JP6082835B2 - 乳清成分の単離と精製 - Google Patents

Description

本発明は、乳清成分の単離と精製の方法に関し、詳細には、乳清透過物からの単離に限らず、特にシアリルラクトース、具体的には３’−シアリルラクトース（別の方法では、３’−ＳＬ、３−ＳＬ、又は３プライムと称される）の単離に関する。

一般的に、チーズの製品には、ミルクへの酵素の作用により、又は適当な酸を使用したミルクのｐＨの低下により、乳固形分と乳脂肪分を凝乳マトリクス中に閉じ込めるための乳タンパク質（カゼイン）の凝固物が含まれる。そして、この凝乳マトリクスは、チーズ乳清として知られている液体画分を搾り出すために、固められる。チーズ乳清は、凝乳マトリクス中には保持されない乳固形分、特にミルク単糖類及び可溶性タンパク質を含んでいる。乳清は、チーズ製造工程において使用されるミルクの全体積のうち、８０〜９０％を占めており、また最初の全乳からの固形分の半分以上を占め、２０％のタンパク質とラクトースの大部分を含有し、非常に高い有機物含量を有する。

その高い有機物含量のために、乳清の処分は、常に酪農産業の課題であった。現在、乳清からの可溶性タンパク質を回収し、ラクトースから有用性を取り戻すことが可能である。そして放流河川への有機物負荷を減少させ、乳清からより高い利益を得るために、できるだけ多くの有機物量を回収することが明らかに望ましい。主な努力は、この産品の利用法を開発するチーズ製造会社によって、進められている。

タンパク質濃縮物と乳清透過物を得るために、乳清を限外濾過（ＵＦ）することは業界において一般的となっている。タンパク質濃縮物は、動物飼料、肥料、発酵において、また食物増量材として、適用法が見出された。しかしながら、透過物の個々の成分について、それらをさらなる利用に適するように、単離して精製することが十分にできないため、ラクトースを多く含む透過物は依然として廃棄物のままである。

ラクトースを多く含む透過物は、３’−シアリルラクトースなどの様々なオリゴ糖類を含んでいる。これは、有益な適用、例えば医薬品やベビーフードへの適用があることが見出されているが、十分に純粋な状態で、この成分を提供することが必要である。

α（２−３）トランス−シアリダーゼの触媒活性の使用によって、乳製品源とチーズ加工廃棄物のストリームから、シアリルオリゴ糖を製造する方法が報告されている（特許文献１（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ））。α（２−３）トランス−シアリダーゼは、α（２−３）シアリルラクトースの酵素合成を促進するとされている、チーズ加工廃棄物中で自然に生じるラクトース及びシアロシド類の高濃縮物を、有効に利用する。この酵素作用により作り出されたシアリルラクトースは、陽イオン樹脂とその後に続く強陰イオン樹脂とを通過させることによって精製される。シアリルラクトースは陰イオン樹脂に取り込まれ、適切な溶液を使用して溶出される。この工程はシアリルラクトースを精製する。しかし、陽イオン樹脂は、シアリルラクトースと共に塩を形成して残存する陽イオン種と共に、いくつかの陽イオンしか取り除けないという欠点を抱えている。さらに、塩を分配し、シアリルラクトースを樹脂に結合させるためには、強い陰イオン樹脂を必要とする。しかしながら、実際にカラムに結合するシアリルラクトースの量は、廃棄物中に存在するシアリルラクトースに対する他の陰イオンの量に依存する。したがって、他の陰イオンを多く含む溶出された原料の浄化が必要とされる。

米国特許第６３２３００８号明細書

本発明は、上記の欠点を克服、又は少なくとも軽減するための、乳清の成分、特に３’−シアリルラクトースの単離及び精製に係る方法を提供することを目的とするが、単離及び精製の対象として、乳清透過物のみには限らない。

従って、本発明の第一の態様は、３’−シアリルラクトースのような乳清の所望の成分を、乳清から単離及び／又は精製する方法を提供し、該方法は以下の工程を含む：
乳清を少なくとも一組のイオン交換樹脂に接触させる工程であって、前記一組とは、乳清を脱塩するための第一の陽イオン樹脂、第一の陰イオン樹脂、第二の陽イオン樹脂及び第二の陰イオン樹脂を含む工程；
該脱塩された乳清を、強酸性陽イオン及び最後の弱塩基性陰イオン樹脂を含む二つのさらなる又は最後のイオン交換樹脂に接触させる工程であって、所望の成分が陰イオン樹脂に取り込まれる工程；及び、
最後の陰イオン樹脂から適切な溶離液を使用して所望の成分を溶出させる工程。

図１は、実施例１の方法にかかる工程を示すフローチャートである。 図２は、実施例２の方法にかかる工程を示すフローチャートである。 図３は、実施例３の方法にかかる工程を示すフローチャートである。

本発明の好適実施態様においては、イオン交換樹脂に接触する前に原料の乳清は限外濾過にかけられ、該限外濾過工程はタンパク質濃縮物と乳清透過物を提供することができる。ここで該乳清透過物はイオン交換樹脂に接触する。この工程には、原料の乳清又は脱塩された乳清を使用することが可能である。

所望の成分とは、好ましくは３’−シアリルラクトースである。他の成分には透過物中に存在する６’−シアリルラクトース及び／又は他の陰イオン性オリゴ糖類を含むことができる。

第一の陽イオン樹脂は、好ましくは、弱酸性陽イオン樹脂である。第二の陽イオン樹脂は強酸性陽イオン樹脂であることが好ましい。第二の陽イオン樹脂が弱酸性陽イオンである場合は、樹脂に入る物質のｐＨはｐＨ５以上、好ましくはｐＨ５．５以上で維持されるべきである。

第一及び第二の塩基性陰イオンは、好ましくは、弱塩基性陰イオンを含む。

本発明の第二の態様は、本発明の第一の態様の方法によって乳清から単離及び精製された所望の成分、特に３’−シアリルラクトースを対象とする。

コスト効率及び／又は技術効率を最適化するために、限外濾過（ＵＦ）された乳清透過物は、直接、イオン交換樹脂に通しても良いし、又は、完全に、若しくは、より好ましくは部分的に、透析、電気透析、ナノ濾過、又は前記の組み合せなどの技術を使用する、事前の脱塩工程にかけても良い。

本発明の１つの実施態様では、濃縮された原料が本発明の第一の態様で定義される一組の樹脂と接触する前に、ＵＦ乳清透過物がナノ濾過を使用して濃縮される。この実施態様では、濃縮された原料が２組の樹脂、すなわち、弱酸性陽イオン、塩基性陰イオン、強酸性陽イオン、塩基性陰イオンの第一組目と、その後に続く弱酸性陽イオン、塩基性陰イオン、強酸性陽イオン、塩基性陰イオンの第二組目とに接触することが好ましい。塩基性陰イオンは、強塩基であっても弱塩基であってもよいが、好ましくは、損失を最小に抑え、溶出を最適化するために弱塩基である。

電気透析によって、透過物に部分的脱塩を施すことができる。そして、これを、一組の陽イオン及び陰イオン樹脂に通過させて、３−ＳＬの完全な浄化とその後の最後の陰イオン樹脂への結合ができるようにする。

本発明の１つの実施態様では、本発明の第一の態様による一組の樹脂との接触前に、イオン浸透クロマトグラフィー（又は、イオン排除クロマトグラフィー）測定によって、濃縮されたＵＦ乳清透過物中の相対的な３’−ＳＬ含有量を増加することができる。好ましくは、イオン浸透クロマトグラフィーは高温で行われ、より好ましくは少なくとも５０℃であり、さらに好ましくは５０℃から８０℃である。溶出する原料は、３’−シアリルラクトースを含んだ帯電した分子を含む第一の画分と、それに続くラクトースなどの帯電していない分子を含んだ第二の画分とを含有する。次に、３’−シアリルラクトースが陰イオン樹脂に取り込まれる状態で、３’−シアリルラクトースを含む第一の画分を一組の樹脂と接触させる。

クロマトグラフ分離用樹脂は、好ましくは、ローム アンド ハース（Ｒｏｈｍ ＆ Ｈａａｓ）によって供給されるＣＲ１３１０Ｋである。しかしながら、他にも適切な樹脂は存在する。例として、これらに限定されることはないが、ＣＲ１３１０Ｃａ＆Ｎａ、ＣＲ１３２０Ｃａ、Ｋ若しくはＮａ，ダウ（Ｄｏｗ）によるＤＯＷＥＸ（商標）Ｍｏｎｏｓｐｈｅｒｅ（商標）９９Ｃａ／３２０、三菱によるダイヤイオン（Ｄｉａｉｏｎ）（商標）ＵＢＫ５３０、又はピュロライト（Ｐｕｒｏｌｉｔｅ）によるＰＣＲ１４５Ｋが挙げられる。

３’−シアリルラクトースは、適切に希釈されたアルカリ、塩、緩衡剤又は酸の溶液のいずれかを使用することで、陰イオン樹脂から溶出される。使用されるアルカリは、水酸化アンモニウム、ＮａＯＨ、ＫＯＨが挙げられ、塩の溶液は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム、炭酸アンモニウムなどが挙げられ、また、酸は、希薄なＨＣｌ、酢酸、ギ酸が挙げられ、及び／又は、緩衡剤は、陰イオン樹脂から３’−シアリルラクトースを効率的に溶出させることができる十分な量のカウンターアニオンを含有し、又は上記の適切な組み合わせたものである。しかしながら、揮発性の傾向があるため、アンモニウム塩がより好ましい。

適切な塩基又は塩を使用して陰イオン樹脂から溶出した３’−シアリルラクトースは、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）（商標）Ｇ２５などの脱塩樹脂を使用して塩類の除去を施すことができる。例えば、溶出生成物は、ナノ濾過を使用して固形分約２０〜３０％に濃縮することができ、そして得られた物質はセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）（商標）Ｇ２５（又は、市販されているこのような他の脱塩樹脂）でクロマトグラフされる。溶出する最初の物質は、より大きな分子と共に３’−シアリルラクトースであり、ＮＰＮなどのより小さな分子と塩がそれに続く。酢酸塩、ギ酸塩などの大きなイオンを含む溶液を使用する場合は、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）（商標）Ｇ２５又はその同等の樹脂を用いたこれらの分子の除去はいくらか不十分となる。それでもなお、樹脂層の深さと流速を調整することで、純度を改善することができる。このような場合、適切な陰イオン樹脂（強塩基性又は弱塩基性陰イオン樹脂）と、それに続くｐＨを中性に調整するための弱酸性陽イオン樹脂を使用することで、不純物を除去することを選択することができる。また、透析濾過、ナノ濾過、電気透析、透析又は他の手段によっても塩を除去することができる。

浄化された溶出した物質は、ナノ濾過及び／又は蒸発によってさらに濃縮することができ、好ましくは、白い生成物質を生じさせるために乾燥する。

本発明の方法においては、任意の適切な、強及び弱、陽イオン及び陰イオンの樹脂を使用することができる。第一の弱酸性陽イオンは、好ましくはポリアクリル酸の弱酸性陽イオンであり、好ましくは商品名ＩＭＡＣ ＨＰ３３６で供給されるものである。別のポリアクリル酸の弱陽イオンとしては、ローム アンド ハース（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ）が供給するＰＷＣ１１、ダウが供給するＤＯＷＥＸ（商標）ＭＡＣ−３、又は三菱が供給するダイヤイオン（Ｄｉａｉｏｎ）（商標）ＷＫ１０及びＷＫ４０が挙げられる。第一の弱陰イオンは、好ましくはアクリル系の弱塩基性陰イオン、好ましくは商品名ＦＰＡ５５で供給されるものである。別のアクリル系の弱塩基性陰イオンには、三菱が供給するダイヤイオン（Ｄｉａｉｏｎ）（商標）ＷＡ１０、ＷＡ２０、ＷＡ２１Ｊ及びＷＡ３０、又はピュロライト（Ｐｕｒｏｌｉｔｅ）が供給するＡ８４７又はＰＦＡ８４７が挙げられる。また、スチレンの弱塩基性陰イオン樹脂を使用することができる。さらに強塩基性陰イオン樹脂を使用することもできるが、これは、その後に続く樹脂の浄化のための再生液の使用量を増加させる可能性がある。

第二の強酸性陽イオンは、好ましくはスチレン−ＤＶＢの強酸性陽イオンであり、より好ましくは商品名ＨＰ１１１０で販売されるものである。別の強酸性陽イオンには、ローム アンド ハースが供給するＦＰＣ２３、ダウが供給するＤＯＷＥＸ（商標）８８、ＤＯＷＥＸ（商標）８８ＭＢ、ＤＯＷＥＸ（商標）Ｍｏｎｏｓｐｈｅｒｅ（商標）８８、三菱が供給するダイヤイオン（Ｄｉａｉｏｎ）（商標）ＳＫ１Ｂ、ＳＫ１０４、ＳＫ１１０、ＳＫ１１２、ＳＫ１１６、ＰＫ２０８、ＰＫ２１２、ＰＫ２１６、ＰＫ２２０、ＰＫ２２８若しくはＨＰＫ２５、又はピュロライト（Ｐｕｒｏｌｉｔｅ）が供給するＰＦＣ１１０若しくはＰＦＣ１５０が挙げられる。

第二の弱塩基性陰イオンは、好ましくはスチレン−ＤＶＢの弱塩基性陰イオンであり、より好ましくは商品名ＦＰＡ５１で販売されるものである。別の弱塩基性陰イオンには、ダウが供給するＤＯＷＥＸ（商標）６６、ＤＯＷＥＸ（商標）Ｍｏｎｏｓｐｈｅｒｅ（商標）６６若しくはＤＯＷＥＸ（商標）Ｍｏｎｏｓｐｈｅｒｅ（商標）７７、又は三菱が供給するダイヤイオン（Ｄｉａｉｏｎ）（商標）ＷＡ１０、ＷＡ２０、ＷＡ２１Ｊ及びＷＡ３０が挙げられる。

弱塩基性陰イオン樹脂が好ましくはあるが、弱塩基性陰イオン樹脂を強陰イオン樹脂と置き換えることもできる。このような樹脂として、これらに限定されることはないが、ローム アンド ハースによるＦＰＡ４２、ＦＰＡ９０、ピュロライト（Ｐｕｒｏｌｉｔｅ）によるＡ６００、Ａ４００Ｅ、Ａ４２０及びＡ８５０、並びにダウケミカル社（Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）によるＤｏｗｅｘ（商標）Ａ、Ｄｏｗｅｘ（商標）１、Ｄｏｗｅｘ（商標）２２、Ｄｏｗｅｘ（商標）ＳＡＲが挙げられる。

さらなる態様においては、本発明は乳清の所望の成分に富んだ酪農製品を製造する方法を提供するが、該方法は、本発明の第一の態様の方法により、乳清の所望の成分を準備する過程を含む。乳清の所望の成分は、任意に、３’−シアリルラクトースとすることができ、該方法は、任意に、３’−シアリルラクトースに富んだ酪農製品を製造する方法とすることができる。酪農製品は、場合により、乳製品であるが、乳清の所望の成分に富んだ任意の酪農製品を用いることができる。溶出した所望の成分を酪農製品のストリームと接触させることによって、乳清の所望の成分に富んだ酪農製品を製造することができる。溶出した所望の成分と酪農製品のストリームは、それぞれ独立して液体であっても固体であってもよい。場合により、溶出した所望の成分と酪農製品のストリームは、それぞれ独立した液体である。場合により、酪農製品の製造方法は、さらに酪農製品を濃縮する工程を含む。濃縮工程は、酪農製品のナノ濾過、蒸発及び乾燥のいずれか一つ、又は組み合せを含むことができる。

ここで、ほんの一例である実施例を添えて、本発明をより具体的に説明する。実施例１は、本発明の方法を用いた、ＵＦ乳清透過物からの３’−シアリルラクトースの直接単離について説明する。実施例２は、ＵＦ乳清透過物がナノ濾過を使用して最初に濃縮される本発明の方法を使用した、濃縮されたＵＦ乳清透過物からの３’−シアリルラクトースの単離について説明する。実施例３〜７は、ナノ濾過とそれに続くイオン浸透クロマトグラフィーを使用してＵＦ乳清透過物が最初に濃縮される本発明の方法を使用する、濃縮されたＵＦ乳清透過物からのシアリルラクトースの単離について説明する。また添付の図面に関しては：
図１は、実施例１の方法にかかる工程を示すフローチャートであり；
図２は、実施例２の方法にかかる工程を示すフローチャートであり；そして、
図３は、実施例３の方法にかかる工程を示すフローチャートである。

＜実施例１＞
全ての実施例について、本発明における第一の工程は、チーズ乳清中のタンパク質の大部分を取り除く限外濾過（ＵＦ）工程である。
ＵＦ工程は、乳清タンパク質濃縮物（ＷＰＣ）３５、６０、８０及び８５の製造を含むことができる。この工程の副産物は、固形分が約４〜７％の乳清透過物であり、約９０〜９５％のラクトース、１〜５％のタンパク質（ＮＰＮと純タンパク質）、４〜７％の灰分、及び０．０５〜０．２５％の３’−シアリルラクトース（３−ＳＬ）で構成される。年間のある時期には、３−ＳＬの割合がかなり高く、固形分が最大０．５重量％程度までとなることがある。

実施例ではＵＦ透過物を一組の樹脂と直接接触させ、そして、３−ＳＬは陰イオン樹脂に最終的に取り込まれた。この工程は添付図面の図１に要約される。

固形分約５％、３’−ＳＬ約６０ｐｐｍのＵＦ乳清透過物ストリーム１，０３５リットルをポンプで送り、直径２００ｍｍのカラム内の一組の樹脂に通すことによって、連続的に以下の樹脂と直接、接触させた。
・１５リットルのＩＭＡＣ ＨＰ３３６（ポリアクリル酸の弱酸性陽イオン）；
・２２リットルのＦＰＡ５５（アクリル系の弱塩基性陰イオン）；
・２３リットルのＨＰ１１１０（スチレン−ＤＶＢの強酸性陽イオン）；
・２３リットルのＦＰＡ５１（スチレン−ＤＶＢの弱塩基性陰イオン）；
・１７リットルのＨＰ１１１０（スチレン−ＤＶＢの強酸性陽イオン）；
・１７リットルのＦＰＡ５１（スチレン−ＤＶＢの弱塩基性陰イオン）。

３−ＳＬは、最後の陰イオン樹脂に取り込まれ、４．４％の水酸化アンモニウム２８リットルと、それに続く脱塩水５０リットルによって溶出された。溶出した物質は、約６〜１５重量％の３’−シアリルラクトースを含んでいた。そして、これを３０リットルのＩＭＡＣ ＨＰ３３６（ポリアクリル酸の弱酸性陽イオン）、及びそれに続くＦＰＡ５１（スチレン−ＤＶＢの弱塩基性陰イオン）と接触させ、過剰のアンモニアを取り除き、最終生成物のｐＨを７〜９．５に調整した。

得られた生成物は、固形分重量あたりで１２〜５０重量％の非常に高純度な３’−シアリルラクトースを含んでいた。最終生成物中における灰分含量は、１０％未満であり、残りはタンパク質であった。タンパク質の値の約２０〜５０％はＮＰＮであった。このようにして、本実施例では、一定の流速で３−ＳＬをポンプで送ることによって、以下の一組の樹脂に通し、透過物を直接接触させた： 陽イオン−陰イオン−陽イオン−陰イオン−陽イオン−陰イオン。
これは、不要かつ干渉する分子を取り除くことを可能とし、また、特に最後の陰イオン樹脂カラムに３−ＳＬが取り込まれるようにする。具体的には、以下の系列は、３−ＳＬを最大に回収することについて最高の結果を示した：
・強酸性陽イオン（ＷＡＣ）−弱塩基性陰イオン（ＷＢＡ）−強酸性陽イオン（ＳＡＣ）−弱塩基性陰イオン（ＷＢＡ）−強酸性陽イオン（ＳＡＣ）−弱塩基性陰イオン（ＷＢＡ）。
３−ＳＬは、少量のタンパク質（純タンパク質＋ＮＰＮ）といくらかの陰イオンと共に、最後の陰イオンカラムに取り込まれる。次に、３−ＳＬは、水酸化アンモニウムを使用して溶出される。（アンモニア、カリウム、ナトリウム、マグネシウム若しくはカルシウムの塩化物、又はそれらの組み合せをうまく使用することもできる。）

層を通した圧力の低下が大きくなり過ぎるので、処理された透過物を回収するために、適切な位置で中断タンク（ｂｒｅａｋ ｔａｎｋ）を使用してもよい。このタンクから、処理された透過物はさらにポンプで送られ、残りのカラムを通過する。

次に、溶出した３−ＳＬは、塩を取り除くために、陽イオン樹脂とそれに続く陰イオン樹脂で浄化された。その代案として、透析濾過、ＮＦ、電気透析、透析又は他の手法によって塩を取り除くことができる。樹脂技術の使用による他の利点は、特定の不要のＮＰＮを同様に取り除くことである。

得られた物質は、ＮＦ及び／又は蒸発による濃縮のために７〜４２重量％の３−ＳＬ含有量を有しており、非常に高い３−ＳＬ濃度を有する白い生成物を得るために最後に乾燥される。

最後の弱塩基性陰イオン樹脂における透過物からの３’−ＳＬの取り込みはほぼ１００％であり、溶出されたのは、吸着された３’−ＳＬの総量のうちの８５〜１００％であった。上記の製造過程において、イオン交換樹脂技術における当業者にとっては、水酸化アンモニウムの濃度、体積、又はそれら両方の変更を検討し、溶出を最適化して、その結果、収量について妥協するか否かに関わらず、最も高い純度を得ることが可能である。また、３−ＳＬの最も高い純度と収量を得るために、予備的な工程として、より低い濃度の水酸化アンモニウムを用い、次に最適濃度の水酸化アンモニウムで溶出することによって、陰イオン樹脂中の不要の物質の溶出を選択することができる。

＜実施例２＞
上記の実施例１のように、乳清透過物を再び限外濾過（ＵＦ）工程にかけた。次に、ナノ濾過（ＮＦ）により、ＵＦ透過物を固形分３０％まで濃縮して、濃縮された原料を本発明による一組の樹脂と接触させることで、最終的に３−ＳＬを陰イオン樹脂に取り込んだ。該工程を添付図面の図２に要約する。

ＵＦ透過物は、ナノ濾過によって濃縮され、固形分が約１５〜２５％、１８６〜２０８ｐｐｍの３’−シアリルラクトースを含むＮＦ残余分（ＮＦ ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）が得られた。２，５００ｍｌの上記ＮＦ残余分は、直径２５ｍｍのカラム内で樹脂の中にポンプで送られることによって、以下の一組の樹脂の中に通された／送り込まれた：
・１２０ｍｌのＩＭＡＣ ＨＰ３３６（ポリアクリル酸の弱酸性陽イオン）；
・１８０ｍｌのＦＰＡ５５（アクリル系の弱塩基性陰イオン）；
・１８０ｍｌのＨＰ１１１０（スチレン−ＤＶＢの強酸性陽イオン）；
・１８０ｍｌのＦＰＡ５１（スチレン−ＤＶＢの弱塩基性陰イオン）；
・１００ｍｌのＩＭＡＣ ＨＰ３３６（ポリアクリル酸の弱酸性陽イオン）；
・１５０ｍｌのＦＰＡ５５（アクリル系の弱塩基性陰イオン）；
・１５０ｍｌのＨＰ１１１０（スチレン−ＤＶＢの強酸性陽イオン）；
・１５０ｍｌのＦＰＡ５１（スチレン−ＤＶＢの弱塩基性陰イオン）。

この場合も先と同様に、圧力低下の問題を回避するために、第４カラムの後に中断タンクを首尾よく用いた。

３−ＳＬは、最後の陰イオン樹脂に取り込まれ、１８０ｍｌの４．４％水酸化アンモニウムと、その後に続く３００ｍｌの脱塩水を用いて溶出された。溶出した物質は、約６〜１８重量％の３’−シアリルラクトースを含んでいた。そして溶出した物質を、２５０ｍｌのＩＭＡＣ ＨＰ３３６（ポリアクリル酸の弱酸性陽イオン）と、その後に続く１２０ｍｌのＦＰＡ５１（スチレン−ＤＶＢの弱塩基性陰イオン）とに接触させて、過剰のアンモニアを除去し、最終生成物のｐＨを７〜９．５に調整した。得られた生成物は、固形分で２０〜５０重量％にあたる、非常に高い純度の３’−シアリルラクトースを含んでいた。最終生成物の灰分含量は、１０％未満であり、残りはタンパク質であった。タンパク質の値の約２０〜５０％はＮＰＮであった。

＜実施例３＞
乳清透過物は、実施例１と２に関して説明したものと同様に、限外濾過工程にかけられた。次に、ＵＦ透過物は、ナノ濾過を使用して固形分２０〜３０％（好ましくは２５％）に濃縮され、そして、透過物は、５０〜８０℃の高温でイオン浸透クロマトグラフィー（さもなければ、大抵はイオン排除クロマトグラフィーと称される）にかけられた。溶出した物質は、２つの画分に分けられた。−最初の画分は、大部分のタンパク質（ＮＰＮを含む）、無機物及び３−ＳＬを含む帯電分子を含み、それに続く画分は、ラクトースなどの非帯電分子を含む。次に、３−ＳＬを含む最初の画分を、実施例１で示す一組の樹脂と接触させた。そして、３−ＳＬは最終的に陰イオン樹脂に取り込まれた。該工程は、添付図面の図３に要約される。

より詳細には、イオン浸透の工程は、６５０リットルのＣＲ１３１０Ｋを含むクロマトグラフカラムを使用し、プロセス水で較正された３メートルの高さの層を与えた。＋４〜７５℃の運転温度で評価を行い、高い温度で最も良い結果が得られた。ＵＦ透過物は、ナノ濾過によって濃縮され、固形分が約２２〜２５％、１１８〜３０４ｐｐｍ（平均２２０ｐｐｍ）の３’−シアリルラクトースを含むＮＦ残余分が得られた。そして、イオン排除工程として、この原料をイオン排除樹脂層と、それに続く水の中を通し、ナノ濾過した原料をポンプで送った。最適な結果として、樹脂の対ＮＦ残余分の１サイクルあたりのロード率は１：０．１で維持され、水の０．９ｂｖがそれに続いた（１ｂｖ＝全樹脂量、ｖｉｚ．＝６５０リットル）。０．３〜０．８６ｂｖ／時間の一定の流速が評価された。流速の変化は、得られたクロマトグラムの本質に、大きな影響を与えることはなかった。溶出した物質は、２つの画分に分けられた。−最初の画分は、無機物及びタンパク質（ＮＰＮを含む）とともに３’−シアリルラクトースを含み、それに続く第二の画分は、ほとんど純粋な状態のラクトースを含む。１サイクルによって得られた３’−シアリルラクトースを多く含む画分の実容量は、１３５リットルであった。固形分は０．５〜１％の間で異なり、３’−シアリルラクトースのレベルは、固形分で０．５〜１．３重量％であった。９５サイクル以上の操作における３’−シアリルラクトースの再生は、８０〜１００％の範囲にあり、再生の平均は８５％であった。

次に、９５０リットルの３−ＳＬを豊富に含む画分を、以下の樹脂に、順に通過させた。
・１５リットルのＩＭＡＣ ＨＰ３３６（ポリアクリル酸の弱酸性陽イオン）；
・２２リットルのＦＰＡ５５（アクリル系の弱塩基性陰イオン）；
・１７リットルのＨＰ１１１０（スチレン−ＤＶＢの強酸性陽イオン）；
・１７リットルのＦＰＡ５１（スチレン−ＤＶＢの弱塩基性陰イオン）。

３−ＳＬは、最後の陰イオン樹脂に取り込まれ、２８リットルの４．４％アンモニウムと、その後に続く５０リットルの脱塩水を用いて溶出された。溶出した物質は、約６〜１５重量％の３’−シアリルラクトースを含んでいた。そして、これを、３０リットルのＩＭＡＣ ＨＰ３３６（ポリアクリル酸の弱酸性陽イオン）と、その後に続く２３リットルのＦＰＡ５１（スチレン−ＤＶＢの弱塩基性陰イオン）とに接触させて、過剰のアンモニアを取り除き、最終生成物のｐＨを７〜９．５に調整した。固形分０．３〜１％の得られた生成物は、固形分あたりで０．５〜３重量％の３’−シアリルラクトースを含んでいた。最終生成物の灰分含量は１０％未満であり、ラクトース含量は３０〜５０％、残りがタンパク質であった。タンパク質の値の約２０〜５０％はＮＰＮであった。

＜実施例４＞
別の製造方法では、実施例３に記載のナノ濾過とイオン浸透工程によって製造された１，６００リットルの３−ＳＬを豊富に含む画分をポンプで送り、直径２００ｍｍのカラム内を通すことによって、以下の一組の樹脂と接触させた：
・１５リットルのＩＭＡＣ ＨＰ３３６（ポリアクリル酸の弱酸性陽イオン）；
・２２リットルのＦＰＡ５５（アクリル系の弱塩基性陰イオン）；
・１７リットルのＨＰ１１１０（スチレン−ＤＶＢの強酸性陽イオン）；
・１７リットルのＦＰＡ５１（スチレン−ＤＶＢの弱塩基性陰イオン）；
・１７リットルＨＰ１１１０（スチレン−ＤＶＢの強酸性陽イオン）；
・１７リットルのＦＰＡ５１（スチレン−ＤＶＢの弱塩基性陰イオン）。

３−ＳＬは、最後の陰イオン樹脂に取り込まれ、２８リットルの４．４％水酸化アンモニウムと、その後に続く５０リットルの脱塩水を用いて溶出された。溶出した物質は、約６〜１５重量％の３’−シアリルラクトースを含んでいた。そして、これを、３０リットルのＩＭＡＣ ＨＰ３３６（ポリアクリル酸の弱酸性陽イオン）と、その後に続く２３リットルのＦＰＡ５１（スチレン−ＤＶＢの弱塩基性陰イオン）に接触させて、過剰のアンモニアを取り除き、最終生成物のｐＨを７〜９．５に調整した。得られた生成物は、固形分で２０〜７０重量％にあたる非常に高い濃度の、精製された３’−シアリルラクトースを含んでいた。最終生成物の灰分含量は、１０％未満であり、残りがタンパク質であった。タンパク質の値の約１５〜３０％はＮＰＮであった。

＜実施例５＞
乳清透過物は、実施例１と２に関して説明したのと同様に、限外濾過工程にかけられた。ＵＦ透過物を本発明による二相の一組の樹脂と接触させ、最終的に３−ＳＬは陰イオン樹脂に取り込まれた。該工程は、添付図面の図１に要約したものの変形である。

３０〜８０ｐｐｍの３’−シアリルラクトースを含む固形分２〜６％のＵＦ透過物を使用した。
本実施例の第１相において、多量の上記ＵＦ残余分をポンプで送り、直径２００ｍｍのカラム内を通すことによって、以下の一組の樹脂の中を通された／送り込まれた：
・１５リットルのＩＭＡＣ ＨＰ３３６（ポリアクリル酸の弱酸性陽イオン）；
・２２リットルのＦＰＡ５５（アクリル系の弱塩基性陰イオン）；
・１７リットルのＨＰ１１１０（スチレン−ＤＶＢの強酸性陽イオン）；
・１７リットルのＦＰＡ５１（スチレン−ＤＶＢの弱塩基性陰イオン）。
ＵＦ残余分のロードのカットオフポイントは、排出水伝導率が約３００〜４００マイクロジーメンスに達したときのポイントに決定した。上記手順を３回連続して繰り返すことによって、残余分のロードは、各々６１０リットル、６５０リットル及び６００リットルとなった。上記の４つの樹脂カラムを通過して脱塩された３’−ＳＬを有する対象の生成物（残余分）は、１００リットルのプロセス水、上記の６８４リットル、７２４リットル及び６７４リットルの連続３回の繰り返しによって、第１相で得られた生成物と置き換えられた。

そして、本実施例の第２相では、８００リットルの第１相で溶出した物質を、１７リットルのＨＰ１１１０（スチレン−ＤＶＢの強酸性陽イオン）と、それに続く１７リットルのＦＰＡ５１（スチレン−ＤＶＢの弱塩基性陰イオン）とに接触させた。精製された３’−ＳＬを含む対象の生成物は、最後の樹脂に取り込まれ、そして２０リットルの１％塩化カリウムと、それに続く４５リットルのプロセス水を用いて溶出された。

第２相の２度の繰り返しにおいて、合計１２０リットルの溶出した生成物を得た。次に、これをナノ濾過、それに続く透析濾過にかけ、７．３リットルの残余分を製造した。この生成物は、固形分２７重量％の３’−シアリルラクトースを含む。

凍結乾燥の後、ナノ濾過とダイアフィルター（商標）にかけられた生成物２．９６リットルから、固体の３’−ＳＬ重量で３０重量％含む４２０ｇの乾燥生成物を製造した。最終物質の灰分含量は１６％であり、たんぱく質は３０％で、２％のＮＰＮを含んでいた。

＜実施例６＞
別の製造方法において、実施例３に記載されたイオン排除工程による３−ＳＬを多く含む画分は、ナノ濾過によって固形分約１２％にまで濃縮された。この物質１５ｍｌを１５０ｍｌのセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ２５でクロマトグラフし、固形分で４〜６重量％の３−ＳＬを含む最終生成物を得た。回収率は約９８％であった。市販されているトヨパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）（商標）ＨＷ４０、バイオゲル（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ）（商標）Ｐ−４、バイオゲル（商標）Ｐ−６又はその他バルク脱塩樹脂のような、セファデックスＧ１０を含む任意の脱塩樹脂を使用することができる。

上記実施例で示すように、本発明の単離の工程は、本質的に、透過物原料（実施例１の場合は未処理のＵＦ透過物、実施例２の場合はナノ濾過された透過物、又は、実施例３〜６の場合はイオン排除された原料）を以下の樹脂に通すことを含む：
・弱酸性陽イオン樹脂（例えば、Ｉｍａｃ ＨＰ３３６又はＷＫ４０）
・弱又は強陰イオン樹脂（例えば、ＦＰＡ５５又はＦＰＡ４２）
・強酸性陽イオン樹脂（例えば、Ｉｍａｃ ＨＰ１１１０又はＦＰＣ２３）
・弱又は強陰イオン樹脂（例えば、ＦＰＡ５１、ＦＰＡ５５又はＦＰＡ４２）

これは透過物原料の浄化をもたらす。浄化に続いて、適切な陰イオン交換樹脂に３−ＳＬを吸収することができる（好適な実施例は、ＦＰＡ５１であり、最も良い溶出をもたらした）。原料は陰イオン樹脂の前に陽イオン樹脂を通過でき、全ての３’−ＳＬが陰イオン樹脂に取り込まれる。先の陽イオンの有無に関わらず、強塩基性陰イオンを使用することは、３’−ＳＬが樹脂に取り込まれることにつながるが、また溶出媒体のより大きな溶出力をも必要とする。樹脂からの溶出は、水酸化アンモニウム、塩化カルシウム、ＮａＣｌ及びＫＣｌ又はこれらの組み合せを使用することで達成された。

＜実施例７＞
実施例５と同じ方針に沿って実施された別の系の実験において、３’−シアリルラクトースの溶出画分は様々な画分に分けられ、１００％純粋な３’−シアリルラクトースの画分は、収率が１９〜２０％に減少して得られた。

画分は、直接凍結乾燥すること、又は、適切な方法による固形分の濃縮に続いて、スプレー乾燥することができる。

負に帯電した分子は不要であり、及び／又は、３−ＳＬが陰イオン樹脂（ＦＰＡ５１）に選択的に付着する妨げとなるが、本発明の方法についての周辺の原理は、この負に帯電した分子を除くことから成る。３−ＳＬが陰イオン樹脂に捕えられる前に、３−ＳＬを負に帯電させるため、陽イオン樹脂は不可欠である。

任意の強陽イオン樹脂を使用した正に帯電した分子の除去に続いて、３−ＳＬが任意の陰イオン樹脂に捕えられることが予期される。しかし、驚くべきことに、そのようにはならず、３’−ＳＬと樹脂との間の結合が非常に弱く、任意の競合する陰イオン種の存在によって容易に分離することが示唆される。上記のように、一組である４つの樹脂全てを有することは不可欠である。このような場合、ナノ濾過された透過物が出発物質として使用されると（実施例２参照）、弱陰イオン樹脂を含む最後のカラムで３−ＳＬを捕えるためには、前記の４つの樹脂の存在に加えて、再度これら４つの樹脂をこの順番で有することが非常に望ましい。

純粋な天然状態の３−ＳＬは非常に弱い負電荷を帯びた分子として存在している。Ｈ^＋イオンを除くほとんどすべてのカチオン種を除去し、多くの競合する陰イオンを除去した場合に、陰イオン樹脂は３−ＳＬのみを捕えることができる。本発明の方法は、固形分で３〜６０重量％の異なった濃度範囲である場合に、精製された３−ＳＬを得ることを目的とする。この目的を達成することは容易ではない。第一の弱酸性陽イオンは、ＣａやＭｇなど、多くの二価の陽イオンや、それほどではないにせよ、乳清の中に存在するＮａ、Ｋや、特定のアミノ酸やタンパク質をも取り除く。第二の樹脂である弱塩基性陰イオンは、塩化物、リン酸塩及び硫酸塩などの負電荷を帯びた一部の分子や、ある程度のクエン酸塩、乳酸塩、並びに負電荷のアミノ酸やタンパク質を捕える。次に、第三の樹脂は、残存する陽イオンのほとんど全てを捕える強い陽イオン樹脂である。第四の樹脂は、選択的に、３−ＳＬ上に残存する陰イオンをどれでも捕える弱塩基性陰イオンである。最小限の３−ＳＬがこのカラムに捕えられることを確実にするために、第四の樹脂によって取り込まれた３−ＳＬのどれもが、競合する陰イオンによって選択的にたたき出されることが、工程の上で好ましい。一度、原料が浄化されると（又は９０％以上が脱塩されると）、事実上、すべての残存する陽イオンを取り除くために、強酸性陽イオンを放出することができ、その結果、３−ＳＬを天然の又は自由な状態（“Ｈ−３−ＳＬ”の可能性が最も高い）で存在することができる。次に、−ＯＨ型の弱い陰イオンは、容易に“Ｈ−３−ＳＬ”と反応し（ＨはＯＨと反応して水になる）、負に帯電した３−ＳＬは弱陰イオン樹脂によって容易に捕えられる。

上記より明らかなように、３’−ＳＬを含む原料を樹脂と接触させる前に、透析、電気透析、透析濾過などの群から選択される手順／技術によって、樹脂上のイオンによる負荷を軽減させる手法を選択できる。これは、樹脂の耐荷性を高める一方で、対象のオリゴ糖を単離する基本的な原則を変更しない。

すべての場合において、３−ＳＬをとらえる際に技術的に等しくうまく作用するのは強塩基性陰イオンであるが、最後の樹脂は弱塩基性陰イオンである。一方、強塩基性陰イオンからの溶出は弱塩基性陰イオンと比較してより困難である。ＫＣｌ、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ_２などの塩化物、又はこれらの組み合せが好ましい。他の揮発性塩としては、水酸化アンモニウム、酢酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム、ギ酸、酢酸などが含まれる。

陰イオンカラムからの溶出に続き、アンモニア及び／又はＣａＣｌ_２が使用されたときはＣａを、ＫＣｌが使用されたときはＫを取り除くために、原料を弱酸性陽イオンと接触させ、それに続いてＦＰＡ５１などの弱い陰イオンに接触させることで、中性のポイントまで戻してｐＨを調整する。そしてＫＣｌ又はＣａＣｌ_２が使用された場合、過剰の塩化物を取り除く。または、原料をナノ濾過及び／又はダイアフィルターにかけ、生成物中の所望の目標とする規格を達成することができる。

また、当業者は、３’−シアリルラクトースを含む溶出画分の部分を得る技術を使用した場合、たとえ収量に妥協したとしても、純度は１００％である所望の生成物を得ることができる。

実施例は、製造方法を３’−ＳＬに限定して説明しているが、透過物中には、タンパク質、アミノ酸類及び他のオリゴ糖類など、対象となる様々な成分が存在し、本明細書中に記載された同様の操作原理を使用することで、分離が成功する。さらに、溶出溶液の濃度を変えることによって、樹脂技術のいずれの当業者であっても、吸着された原料を選択的に樹脂から分画することで、純度を上げることができる。

Claims (22)

1. ３’−シアリルラクトース、６’−シアリルラクトース、及び／又は陰イオン性オリゴ糖類を、チーズ乳清から単離及び／又は精製する方法であって、以下の工程を含む方法：
   チーズ乳清を少なくとも一組のイオン交換樹脂に接触させることによりチーズ乳清を脱塩する工程であって、前記一組とは、第一の弱酸性陽イオン樹脂、第一の弱塩基性陰イオン樹脂、第二の強酸性陽イオン樹脂、及び第二の弱塩基性陰イオン樹脂を含む、工程；
   該脱塩されたチーズ乳清を、第三の強酸性陽イオン樹脂、それに続く弱塩基性陰イオン樹脂を含む二つのさらなるイオン交換樹脂に接触させる工程であって、３’−シアリルラクトース、６’−シアリルラクトース、陰イオン性オリゴ糖類、及び／又はタンパク質が弱塩基性陰イオン樹脂に取り込まれる、工程；及び、
   弱塩基性陰イオン樹脂から３’−シアリルラクトース、６’−シアリルラクトース、陰イオン性オリゴ糖類、及び／又はタンパク質を溶出させる工程。
2. イオン交換樹脂に接触する前にチーズ乳清を限外濾過にかけて、タンパク質濃縮物とチーズ乳清透過物とを供給し、そこで該チーズ乳清透過物がイオン交換樹脂に接触する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. チーズ乳清又はチーズ乳清透過物が、樹脂を通過する前に、濃縮工程にかけられる、請求項１又は２に記載の方法。
4. ３’−シアリルラクトース、６’−シアリルラクトース、及び／又は陰イオン性オリゴ糖類の単離及び精製を改良するために、チーズ乳清又はチーズ乳清透過物が追加の手順にかけられ、該追加の手順が、透析、電気透析、透析濾過、ナノ濾過、及びイオン交換樹脂から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 濃縮された原料が少なくとも一組の樹脂と接触する前に、ナノ濾過を使用してチーズ乳清又はチーズ乳清透過物を濃縮する工程をさらに含む、請求項４に記載の方法。
6. イオン浸透クロマトグラフィー又はイオン排除クロマトグラフィーによって、濃縮されていない又は濃縮された、チーズ乳清又はチーズ乳清透過物中の３’−シアリルラクトース、６’−シアリルラクトース、及び／又は陰イオン性オリゴ糖類の相対的な濃度を増加させることをさらに含み、３’−シアリルラクトース、６’−シアリルラクトース、及び／又は陰イオン性オリゴ糖類を含む帯電した分子を含む濃縮された第一の画分と、それに続く第二の画分とが提供され、その後、第一の画分が少なくとも一組の樹脂と接触する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 濃縮された第一の画分を少なくとも一組の樹脂と接触させて、脱塩された濃縮画分を得る、請求項６に記載の方法。
8. 濃縮された画分を少なくとも一組の樹脂と接触させて、３’−シアリルラクトース、６’−シアリルラクトース、及び／又は陰イオン性オリゴ糖類をさらなる陰イオン樹脂に吸着させる、請求項６又は７に記載の方法。
9. 少なくとも５０℃の高温でイオン浸透クロマトグラフィーを行う工程をさらに含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. 高温とは５０℃〜８０℃である、請求項９に記載の方法。
11. 適切に希釈されたアルカリ、塩、緩衡剤、又は酸の溶液を使用することで、さらなる陰イオン樹脂から３’−シアリルラクトース、６’−シアリルラクトース、及び／又は陰イオン性オリゴ糖類を溶出する工程をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記溶出に、アンモニウム塩を使用する、請求項１１に記載の方法。
13. 前記溶出に、アルカリ土類金属の塩化物塩、又は任意の二価陽イオンの塩化物塩を使用する、請求項１１に記載の方法。
14. 適切な陽イオン樹脂、それに続く弱塩基性陰イオン樹脂と接触させることにより、溶出した原料を浄化する工程をさらに含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 透析濾過、ナノ濾過、電気透析、及び透析からなる群より選択された手段によって、溶出した原料を浄化する工程をさらに含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
16. ナノ濾過及び／又は蒸発及び／又は乾燥によって、溶出した原料を濃縮する工程をさらに含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 第二の強酸性陽イオン樹脂がスチレン−ＤＶＢ系の強酸性陽イオンである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 第二の弱塩基性陰イオン樹脂がスチレン−ＤＶＢ又はアクリル系の弱塩基性陰イオンである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 第三の陽イオン樹脂がスチレン−ＤＶＢ系の強酸性陽イオンである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法によるチーズ乳清の３’−シアリルラクトース、６’−シアリルラクトース、及び／又は陰イオン性オリゴ糖類の製造を含む、酪農製品を製造する方法。
21. 溶出工程からの３’−シアリルラクトース、６’−シアリルラクトース、及び／又は陰イオン性オリゴ糖類を、酪農製品のストリームと接触させる工程をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
22. 酪農製品が乳製品である、請求項２０又は２１に記載の方法。

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