CN102395674A - 调节acc合酶改善低氮条件下的植物产量 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于改善植物产量，特别是氮限制条件下的植物产量的方法。根据本发明，申请人已发现调节植物中的ACC合酶活性可改善植物的产量，即使是在低氮条件下栽培也是如此。相同的植物，在展示出产量较非经修饰的植物有改善的同时，在正常氮条件下未表现出有害的效果。本发明还提供了使用重组表达盒、宿主细胞和转基因植物的方法。

Description

调节ACC合酶改善低氮条件下的植物产量
对通过EFS-WEB作为文本文件提交的序列表的引用
遵照美国信息交换标准码(American Standard Code for InformationInterchange(ASCII))，通过EFS-Web将序列表的正式文本作为文本文件与本说明书同时提交，文件名为388171SEQLIST.TXT，创建日期为2010年4月13日，文件大小为200KB。通过EFS-Web提交的序列表是说明书的一部分，藉此将其全文以引用的方式并入本文。
发明领域
本发明总体上涉及分子生物学领域，h具体来讲涉及调节ACC合酶活性来改善植物产量和氮胁迫耐受性。
发明背景
许多植物的驯化已与产量显著增加相关。自然群体中发生的大多数表型变异是连续的并通过多种基因影响来实现。对造成驯化植物中产量显著不同的特定基因的鉴别已成为农业研究的重要焦点。
氮利用效率(NUE)基因影响产量并对改善氮在作物(特别是玉蜀黍)中的利用具有实用性。氮使用效率增加可由增加的对氮肥的吸收和同化和/或对积聚的氮储备的后续再动员和再利用，以及植物对诸如低氮环境之类的胁迫情况的耐受性增加得到。基因可用于改变植物的遗传组成，从而使得它们在当前的肥料施用标准下更高产或在肥料显著减少或氮可用量显著减少的情况下保持它们的产出率。在氮肥获得受限的发展中国家和在氮使用水平保持较高的发达国家，改善玉米中的NUE都将会增加每单位投入氮肥的玉米可收获产量。氮利用改善还使得能降低在农场上的投入成本，降低对氮肥生产所需的非可再生能源的使用和依赖，以及减少氮肥生产和农业利用的环境影响。
发明概述
本发明提供了改善植物产量的方法和组合物。在一些实施方案中，植物产量在胁迫，特别是非生物胁迫，例如氮限制条件下得以改善。改善植物产量的方法包括抑制乙烯合成途径，例如，抑制至少一种1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)合酶的活性。ACC合酶的活性可用本领域已知的任何方法来抑制，这些方法包括但不限于破坏ACC合酶基因，或者通过利用共抑制、反义、或RNA沉默或干扰来降低基因的表达。
抑制植物中的至少一种ACC合酶的活性可改善植物的氮胁迫耐受性，并且这种植物可在显著较低的氮肥投入的情况下保持它们的产出率和/或可表现出增加的氮肥吸收和同化和/或对积聚的氮储备的再动员和再利用。除了产量的总体增加外，通过抑制ACC合酶改善氮胁迫耐受性还可导致根质量和/或长度增加，穗、叶、种子和/或胚乳尺寸增加，和/或抗倒伏性改善。因此，在一些实施方案中，所述方法还包括在氮限制条件下栽培所述植物，并任选选择表现出对低氮水平有较大耐受性的那些植物。
另外，提供了改善非生物胁迫下的产量的方法和组合物，该方法包括：评价耕作区的环境条件的非生物应激源(stressor)(例如，土壤中的低氮水平)，并在胁迫环境下栽培具有减低的乙烯合成的种子或植株，在一些实施方案中减低的乙烯合成是由于至少一种ACC合酶的活性降低引起的。
本发明还提供了构建体和表达盒，所述构建体和表达盒包含可有效减少ACC合酶表达的核苷酸序列。
附图简述
图1是植物(例如拟南芥属植物)中的乙烯生物合成和信号传导基因的示意图。乙烯由确定的途径从甲硫氨酸产生，该途径涉及S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM或Ado Met)转化为环状氨基酸1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)，该转化由ACC合酶推进。ACC合酶是一种氨基转移酶，该酶通过将S-腺苷甲硫氨酸转化为ACC而催化乙烯的形成中的限速步骤。
然后通过ACC氧化酶(也称为乙烯形成酶)的作用氧化ACC产生乙烯，氰化氢为次级产物，由β-氰基丙氨酸合酶使氰化氢去毒。最后，乙烯通过氧化为CO2或氧化为环氧乙烷和乙二醇而被代谢。
图2的分图A-C示出了ACS2发夹构建体。分图A为PHP质粒的示意图，该质粒含有驱动ACS2发夹(由TR1和TR2组成的末端重复序列)的表达的泛素启动子(UBI1ZM PRO)。RB表示农杆菌(Agrobacterium)右边界序列。示出了49682bp盒的4126bp片段。分图B给出了ZM-ACS2 TR1的序列(SEQ ID NO：12)，分图C给出了ZM-ACS2TR2的序列(SEQ ID NO：13)。
图3的分图A-C示出了ACS6发夹构建体。分图A为PHP质粒的示意图，该质粒含有驱动ACS6发夹(由TR1和TR2组成的末端重复序列)的表达的泛素启动子(UBI1ZM PRO)。RB表示农杆菌右边界序列。示出了49108bp盒的3564bp片段。分图B给出了ZM-ACS6TR1的序列(SEQ IDNO：14)，分图C给出了ZM-ACS6TR2的序列(SEQ ID NO：15)。
图4是改良的ACS6抑制表达盒的示意图，该表达盒在SEQ ID NO：57中示出。
图5示出了本发明的转化植株在环境1中的开花胁迫下的产量。每根柱条表示一单独的转化事件。示出了转基因阴性分离子的平均产量(139蒲式耳/英亩)作为对照(CN)。总计74％的事件的标称产量比对照植株高。代表18个转基因事件的植株产量超过对照，P＜0.10。
图6示出了本发明的转化植株在环境2的灌浆胁迫下的产量。每根柱条表示一单独的转化事件。示出了转基因阴性分离子的平均产量(176蒲式耳/英亩)作为对照(CN)。有十三个事件产量超过CN，P＜0.10。其中，八个事件还在开花胁迫下显示出显著的改善。
图7示出了本发明的转化植株(由圆圈表示)以及用另选的ACS6抑制载体转化的植株(由正方形表示)在环境3中的灌浆胁迫下的产量(显示为对照的百分比)。每个数据点表示一单独的转化事件。NS＝不显著。对照植株为集团(bulked)转基因阴性分离子。可以看出，相对于对照，64％的本发明事件具有显著较好的产量；仅17％的另选ACS6抑制事件具有显著的较好产量。
图8示出了本发明的转化植株(由圆圈表示)以及用另选的ACS6抑制载体转化的植株(由正方形表示)在环境4中的雨养条件下的产量(显示为对照的百分比)。每个数据点表示一单独的转化事件。NS＝不显著。对照植株为集团转基因阴性分离子。可以看出，所有表现出统计学上显著的产量增加的数据点代表本文所公开的本发明事件。此外，所有表现出统计学上显著的产量下降的数据点是含有另选的ACS6抑制载体的事件。
具体实施方式
本发明是基于这样一个出人意料的发现：调节ACC合酶(ACS)可改善植物在低氮条件下的响应，而对正常氮条件下的植物性能无有害影响。事实上，具有ACS抑制构建体的植物确实不仅在低氮条件下，而且还在正常氮条件下具有较好产量。因此，提供了通过调节乙烯合成途径来改善植物产量，特别是在非生物胁迫下的植物产量的方法。
乙烯由确定的途径从甲硫氨酸产生，该途径涉及S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM或Ado Met)转化为环状氨基酸1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)，该转化由ACC合酶推进。ACC合酶是一种氨基转移酶，该酶通过将S-腺苷甲硫氨酸转化为ACC而催化乙烯的形成中的限速步骤。然后通过ACC氧化酶(也称为乙烯形成酶)的作用氧化ACC产生乙烯，氰化氢为次级产物，由β-氰基丙氨酸合酶使氰化氢去毒。ACC氧化酶由多基因家族编码，其中各成员表现出组织特异性调节和/或响应环境刺激和化学刺激而被诱导。ACC氧化酶的活性可被缺氧和钴离子抑制。ACC氧化酶是立体特异性的，利用辅因子例如Fe+2、O2、抗坏血酸盐等。最后，乙烯通过氧化为二氧化碳(CO2)或氧化为环氧乙烷和乙二醇而被代谢。参见图1。
在本发明所公开的方法的一些实施方案中，对至少一种ACC合酶的活性进行调节或抑制以增强植物产量和改善氮胁迫耐受性。“ACC合酶”是具有氨基转移酶活性的酶，其催化S-腺苷甲硫氨酸转化为ACC。ACC合酶的非限制性例子包括ACS 1至ACS11。在玉蜀黍中，这包括ACS2、ACS6和/或ACS 7。在双子叶植物中，ACC合酶是更大的氨基转移酶超家族的一部分，该超家族有九个成员为ACS基因。这些基因属于三种不同的类别，这些类别通过它们的C端结构和它们的翻译后调节来区分。在玉蜀黍和其他单子叶植物中，仅有3个成员，每个类别有一个成员。有关可用于本发明的某些可公开获得的ACS序列的非限制性列表，参见实施例16中表4。
术语“ACC合酶多肽”指保留催化S-腺苷甲硫氨酸转化为ACC的功能的一种或多种氨基酸序列并且包括其片段、变体、同源物、等位基因或前体(例如前蛋白原或蛋白原)。“ACC合酶蛋白质”包含ACC合酶多肽。除非另外说明，否则术语“ACC合酶核酸”意指包含编码ACC合酶多肽的多核苷酸(“ACC合酶多核苷酸”)的核酸。
本文所用的术语“ACC合酶活性的调节”应理解为意指ACC合酶生物活性的任何改变，这可包括植物细胞中存在的ACC合酶水平的改变、该酶效力的改变或可影响ACC合酶与其在乙烯形成过程中将S-腺苷甲硫氨酸转化为ACC的作用相关的生物学性质中的一种或多种性质的任何其他手段。因此，“ACC合酶活性的抑制”涵盖该酶效力的降低，或植物细胞中存在的ACC合酶水平的降低，该水平的降低例如由于ACC合酶基因表达降低引起。
在其它实施方案中，可对乙烯合成途径的其他步骤进行调节来改善植物产量或植物的氮胁迫耐受性。例如，可增加SAM转化为多胺的速率，或者可降低ACC氧化酶的水平或活性，或者可增加ACC的水平或活性，或者可增加SAM的水平或活性，或者乙烯合成途径中的这些和/或其他修饰的某种组合可由于本文所描述的遗传调节而发生。尽管不希望受任何理论的约束，但假定认为对乙烯合成的一个或多个步骤的修饰可导致乙烯活性的降低。在任何情况下，本发明涉及增加在非生物胁迫条件下的植物产量，并且在某些实施方案中，涉及改善氮胁迫耐受性，这由ACC合酶基因的受调节表达而引起的，而无论该调节对乙烯合成途径、乙烯产生或乙烯活性的确切作用如何。
本发明的方法提供改善的植物产量。本文所用的“产量”可包括指涉收获时每英亩谷类作物的蒲式耳数，该值针对谷粒水分(例如，对于玉蜀黍通常是15％)进行了调整，和/或所产生的生物量的体积(对于饲料作物如苜蓿而言)以及植物的根尺寸(对于多种作物而言)。谷粒水分是在收获时的谷粒中测量。谷粒的经调整的测试重量确定为针对收获时的谷粒水分水平进行了调整的重量，单位磅/蒲式耳。生物量测量为所产生的可收获植物材料的重量。
在本发明所公开的方法的一些实施方案中，对乙烯合成途径的调节导致植物的氮胁迫耐受性改善。本文所用的“氮胁迫耐受性改善”的植物应该包括但不限于与对应的对照植物(例如非修饰植物)相比，对低氮条件耐受性改善的植物、在显著较低的氮肥投入的情况下保持它们的产出率的植物、对氮肥的吸收和同化和/或对积聚的氮储备的再动员和再利用改善的植物，或具有它们的任何组合的植物。
本文所用的术语“低氮条件”或“氮限制条件”应理解为意指任何其中植物可利用的氮比对于最大产量潜能的表达而言将为最佳的量低的环境条件。
本发明的方法提供在氮限制条件下改善的植物性能。该性能可以多种方式展示，包括对根发育、苗和叶发育和/或生殖组织发育的调节。
因此，提供了用于调节植物中的根发育的方法。所谓“调节根发育”意指在与对照植物比较时在氮限制条件下植物根的发育的任何改变。根发育的这种改变包括但不限于：初生根的生长速率、根鲜重、侧根和不定根形成的程度、维管系统、分生组织发育或径向扩张度。
提供了用于在氮限制条件下调节植物的根发育的方法。该方法包括调节植物中的ACC合酶多肽的水平和/或活性。在一种方法中，将ACC合酶序列抑制构建体提供给植物。在另一种方法中，该核苷酸序列这样提供：向植物引入包含ACC合酶抑制性核苷酸序列的多核苷酸，使该核苷酸表达并从而改变低氮条件下的根发育。在另外其他的方法中，引入植物的ACC合酶抑制核苷酸构建体被稳定整合进植物的基因组中。ACC合酶活性的改变可导致当植物在氮限制条件下栽培时，对根发育的如下改变中的至少一者或多者，包括但不限于根生物量和长度的改变。
本文所用的“根生长”涵盖单子叶植物和双子叶植物中构成根系的不同部分在根系发育的不同阶段的生长的所有方面。应当理解，根生长增强可由其各部分(包括初生根、侧根、不定根等)中的一者或多者的生长增强引起。
测量根系中的这种发育改变的方法是本领域已知的。参见例如第2003/0074698号美国专利申请公开和Werner等人，(2001)PNAS 18：10487-10492，将这两篇文献以引用的方式并入本文。
如本文别处所论述的，技术人员将会认识用于调节植物中的根发育的适当启动子。用于这个实施方案的示例性启动子包括组成型启动子和根优选的启动子。示例性的根优选的启动子已在本文别处公开。
通过降低ACC合酶多肽的活性和/或水平来在存在低氮或氮相关胁迫的情况下刺激根生长和增加根质量，这也可用于改善植物的抗倒伏性。术语“耐倒伏性”或“抗倒伏性”指植物使其自身固定至土壤的能力。对于具有竖立或半竖立生长习性的植物，该术语还指在不利(环境)条件下保持直立位置的能力。该性状涉及根系的尺寸、深度和形态。此外，通过改变ACC合酶多肽的水平和/或活性来在氮限制条件下刺激根生长和增加根质量，这还可用于促进外植体的体外繁殖。
此外，较高的根生物量产出对产量具有直接影响，并且对由根细胞或转基因根细胞或所述转基因根细胞的细胞培养物产生的化合物的生成具有间接影响。
因此，本发明还提供了与对照植物的根发育相比在氮限制条件下具有受调节的根发育的植物。在正常条件下未观察到这种调节。
还提供了用于调节植物中的苗和叶发育，特别是在氮限制条件下的这种发育的方法。所谓“调节苗和/或叶发育”其意指在氮限制条件下植物苗和/或叶的发育的任何改变。苗和/或叶发育中的这种改变包括但不限于在苗分生组织发育方面、在叶数目、叶尺寸、叶和茎维管系统、节间长度和叶衰老方面的改变。本文所用的“叶发育”和“苗发育”涵盖在单子叶植物和双子叶植物中分别构成叶系统和苗系统的不同部分在这些系统发育的不同阶段中的生长的所有方面。测量苗和叶系统中的这种发育改变的方法是本领域已知的。参见例如Werner等人，(2001)PNAS 98：10487-10492和第2003/0074698号美国专利申请公开，将这两篇文献各以引用的方式并入本文。
用于调节植物在低氮条件下苗和/或叶发育的方法包括调节ACC合酶多肽的活性和/或水平。在一个实施方案中，可这样来提供ACC合酶核苷酸序列：向植物引入包含ACC合酶核苷酸抑制构建体的多核苷酸，使该多核苷酸表达，从而改变在氮限制条件下的苗和/或叶发育。在其他的实施方案中，引入植物的ACC合酶抑制核苷酸构建体被稳定整合进植物的基因组中。
ACC合酶活性的改变可导致在与相同条件下的对照植物比较时，在低氮条件下苗和/或叶发育的如下改变中的至少一者或多者，包括但不限于叶数目的变化、叶表面改变、维管系统、节间和植物生长的改变以及叶衰老的改变。
如本文别处所论述的，技术人员将会认识到用于调节植物的苗和叶发育的适当启动子。用于这个实施方案的示例性启动子包括组成型启动子、苗优选的启动子、苗分生组织优选的启动子和叶优选的启动子。示例性的启动子已在本文别处公开。
提供了用于调节生殖组织发育，特别是氮限制条件下的这种发育的方法。在一个实施方案中，提供了用于调节植物中的花发育的方法。所谓“调节花发育”其意指与其中ACC合酶多肽的活性或水平未受调节的对照植物相比，植物的生殖组织的结构的任何改变。“调节花发育”还包括与其中ACC合酶多肽的活性或水平未受调节的对照植物相比，植物生殖组织发育的时间安排的任何改变(即花发育时间安排的延迟或加速)。宏观改变可包括在环境胁迫时的如下变化：繁殖器官的尺寸、形状、数目或位置，这些结构形成的发育时间周期，或者维持或发展经过开花过程的能力。微观改变可包括构成繁殖器官的细胞的类型或形状的改变。
用于调节植物的花发育的方法包括调节植物中的ACC合酶活性。这种方法可包括将ACC合酶核苷酸序列引入植物中并改变ACC合酶多肽的活性。在一些实施方案中，引入植物的ACC合酶核苷酸构建体被稳定整合进植物的基因组中。改变本发明的ACC合酶序列的表达可调节胁迫期间花的发育。这种方法在本文别处进行了描述。因此，本发明还提供了与对照植物的花发育相比具有受调节的花发育的植物。组合物包括ACC合酶多肽的水平/活性改变了的以及花发育改变了的植物。组合物还包括在胁迫时ACC合酶多肽的水平/活性改变了的植物，其中该植物维持或发展经过开花过程。
如本文别处所论述的，技术人员将认识到用于调节植物的花发育或用于增加种子尺寸和/或种子重量的适当启动子。这个实施方案的示例性启动子包括组成型启动子、诱导型启动子、种子优选的启动子、胚的优选启动子和胚乳的优选启动子。
因而，ACC合酶活性降低了的植物在氮限制条件下可具有如下表型中的至少一种，包括但不限于：与低氮条件下的非经修饰的植物相比时，总体植物产量增加、根质量增加、根长度增加、叶尺寸增加、穗尺寸增加、种子尺寸增加、胚乳尺寸增加、抗倒伏性改善、胚和胚乳的相对尺寸改变(从而导致种子中的蛋白质、油脂和/或淀粉的相对水平的变化)、花发育改变、叶数目变化、叶表面改变、维管系统改变、节间改变、叶衰老改变、缺少穗状雄花、缺少带功能性花粉的穗状雄花或植株尺寸增加。
本领域已知可降低或消除ACC合酶多肽的活性的任何方法均可用于改善植物的氮胁迫耐受性。在一些实施方案中，将这样的多核苷酸引入植物中，该多核苷酸可通过防止ACC合酶信使RNA的转录或翻译直接抑制ACC合酶多肽的表达，或通过编码可抑制编码ACC合酶多肽的ACC合酶基因的转录或翻译的多肽间接抑制ACC合酶多肽的表达。用于抑制或消除基因在植物中的表达的方法是本领域所熟知的，任何这种方法可用于本发明中来抑制ACC合酶多肽的表达。在其它实施方案中，将编码可抑制ACC合酶多肽活性的多肽的多核苷酸引入植物中。在另外其他实施方案中，通过破坏ACC合酶基因来抑制ACC合酶的活性。有许多方法可用于减少或消除ACC合酶多肽的活性。此外，有不止一种方法可用于减少单种ACC合酶多肽的活性。
在一些实施方案中，通过破坏至少一种ACC合酶基因或减少至少一种ACC合酶基因的表达来减少ACC合酶活性。本文所用的“ACC合酶基因”指编码ACC合酶多肽的基因。ACC合酶基因可编码一种或多种ACC合酶，并且在一些实施方案中可具有例如至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％或更高的与序列SEQ ID NO：1(gACS2)、SEQ ID NO：2(gACS6)或SEQ ID NO：3(gACS7)的序列同一性。许多ACS基因是本领域技术人员已知的并且可容易通过诸如GENBANK等之类的来源获得，实例16中的表4列出了若干。任何ACS基因的表达都可根据本发明被减少。
根据本发明，如果ACC合酶的转录物或蛋白质水平在统计学上低于未经受遗传修饰或未经诱变来抑制该ACC合酶表达的植物中的相同ACC合酶的转录物或蛋白质水平，则ACC合酶的表达得到抑制。在本发明的特定实施方案中，根据本发明的经修饰的植物中的ACC合酶的转录物或蛋白质水平为不是突变体或未经遗传修饰来抑制该ACC合酶表达的植物中的相同ACC合酶的蛋白质水平的不到95％、不到90％、不到85％、不到80％、不到75％、不到70％、不到60％、不到50％、不到40％、不到30％、不到20％、不到10％、不到5％。ACC合酶的表达水平可例如通过分析细胞或植物中表达的ACC合酶的水平来直接测量，或例如通过测量细胞或植物中的ACC合酶活性来间接测量。当ACC合酶蛋白的活性不能通过至少一种分析方法测定时，则其活性根据本发明得以消除。用于评价ACC合酶活性的方法是本领域已知的并且包括测量ACC或乙烯的水平，ACC或乙烯可从细胞提取物中回收并分析。例如，酸性植物提取物中的ACC的内部浓度可通过气相色谱-质谱，在碱性次氯酸盐溶液等中分解后作为乙烯进行分析。乙烯的浓度可通过例如气相色谱-质谱等测定。参见例如Nagahama等人，(1991)J.Gen.Microbiol.137：2281 2286。例如，可用配备有例如基于氧化铝的柱(如HP-PLOT A1203毛细管柱)和火焰离子化检测器的气相色谱仪测量乙烯。方法。
在本发明的其他实施方案中，通过用这样的表达盒转化植物细胞来减少或消除一种或多种ACC合酶的活性，该表达盒包含编码可抑制一种或多种ACC合酶的活性的多肽的多核苷酸。如果转化植物或细胞中的ACC合酶的活性在统计学上低于未经遗传修饰来抑制至少一种ACC合酶活性的植物中的该ACC合酶的活性，则该ACC合酶的活性根据本发明得以抑制。在本发明的特定实施方案中，根据本发明的经修饰的植物的ACC合酶活性为未经遗传修饰来抑制该ACC合酶的表达或活性的适当对照植物中的该ACC合酶活性的不到95％、不到90％、不到85％、不到80％、不到75％、不到70％、不到60％、不到50％、不到40％、不到30％、不到20％、不到10％、不到5％。
在其它实施方案中，ACC合酶的活性可通过破坏至少一种编码ACC合酶的基因来减少或消除。与缺少该破坏的相应的对照植物细胞相比，该破坏抑制至少一种ACC合酶蛋白的表达或活性。在一个实施方案中，所述至少一种内源ACC合酶基因包含两种或更多种内源ACC合酶基因或其亚序列(例如，ACS2、ACS6和ACS7中的任何两种或更多种，例如ACS2和ACS6)。类似地，在另一个实施方案中，所述至少一种内源ACC合酶基因包含三种或更多种ACC合酶基因。在某些实施方案中，与对照植物细胞相比所述破坏导致被敲除的植物细胞的乙烯产出减少或降低。所述破坏导致所述植物与相似条件下的对照植物相比，在低氮条件下的性能改善。
在另一个实施方案中，破坏步骤包括插入一个或多个转座子，其中所述一个或多个转座子插入到所述至少一种内源ACC合酶基因中。在又另一个实施方案中，破坏包括在所述至少一种内源ACC合酶基因中的一个或多个点突变。破坏可以是在所述至少一种ACC合酶基因中的纯合破坏。或者，破坏是在所述至少一种ACC合酶基因中的杂合破坏。在某些实施方案中，当涉及不止一种ACC合酶基因时，存在不止一种破坏，其可包括纯合破坏、杂合破坏或纯合破坏和杂合破坏的组合。
对表达产物的检测，或者是定性地进行(通过检测一种或多种所关注产物的存在与否)，或者是定量地进行(通过监测一种或多种所关注产物的表达水平)。在一个实施方案中，表达产物为RNA表达产物。本发明的各方面任选包括监测植物中或植物群体中的核酸、多肽或化学物质(例如ACC、乙烯等)的表达水平，正如本文所指出的，用于检测ACC合酶、乙烯产出、氮利用率或对低氮条件的耐受性等。
因而，有许多方法可用于减少或消除ACC合酶的活性。此外，有不止一种方法可用于减少单种植物ACC合酶的活性。此外，可将各方法的组合用于减少或消除两种或更多种不同ACC合酶的活性。下面给出了减少或消除植物ACC合酶的表达的方法的非限制性例子。
在本发明的一些实施方案中，将多核苷酸引入植物中，其一旦引入或表达，即可抑制本发明的ACC合酶多肽的表达。本文所用的术语“表达”指基因产物的生物合成，包括所述基因产物的转录和/或翻译。例如，出于本发明的目的，能够表达可抑制至少一种ACC合酶多肽的表达的多核苷酸的表达盒，是能够产生可抑制本发明的至少一种ACC合酶多肽的转录和/或翻译的RNA分子的表达盒。蛋白质或多肽从DNA分子的“表达”或“产生”指该编码序列转录和翻译而产生该蛋白质或多肽，而蛋白质或多肽从RNA分子“表达”或“产生”指该RNA编码序列翻译而产生蛋白质或多肽。另外，基因的“表达”可指该基因转录为非蛋白质编码转录物。
本文所用的“多核苷酸”包括指涉脱氧核糖多核苷酸、核糖多核苷酸或其类似物，所述类似物在如下方面具有天然核糖核苷酸的基本性质：在严格杂交条件下其所杂交的核苷酸序列与天然存在的核苷酸所杂交的核苷酸序列基本上相同，和/或使得翻译成与天然存在的核苷酸所翻译的氨基酸相同的氨基酸。多核苷酸可以是天然或异源结构基因或调控基因的全长序列或其亚序列。除非另外指明，否则该术语包括指涉指定的序列及其互补序列。因而，为了稳定性或为了其他原因对主链进行了修饰的DNA或RNA是“多核苷酸”(如该术语在本文所意指的)。此外，包含稀有碱基(如次黄嘌呤核苷)或修饰碱基(如三苯甲基化的碱基)(仅举两个例子)的DNA或RNA是多核苷酸(如该术语在本文所用的)。应当理解，已对DNA和RNA进行了很多种修饰，这些修饰起到本领域技术人员已知的许多有用目的。本文所用的术语多核苷酸涵盖多核苷酸的这类经化学修饰、酶修饰或代谢修饰的形式，以及病毒和细胞(包括特别是简单细胞和复杂细胞)特征性的DNA和RNA的化学形式。
本文所用的“核酸”包括指涉单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另外限制，否则涵盖在以下方面具有天然核苷酸的基本性质的已知类似物：其以与天然出现的核苷酸(例如肽核酸)相似的方式杂交至单链核酸。
就指定的核酸而言，所谓“编码”意指包含供转录为RNA，并且在一些实施方案中，翻译成指定蛋白质的信息。编码蛋白质的核酸可在该核酸的翻译区内包含非翻译序列(例如内含子)，或可缺少这种居间的非翻译序列(例如，如在cDNA中)。据以编码蛋白质的信息是通过使用密码子来确定的。通常，氨基酸序列由核酸利用“通用”遗传密码来编码。然而，可使用如在某些植物、动物和真菌线粒体、细菌山羊支原体(Mycoplasmacapricolum)(Yamao等人，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：2306-9)或纤毛虫大核中存在的通用密码的变体，当用这些生物体表达该核酸时。
在下面给出了可抑制ACC合酶多肽表达的多核苷酸的例子。
在本发明的在一些实施方案中，ACC合酶多肽表达的抑制可通过有义抑制或共抑制获得。对于共抑制，将表达盒设计为表达这样的RNA分子，该RNA分子以“有义”取向对应于编码ACC合酶多肽的信使RNA的全部或部分。该RNA分子的过表达可导致天然基因的表达减少。因此，对用该共抑制表达盒转化的多个植株进行筛选以鉴别那些显示出对ACC合酶多肽表达的最大抑制的植株。
用于共抑制的多核苷酸可对应于编码ACC合酶多肽的序列的全部或部分、ACC合酶多肽转录物的5′和/或3′非翻译区的全部或部分、或者编码ACC合酶多肽的转录物的编码序列和非翻译区二者的全部或部分。用于共抑制或其他基因沉默方法的多核苷酸可与靶序列具有99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、85％、80％或更低的序列同一性，所述靶序列在一些实施方案中为SEQ ID NO：4、5或6。当所述多核苷酸(例如SEQ ID NO：4、5或6)的部分用于破坏靶基因的表达时，通常可使用至少15、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、450、500、550、600、650、700、750、800、900或1000个连续核苷酸或更多个连续核苷酸的序列。在其中所述多核苷酸包含ACC合酶多肽的编码区的全部或部分的一些实施方案中，将表达盒设计用于消除多核苷酸起始密码子，使得不会翻译出蛋白质产物。
共抑制可用来抑制植物基因的表达以产生对于由这些基因编码的蛋白质而言具有不可检测的蛋白质水平的植物。参见(例如)Broin等人，(2002)Plant Cell 14：1417-1432。共抑制还可用来抑制同一植株中的多种蛋白质的表达。参见(例如)第5,942,657号美国专利。利用共抑制来抑制植物中的内源基因的表达的方法在如下文献中有描述：Flavell等人，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：3490-3496；Jorgensen等人，(1996)Plant Mol.Biol.31：957-973；Johansen和Carrington，(2001)Plant Physiol.126：930-938；Broin等人，(2002)Plant Cell 14：1417-1432；Stoutjesdijk等人，(2002)Plant Physiol.129：1723-1731；Yu等人，(2003)Phytochemistry 63：753-763以及第5,034,323号、第5,283,184号和第5,942,657号美国专利，将这些参考文献的每一个以引用的方式全文并入本文。共抑制的效率可通过在表达盒中在有义序列的3′和聚腺苷酸化信号的5′位置包括poly-dT区来提高。参见第2002/0048814号美国专利公布，将其以引用的方式并入本文。通常，这种核苷酸序列与内源基因的转录物的序列具有相当大的序列同一性，优选的是高于约65％的序列同一性，更优选的是高于约85％的序列同一性，最优选的是高于约95％的序列同一性。参见第5,283,184号和第5,034,323号美国专利，将它们以引用的方式并入本文。
在本发明的一些实施方案中，对ACC合酶多肽表达的抑制可通过反义抑制来获得。对于反义抑制，将表达盒设计为表达这样的RNA分子，该RNA分子与编码ACC合酶多肽的信使RNA的全部或部分互补。该反义RNA分子的过量表达可导致天然基因的表达减少。因此，对用反义抑制表达盒转化的多个植株进行筛选以鉴别那些显示出对ACC合酶多肽表达的最大抑制的植株。
用于反义抑制的多核苷酸可对应于编码ACC合酶多肽的序列的互补序列的全部或部分、ACC合酶转录物的5′和/或3′非翻译区的互补序列的全部或部分、或者编码ACC合酶多肽的转录物的编码序列和非翻译区二者的互补序列的全部或部分。
此外，反义多核苷酸可与靶序列完全互补(即与靶序列的互补序列100％相同)或部分互补(即与靶序列的互补序列的同一性低于100％，包括99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、85％、80％，在一些实施方案中靶序列为SEQ ID NO：4、5或6)。反义抑制还可用来抑制同一植株中的多种蛋白质的表达。参见(例如)第5,942,657号美国专利。此外，反义核苷酸的部分可用来破坏靶基因的表达。一般来讲，可使用至少50个核苷酸、100个核苷酸、200个核苷酸、300、400、450、500、550或更多个核苷酸的序列。
使用反义抑制来抑制植物中的内源基因的表达的方法在例如如下文献中有描述：Liu等人，(2002)Plant Physiol.129：1732-1743，和第5,759,829号和第5,942,657号美国专利，将这些参考文献的每一个以引用的方式并入本文。反义抑制的效率可通过在表达盒中在反义序列的3′和聚腺苷酸化信号的5′位置处包括poly-dT区来提高。参见第2002/0048814号美国专利申请公开，将其以引用的方式并入本文。
在本发明的一些实施方案中，对ACC合酶多肽表达的抑制可通过双链RNA(dsRNA)干扰来获得。对于dsRNA干扰，有义RNA分子(如上文针对共抑制所描述)和与该有义RNA分子完全或部分互补的反义RNA分子在同一细胞中表达，从而导致对应的内源信使RNA的表达的抑制。
有义和反义分子的表达可通将表达盒子设计为同时包含有义序列和反义序列来实现。或者，可将单独的表达盒分别用于有义序列和反义序列。对用(一个或多个)dsRNA干扰表达盒转化的多个植株进行筛选以鉴别显示出对ACC合酶多肽表达的最大抑制的植株。利用dsRNA干扰来抑制内源植物基因的表达的方法在如下文献中有描述：Waterhouse等人，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13959-13964、Liu等人，(2002)Plant Physiol.129：1732-1743和WO 99/49029、WO 99/53050、WO 99/61631以及WO00/49035，将这些参考文献的每一个以引用的方式并入本文。
在本发明的一些实施方案中，对ACC合酶多肽表达的抑制可通过发夹RNA(hpRNA)干扰或含内含子的发夹RNA(ihpRNA)干扰来获得。这些方法在抑制内源基因表达方面是高度有效的。参见，Waterhouse和Helliwell，(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38以及其中引用的参考文献。
对于hpRNA干扰，将表达盒设计为表达这样的RNA分子，该RNA分子自身杂交而形成包括单链环区和碱基配对茎的发夹结构。该碱基配对茎区包含对应于编码要对其表达进行抑制的基因的内源信使RNA的全部或部分的有义序列和与该有义序列完全或部分互补的反义序列。反义序列可位于有义序列的“上游”(即反义序列可比有义序列更靠近驱动该发夹RNA的表达的启动子)。碱基配对茎区可对应于控制待抑制的基因的表达的启动子序列的一部分。设计用于表达具有发夹结构的RNA分子的多核苷酸包含第一核苷酸序列和属第一核苷酸序列的互补序列的第二核苷酸序列，并且其中第二核苷酸序列相对于第一核苷酸序列处于相反取向。
因而，该分子的碱基配对茎区通常确定了RNA干扰的特异性。该有义序列和该反义序列通常具有相似长度，但长度可不同。因而，这些序列可以是长度为至少10、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、50、70、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、500、600、700、800、900个核苷酸，或长度为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10kb的部分或片段。该表达盒的环区长度可以变化。因而，环区可长度为至少100、200、300、400、500、600、700、800、900个核苷酸，或长度为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10kb。
hpRNA分子在抑制内源基因的表达方面是高度有效的，并且它们诱导的RNA干扰被植物的后代遗传。参见(例如)Chuang和Meyerowitz，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：4985-4990；Stoutjesdijk等人，(2002)PlantPhysiol.129：1723-1731以及Waterhouse和Helliwell，(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38。利用hpRNA干扰来抑制或沉默基因的表达的方法例如在如下文献中有描述：Chuang和Meyerowitz，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：4985-4990；Stoutjesdijk等人，(2002)Plant Physiol.129：1723-1731；Waterhouse和Helliwell，(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38；Pandolfini等人，BMCBiotechnology 3：7和第2003/0175965号美国专利申请公开，将这些参考文献的每一个以引用的方式并入本文。hpRNA构建体体内沉默基因表达的效率的瞬时测定法已由Panstruga等人，(2003)Mol.Biol.Rep.30：135-140进行了描述，将该文献以引用的方式并入本文。
对于ihpRNA，干扰分子具有与hpRNA相同的总体结构，但该RNA分子另外还在发夹的环区中包含内含子，该内含子能够在表达ihpRNA的细胞中被剪接。内含子的使用使得发夹RNA分子中的环区大小在剪接后最小化，这可提高干扰的效率。参见(例如)Smith等人，(2000)Nature407：319-320。事实上，Smith等人显示使用ihpRNA介导的干扰100％抑制了内源基因表达。在一些实施方案中，内含子是ADH1内含子1。利用ihpRNA干扰来抑制内源植物基因的表达的方法例如在如下文献中有描述：Smith等人，(2000)Nature 407：319-320；Wesley等人，(2001)Plant J.27：581-590；Wang和Waterhouse，(2001)Curr.Opin.Plant Biol.5：146-150；Waterhouse和Helliwell，(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38；Helliwell和Waterhouse，(2003)Methods 30：289-295以及第2003/0180945号美国专利申请公开，将这些参考文献的每一个以引用的方式并入本文。
还可对用于hpRNA干扰的表达盒进行设计，使得有义序列和反义序列不对应于内源RNA。在这个实施方案中，该反义和有义序列在这样的环序列的旁侧，该环序列包含对应于靶基因的内源信使RNA的全部或部分的核苷酸序列。因而，是环区决定了RNA干扰的特异性。参见(例如)WO02/00904；Mette等人，(2000)EMBO J 19：5194-5201；Matzke等人，(2001)Curr.Opin.Genet.Devel.11：221-227；Scheid等人，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 99：13659-13662；Aufsaftz等人，(2002)Proc.Nat′l.Acad.Sci.99(4)：16499-16506；Sijen等人，Curr.Biol.(2001)11：436-440)，将这些文献以引用的方式并入本文。
扩增子表达盒包含源自植物病毒的序列，该序列含有靶基因的全部或部分但通常不含有该天然病毒的基因的全部。存在于表达盒的转录产物中的病毒序列使得该转录产物能指导其自身的复制。由扩增子产生的转录物相对于靶序列(即ACC合酶多肽的信使RNA)可以是有义或反义的。利用扩增子来抑制内源植物基因的表达的方法例如在如下文献中有描述：Angell和Baulcombe，(1997)EMBO J.16：3675-3684、Angell和Baulcombe，(1999)PlantJ.20：357-362以及第6,635,805号美国专利，将这些参考文献的每一个以引用的方式并入本文。
在一些实施方案中，由本发明的表达盒表达的多核苷酸是ACC合酶多肽的信使RNA特异性的催化性RNA或具有ACC合酶多肽的信使RNA特异性的核酶活性。因而，该多核苷酸引起内源信使RNA的降解，从而导致ACC合酶多肽表达减少。这个方法例如在第4,987,071号美国专利中进行了描述，将该专利以引用的方式并入本文。
在本发明的一些实施方案中，对ACC合酶多肽的表达的抑制可通过经由编码微RNA(miRNA)的多核苷酸的表达进行的RNA干扰来获得。miRNA是由约22个核糖核苷酸组成的调控剂。miRNA在抑制内源基因的表达方面是高度有效的。参见例如Javier等人，(2003)Nature 425：257-263，将该文献以引用的方式并入本文。
对于miRNA干扰，将表达盒设计成表达模仿内源miRNA基因的RNA分子。该miRNA基因编码可形成发夹结构的RNA，该发夹结构含有与另一内源基因(靶序列)互补的22核苷酸序列。为了抑制ACC合酶表达的，从ACC合酶转录物序列选择该22核苷酸序列，其含有有义取向的所述ACC合酶序列的22个核苷酸和与该有义序列互补的对应反义序列的21个核苷酸。miRNA分子在抑制内源基因的表达方面是高度有效的，并且它们诱导的RNA干扰被植物后代遗传。
在一些实施方案中，可将多肽或编码多肽的多核苷酸引入植物中，其中所述多肽能够抑制ACC合酶多肽的活性。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基为相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。
术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”在本文中可互换使用，指整合进蛋白质、多肽或肽(统称“蛋白质”)中的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，除非另外进行限制，否则可涵盖可以以与天然存在的氨基酸类似的方式发挥功能的天然氨基酸已知类似物。
在一个实施方案中，所述多核苷酸编码锌指蛋白，该锌指蛋白结合至编码ACC合酶多肽的基因，从而导致所述基因的表达减少。在特定实施方案中，该锌指蛋白结合至ACC合酶基因的调控区。在其它实施方案中，该锌指蛋白结合至编码ACC合酶多肽的信使RNA并防止其翻译。选择被锌指蛋白靶向的位点的方法已例如在第6,453,242号美国专利进行了描述，利用锌指蛋白来抑制植物中的基因表达的方法例如在第2003/0037355号美国专利申请公开中进行了描述，将这些专利每一个以引用的方式全文并入本文。
在本发明的一些实施方案中，所述多核苷酸编码这样的抗体，该抗体结合至少一种ACC合酶多肽并减少该ACC合酶多肽的活性。在另一个实施方案中，抗体的结合导致由细胞质量控制机制进行的抗体-ACC合酶复合物的周转增加。抗体在植物细胞中的表达以及通过抗体表达并结合至植物细胞中的蛋白质来抑制分子途径是本领域所熟知的。参见例如Conrad和Sonnewald，(2003)Nature Biotech.21：35-36，将该文献以引用方式并入本文。
在本发明的一些实施方案中，通过破坏编码ACC合酶多肽的基因来减少或消除ACC合酶多肽的活性。可通过本领域已知的任何方法来破坏编码ACC合酶多肽的基因。例如，在一个实施方案中，通过转座子标签法破坏所述基因。在另一个实施方案中，通过利用随机诱变或定向诱变来对植物进行诱变处理并选择具有减低了的氮利用活性的植物来破坏所述基因。
在本发明的一个实施方案中，将转座子标签法用于减少或消除一种或多种ACC合酶多肽的ACC合酶活性。转座子标签法包括在内源ACC合酶基因内插入转座子以减少或消除所述ACC合酶多肽的表达。
在这个实施方案中，通过在编码ACC合酶多肽的基因的调控区或编码区内插入转座子来减少或消除一种或多种ACC合酶多肽的表达。处于ACC合酶基因的外显子、内含子、5′或3′非翻译序列、启动子或任何其他调控序列内的转座子，可用于减少或消除所编码的ACC合酶多肽的表达和/或活性。
用于对植物中的特定基因进行转座子标记的方法是本领域所熟知的。参见(例如)Maes等人，(1999)Trends Plant Sci.4：90-96；Dharmapuri和Sonti，(1999)FEMS Microbiol.Lett.179：53-59；Meissner等人，(2000)Plant J.22：265-274；Phogat等人，(2000)J.Biosci.25：57-63；Walbot，(2000)Curr.Opin.Plant Biol.2：103-107；Gai等人，(2000)Nucleic Acids Res.28：94-96；Fitzmaurice等人，(1999)Genetics 153：1919-1928)。此外，用于选择选定基因中的Mu插入序列的TUSC方法已在如下文献中进行了描述：Bensen等人，(1995)Plant Cell 7：75-84；Mena等人，(1996)Science 274：1537-1540和第5,962,764号美国专利，将这些参考文献的每一个以引用的方式全文并入本文。
用于降低或消除植物中的内源基因的表达的另外方法也是本领域已知的，并且可类似地应用于本发明。这些方法包括其他形式的诱变，例如甲磺酸乙酯诱导的诱变、缺失诱变和快中子缺失诱变，快中子缺失诱变以反向遗传学方式(使用PCR)用于鉴别其中内源基因已缺失的植株。这些方法的例子参见Ohshima等人，(1998)Virology 243：472-481；Okubara等人，(1994)Genetics 137：867-874和Quesada等人，(2000)Genetics 154：421-436，将这些参考文献的每一个以引用的方式全文并入本文。此外，一种用于筛选化学诱导的突变的快速且可自动化的方法TILLING(Targeting Induced LocalLesions In Genomes(定向诱导基因组局部突变))也适用于本发明，该方法利用变性HPLC或者对选定的PCR产物的选择性内切核酸酶消化。参见McCallum等人，(2000)Nat.Biotechnol.18：455-457，将该文献以引用的方式并入本文。
影响基因表达或干扰所编码的蛋白质的功能的突变是本领域所熟知的。基因外显子中的插入突变通常导致无效突变体。保守残基的突变在抑制所编码的蛋白质的活性方面是特别有效的。植物ACC合酶多肽的适于以消除ACC合酶活性为目标进行的诱变的保守残基已得到描述。可根据熟知的程序分离这种突变体，并且可通过遗传杂交对不同ACC合酶基因座中的突变进行堆叠。参见例如Gruis等人，(2002)Plant Cell 14：2863-2882。
在本发明的另一个实施方案中，显性突变体由于基因倒位和重复基因座的重组可用于引发RNA沉默。参见例如Kusaba等人，(2003)Plant Cell15：1455-1467。
本发明涵盖另外的用于减少或消除一种或多种ACC合酶多肽的活性的方法。用于改变或突变植物中的基因组核苷酸序列的其他方法的例子是本领域已知的，包括但不限于使用RNA:DNA载体、RNA:DNA突变载体、RNA:DNA修复载体、混合双链寡核苷酸、自互补RNA:DNA寡核苷酸以及重组工程寡核碱基(recombinogenic oligonucleobase)。这种载体和使用方法是本领域已知的。参见例如第5,565,350号美国专利；第5,731,181号美国专利；第5,756,325号美国专利；第5,760,012号美国专利；第5,795,972号美国专利和第5,871,984号美国专利，将这些专利中的每一个以引用的方式并入本文。另参见WO 98/49350、WO 99/07865、WO 99/25821和Beetham等人，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：8774-8778，将这些专利和参考文献的每一个以引用的方式全文并入本文。
在多核苷酸用于降低或抑制ACC合酶活性的情况中，则应该认识到可对本文中所公开的示例性序列作出修饰，只要该序列起到降低或抑制相应mRNA的表达的作用。因而，例如，可使用与本文所公开的示例性序列(例如SEQ ID NO：4、5或6)具有至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多核苷酸。此外，可将示例性序列的部分或片段或者与示例性序列具有特定百分比的序列同一性的多核苷酸的部分或片段用于破坏靶基因的表达。一般来讲，可使用例如SEQ ID NO：4、5或6的至少10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、250、260、280、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000个或更多个连续核苷酸。应该认识到，在特定实施方案中，可以使用这类序列的互补序列。例如，发夹构建体同时包含对应于所关注基因的有义序列片段和互补(或反义)序列片段。反义构建体可与所关注基因具有不到100％的序列同一性，并且可包含所关注基因的部分或片段，只要本发明的目标得到实现，即只要所关注基因的表达被降低。
可用于本发明的ACC合酶核酸包含至少一种选自以下的ACC合酶多核苷酸：
(a)编码ACC合酶多肽的多核苷酸及其保守修饰的变体和多态性变体；
(b)与(a)的多核苷酸具有至少70％序列同一性的多核苷酸；
(c)编码ACC合酶多肽的多核苷酸的片段；以及
(d)(a)、(b)或(c)的多核苷酸的互补序列。
因而，在一些实施方案中，所述方法包括将至少一种包含ACC合酶核酸序列或其亚序列的多核苷酸序列引入植物细胞中，使得所述至少一种多核苷酸序列以有义或反义取向连接至启动子，并且其中所述至少一种多核苷酸序列与SEQ ID NO：1(gACS2)、SEQ ID NO：2(gACS6)或SEQ ID NO：3(gACS7)或它们的亚序列或它们的互补序列具有(例如)至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、约99.5％或更高的序列同一性。在另一个实施方案中，通过向植物细胞引入至少一种被构造用于RNA沉默或干扰的、包含ACC合酶核酸序列的一种或多种亚序列的多核苷酸序列来实现破坏。
在其它实施方案中，本发明的方法用包含选自以下的成员的多核苷酸来实施：(a)与SEQ ID NO：1(gACS2)、SEQ ID NO：2(gACS6)、SEQ IDNO：3(gACS7)、SEQ ID NO：4(ACS2cDNA)、SEQ ID NO：5(ACS6cDNA)或SEQ ID NO：6(ACS7cDNA)或它们的亚序列或它们的保守变异体具有例如至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、约99.5％或更高的序列同一性的多核苷酸或其互补序列；(b)编码SEQ ID NO：7(ACS2)、SEQ ID NO：8(ACS6)或SEQ ID NO：9(ACS7)的多肽序列或它们的亚序列或它们的保守变异体的多核苷酸序列或其互补序列；(c)在严格条件下杂交至包含SEQ ID NO：1(gACS2)、SEQ ID NO：2(gACS6)、SEQ IDNO：3(gACS7)、SEQ ID NO：4(ACS2cDNA)、SEQ ID NO：5(ACS6cDNA)或SEQ ID NO：6(ACS7cDNA)的至少100个连续核苷酸的多核苷酸亚序列的基本上整个长度的多核苷酸或其互补序列，或者杂交至(a)或(b)的多核苷酸序列的多核苷酸或其互补序列；以及(d)与(a)、(b)或(c)的多核苷酸序列具有至少约85％同一性的多核苷酸。在某些实施方案中，所述多核苷酸当在植物中表达时抑制乙烯产生。
在特定实施方案中，将异源多核苷酸引入植物中，其中所述异源多核苷酸选自：a)包含ACC合酶核酸的核酸；b)包含ACC合酶核酸的互补序列的至少15个连续核苷酸的核酸；以及c)编码能够形成双链RNA(例如发夹)并介导对ACC合酶核酸的RNA干扰的转录物的核苷酸序列，其中所述核酸包含第一核苷酸序列和第二核苷酸序列，该第一核苷酸序列包含ACC合酶核酸的至少21个连续核苷酸，该第二核苷酸序列包含所述第一核苷酸序列的互补序列。
在其他特定实施方案中，所述方法包括向植物引入选自以下的异源多核苷酸：a)SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6中示出的核苷酸序列，或其完全互补序列；b)与SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高的序列同一性的核苷酸序列，或其完全互补序列；c)编码SEQ IDNO：7、8或9的多肽序列的核苷酸序列；d)编码与SEQ ID NO：7、8或9具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高的序列同一性的多肽序列的核苷酸序列；e)包含SEQID NO：1、2、3、4、5或6的至少15个连续核苷酸的核苷酸序列；f)包含SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6的互补序列的至少15个连续核苷酸的核苷酸序列；以及g)编码能够形成双链RNA(例如发夹)并介导对ACC合酶核酸的RNA干扰的转录物的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含SEQ IDNO：1、2、3、4、5或6的至少21个连续核苷酸，以及其互补序列。在其它实施方案中，所述异源多核苷酸包含SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6的至少500个连续核苷酸以及其互补序列。在这些实施方案中的一些中，所述异源多核苷酸编码能够形成双链RNA(例如发夹)并介导对ACC合酶核酸的RNA干扰的转录物。在这些实施方案中的一些中，植物包含由具有SEQID NO：1、2、3、4、5或6示出的靶序列的多核苷酸编码的mRNA。
在另外的特定实施方案中，所述方法包括向植物引入异源多核苷酸，所述异源多核苷酸包含编码具有发夹结构的转录物的序列，其中所述序列包含第一核苷酸序列和第二核苷酸序列，该第一核苷酸序列具有SEQ IDNO：14中示出的序列，该第二核苷酸序列具有SEQ ID NO：15中示出的序列。在其它实施方案中，包含编码具有发夹结构的转录物的序列的异源多核苷酸包含具有SEQ ID NO：51中示出的序列的第一核苷酸序列和具有SEQID NO：52中示出的序列的第二核苷酸序列。在其它实施方案中，所述方法包括向植物引入包含SEQ ID NO：53、54、55、56或57的构建体。
提供了用于改善在低氮条件下的产量的方法，该方法包括在具有氮限制条件的耕作区中种植具有至少一种ACC合酶的减低了的活性的种子或植物。
在具有氮限制条件的耕作区中种植种子或植物之前，可对该环境进行评价以确定是否存在氮限制条件，包括测量土壤中的氮或氮肥的量。本文所用的“耕作区”包括期望在其中栽培植物的任何区域。这种耕作区包括但不限于在其中栽培植物的田地(如作物田、草地、树林地、生产林、用于栽培水果和蔬菜的田地等等)、温室、生长室等等。
本发明提供利用(特别是)包含ACC合酶多核苷酸的RNA、DNA、其同源物、旁系同源物和直系同源物和/或嵌合体的分离核酸等的方法。这包括所述序列的天然存在的以及合成的变体和同源物。
术语“分离的”或“分离的核酸”或“分离的蛋白质”指诸如核酸或蛋白质之类的物质，该物质实质上或基本上不含在其天然存在的环境中发现的通常与其相伴随或与其相互作用的组分。分离的物质任选包含未发现在其天然环境中与其一起的物质。优选地，“分离的”核酸不含在该核酸的来源生物体的基因组DNA中，天然处于该核酸旁侧的序列(即位于该核酸的5′和3′端的序列)(优选蛋白质编码序列)。例如，在各个实施方案中，分离的核酸分子可含有少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的在该核酸的来源细胞的基因组DNA中天然处于该核酸分子的旁侧的核苷酸序列。
源自玉蜀黍、拟南芥(Arabidopsis thaliana)或源自所选择的其他植物的、与本文提供的序列同源即与之具有显著的序列同一性或相似性的序列，也可用于本发明的方法中。同源序列可源自任何植物，包括单子叶植物和双子叶植物，特别是农业上重要的植物物种，包括但不限于作物类如大豆、小麦、玉米(玉蜀黍)、马铃薯、棉花、水稻、油菜、油籽油菜(包括卡诺拉)、向日葵、苜蓿、三叶草、甘蔗和草皮，或水果和蔬菜类如香蕉、黑莓、蓝莓、草莓和树莓、香瓜、胡萝卜、菜花、咖啡、黄瓜、茄子、葡萄、香蜜瓜、莴苣、芒果、甜瓜、洋葱、木瓜、豌豆、胡椒、菠萝、南瓜、菠菜、西葫芦、甜玉米、烟草、番茄、青番茄(tomatillo)、西瓜、蔷薇科水果(如苹果、桃、梨、樱桃和李子)和芸苔属蔬菜(如西兰花、卷心菜、花椰菜、芽甘蓝和苤蓝)。其表型可以改变并且其包含同源序列的其他作物(包括水果和蔬菜)包括大麦；黑麦；小米；高粱；黑醋栗；鳄梨；柑橘类水果如橙、柠檬、柚子和橘子、洋蓟、樱桃；坚果如胡桃和花生；菊苣；韭葱；根类蔬菜如竹芋、甜菜、木薯、芜菁、萝卜、薯蓣和甘薯以及豆类。所述同源序列还可源于木本物种，如松树、杨树和桉树或者薄荷或其他唇形科植物。此外，同源序列可源自在进化上与作物相关，但可能还仍未用作作物的植物。例子包括：颠茄(Atropa belladona)，其与番茄相关；曼陀罗(Daturastrommium)，其与佩奥特掌相关，以及墨西哥玉蜀黍(玉蜀黍属物种)，其与玉米(玉蜀黍)相关。
上述同源序列可包含直系同源序列和旁系同源序列。本领域技术人员已知有若干不同方法用于鉴别和定义这些功能上同源的序列。描述了用于定义直系同源物和旁系同源物的三种一般方法；可通过下述方法中的一种或多种来鉴别直系同源物、旁系同源物或同源物。
直系同源物和旁系同源物是具有类似序列和类似功能的进化上相关的基因。直系同源物是由于物种形成事件而衍生的不同物种中的结构上相关的基因。旁系同源物是由于复制事件而衍生的单种物种内的结构上相关的基因。
在单种植物物种内，基因复制可导致两个拷贝的特定基因，从而产生两种或更多种称为旁系同源物的具有相似序列以及通常有相似功能的基因。因而旁系同源物为相同物种内的复制而形成的相似基因。当用诸如CLUSTAL)(Thompson等人，(1994)Nucleic Acids Res.22：4673-4680；Higgins等人，(1996)Methods Enzymol.266：383-402)之类的程序分析基因家族演化发展时，旁系同源物通常聚类在一起或聚类在相同进化枝(一组相似基因)中。还可用双序列BLAST(pair-wise BLAST)分析(Feng和Doolittle，(1987)J.Mol.Evol.25：351-360)来鉴别相似基因的群组。
例如，来自拟南芥属的一枝十分相似的MADS域转录因子全部在花期中具有共同功能(Ratcliffe等人，(2001)Plant Physiol.126：122-132)，来自拟南芥属的一组十分相似的AP2域转录因子涉及植物对冷冻的耐受性(Gilmour等人，(1998)Plant J.16：433-442)。对处于一个进化枝内的具有相似功能的相似基因的群组进行分析，可得到该进化枝特有的亚序列。这些亚序列(称为共有序列)不仅可用于限定每个进化枝内的该序列，而且还可用于限定这些基因的功能；进化枝内的基因可含有具有相同功能的旁系序列或直系同源序列(另参见例如Mount，(2001)，Bioinformatics：Sequence andGenom e Analysis Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，第543页)。
物种形成(从母物种产生新物种)也可产生两种或更多种具有相似序列和相似功能的基因。这些基因(称为直系同源物)通常在它们的宿主植株内具有相同的功能，并且还可在物种之间交换而不会丧失功能。因为植物具有共同的祖先，任何植物物种内的许多基因将在其他植物物种中具有相应的直系同源基因。一旦已用诸如CLUSTAL(Thompson等人，(1994)NucleicAcids Res.22：4673-4680；Higgins等人，(1996)(同上))之类的程序构建一个物种的基因家族的系统发生树后，可将潜在的直系同源序列放入该系统发生树中并可确定它们与来自所关注物种的基因的关系。还可通过交互式BLAST(reciprocal BLAST)策略鉴别直系同源序列。一旦已鉴别直系同源序列，则可从参比序列的已鉴别功能推断出该直系同源物的功能。
来自不同生物体的直系同源基因具有高度保守的功能，常常是基本相同的功能(Lee等人，(2002)Genome Res.12：493-502；Remm等人，(2001)J.Mol.Biol.314：1041-1052)。旁系基因(其通过基因复制而趋异)可保留所编码蛋白质的相似功能。在这种情形中，就本发明的某些实施方案(例如，编码序列的转基因表达)来说旁系同源物可互换使用。
ACC合酶多核苷酸(例如本文所公开的那些)可用于分离同源物、旁系同源物或直系同源物。这样，可将诸如PCR、杂交等之类的方法用于基于这类序列与ACC合酶多核苷酸的序列同源性来鉴别这类序列。
在PCR方法中，可设计寡核苷酸引物用于PCR反应来从提取自任何所关注的植物的cDNA或基因组DNA扩增相应的DNA序列。用于设计PCR引物或PCR克隆的方法是本领域公知的，在Sambrook等人，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Plainview，New York)中有公开。另参见Innis等人(编辑)，(1990)PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(AcademicPress，New York)；Innis和Gelfand(编辑)(1995)PCR Strategies(AcademicPress，New York)；以及Innis和Gelfand(编辑)，(1999)PCR MethodsManual(Academic Press，New York)。已知的PCR方法包括但不限于利用成对引物、巢式引物、单一特异引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。所谓“扩增”意指构造核酸序列的多个拷贝或与该核酸序列互补的多个拷贝，构建是利用所述核酸序列中的至少一个作为模板进行。扩增系统包括聚合酶链式反应(PCR)系统、连接酶链反应(LCR)系统、基于核酸序列的扩增(NASBA，Cangene，Mississauga，Ontario)、Q-β复制酶系统、基于转录的扩增系统(TAS)和链置换扩增(SDA)。参见例如Diagnostic Molecular Microbiology：Principles and Applications，Persing等人(编辑)，American Society for Microbiology，Washington，DC(1993)。扩增的产物称为扩增子。
在杂交技术中，已知的多核苷酸的全部或部分被用作探针，该探针选择性杂交至一群克隆的基因DNA片段或cDNA片段(即基因组或cDNA文库)中存在的包含相应核苷酸序列的其他核酸。杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸，并且可用诸如32P之类的可检测基团或任何其他可检测标记物进行标记。因而，例如，用于杂交的探针可通过标记基于本文所公开的ACC合酶序列的合成寡核苷酸来制备。制备杂交探针和构造cDNA文库和基因组文库的方法是本领域已知的，在Sambrook等人，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)中有公开。
例如，可将本文所公开的整个ACC合酶序列或其一个或多个部分用作能够特异性杂交至相应ACC合酶序列和信使RNA的探针。为了在多种条件下实现特异性杂交，这种探针包括各ACC合酶序列当中独特的序列并且长为至少约10、12、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、50、60、70、80、90或更多个核苷酸。这种探针可用于通过PCR从选定的植物扩增出相应的ACC合酶序列。该技术可用于从所需植物分离出另外的编码序列或用作诊断测定法以确定编码序列在植物中的存在。杂交技术包括对涂布的核酸(例如DNA)文库(噬菌斑或菌落)的杂交筛选，参见例如Sambrook等人，(1989)Molecular Cloning：A LaboratoryManual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，NewYork)。所谓“核酸文库”意指分离的DNA或RNA分子的集合，它们包含且实质上代表指定生物体的基因组的整个被转录的部分。示例性的核酸文库(例如基因组文库和cDNA文库)的构造在例如如下的标准分子生物学参考文献中有教导：Berger和Kimmel，(1987)Guide To Molecular CloningTechniques，Methods in Enzymology系列，第152卷，Academic Press，Inc.，San Diego，CA；Sambrook等人，(1989)Molecular Cloning：A LaboratoryManual，第2版，第1-3卷；以及Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等人(编辑)，Current Protocols，a joint venture between GreenePublishing Associates，Inc.and John Wiley & Sons，Inc.(1994年增补本)；
这类序列的杂交可在严格条件下进行。术语“严格条件”或“严格杂交条件”包括指涉探针与其靶序列杂交的程度将比它与其他序列杂交的程度可检测地更高(例如，至少2倍于背景)的条件。严格条件是序列依赖性的，在不同的环境中将会不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可鉴别与探针可最高达100％互补的靶序列(同源探测)。或者，可调节严格性条件以允许序列中有一些错配，以使得检测到较低程度的相似性(异源探测)。优选地，探针长为大约500个核苷酸，但长度可变化很大，从小于500个核苷酸到等于靶序列的整个长度。
通常，严格条件将为其中盐浓度低于约1.5M钠离子，通常为约0.01至1.0M钠离子浓度(或其他盐)，pH为7.0至8.3，对短探针(例如，10至50个核苷酸)而言温度为至少30℃，对长探针(例如超过50个核苷酸)而言温度为至少约60℃的那些条件。严格条件还可通过添加去稳定剂如甲酰胺或Denhardt′s来实现。示例性的低严格性条件包括在37℃下用30至35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液杂交，并在50至55℃下在1X至2X SSC(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中洗涤。示例性的中等严格性条件包括37℃下在40至45％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，并在55至60℃下在0.5X至1X SSC中洗涤。示例性的高严格性条件包括37℃下在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，并在60至65℃下在0.1X SSC中洗涤。特异性通常决定于杂交后的洗涤，关键因素为最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交体，可根据Meinkoth和Wahl，(1984)Anal.Biochem.，138：267-84的公式估计Tm：Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L，其中M为单价阳离子的摩尔浓度，％GC为DNA中鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form为杂交溶液中甲酰胺的百分比，L为杂交体的长度(单位为碱基对)。Tm为50％的互补靶序列杂交至完全匹配的探针时的温度。每1％错配，Tm减少约1℃，因而，可调节Tm、杂交和/或洗涤条件以杂交至所需同一性的序列。例如，如果寻求具有≥90％同一性的序列，则可将Tm降低10℃。通常，将严格条件选择为比特定序列及其互补序列在确定的离子强度和pH下的热解链温度(Tm)低约5℃。然而，极严格条件可采用在低于热解链温度(Tm)1、2、3或4℃下杂交和/或洗涤；中等严格条件可采用在低于热解链温度(Tm)6、7、8、9或10℃下杂交和/或洗涤；低严格条件可采用在低于热解链温度(Tm)11、12、13或14、15或20℃下杂交和/或洗涤。利用该公式，杂交和洗涤组成以及所需的Tm，普通技术人员将认识到，杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化固有地得到了描述。如果所需的错配程度导致Tm低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则优选增加SSC浓度以使得可使用较高的温度。有关核酸杂交的详尽指导可在如下文献中找到：Tijssen，Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridizationwith Nucleic Acid Probes，第I部分，第2章，“Overview of principles ofhybridization and the strategy of nucleic acid probe assays，”Elsevier，New York(1993)；和Current Protocols in Molecular Biology，第2章，Ausubel等人(编辑)，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York(1995)。除非另外指明，否则在本专利申请中，高严格性定义为在65℃下在4X SSC、5XDenhardt′s(500ml水中的5g Ficoll，5g聚乙烯吡咯烷酮、5g牛血清白蛋白)、0.1mg/ml煮沸鲑精DNA和25mM磷酸钠中杂交，并在65℃下在0.1X SSC、0.1％SDS中洗涤。
术语“选择性杂交”包括指涉在严格杂交条件下核酸序列与指定的核酸靶序列杂交的程度比其与非靶序列杂交的程度可检测地更高(例如，至少2倍于背景)，并且实质上排除非靶核酸。选择性杂交的序列通常相互具有约至少40％的序列同一性，优选60-90％的序列同一性，最优选100％的序列同一性(即互补性)。
术语“杂交复合物”包括指涉由相互选择性杂交的两条单链核酸序列形成的双链核酸结构。
本文所用的“基本上由组成”意指包括目标多核苷酸以外的额外序列，其中该额外序列在严格杂交条件下不选择性杂交至所述多核苷酸所杂交的同一cDNA，并且其中杂交条件包括在65℃下在0.1X SSC和0.1％十二烷基硫酸钠中的洗涤步骤。
ACC合酶核苷酸序列可用于产生变体核苷酸序列，该变体核苷酸序列具有与初始核苷酸序列具有大约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％同一性的5′-非翻译区、3′-非翻译区或启动子区的核苷酸序列。然后将这些变体与种质中的与NUE相关的组成性状的天然变异相关联。该相关联的变体用作标志单倍型来选择所期望的性状。
产生出ACC合酶多肽的变体氨基酸序列。在这个实例中，对一个或多个氨基酸进行变更。具体而言，观察开放阅读框以确定适当的氨基酸变更。要改变的氨基酸的选择是通过参考蛋白质比对(与其他直向同源物和来自不同物种的其他基因家族成员的比对)进行的。选择出这样的氨基酸，其被认为不处在高选择压力下(不高度保守)，且相当容易地被具有相似的化学特性(即相似的功能侧链)的氨基酸置换。利用蛋白质比对，可对适当的氨基酸进行改变。一旦鉴定出目标氨基酸，即遵循本文所述的程序。使用这个方法产生出具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高核酸序列同一性的变体。然后将这些变体与种质中的与NUE相关的组成性状的天然变异相关联。该相关联的变体用作标志单倍型来选择所期望的性状。
本发明还包括为在不同生物体中表达而经优化的多核苷酸。例如，对于多核苷酸在玉蜀黍植物中的表达，可变更该序列以解决特定的密码子偏好性和改变GC含量，如根据Murray等人(同上)所述。关于来自玉蜀黍植物的28种基因的玉蜀黍密码子用法在Murray等人(同上)的表4中列出。
术语“保守修饰的变体”同时适用于氨基酸序列和核酸序列。就特定核酸序列而言，保守修饰的变体指编码氨基酸序列的相同的或保守修饰的变体的那些核酸。由于遗传密码的简并性，大量功能上相同的核酸编码任何给定蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU全部编码丙氨酸这种氨基酸。因而，在每个由密码子规定丙氨酸的位置，可将该密码子变更为所描述的相应密码子的任一种而不会改变所编码的多肽。这种核酸变异为“沉默变异”，代表保守修饰的变异的一种。编码多肽的本文每种核酸序列还描述了该核酸的每种可能的沉默变异。普通技术人员将认识到，可修饰核酸中的每种密码子(AUG除外，其通常为甲硫氨酸的唯一密码子；一个例外是红色微球菌(Micrococcus rubens)，对于其来说GTG是甲硫氨酸密码子(Ishizuka等人，(1993)J.Gen.Microbiol.139：425-32)以产生功能上相同的分子。因此，编码本发明多肽的核酸的每种沉默变异均隐含在每种所描述的多肽序列中并以引用的方式并入本文。
对于氨基酸序列，技术人员将认识到，对核酸、肽、多肽或蛋白质序列作出的会改变、添加或缺失所编码的序列中的单个氨基酸或一小部分氨基酸的各个置换、缺失或添加，在该变更导致氨基酸为化学类似的氨基酸所置换时，为“保守修饰的变体”。因而，还可变更选自1至15的整数的任何数目的氨基酸残基。因而，例如，可作出1、2、3、4、5、7或10个变更。保守修饰的变体通常提供与它们所源自的未经修饰的多肽序列类似的生物活性。例如，对于其天然底物而言，底物特异性、酶活性或配体/受体结合通常为天然蛋白质的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，优选60-90％。提供功能上相似的氨基酸的保守置换表是本领域所熟知的。
下面的六个组各含有对彼此而言是保守置换的氨基酸：
1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
另参见Creighton，Proteins，W.H.Freeman and Co.(1984)。
以下术语用来描述两个或更多个核苷酸或多肽之间的序列关系：(a)“参比序列”，(b)“比较窗口”，(c)“序列同一性”，(d)“序列同一性百分比”和(e)“实质相同”。
本文所用的“参比序列”是用作序列比较的基础的确定的序列。参比序列可为指定的序列的子集或全部；例如作为全长cDNA或基因序列的区段或者该完全cDNA或基因序列。
本文所用的“比较窗口”意指包括指涉多核苷酸序列的连续和指定的区段，其中该比较窗口中的该多核苷酸序列相比于参比序列(不包含添加或缺失)可包含添加或缺失(即空位)，以便两个多核苷酸的最佳比对。通常，比较窗口长度为至少20个连续的核苷酸，任选地可为30、40、50、100个或更长。本领域技术人员认识到，为避免由于在多核苷酸序列中加入空位所致的与参比序列的高度相似性，通常引入空位罚分并从匹配数扣除空位罚分。将核苷酸和氨基酸序列进行比对以作比较的方法是本领域公知的。
Smith和Waterman，(1981)Adv.Appl.Math 2：482的局部同源算法(BESTFIT)可对用于比较的序列进行最佳比对；通过Needleman和Wunsch，(1970)J.Mol.Biol.48：443-53的同源比对算法(GAP)；通过Pearson和Lipman，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444的相似性搜索算法(Tfasta和Fasta)；通过这些算法的计算机化执行，包括但不限于：Intelligenetics(Mountain View，California)的PC/Gene程序中的CLUSTAL、WisconsinGenetics Software Package
Figure BPA00001446526500321
第8版(可得自Genetics Computer Group(GCG
Figure BPA00001446526500322
程序(Accelrys，Inc.，San Diego，CA))中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。如下文献详细描述了CLUSTAL程序：Higgins和Sharp，(1988)Gene 73：237-44；Higgins和Sharp，(1989)CABIOS 5：151-3；Corpet等人，(1988)Nucleic Acids Res.16：10881-90；Huang等人，(1992)ComputerApplications in the Biosciences 8：155-65以及Pearson等人，(1994)Meth.Mol.Biol.24：307-31。用于多序列的最佳全局比对的优选程序是PileUp(Feng和Doolittle，(1987)J.Mol.Evol.，25：351-60，其类似于Higgins和Sharp，(1989)CABIOS 5：151-53描述的方法，藉此以引用的方式将其并入本文)。可用于数据库相似性搜索的BLAST程序家族包括：用于核苷酸查询序列对核苷酸数据库序列的BLASTN；用于核苷酸查询序列对蛋白质数据库序列的BLASTX；用于蛋白质查询序列对蛋白质数据库序列的BLASTP；用于蛋白质查询序列对核苷酸数据库序列的TBLASTN和用于核苷酸查询序列对核苷酸数据库序列的TBLASTX。参见Current Protocols in Molecular Biology，第19章，Ausubel等人(编辑)，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York(1995)。
GAP利用Needleman和Wunsch(同上)的算法来寻找两个完整序列的比对，该比对使匹配数最大而使空位数最小。GAP会考虑所有可能的比对和空位位置，并产生具有最大数目的匹配碱基和最少的空位的比对。其允许提供以匹配碱基数为单位的空位产生罚分和空位延伸罚分。GAP对于其插入的每个空位，都必须利用匹配的空位产生罚分数。如果选择大于零的空位延伸罚分，GAP对于每个插入的空位必须另外利用空位长度乘以空位延伸罚分。Wisconsin Genetics Software Package
Figure BPA00001446526500331
第10版中的默认空位产生罚分值和空位延伸罚分值分别为8和2。空位产生和空位延伸罚分可以以选自0-100的整数来表示。因而，例如，空位产生和空位延伸罚分可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或更大。
GAP给出最好的比对的群体中的一个成员。这个群体可能存在许多成员，但其他成员没有更好的质量。GAP显示关于比对的四个品质因素：品质(quanlity)、比率(ratio)、同一性(identity)和相似性(similarity)。质量是为了比对序列而被最大化的指标(metric)。比率是品质除以较短区段中的碱基数。同一性百分数是实际匹配的符号的百分数。相似性百分数是相似的符号的百分数。将对应于空位的符号忽略。当一对符号的打分矩阵值大于或等于0.50(相似性阈值)时，对相似性打分。Wisconsin Genetics SoftwarePackage
Figure BPA00001446526500332
版本10中所用的打分矩阵为BLOSUM62(参见Henikoff和Henikoff，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)。
除非另外指明，否则本文所提供的序列同一性/相似性值指用BLAST2.0程序包，采用默认参数获得的值(Altschul等人，(1997)Nucleic AcidsRes.25：3389-402)。
如本领域普通技术人员将会理解的，BLAST搜索假定蛋白质可被模拟为随机序列。然而，许多真实蛋白质包含非随机序列区，该非随机序列可为同聚段、短周期重复或富含一种或多种氨基酸的区域。这种低复杂性区域可在不相关的蛋白质之间比对，尽管该蛋白质的其他区域完全不相似。可采用多种低复杂性过滤程序来减少这种低复杂性比对。例如，SEG(Wooten和Federhen，(1993)Comput.Chem.17：149-63)和XNU(Claverie和States，(1993)Comput.Chem.17：191-201)低复杂性过滤器可单独使用或联合使用。
在两个多核苷酸或多肽序列的情形中，本文所用的“序列同一性”或“同一性”是指当在指定的比较窗口上进行比对以获得最大对应时两个序列中相同的残基。当序列同一性百分数针对蛋白质使用时，应认识到，不相同的残基位置往往差别在于保守氨基酸置换，其中氨基酸残基被其他具有相似的化学性质(例如电荷或疏水性)的氨基酸残基置换，因此不会改变分子的功能性质。如果序列差别在于保守置换，则可上调百分比序列同一性以校正置换的保守性质。差异在于这种保守置换的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。作出这个调整的方法是本领域技术人员公知的。通常，这涉及将保守置换打分为部分错配而不是完全错配，从而提高序列同一性百分数。因而，例如，如果相同的氨基酸给予1分，非保守置换给予0分，则保守置换给予0至1之间的分数。例如，根据Meyers和Miller，(1988)Computer Applic.Biol.Sci.4：11-17的算法计算保守置换的分数，例如如在程序PC/GENE(Intelligenetics，Mountain View，California，USA)中所执行的。
本文所用的“序列同一性百分数”意指通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列所确定的数值，其中多核苷酸序列在比较窗口中的部分与参比序列(不包含添加或缺失)相比包含添加或缺失(即空位)，以便两个序列的最佳比对。该百分数是这样计算的：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较窗口中的位置的总数目，然后将结果乘以100以得到序列同一性百分数。
术语多核苷酸序列的“实质同一性”意指利用所描述的比对程序之一采用标准参数与参考序列比较时，多核苷酸包含具有50-100％之间的序列同一性，优选至少50％的序列同一性，优选至少60％的序列同一性，优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％且最优选至少95％序列同一性的序列。技术人员将会认识到，可通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等等适当调整这些值以确定两个核苷酸序列所编码的蛋白质的相应同一性。用于这些目的的氨基酸序列的实质同一性通常意指55-100％之间的序列同一性，优选至少55％，优选至少60％，更优选至少70％、80％、90％，最优选至少95％。
核苷酸序列实质同一性的另一指示是两个核酸分子在本文别处所描述的严格条件下是否彼此杂交。然而，遗传密码的简并性允许多种编码相同氨基酸的、导致核苷酸序列的多样化的核酸置换，因而有可能该DNA序列可编码相同多肽但在严格条件下不彼此杂交。例如，当利用遗传密码所允许的最大密码子简并性产生一个核酸拷贝时，这可能会发生。两条核酸序列是实质上相同的一个指示是，第一核酸编码的多肽与第二核酸所编码的多肽发生免疫交叉反应。
在肽的情形中术语“实质同一性”指肽包含在指定比较窗口上与参考序列具有55-100％之间的序列同一性；在一些实施方案中与参考序列具有至少55％的序列同一性、60％、70％、80％、至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列。在一些实施方案中，利用Needleman和Wunsch(同上)的同源比对算法进行最佳比对。两条肽序列是实质上相同的指示是，一种肽可与针对第二种肽产生的抗体发生免疫反应。因而，例如，如果某种肽与第二种肽差别仅在于保守置换的话，则这两种肽实质上相同。此外，当某种肽与第二种肽差别在于非保守变化时，如果抗体识别的表位实质上相同，则它们实质上相同。“基本相似的”肽共有如上所述的序列，例外的是不相同的残基位置差别可在于保守氨基酸变化。
用于本公开的方法中的核酸可用(a)标准重组方法，(b)合成技术或它们的组合来制备。在一些实施方案中，本发明的多核苷酸将从真菌或细菌克隆、扩增或以其他方式构建。
便利的是核酸可包含除在本发明方法中有用的多核苷酸之外的序列。例如，可将包含一个或多个内切核酸酶限制性位点的多克隆位点插入核酸中以帮助分离该多核苷酸。另外，可插入可翻译序列以帮助分离翻译了的在本发明方法中有用的多核苷酸。例如，六组氨酸标志物序列提供了便捷的手段来纯化在本发明方法中有用的蛋白质。本发明方法中可用的核酸(排除所述多核苷酸序列)任选为用于本发明的多核苷酸的克隆和/或表达的载体、衔接子或接头。可将另外的序列添加至这种克隆和/或表达序列来优化它们在克隆和/或表达中的功能，以助于分离所述多核苷酸，或改善所述多核苷酸向细胞内的导入。通常，用于本发明方法的核酸的长度减去其本发明多核苷酸的长度为不到20千碱基对，通常不到15kb，常常不到10kb。克隆载体、表达载体、衔接子和接头的使用是本领域已知的。示例性的核酸包括诸如如下的载体：M13、λZAP Express、λZAP II、λgt10、λgt11、pBK-CMV、pBK-RSV、pBluescript II、λDASH II、λEMBL 3、λEMBL 4、pWE15、SuperCos 1、SurfZap、Uni-ZAP、pBC、pBS+/-、pSG5、pBK、pCR-Script、pET、pSPUTK、p3′SS、pGEM、pSK+/-、pGEX、pSPORTI和II、pOPRSVI CAT、pOPI3 CAT、pXT1、pSG5、pPbac、pMbac、pMC1neo、pOG44、pOG45、pFRTβGAL、pNEOβGAL、pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pRS413、pRS414、pRS415、pRS416、λMOSSlox和λMOSElox。本发明的任选载体包括但不限于λZAP II和pGEX。有关各种核酸的描述，参见例如Stratagene Cloning Systems，Catalogs 1995，1996，1997(La Jolla，CA)和Amersham Life Sciences，Inc，Catalog′97(Arlington Heights，IL)。
用于本发明方法中的核酸还可用诸如如下的方法通过直接化学合成来制备：Narang等人，(1979)Meth.Enzymol.68：90-9的磷酸三酯法；Brown等人，(1979)Meth.Enzymol.68：109-51的磷酸二酯法；Beaucage等人，(1981)Tetra.Letts.22(20)：1859-62的二乙基亚膦酰胺法；Beaucage等人(同上)描述的固相亚磷酰胺三酯法，使用自动合成仪，例如，如Needham-VanDevanter等人，(1984)Nucleic Acids Res.12：6159-68中所描述的，以及第4,458,066号美国专利的固相载体法。化学合成通常产生单链寡核苷酸。这可通过与互补序列杂交或通过将该单链作为模板用DNA聚合酶进行聚合来转变为双链DNA。技术人员将会认识到，虽然DNA的化学合成局限于约100个碱基的序列，但可通过连接较短的序列来获得较长的序列。
通常，已发现翻译效率受RNA的5′非编码或非翻译区(5′UTR)中的特定序列元件的调控。正序列基序包括翻译起始共有序列(Kozak，(1987)Nucleic Acids Res.15：8125)和5<G>7甲基GpppG RNA帽结构(Drummond等人，(1985)Nucleic Acids Res.13：7375)。负元件包括稳定的分子内5’UTR茎-环结构(Muesing等人，(1987)Cell 48：691)和5′UTR中的AUG序列或前面有适当AUG的短开放阅读框(Kozak(同上)、Rao等人，(1988)Mol.and Cell.Biol.8：284)。因此，本发明提供了用于调节异源编码序列的翻译的5′和/或3′UTR区。
另外，可修饰用于本发明的多核苷酸的多肽编码区段以改变密码子用法。可采用改变了的密码子用法，来改变翻译效率和/或优化编码序列在所需宿主中的表达或为了在玉蜀黍中表达而优化异源序列中的密码子用法。在本发明方法中有用的多核苷酸的编码区中的密码子用法可用可商购获得的软件包(如可得自University of Wisconsin Genetics Computer Group的“CodonPreference”)进行统计分析。参见，Devereaux等人，(1984)Nucleic AcidsRes.12：387-395)；或MacVector 4.1(Eastman Kodak Co.，New Haven，Conn.)。因而，本发明提供了在本发明方法中有用的多核苷酸中的至少一种的编码区特征性的密码子用法频率。可用于确定密码子用法频率的多核苷酸的数目(每个氨基酸3个核苷酸)可以为从3至本文所提供的本发明多核苷酸的数目的任何整数。任选地，多核苷酸将为全长序列。用于统计分析的序列的示例性数目可以为至少1、5、10、20、50或100。
当通过合成法制备或改变核酸时，可利用将在其中表达核酸的预期宿主的已知密码子偏好性。例如，尽管本发明的核酸序列在单子叶植物物种和双子叶植物物种中都可表达，但可对序列进行修饰以解决单子叶植物或双子叶植物的特定密码子偏好性和GC含量偏好性，因为这些偏好性已被证实不同(Murray等人，(1989)Nucleic Acids Res.17：477-98，将其以引用的方式并入本文)。因而，具体氨基酸的玉蜀黍优选密码子可由来自玉蜀黍的已知基因序列得出。关于来自玉蜀黍植物的28种基因的玉蜀黍密码子用法在Murray等人(同上)的表4中列出。
用于本发明方法的多核苷酸可使用ACC合酶编码多核苷酸通过序列改组(sequence shuffling)获得。序列改组在第96/19256号PCT公开中有描述。另参见Zhang等人，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4504-9和Zhao等人，(1998)Nature Biotech 16：258-61。一般来讲，序列改组提供出用于产生具有所需特性的多核苷酸的文库的手段，该文库可被进行选择或筛选。从一群相关序列多核苷酸产生重组多核苷酸的文库，所述相关序列多核苷酸包含具有实质序列同一性并可在体外或体内进行同源重组的序列区。序列重组的多核苷酸的群体包含具有所需的或有利的特性并且可通过合适的选择或筛选方法来选择的多核苷酸的亚群。所述特性可以为任何能够在筛选系统中被选择或检测的性质或属性，可包括：所编码的蛋白质、转录元件、控制转录的序列、RNA加工、RNA稳定性、染色质构象、基因或转基因的翻译或其他表达性质、复制元件、蛋白质结合元件等等的性质，例如赋予可选择或可检测性质的任何特征。在一些实施方案中，选择的特性将为相对于本文所提供的野生型蛋白质而言改变了的Km和/或Kcat。在其它实施方案中，序列改组所产生的蛋白质或多核苷酸具有的配体结合亲和力将比非改组的野生型多核苷酸的高。在另外其它实施方案中，与非改组的野生型多核苷酸相比，序列改组所产生的蛋白质或多核苷酸将具有改变了的最佳pH。这类性质的提高可以为野生型值的至少110％、120％、130％、140％或高于150％。
用于实施本发明方法的组件包括在带有说明资料的试剂盒中，该试剂盒包含编码ACC合酶的多核苷酸或它们的互补序列或构造用于ACC合酶的RNA干扰的核酸，用于改善植物在低氮条件下的产量。在这些实施方案中的一些中，试剂盒包含具有SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6的序列的核酸或其完全互补序列；与SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高序列同一性的核酸或其完全互补序列；编码SEQ ID NO：8的多肽序列或与SEQ ID NO：8具有70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高序列同一性的多肽序列的核酸；或构造用于RNA沉默或干扰的核酸，其中所述核酸包含具有SEQ IDNO：1、2、3、4、5或6的至少19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500个或更多个连续核苷酸的多核苷酸和所述多核苷酸的互补序列。
本发明还提供了重组表达盒的用途，该表达盒包含在本发明方法中可用的核酸。本文所用的“重组表达盒”是核酸构建体，通过重组法或合成法产生，具有一系列规定的核酸元件，其允许特定核酸在靶细胞中的转录。可将重组表达盒掺入到质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。通常，除了别的序列以外，表达载体的重组表达盒部分还包含待转录的核酸和启动子。
编码在本发明方法中可用的所需多核苷酸或多肽的核酸序列，例如编码可减少ACC合酶基因的表达的核酸的多核苷酸，可用于构建可引入到所需宿主细胞中的重组表达盒。重组表达盒将通常包含可操作连接至转录起始调控序列的在本发明方法中有用的多核苷酸，所述转录起始调控序列将引导所述多核苷酸在预定的宿主细胞(例如转化植物的组织)中的转录。
例如，植物表达载体可包含(1)处于5′和3′调控序列的转录控制下的克隆植物基因和(2)显性选择性标志物。如果需要，这种植物表达载体还可含有启动子调控区(例如，赋予诱导型表达或组成型表达，由环境或发育调节的表达，或细胞或组织特异性/选择性表达的启动子调控区)、转录起始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点和/或多腺苷酸化信号。
本文所用的“可操作连接”包括指涉第一序列(如启动子)和第二序列之间的功能性连接，其中启动亚序列起始或介导对应第二序列的DNA的转录。一般来讲，可操作连接意指被连接的核酸序列是连续的，并且如果有必要连接两个蛋白质编码区的话，是连续的且在相同的阅读框内。
本文所用的“启动子”包括指涉DNA的在转录起始的上游并涉及RNA聚合酶和其他蛋白质的识别和结合以起始转录的区域。“植物启动子”是能够引发在植物细胞中的转录的启动子。示例性的植物启动子包括但不限于从植物、植物病毒和包含在植物细胞中表达的基因的细菌获得的那些启动子，所述细菌如农杆菌或根瘤菌属(Rhizobium)。例子为优先起始在某些组织，例如叶、根、种子、纤维、木质部导管、管胞或厚壁组织中的转录的启动子。这种启动子称为“组织优选的”。“细胞类型”特异性启动子主要驱动在一种或多种器官中的某些细胞类型(例如，根或叶中的维管细胞)中的表达。“诱导型”或“调控型”启动子是处于环境控制下的启动子。可实现通过诱导型启动子进行的转录的环境条件的例子包括无氧条件或光的存在。另一类型的启动子是发育调节启动子，例如在花粉发育过程中驱动表达的启动子。组织优选的、细胞类型特异性的、发育调节的和诱导型的启动子构成了“非组成型”启动子类别。“组成型”启动子是在大多数环境条件下活跃的启动子。组成型启动子被分类为可提供一系列组成型表达。因而，某些是弱组成型启动子，而另一些是强组成型启动子。一般来讲，所谓“弱启动子”意指驱动编码序列以低水平表达的启动子。所谓“低水平”意指处于约1/10,000个转录物至约1/100,000个转录物至约1/500,000个转录物的水平。相反，“强启动子”驱动编码序列以“高水平”或约1/10个转录物至约1/100个转录物至约1/1,000个转录物进行表达。
可采用会指导在本发明方法中有用的多核苷酸在再生植物的所有组织中的表达的植物启动子片段。这种启动子在本文中称为“组成型”启动子并且在大多数环境条件和发育或细胞分化状态下是活跃的。组成型启动子的例子包括Rsyn7启动子的核心启动子及在WO 99/43838和美国专利No.6,072,050中公开的其他组成型启动子；源于根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的T-DNA的1′-或2′-启动子、Smas启动子、肉桂基醇脱氢酶启动子(第5,633,439号美国专利)、Nos启动子、rubisco启动子、GRP1-8启动子、来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子，如Odell等人，(1985)Nature 313：810-2中所述；水稻肌动蛋白启动子(McElroy等人，(1990)Plant Cell 163-171)；泛素启动子(Christensen等人，(1992)Plant Mol.Biol.12：619-632和Christensen等人，(1992)Plant Mol.Biol.18：675-89)；pEMU(Last等人，(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-8)；MAS(Velten等人，(1984)EMBO J.3：2723-30)和玉蜀黍H3组蛋白启动子(Lepetit等人，(1992)Mol.Gen.Genet.231：276-85和Atanassvoa等人，(1992)Plant Journal2(3)：291-300)；ALS启动子，如第WO 96/30530号PCT申请中所述，以及技术人员知道的来自多种植物基因的其他转录起始区。其他组成型启动子包括(例如)美国专利No.5,608,149；No.5,608,144；No.5,604,121；No.5,569,597；No.5,466,785；No.5,399,680；No.5,268,463；No.5,608,142；和No.6,177,611。在一些实施方案中，泛素启动子用于单子叶植物中的表达。
或者，植物启动子可指导本发明的多核苷酸在特定组织中的表达或者可另外在更精确的环境或发育控制下。这种启动子在这里称为“诱导型”启动子。可实现通过诱导型启动子进行的转录的环境条件包括病原体攻击、无氧条件或光的存在。诱导型启动子的例子是Adh1启动子(其可通过低氧或寒冷胁迫诱导)、Hsp70启动子(其可通过热胁迫诱导)和PPDK启动子(其可通过光诱导)。
一般来讲，从诱导型启动子，特别是从病原体诱导型启动子表达基因将会是有利的。这种启动子包括来自发病相关蛋白(PR蛋白)的那些，所述蛋白在病原体感染后诱导，例如PR蛋白、SAR蛋白、β-1，3-葡聚糖酶、壳多糖酶等等。参见(例如)Redolfi等人，(1983)Neth.J.Plant Pathol.89：245-254；Uknes等人，(1992)Plant Cell 4：645-656；和Van Loon(1985)Plant Mol.Virol.4：111-116。另参见WO 99/43819，将该文献以引用的方式并入本文。
在病原体感染位点处或附近局部表达的启动子值得关注。参见(例如)Marineau等人，(1987)Plant Mol.Biol.9：335-342；Matton等人，(1989)Molecular Plant-Microbe Interactions 2：325-331；Somsisch等人，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：2427-2430；Somsisch等人，(1988)Mol.Gen.Genet.2：93-98；和Yang(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：14972-14977。另参见Chen等人，(1996)Plant J.10：955-966；Zhang等人，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：2507-2511；Warner等人，(1993)Plant J.3：191-201；Siebertz等人，(1989)Plant Cell 1：961-968；美国专利No.5,750,386(线虫诱导型)；以及其中引用的参考文献。玉蜀黍PRms基因的诱导型启动子特别值得关注，该基因的表达是由病原体串珠镰孢(Fusarium moniliforme)诱导(参见例如Cordero等人，(1992)Physiol.Mol.Plant Path.41：189-200)。
另外，因为病原体可通过伤口或昆虫损伤进入植物中，可将伤口诱导型启动子用于本发明的构建体中。这种伤口诱导型启动子包括马铃薯蛋白酶抑制剂(pin II)基因(Ryan(1990)Ann.Rev.Phytopath.28：425-449；Duan等人，(1996)Nature Biotechnology 14：494-498)；wun1和wun2，美国专利No.5,428,148；win1和win2(Stanford等人，(1989)Mol.Gen.Genet.215：200-208)；systemin(McGurl等人，(1992)Science 225：1570-1573)；WIP1(Rohmeier等人，(1993)Plant Mol.Biol.22：783-792；Eckelkamp等人，(1993)FEBS Letters 323：73-76)；MPI基因(Corderok等人，(1994)Plant J.6(2)：141-150)；等等，将这些文献以引用的方式并入本文。
可将化学调节启动子用于通过施加外源化学调节剂来调控基因在植物中的表达。取决于目标，启动子可以是化学诱导型启动子，其中施用化学物质可诱导基因表达，或者是化学抑制型启动子启动子，其中施用化学物质可抑制基因表达。化学诱导型启动子是本领域已知的，包括但不限于玉蜀黍In2-2启动子(其通过苯磺酰胺除草剂安全剂激活)、玉蜀黍GST启动子(其通过用作前突生(pre-emergent)除草剂的疏水性亲电化合物激活)和烟草PR-1a启动子(其通过水杨酸激活)。其他所关注化学调节启动子包括甾类化合物响应性启动子(参见例如，Schena等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10421-10425和McNellis等人，(1998)Plant J.14(2)：247-257中的糖皮质素诱导型启动子)和四环素诱导型和四环素抑制型启动子(参见例如，Gatz等人，(1991)Mol.Gen.Genet.227：229-237和美国专利No.5,814,618和No.5,789,156)，将这些文献以引用的方式并入本文。
在发育控制下的启动子的例子包括仅仅或优先在某些组织(如叶、根、果实、种子或花)中起始转录的启动子。取决于启动子在基因组的位置，启动子的操作也可以变化。因而，诱导型启动子在某些位置可变为完全或部分组成型的。
可将组织优选的启动子用于靶向在本发明方法中有用的多核苷酸在特定植物组织内的表达。组织优选的启动子包括Yamamoto等人，(1997)PlantJ.12(2)：255-265；Kawamata等人，(1997)Plant Cell Physiol.38(7)：792-803；Hansen等人，(1997)Mol.Gen Genet.254(3)：337-343；Russell等人，(1997)Transgenic Res.6(2)：157-168；Rinehart等人，(1996)Plant Physiol.112(3)：1331-1341；Van Camp等人，(1996)Plant Physiol.112(2)：525-535；Canevascini等人，(1996)Plant Physiol.112(2)：513-524；Yamamoto等人，(1994)Plant Cell Physiol.35(5)：773-778；Lam(1994)Results Probl.Cell Differ.20：181-196；Orozco等人，(1993)Plant Mol Biol.23(6)：1129-1138；Matsuoka等人，(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA 90(20)：9586-9590；和Guevara-Garcia等人，(1993)Plant J.4(3)：495-505。如有必要，可对这种启动子进行修饰以用于弱表达。
叶优选的启动子是本领域已知的。参见例如Yamamoto等人，(1997)Plant J.12(2)：255-265；Kwon等人，(1994)Plant Physiol.105：357-67；Yamamoto等人，(1994)Plant Cell Physiol.35(5)：773-778；Gotor等人，(1993)Plant J.3：509-18；Orozco等人，(1993)Plant Mol.Biol.23(6)：1129-1138；andMatsuoka等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(20)：9586-9590。
根优选的启动子是已知的，可选自许多可从文献得到的启动子，或者从多种相容物种从头分离。参见例如Hire等人，(1992)Plant Mol.Biol.20(2)：207-218(大豆根特异性谷氨酰胺合成酶基因)；Keller和Baumgartner(1991)Plant Cell 3(10)：1051-1061(菜豆GRP 1.8基因中的根特异性控制元件)；Sanger等人，(1990)Plant Mol.Biol.14(3)：433-443(根瘤农杆菌的甘露氨酸合酶(MAS)基因的根特异性启动子)；和Miao等人，(1991)PlantCell 3(1)：11-22(编码胞质谷氨酰胺合成酶(GS)的全长cDNA克隆，该酶在大豆的根或根瘤中表达)。另参见Bogusz等人，(1990)Plant Cell 2(7)：633-641，其中描述了从来自固氮非豆科榆科山黄麻(Parasponia andersonii)和相关的非固氮非豆科山麻黄(Trema tomentosa)的血红蛋白基因分离的两种根特异性启动子。将这些基因的启动子连接至β-葡糖醛酸酶报道基因并引入非豆科植物烟草(Nicotiana tabacum)和豆科植物百脉根(Lotus corniculatus)二者中，在这两种情况中根特异性启动子活性得以保持。Leach和Aoyagi(1991)描述了他们对毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的高度表达的rolC和rolD根诱导基因的分析(参见Plant Science(Limerick)79(1)：69-76)。他们得出结论认为，增强子和组织组织优选的DNA决定子在那些启动子中是分离的。Teeri等人(1989)使用与lacZ的基因融合显示，编码章鱼氨酸合酶的农杆菌T-DNA基因在根尖的表皮中特别活跃，且TR2′基因在完整植物中是根特异性的并且通过叶中的创伤刺激，这是用于杀昆虫或杀幼虫基因的特别理想的特性组合(参见EMBO J.8(2)：343-350)。与nptII(新霉素磷酸转移酶II)融合的TR1′基因显示了相似的特性。另外的根优选的启动子包括VfENOD-GRP3基因启动子(Kuster等人，(1995)Plant Mol.Biol.29(4)：759-772)；和rolB启动子(Capana等人，(1994)Plant Mol.Biol.25(4)：681-691)。另参见美国专利No.5,837,876；No.5,750,386；No.5,633,363；No.5,459,252；No.5,401,836；No.5,110,732；和No.5,023,179。
“种子优选的”启动子包括“种子特异性”启动子(那些启动子在种子发育期间活跃，例如种子贮藏蛋白的启动子)以及“种子萌发”启动子(那些启动子在种子萌发期间活跃)。参见Thompson等人，(1989)BioEssays 10：108，将该文献以引用的方式并入本文。这种种子优选的启动子包括但不限于Cim1(细胞分裂素诱导信息基因启动子)；cZ19B1(玉蜀黍19kDa玉米素基因启动子)；milps(肌醇-1-磷酸合成酶基因启动子)(参见WO 00/11177和美国专利No.6,225,529；将这两篇文献以引用的方式并入本文)。γ-玉米醇溶蛋白基因启动子是胚乳特异性启动子。球蛋白1(Glb-1)基因启动子是代表性的胚芽特异性启动子。对于双子叶植物而言，种子特异性启动子包括但不限于菜豆β-菜豆素基因启动子、油菜籽蛋白(napin)基因启动子、β-伴球蛋白基因启动子、大豆凝集素基因启动子、十字花科蛋白基因启动子等。对于单子叶植物而言，种子特异性启动子包括但不限于玉蜀黍15kDa玉米素基因启动子、22kDa玉米素基因启动子、27kDa玉米素基因启动子、γ-玉米醇溶蛋白基因启动子、糯质基因启动子、超甜基因(shrunken)1启动子、超甜基因2启动子、球蛋白1基因启动子等等。另参见WO 00/12733，其中公开了来自end1和end2基因的种子优选启动子；将该文献以引用的方式并入本文。
调控区(即启动子、转录调控区和翻译终止区)和/或ACC合酶多核苷酸对宿主细胞而言或彼此之间而言可以是天然的/同功的。或者，调控区和/或ACC合酶多核苷酸对宿主细胞而言或彼此之间而言可以是异源的。本文所用的针对序列所谓的“异源”为起源于外来物种的序列，或者，如果起源于相同物种的话，则通过有意的人为干预对其天然形式在组成和/或基因座方面进行实质性修饰的序列。例如，可操作连接至异源多核苷酸的启动子来自与该多核苷酸所源自的物种不同的物种，或者，如果来源于相同/类似物种，一者或二者在它们的初始形式上进行了实质修饰，或者该启动子对该可操作连接的多核苷酸而言不是天然启动子。同样，异源蛋白质可起源于外来物种，或者，如果起源于相同物种，则通过有意的人为干预对其天然形式进行了实质修饰。
如果多肽表达是所需的，则通常期望在多核苷酸编码区的3′端包括多腺苷酸化区。该多腺苷酸化区可源于多种植物基因，或源于T-DNA。待添加的3′端序列可源于(例如)胭脂氨酸合酶或章鱼氨酸合酶基因，或作为另一种选择，源于另一植物基因，或较不优选地，源自任何其他真核基因。这种调控元件的例子包括但不限于3′终止和/或多腺苷酸化区如根瘤农杆菌胭脂氨酸合酶(nos)基因的那些(Bevan等人，(1983)Nucleic Acids Res.12：369-85)；马铃薯蛋白酶抑制剂II(PINII)基因(Keil等人，(1986)Nucleic AcidsRes.14：5641-50和An等人，(1989)Plant Cell 1：115-22)和CaMV 19S基因(Mogen等人，(1990)Plant Cell 2：1261-72)。
可将内含子序列添加至部分编码序列的5′非翻译区或编码序列以增加胞质溶胶中积聚的成熟信息的量。在植物表达构建体和动物表达构建体二者中的转录单位中包括可剪接内含子，已证实能在mRNA水平和蛋白质水平二者上使基因表达增加高达1000倍(Buchman和Berg，(1988)Mol.Cell Biol.8：4395-4405；Callis等人，(1987)Genes Dev.1：1183-200)。当设置在接近转录单位的5′端时，这种基因表达的内含子增强通常是最大的。玉蜀黍内含子Adh1-S内含子1、2和6、Bronze-1内含子的使用是本领域已知的。主要参见The Maize Handbook，第116章，Freeling和Walbot(编辑)，Springer，New York(1994)。
植物信号序列，包括但不限于将蛋白质靶向植物细胞的细胞外基质的信号肽编码DNA/RNA序列(Dratewka-Kos等人，(1989)J.Biol.Chem.264：4896-900)，如皱叶烟草(Nicotiana plumbaginifolia)扩展基因(DeLoose等人，(1991)Gene 99：95-100)；将蛋白质靶向液泡的信号肽，如甘薯sporamin基因(Matsuka等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：834)和大麦凝集素基因(Wilkins等人，(1990)Plant Cell，2：301-13)；引起蛋白质分泌的信号肽，如PRIb的信号肽(Lind等人，(1992)Plant Mol.Biol.18：47-53)或大麦α淀粉酶(BAA)的信号肽(Rahmatullah等人，(1989)Plant Mol.Biol.12：119，藉此将该文献以引用的方式并入本文)或将蛋白质靶向质体的信号肽如油菜籽烯酰-Acp还原酶的信号肽(Verwaert等人，(1994)Plant Mol.Biol.26：189-202)，在本发明中是有用的。
包含来自在本发明方法中有用的多核苷酸的序列的载体将通常包含标志物基因，该标志物基因可给植物细胞赋予选择性表型。通常，选择性标志物基因将编码抗生素抗性，合适的基因包括编码对壮观霉素这种抗生素的抗性的基因(例如aada基因)、编码链霉素抗性的链霉素磷酸转移酶(SPT)基因、编码卡那霉素或遗传霉素抗性的新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因、编码潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶(HPT)基因、编码对起到抑制乙酰乳酸合酶(ALS)的作用的除草剂，特别是磺酰脲类除草剂的抗性的基因(例如含有导致这种抗性的突变特别是S4和/或Hra突变的乙酰乳酸合酶(ALS)基因)、编码对起到抑制谷氨酰胺合酶的作用的除草剂如草胺膦或basta的抗性的基因(例如bar基因)，或本领域已知的其他这种基因。bar基因编码对除草剂basta的抗性，ALS基因编码对除草剂氯磺隆的抗性。可使用其他赋予对除草化合物如草铵膦、溴苯腈、咪唑啉酮类和2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)的抗性的基因。另外的选择性标志物包括表型标志物如β-半乳醣苷酶和荧光蛋白如绿荧光蛋白(GFP)(Su等人，(2004)Biotechnol Bioeng 85：610-9和Fetter等人，(2004)Plant Cell 16：215-28)、青色荧光蛋白(CYP)(Bolte等人，(2004)J.Cell Science 117：943-54和Kato等人，(2002)Plant Physiol 129：913-42)和黄色荧光蛋白(来自Evrogen的PhiYFPTM，参见Bolte等人，(2004)J.CellScience 117：943-54)。对于另外的选择性标志物，一般可参见Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3：506-511；Christopherson等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6314-6318；Yao等人，(1992)Cell 71：63-72；Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.6：2419-2422；Barkley等人，(1980)The Operon，第177-220页；Hu等人，(1987)Cell 48：555-566；Brown等人，(1987)Cell 49：603-612；Figge等人，(1988)Cell 52：713-722；Deuschle等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Aci.USA 86：5400-5404；Fuerst等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2549-2553；Deuschle等人，(1990)Science 248：480-483；Gossen(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg；Reines等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：1917-1921；Labow等人，(1990)Mol.Cell.Biol.10：3343-3356；Zambretti等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：3952-3956；Baim等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：5072-5076；Wyborski等人，(1991)Nucleic Acids Res.19：4647-4653；Hillenand-Wissman(1989)Topics Mol.Struc.Biol.10：143-162；Degenkolb等人，(1991)Antimicrob.Agents Chemother.35：1591-1595；Kleinschnidt等人，(1988)Biochemistry 27：1094-1104；Bonin(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg；Gossen等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：5547-5551；Oliva等人，(1992)Antimicrob.Agents Chemother.36：913-919；Hlavka等人，(1985)Handbook of Experimental Pharmacology，第78卷(Springer-Verlag，Berlin)；Gill等人，(1988)Nature 334：721-724。将这些公开内容以引用的方式并入本文。
上面关于选择性标志物基因的列表并不意指是限制性的。任何选择性标志物基因均可用于本发明。
可用于基因在高等植物中的表达的典型载体是本领域所熟知的，包括源于根瘤农杆菌的肿瘤诱导(Ti)质粒的载体，这类载体由Rogers等人，(1987)，Meth.Enzymol.153：253-77进行了描述。这些载体是植物整合型载体，因为在转化时，这些载体将载体DNA的一部分整合进宿主植物的基因组中。可用于本发明的示例性根瘤农杆菌载体是Schardl等人，(1987)Gene61：1-11和Berger等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：8402-6的质粒pKYLX6和pKYLX7。本发明中可用的另一种载体是质粒pBI101.2，其可得自CLONTECH Laboratories，Inc.(Palo Alto，CA)。本文所用的“载体”包括指涉用于转染宿主细胞并可在其中插入多核苷酸的核酸。载体常常是复制子。表达载体允许插入其中的核酸转录，如本文别处描述的。
可以在重组工程化细胞如细菌、酵母、昆虫、哺乳动物或优选植物细胞中表达蛋白质。这类细胞在非天然条件下(例如，在数量、组成、位置和/或时间方面)产生蛋白质，因为它们已通过人为干预被遗传改变成在非天然条件下产生蛋白质。
所谓“宿主细胞”意指包含本发明的异源核酸序列的、含有载体并支持该表达载体的复制和/或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌，或真核细胞如酵母、昆虫、植物、两栖动物或哺乳动物细胞。优选地，宿主细胞是单子叶植物细胞或双子叶植物细胞，包括但不限于玉蜀黍、高粱、向日葵、大豆、小麦、苜蓿、水稻、棉花、甘蔗、卡诺拉、草坪草、大麦、小米和番茄。在一些实施方案中，单子叶宿主细胞是玉蜀黍宿主细胞。
本文所用的“重组的”包括指涉已通过引入异源核酸进行修饰的细胞或载体，或者源于经这样修饰过的细胞的细胞。因而，例如，重组细胞表达不以天然(非重组)形式的细胞内的相同形式存在的基因，或因为有意人为干预而表达原本异常表达、表达不足或根本不表达的天然基因，或可具有减低的或消除的天然基因表达。本文所用的术语“重组的”不涵盖通过天然发生的事件(例如自发突变、天然转化/转导/转座)进行的细胞或载体的变更，所述事件如在没有有意人为干预的情况下发生的那些。
预期的是，本领域的技术人员知道多种可用于表达编码在本发明方法中有用的蛋白质的核酸的表达体系。无意于详细描述已知用于在原核生物或真核生物中表达蛋白质的各种方法。
简单概括而言，编码本发明蛋白质的分离核酸的表达通常将通过使例如DNA或cDNA可操作连接至启动子(组成型或诱导型)，然后整合进表达载体中来实现。该载体可适合于在原核生物或真核生物中复制和整合。如上所述，典型的表达载体含有可用于调节编码在本发明方法中有用的蛋白质的DNA的表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。为了获得克隆基因的高水平表达，期望构建表达载体，该表达载体在最低程度上含有用以指导转录的强启动子(如泛素启动子)、用于翻译起始的核糖体结合位点和转录/翻译终止子。
技术人员将认识到，可对本发明方法中有用的蛋白质进行修饰而不减少其生物活性。可进行某些修饰以有利于目标分子的克隆、表达或掺入进融合蛋白中。这种修饰是本领域技术人员所熟知的，包括例如在氨基末端添加甲硫氨酸以提供起始位点，或在任一端设置额外的氨基酸(例如多聚His)以产生便利地定位的限制性位点或终止密码子或纯化序列。
原核细胞可用作表达的宿主。原核生物最通常由大肠杆菌的多种菌株代表；然而，也可使用其他微生物株。在本文中定义为包括用于转录起始的启动子(任选具有操纵子)以及核糖体结合位点序列的常用原核控制序列，包括诸如β-内酰胺酶(青霉素酶)启动子系统和乳糖(lac)启动子系统(Chang等人，(1977)Nature 198：1056)、色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel等人，(1980)Nucleic Acids Res.8：4057)和λ衍生PL启动子之类的常用启动子和N-基因核糖体结合位点(Shimatake等人，(1981)Nature 292：128)。在转染进大肠杆菌中的DNA载体中包含选择标志物也是有用的。这种标志物的例子包括规定对氨苄青霉素、四环素或氯霉素的抗性的基因。
选择载体以使得将所关注基因引入到适当的宿主细胞中。细菌载体通常是质粒或噬菌体起源的。将适当的细菌细胞用噬菌体载体颗粒转染或用裸噬菌体载体DNA转染。如果使用质粒载体，则将细菌细胞用质粒载体DNA转染。用于表达在本发明方法中有用的蛋白质的表达系统可用芽孢杆菌属(Bacillus sp.)和沙门氏菌属(Salmonella)提供(Palva等人，(1983)Gene22：229-35；Mosbach等人，(1983)Nature 302：543-5)。来自Pharmacia的pGEX-4T-1质粒载体是本发明的优选大肠杆菌表达载体。
多种真核表达系统如酵母、昆虫细胞系、植物和哺乳动物细胞是本领域技术人员已知的。如下面简单解释的，本发明可在这些真核系统中表达。在一些实施方案中，将转化的/转染的植物细胞(如下文所论述的)用作表达系统，用于产生本发明的蛋白质。
异源蛋白质在酵母中的合成是众所周知的。Sherman等人，(1982)Methods in Yeast Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory是描述多种可用于在酵母中产生蛋白质的方法的广泛认可的著作。两种广泛采用的用于产生真核蛋白质的酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。用于在酵母属(Saccharomyces)和毕赤酵母属(Pichia)中表达的载体、菌株和方法是本领域已知的并可从商业来源(例如Invitrogen)获得。根据需要，合适的载体通常具有表达控制序列，例如启动子(包括3-磷酸甘油酸激酶或醇氧化酶启动子)和复制起始区、终止序列等等。
在本发明方法中有用的蛋白质，一旦表达，可通过裂解细胞并向溶胞产物或沉淀物应用标准蛋白质分离技术来从酵母分离。可通过使用蛋白质印记技术或其他标准免疫测定技术的放射免疫测定法来完成对纯化过程的监测。
还可将编码在本发明方法中有用的蛋白质的序列连接至多种用于转染例如哺乳动物、昆虫或植物起源的细胞培养物的表达载体。哺乳动物细胞系统通常会是单层细胞的形式，但也可使用哺乳动物细胞悬浮液。本领域已开发了多种能够表达完整蛋白质的合适宿主细胞系，包括HEK293、BHK21和CHO细胞系。用于这些细胞的表达载体可包括表达控制序列，如复制起始区、启动子(例如CMV启动子、HSV tk启动子或pgk(磷酸甘油酸激酶)启动子)、增强子(Queen等人，(1986)Immunol.Rev.89：49)和必要的加工信息位点如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多腺苷酸化位点(例如SV40大T Ag poly A添加位点)和转录终止子序列。可用于产生本发明蛋白质的其他动物细胞可从(例如)美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection)Catalogue of Cell Lines and Hybridomas(第7版，1992)获得。
用于在昆虫细胞中表达本发明的蛋白质的适当载体通常源于SF9杆状病毒。合适的昆虫细胞系包括蚊幼虫、蚕、行军虫、蛾和果蝇属(Drosophila)细胞系如Schneider细胞系(参见例如Schneider，(1987)J.Embryol.Exp.Morphol.27：353-65)。
如使用酵母一样，当采用高等动物或植物宿主细胞时，通常将多腺苷酸化或转录终止子序列整合进载体中。终止子序列的例子是来自牛生长激素基因的多聚腺苷酸化序列。还可包括用于转录物的精确剪接的序列。剪接序列的例子是来自SV40的VP1内含子(Sprague等人，(1983)J.Virol.45：773-81)。另外，可将控制在宿主细胞中的复制的基因序列整合进载体(如牛乳头瘤病毒类型的载体中存在的那些)(Saveria-Campo，“Bovine PapillomaVirus DNA a Eukaryotic Cloning Vector，”DNA Cloning：A PracticalApproach，第II卷，Glover(编辑)，IRL Press，Arlington，VA，第213-38页(1985))。
另外，可将布置在适当植物表达载体中的ACC合酶多核苷酸用于转化植物细胞。然后可从植物愈伤组织分离多肽或可将转化的细胞用于再生转基因植物。可收获这种转基因植物，将适当的组织(例如，种子或叶)进行大规模蛋白质提取和纯化技术。
有多种用于将外来多核苷酸引入植物中的方法是已知的，并且可用于将ACC合酶多核苷酸插入植物宿主中，包括生物学或物理植物转化方案在内。参见例如Miki等人，“Procedure for Introducing Foreign DNA intoPlants”，Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology，Glick和Thompson(编辑)，CRC Press，Inc.，Boca Raton，第67-88页(1993)。所选择的方法随宿主植物而变化，包括化学转染方法如磷酸钙介导的基因转移、微生物介导的基因转移如农杆菌介导的基因转移(Horsch等人，Science227：1229-31(1985))、电穿孔、显微注射和基因枪轰击。
在将核酸插入细胞的语境中的术语“引入”，意指“转染”或“转化”或“转导”，包括指涉核酸掺入进真核或原核细胞中，其中该核酸可掺入进细胞的基因组(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中，转化成自主复制子或瞬时表达(例如，转染的mRNA)。当将多核苷酸或多肽引入植物中时，“引入”旨在表示以使得序列能够进入植物细胞的内部的方式将多核苷酸或多肽给予植物。本发明的方法不取决于将序列引入植物中的具体方法，只要多核苷酸或多肽可进入植物的至少一个细胞的内部即可。将多核苷酸或多肽引入植物中的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的转化方法。
用于植物细胞或组织转化和植物再生的表达盒和载体以及体外培养方法是已知的并可获得。参见例如Gruber等人，“Vectors for PlantTransformation”，Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology(同上)，第89-119页。
可通过一种或多种通常用于直接递送进细胞的技术将多核苷酸或多肽引入植物中。取决于要进行基因修饰的生物体、细胞、植物或植物细胞的类型(即单子叶植物或双子叶植物)，这种方案可不同。转化植物细胞的合适方法包括显微注射(Crossway等人，(1986)Biotechniques 4：320-334和第6,300,543号美国专利)、电穿孔(Riggs等人，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5602-5606)、直接基因转移(Paszkowski等人，(1984)EMBO J.3：2717-2722)和弹道颗粒加速(参见例如Sanford等人，第4,945,050号美国专利；WO 91/10725和McCabe等人，(1988)Biotechnology 6：923-926)。另参见Tomes等人，“Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells ViaMicroprojectile Bombardment”.第197-213页，Plant Cell，Tissue and OrganCulture，Fundamental Methods.Gamborg和Phillips(编辑)，Springer-VerlagBerlin Heidelberg New York，1995；第5,736,369号美国专利(meristem)；Weissinger等人，(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477；Sanford等人，(1987)Particulate Science and Technology 5：27-37(洋葱)；Christou等人，(1988)Plant Physiol.87：671-674(大豆)；Datta等人，(1990)Biotechnology 8：736-740(稻)；Klein等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：4305-4309(玉蜀黍)；Klein等人，(1988)Biotechnology 6：559-563(玉蜀黍)；WO91/10725(玉蜀黍)；Klein等人，(1988)Plant Physiol.91：440-444(玉蜀黍)；Fromm等人，(1990)Biotechnology 8：833-839和Gordon-Kamm等人，(1990)Plant Cell 2：603-618(玉蜀黍)；Hooydaas-Van Slogteren和Hooykaas，(1984)Nature(London)311：763-764；Bytebierm等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5345-5349(百合科(Liliaceae))；De Wet等人，(1985)TheExperimental Manipulation of Ovule Tissues，Chapman等人(编辑)，第197-209页，Longman，NY(花粉)；Kaeppler等人，(1990)Plant Cell Reports9：415-418；以及Kaeppler等人，(1992)Theor.Appl.Genet.84：560-566(晶须介导的转化)；第5,693,512号美国专利(超声处理)；D′Halluin等人，(1992)Plant Cell 4：1495-1505(电穿孔)；Li等人，(1993)Plant Cell Reports12：250-255以及Christou和Ford，(1995)Annals of Botany 75：407-413(水稻)；Osjoda等人，(1996)Nature Biotech.14：745-750；农杆菌介导的玉蜀黍转化(第5,981,840号美国专利)；碳化硅晶须法(Frame等人，(1994)Plant J.6：941-948)；激光法(Guo等人，(1995)Physiologia Plantarum93：19-24)；超声处理法(Bao等人，(1997)Ultrasound in Medicine &Biology 23：953-959；Finer和Finer，(2000)Lett Appl Microbiol.30：406-10；Amoah等人，(2001)J Exp Bot 52：1135-42)；聚乙二醇法(Krens等人，(1982)Nature 296：72-77)；可利用电穿孔转化单子叶植物和双子叶植物细胞的原生质体(Fromm等人，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：5824-5828)和显微注射(Crossway等人，(1986)Mol.Gen.Genet.202：179-185)，将上述所有文献以引用的方式并入本文。
最广泛使用的将表达载体引入植物中的方法是基于农杆菌的天然转化系统。根瘤农杆菌和毛根农杆菌是植物病原性土壤细菌，其能遗传转化植物细胞。根瘤农杆菌和毛根农杆菌各自的Ti和Ri质粒携带负责植物的遗传转化的基因。参见例如Kado，(1991)Crit.Rev.Plant Sci.10：1。如下文献提供了有关用于农杆菌介导的基因转移的农杆菌载体系统和方法的描述：Gruber等人(同上)；Miki等人(同上)和Moloney等人，(1989)Plant Cell Reports8：238。
相似地，可将基因插入源于根瘤农杆菌或毛根农杆菌各自的Ti或Ri质粒的T-DNA区。因而，可使用这些质粒，如上构建表达盒。已知有许多控制序列，其在偶联至异源编码序列并转化进宿主生物体中时，在初始编码序列的组织/器官特异性方面显示出基因表达的保真性。参见例如Benfey和Chua，(1989)Science 244：174-81。用于这些质粒中的特别合适的控制序列是用于基因在各种靶植物中的组成型叶特异性表达的启动子。其他可用的控制序列包括来自胭脂氨酸合酶基因(NOS)的启动子和终止子。NOS启动子和终止子存在于质粒pARC2中，该质粒可得自美国典型培养物保藏中心，指定的ATCC存放号为67238。如果使用这样一种系统，则来自Ti或Ri质粒的毒力(vir)基因也必须存在，或者与T-DNA部分一起，或者通过其中vir基因存在于单独载体上的双元系统。用于本发明的这类系统、载体以及转化植物细胞的方法在如下文献中进行了描述：第4,658,082号美国专利；1993年11月16日提交的第5,262,306号美国专利中引用的、1986年10月1提交的系列号为913,914的美国专利申请以及Simpson等人，(1986)Plant Mol.Biol.6：403-15(也在′306专利中引用)，将所有上述参考文献以引用的方式全文并入本文。
一旦构建，可将这些质粒置于毛根农杆菌或根瘤农杆菌中并将这些载体用于转化植物物种的细胞，所述植物物种的细胞通常对镰孢属(Fusarium)或链格孢属(Alternaria)感染而言是易感的。本发明还可以想到若干其他转基因植物，包括但不限于大豆、玉米、高粱、苜蓿、水稻、三叶草、卷心菜、香蕉、咖啡、芹菜、烟草、豇豆、棉花、甜瓜和胡椒。根瘤农杆菌或者毛根农杆菌的选择将取决于用其转化的植物。通常，根瘤农杆菌是用于转化的优选生物体。多大数双子叶植物、一些裸子植物和少数单子叶植物(例如百合目(Liliales)和天南星目(Arales)的某些成员)对根瘤农杆菌感染是易感的。毛根农杆菌也具有广泛的宿主范围，涵盖大多数双子叶植物和一些裸子植物，其包括豆科(Leguminosae)、菊科(Compositae)和藜科(Chenopodiaceae)的成员。单子叶植物现在可以一定的成功率进行转化。第604 662 A1号欧洲专利申请公开了用农杆菌转化单子叶植物的方法。第672 752 A1号欧洲专利申请公开了使用未成熟胚的盾片用农杆菌转化单子叶植物的方法。Ishida等人论述了通过使未成熟胚暴露于根瘤农杆菌来转化玉蜀黍的方法(NatureBiotechnology 14：745-50(1996))。
一旦转化，可将这些细胞用于再生转基因植物。本文所用的“转基因植物”包括指涉在其基因组内包含异源多核苷酸的植物。一般来讲，异源多核苷酸稳定地整合在基因组内使得该多核苷酸得以传递到连续世代。可将异源多核苷酸单独整合进基因组中或作为重组表达盒的一部分整合进基因组中。“转基因”在本文中用于包括其基因型已因异源核酸的存在而改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植株部分或植株，包括那些那种最初经如此改变的转基因植物以及通过有性杂交或无性繁殖从最初的转基因植物产生的那些。本文所用的术语“转基因”不涵盖通过常规植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组(染色体基因组或染色体外基因组)的改变。
例如，整个植株可通过使该植株产生伤口，然后将载体引入该伤口位点来用这些载体进行感染。可使植株的任何部分产生伤口，包括叶、茎和根。或者，可将外植体形式的植物组织如子叶组织或叶圆片用这些载体接种，并在可促进植物再生的条件下培养。可将通过用毛根农杆菌或根瘤农杆菌(含有编码伏马毒素降解酶的基因)接种植物组织而转化的根或苗用作植物来源，以通过体细胞胚胎发生或器官发生来再生伏马毒素抗性转基因植物。用于再生植物组织的这类方法的例子在如下文献中有所公开：Shahin，(1985)Theor.Appl.Genet.69：235-40；第4,658,082号美国专利；Simpson等人(同上)和在1993年11月16日提交的第5,262,306号美国专利中引用的均于1986年10月1日提交的系列号为913,913和913,914的美国专利申请，将上述文献的全部公开内容以引用的方式并入本文。
尽管农杆菌介导的转化的宿主范围广泛，但一些主要的谷类作物物种和裸子植物总体上对该基因转移模式而言是顽拗的，尽管最近已在稻中获得了一定的成功(Hiei等人，(1994)The Plant Journal 6：271-82)。已开发了几种植物转化的方法(统称为直接基因转移)作为对农杆菌介导的转化的替代。
一般适用的植物转化方法是微抛射体(microprojectile)介导的转化，其中DNA携带在约1至4μm的微抛射体的表面上。用基因枪装置将表达载体引入植物组织中，该基因枪装置将微抛射体加速至300至600m/s的速度，该速度足以穿透植物细胞壁和膜(Sanford等人，(1987)Part.Sci.Technol.5：27；Sanford，(1988)Trends Biotech 6：299；Sanford，(1990)Physiol.Plant79：206和Klein等人，(1992)Biotechnology 10：268)。
物理递送DNA至植物的另一种方法是如Zang等人，(1991)BioTechnology 9：996中所述的对靶细胞的超声处理。或者，脂质体或原生质球融合已用于将表达载体引入植物中。参见例如Deshayes等人，(1985)EMBO J.4：2731和Christou等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：3962。利用CaCl2沉淀、聚乙烯醇或poly-L-鸟氨酸直接将DNA摄入原生质体中已有报道。参见例如Hain等人，(1985)Mol.Gen.Genet.199：161和Draper等人，(1982)Plant Cell Physiol.23：451。
原生质体和完整细胞和组织的电穿孔也已有描述。参见例如Donn等人，(1990)Abstracts of the VIIth Int′l.Congress on Plant Cell and TissueCulture IAPTC，A2-38，第53页；D′Halluin等人，(1992)Plant Cell 4：1495-505和Spencer等人，(1994)Plant Mol.Biol.24：51-61。
除了调节乙烯合成，本发明的方法可连同可改变植物中的另外的表型的序列或方法一起使用。有多种表型变化是值得关注的，包括修饰植物中的脂肪酸组成、改变植物的氨基酸含量、改变植物的病原体防御机制等等。这些结果可通过在植物中表达异源产物或增加内源产物的表达来实现。或者，这些结果可通过在植物中减少一种或多种内源产物(特别是酶或辅因子)的表达来实现。这些改变导致转化植物的表型变化。
所关注基因反映了作物开发的参与者的商业市场和利益。所关注作物和市场在变化，并且随着发展中国家开放了世界市场，也将会出现新的作物和技术。另外，随着我们对农学性状和特性如产量和杂种优势的理解的增加，对用于转化的基因的选择将会相应变化。所关注基因的大体类别包括例如涉及信息的那些基因(如锌指)、涉及通信的那些基因(如激酶)和涉及看家的那些基因(如热休克蛋白)。转基因的更具体类别例如包括编码对农学、昆虫抗性、病害抗性、除草剂抗性、不育性、谷粒特征和商业产品重要的性状的基因。一般而言，所关注基因包括涉及油脂、淀粉、碳水化合物或营养物质代谢的那些以及影响仁大小、蔗糖载量等的那些。
在某些实施方案中，可将本发明的核酸序列与所关注的其他多核苷酸序列联合(“堆叠”)使用，以便产生具有所需表型的植物。生成的组合可包括所关注多核苷酸中的任何一者或多者的多个拷贝。本发明的多核苷酸可与任何基因或基因的组合堆叠以产生具有多种所需性状组合的植物，包括但不限于对动物饲料而言理想的性状如高油脂基因(例如第6,232,529号美国专利)；平衡的氨基酸(例如hordothionin类(第5,990,389号；第5,885,801号；第5,885,802号和第5,703,049号美国专利)；大麦高赖氨酸(Williamson等人，(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106和WO 98/20122)和高甲硫氨酸蛋白质(Pedersen等人，(1986)J.Biol.Chem.261：6279；Kirihara等人，(1988)Gene 71：359和Musumura等人，(1989)Plant Mol.Biol.12：123))；增加的消化率(例如经修饰的贮藏蛋白(于2001年11月7日提交的系列号为10/053,410的美国专利申请)和硫氧还蛋白(于2001年12月3日提交的系列号为10/005,429的美国专利申请))，将上述文献的公开内容以引用的方式并入本文。本发明的多核苷酸还可与对昆虫、病害或除草剂抗性而言理想的性状堆叠(例如，苏芸金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)毒蛋白(第5,366,892号；第5,747,450号；第5,736,514号；第5,723,756号；第5,593,881号美国专利；Geiser等人，(1986)Gene 48：109)；凝集素(Van Damme等人，(1994)Plant Mol.Biol.24：825)；伏马毒素解毒基因(第5,792,931号美国专利)；毒力和病害抗性基因(Jones等人，(1994)Science 266：789；Martin等人，(1993)Science 262：1432；Mindrinos等人，(1994)Cell 78：1089)；导致除草剂抗性的乙酰乳酸合酶(ALS)突变体如S4和/或Hra突变；谷氨酰胺合酶的抑制剂如草胺膦或basta(例如bar基因)；以及草甘膦抗性(EPSPS基因))，以及对加工或工艺产品而言理想的性状如高油脂(例如第6,232,529号美国专利)；经修饰的油脂(例如脂肪酸去饱和酶基因(第5,952,544号美国专利；WO 94/11516))；经修饰的淀粉(例如ADPG焦磷酸化酶(AGP酶)、淀粉合酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)和淀粉脱支酶(SDBE))和聚合物或生物塑料(例如第5.602,321号美国专利；促进聚羟基链烷酸酯(PHA)表达的β-酮硫解酶、聚羟基丁酯合酶和乙酰乙酰辅酶A还原酶(Schubert等人，(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847))，将上述文献的公开内容以引用的方式并入本文。还可以将本发明的多核苷酸与影响诸如雄性不育(例如参见第5,583,210号美国专利)、茎秆强度、开花时间之类的农学性状或诸如细胞周期调控或基因打靶(例如WO 99/61619；WO 00/17364；WO 99/25821)之类的转化技术性状的多核苷酸组合，将上述文献以引用的方式并入本文。
在一个实施方案中，所关注序列可改善植物生长和/或作物产量。例如，所关注序列包括可导致初生根系或侧根系改善的农学上重要的基因。这类基因包括但不限于营养物质/水转运蛋白和生长诱导。这类基因的例子包括但不限于玉蜀黍质膜H+-ATP酶(MHA2)(Frias等人，(1996)Plant Cell8：1533-44)；AKT1，拟南芥属中钾摄取器的组件，(Spalding等人，(1999)J Gen Physiol 113：909-18)；RML基因，其激活根顶端细胞中的细胞分裂周期(Cheng等人，(1995)Plant Physiol 108：881)；玉蜀黍谷氨酰胺合成酶基因(Sukanya等人，(1994)Plant Mol Biol 26：1935-46)和血红蛋白(Duff等人，(1997)J.Biol.Chem 27：16749-16752；Arredondo-Peter等人，(1997)Plant Physiol.115：1259-1266；Arredondo-Peter等人，(1997)Plant Physiol114：493-500以及其中引用的参考文献)。所关注序列还可用于表达负面影响根发育的基因的反义核苷酸序列。
另外，除了利用传统的育种方法外，还可遗传改变诸如油脂、淀粉和蛋白质含量之类的农学上重要的性状。修饰包括增加油酸、饱和或不饱和油的含量、增加赖氨酸或硫的水平、提供必需氨基酸以及修饰淀粉。第5,703,049号、第5,885,801号、第5,885,802号和第5,990,389号美国专利中描述了Hordothionin蛋白修饰，将这些文献以引用的方式并入本文。另外的例子是第5,850,016号美国专利中描述的由大豆2S白蛋白编码的富含赖氨酸和/或硫的种子蛋白质和Williamson等人，(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106中描述的来自大麦的胰凝乳蛋白酶抑制剂，将上述参考文献的公开内容以引用的方式并入本文。
可通过定点诱变产生编码序列的衍生物来增加预选氨基酸在所编码的多肽中的水平。例如，编码大麦高赖氨酸多肽的基因(BHL)源于大麦胰凝乳蛋白酶抑制剂，参见于1996年11月1日提交的系列号为08/740,682的美国专利申请和WO 98/20133，将这两篇文献的公开内容以引用的方式并入本文。其他蛋白质包括富含甲硫氨酸的植物蛋白质如来自向日葵籽(Lilley等人，(1989)Proceedings of the World Congress on Vegetable Protein Utilizationin Human Foods and Animal Feedstuffs，Applewhite(编辑)(American OilChemists Society，Champaign，Illinois)，第497-502页，将该文献以引用的方式并入本文)；玉米(Pedersen等人，(1986)J.Biol.Chem.261：6279；Kirihara等人，(1988)Gene 71：359，将这两篇文献均以引用的方式并入本文)和水稻(Musumura等人，(1989)Plant Mol.Biol.12：123，将该文献以引用的方式并入本文)。其他农学上重要的基因编码胶乳、Floury 2、生长因子、种子贮藏因子和转录因子。
昆虫抗性基因可编码针对会导致产量大跌的害虫(如根虫、切根虫、欧洲玉米螟等)的抗性。这类基因包括例如苏芸金芽胞杆菌毒蛋白基因(第5,366,892号；第5,747,450号；第5,736,514号；第5,723,756号；第5,593,881号美国专利和Geiser等人，(1986)Gene 48：109)等等。
编码病害抗性性状的基因包括：解毒基因，如对抗伏马毒素的基因(第5,792,931号美国专利)；毒力(avr)和病害抗性(R)基因(Jones等人，(1994)Science 266：789；Martin等人，(1993)Science 262：1432和Mindrinos等人，(1994)Cell 78：1089)等等。
除草剂抗性性状可包括编码针对起到抑制乙酰乳酸合酶(ALS)作用的除草剂(特别是磺酰脲类除草剂)的抗性的基因(例如含有导致这种抗性的突变，特别是S4和/或Hra突变的乙酰乳酸合酶(ALS)基因)、编码针对起到抑制谷氨酰胺合酶作用的除草剂如草胺膦或basta的抗性的基因(例如bar基因)，或本领域已知的其他这类基因。bar基因编码针对除草剂basta的抗性，nptII基因编码针对抗生素卡那霉素和遗传霉素的抗性，ALS基因突变编码针对除草剂氯磺隆的抗性。
不育基因也可编码在表达盒中，为物理去雄提供另选方案。可以这类方式使用的基因的例子包括雄性组织优选的基因和具有雄性不育表型的基因如QM，其在第5,583,210号美国专利中进行了描述。其他基因包括激酶和编码对雄性或雌性配子体发育有毒的化合物的那些。
谷粒品质反映在诸如饱和和非饱和的油的水平和类型、必需氨基酸的品质和数量以及纤维素的水平之类的性状中。在玉米中，修饰的hordothionin蛋白在第5,703,049号、第5,885,801号、第5,885,802号和第5,990,389号美国专利中进行了描述。
还可在(一种或多种)基因上编码商业性状，所述基因可增加例如用于乙醇生产的淀粉，或提供蛋白质的表达。转化植物的另一重要的商业用途是生产聚合物和生物塑料，如在第5,602,321号美国专利中描述的。诸如β-酮硫解酶、PHB酶(聚羟基丁酸酯合酶)和乙酰乙酰辅酶A还原酶之类的基因(参见Schubert等人，(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847)可促进聚羟基链烷酸酯(PHA)的表达。
外源产物包括植物酶和产物以及来自包括原核生物和其他真核生物在内的其他来源的那些。这类产物包括酶、辅因子、激素等等。可增加蛋白质，特别是具有改善的氨基酸分布以改善植物营养价值的修饰蛋白质的水平。这可通过表达具有提高的氨基酸含量的这类蛋白质来实现。
可根据常规方式将已转化的细胞培育成植株。参见例如McCormick等人，(1986)Plant Cell Reports 5：81-84。然后可栽培这些植株并用相同的转化株授粉或用不同的株系授粉；然后可鉴别具有所需表型特性的所得子代。可培育两代或更多代以确保所需表型特性得以稳定保持和遗传，然后采集种子以确保已获得展现出所需表型特性的稳定转化体。这样，本发明提供了转化种子(也称为“转基因种子”)，该转化种子具有稳定整合进它们的基因组中的本发明的核酸构建体，例如本发明的表达盒。
本文所用的术语“植物”包括指涉整个植株、植物器官(例如叶、茎、根等)、种子和植物细胞和它们的子代。术语植物还包括植物原生质体、植物愈伤组织和植物块。本文所用的植物细胞包括但不限于存在于或来自种子、悬浮培养物、胚、分生组织区、愈伤组织、叶、根、苗、配子体、孢子体、花粉和小孢子的细胞。植物细胞可以是完整植株的部分或植株部分，如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、仁、穗、穗轴、壳、茎、根、根尖、花粉囊等。谷粒旨在表示商业种植者出于栽培或繁殖物种之外的目的生产的成熟种子。再生的植物的子代、变体和突变体也包括在本发明的范围内，条件是这些部分包含所引入的多核苷酸。
本发明可用于任何植物物种(包括但不限于单子叶植物和双子叶植物)的转化。所关注的植物物种的例子包括但不限于玉米(Zea mays)；芸苔属物种(Brassica sp.)(例如甘蓝型油菜(B.napus)、芜菁(B.rapa)、芥菜(B.juncea))，特别是可用作种子油来源的那些芸苔属物种；苜蓿(Medicagosativa)、水稻(Oryza sativa)、黑麦(Secale cereale)、高粱(Sorghum bicolor，Sorghum vulgare)、小米(例如珍珠粟(Pennisetum glaucum)、黄米(Panicummiliaceum)、谷子(Setaria italica)、龙爪稷(Eleusine coracana))；向日葵(Helianthus annuus)；红花(Carthamus tinctorius)；小麦(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotiana tabacum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、落花生(Arachis hypogaea)、棉花(海岛棉(Gossypium barbadense)、陆地棉(Gossypium hirsutum))；甘薯(Ipomoea batatus)；木薯(Manihot esculenta)；咖啡(Coffea spp.)；椰子(Cocos nucifera)；菠萝(Ananas comosus)；柑橘(Citrus spp.)；可可(Theobroma cacao)；茶(Camellia sinensis)；香蕉(Musaspp.)；鳄梨(Persea americana)；无花果(Ficus casica)；番石榴(Psidiumguajava)；芒果(Mangifera indica)；橄榄(Olea europaea)；木瓜(Caricapapaya)；腰果(Anacardium occidentale)；澳洲坚果(Macadamia integrifolia)；杏树(Prunus amygdalus)；糖用甜菜(Beta vulgaris)；甘蔗(Saccharum spp.)；燕麦；大麦；蔬菜；观赏植物和针叶树。在本发明公开的方法的特定实施方案中，所述植物是玉米。
蔬菜包括番茄(Lycopersicon esculentum)、莴苣(例如Lactucasativa)、青豆(Phaseolus vulgaris)、利马豆(Phaseolus limensis)、豌豆(Lathyrus spp.)和黄瓜属(Cucumis)的成员如黄瓜(C.sativus)、香瓜(C.cantalupensis)和甜瓜(C.melo)。观赏植物包括杜鹃花(Rhododendron spp.)、八仙花(Macrophylla hydrangea)、朱槿(Hibiscus rosasanensis)、玫瑰(Rosaspp.)、郁金香(Tulipa spp.)、水仙花(Narcissus spp.)、矮牵牛花(Petuniahybrida)、康乃馨(Dianthus caryophyllus)、一品红(Euphorbia pulcherrima)和菊花。
可用于实施本发明的针叶树包括例如：松树如火炬松(Pinus taeda)、湿地松(Pinus elliotii)、美国黄松(Pinus ponderosa)、美国黑松(Pinus contorta)和辐射松(Pinus radiata)；花旗松(Pseudotsuga menziesii)；加拿大铁杉(Tsugacanadensis)；北美云杉(Picea glauca)；红杉(Sequoia sempervirens)；真冷杉如银枞(Abies amabilis)和香脂冷杉(Abies balsamea)；和雪松如西岸红雪松(Thuja plicata)和黄扁柏(Chamaecyparis nootkatensis)。在具体的实施方案中，本发明的植物是作物植物(例如玉米、苜蓿、向日葵、芸苔、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、小米、烟草等等)。在其它实施方案中，玉米和大豆以及甘蔗植物是优选的，在另外的实施方案中玉米植物是优选的。
所关注的其他植物包括提供所关注的种子的谷物植物、油料种子植物和豆科植物。所关注的种子包括谷物种子，如玉米、小麦、大麦、水稻、高粱、黑麦等等。油料植物包括玉米、大豆、红花、向日葵、芸苔、玉蜀黍、苜蓿、棕榈、椰子等等。豆科植物包括荚果类和豌豆。荚果类包括瓜尔豆、槐豆、胡芦巴、大豆、四季豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等等。
除非另外指明，否则本发明的实施将采用植物学、微生物学、组织培养、分子生物学、化学、生物化学和重组DNA技术的常规技术，这些技术处于本领域技能范围内。这类技术在文献中有完全的解释。参见例如Langenheim和Thimann，(1982)Botany：Plant Biology and Its Relation toHuman Affairs，John Wiley；Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants，第1卷，Vasil(编辑)(1984)；Stanier等人，(1986)The Microbial World，第5版，Prentice-Hall；Dhringra和Sinclair，(1985)Basic Plant PathologyMethods，CRC Press；Maniatis等人，(1982)Molecular Cloning：A LaboratoryManual；DNA Cloning，第I和第II卷，Glover(编辑)(1985)；Oligonucleotide Synthesis，Gait(编辑)(1984)；Nucleic Acid Hybridization，Hames和Higgins(编辑)(1984)以及Methods in Enzymology系列，Colowick和Kaplan(编辑)，Academic Press，Inc.，San Diego，CA。
单位、前缀和符号可以它们SI接受的形式表示。除非另外指明，否则分别地，核酸以5′至3′取向从左向右书写；氨基酸序列以氨基向羧基取向从左向右书写。数值范围包括限定该范围的数字。氨基酸在本文中可通过它们通常知道的三字母符号表示或通过IUPAC-IUB生化命名委员会(IUPAC-IUBBiochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母符号表示。同样，核苷酸可通过它们通常接受的单字母密码表示。
应该指出，术语“一个”或“一种”实体指一(个)种或多(个)种该实体；例如“一种多肽”理解为表示一种或多种多肽。同样地，术语“一个”(或“一种”)、“一(个)种或多(个)种”和“至少一(个)种”在本文中可互换使用。
在本说明书和权利要求书全文中，措辞“包含”、“含有”和“包括”以非排他的意义使用，除非其中语境中有别的要求。
本文所用的术语“约”当指值时，意在涵盖偏离指定的量达，在一些实施方案中，±50％的偏差，在一些实施方案中，±20％的偏差，在一些实施方案中，±10％的偏差，在一些实施方案中，±5％的偏差，在一些实施方案中，±1％的偏差，在一些实施方案中，±0.5％的偏差，在一些实施方案中，±0.1％的偏差，只要这种偏差适于执行所公开的方法或采用所公开的组合物。
另外，在量、浓度或其他值或参数以范围(优选范围)或上限优选值和下限优选值列表给出时，这应该理解为具体地公开了由任何范围上限或上限优选值和任何范围下限或下限优选值的任何配对形成的所有范围，而无论是否单独公开了这些范围。如果本文中叙述了数值的范围，除非另外指明，否则该范围旨在包括它们的端点，以及该范围内的所有整数和分数。当限定范围时，无意于使本公开的主题的范围受限于所叙述的具体值。
参考如下非限制性实施例可更好地理解本发明。本领域技术人员将会理解，可在不脱离本文所公开的并受权利要求书保护的发明的精神和范围的情况下实施本发明的其他实施方案。
实施例
实施例1.通过发夹RNA表达进行的ACC合酶敲除
如先前指出的，可例如通过引入构建用于RNA沉默或干扰的ACC合酶多核苷酸序列，来产生敲除植物细胞和植物。本实施例描述了用于例如在玉蜀黍中改善植物氮利用表型的发夹RNA表达盒。如先前指出的，ACC合酶的敲除(例如通过hpRNA表达)可导致一种或多种ACC合酶的表达减少(最高至并且包括无可检测的表达)的植物或植物细胞。
对ACC合酶基因的区域(例如，启动子、其他非翻译区或编码区)有特异性的发夹RNA(hpRNA)分子在植物中表达可改变该植物的氮利用潜能，例如通过RNA干扰和/或沉默。
ACS2和ACS6的hpRNA构建体通过将泛素启动子连接至ACS2或ACS6基因的编码序列的一部分的反向重复序列来产生(参见图2和3)。使用农杆菌介导的转化技术将每种构建体转化进玉蜀黍中。用于制备构建体和转化玉蜀黍的核酸分子和方法是如以前所描述的和本领域已知的，并且如本文所描述的。
对ACS2或ACS6编码序列有特异性的hpRNA的表达导致在营养生长和繁殖生长中不显示出异常的玉蜀黍植物。针对ACS2发夹构建体和ACS6发夹构建体，分别产生了总共36和40个单独的玉蜀黍转基因事件。
每种hpRNA构建体选择大约10低拷贝数事件用于另外的回交和转基因评价。对包含hpRNA转基因的回交系评价氮利用潜能表型，例如，如本文所述(例如，在正常条件下或在氮耗竭、干旱或其他胁迫条件下，通过目视检查、测量光合作用活性、测定叶绿素或蛋白质含量、谷粒产量等等)。
将含有抑制构建体的玉米杂交体和无效对照(null)在氮胁迫条件和正常氮条件下在田间种植。种植密度为36,000株植株/英亩，对植物进行充分灌溉。在正常氮条件下，栽培前以尿素硝酸铵(UAN)的形式施用100lbs氮/英亩，然后在发育的V6阶段将150lbs/英亩的UAN作为侧施肥施用。通过在不添加氮的情况下种植玉米两年耗竭土壤氮储备来实现氮胁迫。在耗竭的每一季后，将玉米粒和稿秆移除以耗竭氮的通过矿化作用得到的有机物质来源。监测土壤硝酸盐储备来评估耗竭水平。为了实现目标胁迫水平，通过在V2和VT之间加肥灌溉来施用UAN，达到总共150lbs氮。
将来自构建体的转基因事件与无效对照一起嵌套，以使得田间变异的空间效应最小。将含有转基因的事件的谷粒产量与转基因无效对照的产量进行比较。进行统计分析来评估与转基因无效对照相比产量是否存在显著改善，行和列的空间效应考虑在内。
■处理：低氮(LN)和正常N(NN)
■嵌套设计，6个重复样本在LN中，4个重复样本在NN中
下表1示出了具有RNAi抑制构建体Ubi：ACS6的7个事件和野生型对照的产量数据(每英亩蒲式耳数)。
表1.
  事件   低氮   正常氮
  E5678.29.1.20   128   266*
  E5678.29.1.22   162*   256*
  E5678.29.1.26   148*   251*
  E5678.29.1.3   150*   244
  E5678.29.1.30   151*   236
  E5678.29.1.32   160*   276*
  E5678.29.1.33   125   265*
  野生型   117   231
  Lsd   14.9   20.0
*显著不同于野生型(P＜0.1)
可以看出，在低氮条件下7个事件中有5个显示出优于野生型的产量。另外有趣地是，在正常氮条件下7个事件中也有5个显示出由于较优的产量。
实施例2：通过发夹RNA表达得到的改善的ACC合酶抑制
通过将泛素启动子连接至ACS6基因的编码序列的一部分及其由ADH1内含子分开的反向重复序列(SEQ ID NO：51和52)，产生改良的hpRNA构建体，该构建体的序列在SEQ ID NO：53中示出(表达盒在EQ ID NO：57中示出并在图Fig.4中绘出)。
下面提供的是对该改良hpRNA质粒(SEQ ID NO：53)的一般描述：
DNA SEQ ID NO：53
UBI:ZM-ACS6 RNAi+UBI:MOPAT:PINII共整合。
长度：51280bp
储存类型：基础型
形式：环状
功能图谱
编码序列(10个信号)
MO-PAT
起始：7109终止：7660
SPC
起始：9525终止：10313(互补)
壮观霉素抗性
TET
起始：14622终止：15272(互补)
四环素抗性
TET
起始：15378终止：16028(互补)
四环素抗性
TRF A
起始：17208终止：19397(互补)
CTL
起始：24763终止：31033(互补)
VIR C1
起始：34264终止：34958
VIR C2
起始：34961终止：35569
VIR G
起始：35680终止：36483(互补)
农杆菌virG(邻近区域)
VIR B
起始：36615终止：46051(互补)
农杆菌virB(邻近区域)
内含子(3个信号)
UBI1ZM INTRON1(PHI)
起始：2196终止：3208
ADH1 INTRON1(PHI)
起始：3791终止：4327
在Pioneer分离自B73(记录本编号4136.51)
UBI1ZM INTRON1(PHI)
起始：6060终止：7072
Misc_feature(11个信号)
RB
起始：1终止：25
ALL STOPS
起始：306终止：339
设计用于终止所有6个开放阅读框的终止密码子的合成序列。
FRT5
起始：452终止：499
ALL STOPS
起始：910终止：943
设计用于终止所有6个开放阅读框的终止密码子的合成序列。
ATTB1
起始：1155终止：1175
ATTB2
起始：4931终止：4951(互补)
FRT12
起始：4998终止：5045
FLP重组靶标12
FRT1
起始：8004终止：8051
PSB1
起始：8052终止：8146
设计用于方便对重组FRT位点进行PCR分析的合成序列。
ALL STOPS
起始：8147终止：8180
设计用于终止所有6个开放阅读框的终止密码子的合成序列。
LB
起始：8325终止：8350
来自Japan Tobacco的tDNA左边界序列
启动子_原核生物(2个信号)
UBI1ZM PRO
起始：1218终止：2113
玉蜀黍泛素启动子
UBI1ZM PRO
起始：5082终止：5977
玉蜀黍泛素启动子
Rep_origin(2个信号)
COLE1 ORI
起始：11588终止：11857(互补)
ORI V
起始：32041终止：32751(互补)
终止子(2个信号)
IN2-1(B)TERM
起始：505终止：902(互补)
该终止子的3′端有98bp缺失。IN表示诱导型，2-1与用于命名该终止子的内部代码相关。
PINII TERM
起始：7671终止：7989
马铃薯PINII终止子
5′UTR(2个信号)
UBI1ZM 5UTR(PHI)
起始：2114终止：2195
UBI1ZM 5UTR(PHI)
起始：5978终止：6059
Misc_RNA(2个信号)
ZM-ACS6(TR3)
起始：3272终止：3776(互补)
用于基因沉默的玉蜀黍ACC合酶6(氨基环丙烷羧酸合酶)截短片段。从基因组PCR得来
ZM-ACS6(TR4)
起始：4332终止：4874
用于基因沉默的玉蜀黍ACC合酶6(氨基环丙烷羧酸合酶)截短片段。从基因组PCR得来
限制性酶切图谱
ApaLI：14个位点G|TGCAC，CACGT|G
N1：287
N2：2517
N3：3704
N4：4391
N5：6381
N6：10036
N7：10810
N8：11376
N9：11874
N10：13564
N11：45696
N12：48291
N13：48789
N14：50471
AvaI：37个位点C|YCGRG，GRGCY|C
N1：1144
N2：1909
N3：3318
N4：3666
N5：4429
N6：4777
N7：4922
N8：5072
N9：5773
N10：7116
N11：10391
N12：15995
N13：16761
N14：17741
N15：20628
N16：21650
N17：22422
N18：24908
N19：28599
N20：30815
N21：31984
N22：33215
N23：33223
N24：33231
N25：34047
N26：34545
N27：35022
N28：35445
N29：35491
N30：36128
N31：36869
N32：37358
N33：37895
N34：38948
N35：41282
N36：43949
N37：51174
BamHI：11个位点G|GATCC，CCTAG|G
N1：3230
N2：4329
N3：4865
N4：5066
N5：7094
N6：34434
N7：35775
N8：37634
N9：38570
N10：38770
N11：43916
ClaI：18个位点AT|CGAT，TAGC|TA
N1：2445
N2：2710
N3：2935
N4：6309
N5：6574
N6：6799
N7：33943
N8：34189
N9：34622
N10：36384
N11：36728
N12：36855
N13：41483
N14：42530
N15：44527
N16：46781
N17：47943
N18：48057
EcoRI：11个位点G|AATTC，CTTAA|G
N1：2609
N2：3261
N3：4834
N4：4877
N5：6473
N6：13890
N7：37680
N8：40564
N9：40976
N10：42287
N11：43685
HindIII：8个位点A|AGCTT，TTCGA|A
N1：649
N2：1202
N3：3864
N4：33254
N5：44317
N6：45226
N7：46347
N8：47862
NcoI：2个位点C|CATGG，GGTAC|C
N1：17026
N2：17554
PstI：15个位点CTGCA|G，G|ACGTC
N1：1218
N2：3208
N3：3777
N4：5082
N5：7072
N6：12698
N7：13142
N8：33407
N9：38321
N10：41155
N11：42206
N12：42791
N13：48045
N14：49613
N15：50049
SmaI：10个位点CCC|GGG，GGG|CCC
N1：1146
N2：3320
N3：3668
N4：4431
N5：4779
N6：4924
N7：5074
N8：15997
N9：16763
N10：34049
使用农杆菌介导的转化技术将每种构建体转化进玉蜀黍中。用于制备构建体和转化玉蜀黍的核酸分子和方法是如以前所描述的并且是本领域已知的。
在四种环境下针对产量对本发明的转化植物进行分析。将八个重复样本在环境1中的花期胁迫下栽培，6个重复样本在环境2中的灌浆胁迫下栽培，6个重复样本在环境3中的灌浆胁迫下栽培，4个重复样本在环境4中的雨养条件下栽培。将产量与高度重复的构建体无效对照(CN)比较。数据示于图5-8中。
图5示出了本发明的转化植株在环境1中的花期胁迫下的产量。每根柱条表示一单独的转化事件。示出了转基因阴性分离子的平均产量(139蒲式耳/英亩)作为对照(CN)。总计74％的事件的标称产量比对照植株更高。代表18个转基因事件的植株产量超过对照，P＜0.10。
图6示出了本发明的转化植株在环境2的灌浆胁迫下的产量。每根柱条表示一单独的转化事件。示出了转基因阴性分离子的平均产量(176蒲式耳/英亩)作为对照(CN)。十三个事件产量超过CN，P＜0.10。其中，八个事件还在花期胁迫下显示出显著的改善。
图7显示本发明的转化植株(由圆圈指示)以及用另选的ACS6抑制载体转化的植株(由正方形指示)在环境3中的灌浆胁迫下的产量(显示为对照的百分比)。每个数据点表示一单独的转化事件。NS＝不显著。对照植株为集团(bulked)转基因阴性分离子。可以看出，相对于对照，64％的本发明事件具有显著较好的产量；仅17％的另选ACS6抑制事件具有显著较好的产量。
图8示出了本发明的转化植株(由圆圈指示)以及用另选的ACS6抑制载体转化的植株(由正方形指示)在环境4中的雨养条件下的产量(显示为对照的百分比)。每个数据点表示一单独的转化事件。NS＝不显著。对照植株为集团转基因阴性分离子。可以看出，所有表现出统计学上显著的产量增加的数据点代表本文所公开的本发明事件。此外，所有表现出统计学上显著的产量降低的数据点是含有另选的ACS6抑制载体的事件。
不受限于任何具体的理论，但据推测本发明的构建体通过改进对ACS表达的调节而在产量方面提供了有文件证明的改善。例如，将Adh1内含子包含在ACS6发夹内，可导致ACS6在本发明的植物中被下调的程度低于在用之前的(另选的)ACS6抑制载体转化的植物中被下调的程度。作为另外一种选择或除此之外，本发明的构建体可影响除ACS6之外的基因(例如ACS2)的表达。
方法：
蛋白质提取
对于总蛋白质分离，在指定的时间收集B73或突变植物的叶，在液氮中迅速冷冻并研磨为细粉。将1ml提取缓冲液(20mM HEPES(pH 7.6)，100mM KCl，10％甘油)添加至大约0.1g冷冻粉末并彻底混合。将样品以10,000rpm离心10分钟，将上清液移至新试管并根据Bradford，(1976)的方法用分光光度法测定浓度。参见Bradford，(1976)Anal.Biochem.72：248-254。
叶绿素提取
将叶在液氮中冷冻并研磨成细粉。将大约0.1g样品移至1.5ml管并称重。用1ml(或0.8ml)的80％丙酮提取叶绿素5次。将各提取物合并，用另外的80％丙酮将最终体积调整为10ml(或15ml)。根据Wellburn，(1994)的方法用分光光度法测定叶绿素含量(a+b)。参见Wellburn，(1994)J.PlantPhysiol.144：307-313。
光合作用的测量
将植物在正常和干旱胁迫条件下的田间栽培。在正常条件下，每周两次给植物浇水八小时。对于干旱胁迫植物，在授粉前大约一周开始并继续至授粉后三周的时间段内，将水限制为每周大约四小时。在限制水供应的时间段内，受干旱胁迫的植物可能显示出萎蔫和卷叶的可见迹象。用便携式TPS-1Photosynthesis System(PP Systems)测定蒸腾作用、气孔导度和CO2同化。在授粉后第四十天测量植物上的每片叶片。数值通常表示为六次测定的平均值。
DNA和RNA纯化
对于总核酸分离，在所需的时间收集B73的叶片，在液氮中快速冷冻并研磨成细粉。然后添加10ml的提取缓冲液(100mM Tris(pH 8.0)，50mMEDTA，200mM NaCl，1％SDS，10μ/ml β-巯基乙醇)并充分混合直至解冻。添加10ml的苯酚/氯仿(1∶1，vol∶vol)并充分混合。将样品以8,000rpm离心10分钟，将上清液移至新的管并在-20℃下使核酸沉淀，然后添加1/10体积的3M乙酸钠和1体积的异丙醇。通过在8,000rpm下离心使总核酸沉淀，并将沉淀再悬浮于1ml TE中。将该制备物的一半用于DNA纯化，剩余的一半用于RNA纯化。(或者，可从1cm2在液氮中迅速冷冻并研磨为细粉的籽苗叶提取DNA或总核酸。添加600μl的提取缓冲液[100mM Tris(pH 8.0)，50mMEDTA，200mM NaCl，1％SDS，10μl/ml β-巯基乙醇]并混合样品。用700μl苯酚/氯仿(1∶1)提取样品并以12,000rpm离心10分钟。使DNA沉淀并再悬浮于600μl H2O中。)
对于DNA纯化，将500μg无DNA酶的RNA酶添加至管中并在37℃下温育1小时。RNA酶消化后，添加等体积的苯酚/氯仿(1∶1，vol∶vol)并充分混合。将样品以10,000rpm离心10分钟，将上清液移至新的管并在添加1/10体积3M乙酸钠和1体积异丙醇后使DNA在-20℃下沉淀。将DNA再悬浮于无菌水中并通过分光光度法测定浓度。为了确定DNA完整性，将20mg DNA在1.8％琼脂糖凝胶上分离并在用溴化乙锭染色后显影。根据Sambrook等人(同上)描述的方法通过2轮LiCl2沉淀来纯化RNA。
实时RT-PCR分析
将50μg总RNA用RQ1.TM.DNA酶(Promega)处理以确保不存在污染性DNA。将2μg总RNA直接用于cDNA合成，该合成使用OmniscriptTM逆转录试剂盒(Qiagen)，以oligo-dT(20)作为引物。
用QuantiTectTM SYBR Green PCR试剂盒(Qiagen)完成对转录物丰度的分析。反应含有1倍缓冲液、0.5μl逆转录反应物(相当于50ng总RNA)和0.25μM(终浓度)正向引物和反向引物，总反应体积为25μl。
在如下条件下用ABI PRISM 7700序列检测系统进行反应：95℃/15分钟)(1个循环)；95C/30秒，62℃/30秒，72℃/2分钟(50个循环)；72℃/5分钟(1个循环)。将每种基因分析最少四次。
将所有引物组合最初在琼脂糖凝胶上跑胶并显影以确认正确大小的单一产物的存在。将所有扩增产物亚克隆进pGEM-T Easy载体系统(Promega)中以用于产生标准曲线，以便将表达数据换算为拷贝/μg RNA。
乙烯测定
从4叶阶段的籽苗的第二完全展开的叶片或从授粉后20、30或40天(DAP)的植物的叶片的末端15cm测量乙烯。在指定的时间收获叶片并让其在湿润的纸巾之间恢复2小时后再收集乙烯。将叶片置于玻璃小瓶中并用橡胶隔片盖上。温育3至4小时后，从每个小瓶采集0.9mL的顶部空间气体样品并用装配有HP Plot氧化铝基毛细管柱(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)的6850系列气相色谱系统(Hewlett-Packard，Palo Alto，CA)测量乙烯含量。对每份样品测量组织鲜重。通常测量三个重复样本并记录平均值和标准偏差。
蛋白质印记分析
在指定的时间收集B73叶片并在液氮中研磨为细粉。将1ml提取缓冲液[20mM HEPES(pH 7.6)，100mM KCl，10％甘油，1mM PMSF]添加至大约0.1g冷冻粉末并充分混合。通过在10,000rpm下离心10分钟使细胞碎片沉淀，并如所描述的(Bradford，1976)测定蛋白质浓度。从Tadahiko Mae博士(Tohoku University，日本仙台)获得针对水稻Rubisco的大亚基的抗血清。用标准SDS-PAGE解析蛋白质提取物并通过电印迹将蛋白质转移至0.22μm硝化纤维膜。转移后，将膜在TPBS(0.1％TWEEN
Figure BPA00001446526500751
20，13.7mMNaCl，0.27mM KCl，1mM Na2HPO4，0.14mM KH2PO4)中的5％牛奶、0.01％硫柳汞中封闭，然后与一抗温育1.5小时，该一抗通常在具有1％牛奶的TPBS中1∶1000至1∶2000稀释。然后将印迹用TPBS洗涤两次并与稀释至1∶5000至1∶10,000的山羊抗兔辣根过氧化物酶缀合抗体(SouthernBiotechnology Associates，Inc.)温育1小时。将印迹用TPBS洗涤两次并利用化学发光(Amersham Corp)检测通常在1至15分钟之间的信号。
实施例3.包含改良的ACS6抑制构建体的植物在低氮下的产量
将实施例2中描述的包含改良的ACS6抑制构建体的植物栽培于在氮胁迫和正常氮条件下的田间。
氮胁迫通过对土壤氮储备的定向耗竭来实现，该耗竭是通过先前的玉米生产和/或限制施用氮肥来进行。除了耕作历史外，在产生适当的氮胁迫条件时还考虑土壤类型和其他环境因素。
将含有转基因的植物的谷粒产量与野生型植物或转基因无效对照进行比较。该测试利用随机化完全区组设计，采用6次重复。用ASReml进行统计分析来评估产量的差异，将行和列空间效应和自回归(AR1)调整考虑在内。
表2提供代表两种地理位置中氮胁迫条件下19个转化事件的植物的产量数据，单位为蒲式耳数/英亩。用星号标记的产量为在P＜0.1下显著高于对照。
表2.
  事件  位置1   位置2
  2.12  121   202*
  2.29  124*   199
  2.32  123   211*
  113.2.7  124*   206*
  4.3  124*   204*
  4.8  125*   203*
  1.23  127*   208*
  1.44  126*   207*
  2.15  124*   205*
  2.2  124   201
  2.24  124*   198
  2.38  125*   204*
  2.49  123   202*
  1.14  125*   210*
  218  126*   206*
  2.22  124*   208*
  28   125*   205*
  2.1   125*   206*
  66.2.7   124*   202*
  对照   120   197
如下在位置2处进行另外的测量。转基因植物的平均产量在正常氮条件下为232蒲式耳/英亩；在氮胁迫条件下，平均产量为203蒲式耳/英亩。在氮胁迫下，至散粉的生长度单位(growing-degree-units to pollen shed)为1273，相比之下，在正常氮条件下为1330。另外，在氮胁迫环境条件下栽培的植物显示出18天的雌雄穗开花间隔天数减少。在1至10的等级(其中10为最不好的)上，低氮环境中的不育计数为1。
实施例4.低氮籽苗测定方案
利用种子颜色标志物将转基因植物产生的种子分成转基因种子(杂合种子)和无效种子。对每一区组54盆(以6行9列布置)作两种不同的随机处理分配，对全部处理采用9次重复。在一种情况下，将相同构建体的5个事件的无效种子混合并用作对照，用于该区组中5个阳性事件的对比，从而在每个区组中构成6个处理组合。在第二种情况下，将3种转基因阳性处理和它们对应的无效处理随机分配给该区组的54个盆，从而对每一区组产生6个处理组合，含有所有处理组合的9个重复。在第一种情况下，将转基因参数与整体的构建体无效对照相比；在第二中情况下，将转基因参数与相应的事件无效对照相比。在其中构建体中有10、15或20个事件的情况下，将这些事件分配成5个事件一组，对每一区组54盆计算方差，但在进行平均值比较前将各区组的区组无效平均值汇集起来。
将每种处理的两粒种子在8英寸错列中心台上的装有TURFACE
Figure BPA00001446526500771
-MVP的4英寸见方的盆中种植，每天用含有如下营养物质的溶液浇四次水：
Figure BPA00001446526500772
出苗后，将植株稀疏至每盆一粒种子。处理植株按常规在周一栽培，在随后的周五萌发，在栽培18天后收获。收获后，从盆移取植物，将Turface从根洗掉。将根从苗分离，置于纸袋中并在70℃下干燥70小时。将干燥的植物部分(根和苗)称重并置于带有大约20个5/32英寸的钢球的50ml锥形管中，并通过在涂料振荡器中振荡进行研磨。在170℃下将大约30mg经研磨的组织(记录重量以在后面作调整)在2ml 20％H2O2和6MH2SO4中水解30分钟。冷却后，将水添加至20ml，充分混合，移出50μl的等分试样并添加至950μl 1M Na2CO3。通过将100μl该溶液置于96孔板的各个孔中然后添加50μl OPA溶液，将该溶液中的氨用于估计总还原植物氮。测定荧光(激发＝360nM/发射＝530nM)并将其与溶解于类似溶液并用OPA溶液处理的NH4Cl标准品比较。
OPA溶液-5ul巯基乙醇+1ml OPA母液(每天新鲜制备)OPA母液-溶解于1.5ml甲醇中的50mg邻苯二甲醛(OPA-Sigma#P0657)+4.4ml 1M硼酸盐缓冲液pH9.5(50ml水中3.09g H3BO4+1g NaOH)+0.55ml 20％SDS(每天新鲜制备)
使用这些数据，测量如下参数并利用Student t检验将平均值与无效对照参数平均值相比较：
总植物生物量
根生物量
苗生物量
根/苗比率
植物氮浓度
总植物氮
采用最近邻计算法以及通过采用完全随机设计(CRD)模型的方差分析，计算每个区组内的方差。通过将总体区组处理均方除以总体区组误差均方，利用F统计计算每个区组的总体处理效应。
实施例5.氮限制条件下Gaspe Bay Flint衍生的玉蜀黍品系的筛选
转基因植物将含有两或三剂量的带一剂量的GS3的Gaspe Flint-3(GS3/(Gaspe-3)2X或GS3/(Gaspe-3)3X)并将对显性转基因1∶1分离。将植物栽培于TURFACE
Figure BPA00001446526500791
(一种商业盆栽培养基)并每天用1mM KNO3生长培养基和用2mM KNO3或更高浓度的生长培养基每天浇水四次。在1mMKNO3培养基中生长的对照植物将较不绿，产生较少生物量并且在花期具有较小的穗。对结果的统计显著性进行了分析。
在与转基因无效对照相比时，转基因的表达将导致植物在1mM KNO3中具有改善的植物生长。因而将对生长期间的生物量和绿度进行监测并与转基因无效对照进行比较。花期时的生长、绿度和穗大小的改善将指示氮利用效率的增加。
实施例6.用于确定玉蜀黍的根构型的改变的测定法
测定转基因玉米植物在籽苗阶段、花期或成熟期时根构型的变化。用于测量玉蜀黍植物的根构型的改变的测定法包括但不限于下面列出的方法。为了便于对根构型改变的人工或自动测定，可将玉米植物栽培于透明盆中。
1)根质量(干重)将植物栽培于Turface
Figure BPA00001446526500792
中，Turface
Figure BPA00001446526500793
为一种便于使根容易分开的生长培养基。将烘箱干燥的苗和根组织称重并计算根/苗比率。
2)侧根分支的水平侧根分支的程度(例如，侧根数目、侧根长度)通过对完整根系进行二次采样并用平台式扫描仪或数码相机成像并用WinRHIZOTM软件(Regent Instruments Inc.)分析来测定。
3)根带宽度测量根带为随植物成熟而在温室盆的底部形成的根的带或群体。在成熟期测量根带的毫米厚度作为对根质量的粗略估计值。
4)节根计数在将根从支持培养基(例如盆栽混合物(potting mix))分离后，可测定脱离较高节位的冠根的数目。另外，可测量冠根和/或支柱根的角度。对节根和节根分支量进行的数字分析，构成对上述人工方法的另一个扩充。
将所取得的关于根表型的所有数据进行统计分析，通常是t检验，以将转基因根与非转基因姊妹植株的根进行比较。在多个事件和/或构建体参与该分析的情形中，还可使用单因素方差分析。
实施例7：植物生长的NUE测定法
将哥伦比亚生态型拟南芥(对照和转基因品系)的种子进行表面消毒(Sánchez等人，2002)，然后接种于含有0.8％(w/v)BactoTM-Agar(Difco)的Murashige和Skoog(MS)培养基上。将平皿4℃下黑暗中温育3天以打破休眠(土层保护)，随后转移至20℃下处于16小时光照/8小时黑暗周期的生长室(Conviron，Manitoba，Canada)。平均光强度为120μE/m2/s。将籽苗培育12天，然后转移至装土壤的盆。如上所述，在生长室中，将盆栽植物在各个1.5英寸盆(Arabidopsis system；Lehle Seeds，Round Rock，TX，USA)中在无营养物质的土壤LB2 Metro-Mix
Figure BPA00001446526500801
200(Scott’s Sierra Horticultural Products，Marysville，OH，USA)中培育。给植物浇注基于Murashige和Skoog(无氮MS)培养基的营养溶液中的0.6或6.5mM硝酸钾。将相对湿度保持在70％左右。16-18天后，收集植物苗评价生物量和SPAD读数。
实施例8.农杆菌介导的向玉蜀黍中的转化
可转化玉蜀黍植物来过量表达所关注的核酸序列以便检验所得的表型。
基本上如以下文献所述进行农杆菌介导的玉蜀黍转化：Zhao等人，(2006)Meth.Mol.Biol.318：315-323(另参见Zhao等人，(2001)Mol.Breed.8：323-333和1999年11月9日公布的第5,981,840号美国专利，将这些文献以引用方式并入本文中)。转化过程涉及细菌接种、共培养、静息、选择和植物再生。
1.未成熟胚制备
从颖果解剖出未成熟胚并置于含有2mL PHI-A培养基的2mL微型管中。
2.胚的农杆菌感染和共培养
2.1 感染步骤
用1mL微量移液器移除PHI-A培养基并添加1mL农杆菌悬浮液。将管轻轻地倒转进行混合。将混合物在室温下温育5分钟。
2.2 共培养步骤
用1mL微量移液器从感染步骤移除农杆菌悬浮液。使用无菌刮刀，将胚从管刮脱并转移至100×15mm培养皿中的PHI-B培养基平板。将胚以胚轴向下定向在培养基的表面上。将带有胚的平板在黑暗中20℃下培养3天。L-半胱氨酸可用于共培养阶段。对于标准双元载体，提供有100-400mg/L L-半胱氨酸的共培养培养基对回收稳定的转基因事件是关键的。
3.推定的转基因事件的选择
向100×15mm培养皿中的每个PHI-D培养基平板转移10个胚，保持取向，将培养皿用Parafilm
Figure BPA00001446526500811
密封。将各平板在黑暗中于28℃温育。活跃生长的推定事件预计在6-8周可见，为浅黄色胚性组织。不产生事件的胚可能是褐色的并且坏死，极少看到脆性组织生长。取决于生长速率，以2-3周的间隔将推定的转基因胚性组织分培至新鲜的PHI-D平板。记录事件。
4.T0植株的再生
将在100×25mm培养皿中的PHI-D培养基上繁殖的胚性组织分培至PHI-E培养基(体细胞胚成熟培养基)并在黑暗中于28℃下温育，直至体细胞胚成熟，持续约10-18天。将具有明确盾片和胚芽鞘的单独的成熟体细胞胚转移至PHI-F胚发芽培养基并在光照(约80μE，来自冷白色荧光灯或等同的荧光灯)下于28℃下温育。在7-10天后，将再生的植株(约10cm高)盆栽于园艺混合物(horticultural mix)中并用标准的园艺方法使之茁壮。
用于植物转化的培养基
1.PHI-A：4g/L CHU基础盐，1.0mL/L 1000X Eriksson′s维生素混合物，0.5mg/L盐酸硫胺，1.5mg/L 2，4-D，0.69g/L L-脯氨酸，68.5g/L蔗糖，36g/L葡萄糖，pH 5.2。在使用前添加100μM乙酰丁香酮，过滤灭菌。
2.PHI-B：无葡萄糖的PHI-A，2，4-D增加至2mg/L，蔗糖减少至30g/L并补充有0.85mg/L硝酸银(过滤灭菌)、3.0g/L Gelrite
Figure BPA00001446526500812
、100μM乙酰丁香酮(过滤灭菌)，pH 5.8。
3.PHI-C：无Gelrite
Figure BPA00001446526500813
和乙酰丁香酮的PHI-B，2，4-D减少至1.5mg/L并补充有8.0g/L琼脂、0.5g/L Ms-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液、100mg/L羧苄青霉素(过滤灭菌)。
4.PHI-D：补充有3mg/L双丙氨膦(过滤灭菌)的PHI-C。
5.PHI-E：4.3g/L的Murashige和Skoog(MS)盐(Gibco，BRL 11117-074)，0.5mg/L烟酸、0.1mg/L盐酸硫胺、0.5mg/L盐酸吡哆辛、2.0mg/L甘氨酸、0.1g/L肌醇、0.5mg/L玉米素(Sigma，目录号为Z-0164)、1mg/L吲哚乙酸(IAA)、26.4μg/L脱落酸(ABA)、60g/L蔗糖、3mg/L双丙氨膦(过滤灭菌)、100mg/L羧苄青霉素(过滤灭菌)、8g/L琼脂，pH 5.6。
6.PHI-F：无玉米素、IAA、ABA的PHI-E；蔗糖减少至40g/L；用1.5g/L Gelrite代替琼脂；pH 5.6。
可通过首先将组织簇转移至补充有0.2mg/L 2，4-D的N6培养基来从转基因愈伤组织再生植株。两周后，可将组织转移至再生培养基(Fromm等人，(1990)Bio/Technology 8：833-839)。
可进行对转基因T0植株和T1植株的表型分析。
可分析T1植株的表型变化。使用图象分析，可在植物生长期间多次分析T1植株在植株面积、体积、生长速率和颜色分析方面的表型变化。可如本文所述测定根构型的改变。
可进行对农学特性的改变的后续分析，以确定含有所关注的核酸的植物在与未进行这种转化的对照(参比)植物比较时是否具有至少一种农学特性的改善。还可在各种环境条件下研究这些改变。
导致根和/或苗生物量显著改变、绿色改善、花期较大穗或较高产量的含有所关注核酸序列的表达构建体，将被视为该所关注核酸序列在玉蜀黍中起到改变氮利用效率的作用的证据。
实施例9.根瘤农杆菌LBA4404的电穿孔
将电穿孔感受态细胞(40μl)，如根瘤农杆菌LBA4404(含有PHP10523)，在冰上解冻(20-30分钟)。PHP10523含有用于T-DNA转移的VIR基因、农杆菌低拷贝数质粒复制起点、四环素抗性基因和用于体内DNA生物分子重组的cos位点。同时，将电穿孔小槽在冰上冷冻。将电穿孔仪设置调整为2.1kV。
将DNA等分试样(0.5μL JT(US 7,087,812)亲本DNA，在低盐缓冲液或双蒸水中浓度为0.2μg-1.0μg)与解冻的农杆菌细胞混合，同时仍在冰上。将混合物转移至电穿孔小槽的底部并静止保持于冰上1-2分钟。通过按下“Pulse”键两次(理想的是实现4.0毫秒的脉冲)对细胞进行电穿孔(Eppendorf电穿孔仪2510)。随后将0.5ml 2xYT培养基(或SOC培养基)添加至小槽并转移至15ml Falcon管。将细胞在28-30℃、200-250rpm下温育3小时。
将250μl等分试样铺展于#30B(YM+50μg/mL壮观霉素)板上并在28-30℃下温育3天。为了增加转化体的数目，可进行如下两个任选步骤中的一个：
选项1：用30μl 15mg/ml利福平覆盖平板。LBA4404具有针对利福平的染色体抗性基因。这个额外的选择消除了当使用较差的LBA4404感受态细胞制备物时所观察到的某些污染性菌落。
选项2：进行两次重复电穿孔以补偿较差的电感受态细胞。
转化体的鉴别：
挑选四个独立菌落并划线接种于AB基本培养基加50mg/mL壮观霉素平板(#12S培养基)以分离单一菌落。将平板在28℃下温育2-3天。
对每一推定的共整合子挑选单个菌落并接种4ml具有50mg/l壮观霉素的#60A。将混合物在振荡下于28℃温育24小时。用Qiagen Miniprep从4ml培养物分离质粒DNA，任选用PB洗涤。将DNA在30μl中洗脱。按照上述将2μl等分试样用于电穿孔20μl DH10b+20μl dd H2O。
任选地，可将15μl等分试样用于转化75-100μl InvitrogenTM LibraryEfficiency DH5α。将细胞铺展于LB培养基加50mg/mL壮观霉素平板(#34T培养基)上，并在37℃下温育过夜。
对每种推定的共整合子挑选三至四个独立的菌落并接种4ml具有50μg/ml壮观霉素的2xYT(#60A)。将细胞在振荡下在37℃下温育过夜。
用QIAprep
Figure BPA00001446526500831
Miniprep从4ml培养物分离质粒DNA，任选进行PB洗涤(在50μl中洗脱)，并将8μl用于SalI消化(将JT亲本和PHP10523用作对照)。
对代表2种具有正确Sall消化模式(使用亲本DNA和PHP10523作为对照)的推定共整合子的4个质粒，使用限制性内切酶BamHI、EcoRI和HindIII再进行三次消化。为了比较，建议电子凝胶(electronic gel)。
实施例10.用于玉蜀黍转化的粒子介导轰击
可通过粒子轰击将载体转化进胚发生玉蜀黍愈伤组织，总体上如Tomes等人，Plant Cell，Tissue and Organ Culture：Fundamental Methods，Gamborg和Phillips(编辑)，第8章，第197-213页(1995)所描述以及如下所简述。可通过用缔合DNA质粒的钨粒子轰击胚发生响应性未成熟胚来产生转基因玉蜀黍植株。质粒通常包含选择性标志物和未经选择的结构基因、或选择性标志物和ACC合酶多核苷酸序列或亚序列等，或者由选择性标志物和未经选择的结构基因、或选择性标志物和ACC合酶多核苷酸序列或亚序列等组成。
粒子的制备
将15mg钨粒子(General Electric)，0.5至1.8μ，优选1至1.8μ，最优选1μ，添加至2ml浓硝酸。将这个悬浮液在0℃下超声处理20分钟(450型Branson Sonifier，40％输出功率，恒定负载循环)。通过以10000rpm离心(Biofuge)将钨粒子沉淀一分钟，移除上清液。将两毫升无菌蒸馏水添加至沉淀物，简单进行超声处理以使粒子再次悬浮。使该悬浮液沉淀，将一毫升无水乙醇添加至该沉淀物并简单进行超声处理以使粒子再次悬浮。用无菌蒸馏水再对粒子进行冲洗、离心沉淀并再悬浮两次，最后将粒子再悬浮于两毫升无菌蒸馏水中。将粒子细分成250μl等分试样并冷冻保存。
粒子-质粒DNA缔合物的制备
将钨粒子的原液在水浴超声波仪(450型Branson Sonifier，20％输出功率，恒定负载循环)中简单进行超声处理，然后将50μl转移至微量离心管。载体通常是同域的(cis)：即选择性标志物和所关注的基因(或其他多核苷酸序列)处于同一质粒上。
将质粒DNA添加至所述粒子，最终的DNA量为0.1至10μg，总体积为10μL，简单进行超声处理。优选地，将10μg(TE缓冲液中1μg/μL)总DNA用来混合DNA和粒子以进行轰击。添加五十微升(50μL)2.5M CaCl2无菌水溶液，将混合物短暂超声处理并涡旋。添加二十微升(20μL)0.1M亚精胺无菌水溶液，将混合物短暂超声处理并涡旋。将混合物在室温下温育20分钟，伴随间歇的短暂超声处理。将粒子悬浮液离心并移除上清液。将二百五十微升(250μL)无水乙醇添加至所得沉淀物，然后短暂超声处理。将悬浮液离心沉淀，移除上清液并添加60μl无水乙醇。将悬浮液短暂超声处理，然后将粒子-DNA附聚物加载至巨载体(macrocarrier)上。
组织的制备
玉蜀黍的未成熟胚为粒子轰击介导的转化的靶标。将来自F1植株的穗自交或同胞杂交(sibbed)，并在盾片开始变得不透明时将胚从发育中的颖果无菌解剖出来。这个阶段在授粉后约9-13天，最通常授粉后约10天发生，这取决于生长条件。胚长约0.75至1.5厘米。用2050％Clorox对穗进行表面消毒30分钟，然后用无菌蒸馏水冲洗三次。
在胚发生诱导培养基上以盾片取向朝上培养未成熟胚，该培养基包含N6基础盐、Eriksson维生素、0.5mg/l盐酸硫胺、30g/ml蔗糖、2.88g/ml L-脯氨酸、1mg/l 2，4-二氯苯氧乙酸、2g/ml Gelrite
Figure BPA00001446526500852
和8.5mg/l AgNO3。Chu等人，(1975)Sci.Sin.18：659；Eriksson，(1965)Physiol.Plant 18：976。将该培养基通过在121℃下高压灭菌15分钟进行灭菌，然后分配进100×25mm培养皿中。将AgNO3过滤灭菌并添加至高压灭菌后的培养基。将组织在28℃下在完全黑暗中培养。约3至7天，最通常约4天后，胚的盾片膨胀至其初始大小的两倍，盾片的胚根鞘表面的隆起指示胚发生组织的开始。最高达100％的胚显示出这个响应，但最通常是，胚发生响应频率为约80％。
当观察到胚发生响应时，将胚转移至由经改进而含有120g/ml蔗糖的诱导培养基构成的培养基。将胚定向，使胚根鞘轴(胚发生响应组织)从培养基朝上。每个培养皿有十个胚放置在培养皿中央直径约2cm的区域中。就在用与含有选择性和非选择性标志物基因的质粒DNA缔合的粒子轰击之前，将胚在28℃下在完全黑暗中保持在这个培养基上3至16小时，优选4小时。
为了实现对胚的粒子轰击，用DuPont PDS-1000粒子加速装置加速所述粒子-DNA附聚物。将粒子-DNA附聚物进行短暂超声处理，将10μl沉积于聚载体上，让乙醇蒸发。通过使聚合物隔膜(可裂膜圆片(rupture disk))破裂将聚载体加速至不锈钢阻挡屏上。通过加压氦气实现破裂。根据可裂膜圆片破裂压力确定粒子-DNA加速的速度。使用200至1800psi的可裂膜圆片压力，650至1100psi是优选的，约900psi是最高度优选的。将多个圆片用于实现一系列破裂压力。
将装有带胚的平板的搁架放置在巨载体平台的底部下面5.1cm(3号搁架)。为了实现对培养的未成熟胚的粒子轰击，将可裂膜圆片和具有干燥的粒子-DNA附聚物的巨载体安装于该装置中。将传递至该装置的氦气压力调节至比可裂膜圆片破裂压力高200psi。将带靶标胚的培养皿放置进真空室内，并定位在加速粒子的弹射途径中。在该室中产生真空，优选约28英寸汞柱。在操作该装置后，释放真空，移出培养皿。
在轰击过程中以及随后的1至4天，使受轰击的胚保持在渗透压调节培养基上。将胚转移至选择培养基，该选择培养基由如下组分构成：N6基础盐、Eriksson维生素、0.5mg/l盐酸硫胺、30g/ml蔗糖、1mg/l 2，4-二氯苯氧乙酸、2g/ml Gelrite
Figure BPA00001446526500861
、0.85mg/l Ag NO3和3mg/l双丙氨膦(Herbiace，Meiji)。双丙氨膦是过滤灭菌添加。以10至14天的间隔将胚分培至新鲜的选择培养基。约7周后，推定转化了选择性和非选择性标志物基因两者的胚胎发生组织从一部分经轰击的胚增殖出来。救援推定的转基因组织，源于各单独胚的组织被视为事件并使其在选择培养基上独立地繁殖。通过视觉选择组织化的(organized)胚发生组织的最小连续片段来实现两个克隆繁殖周期。
处理来自每个事件的组织样品以回收DNA。将DNA用限制性内切核酸酶进行限制性酶切并用引物序列探测，所述引物序列设计用于扩增重叠质粒的ACC合酶和非ACC合酶部分的DNA序列。将具有可扩增序列的胚发生组织增进(advance)至植物再生。
为了再生转基因植物，将胚发生组织分培至100×25mm培养皿中的包含MS盐和维生素(Murashige和Skoog，(1962)Physiol.Plant 15：473)、100mg/l肌醇、60g/ml蔗糖、3g/ml Gelrite
Figure BPA00001446526500862
、0.5mg/l玉米素、1mg/l吲哚-3-乙酸、26.4ng/l顺式-反式-脱落酸和3mg/l双丙氨膦的培养基，于28℃下在黑暗中温育直至见到良好成形的、成熟的体细胞胚的发育。这要求约14天。良好成形的体细胞胚是不透明的且为奶油色的，由可辨认的盾片和胚芽鞘构成。将各胚分别分培至100×25mm培养皿中的包含MS盐和维生素、100mg/l肌醇、40g/ml蔗糖和1.5g/ml Gelrite
Figure BPA00001446526500863
的发芽培养基，并在16小时光照∶8小时黑暗光周期和40meinsteinsm-2sec-1(来自冷白色荧光管)下温育。约7天后，体细胞胚发芽并产生轮廓分明的苗和根。将各单独植株分培至125×25mm玻璃管中的发芽培养基以让植株进一步发育。将植物维持在16小时光照∶8小时黑暗光周期和40meinsteinsm-2sec-1(来自冷白色荧光管)下。约7天后，植株良好确立，将其移植至园艺土壤使其茁壮并盆栽至商业温室土壤混合物中，在温室中栽培至性成熟。将优良近交系用作雄株以给再生的转基因植株授粉。
实施例11：大豆胚转化
如下用质粒轰击大豆胚，该质粒包含可操作连接至异源核苷酸序列的优选启动子，该异源核苷酸序列包含ACC合酶多核苷酸序列或亚序列(例如SEQ ID NO：1和2)。为了诱导体细胞胚，从大豆栽培种A2872的经表面消毒的未成熟种子解剖出长35mm的子叶，然后将其在适当的琼脂糖培养基上于26℃在光照或黑暗中培养六至十周。然后切取产生次级胚的体细胞胚并置于合适的液体培养基中。在重复选择增殖为早期球形期胚的体细胞胚簇后，如下所述维持悬浮液。
可将大豆胚发生悬浮培养物维持在26℃下旋转振荡器(150rpm)上的35ml液体培养基中，使用16∶8小时白天/黑夜时间安排的荧光光照。通过将大约35mg组织接种进35ml液体培养基中，每两周对培养物进行分培。
可然后通过粒子枪轰击方法(Klein等人，(1987)Nature(London)327：70-73、第4,945,050号美国专利)转化大豆胚发生悬浮培养物。可将DuPont BiolisticTM PDS1000/HE仪(氦气改型)用于这些转化。
可用于促进大豆转化的选择性标志物基因，是由来自花椰菜花叶病毒的35S启动子(Odell等人，(1985)Nature 313：810-812)、来自质粒pJR225(来自大肠杆菌；Gritz等人，(1983)Gene 25：179-188)的潮霉素磷酸转移酶基因和来自根瘤农杆菌的Ti质粒的T-DNA的胭脂氨酸合酶基因的3′区所组成的转基因。包含优选的启动子和异源ACC合酶多核苷酸的所关注表达盒，可作为限制性酶切片段分离。然后可将这个片段插入携带标志物基因的载体的独特限制性酶切位点中。
向50μl 60mg/ml 1μm金粒子悬浮液添加(按次序)：5μl DNA(1μg/μl)、20μl亚精胺(0.1M)和50μl CaCl2(2.5M)。然后将粒子制备物搅动三分钟，在微量离心机中离心10秒，移除上清液。然后将DNA包被的粒子在400μl 70％乙醇中洗涤一次并再悬浮于40μl无水乙醇中。可将DNA/粒子悬浮液超声处理三次，每次1秒。然后将五微升DNA包被的金粒子加载至每个巨载体盘上。
将大约300 400mg两周龄悬浮培养物置于空的60×5mm培养皿中，用移液管将残余液体从组织移除。对于每次转化实验，通常轰击大约5-10个组织平板。将膜破裂压力设定为1100psi，将室抽至28英寸汞柱的真空。将组织距离阻滞屏(retaining screen)大约3.5英寸放置，轰击三次。轰击后，可将组织一分为二并放回进液体中，如上所述进行培养。
轰击后五至七天，可将液体培养基与新鲜培养基交换，轰击后七至十二天与含有50mg/ml潮霉素的新鲜培养基交换。可每周更新这个选择培养基。轰击后七至八周，可观察到绿色的转化组织从未转化的坏死的胚发生簇长出来。移出分离的绿色组织并接种进单独的烧瓶中以产生新的、克隆繁殖的、转化的胚发生悬浮培养物。可将每一新品系当作独立的转化事件。然后可将这些悬浮液分培，并作为未成熟胚簇维持或者通过使各单独体细胞胚成熟和发芽而再生成完整植株。
实施例12.cDNA文库的组成；cDNA克隆的分离和测序
通过许多可用的方法中的任何一种，制备了代表来自美人蕉(Cannaedulis)、苦瓜(Momordica charantia)、芸苔属(芥菜)、瓜尔豆(Cyamopsistetragonoloba)、玉蜀黍(Zea mays)、水稻(Oryza sativa)、大豆(Glycinemax)、向日葵(Helianthus annuus)和小麦(Triticum aestivum)的多个组织的mRNA的cDNA文库。例如，可通过首先根据制造商规程(Stratagene CloningSystems，La Jolla，CA)在Uni-ZAPTM XR载体中制备cDNA文库来将cDNA引入质粒载体中。
利用改良的转座规程产生全长插入序列(FIS)数据。从存档的甘油原种(stock)将针对FIS鉴定出的克隆作为单一菌落回收，通过碱性裂解分离质粒DNA。使分离的DNA模板与载体引导的M13正向寡核苷酸和反向寡核苷酸在基于PCR的测序反应中反应并上样至自动测序仪上。克隆身份的确认通过与从中作出FIS请求的初始EST序列进行序列比对来进行。
通过Primer Island转座试剂盒(PE Applied Biosystems，Foster City，CA)对确认的模板进行转座，该试剂盒是基于酿酒酵母Ty1转座元件(Devine和Boeke，(1994)Nucleic Acids Res.22：3765-3772)。该体外转座系统在整个一群大DNA分子中随机地设置独特的结合位点。从每一转座反应随机选择多个亚克隆，通过碱性裂解制备质粒DNA并利用对转座子内的结合位点有特异性的独特引物从转座事件位点向外对模板进行测序(ABI Prism dye-terminator ReadyReaction混合物)。
收集序列数据(ABI Prism Collections)并用Phred和Phrap进行组装(Ewing等人，(1998)Genome Res.8：175-185；Ewing和Green，(1998)Genome Res.8：186-194)。使用商业试剂盒并按照制造商规程将所得的DNA片段连接进pBluescript载体中。这个试剂盒选自可从若干厂商获得的许多试剂盒，这些厂商包括InvitrogenTM(Carlsbad，CA)、Promega Biotech(Madison，WI)和Gibco-BRL(Gaithersburg，MD)。通过碱性裂解方法分离质粒DNA并提交用于测序和用Phred/Phrap进行组装，如上所述。
实施例13.cDNA克隆的鉴别
通过针对与包含在BLAST“nr”数据库(包含所有非冗余的GenBankCDS翻译、源于三维结构Brookhaven Protein Data Bank、SWISS-PROT蛋白质序列数据库的最新主要发布版本、EMBL和DDBJ数据库的序列)中的序列的相似性进行BLAST(Basic Local Alignment Search Tool；Altschul等人，(1993)J.Mol.Biol.215：403-410；另参见美国国立卫生研究院(Medicineof the National Institutes of Health)国立医学图书馆(National Library ofMedicine)的国立生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)的万维网上的BLAST算法的解释)搜索，来鉴别编码ACC合酶样多肽的cDNA克隆。使用由美国国立生物技术信息中心(NCBI)提供的BLASTN算法分析如实施例11中所述获得的cDNA序列与包含在“nr”数据库中的所有可公开获得的DNA序列的相似性。将DNA序列在所有阅读框中翻译并使用由NCBI提供的BLASTX算法(Gish和States，(1993)Nat.Genet.3：266-272)将其与包含在“nr”数据库中的所有可公开获得的蛋白质序列比较相似性。为方便起见，通过BLAST计算观察到仅因为偶然原因cDNA序列与包含在所搜索数据库中的序列匹配的P值(概率))在本文中报道为“pLog”值，该值表示所报道的P值的对数的负数。因此，pLog值越大，cDNA序列和BLAST“命中序列”代表同源蛋白质的可能性就越高。
如上所述将提交进行分析的EST与Genbank数据库进行比较。含有更靠近5′端或3′端的序列的EST可通过使用BLASTn算法(Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402)针对Du Pont专有数据库，比较具有共同的或重叠的序列同源区的核苷酸序列而找到。当两个或更多个核酸片段之间存在共同的或重叠的序列时，可将这些序列组装成单条连续的核苷酸序列，因而在5′或3′方向延伸了初始片段。一旦鉴别了大多数5′EST，可通过全插入测序(Full Insert Sequencing)确定其完整的序列。属于不同物种的同源基因可通过使用tBLASTn算法将已知基因(来自专有来源或公开数据库)的氨基酸序列对EST数据库进行比较来找到。tBLASTn算法针对在全部6个阅读框中翻译的核苷酸数据库搜索氨基酸查询。这个搜索考虑到不同物种之间的核苷酸密码子用法的不同和密码子简并性。
实施例14.植物表达载体的制备
可将用本领域技术人员已知的方法获得的PCR产物与Gateway
Figure BPA00001446526500901
供体载体如pDONRTM/Zeo(InvitrogenTM)组合。采用InvitrogenTM Gateway
Figure BPA00001446526500902
ClonaseTM技术，同源基因可然后转移至合适的目的载体而获得用于拟南芥和玉米的植物表达载体。
实施例15.ACC合酶序列的变体
A.不改变所编码的氨基酸序列的ACC合酶蛋白的变体核苷酸序列
将ACC合酶核苷酸序列用于产生变体核苷酸序列，在与相应SEQ IDNO的起始的未改变的开放阅读框核苷酸序列比较时，该变体核苷酸序列的开放阅读框的核苷酸序列具有约70％、75％、80％、85％、90％和95％的核苷酸序列同一性。用标准密码子表产生这些功能变体。虽然变体的核苷酸序列被改变，但由开放阅读框所编码的氨基酸序列没有变化。
B.ACC合酶多肽的变体氨基酸序列
产生ACC合酶多肽的变体氨基酸序列。在这个实施例中，变更一个氨基酸。具体而言，观察开放阅读框以确定适当的氨基酸变更。通过考虑蛋白质比对(与其他直系同源物或来自各种物种的其他基因家族成员的比对)来选择氨基酸进行改变。选择据认为不处于高选择压力下(不是高度保守的)和相当易于用具有类似化学性质(即，类似功能性侧链)的氨基酸置换的氨基酸。利用蛋白质比对，可以改变适当的氨基酸。一旦鉴别出目标氨基酸，就随后进行如下C部分中所述的程序。使用这个方法产生出具有约70％、75％、80％、85％、90％和95％核酸序列同一性的变体。
C.ACC合酶多肽的另外的变体氨基酸序列
在这个实例中，产生出相对于参比蛋白质序列而言具有80％、85％、90％和95％同一性的人工蛋白质序列。这后一尝试要求从比对鉴别保守区和可变区，然后明智地应用氨基酸置换表。这些部分将在下文中作更详细的讨论。
主要地，根据ACC合酶蛋白之间或其他ACC合酶多肽之间的保守区作出哪些氨基酸序列要进行改变的决定。应认识到，可在以下保守区域中作出保守置换而又不改变功能。另外，技术人员将理解，本发明的ACC合酶序列的功能性变体可在保守结构域中具有微小的非保守氨基酸变更。
然后产生出与原始蛋白质序列相差在80-85％、85-90％、90-95％和95-100％同一性范围内的人工蛋白质序列。目标定在这些范围的中点，正负偏差近似幅度例如为1％。氨基酸置换将通过定制的Perl脚本来实现。置换表在下表3中提供。
表3.置换表
  氨基酸   强相似的和最佳的置换   改变顺序排列   注释
  I   L，V   1   50∶50置换
  L   I，V   2   50∶50置换
  V   I，L   3   50∶50置换
  A   G   4
  G   A   5
  D   E   6
  E   D   7
  W   Y   8
  Y   W   9
  S   T   10
  T   S   11
  K   R   12
  R   K   13
  N   Q   14
  Q   N   15
  F   Y   16
  M   L   17   第一个甲硫氨酸不能改变
  H   Na   无好的置换物
  C   Na   无好的置换物
  P   Na   无好的置换物
首先，鉴定出蛋白质中不应改变的任何保守氨基酸并“作上记号”以隔离开来不作置换。起始甲硫氨酸当然将自动被加到这个名单。接着，作出改变。
H、C和P在任何情况下都不改变。该改变将首先以异亮氨酸开始，从N端扫描至C端。然后是亮氨酸，如此按列表往下直至达到所需的目标。可作出中数置换(interim number substitution)，以便不造成改变的逆转。名单的顺序是1-17，因此按需以尽可能多的异亮氨酸变化开始，然后是亮氨酸，一直到甲硫氨酸。显然，按此方式，许多氨基酸将不需要改变。L、I和V将涉及两个交替的最佳置换的50∶50置换。
将变体氨基酸序列作为输出写出。用Perl脚本计算同一性百分数。使用这个程序，产生出与SEQ ID NO：1、2或3的起始未改变的开放阅读框核苷酸序列具有约80％、85％、90％和95％氨基酸同一性的ACC合酶多肽的变体。
实施例16.来自Genbank的ACS序列
以下为可用于根据本发明的各种作物物种的可从Genbank公开获得的ACS基因的例子。
表4.
  作物  Genbank登录号  SEQ ID NO
  拟南芥属  NM_116016-ACS1  16
  拟南芥属  NM_100030-ACS2  17
  拟南芥属  NM_179241-ACS2  18
  拟南芥属  AF334719-ACS2  19
  拟南芥属  NM_122719-ACS-3  20
  拟南芥属  NM_127846-ACS4  21
  拟南芥属  AF332404-ACS4  22
  拟南芥属  AK229087-ACS5  23
  拟南芥属  AF334720-ACS5  24
  拟南芥属  NM_125977-ACS5  25
  拟南芥属  NM_117199-ACS6  26
  拟南芥属  NM_118753-ACS7  27
  拟南芥属  NM_119939-ACS8  28
  拟南芥属  AF334712-ACS8  29
  拟南芥属  AF332391-ACS9  30
  拟南芥属  NM_104974-ACS10  31
  拟南芥属   NM_116873-ACS11   32
  水稻   Z27244-ACC合酶   33
  水稻   Z27243-ACC合酶   34
  水稻   Z27242-ACC合酶   35
  水稻   Z27241-ACC合酶   36
  水稻   U65704-ACS5   37
  水稻   U65703-ACS4   38
  水稻   U65702-ACS3   39
  水稻   U65701-ACS2   40
  水稻   M96673-(ACC1合酶)   41
  水稻   M96672-(ACC1合酶)   42
  大豆   EU604829-ACS   43
  大豆   X67100-ACC合酶   44
  大豆   DQ273841-ACS   45
  大豆   DQ273840-ACS   46
  马铃薯   Z27235-ACS2   47
  马铃薯   Z27234-ACS   48
  马铃薯   L20634-ACS   49
  马铃薯   U70842-ACS   50
表5.序列表概要
Figure BPA00001446526500931
Figure BPA00001446526500941
Figure BPA00001446526500951
本说明书中的所有出版物和专利申请表明了本发明所属领域的普通技能水平。所有出版物和专利申请均以引用的方式并入本文，所引用的程度就如同每个单独的出版物或专利申请被具体地和独立地指出以引用的方式并入本文一样。
借助前面的描述和随附的附图中给出的教导，本发明所属领域的技术人员将会想到本发明的许多修改形式和其他实施方案。因此，应当了解，本发明不限于所公开的特定实施方案，并旨在将修改形式和其他实施方案包括在所附权利要求的范围内。虽然本文采用了特定术语，但它们仅以一般性和描述性含义使用而不出于限制目的。
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Claims (46)

1.一种改善植物中的氮胁迫耐受性的方法，所述方法包括：
a)通过向植物引入异源多核苷酸来抑制植物中的乙烯合成，所述异源多核苷酸具有在所述异源多核苷酸表达时降低ACC合酶或ACC氧化酶的活性的手段；
b)在氮限制条件下栽培所述植物，从而所述异源多核苷酸得以表达并且与对照植物相比较所述植物展示出改善的氮胁迫耐受性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述异源多核苷酸在所述异源多核苷酸表达时降低ACC合酶的表达。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述异源多核苷酸包含选自以下的核酸：
a)包含ACC合酶核酸的核酸；
b)包含ACC合酶核酸的互补序列的至少15个连续核苷酸的核酸；以及
c)编码能够形成双链RNA并介导对ACC合酶核酸的RNA干扰的转录物的核酸，其中所述核酸包含：
i)包含ACC合酶核酸的至少21个连续核苷酸的第一核苷酸序列；和
ii)包含所述第一核苷酸序列的互补序列的第二核苷酸序列。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述异源多核苷酸包含选自以下的核苷酸序列：
a)SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6中示出的核苷酸序列，或其完全互补序列；
b)与SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列，或其完全互补序列；
c)编码SEQ ID NO：7、8或9的多肽序列的核苷酸序列或其完全互补序列；
d)编码与SEQ ID NO：7、8或9具有至少95％的同一性的多肽序列的核苷酸序列或其完全互补序列；
e)包含SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6的互补序列的至少15个连续核苷酸的核苷酸序列；以及
f)编码能够形成双链RNA并介导对ACC合酶核酸的RNA干扰的转录物的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6的至少21个连续核苷酸及其互补序列。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述植物是玉蜀黍植物。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述植物包含由具有SEQ IDNO：1、2、3、4、5或6中示出的靶序列的多核苷酸编码的mRNA，其中所述异源多核苷酸的表达抑制所述mRNA的表达。
7.根据权利要求2所述的方法，其中所述异源多核苷酸包含选自以下的核苷酸序列：
a)SEQ ID NO：2或5中示出的核苷酸序列，或其完全互补序列；
b)与SEQ ID NO：2或5具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列，或其完全互补序列；
c)编码SEQ ID NO：8的多肽序列的核苷酸序列或其完全互补序列；
d)编码与SEQ ID NO：8具有至少95％的同一性的多肽序列的核苷酸序列或其完全互补序列；
e)包含SEQ ID NO：2或5的互补序列的至少15个连续核苷酸的核苷酸序列；以及
f)编码能够形成双链RNA并介导对ACC合酶核酸的RNA干扰的转录物的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：2或5的至少21个连续核苷酸及其互补序列。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述植物是玉蜀黍植物。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述植物包含由具有SEQ IDNO：2或5中示出的靶序列的多核苷酸编码的mRNA，其中所述异源多核苷酸的表达抑制所述mRNA的表达。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述ACC合酶选自：ACC合酶2、ACC合酶6和ACC合酶7。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述较于对照植物而言改善的氮胁迫耐受性包含至少一种选自以下的表型：
a)产量增加；
b)根质量增加；
c)根长度增加；
d)叶尺寸增加；
e)穗尺寸增加；
f)种子尺寸增加；
g)胚乳尺寸增加；以及
h)抗倒伏性改善。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述异源多核苷酸可操作连接至在植物中起作用的启动子。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述在植物中起作用的启动子是组织优选启动子、组织特异性启动子或诱导型启动子。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述异源多核苷酸通过选自以下其中一种的方法导入：电穿孔、微粒轰击和农杆菌介导的转移。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物是单子叶植物。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述单子叶植物是玉蜀黍、小麦、水稻、大麦、高粱、甘蔗或黑麦。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物是双子叶植物。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述双子叶植物是大豆、卡诺拉、芸苔属植物或向日葵。
19.一种用于改善在低氮条件下的氮胁迫耐受性的方法，所述方法包括：
a)针对氮限制条件评价耕作区的环境条件；以及
b)在具有氮限制条件的耕作区栽培其至少一种ACC合酶或ACC氧化酶的活性降低的转基因种子或转基因植物。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述植物或种子用异源多核苷酸稳定转化，所述异源多核苷酸具有在所述异源多核苷酸表达时降低ACC合酶或ACC氧化酶的活性的手段。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述异源多核苷酸在所述异源多核苷酸表达时降低ACC合酶的表达。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述异源多核苷酸包含选自以下的核酸：
a)包含ACC合酶核酸的核酸；
b)包含ACC合酶核酸的互补序列的至少15个连续核苷酸的核酸；以及
c)编码能够形成双链RNA并介导对ACC合酶核酸的RNA干扰的转录物的核酸，其中所述核酸包含：
i)包含ACC合酶核酸的至少21个连续核苷酸的第一核苷酸序列；和
ii)包含所述第一核苷酸序列的互补序列的第二核苷酸序列。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述异源多核苷酸包含选自以下的核苷酸序列：
a)SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6中示出的核苷酸序列，或其完全互补序列；
b)与SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列，或其完全互补序列；
c)编码SEQ ID NO：7、8或9的多肽序列的核苷酸序列或其完全互补序列；
d)编码与SEQ ID NO：7、8或9具有至少95％的同一性的多肽序列的核苷酸序列；
e)包含SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6的互补序列的至少15个连续核苷酸的核苷酸序列；以及
f)编码能够形成双链RNA并介导对ACC合酶核酸的RNA干扰的转录物的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6的至少21个连续核苷酸及其互补序列。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述植物是玉蜀黍植物。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述植物包含由具有SEQ IDNO：1、2、3、4、5或6中示出的靶序列的多核苷酸编码的mRNA，其中所述异源多核苷酸的表达抑制所述mRNA的表达。
26.根据权利要求21所述的方法，其中所述异源多核苷酸包含选自以下的核苷酸序列：
a)SEQ ID NO：2或5中示出的核苷酸序列，或其完全互补序列；
b)与SEQ ID NO：2或5具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列，或其完全互补序列；
c)编码SEQ ID NO：8的多肽序列的核苷酸序列或其完全互补序列；
d)编码与SEQ ID NO：8具有至少95％的同一性的多肽序列的核苷酸序列；
e)包含SEQ ID NO：2或5的互补序列的至少15个连续核苷酸的核苷酸序列；以及
f)编码能够形成双链RNA并介导对ACC合酶核酸的RNA干扰的转录物的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：2或5的至少21个连续核苷酸及其互补序列。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述植物是玉蜀黍植物。
28.根据权利要求26所述的方法，其中所述植物包含由具有SEQ IDNO：2或5中示出的靶序列的多核苷酸编码的mRNA，其中所述异源多核苷酸的表达抑制所述mRNA的表达。
29.根据权利要求19所述的方法，其中所述ACC合酶选自：ACC合酶2、ACC合酶6和ACC合酶7。
30.根据权利要求19所述的方法，其中所述较于对照植物而言改善的氮胁迫耐受性包含至少一种选自以下的表型：
a)产量增加；
b)根质量增加；
c)根长度增加；
d)叶尺寸增加；
e)穗尺寸增加；
f)种子尺寸增加；
g)胚乳尺寸增加；以及
h)抗倒伏性改善。
31.根据权利要求20所述的方法，其中所述异源多核苷酸可操作连接至在植物中起作用的启动子。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述在植物中起作用的启动子是组织优选启动子、组织特异性启动子或诱导型启动子。
33.根据权利要求19所述的方法，其中所述植物是单子叶植物。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述单子叶植物是玉蜀黍、小麦、水稻、大麦、高粱、甘蔗或黑麦。
35.根据权利要求19所述的方法，其中所述植物是双子叶植物。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述双子叶植物是大豆、卡诺拉、芸苔属植物或向日葵。
37.一种表达盒，所述表达盒包含可操作连接至包含SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52中的至少一者的多核苷酸的、在植物中起作用的启动子。
38.根据权利要求37所述的表达盒，其中所述启动子是组成型启动子。
39.一种构建体，所述构建体包含选自以下的核苷酸序列：
a)SEQ ID NO：53中示出的核苷酸序列；
b)SEQ ID NO：54中示出的核苷酸序列；
c)SEQ ID NO：55中示出的核苷酸序列；
d)SEQ ID NO：56中示出的核苷酸序列；以及
e)SEQ ID NO：57中示出的核苷酸序列。
40.一种植物细胞，所述植物细胞包含被构造用于RNA沉默或干扰的异源多核苷酸，其中所述异源多核苷酸包含SEQ ID NO：51和SEQ IDNO：52中的至少一者。
41.根据权利要求40所述的植物细胞，其中所述异源多核苷酸可操作连接至在植物中起作用的启动子。
42.根据权利要求40所述的植物细胞，其中所述异源多核苷酸具有选自以下的核苷酸序列：
a)SEQ ID NO：53中示出的核苷酸序列；
b)SEQ ID NO：54中示出的核苷酸序列；
c)SEQ ID NO：55中示出的核苷酸序列；
d)SEQ ID NO：56中示出的核苷酸序列；以及
e)SEQ ID NO：57中示出的核苷酸序列。
43.根据权利要求40所述的植物细胞，其中所述植物细胞来自双子叶植物或单子叶植物。
44.根据权利要求43所述的植物细胞，其中所述双子叶植物或单子叶植物是玉米、小麦、水稻、高粱、大麦、燕麦、草坪草、黑麦、大豆、甘蔗、芸苔属植物或向日葵。
45.一种植物，所述植物从根据权利要求40所述的植物细胞再生而来。
46.一种抑制植物中的乙烯产生的方法，所述方法包括通过向所述植物引入异源多核苷酸来抑制所述植物中的一种或多种ACC合酶基因的表达，所述异源多核苷酸具有选自以下的核苷酸序列：
a)SEQ ID NO：51中示出的核苷酸序列；
b)SEQ ID NO：52中示出的核苷酸序列；
c)SEQ ID NO：53中示出的核苷酸序列；
d)SEQ ID NO：54中示出的核苷酸序列；
e)SEQ ID NO：55中示出的核苷酸序列；
f)SEQ ID NO：56中示出的核苷酸序列；
g)SEQ ID NO：57中示出的核苷酸序列；以及
h)SEQ ID NO：51和52中示出的核苷酸序列。
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