CN102471763A

CN102471763A - 果糖基氨基酸氧化酶

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Publication number: CN102471763A
Application number: CN2010800343425A
Authority: CN
Inventors: K.索德; K.伊克布库罗
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2009-08-03
Filing date: 2010-08-02
Publication date: 2012-05-23
Anticipated expiration: 2030-08-02
Also published as: PL2462223T3; WO2011015326A2; US20120208226A1; CN102471763B; WO2011015326A8; EP2287295A1; EP2462223B1; WO2011015326A3; ES2720287T3; JP5897463B2; JP2013500729A; EP2462223A2; US8497083B2

Abstract

公开了突变型果糖基氨基酸氧化酶，其在参与质子传递系统的氨基酸残基处被修饰。所述突变型果糖基氨基酸氧化酶具有降低的氧化酶活性，同时基本上保留它的脱氢酶活性。本发明也提供了用于测量糖化蛋白的测定装置和测定方法。

Description

果糖基氨基酸氧化酶

技术领域

本发明涉及用于试剂盒和传感器中的果糖基氨基酸氧化酶(也称作果糖基胺氧化酶)，所述试剂盒和传感器用于测量糖化的蛋白，诸如糖化的白蛋白、果糖基肽、HbA1c和果糖基缬氨酸 (FV)。更具体地，本发明涉及具有降低的氧化酶活性的突变型果糖基氨基酸氧化酶。

背景技术

糖化的蛋白经由蛋白上的氨基和糖的还原末端之间的共价键非酶促地产生，也称作阿马多里(Amadori)化合物。在血液中，葡萄糖会结合在血红蛋白的β-链的N-端处的缬氨酸，生成糖化的血红蛋白(糖血红蛋白; HbA1c)。与正常健康个体相比，在遭受糖尿病的患者中，HbA1c与血红蛋白的丰度比更高，且已知血液中HbA1c的浓度会反映过去几周的血糖水平。因而，在糖尿病诊断的临床试验中，和在遭受糖尿病的患者的血糖控制中，血液中HbA1c的浓度是非常重要的。使用对果糖基缬氨酸或果糖基缬氨酰组氨酸具有特异性的酶，可以测量血液中的HbA1c浓度。

已经从不同种类的菌株中分离出果糖基氨基酸氧化酶，且已经证实，使用这样的酶，可以分析糖化的蛋白，诸如糖化的白蛋白、HbA1c和果糖基氨基酸(JP A 61-268,178; JP A 61-280,297; JP A 03-155,780; JP A 05-192,193; JP A 07-289,253; JP A 08-154,672; JP A 2001-95598; JP A 2003-79386; JP A 2003-235585; Agric. Biol. Chem., 53(1), 103-110, 1989; Agric. Biol. Chem., 55(2), 333-338, 1991; J. Biol. Chem., 269(44), 27297-27301, 1994; Appl. Environ. Microbiol., 61(12), 4487-4489, 1995; Biosci. Biotech. Biochem., 59(3), 487-491, 1995; J. Biol. Chem., 270(1), 218-224, 1995; J. Biol. Chem., 271(51), 32803-32809, 1996;和J. Biol. Chem., 272(6), 3437-3443, 1997)。

果糖基氨基酸氧化酶是一种FAD-依赖性的酶，该酶催化这样的反应：其中氧化果糖基氨基酸，以产生2-酮-D-葡萄糖和对应的氨基酸，并产生FAD 的还原形式 (FADH2)。FADH2又将电子传递给电子受体，并转化成它的氧化形式。在有氧存在下，FADH2优先将电子传递给氧分子，而不是人造电子受体(也称作介质或电子介质)。因而，当通过含有介质的果糖基氨基酸氧化酶测定果糖基氨基酸时，反应系统中的溶解氧水平会极大地影响测定结果。在使用人造电子受体的护理点检验装置对血液样品的临床试验中，这样的缺点是特别显著的。在采用人造电子介质的酶传感器条带中使用的酶理想地具有对氧的低活性。

因此，本发明的目的是，提供一种酶，具体地是果糖基氨基酸氧化酶，其活性更少地受到溶解氧水平的影响。

发明内容

概括地讲，本申请的发明人已经能够提供一种酶，具体地是果糖基氨基酸氧化酶，其活性更少地受到溶解氧水平的影响。更具体地，这已经如下实现：降低在它的野生型形式主要显示出氧化酶活性的酶的氧化酶活性，并优选地，同时增加该酶的脱氢酶活性。如下面将更详细地描述的，这已经通过突变野生型酶来实现。

发明人已经制备了果糖基氨基酸氧化酶的不同突变体，并令人惊讶地发现，特定类型的突变体会表现出降低的氧化酶活性，同时基本上保留脱氢酶活性，尤其是染料-介导的脱氢酶活性。

本发明提供了突变型果糖基氨基酸氧化酶，其通过用选自Ala、Cys、Phe、Met、Ser和Val的氨基酸残基置换氨基酸残基Asn而在SEQ ID NO: 1所述的氨基酸序列的位置56的对应位置处被修饰。

在一个优选的实施方案中，本发明的突变型果糖基氨基酸氧化酶具有与野生型果糖基氨基酸氧化酶相比降低的氧化酶活性，并优选地具有与野生型果糖基氨基酸氧化酶相比增加的脱氢酶活性。优选地，本发明的突变型果糖基氨基酸氧化酶具有野生型果糖基氨基酸氧化酶的氧化酶活性的30%或更少的氧化酶活性，并优选地也具有野生型果糖基氨基酸氧化酶的脱氢酶活性的50%或更多的脱氢酶活性。也优选地，本发明的突变型果糖基氨基酸氧化酶具有与野生型果糖基氨基酸氧化酶相比增加的脱氢酶活性。

在另一个优选的实施方案中，本发明的突变型果糖基氨基酸氧化酶具有选自SEQ ID NO: 1-16的氨基酸序列，其中在SEQ ID NO: 1所述的氨基酸序列的位置56的对应位置处的氨基酸残基Asn被选自Ala、Cys、Phe、Met、Ser和Val的氨基酸残基置换。优选地，本发明的突变型果糖基氨基酸氧化酶具有在SEQ ID NO: 1中所述的氨基酸序列，其中在位置56处的氨基酸残基Asn被选自Ala、Cys、Phe、Met、Ser和Val的氨基酸残基置换。更优选地，在SEQ ID NO: 1的位置109-124处的氨基酸序列: Ser Gly Tyr Gln Ala Leu Val Asp Ala Gly Leu Asp Ala Thr Asn Glu被下述序列置换：Lys Gln Tyr Gln Ala Leu His Asp Ala Gly Ala Gly Leu Glu Lys Thr His Ala。也优选地，本发明的突变型果糖基氨基酸氧化酶具有在SEQ ID NO: 2中所述的氨基酸序列，其中在位置47处的氨基酸残基Asn被选自Ala、Cys、Phe、Met、Ser和Val的氨基酸残基置换。也优选地，本发明的突变型果糖基氨基酸氧化酶具有在SEQ ID NO: 3中所述的氨基酸序列，其中在位置52处的氨基酸残基Asn被选自Ala、Cys、Phe、Met、Ser和Val的氨基酸残基置换。也优选地，本发明的突变型果糖基氨基酸氧化酶具有在SEQ ID NO: 7中所述的氨基酸序列，其中在位置56处的氨基酸残基Asn被选自Ala、Cys、Phe、Met、Ser和Val的氨基酸残基置换。更优选地，在SEQ ID NO: 7的位置61-72处的氨基酸序列 Ile Arg Leu Arg Asn Lys Val Asp Leu Gln Met Ser 被下述序列置换：Val Ser Leu Arg Asn Pro Val Asp Leu Gln Leu Ala。

在另一个方面，本发明提供了一种分离的多核苷酸，其编码本发明的突变型果糖基氨基酸氧化酶。

在另一个方面，本发明提供了一种载体，所述载体包含本发明的多核苷酸。

在另一个方面，本发明提供了用本发明的载体转化的宿主细胞。

在另一个方面，本发明提供了一种用于测定样品中的糖化蛋白的方法，所述方法包括：使所述样品接触本发明的果糖基氨基酸氧化酶，并测量被果糖基氨基酸氧化酶氧化的糖化蛋白的量。

在另一个方面，本发明提供了一种用于测定HbA1c的方法，所述方法包括：消化样品中的HbA1c，以产生果糖基缬氨酸或果糖基缬氨酰组氨酸，使所述果糖基缬氨酸或果糖基缬氨酰组氨酸接触本发明的果糖基氨基酸氧化酶，并测量氧化的果糖基缬氨酸或果糖基缬氨酰组氨酸的量。

在另一个方面，本发明提供了一种用于测定样品中的果糖基缬氨酸、果糖基缬氨酰组氨酸、HbA1c或果糖基六肽的装置，所述装置包含：本发明的果糖基氨基酸氧化酶，和电子传递介质。

在另一个方面，本发明提供了一种用于测定样品中的果糖基缬氨酸、果糖基缬氨酰组氨酸、HbA1c或果糖基六肽的试剂盒，所述试剂盒包含：本发明的果糖基氨基酸氧化酶，和电子传递介质。

在另一个方面，本发明提供了一种酶电极，其具有固定化在所述电极上的本发明的果糖基氨基酸氧化酶。

在另一个方面，本发明提供了一种用于测定果糖基缬氨酸、果糖基缬氨酰组氨酸、HbA1c或果糖基六肽的酶传感器，所述酶传感器包含本发明的酶电极作为工作电极。

在另一个方面，本发明提供了具有在SEQ ID NO: 1中所述的氨基酸序列的突变型果糖基氨基酸氧化酶，其中在SEQ ID NO: 1的位置61-72处的氨基酸序列: Val Ser Leu Arg Asn Pro Val Asp Leu Gln Leu Ala被下述序列置换：Ile Arg Leu Arg Asn Lys Val Asp Leu Gln Met Ser。在另一个方面，本发明提供了具有在SEQ ID NO: 1中所述的氨基酸序列的突变型果糖基氨基酸氧化酶，其中在SEQ ID NO: 1的位置109-124处的氨基酸序列: Ser Gly Tyr Gln Ala Leu Val Asp Ala Gly Leu Asp Ala Thr Asn Glu被下述序列置换：Lys Gln Tyr Gln Ala Leu His Asp Ala Gly Ala Gly Leu Glu Lys Thr His Ala。在另一个方面，本发明提供了具有在SEQ ID NO: 7中所述的氨基酸序列的突变型果糖基氨基酸氧化酶，其中在SEQ ID NO: 7的位置61-72处的氨基酸序列: Ile Arg Leu Arg Asn Lys Val Asp Leu Gln Met Ser被下述序列置换：Val Ser Leu Arg Asn Pro Val Asp Leu Gln Leu Ala。在另一个方面，本发明提供了具有在SEQ ID NO: 7中所述的氨基酸序列的突变型果糖基氨基酸氧化酶，其中在SEQ ID NO: 1的位置109-126处的氨基酸序列: Lys Gln Tyr Gln Ala Leu His Asp Ala Gly Ala Gly Leu Glu Lys Thr His Ala被下述序列置换：Ser Gly Tyr Gln Ala Leu Val Asp Ala Gly Leu Asp Ala Thr Asn Glu。

附图说明

图1显示了在一些真核FAOD的N-端附近的氨基酸序列的比对。

图2显示了果糖基氨基酸氧化酶的反应系统。

图3显示了纯化的N1-1 FAOD N47A突变体的氧化酶和脱氢酶活性。

图4显示了粗的PnFPOX野生型和Asn56突变体的氧化酶和脱氢酶活性。

图5显示了PnFPOX Asn56突变体的动力学参数。

图6显示了纯化的PnFPOX N56A突变体的氧化酶和脱氢酶活性。

图7显示了纯化的阿马多里酶II野生型和N52A突变体的氧化酶和脱氢酶活性。

图8显示了纯化的阿马多里酶II野生型和N52A突变体的动力学参数。

图9显示了使用具有PnFPOX N56A或野生型FAOD的电极测定FV 浓度。

具体实施方式

已知果糖基氨基酸氧化酶 (FAOD)存在于多种真核和原核菌株中。表1显示了迄今为止分离或预测的FAOD的一些实例。

表1 不同的FAOD

根据底物特异性，可以将真核FAOD分组：(i) 偏好α-果糖基氨基酸(FAOD-P、FAOD-U、FPOX-E、FPOX-C和PnFPOX)，(ii) 偏好ε-果糖基氨基酸(FAOD-F、FAOD-A、阿马多里酶I和FAOD-Ao1)，和(iii) 对α-和ε-糖化的氨基酸具有类似的活性 (阿马多里酶II、FAOD-Ao2和N1-1 FAOD)。一般而言，对α-果糖基氨基酸有活性的FAOD可用于测定α-果糖基缬氨酸和HbA1c，对ε-果糖基氨基酸有活性的FAOD可用于测定ε-果糖基赖氨酸和糖化的白蛋白。本领域技术人员会理解，将突变导入酶中可能改变它对α-或ε-果糖基氨基酸的偏好。

本发明提供了突变型果糖基氨基酸氧化酶(PnFPOX)，其通过用选自Ala、Cys、Phe、Met、Ser和Val的氨基酸残基置换氨基酸残基Asn而在SEQ ID NO: 1所述的氨基酸序列的位置56的对应位置处被修饰。

本文使用的术语蛋白的“突变体”表示这样的变体蛋白：其含有在蛋白上的指定位置处的一个或多个氨基酸残基的置换。术语突变体也用于编码这样的突变体蛋白的多核苷酸。

本文使用的短语 “……的对应位置”是指，当使用Vector NTI的软件AlignX使用缺省参数 (可从Invitrogen得到; 参见，Lu, G.,和Moriyama, E. N. (2004) Vector NTI, a balanced all-in-one sequence analysis suite. Brief Bioinform 5, 378-88)时，查询氨基酸序列中与参照氨基酸序列的氨基酸残基对齐的氨基酸残基的位置。因而，“在SEQ ID NO: 1所述的氨基酸序列的位置56的对应位置处的Asn残基”是指，当使用Vector NTI的AlignX（使用缺省参数）将查询氨基酸序列与SEQ ID NO:1比对时，查询氨基酸序列中与SEQ ID NO: 1的Asn56对齐的Asn残基。应当指出，该术语也包括SEQ ID NO: 1本身的Asn47。

图1显示了在一些真核FAOD (来自Penicillum janthinelum AKU 3413的FAOD-P，来自单格孢属JS-103的FAOD-U，来自Eupenicillum terrenum ATCC 18547的FPOX-E，来自Coniochaeta属NISL 9330的FPOX-C，来自Phaeosphaeria nodorum的PnFPOX，来自尖孢镰刀菌NBRC 9972的FAOD-F，来自土曲霉 GP1的FAOD-A，来自烟曲霉的阿马多里酶I，来自米曲霉的FAOD-Ao1，来自烟曲霉的阿马多里酶II, 来自米曲霉的FAOD-Ao2，和来自毕赤酵母N1-1的N1-1 FAOD)的N-端附近的保守区内的氨基酸序列的比对。这些FAOD的整个序列如SEQ ID NO: 1-12所述。使用Vector NTI套件6.0的AlignX应用程序，进行比对。箭头指示与N1-1 FAOD的Asn47对应的残基。括号中的数字指示图1的最左边的“P”在由SEQ ID NO表示的每个氨基酸序列中的位置。本领域技术人员会理解，其它比对软件程序诸如Blast会提供相同的或基本上相同的比对。

从图1可见，在真核FAOD中，在含有N1-1 FAOD的Asn47的区域中的氨基酸序列是高度保守的。因此，本领域技术人员使用用于序列比对的任意可商业得到的软件程序，可以容易地鉴别与保守区内的N1-1 FAOD的Asn47相对应的Asn残基，并理解，通过在该Asn残基处导入修饰，可以容易地制备突变型果糖基氨基酸氧化酶。

在另一个优选的实施方案中，本发明的突变型果糖基氨基酸氧化酶具有选自SEQ ID NO: 1-15 的氨基酸序列，其中在SEQ ID NO: 1所述的氨基酸序列的位置56的对应位置处的氨基酸残基Asn被选自Ala、Cys、Phe、Met、Ser和Val的氨基酸残基置换。优选地，所述Asn残基被Ala置换。

在一个优选的实施方案中，本发明的突变型果糖基氨基酸氧化酶具有在SEQ ID NO: 1中所述的氨基酸序列(PnFPOX)，其中在位置56处的氨基酸残基Asn被选自Ala、Cys、Phe、Met、Ser和Val的氨基酸残基置换。优选地，所述Asn残基被Ala置换。在另一个优选的实施方案中，本发明的突变型果糖基氨基酸氧化酶具有在SEQ ID NO: 2中所述的氨基酸序列(N1-1)，其中在位置47处的氨基酸残基Asn被选自Ala、Cys、Phe、Met、Ser和Val的氨基酸残基置换。在另一个优选的实施方案中，本发明的突变型果糖基氨基酸氧化酶具有在SEQ ID NO: 3中所述的氨基酸序列(阿马多里酶II)，其中在位置52处的氨基酸残基Asn被选自Ala、Cys、Phe、Met、Ser和Val的氨基酸残基置换。

本发明的突变型果糖基氨基酸氧化酶表现出降低的氧化酶活性，同时基本上保留脱氢酶活性。图2 解释了果糖基氨基酸氧化酶的反应方案。

本文使用的“氧化酶活性”是果糖基氨基酸氧化酶的催化果糖基氨基酸的氧化以生成2-酮-D-葡萄糖和对应的氨基酸的酶活性(Vmax)，其中使用氧作为电子受体。可以如下测定氧化酶活性：通过本领域已知的任意方法，测量产生的H₂O₂的量，例如，通过用于H₂O₂检测的试剂，诸如4AA/TODB/POD (4-氨基安替比林/N,N-二(4-磺丁基)-3-甲基苯胺二钠盐/辣根过氧化物酶)，或通过Pt 电极。如本文使用的，在相对活性或定量活性的上下文中，将氧化酶活性具体地定义为，每单位时间氧化的底物(果糖基氨基酸)的摩尔量，这通过在10 mM PPB、pH 7.0、1.5 mM TODB、2 U/ml辣根过氧化物酶(POD)和1.5 mM 4-氨基安替比林 (4AA)中在25 ℃时产生的H₂O₂的量来测量。通过分光光度计法，可以在546 nm测量醌亚胺染料的形成。

本文使用的“脱氢酶活性”是果糖基氨基酸氧化酶的催化果糖基氨基酸的氧化以生成2-酮-D-葡萄糖和对应的氨基酸的酶活性(Vmax)，其中使用除了氧以外的电子介质作为电子受体。可以如下测定脱氢酶活性：通过测量传递给所述介质的电子的量，例如使用mPMS/DCIP (1-甲氧基-5-甲基吩嗪

甲基硫酸盐/ 2,6-二氯靛酚)、cPES (三氟-乙酸盐-1-(3-羧基-丙氧基)-5-乙基-吩嗪

、NA BM31_1144 (N,N-二-(羟基乙基)-3-甲氧基-亚硝基苯胺盐酸盐、NA BM31_1008 (N,N-二-羟基-乙基-4-亚硝基苯胺)和N-N-4-二甲基-亚硝基苯胺。

如本文使用的，在相对活性或定量活性的上下文中，将脱氢酶活性具体地定义为，每单位时间氧化的底物(果糖基氨基酸)的摩尔量，这通过在10 mM PPB (pH 7.0)、0.6 mM DCIP和6 mM 甲氧基 PMS (mPMS)中在25 ℃时传递给所述介质的电子的量来测量。

本发明的突变型果糖基氨基酸氧化酶具有与野生型果糖基氨基酸氧化酶相比降低的氧化酶活性，同时基本上保留脱氢酶活性。

优选地，本发明的突变型果糖基氨基酸氧化酶具有野生型果糖基氨基酸氧化酶的氧化酶活性的50%或更少的氧化酶活性。更优选地，本发明的突变型果糖基氨基酸氧化酶具有野生型果糖基氨基酸氧化酶的氧化酶活性的40%或更少、更优选30%或更少、甚至更优选20%或更少、最优选15%或更少的氧化酶活性。也优选地，本发明的突变型果糖基氨基酸氧化酶具有野生型果糖基氨基酸氧化酶的脱氢酶活性的50%或更多的脱氢酶活性。更优选地，本发明的突变型果糖基氨基酸氧化酶具有野生型果糖基氨基酸氧化酶的脱氢酶活性的70%或更多、更优选90%或更多、甚至更优选100%或更多、最优选超过100%的脱氢酶活性。

在野生型果糖基氨基酸氧化酶中，氧化酶活性和脱氢酶活性处于相当的水平，脱氢酶/氧化酶活性之比是约0.8-1.2。当在测定系统中存在溶解氧时，由底物的氧化产生的电子优先传递给氧。因而，在有电子介质存在下测得的酶活性会受到溶解氧浓度的极大影响。相比而言，本发明的突变型果糖基氨基酸氧化酶的脱氢酶/氧化酶活性之比是约2.0或更高、优选4.0或更高、更优选10或更高、甚至更优选20或更高、最优选40或更高。由于脱氢酶活性超过氧化酶活性，本发明的果糖基氨基酸氧化酶的酶活性会更少地受到溶解氧浓度的影响，当在血液样品的临床诊断中使用果糖基氨基酸氧化酶时，这是有利的。

在另一个方面，本发明提供了果糖基氨基酸氧化酶，其中一个或多个环区域被修饰或突变。PnFPOX对果糖基六肽显示出的氧化酶活性水平比FVH的1%还低，而FPOX-C没有显示出活性。另一方面，FPOX-C显示出比PnFPOX更高的对FVH的活性。对比两种氧化酶的氨基酸序列，在它们的环区域中发现了FAOD和FPOX之间的显著差异。

环1区域

环2区域

在环1区域 (12个氨基酸)，Pn FPOX和FPOX-C之间有5个氨基酸残基是不同的。在环2区域 (16个氨基酸)，观察到2个氨基酸插入和7个氨基酸置换。

令人惊讶地发现，一些嵌合的环突变体（其中1 PnFPOX和FPOX-C的环区域彼此交换）表现出提高的活性。如在下面的实施例8中所证实的，PnFPOX（其中它的环2区域被FPOX-C 环2区域替换）显示出比野生型PnFPOX更高的对FV、FVH和果糖基六肽 (F-HP)的氧化酶活性。FPOX-C（其中它的环1区域被PnFPOX 环1区域替换）显示出对F-HP的氧化酶活性，这在野生型FPOX-C中未检测到。另外，具有N56A突变的嵌合的环突变体也显示出降低的氧化酶活性和增加的脱氢酶活性，如在源自PnFPOX和FPOX-C的N56A突变体中所观察到的。特别优选的嵌合的环突变体是PnFPOX，其中环2区域被置换为来自FPOX-C的环2区域，且Asn56被置换为Ala。另一种特别优选的嵌合的环突变体是FPOX-C，其中环1区域被置换为来自PnFPOX的环1区域，且Asn56被置换为Ala。这些结果表明，来自PnFPOX的环1区域和来自FPOX-C的环2区域的组合，会提供更高的对果糖基缬氨酸和果糖基缬氨酰组氨酸以及对果糖基六肽的活性。

在另一个方面，本发明提供了一种分离的多核苷酸，其编码本发明的突变型果糖基氨基酸氧化酶。从公开的数据库，可以容易地得到编码果糖基氨基酸氧化酶的多核苷酸的核苷酸序列。使用PCR或其它已知的技术，可以从各个生物体的基因组克隆出编码野生型果糖基氨基酸氧化酶的多核苷酸。通过定点诱变、PCR 诱变或本领域众所周知的任意其它技术，可以导入突变。使用本领域可得到的用于序列比对的任意软件，可以鉴别出要突变的Asn残基。或者，使用一系列化学合成的寡核苷酸，通过PCR，可以制备编码突变型果糖基氨基酸氧化酶的多核苷酸，或完全合成。

可以如下制备突变的果糖基氨基酸氧化酶：将突变体基因插入适当的表达载体中，并将该载体导入适当的宿主细胞，诸如大肠杆菌细胞。培养转化体，可以从细胞或培养基收集在转化体中表达的果糖基氨基酸氧化酶。

通过本领域已知的的任意纯化技术，包括离子交换柱色谱法、亲和色谱法、液相色谱法、过滤、超滤、盐沉淀、溶剂沉淀、免疫沉淀、凝胶电泳、等电电泳和透析，可以纯化如此得到的重组的果糖基氨基酸氧化酶。

因而，本发明也包括：包含编码突变型果糖基氨基酸氧化酶的多核苷酸的载体，用这样的载体转化的宿主细胞，和如下制备本发明的突变型果糖基氨基酸氧化酶的方法：培养转化体，从培养物收集和纯化突变型果糖基氨基酸氧化酶。

本发明也包括：用于测定样品中糖化蛋白的方法。所述方法包括：使所述样品接触本发明的果糖基氨基酸氧化酶，并测量被果糖基氨基酸氧化酶氧化的糖化蛋白的量。本发明测定的糖化蛋白包括，例如，果糖基缬氨酸、果糖基缬氨酰组氨酸、HbA1c、果糖基六肽、糖化的白蛋白和其它果糖基氨基酸。在另一个方面，本发明提供了一种用于测定HbA1c的方法，所述方法包括：消化样品中的HbA1c，以产生果糖基缬氨酸，使所述果糖基缬氨酸接触本发明的果糖基氨基酸氧化酶，并测量氧化的果糖基缬氨酸的量。

在另一个方面，本发明提供了一种用于测定样品中的果糖基缬氨酸、果糖基缬氨酰组氨酸、HbA1c、果糖基六肽或糖化的白蛋白的装置，所述装置包含：本发明的果糖基氨基酸氧化酶，和电子传递介质。

所述测定装置可以具有与用于监测血糖水平的任意常规的、可商业得到的测电流生物传感器测试条带类似的结构。这样的装置的一个实例具有2个位于绝缘基质上的电极(工作电极和参比电极或反电极)、试剂孔和样品接收器。所述试剂孔含有本发明的突变的果糖基氨基酸氧化酶和介质。当将样品（诸如血液样品）加入样品接收器时，在样品中含有的果糖基氨基酸会与果糖基氨基酸氧化酶反应，产生电流，所示电流指示样品中果糖基氨基酸的量。从例如WO 2004/113900和US 5,997,817可以获知适合测定酶底物的电化学传感器的典型实例。作为电化学传感器的一个替代，可以使用光学检测技术。通常，这样的光学装置是基于在包含酶、电子传递介质和指示剂的试剂系统中所发生的颜色变化。使用荧光、吸收或发射测量，可以定量颜色变化。从例如US 7,008,799、US 6,036,919和US 5,334,508可以获知适合测定酶底物的光学装置的典型实例。

使用本发明的酶，可以构建出用于测量果糖基缬氨酸或果糖基缬氨酰组氨酸的试剂盒。除了本发明的果糖基氨基酸氧化酶以外，所述试剂盒含有测量必需的缓冲液、适当的介质，以及，在必要时，诸如过氧化物酶等酶、用于制备校正曲线的果糖基缬氨酸或果糖基缬氨酰组氨酸或其衍生物的的标准溶液和使用说明书。本发明的果糖基氨基酸氧化酶可以以不同的形式提供，例如，作为冻干的试剂或作为在适当储存溶液中的溶液。

使用本发明的酶，还可能构建糖化的白蛋白、HbA1c或果糖基六肽测定试剂盒。酶促地或化学地消化糖化的白蛋白、HbA1c或果糖基六肽，以产生果糖基氨基酸或果糖基肽，诸如果糖基缬氨酸、果糖基缬氨酰组氨酸和果糖基六肽，再使用本发明的果糖基氨基酸氧化酶对它们定量。以此方式，可以测定糖化的白蛋白、HbA1c或果糖基六肽.因此，本发明的用于糖化的白蛋白、HbA1c或果糖基六肽的测定试剂盒可以在上述试剂盒中另外含有水解试剂或蛋白酶，用于测量果糖基缬氨酸或果糖基缬氨酰组氨酸。

通过测量酶反应产生的电子的量，可以测定样品中果糖基氨基酸的浓度。各种传感器系统已经是本领域已知的，包括碳电极、金属电极和铂电极。本发明的突变的果糖基氨基酸氧化酶被固定化在电极上。固定化方法的实例包括：交联，包囊在大分子基质中，用透析膜、光学交联聚合物，导电聚合物、氧化-还原聚合物，和它们的任意组合包被。

当在使用碳电极的测电流系统中进行测量时，使用提供了固定化酶的金电极或铂电极作为工作电极，以及反电极(诸如铂电极)和参比电极 (诸如Ag/AgCl 电极)。将电极插入含有介质的缓冲液中，并保持在预定的温度。将预定的电压施加于工作电极，然后加入样品，并测量增加的电流值。在测定中使用的介质的实例包括铁氰化钾、二茂铁、锇衍生物、钌衍生物、吩嗪甲硫酸盐等。通常还可能使用所谓的双电极系统，该系统具有1个工作电极和一个反电极或假参比电极。

此外，在使用碳电极、金电极或铂电极的测电流系统中使用固定化的电子介质，可以测定果糖基氨基酸。与在大分子基质中的电子介质（诸如铁氰化钾、二茂铁、锇衍生物、吩嗪甲硫酸盐）一起，将酶通过吸附或共价键固定化在电极上，以制备工作电极。将它与反电极 (诸如铂电极)和参比电极(诸如Ag/AgCl 电极)一起插入缓冲液中，并保持在预定的温度。将预定的电压施加于工作电极，然后加入样品，并测量增加的电流值。

为了制备用于测量糖化的白蛋白、HbA1c或果糖基六肽的传感器，将上述的用于测量果糖基氨基酸的传感器进一步与含有固定化的蛋白水解酶(诸如蛋白酶)的膜相组合，以构建复合传感器。基于多种酶的组合的连续反应的这种复合传感器的结构是本领域众所周知的。参见，例如，Anthony P. F. Tuner, Isao Karube和George S. Wilson的“Biosensor - Fundamental and Applications”, Oxford University Press, 1987。

在本说明书中引用的所有专利和参考文献的内容通过引用整体并入本文。

实施例

下面的实施例将详细地例证本发明，尽管本发明不限于那些实施例。

实施例1

N1-1 FAOD突变体的制备和表征

单体的肌氨酸氧化酶(MSOX)的结构-功能关系的研究揭示，将电子从FAD传递至氧所涉及的质子传递系统(PRS)包含Thr48和Lys 265以及4个H₂O 分子 (Trickey 等人, Structure, 7, 331-345, 1999)。来自毕赤酵母N1-1菌株的果糖基氨基酸氧化酶(N1-1 FAOD, SEQ ID NO: 2)的活性部位与MSOX具有高度同源性，特别是在预期负责质子传递系统的保守残基中。

使用MSOX 结构，构建了N1-1 FAOD的预测的结构模型，预测氨基酸残基 Asn44、Ser46、Asn47、Lys48和Lys269参与从FAD的质子和电子传递。将单个突变或双突变导入那些氨基酸残基中，目的是，修饰N1-1 FAOD的电子受体可用性。

使用QuickChange^?方法 (Stratagene)，使用N1-1 FAOD野生型基因作为模板，通过定点诱变，建立N1-1 FAOD单突变体的表达载体。设计引物，以在Asn44、Ser46、Asn47、Lys48或Lys269处导入突变。用Dpn I消化扩增的产物，并转化进大肠杆菌DH5α中，在LB 琼脂培养基 (50 μg/ml 卡那霉素)中在37 ℃温育过夜。在ABI Prism 3130遗传分析仪上，使用ABI Prism BigDye Terminator循环测序试剂盒v3.0，验证克隆的突变序列。然后，用Nco I和Sal I消化提取的质粒，并连接进用Nco I和Sal I消化的pET28(a)载体中。在LB 琼脂培养基 (50 μg/ml 卡那霉素)中在37 ℃温育用连接混合物转化的大肠杆菌BL21(DE3)细胞过夜。使用相同的方法，通过引物的组合，建立双突变体。

在150 ml含有50 μg/ml 卡那霉素的LB培养基中，在37 ℃，培养携带N1-1 FAOD突变体的表达载体的大肠杆菌BL21 (DE3)细胞。A660值达到0.6以后，加入0.3 mM IPTG，并在25 ℃温育另外5小时。通过离心来收集细胞，并用0.85% NaCl水溶液洗涤2次。然后，将细胞重新悬浮于10mM 磷酸钾缓冲液(PPB) pH 7.0，并用超声匀浆器裂解。在10,000 × g、4 ℃离心裂解物10 min，在50,000 rpm、4 ℃离心上清液60 min，然后在10 mM PPB (pH 7.0)中透析上清液。在有底物 (0.2、0.5、0.75、1、2、5 mM f-^αVal或5 mM f-^αVal-His )存在下，在10 mM PPB、pH 7.0、1.5 mM TODB、2 U/ml辣根过氧化物酶(POD)和1.5 mM 4-氨基安替比林 (4AA)中，在25 ℃测定氧化酶活性。通过分光光度计法，在546 nm测量醌亚胺染料的形成。在有底物(0.2、0.5、1、2、5 mM f-^αVal或5 mM f-^αVal-His)存在下，在10 mM PPB (pH 7.0)、0.6 mM DCIP和6 mM 甲氧基 PMS (mPMS)中，在25 ℃测定脱氢酶活性。

在大多数情况下，氧化酶活性完全丧失或基本上丧失，但是几种突变体（诸如N47A、S46A、K48A和N44A）表现出相对较高的活性。在它们中，N47A表现出最显著的特征。尽管N47A的氧化酶活性降低至野生型活性的约20%，N47A的脱氢酶活性保持野生型活性的超过60%。结果，N47A表现出的脱氢酶活性是氧化酶活性的约4倍。在采用具有人造电子受体的果糖基氨基酸氧化酶的传感器条带中，N47A的这种特征是有益的。野生型N1-1 FAOD和N47A突变型的粗制品的动力学参数显示于表2中。

表2. N1-1 FAOD突变体和野生型的粗制品的动力学参数

实施例2

N1-1野生型和N47突变型FAOD的纯化

如下纯化重组的FAOD。首先，从重组大肠杆菌制备含有酶的水溶性级分。在7L LB培养基 (37℃，在10L发酵罐中，50 μg/ml 氨苄西林)中培养含有表达载体的大肠杆菌，然后在约OD₆₆₀ = 0.7，用IPTG (终浓度: 0.3 mM)诱导表达，并将培养物温度降低至30℃。将细胞悬浮于100 mM PPb (pH 7.0)中，使用弗氏细胞压碎器破碎4次。对上清液进行超速离心 (40,000 g, 90分钟)，并在4℃在10 mM PPb (pH 7.0)中透析上清液过夜，以制备水溶性级分。

对水溶性级分进一步进行液相色谱法，以制备纯化的酶。用阴离子-交换色谱法 (DEAE-5PW)，进一步纯化酶。将水溶性级分吸附至用10 mM PPb (pH 7.0)平衡的阴离子-交换色谱柱DEAE-5PW (5.0 mm I.D. × 5 cm, Tosoh)。在用3倍柱体积量的10 mM PPb (pH 7.0)平衡以后，用含有0.7 M NaCl的10 mM PPb (pH 7.0)洗脱FAOD。将流速设定为1 ml/min，每1分钟收集洗脱液。使用280 nm 的吸收波长监测洗脱液。

使用35%硫酸铵，分离活性级分，并对上清液进行疏水色谱法。将活性级分吸附至疏水色谱柱Resource Phe (1 ml, Pharmacia)，该柱用含有35%硫酸铵的10 mM PPb (pH 6.5)平衡。在用3倍柱体积量的含有35%硫酸铵的10 mM PPb (pH 6.5)平衡以后，用10 mM PPb (pH 6.5)洗脱FAOD。将流速设定为2 ml/min，每1分钟收集洗脱液。用45%硫酸铵分离活性级分，然后将沉淀物溶解于含有1% 甘露糖和100 μM FAD的10 mM PPb (pH 7.0)中，并在相同的缓冲液中在4℃透析6小时。进一步在含有100 μM FAD的10 mM PPb (pH 8.0)中在4℃透析6小时。透析的样品用于下一个阴离子-交换色谱法。

将样品吸附至阴离子-交换色谱柱Bioasit Q (4.6 mm I.D. × 5 cm, Tosoh)，该柱用10 mM PPb (pH 8.0)平衡。在用3倍柱体积量的10 mM PPb (pH 8.0)平衡以后，用含有0.3M NaCl 的10 mM PPb (pH 7.0)洗脱FAOD。将流速设定为1 ml/min，每1分钟收集洗脱液。在10 mM PPb (pH 7.0)中在4℃透析活性级分过夜。通过SDS/PAGE，检查样品的纯化程度。使用Phast凝胶8-25，对样品进行电泳，用银对凝胶染色。根据Phast System^TM所附随的手册，进行样品制备、电泳和染色。

如在实施例1中所述，测量纯化的酶的氧化酶和脱氢酶活性，并显示在图3中。动力学参数显示在表3中。

表3. 纯化的N1-1 FAOD野生型和突变体N47A的动力学参数

实施例3

PnFPOX突变体的制备

制备和表征了源自Phaeosphaeria nolorum的果糖基氨基酸氧化酶 (PnFPOX , SEQ ID NO: 1)的突变体。

基于N1-1 FAOD和PnFPOX的比对(图1)以及来自实施例1和2的结果，预测Asn56参与从FAD的质子和电子传递。将不同的突变导入Asn56中，目的是，修饰PnFAOD的电子受体可用性。

使用实施例1所述的定点诱变，导入突变，并用含有野生型或突变体PnFPOX的表达载体，转化BL21 (DE3)细胞。将培养的细胞重新悬浮于10 mM PPB、pH 7.0，并通过声处理进行裂解。在10,000g在4 ℃离心裂解物20 min，在50,000 rpm在4 ℃离心上清液60 min。如实施例1所述，测量氧化酶和脱氢酶活性。

粗的PnFPOX野生型和Asn56 变体的活性总结在图4中。大多数Asn56突变体表现出氧化酶活性的急剧下降(<野生型的20%)，但是Asn56Ser除外，它表现出相对较高的氧化酶活性 (野生型的41%)。在它们中，一些变体(Asn56Cys、Phe、Met、Val)表现出相对较高的脱氢酶活性 (>野生型的60%)，甚至在Asn56Cys和Asn56Met中，高于野生型。Asn56突变体的动力学参数总结在图5中。Asn56Met和Asn56Val表现出比Asn56Ala更高的Vmax 脱氢酶(B) / Vmax 氧化酶(A)。Asn56Asp、Glu和Pro丧失氧化酶和脱氢酶活性。

实施例4

PnFPOX N56A突变体的纯化

在含有50 μg 卡那霉素/ml的LB培养基 (2 l)中，在37 ℃好氧地培养用pEPN(pET28a-PnFPOX)-N56A转化的BL21 (DE3)。在A660nm值达到0.6以后，用0.3 mM IPTG诱导细胞，并继续在25 ℃温育5.5小时。通过离心收获细胞，并重新悬浮于10 mM PPB、pH 7.0中，通过穿过弗氏细胞压碎器 (1,000 kg cm^-2) 3次，进行裂解。在10,000g在4 ℃离心裂解物20 min，在50,000 rpm 在4 ℃离心上清液60 min。然后在含有25 μM FAD的10 mM PPB、pH 8.0中透析上清液，并进一步纯化粗的酶溶液。

将硫酸铵加入透析过的上清液至35%饱和度，然后通过在15,000g离心20 min，沉淀出形成的沉淀物。在15,000 g离心上清液（其中加入硫酸铵至65%饱和度）20 min。将得到的沉淀物溶解于含有25 μM FAD和1% 甘露糖的10mM PPB、pH 8.0中，并在相同缓冲液中在4 ℃透析，随后在含有25 μM FAD的10 mM PPB、pH 8.0中透析。将透析的酶溶液上RESOURCE Q柱 (GE Healthcare)，该柱用10 mM PPB、pH 8.0平衡。收集流过的活性级分，用1 M NaCl洗脱吸附的蛋白，所述蛋白没有表现出FAOD 活性。收集流过的活性级分，并在10 mM PPB、pH 7.0中透析。将透析的酶溶液上HiLoad 16/60 Superdex 75 pg柱 (GE Healthcare)，该柱用10 mM PPB、pH 7.0平衡。用相同的缓冲液进行凝胶过滤色谱法。收集活性级分，并在含有100 μM FAD 的10 mM PPB、pH 7.0中透析纯化的酶溶液，在4 ℃保存。通过SDS-PAGE，证实纯化的酶的纯度，并使用DC蛋白测定试剂盒 (Bio-Rad, CA, USA)，测量浓度。结果如表4所示。

表4 重组PnFPOX N56A的纯化

测量N56突变型FAOD的氧化酶和脱氢酶活性。突变体 FAOD的SV曲线和动力学参数分别显示于图6和表5中。在图6中，左图显示了0-5mM的底物浓度的活性，右图是0-2mM的底物浓度的放大图。

N56A突变型表现出明显增加的对两种底物的脱氢酶活性。

表5 纯化的PnFPOX N56A突变体的动力学参数

实施例5

阿马多里酶II FAOD突变体的制备和表征

制备和表征了源自阿马多里酶II的突变体(SEQ ID NO: 3)。基于N1-1 FAOD和阿马多里酶II的比对(图1)以及来自实施例1-4的结果，预测Asn52参与从FAD的质子和电子传递。根据在实施例1中描述的方法，制备具有Asn52Ala 突变的突变体。

用含有阿马多里酶II野生型或N52A突变体的表达载体，转化BL21 (DE3)细胞。收获培养的细胞，并重新悬浮于10 ml 10 mM PPB、pH 7.0中，并通过穿过弗氏细胞压碎器 (1,000 kg cm^-2) 2次，进行裂解。在10,000g在4 ℃离心裂解物20 min，在50,000 rpm 在4 ℃离心上清液60 min。然后在含有25 μM FAD的10 mM PPB、pH 8.0中透析上清液，以制备粗的酶溶液。通过硫酸铵沉淀、阴离子交换色谱法 (RESOURCE Q柱 (GE Healthcare))和凝胶过滤色谱法 (HiLoad 16/60 Superdex 75 pg柱 (GE Healthcare))，纯化粗制品。

使用f-αVal 作为底物，使用4AA/TODB/POD (氧化酶活性)和PMS/DCIP (脱氢酶活性)，测定FAOD活性。结果显示于图7。

纯化的阿马多里酶II野生型和Asn52Ala 的动力学参数总结在图8中。突变体 N52A表现出的脱氢酶活性是氧化酶活性的约2倍。

实施例6

生物传感器的构建

将40 mU/5 μl 的PnFPOX野生型或N56A PnFPOX 溶液与2%的AWP 溶液相混合。将5 μl 混合物应用于可重复使用的金电极(表面积: 7 mm²)上，并在30 ℃干燥30 min。用紫外线照射电极1 min，以制备具有固定化的野生型或N56A FPOX的电极。将电极浸入2 ml含有2 mM亚硝基苯胺 (NA；从WO 2004/113900的第33页以及以后的内容获知)的PBS (pH 7.4) 溶液中。然后，对Ag/AgCl施加+200mV，并监测电流。当观察到稳态电流时，将含有不同浓度的FV的样品溶液加入反应混合物中，并监测电流增加。为了在没有氧存在下测量酶活性，将氩气连续地吹入反应室中。

图9显示了在有氧存在下或在没有氧存在下 (在氩气下)，FV 浓度和具有PnFPOX N56A或野生型酶的电极的电流增加之间的关联。观察了氧对电化学反应的影响，但是氧的存在的影响小于使用的野生型的影响。这些结果表明，本发明的果糖基氨基酸氧化酶的活性更少地受到溶解氧水平的影响。

实施例7

FPOX-C突变体的制备和表征

以与实施例5相同的方式，制备了具有Asn52Ala 突变的源自FPOX-C的突变体(SEQ ID NO: 7)。粗的酶制品不经进一步纯化用于酶活性测定。使用1 mM f-^αVal或1 mM f-^αVal-His作为底物，使用4AA/TODB/POD (Ox: 氧化酶活性)和PMS/DCIP (DH: 脱氢酶活性)，测定FAOD活性。结果显示于下面的表6中。

表6

突变体 FPOX-C N52A表现出的对f-^αVal和f-^αVal-His的脱氢酶活性远远高于氧化酶活性。

实施例8

环突变体的制备和表征

PnFPOX对果糖基六肽显示出的氧化酶活性水平比FVH的1%还低，而FPOX-C没有显示出活性。另一方面，FPOX-C显示出比PnFPOX更高的对FVH的活性。对比两种氧化酶的氨基酸序列，在它们的环区域中发现了FAOD和FPOX之间的显著差异。

环1区域

环2区域

制备了嵌合的环突变体（其中1 PnFPOX和FPOX-C的环区域彼此交换）及其N56A突变体。基于在上面显示的部分氨基酸序列，制备了8类突变体：

Pn FPOX/L1ExC (即，Pn FPOX，其中环1区域被置换为来自FPOX-C的环1区域)

Pn FPOX/L1ExC/N56A (即，Pn FPOX的N56A突变型，其中环1区域被置换为来自FPOX-C的环1区域)

Pn FPOX/L2ExC (即，Pn FPOX，其中环2区域被置换为来自FPOX-C的环2区域)

Pn FPOX/L2ExC/N56A (即，Pn FPOX的N56A 突变型，其中环2区域被置换为来自FPOX-C的环2区域)

FPOX-C/L1ExPn (即，FPOX-C，其中环1区域被置换为来自Pn FPOX的环1区域)

FPOX-C/L1ExPn/N56A (即，FPOX-C的N56A 突变型，其中环1区域被置换为来自Pn FPOX的环1区域)

FPOX-C/L2ExPn (即，FPOX-C，其中环2区域被置换为来自Pn FPOX的环2区域)

FPOX-C/L2ExPn/N56A (即，FPOX-C的N56A突变型，其中环2区域被置换为来自Pn FPOX的环2区域)

如实施例1和5所述，导入突变和制备粗酶。使用1 mM f-^αVal、1 mM f-^αVal-His或5 mM 果糖基六肽 (F-HP) 作为底物，使用4AA/TODB/POD (Ox: 氧化酶活性)和PMS/DCIP (DH: 脱氢酶活性)测定FAOD活性。

Pn FPOX/L1ExC和Pn FPOX/L2ExC都表现出比野生型P.n. FPOX更高的对f-^αVal-His的氧化活性。FPOX-C/L1ExPn表现出对F-HP的活性，该活性在野生型FPOX-C中没有观察到。令人感兴趣地，Pn FPOX/L2ExC表现出增加的对F-HP的活性，而Pn FPOX/L1ExC几乎丧失对F-HP的活性。这些结果表明，通过修饰环区域，可以进一步提高P.n. FPOX对F-HP的活性。

将N56A 突变导入这些环突变体中，导致降低的氧化酶活性和增加的脱氢酶活性。Pn FPOX/L1ExC/N56A和Pn FPOX/L2ExC/N56A表现出的脱氢酶活性都高于它们对f-^αVal的氧化酶活性。Pn FPOX/L2ExC/N56A对f-^αVal的脱氢酶活性比Pn FPOX/N56A显著增加，且高于FPOX-C/N56A的活性。

Pn FPOX/L1ExC/N56A和Pn FPOX/L2ExC/N56A表现出的对f-^αVal-His的脱氢酶活性都高于它们的氧化酶活性。在Pn FPOX/L2ExC/N56A中，观察到最高的脱氢酶活性，这与FPOX-C/N56A的活性几乎类似。

代表性的结果显示于下面的表7中。

表7

工业实用性

本发明的突变的果糖基氨基酸氧化酶可以用于测量糖化的蛋白，诸如血红蛋白(HbA1c)，所述糖化的蛋白在糖尿病的临床诊断和控制中是有用的。

序列表

<110> Roche Diagnostics GmbH

Ultizyme International Ltd.

F. Hoffmann-La Roche AG

<120> 果糖基氨基酸氧化酶

<130> 26147 WO

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 437

<212> PRT

<213> Phaeosphaeria nodorum

<400> 1

Met Ala Pro Ser Arg Ala Asn Thr Ser Val Ile Val Val Gly Gly Gly

1 5 10 15

Gly Thr Ile Gly Ser Ser Thr Ala Leu His Leu Val Arg Ser Gly Tyr

20 25 30

Thr Pro Ser Asn Val Thr Val Leu Asp Ala Tyr Pro Ile Pro Ser Ser

35 40 45

Gln Ser Ala Gly Asn Asp Leu Asn Lys Ile Met Gly Val Ser Leu Arg

50 55 60

Asn Pro Val Asp Leu Gln Leu Ala Leu Glu Ala Arg Gln Met Trp Asn

65 70 75 80

Glu Asp Glu Leu Phe Lys Lys Phe Phe His Asn Thr Gly Arg Leu Asp

85 90 95

Cys Ala His Gly Glu Lys Asp Ile Ala Asp Leu Lys Ser Gly Tyr Gln

100 105 110

Ala Leu Val Asp Ala Gly Leu Asp Ala Thr Asn Glu Trp Leu Asp Ser

115 120 125

Glu Asp Glu Ile Leu Lys Arg Met Pro Leu Leu Ser Arg Asp Gln Ile

130 135 140

Lys Gly Trp Lys Ala Ile Phe Ser Lys Asp Gly Gly Trp Leu Ala Ala

145 150 155 160

Ala Lys Ala Ile Asn Ala Val Gly Glu Tyr Leu Arg Asp Gln Gly Val

165 170 175

Arg Phe Gly Phe Tyr Gly Ala Gly Ser Phe Lys Ala Pro Leu Leu Ala

180 185 190

Glu Gly Val Cys Ile Gly Val Glu Thr Val Asp Gly Thr Arg Tyr Tyr

195 200 205

Ala Asp Lys Val Val Leu Ala Ala Gly Ala Trp Ser Pro Thr Leu Val

210 215 220

Glu Leu His Glu Gln Cys Val Ser Lys Ala Trp Val Tyr Gly His Ile

225 230 235 240

Gln Leu Thr Pro Glu Glu Ala Ala Arg Tyr Lys Asn Ser Pro Val Val

245 250 255

Tyr Asn Gly Asp Val Gly Phe Phe Phe Glu Pro Asn Glu His Gly Val

260 265 270

Ile Lys Val Cys Asp Glu Phe Pro Gly Phe Thr Arg Phe Lys Met His

275 280 285

Gln Pro Phe Gly Ala Lys Ala Pro Lys Arg Ile Ser Val Pro Arg Ser

290 295 300

His Ala Lys His Pro Thr Asp Thr Ile Pro Asp Ala Ser Asp Val Ser

305 310 315 320

Ile Arg Arg Ala Ile Ala Thr Phe Met Pro Gln Phe Lys Asn Lys Lys

325 330 335

Met Phe Asn Gln Ala Met Cys Trp Cys Thr Asp Thr Ala Asp Ala Ala

340 345 350

Leu Leu Ile Cys Glu His Pro Glu Trp Lys Asn Phe Val Leu Ala Thr

355 360 365

Gly Asp Ser Gly His Ser Phe Lys Leu Leu Pro Asn Ile Gly Lys His

370 375 380

Val Val Glu Leu Leu Glu Gly Thr Leu Ala Asp Asp Leu Ala His Ala

385 390 395 400

Trp Arg Trp Arg Pro Gly Ser Gly Asp Ala Leu Lys Ser Arg Arg Ser

405 410 415

Ala Pro Ala Lys Asp Leu Ala Asp Met Pro Gly Trp Asn His Asp Lys

420 425 430

Pro Arg Ala Asn Leu

435

<210> 2

<211> 427

<212> PRT

<213> 毕赤酵母属物种

<400> 2

Met Glu Ser Ile Ile Ile Val Gly Ala Gly Thr Phe Gly Leu Ser Thr

1 5 10 15

Ala Leu Gln Leu Ala Arg Asp Gly Tyr Lys Asn Ile Lys Cys Phe Asp

20 25 30

Lys Phe Pro Val Pro Ser Glu Ile Ala Ala Gly Asn Asp Ser Asn Lys

35 40 45

Ile Phe His Tyr Asp Tyr Val Ala Pro Leu Ala Lys Pro Asn Ser Lys

50 55 60

Glu Arg Leu Ser Leu Glu Ala Leu His Leu Trp Lys Thr Asp Pro Val

65 70 75 80

Tyr Lys Pro Tyr Tyr His Pro Val Gly Phe Ile Leu Ala Ala Ser Ser

85 90 95

Asp Ala Pro Leu Leu His Asp Lys Glu Tyr Tyr Glu Glu Leu Gln Lys

100 105 110

Asn Gly Leu Arg Asn Tyr Arg Tyr Ile Ser Thr Pro Glu Glu Phe Arg

115 120 125

Glu Tyr Leu Pro Ile Leu Lys Gly Pro Leu Pro Asn Trp Arg Gly Tyr

130 135 140

Val Leu Asp Gly Asp Asn Gly Trp Leu His Ala Arg Asp Ser Leu Lys

145 150 155 160

Ser Ala Tyr Glu Glu Cys Lys Arg Leu Gly Val Glu Phe Val Phe Gly

165 170 175

Asp Asp Gly Glu Ile Val Glu Leu Leu Asn Glu Asn Gly Lys Leu Thr

180 185 190

Gly Ile Arg Ala Arg Ser Gly Ala Ile Phe Ser Ala Gln Lys Tyr Val

195 200 205

Leu Ser Ser Gly Ala Asn Ala Val Thr Leu Leu Asn Phe Gln Arg Gln

210 215 220

Leu Glu Gly Lys Cys Phe Thr Leu Ala His Phe Lys Val Thr Asp Glu

225 230 235 240

Glu Ala Lys Ala Phe Lys Ser Leu Pro Val Leu Phe Asn Ala Glu Lys

245 250 255

Gly Phe Phe Phe Glu Ala Asp Glu Asn Asn Glu Ile Lys Ile Cys Asn

260 265 270

Glu Tyr Pro Gly Phe Thr His Thr Asn Glu Ser Gly Glu Ser Ile Pro

275 280 285

Leu Tyr Arg Met Glu Ile Pro Leu Glu Ser Ala Leu Glu Ile Arg Gln

290 295 300

Tyr Leu Lys Glu Thr Met Pro Gln Phe Ala Asp Arg Pro Phe Thr Lys

305 310 315 320

Thr Arg Ile Cys Trp Cys Thr Asp Ser Pro Asp Met Gln Leu Ile Leu

325 330 335

Cys Thr His Pro Glu Tyr Thr Asn Leu Ile Val Ala Ser Gly Asp Ser

340 345 350

Gly Asn Ser Phe Lys Ile Met Pro Ile Ile Gly Lys Tyr Val Ser Lys

355 360 365

Val Val Thr Lys Gly Asp Lys Gly Leu Asp Pro Glu Asp Lys Glu Cys

370 375 380

Trp Lys Trp Arg Pro Glu Thr Trp Asp Lys Arg Gly Gln Val Arg Trp

385 390 395 400

Gly Gly Arg Tyr Arg Val Ala Asp Leu Asn Glu Ile Glu Glu Trp Val

405 410 415

Ser Val Glu Asn Pro Thr Pro His Lys Leu Glu

420 425

<210> 3

<211> 438

<212> PRT

<213> 烟曲霉

<400> 3

Met Ala Val Thr Lys Ser Ser Ser Leu Leu Ile Val Gly Ala Gly Thr

1 5 10 15

Trp Gly Thr Ser Thr Ala Leu His Leu Ala Arg Arg Gly Tyr Thr Asn

20 25 30

Val Thr Val Leu Asp Pro Tyr Pro Val Pro Ser Ala Ile Ser Ala Gly

35 40 45

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Gly Trp Lys Gly Tyr Phe Ala Arg Ser Gly Ala Gly Trp Ala His Ala

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Arg Asn Ala Leu Val Ala Ala Ala Arg Glu Ala Gln Arg Met Gly Val

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Lys Phe Val Thr Gly Thr Pro Gln Gly Arg Val Val Thr Leu Ile Phe

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435

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<212> PRT

<213> Penicillium janthinellum

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435

<210> 5

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<212> PRT

<213> 单格孢属物种

<400> 5

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Ala Ala Ala Lys Ala Ile Asn Ala Ile Gly Arg Phe Leu Arg Asp Gln

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Gly Val Lys Phe Gly Phe Gly Gly Ala Gly Ser Phe Lys Gln Pro Leu

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Arg Ala Ala Arg Ala Lys Asp Leu Ala Asp Met Pro Gly Trp Asn His

420 425 430

Asp Gly Glu Ala Pro Arg Ala Lys Leu

435 440

<210> 6

<211> 437

<212> PRT

<213> Eupenicillium terrenum

<400> 6

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Gln Ser Ala Gly His Asp Leu Asn Lys Ile Met Gly Ile Arg Leu Arg

50 55 60

Asn Gly Pro Asp Leu Gln Leu Ser Leu Glu Ser Leu Asp Met Trp Gln

65 70 75 80

Asn Asp Glu Leu Phe Lys Pro Phe Phe His Gln Val Gly Met Ile Asp

85 90 95

Cys Ser Ser Ser Lys Glu Gly Ile Glu Asn Leu Arg Arg Lys Tyr Gln

100 105 110

Thr Leu Leu Asp Ala Gly Ile Gly Leu Glu Lys Thr Asn Val Trp Leu

115 120 125

Glu Ser Glu Asp Glu Ile Leu Ala Lys Ala Pro Asn Phe Thr Arg Glu

130 135 140

Gln Val Lys Gly Trp Lys Gly Leu Phe Cys Thr Asp Gly Gly Trp Leu

145 150 155 160

Ala Ala Ala Lys Ala Ile Asn Ala Ile Gly Ile Phe Leu Gln Asp Lys

165 170 175

Gly Val Lys Phe Gly Phe Gly Gly Ala Gly Thr Phe Gln Gln Pro Leu

180 185 190

Phe Ala Ala Asp Gly Lys Thr Cys Ile Gly Leu Glu Thr Thr Asp Gly

195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

Phe Ala His Ile Gln Leu Thr Pro Lys Glu Ala Asp Ala Tyr Lys Asn

245 250 255

Val Pro Val Val Tyr Asp Gly Glu Tyr Gly Phe Phe Phe Glu Pro Asn

260 265 270

Glu Tyr Gly Val Ile Lys Val Cys Asp Glu Phe Pro Gly Phe Ser Arg

275 280 285

Phe Lys Leu His Gln Pro Tyr Gly Ala Ala Ser Pro Lys Met Ile Ser

290 295 300

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305 310 315 320

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340 345 350

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405 410 415

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420 425 430

His Asp Ala His Leu

435

<210> 7

<211> 437

<212> PRT

<213> Coniochaeta属物种

<400> 7

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Gly Thr Ile Gly Ser Ser Thr Ala Leu His Leu Val Arg Ser Gly Tyr

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Ala Pro Ala Asn Ile Thr Val Leu Asp Thr Phe Glu Ile Pro Ser Ala

35 40 45

Gln Ser Ala Gly His Asp Leu Asn Lys Ile Met Gly Ile Arg Leu Arg

50 55 60

Asn Lys Val Asp Leu Gln Met Ser Leu Glu Ala Arg Gln Met Trp Lys

65 70 75 80

Glu Asp Glu Leu Phe Gln Pro Phe Phe His Asn Thr Gly Arg Met Asp

85 90 95

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100 105 110

Ala Leu His Asp Ala Gly Ala Gly Leu Glu Lys Thr His Ala Trp Leu

115 120 125

Asp Asn Glu Asp Glu Ile Leu Ser Lys Met Pro Leu Leu Gln Arg Asp

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Gln Ile Gln Gly Trp Lys Ala Ile Trp Ser Gln Asp Gly Gly Trp Leu

145 150 155 160

Ala Ala Ala Lys Ala Ile Asn Ala Ile Gly Gln Phe Leu Lys Glu Arg

165 170 175

Gly Val Lys Phe Gly Phe Gly Gly Ala Gly Ser Phe Lys Gln Pro Leu

180 185 190

Phe Asp Asp Glu Gly Thr Thr Cys Ile Gly Val Glu Thr Ala Asp Gly

195 200 205

Thr Lys Tyr Tyr Ala Asp Lys Val Val Leu Ala Ala Gly Ala Trp Ser

210 215 220

Pro Thr Leu Val Asp Leu Glu Asp Gln Cys Cys Ser Lys Ala Trp Val

225 230 235 240

Tyr Ala His Ile Gln Leu Thr Pro Glu Glu Ala Ala Glu Tyr Lys Gly

245 250 255

Val Pro Val Val Tyr Asn Gly Glu Phe Gly Phe Phe Phe Glu Pro Asn

260 265 270

Glu Phe Gly Val Ile Lys Val Cys Asp Glu Phe Pro Gly Phe Ser Arg

275 280 285

Phe Lys Glu His Gln Pro Tyr Gly Ala Pro Ser Pro Lys His Ile Ser

290 295 300

Val Pro Arg Ser His Ala Lys His Pro Thr Asp Thr Tyr Pro Asp Ala

305 310 315 320

Ser Glu Val Ser Ile Lys Lys Ala Ile Ala Thr Phe Leu Pro Arg Phe

325 330 335

Gln Asp Lys Glu Leu Phe Asn Arg Ala Leu Cys Trp Cys Thr Asp Thr

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Val Gly Lys His Val Val Glu Leu Ile Glu Gly Arg Leu Pro Glu Glu

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Met Ala Tyr Gln Trp Arg Trp Arg Pro Gly Gly Asp Ala Leu Lys Ser

405 410 415

Arg Arg Ala Ala Pro Pro Lys Asp Leu Ala Asp Met Pro Gly Trp Lys

420 425 430

His Asp Pro Lys Leu

435

<210> 8

<211> 440

<212> PRT

<213> 尖孢镰刀菌

<400> 8

Ala Ser Thr Leu Thr Lys Gln Ser Gln Ile Leu Ile Val Gly Gly Gly

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Thr Trp Gly Cys Ser Thr Ala Leu His Leu Ala Arg Arg Gly Tyr Thr

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Asn Val Thr Val Leu Asp Val Asn Arg Ile Pro Ser Pro Ile Ser Ala

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Gly His Asp Val Asn Lys Leu Ala Gly Arg Leu Ser Thr Ala Asp Ser

50 55 60

Lys Gly Asp Asp Glu Asp Ser Ile Trp Lys Ala Leu Ser Tyr Ala Ala

65 70 75 80

Ala Gln Gly Trp Leu His Asp Pro Val Phe Gln Pro Phe Cys His Asn

85 90 95

Thr Gly Ser Val Val Ala Gly Ser Thr Pro Lys Ser Ile Lys Gln Leu

100 105 110

Val Glu Asp Glu Ile Gly Asp Asp Ile Asp Gln Tyr Thr Pro Leu Asn

115 120 125

Thr Ala Glu Asp Phe Arg Lys Thr Met Pro Glu Gly Ile Leu Thr Gly

130 135 140

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405 410 415

Gly Ala Asp Asp Lys Ile Met Asp Leu Pro Lys Ser Asp Val Glu Gly

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Trp Thr Asn Ile Lys Asn Asp Ile

435 440

<210> 9

<211> 437

<212> PRT

<213> 土曲霉

<400> 9

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Val Thr Val Leu Asp Pro Tyr Pro Val Pro Ser Ala Ile Ser Ala Gly

35 40 45

Asn Asp Val Asn Lys Ile Ile Ser Ser Gly Gln Tyr Ser Ser Lys Lys

50 55 60

Asp Glu Val Glu Val Asn Glu Ile Ile Ala Glu Gln Ala Phe Asn Gly

65 70 75 80

Trp Lys Asn Asp Pro Ile Phe Lys Pro Tyr Tyr His Asp Thr Gly Val

85 90 95

Val Met Ser Ala Thr Thr Gln Glu Gly Leu Glu Arg Leu Gly Val Arg

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Val Arg Pro Glu Asp Glu Pro Asp Val Ala Glu Leu Thr Arg Pro Glu

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Gln Phe Arg Gln Leu Ala Pro Gly Val Leu Lys Gly Asn Phe Pro Gly

130 135 140

Trp Arg Gly Tyr His Ile Arg Ser Asn Ala Gly Trp Ala His Ala Arg

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Asn Ala Leu Val Ala Ala Ala Arg Glu Ala Gln Arg Leu Gly Val Arg

165 170 175

Phe Val Ala Gly Ser Pro Gln Gly Arg Val Ile Thr Leu Ile Phe Glu

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Asn Asn Asp Val Lys Gly Ala Val Thr Ala Asp Gly Lys Ile Trp Arg

195 200 205

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210 215 220

Asp Phe Lys Asp Gln Leu Arg Pro Thr Ala Trp Thr Leu Val His Ile

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Phe Asn Ile Glu Lys Gly Phe Phe Phe Glu Pro Asp Glu Glu Arg Gly

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Glu Ile Lys Ile Cys Asp Glu His Pro Gly Tyr Thr Asn Met Thr Thr

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Gly Ala Asp Gly Arg Val Arg Ser Ile Pro Phe Glu Lys Thr Gln Val

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Asn Arg Asn Trp Gly Asp Arg Leu Gly Arg Phe Gly Gly Pro Asn Arg

405 410 415

Val Met Asp Phe Asn Glu Val Lys Glu Trp Thr Asn Val Thr Gln Arg

420 425 430

Asp Ile Ser Lys Leu

435

<210> 10

<211> 445

<212> PRT

<213> 米曲霉

<400> 10

Met Thr Ser Ser Lys Leu Thr Pro Thr Ser Ser Ile Leu Ile Val Gly

1 5 10 15

Ala Gly Thr Trp Gly Cys Ser Thr Ala Leu His Leu Ala Arg Arg Gly

20 25 30

Tyr Lys Asn Val Thr Val Leu Asp Pro His Pro Val Pro Ser Pro Ile

35 40 45

Ala Ala Gly Asn Asp Ile Asn Lys Ile Met Glu His Arg Glu Val Lys

50 55 60

Ala Ser Glu Thr Asp Pro Trp Ser Ile Ala Phe Ser Thr Cys Thr Arg

65 70 75 80

Ala Ala Leu Lys Gly Trp Lys Asn Asp Pro Val Phe Gln Pro Tyr Phe

85 90 95

His Glu Thr Gly Ala Ile Val Ser Gly His Thr Ala Ser Leu Ile Lys

100 105 110

His Ile Gln Glu His Glu Ile Asp Ser Ser Asp Ala Glu Phe Ile Lys

115 120 125

Leu Asn Thr Ala Glu Asp Phe Arg Lys Thr Met Pro Pro Gly Ile Leu

130 135 140

Thr Gly Asn Phe Pro Gly Trp Lys Gly Trp Leu Asn Lys Thr Gly Ala

145 150 155 160

Gly Trp Ile His Ala Lys Lys Ala Met Phe Ser Ala Tyr Thr Glu Ala

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Lys Arg Leu Gly Val Thr Phe Ile Thr Gly Ser Pro Glu Gly Asp Val

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Val Ser Leu Ile Tyr Glu Asn Gly Asp Val Val Gly Ala Arg Thr Ala

195 200 205

Asp Gly Thr Val His Arg Ala Asp His Thr Ile Leu Ser Ala Gly Ala

210 215 220

Gly Ser Asp Arg Leu Leu Asp Phe Lys Lys Gln Leu Arg Pro Thr Ala

225 230 235 240

Trp Thr Leu Cys His Ile Arg Met Thr Pro Asp Glu Ala Lys Lys Tyr

245 250 255

Arg Asn Leu Pro Val Leu Phe Asn Val Ala Lys Gly Phe Phe Met Glu

260 265 270

Pro Asp Glu Asp Asn His Glu Leu Lys Ile Cys Asp Glu His Pro Gly

275 280 285

Tyr Cys Asn Phe Val Pro Asp Pro Lys His Gly Gly Glu Val Arg Ser

290 295 300

Ile Pro Phe Ala Lys His Gln Ile Pro Leu Glu Ala Glu Ala Arg Ala

305 310 315 320

Arg Asp Phe Leu Arg Asp Thr Met Pro His Leu Ala Asp Arg Pro Leu

325 330 335

Ser Phe Ala Arg Ile Cys Trp Asp Ala Asp Thr Val Asp Arg Ala Phe

340 345 350

Leu Ile Asp Arg His Pro Glu Tyr Arg Ser Leu Leu Leu Ala Val Gly

355 360 365

Gly Ser Gly Asn Gly Ala Met Gln Met Pro Thr Ile Gly Gly Phe Ile

370 375 380

Ala Asp Ala Leu Glu Gly Asn Leu Gln Lys Glu Leu Lys His Ala Leu

385 390 395 400

Arg Trp Arg Pro Glu Ile Ala Ala Gln Arg Asp Trp Lys Asp Thr Gln

405 410 415

Asn Arg Phe Gly Gly Pro Asn Lys Val Met Asp Phe Gln Lys Val Gly

420 425 430

Glu Asn Glu Trp Thr Lys Ile Gly Asp Lys Ser Arg Leu

435 440 445

<210> 11

<211> 445

<212> PRT

<213> 烟曲霉

<400> 11

Met Ala Pro Ser Ile Leu Ser Thr Glu Ser Ser Ile Ile Val Ile Gly

1 5 10 15

Ala Gly Thr Trp Gly Cys Ser Thr Ala Leu His Leu Ala Arg Arg Gly

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Tyr Lys Asp Val Thr Val Leu Asp Pro His Pro Val Pro Ser Pro Ile

35 40 45

Ala Ala Gly Asn Asp Ile Asn Lys Ile Met Glu His Ser Glu Leu Lys

50 55 60

Asp Gly Ser Ser Asp Pro Arg Ser Ala Ala Phe Ser Thr Phe Thr Arg

65 70 75 80

Ala Ala Leu Lys Ala Trp Lys Thr Asp Pro Val Phe Gln Pro Tyr Phe

85 90 95

His Glu Thr Gly Phe Ile Ile Ser Gly His Thr Pro Ala Leu Ile Asp

100 105 110

His Ile Arg Lys Asp Glu Val Glu Pro Ser Glu Thr Asn Phe Val Lys

115 120 125

Leu Glu Thr Ala Glu Asp Phe Arg Arg Thr Met Pro Pro Gly Val Leu

130 135 140

Thr Gly Asp Phe Pro Gly Trp Lys Gly Trp Leu His Lys Ser Gly Ala

145 150 155 160

Gly Trp Ile His Ala Lys Lys Ala Met Ile Ser Ala Phe Asn Glu Ala

165 170 175

Lys Arg Leu Gly Val Arg Phe Val Thr Gly Ser Pro Glu Gly Asn Val

180 185 190

Val Ser Leu Val Tyr Glu Asp Gly Asp Val Val Gly Ala Arg Thr Ala

195 200 205

Asp Gly Arg Val His Lys Ala His Arg Thr Ile Leu Ser Ala Gly Ala

210 215 220

Gly Ser Asp Ser Leu Leu Asp Phe Lys Lys Gln Leu Arg Pro Thr Ala

225 230 235 240

Trp Thr Leu Cys His Ile Gln Met Gly Pro Glu Glu Val Lys Gln Tyr

245 250 255

Arg Asn Leu Pro Val Leu Phe Asn Ile Ala Lys Gly Phe Phe Met Glu

260 265 270

Pro Asp Glu Asp Lys His Glu Leu Lys Ile Cys Asp Glu His Pro Gly

275 280 285

Tyr Cys Asn Phe Leu Pro Asp Pro Asn Arg Pro Gly Gln Glu Lys Ser

290 295 300

Val Pro Phe Ala Lys His Gln Ile Pro Leu Glu Ala Glu Ala Arg Ala

305 310 315 320

Arg Asp Phe Leu His Asp Thr Met Pro His Leu Ala Asp Arg Pro Leu

325 330 335

Ser Phe Ala Arg Ile Cys Trp Asp Ala Asp Thr Pro Asp Arg Ala Phe

340 345 350

Leu Ile Asp Arg His Pro Glu His Pro Ser Leu Leu Val Ala Val Gly

355 360 365

Gly Ser Gly Asn Gly Ala Met Gln Met Pro Thr Ile Gly Gly Phe Ile

370 375 380

Ala Asp Ala Leu Glu Ser Lys Leu Gln Lys Glu Val Lys Asp Ile Val

385 390 395 400

Arg Trp Arg Pro Glu Thr Ala Val Asp Arg Asp Trp Arg Ala Thr Gln

405 410 415

Asn Arg Phe Gly Gly Pro Asp Arg Ile Met Asp Phe Gln Gln Val Gly

420 425 430

Glu Asp Gln Trp Thr Lys Ile Gly Glu Ser Arg Gly Pro

435 440 445

<210> 12

<211> 436

<212> PRT

<213> 米曲霉

<400> 12

Met Thr Val Ala Lys Ser Ser Ser Ile Leu Ile Ile Gly Ala Gly Thr

1 5 10 15

Trp Gly Ala Ser Thr Ala Leu His Leu Gly Arg Arg Gly Tyr Thr Asn

20 25 30

Val Thr Val Leu Asp Pro Tyr Thr Val Pro Ser Ala Ile Ser Ala Gly

35 40 45

Asn Asp Val Asn Lys Ile Ile Ser Ser Gly Gln Tyr Ser Asn Lys Lys

50 55 60

Asp Glu Ile Glu Val Asn Glu Ile Leu Ala Glu Glu Ala Phe Lys Gly

65 70 75 80

Trp Thr Thr Asp Pro Leu Phe Lys Pro Tyr Tyr His Asp Thr Gly Val

85 90 95

Val Met Ser Ala Cys Ser Ser Ala Gly Leu Asp Arg Leu Gly Ile Arg

100 105 110

Val Arg Pro Glu Glu Glu Pro Asp Val Ser Glu Val Thr Lys Pro Glu

115 120 125

His Phe Arg Gln Leu Ala Pro Ala Val Leu Lys Gly Asn Phe Pro Gly

130 135 140

Trp Arg Gly Tyr His Ile Arg Ser Asn Ala Gly Trp Ala His Ala Arg

145 150 155 160

Asn Ala Leu Val Ala Ala Ile Arg Glu Ala Glu Lys Leu Gly Val Lys

165 170 175

Phe Val Thr Gly Thr Gln Gly Arg Val Ile Thr Leu Ile Phe Glu Asn

180 185 190

Asn Asp Val Lys Gly Ala Val Thr Ala Asp Gly Lys Ile Trp Arg Ala

195 200 205

Glu Gln Thr Val Leu Cys Ala Gly Ala Asn Ala Ala Gln Phe Leu Asp

210 215 220

Phe Lys Asp Gln Leu Arg Pro Thr Ala Trp Thr Leu Ala His Ile Arg

225 230 235 240

Leu Lys Pro Glu Glu Arg Ala Leu Tyr Lys Asn Leu Pro Val Ile Phe

245 250 255

Asn Ile Glu Lys Gly Phe Phe Phe Glu Pro Asp Glu Glu Arg Gly Glu

260 265 270

Ile Lys Ile Cys Asp Glu His Pro Gly Tyr Thr Asn Met Val Lys Ser

275 280 285

Ala Asp Gly His Leu Thr Ser Leu Pro Phe Glu Lys Thr Gln Ile Pro

290 295 300

Lys Glu Ser Glu Ala Arg Val Arg Ala Leu Leu Ser Glu Thr Met Pro

305 310 315 320

Gln Leu Ala Asp Arg Pro Phe Ser Phe Ala Arg Val Cys Trp Cys Ala

325 330 335

Asp Thr Ala Asn Arg Glu Phe Ile Ile Asp Arg His Pro Glu His Pro

340 345 350

Ser Leu Val Leu Gly Cys Gly Ala Ser Gly Arg Gly Phe Lys Tyr Leu

355 360 365

Pro Ser Ile Gly Asn Leu Ile Val Asp Ala Ile Glu Asp Lys Val Pro

370 375 380

Glu Lys Val His Lys Leu Thr Arg Trp Ser Pro Asp Ile Ala Val Asp

385 390 395 400

Arg Lys Trp Arg Asp Thr Leu Gly Arg Phe Gly Gly Pro Asn Arg Val

405 410 415

Met Asp Phe His Asp Val Lys Glu Trp Thr Asn Val Gln Asn Lys Asp

420 425 430

Thr Ala Lys Leu

435

<210> 13

<211> 12

<212> PRT

<213> Phaeosphaeria nodorum

<400> 13

Val Ser Leu Arg Asn Pro Val Asp Leu Gln Leu Ala

1 5 10

<210> 14

<211> 12

<212> PRT

<213> Coniochaeta属物种

<400> 14

Ile Arg Leu Arg Asn Lys Val Asp Leu Gln Met Ser

1 5 10

<210> 15

<211> 16

<212> PRT

<213> Phaeosphaeria nodorum

<400> 15

Ser Gly Tyr Gln Ala Leu Val Asp Ala Gly Leu Asp Ala Thr Asn Glu

1 5 10 15

<210> 16

<211> 18

<212> PRT

<213> Coniochaeta属物种

<400> 16

Lys Gln Tyr Gln Ala Leu His Asp Ala Gly Ala Gly Leu Glu Lys Thr

1 5 10 15

His Ala

Claims

1.一种突变型果糖基氨基酸氧化酶，其通过用选自Ala、Cys、Phe、Met、Ser和Val的氨基酸残基置换氨基酸残基Asn而在SEQ ID NO: 1所述的氨基酸序列的位置56的对应位置处被修饰。

2.如权利要求1所述的突变型果糖基氨基酸氧化酶，其具有与野生型果糖基氨基酸氧化酶相比降低的氧化酶活性，且具有与野生型果糖基氨基酸氧化酶相比增加的脱氢酶活性。

3.如权利要求1所述的突变型果糖基氨基酸氧化酶，其具有野生型果糖基氨基酸氧化酶的氧化酶活性的30%或更少的氧化酶活性，且具有野生型果糖基氨基酸氧化酶的脱氢酶活性的50%或更多的脱氢酶活性。

4.如权利要求1所述的突变型果糖基氨基酸氧化酶，其具有与野生型果糖基氨基酸氧化酶相比增加的脱氢酶活性。

5.如权利要求1所述的突变型果糖基氨基酸氧化酶，其具有选自SEQ ID NO: 1-12 的氨基酸序列，其中在SEQ ID NO: 1所述的氨基酸序列的位置56的对应位置处的氨基酸残基Asn被选自Ala、Cys、Phe、Met、Ser和Val的氨基酸残基置换。

6.如权利要求1所述的突变型果糖基氨基酸氧化酶，其具有在SEQ ID NO: 1中所述的氨基酸序列，其中在位置56处的氨基酸残基Asn被选自Ala、Cys、Phe、Met、Ser和Val的氨基酸残基置换。

7.如权利要求6所述的突变型果糖基氨基酸氧化酶，其中在SEQ ID NO: 1的位置109-124处的氨基酸序列: Ser Gly Tyr Gln Ala Leu Val Asp Ala Gly Leu Asp Ala Thr Asn Glu 被下述序列置换：Lys Gln Tyr Gln Ala Leu His Asp Ala Gly Ala Gly Leu Glu Lys Thr His Ala。

8.如权利要求1所述的突变型果糖基氨基酸氧化酶，其具有在SEQ ID NO: 2中所述的氨基酸序列，其中在位置47处的氨基酸残基Asn被选自Ala、Cys、Phe、Met、Ser和Val的氨基酸残基置换。

9.如权利要求1所述的突变型果糖基氨基酸氧化酶，其具有在SEQ ID NO: 3中所述的氨基酸序列，其中在位置52处的氨基酸残基Asn被选自Ala、Cys、Phe、Met、Ser和Val的氨基酸残基置换。

10.如权利要求1所述的突变型果糖基氨基酸氧化酶，其具有在SEQ ID NO: 7中所述的氨基酸序列，其中在位置56处的氨基酸残基Asn被选自Ala、Cys、Phe、Met、Ser和Val的氨基酸残基置换。

11.如权利要求10所述的突变型果糖基氨基酸氧化酶，其中在SEQ ID NO: 7的位置61-72处的氨基酸序列 Ile Arg Leu Arg Asn Lys Val Asp Leu Gln Met Ser被下述序列置换：Val Ser Leu Arg Asn Pro Val Asp Leu Gln Leu Ala。

12.一种分离的多核苷酸，其编码如权利要求1-11中任一项所述的突变型果糖基氨基酸氧化酶。

13.一种载体，其包含如权利要求12所述的多核苷酸。

14.一种用如权利要求13所述的载体转化的宿主细胞。

15.一种用于测定样品中的糖化蛋白的方法，所述方法包括：使所述样品接触如权利要求1-11中任一项所述的果糖基氨基酸氧化酶，并测量被果糖基氨基酸氧化酶氧化的糖化蛋白的量。

16.一种用于测定HbA1c的方法，所述方法包括：消化样品中的HbA1c，以产生果糖基缬氨酸或果糖基缬氨酰组氨酸，使所述果糖基缬氨酸或果糖基缬氨酰组氨酸接触如权利要求1-11中任一项所述的果糖基氨基酸氧化酶，并测量氧化的果糖基缬氨酸或果糖基缬氨酰组氨酸的量。

17.一种用于测定样品中的果糖基缬氨酸、果糖基缬氨酰组氨酸、HbA1c或果糖基六肽的装置，所述装置包含：如权利要求1-11中任一项所述的果糖基氨基酸氧化酶，和电子传递介质。

18.一种用于测定样品中的果糖基缬氨酸、果糖基缬氨酰组氨酸、HbA1c或果糖基六肽的试剂盒，所述试剂盒包含：如权利要求1-11中任一项所述的果糖基氨基酸氧化酶，和电子传递介质。

19.一种酶电极，其具有固定化在所述电极上的如权利要求1-11中任一项所述的果糖基氨基酸氧化酶。

20.一种用于测定果糖基缬氨酸、果糖基缬氨酰组氨酸、HbA1c或果糖基六肽的酶传感器，所述酶传感器包含如权利要求19所述的酶电极作为工作电极。

21.具有在SEQ ID NO: 1中所述的氨基酸序列的突变型果糖基氨基酸氧化酶，其中在SEQ ID NO: 1的位置61-72处的氨基酸序列: Val Ser Leu Arg Asn Pro Val Asp Leu Gln Leu Ala 被下述序列置换：Ile Arg Leu Arg Asn Lys Val Asp Leu Gln Met Ser。

22.具有在SEQ ID NO: 1中所述的氨基酸序列的突变型果糖基氨基酸氧化酶，其中在SEQ ID NO: 1的位置109-124处的氨基酸序列: Ser Gly Tyr Gln Ala Leu Val Asp Ala Gly Leu Asp Ala Thr Asn Glu被下述序列置换：Lys Gln Tyr Gln Ala Leu His Asp Ala Gly Ala Gly Leu Glu Lys Thr His Ala。

23.具有在SEQ ID NO: 7中所述的氨基酸序列的突变型果糖基氨基酸氧化酶，其中在SEQ ID NO: 7的位置61-72处的氨基酸序列: Ile Arg Leu Arg Asn Lys Val Asp Leu Gln Met Ser被下述序列置换：Val Ser Leu Arg Asn Pro Val Asp Leu Gln Leu Ala。

24.具有在SEQ ID NO: 7中所述的氨基酸序列的突变型果糖基氨基酸氧化酶，其中在SEQ ID NO: 1的位置109-126处的氨基酸序列: Lys Gln Tyr Gln Ala Leu His Asp Ala Gly Ala Gly Leu Glu Lys Thr His Ala被下述序列置换：Ser Gly Tyr Gln Ala Leu Val Asp Ala Gly Leu Asp Ala Thr Asn Glu。