％的3′-唾液酸乳糖。接下来将它与30升的IMACHP336(聚丙烯酸类弱酸阳离子交换树脂)接触，之后是23升的FPA51(苯乙烯-DVB弱碱阴离子交换树脂)，以移除过量的氨，并调节最终产物的pH到7至9.5。所得到的具有0.3至1％之间的固体含量的产品含有占固体物的大约0.5至3重量％的3′-唾液酸乳糖。最终物中的灰分含量＜10％，乳糖含量为30至50％，其余是蛋白质。大约20至50％的蛋白质价为NPN。
实施例4
在备选的方法中，将由纳米过滤和如实施例3中所述的离子渗透步骤制备的1,600升的3-SL富集级分通过在200-mm直径柱中泵送，使其与串联的以下树脂接触：
·15升的IMACHP336(聚丙烯酸类弱酸阳离子交换树脂)；
·22升的FPA55(丙烯酸类弱碱阴离子交换树脂)；
·17升的HP1110(苯乙烯-DVB强酸阳离子交换树脂)；
·17升的FPA51(苯乙烯-DVB弱碱阴离子交换树脂)；
·17升的HP1110(苯乙烯-DVB强酸阳离子交换树脂)；
·17升的FPA51(苯乙烯-DVB弱碱阴离子交换树脂)。
3-SL被吸在最后的阴离子交换树脂上，用28升的4.4％氢氧化铵之后用50升脱矿质水将其洗脱。洗脱物含有大约6至15重量％的3′-唾液酸乳糖。接下来将它与30升的IMACHP336(聚丙烯酸类弱酸阳离子交换树脂)接触，之后通过23升的FPA51(苯乙烯-DVB弱碱阴离子交换树脂)，以移除过量的氨，并调节最终产物的pH到7至9.5。所得到的产品含有占固体物的大约20至70重量％的非常高浓度的纯化的3′-唾液酸乳糖。最终物中的灰分含量＜10％，其余是蛋白质。大约15至30％的蛋白质价为NPN。
实施例5
再一次对乳清渗透物进行如上面关于实施例1和2所述的超滤步骤。使UF渗透物与根据本发明的一系列树脂在两个阶段中接触，其中3-SL最终被吸在阴离子交换树脂上。这些步骤是在附图的图1中概述的那些步骤的变体。
使用2至6％固体物并且含有30至80ppm3′-唾液酸乳糖的UF渗透物。
在本实施例的阶段I，将一定量的以上UF保留物通过在200-mm直径柱中泵送使其通过/泵送过串联的以下树脂：
·15升的IMACHP336(聚丙烯酸类弱酸阳离子交换树脂)；
·22升的FPA55(丙烯酸类弱碱阴离子交换树脂)；
·17升的HP1110(苯乙烯-DVB强酸阳离子交换树脂)；
·17升的FPA51(苯乙烯-DVB弱碱阴离子交换树脂)；
UF保留物加载的截止点被确定为当流出物电导率达到大约300至400微西门子时的点。以上程序的三次连续重复分别产生610升、650升和600升的保留物加载。将已经通过以上四个树脂柱的含有脱矿质3′-SL的所关心的产物(保留物)用100升的工艺用水置换，在上述三个连续重复中分别产生684升、724升和674升的阶段I产物。
在本实施例的阶段II中，接下来使800升的阶段I洗脱物与17升的HP1110(苯乙烯-DVB强酸阳离子交换树脂)接触，之后与17升的FPA51(苯乙烯-DVB弱碱阴离子交换树脂)接触。含有纯化的3′-SL的所关心的产物被吸在最后一个树脂上并且用20升的1％氯化钾之后是45升的工艺用水将其洗脱。
在阶段II的两次重复中，获得共计120升的洗脱产物。接下来对其进行纳米过滤之后渗滤以产生7.3升的保留物。该产物含有占固体物的27重量％的3′-唾液酸乳糖。
在冷冻干燥之后，2.96升的纳米过滤并且渗滤的产物产生420g的干燥产物，所述干燥产物含有占固体物的30重量％的3′-SL。最终物中的灰分含量16％，蛋白质为30％并且2％的蛋白质价为NPN。
实施例6
在另一个方法中，将来自实施例3中描述的离子排斥步骤的3-SL富集级分通过纳米过滤浓缩至～12％的固体含量。将15ml的该物质在150ml的SephadexG25上层析以产生含有占固体物的4至6重量％的3-SL的最终产物。回收率为～98％。可以使用市场中可得的任何主体(bulk)脱盐树脂如ToyopearlHW40或Bio-GelP-4或Bio-GelP-6或者包括SephadexG10的任何其他的这种脱盐树脂。
如在以上实施例中说明的，本发明的分离方法基本上包括使渗透物(在实施例1的情况下未处理的UF渗透物，在实施例2的情况下纳米过滤的渗透物或者在实施例3至6的情况下的离子排除物)通过以下树脂：
·弱酸阳离子交换树脂(例如ImacHP336或WK40)
·弱或强阴离子交换树脂(例如FPA55或FPA42)
·强酸阳离子交换树脂(例如ImacHP1110或FPC23)
·弱或强阴离子交换树脂(例如FPA51、FPA55或FPA42)
这使得能够净化渗透物。在净化之后，3-SL可以被吸附在适当的离子交换树脂上(在优选实施方案中为FPA51，因为它使得能够进行最好的洗脱)。可以使该物质通过阳离子交换树脂之后通过阴离子交换树脂，以允许所有3′-SL被吸在阴离子交换树脂上。使用在前面有或没有阳离子交换树脂的强碱阴离子交换树脂也将使得3′-SL被吸在该树脂上，但是将需要较高强度的洗脱介质。使用氢氧化铵、氯化钙、NaCl和KCl或其组合完成从树脂的洗脱。
实施例7
在沿与实施例5中相同的路线进行的另一系列的实验中，将3′-唾液酸乳糖的洗脱级分分为多个级分，并且以19-20％的降低的产率获得100％纯3′-唾液酸乳糖的级分。
在通过合适的方法浓缩固体之后可以将该级分直接冷冻干燥或者喷雾干燥。
有关本发明的方法原理由移除不想要的和/或干扰的带负电荷的分子至足以使得3-SL优先附着于阴离子交换树脂(FPA51)的程度构成。阳离子交换树脂主要是在可以通过阴离子交换树脂将3-SL吸收之前使3-SL成为带负电荷的。
可以预期的是在使用任意强阳离子交换树脂将带正电荷的分子移除之后，3-SL将被吸在任意阴离子交换树脂上。但是令人惊讶地表现出的不是这样的情况，这暗示3′-SL与树脂之间的键非常弱，它易于被任何竞争阴离子物种的存在所破坏。必要的是具有上述串联的所有四种树脂。例如当使用纳米过滤的渗透物作为起始材料时(参见实施例2)，高度需要的是具有上述四种树脂外加再一次的这四种树脂以便使3-SL被吸在含有弱阴离子交换树脂的最后的柱上。
纯净和天然形式的3-SL作为非常弱地带负电荷的分子存在。阴离子交换树脂仅在将除H+离子以外几乎所有阳离子物种移除并且将大量的竞争阴离子移除的情况下吸收3-SL。本发明方法的目的在于获得在固体的大约3至60重量％浓度的范围内变化的纯净形式的3-SL。这不是直接实现的。第一弱酸阳离子交换树脂移除乳清中存在的大量的二价阳离子如Ca和Mg以及较少量的Na和K以及某些氨基酸和蛋白质。第二树脂，弱碱阴离子交换树脂，吸收一些带负电荷的分子如氯化物、磷酸盐和硫酸盐，以及在一定程度上吸收柠檬酸盐、乳酸盐和带负电荷的氨基酸和蛋白质。第三树脂是强阳离子交换树脂，它之后吸收几乎所有的剩余阳离子。第四树脂是弱碱阴离子交换树脂，它吸收优先于3-SL的任何剩余阴离子。为了确保最小量的3-SL被该柱吸收，优选的是过度处理(overprocess)以使得任何被第四树脂吸收的3-SL被竞争阴离子选择性地击出(knockedout)。在将该物质净化之后(或者＞90％脱矿质)，可以将其输送通过强酸阳离子交换树脂以基本上清光所有的剩余阳离子，从而使得3-SL以其天然或自由状态(很可能为″H-3-SL″)存在。接下来处于其-OH形式的弱阴离子将易于与″H-3-SL″反应(H与OH反应以形成水)并且现在带负电荷的3-SL易于由弱阴离子交换树脂吸收。
从上面清楚地是，在使含有3′-SL的物质与树脂接触之前，可以选择通过选自如渗析、电渗析、渗滤等的方法/技术降低树脂上的离子负载。这将提高树脂的吸收容量，但是不改变分离感兴趣的低聚糖的基础原理。
在所有的情况下最后的树脂为弱碱阴离子交换树脂，虽然技术上强碱阴离子交换树脂将同样好的适用于吸收3-SL。然而，与弱碱阴离子交换树脂比较，从强碱阴离子交换树脂洗脱更困难。氯化物盐如KCl、NaCl或CaCl2或其组合是优选的。其他挥发性盐将包括氢氧化铵、乙酸铵、甲酸铵、甲酸、乙酸等
在从阴离子柱洗脱之后，使该物质与弱酸阳离子交换树脂接触以移除氨和/或Ca(如果使用CaCl2)或者K(如果使用KCl)，之后是弱阴离子交换树脂如FPA51以将pH调节回中性点，并且如果使用KCl或CaCl2那么移除过量的氯化物。备选地，可以将该物质纳米过滤和/或渗滤以获得产品中所需的目标规格。
本领域技术人员也可以使用以下技术：获取含有3′-唾液酸乳糖的洗脱级分部分，从而获得100％纯度的所需产物，虽然牺牲了产率。
虽然说明本方法的实施例限于3′-SL，渗透物中存在多种感兴趣的成分，如蛋白质、氨基酸以及其他低聚糖，其可以使用本说明书中描述的相同的操作原理将它们成功地分离。此外，通过改变洗脱溶液的浓度，树脂技术领域的任何技术人员可以通过将被吸收的物质从树脂选择性分离而提高纯度。

Claims (30)

1.一种用于将3′-唾液酸乳糖、6′-唾液酸乳糖、阴离子性低聚糖和/或蛋白质从乳清分离和/或纯化的方法，所述方法包括以下步骤：
使所述乳清与至少一组的离子交换树脂接触以将所述乳清脱矿质，所述组包括第一弱酸阳离子交换树脂、第一弱碱阴离子交换树脂、第二强酸阳离子交换树脂和第二弱碱阴离子交换树脂；
使该脱矿质乳清与两个另外的或最终的离子交换树脂接触，所述两个另外的或最终的离子交换树脂包括第三强酸阳离子交换树脂和之后的第三弱碱阴离子交换树脂，其中所述3′-唾液酸乳糖、6′-唾液酸乳糖、阴离子性低聚糖和/或蛋白质被吸在所述第三弱碱阴离子交换树脂上；以及
将所述3′-唾液酸乳糖、6′-唾液酸乳糖、阴离子性低聚糖和/或蛋白质从所述弱碱阴离子交换树脂洗脱。
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括：在与所述离子交换树脂接触之前对所述乳清进行超滤步骤，以提供蛋白质浓缩物和乳清渗透物，其中使所述乳清渗透物与所述离子交换树脂接触。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述分离和/或纯化是用于3′唾液酸乳糖的。
4.根据权利要求1所述的方法，其中将所述乳清保持在至少5.5的pH。
5.根据权利要求1所述的方法，其中对所述乳清，或根据权利要求2所述的方法，其中对所述乳清渗透物，在其通过所述树脂之前进行浓缩步骤。
6.根据权利要求1所述的方法，其中对所述乳清，或根据权利要求2所述的方法，其中对所述乳清渗透物，进行另外的程序以提高所述3′-唾液酸乳糖、6′-唾液酸乳糖、阴离子性低聚糖和/或蛋白质的分离和纯化，所述另外的程序选自渗析、电渗析、渗滤、纳米过滤和离子交换树脂。
7.根据权利要求5所述的方法，所述方法还包括在使浓缩物与所述至少一组的树脂接触之前，使用纳米过滤来浓缩所述乳清或乳清渗透物。
8.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括：通过离子渗透色谱或离子排斥色谱的方式增加未浓缩的或浓缩的乳清或权利要求2所述的乳清渗透物中所述3′-唾液酸乳糖、6′-唾液酸乳糖、阴离子性低聚糖和/或蛋白质的相对浓度，以提供含有包含所述3′-唾液酸乳糖、6′-唾液酸乳糖、阴离子性低聚糖和/或蛋白质的带电荷分子的第一级分，之后是第二级分，其中，之后使所述第一级分与所述至少一组的树脂接触。
9.根据权利要求8所述的方法，其中将富集的第一级分与至少一组的树脂接触以获得脱矿质的富集级分。
10.根据权利要求8或权利要求9中任一项所述的方法，其中将所述富集的级分与至少一组的树脂接触以将所述3′-唾液酸乳糖、6′-唾液酸乳糖、阴离子性低聚糖和/或蛋白质吸附到另外的阴离子交换树脂上。
11.根据权利要求8或权利要求9中任一项所述的方法，所述方法还包括在至少50℃的升高的温度下进行所述离子渗透色谱。
12.根据权利要求10所述的方法，所述方法还包括在至少50℃的升高的温度下进行所述离子渗透色谱。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述升高的温度为50℃至80℃。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述升高的温度为50℃至80℃。
15.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括：使用碱、盐、缓冲溶液或酸的适当稀释的溶液，将所述3′-唾液酸乳糖、6′-唾液酸乳糖、阴离子性低聚糖和/或蛋白质从所述另外的弱碱阴离子交换树脂洗脱。
16.根据权利要求13所述的方法，其中使用铵盐用于所述洗脱。
17.根据权利要求13所述的方法，其中使用碱土金属或任意二价阳离子的氯化物盐用于所述洗脱。
18.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括通过使所述洗脱物与合适的阳离子交换树脂接触之后与弱碱阴离子交换树脂接触而净化所述洗脱物。
19.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括通过选自以下各项的程序净化所述洗脱物：渗滤、纳米过滤、电渗析和渗析。
20.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括通过纳米过滤和/或蒸发将所述洗脱物浓缩，和/或将产物干燥。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一弱酸阳离子交换树脂是聚丙烯酸类弱酸阳离子交换树脂。
22.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一弱碱阴离子交换树脂是丙烯酸类弱碱阴离子交换树脂。
23.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二强酸阳离子交换树脂是苯乙烯-DVB强酸阳离子交换树脂。
24.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二弱碱阴离子交换树脂是苯乙烯-DVB或丙烯酸类弱碱阴离子交换树脂。
25.根据权利要求1所述的方法，其中所述第三强酸阳离子交换树脂是苯乙烯-DVB强酸阳离子交换树脂。
26.根据权利要求1所述的方法，其中所述第三弱碱阴离子交换树脂是苯乙烯-DVB弱碱阴离子交换树脂。
27.一种用于制备乳制品的方法，所述方法包括根据权利要求1所述的方法制备乳清的3′-唾液酸乳糖、6′-唾液酸乳糖、阴离子性低聚糖和/或蛋白质。
28.根据权利要求27所述的方法，所述方法还包括使来自所述洗脱步骤的所述3′-唾液酸乳糖、6′-唾液酸乳糖、阴离子性低聚糖和/或蛋白质与乳制品流接触的步骤。
29.根据权利要求27所述的方法，其中所述乳制品是奶制品。
30.根据权利要求27所述的方法，所述方法还包括通过纳米过滤和/或蒸发将所述乳制品浓缩，和/或干燥所述乳制品。
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