CN102597229A - 下调acc合酶以改进植物性能 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了使用经优化的ACC合酶下调构建体来调节植物的方法。还公开了核苷酸序列、构建体、载体和经修饰的植物细胞，以及表现出种子和/或生物量产量提高、对非生物胁迫如干旱和高植物密度的耐受性改进、氮利用效率改进和/或乙烯生成降低的转基因植物。

Description

下调ACC合酶以改进植物性能
技术领域
本发明主要涉及分子生物学领域以及对影响植物的产量、非生物胁迫耐受性和氮利用效率的基因和蛋白质的表达或活性的调节。
背景技术
乙烯(C2H4)是一种气态植物激素。它具有可以是组织特异性和/或物种特异性的效应谱。例如，生理效应包括但不限于果实成熟的促进、双子叶植物物种的叶子和果实的脱落、花衰老、水生植物的茎秆伸长、根中的气空间(通气组织)发育、叶偏上性弯曲、茎和苗(shoot)膨大(往往与发育迟缓相关)、葫芦的雌化性(femaleness)、某些物种中的果实生长、黄化的苗的顶钩闭合(apical hook closure)、根毛形成、凤梨科中的开花和黄化的苗的横生。乙烯由成熟的果实自然释放，并且由大多数植物组织例如响应胁迫(例如密度、病原体攻击)以及在成熟中和衰老中的器官而产生。
乙烯是通过涉及S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM或Ado Met)向环状氨基酸1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)的转化的生物合成途径从甲硫氨酸产生的，该转化由ACC合酶促进。硫在该过程中通过循环5′-甲基硫代腺苷而得到保存。
ACC合酶是一种氨基转移酶，其通过将S-腺苷甲硫氨酸转化成ACC而催化乙烯的形成中的限速步骤。通常，该酶需要磷酸吡哆醛作为辅因子。本发明的特征包括ACC合酶序列和亚序列。
然后通过ACC氧化酶(也称为乙烯形成酶)的作用由ACC的氧化产生乙烯。ACC氧化酶是立体特异性的，并利用例如Fe+2、O2抗坏血酸盐等辅因子。ACC氧化酶的活性可被缺氧和钴离子所抑制。最终，乙烯可通过氧化被代谢成CO2或者代谢成环氧乙烷和乙二醇。
玉米(maize)ACC合酶(ACS)基因家族包括三个成员：ACS2、ACS6和ACS7。对乙烯生物合成缺陷型拟南芥属(Arabidopsis)和番茄ACC合酶突变体的鉴定和分析，已帮助确立了乙烯在植物生长和发育中所起到的重要作用。ACC合酶，乙烯生物合成途径中的第一个关键酶，在谷物发育的整个过程中起到重要的调节作用以及在调节对环境胁迫的响应方面起到主要的作用。
对于调节植物中的乙烯生成途径以操纵植物发育或胁迫响应，存在着持续的需求。本发明涉及产生新型ACC合酶下调多核苷酸构建体以调节植物中的种子和/或生物量的产量、非生物胁迫耐受性(包括密度耐受性、干旱耐受性)、氮利用效率和/或乙烯生成，包括新型多核苷酸序列、表达盒、构建体、载体、植物细胞和所产生的植物。参考以下内容，本发明的这些和其他的特征将变得显而易见。
发明内容
本发明提供用于调节植物中的产量、干旱耐受性和/或氮利用效率以及调节(例如降低)植物中的乙烯生成的方法和组合物。本发明涉及用于下调植物中的ACC合酶的水平和/或活性的组合物和方法，由例如SEQ IDNO：1和/或SEQ ID NO：2例证，包括开发特异性RNAi构建体(参见SEQID NO：3)以产生具有改进的产量和/或改进的非生物胁迫耐受性的植物，这可包括改进的干旱耐受性、改进的密度耐受性和/或改进的NUE(氮利用效率)。NUE包括在低氮调节下产量改进和在常氮调节下氮利用更具效率两方面。
因此，在一个方面，本发明涉及包含多核苷酸序列的分离核酸，其供在调节ACS表达的下调构建体如RNAi载体中使用。本发明的一个实施方案是包含SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2的核苷酸序列的分离多核苷酸，其可优化与内源RNA序列的相互作用。
在另一个方面，本发明涉及包含所描述的多核苷酸的重组下调构建体(参见SEQ ID NO：3)。下调构建体通常包含SEQ ID NO：1和/或SEQ IDNO：2的多核苷酸及与其可操作地连接的启动子。另外，所述构建体包括几个会导致通过RNAi实施方案有效下调ACS或者会促进ACS表达的调节的特征。一个这种特征是包含一个或多个FLP/FRT位点。其他特征包括在发夹结构中特异性消除外源开放阅读框，从泛素启动子的内含子消除开放阅读框，改变发夹以包括AdhI内含子，以及对构建体进行重构(reconfiguration)使得发夹盒和除草剂耐受性标志物处于串联取向。本发明还涉及含有重组表达盒的载体。此外，含有重组表达盒的载体可促进核酸在宿主细胞中的转录。本发明还涉及能够转录多核苷酸的宿主细胞。
在某些实施方案中，本发明涉及含有包括下调构建体的多核苷酸的转基因植物或植物细胞。在某些实施方案中，本发明的植物细胞来自双子叶植物或单子叶植物。优选的含有所述多核苷酸的植物包括但不限于玉米、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、番茄和小米。在某些实施方案中，转基因植物是玉米植物或植物细胞。包含所描述的转基因下调构建体的转基因种子是一个实施方案。在一个实施方案中，植物细胞在包含干旱耐受性表型和/或氮利用效率表型和/或改进的产量表型的杂种植物中。在另一个实施方案中，植物细胞在包含不育表型例如雄性不育表型的植物中。植物可包含这类表型的组合。从本发明的植物细胞再生的植物也是本发明的特征。
某些实施方案与对照植物相比具有改进的干旱耐受性。本发明植物的改进的干旱耐受性可反映例如但不限于以下各生理方面：与相应的对照植物相比，(a)至少一种ACC合酶编码mRNA的生成的下降；(b)ACC合酶的生成的下降；(c)ACC的生成的下降；(d)乙烯的生成的下降；(e)植株高度的提高或者(f)(a)-(e)的任何组合。表现出改进的干旱耐受性的植物也可表现出一种或多种另外的非生物胁迫耐受性表型，如改进的氮利用效率和提高的密度耐受性。
本发明还提供用于抑制植物中的乙烯生成的方法以及通过这种方法产生的植物。例如，一种抑制乙烯生成的方法包括抑制植物中的一个或多个ACC合酶基因的表达，其中所述一个或多个ACC合酶基因编码一个或多个ACC合酶。有多种方法和/或多种构建体可用来下调单个ACC合酶多核苷酸或多肽。多个ACC合酶多核苷酸或多肽可通过单个方法或通过多个方法来下调；在任一情况中，可采用一种或多种组合物。
用于调节植物中的干旱耐受性的方法也是本发明的特征，由这类方法产生的植物也是本发明的特征。例如，调节干旱耐受性的方法包括：(a)选择至少一种要赋予的ACC合酶基因(例如ACS6)，从而提供至少一种所需的ACC合酶基因；(b)将该至少一种所需的ACC合酶基因的突变形式(例如至少一种ACC合酶基因或其亚序列的反义或有义构型、至少一种ACC合酶基因或其亚序列的RNA沉默构型，等等)引入到植物中；(c)表达该突变形式，从而调节植物中的干旱耐受性。在某些实施方案中，该突变基因通过农杆菌介导的转移、电穿孔、微粒轰击、有性杂交等来引入。
对表达产物的检测，或者是定性地进行(通过检测一种或多种所关注产物的存在与否)，或者是定量地进行(通过监测一种或多种所关注产物的表达水平)。在一个实施方案中，表达产物为RNA表达产物。本发明的各方面任选包括监测本文所指出的核酸、多肽或化学物质(例如ACC、乙烯等)的表达水平，以监测植物或植物群体中的ACC合酶、乙烯生成、干旱耐受性等。
结合了以上所指出的核酸中的一种或多种的试剂盒，也是本发明的特征。这种试剂盒可包括以上所指出的组分中的任何一种，且进一步包括例如有关在任何本文所指出的方法中使用所述各组分的说明书、用于容纳所述各组分的包装材料和/或容器。例如，用于检测植物中的ACS表达水平的试剂盒包括至少一条包含核酸序列的多核苷酸序列，其中该核酸序列例如与SEQ ID NO：3或其亚序列或其互补序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％、约99.5％或更大的同一性。该亚序列可以是SEQ ID No.1或2。在又一个实施方案中，试剂盒包括有关使用该至少一条多核苷酸序列来调节植物中的干旱耐受性的说明性资料。
附图说明
图1提供包含发夹结构的质粒(SEQ ID NO：3)的细节。所描述的质粒的全长序列在SEQ ID NO：3中提供。泛素启动子(UBI1ZM PRO)驱动该发夹的表达，该发夹包含TR3和TR4(SEQ ID NO：1和2)。
图2显示转化的植物在季节1、环境1中在开花胁迫下的产量。每根柱条表示一单独的转化事件。示出了转基因阴性分离子的平均产量(139蒲式耳/英亩)作为对照(CN)。总计74％的事件的标称产量比对照植株高。代表18个转基因事件的植株产量超过对照，P＜0.10。
图3显示本发明的转化植物在季节1、环境2中在灌浆胁迫下的产量。每根柱条表示一单独的转化事件。示出了转基因阴性分离子的平均产量(176蒲式耳/英亩)作为对照(CN)。十三个事件产量超过CN，P＜0.10。其中，八个事件还在开花胁迫下显示出显著的改善。
图4显示本发明的转化植物(圆圈表示)以及用另选的ACS6下调载体转化的植物(正方形表示)在季节1、环境3中在灌浆胁迫下的产量，以相对于对照的百分比表示。每个数据点表示一单独的转化事件。NS＝统计学上不显著。SIG＝统计学上显著。对照植株为批量(bulked)转基因阴性分离子。可见，相对于对照而言，本发明的事件中有64％具有显著优异的产量；另选的ACS6下调事件中只有17％具有显著优异的产量。
图5显示本发明的转化植物(圆圈表示)以及用另选的ACS6下调载体转化的植物(正方形表示)在季节1、环境4中在雨养条件下的产量，以相对于对照的百分比表示。每个数据点表示一单独的转化事件。NS＝不显著。对照植株为批量(bulked)转基因阴性分离子。可以看出，所有表现出统计学上显著的产量增加的数据点代表本文所公开的本发明事件。另外，所有表现出产量的统计学上显著降低的点都是含有另选的ACS6下调载体的事件。
图6是本发明的代表性表达盒的示意图。
图7是水稻ACS6编码序列与TR4发夹截短序列(SEQ ID NO：2)的比对。
图8是玉米ACS6与水稻ACS6序列的比对。
图9显示在季节2、背景1中各事件的谷粒产量(蒲式耳/英亩)。
图10显示在季节3、背景1中各事件的谷粒产量(蒲式耳/英亩)。
图11显示在季节3、背景1中各事件的植株高度(英寸)。
图12显示在季节3、背景2和3中各事件的谷粒产量(蒲式耳/英亩)和植株高度(英寸)。
图13显示在季节4三个水处理和四个试验株系在背景2和3中各事件的谷粒产量(蒲式耳/英亩)。
图14提供ZmACS6和ZmACS3的氨基酸序列的比对。
图15提供ZmACS6和ZmACS3的编码序列的比对。
图16提供TR3(SEQ ID NO：1)与ACS3的比对。
图17显示在玉米生长阶段VT中在转基因根组织和对照根组织中四个事件的ACC水平。
图18提供定量rtPCR数据，表明转入十个ACS下调事件中的一个的转基因籽苗植株的根组织的ACS6表达降低。
具体实施方式
定义
应理解，本文所使用的术语是仅出于描述具体实施方案的目的，并不意在具有限制意义。在本说明书和所附权利要求书中使用的名词形式上为单数，但包括复数指代，除非上下文清楚地表明并非如此。因此，例如，提到“细胞”则包括两种(个)或多种(个)细胞的组合，以此类推。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的含义。除非另外提出，否则本文所采用或所考虑的技术是本领域普通技术人员所熟知的标准方法。材料、方法和实例仅为示例性的而不是限制性的。如下内容以举例说明的方式给出而无意于限制本发明的范围。
下文将参考附图及其他说明性的非限制性实施方案更完全地描述本发明。
根据本说明书和相关附图中的教导，本文提出的本发明的许多修改方案和其他实施方案落入所要求保护的发明的范围内。因此，应当了解，本发明不限于所公开的具体实施方案，并旨在将修改形式和其他实施方案包括在所附权利要求的范围内。
除非另有指明，否则本发明的实施将应用到农艺学、植物学、微生物学、组织培养、分子生物学、化学、生物化学和重组DNA技术中的常规技术，这些技术是在本领域技术范围内。
单位、前缀和符号可以它们SI接受的形式表示。除非另外指明，否则分别地，核酸以5′至3′取向从左向右书写；氨基酸序列以氨基向羧基取向从左向右书写。数值范围包括限定该范围的数字。在本文中，氨基酸可通过其通常所知的三字母符号表示，或者通过IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号表示。同样，核苷酸可通过它们通常接受的单字母密码表示。下面定义的术语通过参考本说明书整体进行更完整的定义。
在描述本发明时，将采用下面的术语，并且旨在如下文所指出的进行定义。
所谓“微生物”意指任何微生物(包括真核微生物和原核微生物)，如真菌、酵母、细菌、放线菌、藻类和原生动物以及其他单细胞结构。
所谓“扩增”意指构建核酸序列的多个拷贝或与该核酸序列互补的多个拷贝，该构建是利用所述核酸序列中的至少一者作为模板进行。扩增系统包括聚合酶链式反应(PCR)系统、连接酶链反应(LCR)系统、基于核酸序列的扩增(NASBA，Cangene，Mississauga，Ontario)、Q-β复制酶系统、基于转录的扩增系统(TAS)和链置换扩增(SDA)。参见例如Diagnostic MolecularMicrobiology：Principles and Applications，Persing等人(编辑)，AmericanSociety for Microbiology，Washington，DC(1993)。扩增的产物称为扩增子。
术语“保守修饰的变体”同时适用于氨基酸序列和核酸序列二者。就特定核酸序列而言，保守修饰的变体指编码氨基酸序列的相同的或保守修饰的变体的那些核酸。由于遗传密码的简并性，有多种功能上相同的核酸编码任何给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU全部编码丙氨酸这种氨基酸。因而，在每个由密码子规定丙氨酸的位置，可将该密码子变更为所描述的相应密码子中的任一种而不会改变所编码的多肽。这种核酸变异为“沉默变异”，代表保守修饰变异的一种。本文中编码多肽的每种核酸序列还描述了该核酸的每种可能的沉默变异。普通技术人员将认识到，可修饰核酸中的每种密码子(AUG除外，其通常为甲硫氨酸的唯一密码子；一个例外是红色微球菌(Micrococcus rubens)，对于其来说GTG是甲硫氨酸密码子(Ishizuka等人，(1993)J.Gen.Microbiol.139：425-32))以产生功能上相同的分子。因此，核酸的每种沉默变异均隐含在每种所描述的多肽序列中并以引用的方式并入本文。
至于氨基酸序列，技术人员会认识到，对核酸、肽、多肽或蛋白序列的各个单独置换、缺失或添加(其使被编码的序列中的单个氨基酸或一小部分氨基酸变更、添加或缺失)在该变更导致氨基酸被化学上相似的氨基酸置换时，为“保守修饰变体”。因此，例如，可对选自1-15如1、2、3、4、5、7或10的整数的任何数目的氨基酸残基进行如此变更。保守修饰的变体通常提供与它们所源自的未经修饰的多肽序列类似的生物活性。例如，底物特异性、酶活性或配体/受体结合通常为天然蛋白质对于其天然底物的结合的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，优选60-90％。提供功能上相似的氨基酸的保守置换表是本领域所熟知的。
下面的六个组各含有对彼此而言是保守置换的氨基酸：
1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
另参见Creighton，Proteins，W.H.Freeman and Co.(1984)。
本文所用的“基本上由组成”意指除了目标多核苷酸之外还包括另外的序列，其中所述另外的序列在严格杂交条件下不与原始目标多核苷酸杂交相同的cDNA，且其中杂交条件包括在0.1X SSC和0.1％十二烷基硫酸钠中在65℃下的洗涤步骤。通常，所述(一条或多条)另外的序列不实质上影响所要求保护的本发明的基本和新型特征，例如ACS6的下调。例如，在一个实施方案中，可将另外的序列包括在发夹结构的5’或3’末端而不实质上影响该构建体的RNA干扰功能。
术语“构建体”用来主要指多核苷酸序列的人工组合，即在自然界中不会发生的、通常包含一个或多个调节元件和一个或多个编码序列的组合。该术语可包括指表达盒和/或载体序列，视上下文而定。
“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供测量其中已针对所关注的基因实现了遗传变更(如转化)的受试植物或植物细胞的表型变化的参考点。受试植物或植物细胞可从作了如此变更的植物或细胞遗传而来，且会包含该变更。
“对照植物或植物细胞”可包括例如：(a)野生型植物或细胞，即其基因型与用于进行导致产生该受试植物或细胞的遗传变更的起始材料相同的野生型植物或细胞；(b)其基因型与该起始材料相同但已用无效构建体(即用已知对所关注性状没有作用的构建体(如包含标志基因的构建体)进行了转化的植物或植物细胞；(c)为受试植物或植物细胞的子代当中的非转化分离子的植物或植物细胞；(d)在遗传上与该受试植物或植物细胞相同但不被暴露于会引发所关注基因表达的条件或刺激的植物或植物细胞；或者(e)处于所关注基因不被表达的条件下的该受试植物或植物细胞本身。对照植物还可以是用另选的ACS6下调构建体转化的植物。
就指定的核酸而言，所谓“编码”意指包含翻译成指定蛋白质的信息。编码蛋白质的核酸可在该核酸的翻译区内包含非翻译序列(例如内含子)，或可缺少这种居间的非翻译序列(例如，如在cDNA中)。据以编码蛋白质的信息是通过使用密码子来确定的。通常，氨基酸序列由核酸利用“通用”遗传密码来编码。然而，可使用如在某些植物、动物和真菌线粒体、细菌山羊支原体(Mycoplasma capricolum)(Yamao等人，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：2306-9))或纤毛虫大核(ciliate Macronucleus)中存在的通用密码的变体，当用这些生物体表达该核酸时。
当用合成法制备或变更该核酸时，可利用要表达该核酸的预定宿主的已知的密码子偏好性。例如，尽管核酸序列在单子叶植物物种和双子叶植物物种中都可表达，但可对序列进行修饰以考虑单子叶植物或双子叶植物的特定密码子偏好性和GC含量偏好性(参见Murray等人，(1989)NucleicAcids Res.17：477-98，将其以引用的方式并入本文)。因而，具体氨基酸的玉米优选密码子可由来自玉米的已知基因序列得出。关于来自玉米植物的28种基因的玉米密码子使用在Murray等人(出处同上)的表4中列出。
所谓“开花胁迫”是指在开花期或开花期前后植物没有水分供应而出现干旱胁迫。
所谓“灌浆胁迫”是指在种子积累贮藏产物(碳水化合物、蛋白质和/或油)的时期植物没有水分供应而出现干旱胁迫。
所谓“雨养条件”是指没有故意地不供应水，也没有人工补充水。
所谓“良好浇灌条件”是指可供给植物的水通常足够以使生长最佳。
可控制玉米的干旱胁迫条件以导致所定的产量降低目标。例如，通过在植物发育的特定时期提供量好数量的水，可实现对照植物的产量下降达20％、30％、40％、50％、60％、70％或更多。
如本文所用，指涉核酸的“异源”为起源于外来物种的核酸，或者，如果起源于相同物种的话，则为通过蓄意的人为干预对其天然形式在组成和/或基因座方面进行实质性修饰的核酸。例如，可操作地连接至异源结构基因的启动子是来自不同于衍生该结构基因的物种的物种，或者如果是来自相同的物种，则对一者或二者对其初始形式进行了实质性的修饰。异源蛋白质可起源于外来物种，或者，如果起源于相同物种，则通过蓄意的人为干预对其天然形式进行了实质修饰。
所谓“宿主细胞”是指包含本发明的异源核酸序列的细胞。宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌，或者真核细胞如酵母、昆虫、植物、两栖动物或哺乳动物细胞。优选地，宿主细胞是单子叶植物或双子叶植物细胞，包括但不限于玉米、高粱、向日葵、大豆、小麦、苜蓿、水稻、棉花、卡诺拉油菜、大麦、稷、甘蔗、草坪草和番茄。特别优选的单子叶宿主细胞是玉米宿主细胞。
术语“杂交复合体”包括指由两条相互选择性杂交的单链核酸序列形成的双链核酸结构。
术语“下调”指可以是部分的或完全的下降。例如，植物或细胞中的ACS多核苷酸的下调涵盖表达下降至对照植物或细胞中相应ACS多核苷酸的表达水平的99％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或0％的一个水平。
在将核酸插入细胞的语境中，术语“引入”意指“转染”或“转化”或“转导”，包括指核酸掺入进真核或原核细胞中，其中该核酸可掺入进细胞的基因组(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中，转化成自主复制子或瞬时表达(例如，转染的mRNA)。
术语“分离的”指诸如核酸或蛋白质之类的物质，该物质实质上或基本上不含在其天然存在的环境中发现的通常与其相伴随或与其相互作用的组分。分离的物质任选包含未发现在其天然环境中与其一起的物质。本文所定义的“分离的”核酸也称为“异源”核酸。
本文所用的术语“ACC合酶活性的调节”应理解为意指ACC合酶生物活性的任何改变，这可包括植物细胞中存在的ACC合酶水平的改变、该酶效力的改变或可影响ACC合酶与其在乙烯形成过程中将S-腺苷甲硫氨酸转化为ACC的作用相关的生物学性质中的一种或多种性质的任何其他手段。因此，“ACC合酶活性的抑制”涵盖该酶的功效的下降或者例如由于ACC合酶基因表达的下降所致的植物细胞中存在的ACC合酶水平的下降。
在其他实施方案中，本文所述的下调构建体的表达可调节乙烯合成途径的其他步骤以改进植物的产量或非生物胁迫耐受性。例如，由于本文所述的遗传调节，SAM向聚胺的转化速率可被提高，或者ACC氧化酶的水平或活性可被下降，或者SAM的水平或活性可被提高，或者乙烯合成途径中的这些和/或其他修饰的某种组合可出现。尽管不希望受任何理论的约束，但假定认为对乙烯合成的一个或多个步骤的修饰可导致乙烯活性的降低。无论如何，本发明涉及通过调节ACC合酶基因的表达，来在最佳条件下提高植物产量以及在非生物胁迫条件下改进性能，而无论该调节对乙烯合成途径、乙烯生成或乙烯活性的精确效应。
术语“氮利用效率”(NUE)指氮吸收和/或同化和/或积累的氮储备随后再动员和再利用的生理过程。改进的NUE指相对于对照植物而言这些过程的增进。NUE得到改进的植物可在氮供应充足的可比条件下比对照植物具有更高的生产率，和/或可在氮供应显著降低的情况下维持生产率。改进NUE，特别是在玉米中，将提高每单位输入氮肥的可收获产量，这在氮肥供应有限的发展中国家和在氮使用水平高的发达国家都如此。改进的NUE能降低农场投入成本、减少对氮肥生产所需的非可再生能源的依赖和减低氮肥制造和农业使用的环境影响。改进的NUE可反映在一个或多个属性，如生物量提高、谷粒产量提高、收获指数提高、光合速率提高和对生物或非生物胁迫的耐受性提高。这些属性可反映或导致各种变化，包括根发育、苗和叶发育和/或繁殖组织发育的调节。所谓“调节根发育”意指在与对照植物比较时植物根的发育的任何改变。根发育的这种改变包括但不限于：初生根的生长速率、根鲜重、侧根和不定根形成的程度、维管系统、分生组织发育或径向扩张度。此外，较高的根生物量生成可反映由根细胞或转基因根细胞或所述转基因根细胞的细胞培养物所合成的化合物的生成。测量根系中的发育改变的方法是本领域知道的。参见例如第2003/0074698号美国专利申请公开和Werner等人，(2001)PNAS 18：10487-10492，将这两篇文献以引用的方式并入本文。
降低植物中的至少一种ACC合酶的活性，可改进该植物的氮胁迫耐受性。这种植物可表现出在氮肥输入显著较少的情况下生产率维持，和/或表现出氮肥吸收和同化增强，和/或表现出积累的氮储备的再动员和再利用改变，或者表现出这类特性的任何组合。除了产量的全面提高之外，通过抑制ACC合酶改进氮胁迫耐受性还可导致根生物量和/或长度提高，穗、叶、种子和/或胚乳大小提高，和/或抗倒伏性改进。因此，在一些实施方案中，所述方法还包括在氮限制条件下栽培所述植物，并任选选择表现出对低氮水平有较大耐受性的那些植物。
此外，提供了用以改进非生物胁迫下的产量的方法和组合物，其包括评估耕作区域的环境条件确定非生物胁迫因素(例如土壤中氮水平低)，并在胁迫环境中种植乙烯合成减低的植物，该乙烯合成减低在一些实施方案中是由于至少一种ACC合酶的活性减低所致。
本文所用的术语“低氮条件”或“氮限制条件”应理解为意指任何其中植物可利用的氮比对于最大产量潜能的表达而言将为最佳的量低的环境条件。
如本文所用，“核酸”包括指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另外限制，否则涵盖在以下方面具有天然核苷酸的基本性质的已知类似物：其以与天然存在的核苷酸(例如肽核酸)相似的方式杂交至单链核酸。
所谓“核酸文库”是指包含和实质上代表指定生物体的基因组的整个转录部分的分离DNA或RNA分子的集合。示例性的核酸文库如基因组文库和cDNA文库的构建在标准的分子生物学参考书有教导，如Berger和Kimmel，(1987)Guide To Molecular Cloning Techniques、系列书籍Methodsin Enzymology，vol.152，Academic Press，Inc.，San Diego，CA；Sambrook等人，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，第1-3卷，以及Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等人编辑，CurrentProtocols，Greene Publishing Associates，Inc.和John Wiley & Sons，Inc.之间合作(1994年补编)。
本文所用的“可操作地连接”包括指第一序列如启动子和第二序列之间的功能连接，其中该启动子序列引发和介导该第二序列的转录。一般来讲，可操作地连接意指被连接的核酸序列是连续的，并且如果有必要连接两个蛋白质编码区的话，是连续的且在相同的阅读框内。
如本文所用，术语“植物”包括指整个植株、植物器官(例如叶、茎、根等)、种子和植物细胞和它们的子代。本文所用的植物细胞包括但不限于存在于或来自种子、悬浮培养物、胚、分生组织区、愈伤组织、叶、根、苗、配子体、孢子体、花粉和小孢子的细胞。可用于本发明方法的植物类型通常与适用于转化技术的高等植物类型一样宽泛，包括单子叶植物和双子叶植物，包括来自如下属的种：南瓜属(Cucurbita)、玫瑰属(Rosa)、葡萄属(Vitis)、胡桃属(Juglans)、草莓属(Fragaria)、百脉根属(Lotus)、苜蓿属(Medicago)、驴食草属(Onobrychis)、三叶草属(Trifolium)、胡芦巴属(Trigonella)、豇豆属(Vigna)、柑桔属(Citrus)、亚麻属(Linum)、老鹳草属(Geranium)、木薯属(Manihot)、胡罗卜属(Daucus)、拟南芥属(Arabidopsis)、芸苔属(Brassica)、萝卡属(Raphanus)、白芥属(Sinapis)、颠茄属(Atropa)、辣椒属(Capsicum)、曼陀罗属(Datura)、天仙子属(Hyoscyamus)、番茄属(Lycopersicon)、烟草属(Nicotiana)、茄属(Solanum)、碧冬茄属(Petunia)、毛地黄属(Digitalis)、Majorana、菊苣属(Ciahorium)、向日葵属(Helianthus)、莴苣属(Lactuca)、雀麦属(Bromus)、天门冬属(Asparagus)、金鱼草属(Antirrhinum)、萱草属(Heterocallis)、Nemesis、天竺葵属(Pelargonium)、黍属(Panieum)、狼尾草属(Pennisetum)、毛茛属(Ranunculus)、千里光属(Senecio)、蛾蝶花属(Salpiglossis)、黄瓜属(Cucumis)、布洛华丽属(Browaalia)、大豆属(Glycine)、豌豆属(Pisum)、菜豆属(Phaseolus)、黑麦草属(Lolium)、稻属(Oryza)、燕麦属(Avena)、大麦属(Hordeum)、黑麦属(Secale)、葱属(Allium)和小麦属(Triticum)。特别优选的植物是玉米(Zea mays)。
本文所用的“产量”可包括指收获时每英亩谷类作物的蒲式耳数目(针对谷粒水分进行了调整，例如玉米的水分通常为15％)，和指所产生的生物量的体积(例如，对于草料作物如苜蓿、青贮用玉米和为了生产生物柴油而种植的任何物种而言)。生物量测量为所产生的可收获植物材料的重量。
本文所用的“多核苷酸”包括指具有天然核苷酸的必要性质的脱氧核糖多核苷酸、核糖多核苷酸或其类似物，它们具有该必要性质是因为它们能在严格杂交条件下杂交至与天然核苷酸所杂交的核苷酸序列基本上相同的核苷酸序列，和/或容许翻译成与天然核苷酸所翻译成的氨基酸相同的氨基酸。多核苷酸可以是天然或异源结构基因或调控基因的全长序列或其亚序列。除非另外指明，否则该术语包括指指定的序列及其互补序列。因而，为了稳定性或为了其他原因对主链进行了修饰的DNA或RNA是如该术语在本文所意指的“多核苷酸”。此外，包含稀有碱基(如肌苷)或修饰碱基(如三苯甲基化的碱基)(仅举两个实例)的DNA或RNA是多核苷酸(如该术语在本文所用的)。应当理解，已对DNA和RNA进行了很多种修饰，这些修饰起到本领域技术人员已知的许多有用目的。本文所用的术语多核苷酸涵盖多核苷酸的这类经化学修饰、酶修饰或代谢修饰的形式，以及病毒和细胞(包括特别是简单细胞和复杂细胞)特征性的DNA和RNA的化学形式。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基为相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。
本文所用的“启动子”包括指DNA的在转录起始的上游并涉及RNA聚合酶和其他蛋白质的识别和结合以起始转录的区域。“植物启动子”是能够引发在植物细胞中的转录的启动子。示例性的植物启动子包括但不限于从植物、植物病毒和包含在植物细胞中表达的基因的细菌(如农杆菌属(Agrobacterium)或根瘤菌属(Rhizobium))获得的那些启动子。
术语“ACS多肽”指ACS酶的一条或多条氨基酸序列。该术语还包括其片段、变体、同源物、等位基因或前体(例如原前蛋白或前蛋白)。“ACS蛋白”包含ACS多肽。
本文所用的“重组的”包括指已通过引入异源核酸进行修饰的细胞或载体，或者源于经这样修饰过的细胞并保持该修饰的细胞。因此，例如，重组细胞可由于蓄意人为干预而表达不以同样形式存在于天然(非重组)形式的该细胞内的基因或者表达原本被异常表达、低表达或不被表达的自然基因，或者可具有减低了的或消除了的天然基因表达。在某些实例中，重组细胞相对于非重组细胞而言表现出一个或多个目标基因的表达降低或者所关注的多肽的水平或活性降低。本文所用的术语“重组的”不涵盖通过天然发生的事件(例如自发突变、天然转化/转导/转座)进行的细胞或载体的变更，所述事件为例如在没有蓄意人为干预的情况下发生的那些。
本文所用的“重组表达盒”是具有一系列规定核酸元件的通过重组法或合成法产生的核酸构建体，其允许特定核酸在靶细胞中转录。可将重组表达盒掺入到质粒、染色体、线粒体DNA、质粒DNA、病毒或核酸片段中。通常，除了别的序列以外，表达载体的重组表达盒部分还包含待转录的核酸和启动子。
术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”在本文中可互换使用，指被掺入蛋白质、多肽或肽(统称“蛋白质”)中的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，除非另外进行限制，否则可涵盖可以以与天然存在的氨基酸类似的方式发挥功能的天然氨基酸已知类似物。
术语“选择性杂交”包括指在严格杂交条件下核酸序列与指定的核酸靶序列杂交的程度比其与非靶序列杂交的程度可检测地更高(例如，至少2倍于背景)，并且基本上排除非靶核酸。选择性杂交序列通常相互间具有大约至少40％序列同一性，常常60-90％序列同一性，且可具有100％序列同一性(即互补)。
术语“严格条件”或“严格杂交条件”包括指探针与其靶序列杂交的程度将比它与其他序列杂交的程度可检测地更高(例如，至少2倍于背景)的条件。严格条件是序列依赖性的，在不同的环境中将会不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可鉴别与探针可最高达100％互补的靶序列(同源探测)。或者，可调节严格性条件以允许序列中有一些错配，以使得检测到较低程度的相似性(异源探测)。优选地，探针长为大约500个核苷酸，但长度可变化很大，从小于500个核苷酸到等于靶序列的整个长度。
通常，严格条件将为其中盐浓度低于约1.5M钠离子，通常为约0.01至1.0M钠离子浓度(或其他盐)，pH为7.0至8.3，对短探针(例如，10至50个核苷酸)而言温度为至少30℃，对长探针(例如超过50个核苷酸)而言温度为至少约60℃的那些条件。严格条件还可通过添加去稳定剂如甲酰胺或Denhardt’s来实现。示例性的低严格性条件包括在37℃下用30至35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液进行杂交，并在50至55℃下在1X至2X SSC(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中洗涤。示例性的中等严格性条件包括37℃下在40至45％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，并在55至60℃下在0.5X至1X SSC中洗涤。示例性的高严格性条件包括37℃下在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，并在60至65℃下在0.1X SSC中洗涤。特异性通常决定于杂交后的洗涤，关键因素为最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交体，可根据Meinkoth和Wahl，(1984)Anal.Biochem.，138：267-84的公式估计Tm∶Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M为单价阳离子的摩尔浓度，％GC为DNA中鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸的百分数，％form为杂交溶液中甲酰胺的百分数，L为杂交体的长度(单位为碱基对)。Tm为50％的互补靶标序列与完美匹配的探针杂交时的温度(在确定的离子强度和pH下)。每1％错配，Tm减少约1℃，因而，可调节Tm、杂交和/或洗涤条件以杂交至所需同一性的序列。例如，如果寻求具有≥90％同一性的序列，则可将Tm降低10℃。通常，将严格条件选择为比特定序列及其互补序列在确定的离子强度和pH下的热解链温度(Tm)低约5℃。然而，极严格条件可采用在低于热解链温度(Tm)1、2、3或4℃下杂交和/或洗涤；中等严格条件可采用在低于热解链温度(Tm)6、7、8、9或10℃下杂交和/或洗涤；低严格条件可采用在低于热解链温度(Tm)11、12、13或14、15或20℃下杂交和/或洗涤。利用该公式，杂交和洗涤组成以及所需的Tm，普通技术人员将认识到，杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化固有地得到了描述。如果所需的错配程度导致Tm低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则优选增加SSC浓度以使得可使用较高的温度。有关核酸的杂交的详尽指南见于以下文献：Tijssen，Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridizationwith Nucleic Acid Probes，第I部分，第2章，“Overview of principles ofhybridization and the strategy of nucleic acid probe assays，”Elsevier，New York(1993)；和Current Protocols in Molecular Biology，第2章，Ausubel等人(编辑)，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York(1995)。
本文所用的“转基因植物”包括指在其基因组中包含异源多核苷酸的植物。一般来讲，异源多核苷酸稳定地整合在基因组内使得该多核苷酸得以传递到连续世代。异源多核苷酸可单独整合进基因组中，或者作为重组表达盒的一部分整合进基因组中。“转基因”在本文中用来包括任何其基因型已因异源核酸的存在而被变更的细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括那些最初如此变更的转基因以及那些通过从最初的转基因进行有性杂交或无性繁殖而产生的转基因在内。本文所用的术语“转基因”不涵盖通过常规植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组(染色体基因组或染色体外基因组)的改变。
如本文所用，“载体”包括指用于转染宿主细胞并可在其中插入多核苷酸的核酸。载体常常是复制子。表达载体容许插入其中的核酸的转录。
以下术语用来描述两条或更多条核苷酸或多肽之间的序列关系：(a)“参考序列”，(b)“比较窗口”，(c)“序列同一性”，(d)“序列同一性百分比”和(e)“基本上相同”。
本文所用的“参考序列”是用作序列比较基准的确定的序列。参考序列可以是指定序列的子集或全体；例如，全长cDNA或基因序列的区段或者该完全的cDNA或基因序列。
本文所用的“比较窗口”包括指多核苷酸序列的连续和指定的区段，其中可将该多核苷酸序列与参考序列进行比较，且其中该多核苷酸序列在比较窗口中的该部分相比于该参考序列(其不包含添加或缺失)可包含添加或缺失(即空位)，以便该两个序列的最佳比对。通常，比较窗口长度为至少20个连续的核苷酸，任选可为30、40、50、100个或更多个核苷酸。本领域技术人员认识到，为避免与参考序列的不适当地高度相似性的推论，通常引入空位罚分并从匹配数扣除空位罚分。
将核苷酸和氨基酸序列进行比对以作比较的方法是本领域公知的，如Smith和Waterman，(1981)Adv.Appl.Math 2：482的局部同源算法(BESTFIT)，其可对用于比较的序列进行最佳比对；Needleman和Wunsch，(1970)J.Mol.Biol.48：443-53的同源比对算法(GAP)；Pearson和Lipman，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444的相似性搜索算法(Tfasta和Fasta)；这些算法的计算机化执行，包括但不限于：Intelligenetics(Mountain View，California)的PC/Gene程序中的CLUSTAL、WisconsinGenetics软件包
Figure BPA00001530551000181
第8版(可得自Genetics Computer Group
Figure BPA00001530551000182
程序(Accelrys，Inc.，San Diego，CA))中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。如下文献详细描述了CLUSTAL程序：Higgins和Sharp，(1988)Gene 73：237-44；Higgins和Sharp，(1989)CABIOS 5：151-3；Corpet等人，(1988)Nucleic Acids Res.16：10881-90；Huang等人，(1992)ComputerApplications in the Biosciences 8：155-65以及Pearson等人，(1994)Meth.Mol.Biol.24：307-31。用于多个序列的最佳全局比对的优选程序是PileUp(Feng和Doolittle，(1987)J.Mol.Evol.，25：351-60，其类似于Higgins和Sharp，(1989)CABIOS 5：151-53描述的方法，将文献以引用的方式将其并本文)。可用于数据库相似性搜索的BLAST程序家族包括：用于核苷酸查询序列对核苷酸数据库序列的BLASTN；用于核苷酸查询序列对蛋白质数据库序列的BLASTX；用于蛋白质查询序列对蛋白质数据库序列的BLASTP；用于蛋白质查询序列对核苷酸数据库序列的TBLASTN和用于核苷酸查询序列对核苷酸数据库序列的TBLASTX。参见Current Protocols in MolecularBiology，第19章，Ausubel等人(编辑)，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York(1995)。
Wisconsin Genetics Software
Figure BPA00001530551000183
第10版中的默认空位产生罚分值和空位延伸罚分值分别为8和2。空位产生和空位延伸罚分可以以选自0-100的整数来表示。因而，例如，空位产生和空位延伸罚分可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或更大。
GAP给出具有最好的比对的家族中的一个成员。这个家族可能存在许多成员，但其他成员没有更好的品质。GAP显示关于比对的四个品质因素：质量(quanlity)、比率(ratio)、同一性(identity)和相似性(similarity)。质量是为了比对序列而被最大化的指标(metric)。比率是品质除以较短区段中的碱基数。同一性百分数是实际匹配的符号的百分数。相似性百分数是相似的符号的百分数。将对应于空位的符号忽略。当一对符号的打分矩阵值大于或等于0.50(相似性阈值)时，对相似性打分。Wisconsin Genetics软件包
Figure BPA00001530551000191
第10版中所用的打分矩阵为BLOSUM62(参见Henikoff和Henikoff，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)。
除非另外指明，否则本文所提供的序列同一性/相似性值指用BLAST2.0程序包，采用默认参数获得的值(Altschul等人，(1997)Nucleic AcidsRes.25：3389-402)。
如本领域普通技术人员将会理解的，BLAST搜索假定蛋白质可以随机序列建模。然而，许多真实蛋白质包含非随机序列区，该非随机序列可为同聚片段、短周期重复或富含一种或多种氨基酸的区域。这种低复杂性区域可在不相关的蛋白质之间比对，尽管该蛋白质的其他区域完全不相似。可采用多种低复杂性过滤程序来减少这种低复杂性比对。例如，可单独使用或联合使用SEG(Wooten和Federhen，(1993)Comput.Chem.17：149-63)和XNU(Claverie和States，(1993)Comput.Chem.17：191-201)低复杂性过滤程序。
在两条多核苷酸或多肽序列的情形中，本文所用的“序列同一性”或“同一性”是指当在指定的比较窗口上进行比对以获得最大对应时两个序列中相同的残基。当序列同一性百分数针对蛋白质使用时，应认识到，不相同的残基位置往往差别在于保守氨基酸置换，其中氨基酸残基被其他具有相似的化学性质(例如电荷或疏水性)的氨基酸残基置换，因此不会改变分子的功能性质。如果序列差别在于保守置换，则可上调百分数序列同一性以校正置换的保守性质。差别在于这种保守置换的序列被说成具有“序列相似性”或“相似性”。作出这个调整的方法是本领域技术人员所熟知的。通常，这涉及将保守置换打分为部分错配而不是完全错配，从而提高序列同一性百分数。因而，例如，如果相同的氨基酸给予1分，非保守置换给予0分，则保守置换给予0至1之间的分数。例如，根据Meyers和Miller，(1988)Computer Applic.Biol.Sci.4：11-17的算法计算保守置换的分数，例如如在程序PC/GENE(Intelligenetics，Mountain View，California，USA)中所实现的。
本文所用的“序列同一性百分数”意指通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列所确定的数值，其中多核苷酸序列在比较窗口中的部分与参考序列(不包含添加或缺失)相比包含添加或缺失(即空位)，以便两个序列的最佳比对。该百分数是这样计算的：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较窗口中的位置的总数目，然后将结果乘以100以得到序列同一性百分数。
术语多核苷酸序列的“基本上相同”意指包含这样的序列的多核苷酸，该序列与参考序列相比具有50-100％序列同一性，如至少50％、60％、70％、80％、90％或95％序列同一性，所述比较是使用所描述的比对程序中的一种并采用标准参数进行的。技术人员将会认识到，可通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等等适当调整这些值以确定两个核苷酸序列所编码的蛋白质的相应同一性。出于这些目的，氨基酸序列的基本上相同通常意指55-100％之间，如55％、60％、70％、80％、90％或95％的序列同一性。
核苷酸序列基本上相同的另一指示是两个分子在严格条件下彼此杂交。遗传密码的简并性容许许多核酸置换，这些核酸置换在编码相同氨基酸的核苷酸序列中导致多样化，因而有可能两条DNA序列可编码相同多肽但在严格条件下不彼此杂交。例如，当利用遗传密码所允许的最大密码子简并性产生一个核酸拷贝时，这可能会发生。两条核酸序列是基本上相同的一个指示是，第一核酸编码的多肽与第二核酸所编码的多肽发生免疫交叉反应。
在肽的情形中，术语“基本上相同”指肽包含这样的序列，在指定比较窗口上该序列与参考序列具有55-100％之间的序列同一性，如与该参考序列具有55％、60％、70％、80％、85％、90％或95％序列同一性。优选地，利用Needleman和Wunsch(出处同上)的同源比对算法进行最佳比对。两条肽序列是基本上相同的指示是，一种肽可与针对第二种肽产生的抗体发生免疫反应。因而，例如，如果某种肽与第二种肽差别仅在于保守置换的话，则这两种肽基本上相同。此外，当某种肽与第二种肽差别在于非保守变化时，如果抗体识别的表位基本上相同，则它们基本上相同。“基本上相似”的肽如以上所指出共享序列，例外的是不相同的残基位置其差异在于保守氨基酸变化。
核酸的构建
分离核酸可用以下方法和技术制备：(a)标准的重组方法、(b)合成技术或者(c)它们的组合。在一些实施方案中，将从植物、真菌或细菌克隆、扩增或者以别的方式构建多核苷酸。
核酸——该多核苷酸序列除外——任选为用于多核苷酸的克隆和/或表达的载体、衔接子或接头。可将另外的序列添加至这种克隆和/或表达序列来优化它们在克隆和/或表达中的功能，以助于分离所述多核苷酸，或改善所述多核苷酸向细胞内的引入。例如，可以使用重组位点如FRT位点来产生和分离本发明的多核苷酸，如在第2008/0202505号美国专利申请公开说明书中所公开。重组位点的例子是本领域知道的，包括FRT位点(参见例如Schlake和Bode，(1994)Biochemistry 33：12746-12751；Huang等人，(1991)Nucleic Acids Research 19：443-448；Sadowski，(1995)载于Progress inNucleic Acid Research and Molecular Biology第51卷第53-91页；Cox，(1989)载于Mobile DNA，Berg和Howe编辑，American Society ofMicrobiology，Washington D.C.，第116-670页；Umlauf和Cox，(1988)TheEMBO Journal 7：1845-1852；Buchholz等人，(1996)Nucleic Acids Research24：3118-3119；Kilby等人，(1993)Trends Genet.9：413-421；Rossant和Geagy，(1995)Nat.Med.1：592-594；Albert等人，(1995)The Plant Journal7：649-659；Bayley等人，(1992)Plant Mol.Biol.18：353-361；Odell等人，(1990)Mol.Gen.Genet.223：369-378以及Dale和Ow，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10558-105620，以上文献均以引用方式并入本文)；Lox(Albert等人，(1995)Plant J.7：649-659；Qui等人，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：1706-1710；Stuurman等人，(1996)Plant Mol.Biol.32：901-913；Odell等人，(1990)Mol.Gen.Gevet.223：369-378；Dale等人，(1990)Gene 91：79-85和Bayley等人，(1992)Plant Mol.Biol.18：353-361；Vega等人，(2008)Plant Mol.Biol.66(6)：587-598)。
位点特异性重组酶如FLP能在特定目标序列切割和再连接DNA，导致两个相同位点之间的精确确定的(precisely defined)重组。为发挥功能，该系统需要该重组位点和该重组酶。不需要辅助因子。因此，整个系统可插入到植物细胞中并在其中发挥功能。将FLP/FRT位点工程构建在发夹结构内部或者发夹结构附近，可促进选择性标志物和其他载体主链序列从宿主细胞的切除。
克隆载体、表达载体、衔接子和接头的使用是本领域已知的。示例性的核酸包括诸如如下的载体：M13、λZAP Express、λZAP II、λgt10、λgt11、pBK-CMV、pBK-RSV、pBluescript II、λDASH II、λEMBL 3、λEMBL 4、pWE15、SuperCos 1、SurfZap、Uni-ZAP、pBC、pBS+/-、pSG5、pBK、pCR-Script、pET、pSPUTK、p3’SS、pGEM、pSK+/-、pGEX、pSPORTI和pSPORTII、pOPRSVI CAT、pOPI3 CAT、pXT1、pSG5、pPbac、pMbac、pMClneo、pOG44、pOG45、pFRTβGAL、pNEOβGAL、pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pRS413、pRS414、pRS415、pRS416、λMOSSlox和λMOSElox。本发明的任选载体包括但不限于λZAP II和pGEX。有关各种核酸的描述，参见例如StratageneCloning Systems，Catalogs 1995，1996，1997(La Jolla，CA)和Amersham LifeSciences，Inc，Catalog’97(Arlington Heights，IL)。
用于构建核酸的合成方法
分离核酸也可通过本领域知道的直接化学合成来制备。化学合成通常产生单链寡核苷酸。这可通过与互补序列杂交或通过将该单链作为模板用DNA聚合酶进行聚合来转变为双链DNA。较长的序列可通过连接较短的序列来获得。
UTR和密码子偏好性
一般而言，已发现翻译效率受RNA的5′非编码区或非翻译区(5′UTR)中的特定序列元件的调控。正序列基序包括翻译起始共有序列(Kozak，(1987)Nucleic Acids Res.15：8125)和5<G>7甲基GpppG RNA帽结构(Drummond等人，(1985)Nucleic Acids Res.13：7375)。负元件包括稳定的分子内5′UTR茎-环结构(Muesing等人，(1987)Cell 48：691)和5′UTR中的AUG序列或前面有适当AUG的短开放阅读框(Kozak(出处同上)、Rao等人，(1988)Mol.和Cell.Biol.8：284)。因此，本发明提供了用于调节异源编码序列的翻译的5′和/或3′UTR区。
此外，多核苷酸的多肽编码区段可进行修饰以改变密码子使用。可采用改变了的密码子使用，来改变翻译效率和/或优化编码序列在所需宿主中的表达或为了在玉米中表达而优化异源序列中的密码子使用。多核苷酸的编码区中的密码子使用可用可商购获得的软件包(如可得自University ofWisconsin Genetics Computer Group的“Codon Preference”)进行统计分析。参见Devereaux等人，(1984)Nucleic Acids Res.12：387-395)或者MacVector 4.1(Eastman Kodak Co.，New Haven，Conn.)。可用于确定密码子使用频率的多核苷酸的数目(每个氨基酸3个核苷酸)可为从3至所测试多核苷酸数目的任何整数。任选地，多核苷酸将为全长序列。用于统计分析的序列的示例性数目可以为至少1、5、10、20、50或100。
重组表达盒
本发明还提供包含核酸的重组表达盒。重组表达盒将通常包含可操作地连接至转录起始调控序列的多核苷酸，所述转录起始调控序列将指导该多核苷酸在预定的宿主细胞(如转化植物的组织)中的转录。
例如，植物表达载体可包含：(1)处于5′和3′调控序列的转录控制下的克隆的植物基因和(2)显性选择性标志物。这种植物表达载体还可含有(如果需要的话)启动子调节区(例如赋予诱导型或组成型表达、环境调节型或发育调节型表达或者细胞或组织特异性/偏好性表达的调节区)、转录起始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点和/或聚腺苷酸化信号。
可采用植物启动子片段，其将指导多核苷酸在再生的植物的所有或几乎所有组织中的表达。这种启动子在本文中称为“组成型”启动子并且在大多数环境条件和发育或细胞分化状态下是活跃的。组成型启动子的实例包括源于根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的T-DNA的1′-或2′启动子、Smas启动子、肉桂醇脱氢酶启动子(第5,683,439号美国专利)、Nos启动子、rubisco启动子、GRP1-8启动子、来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子，如Odell等人，(1985)Nature 313：810-2中所述；水稻肌动蛋白启动子(McElroy等人，(1990)Plant Cell 163-171)；泛素启动子(Christensen等人，(1992)Plant Mol.Biol.12：619-632和Christensen等人，(1992)Plant Mol.Biol.18：675-89)；pEMU(Last等人，(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-8)；MAS(Velten等人，(1984)EMBO J.3：2723-30)和玉米H3组蛋白启动子(Lepetit等人，(1992)Mol.Gen.Genet.231：276-85；和Atanassvoa等人，(1992)Plant Journal 2(3)：291-300)；ALS启动子，如第WO 1996/30530号PCR申请中所述；以及本领域技术人员知道的来自多种植物基因的其他转录起始区。
组织偏好的启动子、细胞类型偏好的启动子、发育调节型和诱导型启动子是“非组成型”启动子的实例。
组织偏好的启动子可用来使表达靶定在特定的植物组织内。所谓“组织偏好的”旨在指该表达主要是在特定的组织中，尽管未必专门在该组织中。实例包括优先在叶子、根、种子、胚乳、纤维、木质部微管、管胞或厚壁组织中起始转录的启动子。某些组织偏好的启动子可仅在光合(“绿色”)组织中驱动表达。组织偏好的启动子包括Yamamoto等人，(1997)Plant J.12(2)：255-265；Kawamata等人，(1997)Plant Cell Physiol.38(7)：792-803；Hansen等人，(1997)Mol.Gen Genet.255(3)：337-353；Russell等人，(1997)Transgenic Res.6(2)：157-168；Rinehart等人，(1996)Plant Physiol.112(3)：1331-1351；Van Camp等人，(1996)Plant Physiol.112(2)：525-535；Canevascini等人，(1996)Plant Physiol.112(2)：513-525；Yamamoto等人，(1995)Plant Cell Physiol.35(5)：773-778；Lam，(1995)Results Probl.Cell Differ.20：181-196；Orozco等人，(1993)Plant Mol Biol.23(6)：1129-1138；Matsuoka等人，(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA90(20)：9586-9590；玉米glb1启动子(GenBank L22344)和Guevara-Garcia等人，(1993)Plant J.5(3)：595-505。如有必要，可对这种启动子进行修饰以用于弱表达。另参见第2003/0074698号美国专利申请，将其以引用方式并入本文。
苗偏好的启动子包括苗分生组织偏好的启动子，如Weigal等人，(1992)Cell 69：853-859中公开的启动子；登录号AJ131822；登录号Z71981；登录号AF059870、ZAP启动子(第10/387,937号美国专利申请)、玉米tb1启动子(Wang等人，(1999)Nature 398：236-239)和McAvoy等人，(2003)Acta Hort.(ISHS)625：379-385中公开的苗偏好的启动子。
根偏好的启动子是已知的，可选自许多可从文献得到的启动子，或者从多种相容物种从头分离。参见例如Hire等人，(1992)Plant Mol.Biol.20(2)：207-218(大豆根特异性谷氨酰胺合成酶基因)；Keller和Baumgartner(1991)Plant Cell 3(10)：1051-1061(法国菜豆的GRP 1.8基因中的根特异性控制元件)；Sanger等人，(1990)Plant Mol.Biol.15(3)：533-553(根瘤农杆菌的甘露氨酸合酶(MAS)基因的根特异性启动子)；和Miao等人，(1991)Plant Cell 3(1)：11-22(编码胞质谷氨酰胺合成酶(GS)的全长cDNA克隆，该酶在大豆的根和根瘤中表达)。另参见Bogusz等人，(1990)Plant Cell 2(7)：633-651；Leach和Aoyagi，(1991)Plant Science(Limerick)79(1)：69-76)；Teeri等人，(1989)EMBO J.8(2)：353-350。另外的根偏好启动子包括VfENOD-GRP3基因启动子(Kuster等人，(1995)PlantMol.Biol.29(5)：759-772)；rolB启动子(Capana等人，(1995)Plant Mol.Biol.25(5)：681-691)和具有ADH第一内含子的CRWAQ81根偏好启动子(美国专利No.7,411,112)。另参见以下各号美国专利：5,837,876、5,750,386、5,633,363、5,559,252、5,501,836、5,110,732和5,023,179。
“细胞类型”特异性启动子或细胞类型偏好启动子主要驱动某些细胞类型在一个或多个器官中的表达，例如根中的维管细胞或者叶细胞或者叶肉细胞。叶肉细胞偏好的启动子包括但不限于来自多种物种的已知的磷酸烯醇式丙酮酸脱羧酶(PEPC)启动子或推定的PEPC启动子，例如玉米(Zeamays)、水稻(Oryza sativa)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、栽培大豆(Glycinemax)或高粱(Sorghum bicolor)。实例包括GenBank登录号为gi：116268332_HTG AC190686和gCAT GSS复合序列的玉米PEPC；GenBank登录号为gi|20804452|dbj|AP003052.3|的水稻PEPC；GenBank登录号为gi|5541653|dbj|AP000370.1|AP000370、gi：7769847或gi|20198070|gb|AC007087.7的拟南芥PEPC；大豆(GSS叠连群)或高粱(JGI assembly scaffold_832，89230bp.，JGI assembly scaffold_1632，(1997)Plant J.12(2)：255-265；Kwon等人，(1995)Plant Physiol.105：357-67；Yamamoto等人，(1995)Plant Cell Physiol.35(5)：773-778；Gotor等人，(1993)Plant J.3：509-18；Orozco等人，(1993)Plant Mol.Biol.23(6)：1129-1138；Baszczynski等人，(1988)Nucl.Acid Res.16：5732；Mitra等人，(1995)Plant Molecular Biology 26：35-93；Kayaya等人，(1995)Molecularand General Genetics 258：668-675以及Matsuoka等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(20)：9586-9590。
植物启动子可在更精确的环境控制之下，例如启动子可响应外部刺激而启动可操作地连接的基因的转录。这种启动子在本文中称为“诱导型”启动子。可实现通过诱导型启动子进行的转录的环境条件包括病原体攻击、无氧条件或光的存在。诱导型启动子的实例为Adh1启动子(其可由低氧或冷胁迫诱导)、Hsp70启动子(其可由热胁迫诱导)、PPDK启动子(其可由光诱导)和非生物胁迫诱导型启动子rab17(Vilardell等人，(1991)Plant Mol.Biol.17(5)：985-993)；rd29a(Yamaguchi-Shinozaki等人，(1993)Mol.Gen.Genet.236：331-340)和KT250(第2009/0229014号美国专利公开说明书)；另参见第2004/0123347号美国专利公开说明书。
发育调节的启动子可同时具有时间和空间限制，例如在花粉发育过程中或者开花发育过程中驱动在特定组织类型中的表达的启动子。参见例如第2007/0234444号和第2009/0094713号美国专利公开说明书。另一个实例是衰老调节的启动子，如SAM22(Crowell等人，(1992)Plant Mol.Biol.18：559-566)；另参见第5,589,052号美国专利。
在发育控制下的启动子的例子包括仅仅或优先在某些组织(如叶、根、果实、种子或花)中起始转录的启动子。取决于启动子在基因组的位置，启动子的操作也可以变化。因而，诱导型启动子在某些位置可变为完全或部分组成型的。
如果需要多肽表达，往往在多核苷酸编码区的3’末端包括聚腺苷酸化区域。聚腺苷酸化区域可衍自多种植物基因或衍自T-DNA。要添加的序列可衍自例如胭脂氨酸合酶或章鱼氨酸合酶基因，或者衍自另一植物基因，或者较不优选地衍自任何其他真核基因。这种调控元件的例子包括但不限于3′终止和/或多腺苷酸化区如根瘤农杆菌胭脂碱合酶(nos)基因的那些(Bevan等人，(1990)Nucleic Acids Res.12：369-85)；马铃薯蛋白酶抑制剂II(PINII)基因(Keil等人，(1989)Nucleic Acids Res.14：5641-50和An等人，(1986)Plant Cell 1：115-22)和CaMV 19S基因(Mogen等人，(1983)Plant Cell 2：1261-72)。
可将内含子序列加到5’非翻译区或编码序列或部分编码序列，以增加在细胞溶胶中积累的成熟信息的数量；例如，玉米Adh1和Bz1内含子(Callis等人，(1987)Genes Dev.1：1183-1200)。在表达构建体中的转录单位中包括可剪接的内含子，已证实在mRNA水平上和蛋白质水平上(如果适用的话)都能增加基因表达最高达1000倍(Buchman和Berg，(1988)Mol.Cell Biol.8：4395-4405)。当设置在接近转录单位的5′端时，基因表达的这种内含子增强通常是最大的。有关综述参见Simpson和Filipowicz，(1996)Plant Mol.Biol.32：1-41。
植物信号序列包括但不限于：编码将蛋白质靶向植物细胞的胞外基质的信号肽的DNA/RNA序列(Dratewka-Kos等人，(1989)J.Biol.Chem.264：4896-900)，如皱叶烟草(Nicotiana plumbaginifolia)扩延基因(DeLoose等人，(1991)Gene 99：95-100)；将蛋白质靶向液泡的信号肽，如甘薯sporamin基因(Matsuka等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：834)和大麦凝集素基因(Wilkins等人，(1990)Plant Cell，2：301-13)；促使蛋白质被分泌的信号肽，如PRIb的(Lind等人，(1992)Plant Mol.Biol.18：47-53)或者大麦α淀粉酶(BAA)(Rahmatullah等人，(1989)Plant Mol.Biol.12：119)或者将蛋白质靶向质体的信号肽，如油菜籽烯酰-Acp还原酶的(Verwaert等人，(1994)Plant Mol.Biol.26：189-202)。
包含本发明的多核苷酸的序列的载体将通常包含赋予植物细胞选择性表型的标志物基因。选择性标志物基因可编码抗生素抗性，合适的基因包括编码对壮观霉素的抗性的基因(例如aada基因)、编码链霉素抗性的链霉素磷酸转移酶(SPT)基因、编码卡那霉素或遗传霉素抗性的新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因、编码潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶(HPT)基因。同样有用的是编码对能抑制乙酰乳酸合酶(ALS)的作用的除草剂的抗性的基因，特别是磺酰脲型除草剂(例如含有导致这种抗性的突变的乙酰乳酸合酶(ALS)基因，尤其是S4和/或Hra突变)，编码对能抑制谷氨酰胺合酶的作用的除草剂的抗性的基因，如膦丝菌素或basta(例如bar基因)，或者本领域知道的其他此类基因。bar基因编码对除草剂basta的抗性，ALS基因编码对除草剂氯磺隆的抗性。同样有用的是编码对草甘磷的抗性的基因；参见例如以下各号美国专利：7,462,481、7,531,339、7,405,075、7,666,644、7,622,641和7,714,188。可用于在高等植物中表达基因的典型载体是本领域公知的，包括衍自根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的肿瘤诱导(Ti)质粒的载体，如Rogers等人，(1987)，Meth.Enzymol.153：253-77所描述。这些载体是植物整合型载体，因为在转化时，这些载体将载体DNA的一部分整合进宿主植物的基因组中。可用于本发明的示例性的根瘤农杆菌载体是Schardl等人，(1987)Gene 61：1-11和Berger等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：8402-6的质粒pKYLX6和pKYLX7。另一种可用于本发明的载体是质粒pBI101.2，其可获自CLONTECH Laboratories，Inc.(Palo Alto，CA)。
序列在宿主细胞中的表达
可以在重组工程细胞如细菌、酵母、昆虫或预选植物细胞中表达多核苷酸。该细胞在非天然条件下(例如在数量、组成、位置和/或时间方面改变)产生多核苷酸，因为它已被通过人为干预进行了遗传变更使其能做到这一点。
预期的是，本领域的技术人员会知道多种可用于表达多核苷酸的表达体系。无意于详细描述已知用于在原核生物或真核生物中表达的所有各种方法。
简单概括而言，分离多核苷酸的表达通常将通过使例如DNA或cDNA可操作地连接至启动子，然后合并入到表达载体中来实现。该载体可适合于在原核生物或真核生物中复制和整合。典型的表达载体含有可用于调节DNA的表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。为获得克隆基因的高水平表达，需要构建至少含有用于指导转录的强启动子(如泛素)、用于起始翻译的核糖体结合位点以及转录/翻译终止子的表达载体。组成型启动子被分类为可提供一系列组成型表达。因而，某些是弱组成型启动子，而另一些是强组成型启动子。参见(例如)第6,504,083号美国专利。一般来讲，所谓“弱启动子”意指驱动编码序列以低水平表达的启动子。所谓“低水平”意指处于约1/10,000个转录物至约1/100,000个转录物至约1/500,000个转录物的水平。相反，“强启动子”驱动编码序列以“高水平”或约1/10个转录物至约1/100个转录物至约1/1,000个转录物进行表达。
在原核生物中的表达
原核细胞可用作表达的宿主。原核生物最通常由大肠杆菌的各种菌株代表；然而，也可使用其他微生物株。在本文中定义为包括用于转录起始的启动子(任选具有操纵子)以及核糖体结合位点序列的常用原核生物控制序列，包括诸如以下的常用启动子：β-内酰胺酶(青霉素酶)启动子系统和乳糖(lac)启动子系统(Chang等人，(1977)Nature 198：1056)、色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel等人，(1980)Nucleic Acids Res.8：4057)和λ衍生PL启动子之类的常用启动子和N-基因核糖体结合位点(Shimatake等人，(1981)Nature 292：128)。在转染进大肠杆菌中的DNA载体中包含选择性标志物也是有用的。这种标志物的例子包括规定对氨苄青霉素、四环素或氯霉素的抗性的基因。
对载体进行选择以使得将所关注基因引入到适当的宿主细胞中。细菌载体通常是质粒或噬菌体起源的。将适当的细菌细胞用噬菌体载体颗粒转染或用裸噬菌体载体DNA转染。如果使用质粒载体，则将细菌细胞用质粒载体DNA转染。用于表达蛋白质的表达系统可使用芽孢杆菌属(Bacillussp.)和沙门氏菌属(Salmonella)来获得(Palva等人，(1983)Gene 22：229-35；Mosbach等人，(1983)Nature 302：543-5)。
在真核生物中的表达
多种真核表达系统如酵母、昆虫细胞系、植物和哺乳动物细胞是本领域技术人员知道的。如下面简单解释的，本发明可在这些真核系统中表达。在一些实施方案中，将转化的/转染的植物细胞(如下文所论述的)用作表达系统，用于产生本发明的蛋白质。
异源蛋白质在酵母中的合成是众所周知的。Sherman等人，(1982)Methods in Yeast Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory是描述多种可用于在酵母中产生蛋白质的方法的广泛认可的著作。两种广泛采用的用于产生真核蛋白质的酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。用于在酵母属(Saccharomyces)和毕赤酵母属(Pichia)中表达的载体、菌株和方法是本领域已知的并可从商业来源(例如Invitrogen)获得。根据需要，合适的载体通常具有表达控制序列，例如启动子(包括3-磷酸甘油酸激酶或醇氧化酶启动子)和复制起始区、终止序列等等。
蛋白质一旦表达，可通过裂解细胞并向溶胞产物或离心沉淀物应用标准的蛋白质分离技术来从酵母分离。可通过使用蛋白质印记技术或其他标准免疫测定技术的放射免疫测定法来完成对纯化过程的监测。
还可将编码蛋白质的序列连接至各种用于转染例如昆虫或植物来源的细胞培养物的表达载体。用于这些细胞的表达载体可包括表达控制序列，如复制起点、启动子(例如CMV启动子、HSV tk启动子或pgk(磷酸甘油酸激酶)启动子)、增强子(Queen等人，(1986)Immunol.Rev.89：49)和必要的加工信息位点如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多腺苷酸化位点(例如SV40大T Ag多聚A添加位点)和转录终止子序列。其他可用于生产蛋白质的动物细胞可从例如美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection，P.O.Box 1549，Manassas，Virginia，USA，20108)获得。
如使用酵母一样，当采用植物宿主细胞时，通常将多腺苷酸化序列或转录终止子序列掺入到载体中。终止子序列的一个实例是马铃薯pinII终止子(Keil等人，出处同上；An等人，出处同上)。还可包括用于转录物的精确剪接的序列。剪接序列的一个实例是来自SV40的VP1内含子(Sprague等人，J.Virol.45：773-81(1983))。
植物转化方法
有多种用于将外来基因引入到植物中的方法是公知的并可用来将ACS多核苷酸插入植物宿主中，包括生物学和物理学的植物转化方案。参见例如Miki等人，“Procedure for Introducing Foreign DNA into Plants”，Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology，Glick和Thompson编辑，CRC Press，Inc.，Boca Raton，第67-88页(1993)。所选用的方法随宿主植物而变，包括化学转染方法，如磷酸钙、微生物介导的基因转移如农杆菌(Horsch等人，Science 227：1229-31(1985))、电穿孔、显微注射和基因枪轰击。
用于植物细胞或组织转化和植物再生的表达盒和载体以及体外培养方法是已知的并可获得。参见例如Gruber等人，“Vectors for PlantTransformation”，Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology(出处同上)，第89-119页。
可通过一种或多种通常用于直接递送进细胞的技术将分离的多核苷酸或多肽引入植物中。取决于要进行基因修饰的生物体、细胞、植物或植物细胞的类型(例如单子叶植物或双子叶植物)，这种方案可不同。转化植物细胞的合适方法包括显微注射(Crossway等人，(1986)Biotechniques4：320-334和第6,300,543号美国专利)、电穿孔(Riggs等人，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5602-5606)、直接基因转化(Paszkowski等人，(1984)EMBO J.3：2717-2722)和弹道粒子加速(参见例如Sanford等人，第4,945,050号美国专利；WO 91/10725；和McCabe等人，(1988)Biotechnology 6：923-926)。还可参见Tomes等人，“Direct DNA Transferinto Intact Plant Cells Via Microprojectile Bombardment”.第197-213页，载于Plant Cell，Tissue and Organ Culture，Fundamental Methods.Gamborg和Phillips编辑，Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York，1995；第5,736,369号美国专利(分生组织)；Weissinger等人，(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477；Sanford等人，(1987)Particulate Science and Technology5：27-37(洋葱)；Christou等人，(1988)Plant Physiol.87：671-674(大豆)；Datta等人，(1990)Biotechnology 8：736-740(水稻)；Klein等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：4305-4309(玉米)；Klein等人，(1988)Biotechnology 6：559-563(玉蜀黍)；WO 91/10725(玉米)；Klein等人，(1988)Plant Physiol.91：440-444(玉米)；Fromm等人，(1990)Biotechnology 8：833-839和Gordon-Kamm等人，(1990)Plant Cell 2：603-618(玉米)；Hooydaas-Van Slogteren和Hooykaas(1984)Nature(London)311：763-764；Bytebierm等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5345-5349百合科(Liliaceae)；De Wet等人，(1985)载于The ExperimentalManipulation of Ovule Tissues，Chapman等人编辑，第197-209页，Longman，NY(花粉)；Kaeppler等人，(1990)Plant Cell Reports 9：415-418和Kaeppler等人，(1992)Theor.Appl.Genet.84：560-566(晶须介导的转化)；第5,693,512号美国专利(超声处理)；D’Halluin等人，(1992)Plant Cell 4：1495-1505(电穿孔)；Li等人，(1993)Plant Cell Reports12：250-255以及Christou和Ford，(1995)Annals of Botany 75：407-413(水稻)；Osjoda等人，(1996)Nature Biotech.14：745-750；农杆菌介导的玉米转化(第5,981,840号美国专利)；碳化硅晶须方法(Frame等人，(1994)Plant J.6：941-948)；激光方法(Guo等人，(1995)Physiologia Plantarum93：19-24)；超声处理方法(Bao等人，(1997)Ultrasound in Medicine &Biology 23：953-959；Finer和Finer，(2000)Lett Appl Microbiol.30：406-10；Amoah等人，(2001)J Exp Bot 52：1135-42)；聚乙二醇方法(Krens等人，(1982)Nature 296：72-77)；单子叶植物和双子叶植物细胞的原生质体可用电穿孔(Fromm等人，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：5824-5828)和显微注射(Crossway等人，(1986)Mol.Gen.Genet.202：179-185)进行转化；将这些文献全部以引用的方式并入本文。
农杆菌介导的转化
广泛使用的将表达载体引入植物中的方法是基于农杆菌天然转化系统。根瘤农杆菌(A.tumefaciens)和毛根农杆菌(A.rhizogenes)是植物病原性土壤细菌，其能遗传转化植物细胞。根瘤农杆菌和毛根农杆菌各自的Ti和Ri质粒携带负责植物的遗传转化的基因。参见例如Kado，(1991)Crit.Rev.Plant Sci.10：1。如下文献提供了有关用于农杆菌介导的基因转移的农杆菌载体系统和方法的描述：Gruber等人(出处同上)；Miki等人(出处同上)和Moloney等人，(1989)Plant Cell Reports 8：238。
相似地，可将所关注的多核苷酸插入到源于根瘤农杆菌或毛根农杆菌各自的Ti或Ri质粒的T-DNA区中。因而，可使用这些质粒，如上构建表达盒。已知有许多控制序列，其在偶联至异源编码序列并转化进宿主生物体中时，在初始编码序列的组织/器官特异性方面显示出基因表达的保真性。参见例如Benfey和Chua，(1989)Science 244：174-81。用于这些质粒中的特别合适的控制序列是用于基因在各种靶植物中的组成型表达的启动子。其他可用的控制序列包括来自胭脂氨酸合酶基因(NOS)的启动子和终止子。NOS启动子和终止子存在于质粒pARC2中，该质粒可得自美国典型培养物保藏中心，指定的ATCC存放号为67238。如果使用这样一种系统，则来自Ti或Ri质粒的毒力(vir)基因也必须存在，或者与T-DNA部分一起，或者通过其中vir基因存在于单独载体上的双元系统。这类系统、在其中使用的载体以及转化植物细胞的方法在以下专利和文献(均以引用方式全文并入本文)中有描述：第4,658,082号美国专利；1986年10月1日提交的系列号为913,914的美国专利申请，如在1993年11月16日公布的第5,262,306号美国专利申请中引用的；和Simpson等人，(1986)PlantMol.Biol.6：403-15(也在‘306专利中引用)。
一旦构建，可将这些质粒置于毛根农杆菌或根瘤农杆菌中并将这些载体用于转化植物物种的细胞，所述植物物种包括但不限于大豆、玉米、高粱、苜蓿、水稻、三叶草、卷心菜、香蕉、咖啡、芹菜、烟草、豇豆、棉花、甜瓜和胡椒。根瘤农杆菌或者毛根农杆菌的选择将取决于用其转化的植物。通常，根瘤农杆菌是用于转化的优选生物体。多大数双子叶植物、一些裸子植物和少数单子叶植物(例如百合目(Liliales)和天南星目(Arales)的某些成员)对根瘤农杆菌感染是易感的。毛根农杆菌也具有广泛的宿主范围，涵盖大多数双子叶植物和一些裸子植物，其包括豆科(Leguminosae)、菊科(Compositae)和藜科(Chenopodiaceae)的成员。单子叶植物现在可以一定的成功率进行转化。第604662 B1号欧洲专利公开了用农杆菌转化单子叶植物的方法。第672752 B1号欧洲专利公开了采用不成熟胚的盾片用农杆菌转化单子叶植物的方法。Ishida等人论述了通过使未成熟胚暴露于根瘤农杆菌来转化玉米的方法(Nature Biotechnology 14：745-50(1996))。
一旦转化，可将这些细胞用于再生转基因植物。例如，整个植株可通过使该植株产生伤口，然后将载体引入该伤口位点来用这些载体进行感染。可使植株的任何部分产生伤口，包括叶、茎和根。可将通过用毛根农杆菌或根瘤农杆菌接种植物组织而转化的根或苗用作植物来源，以通过体细胞胚胎发生或器官发生来再生转基因植物。或者，可将外植体形式的植物组织如子叶组织或叶圆片用这些载体接种，并在可促进植物再生的条件下培养。这种再生植物组织的方法的例子是本领域技术人员知道的。
直接基因转移
尽管农杆菌介导的转化的宿主范围广泛，但一些主要的谷类作物物种和裸子植物最初对这个基因转移模式而言是顽拗的。对于农杆菌介导的转化和对于另选的方法(统称直接基因转移)都报道了成功案例和改进案例。例如，对于水稻，参见Kathuria等人，(2007)Critical Reviews in PlantSciences 26：65-103。对于小麦，参见He，(2010)J.Exp.Bot 61(6)：1567-1581；XiuDao等人，(2010)Sci.Agri.Sinica 43(8)：1539-1553；Zale，(2009)Plant Cell Rep.28(6)：903-913；Wang等人，(2009)Cereal Res.Commun.37(1)：1-12；Greer，(2009)New Biotech.26(1/2)：44-52。对于甘蔗，参见vander Vyver，(2010)Sugar Tech.12(1)：21-25；Joyce等人，(2010)Plant Cell Rep.29(2)：173-183；Kalunke等人，(2009)Sugar Tech.11(4)：365-369；Gilbert等人，(2009)Field Crops Res.111(1-2)：39-46。对于草坪草，参见Cao，(2006)Plant Cell，Tissue，Organ Culture 85(3)：307-316。
一般适用的植物转化方法是微抛射体(microprojectile)介导的转化，其中DNA携带在约1-4μm的微抛射体的表面上。用基因枪装置(biolisticdevice)将表达载体引入植物组织中，该基因枪装置将微抛射体加速至300-600m/s的速度，该速度足以穿透植物细胞壁和膜(Sanford等人，(1987)Part.Sci.Technol.5：27；Sanford，(1988)Trends Biotech 6：299；Sanford，(1990)Physiol.Plant 79：206和Klein等人，(1992)Biotechnology 10：268)。
物理递送DNA至植物的另一种方法是如Zang等人，(1991)BioTechnology 9：996中所述的对靶细胞的超声处理。或者，脂质体或原生质球融合已用于将表达载体引入植物中。参见例如Deshayes等人，(1985)EMBO J.4：2731和Christou等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：3962。利用CaCl2沉淀、聚乙烯醇或聚-L-鸟氨酸直接将DNA摄入原生质体中也已有报道。参见例如Hain等人，(1985)Mol.Gen.Genet.199：161和Draper等人，(1982)Plant Cell Physiol.23：451。
原生质体和完整细胞和组织的电穿孔也已有描述。参见例如Donn等人，(1990)Abstracts of the VIIth Int’l.Congress on Plant Cell and TissueCulture IAPTC，A2-38，p.53；D’Halluin等人，(1992)Plant Cell 4：1495-505和Spencer等人，(1994)Plant Mol.Biol.24：51-61。
降低ACS多肽的活性和/或水平
提供了通过用表达盒转化植物细胞来降低或消除ACS多肽的水平或活性的方法，该表达盒表达能降低该ACS多肽的表达的多核苷酸。该多核苷酸可通过防止ACS信史RNA的转录或翻译来直接降低ACS多肽的表达，或者通过编码能降低编码ACS多肽的ACS基因的转录或翻译的多肽来间接降低ACS多肽的表达。用于降低或消除基因在植物中的表达的方法是本领域公知的，任何这种方法都可用于本发明以降低ACS多肽的表达。
如果ACS多肽的水平为对照植物中的相同ACS多肽的水平的不到100％、99％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％，则该ACS多肽的表达被降低。在具体的实施方案中，经修饰的植物中的ACS多肽的水平为对照植物中的相同或相关ACS多肽的水平的不到60％、不到50％、不到40％、不到30％、不到20％、不到10％、不到5％或不到2％。可使ACS多核苷酸表达水平和/或多肽水平和/或酶活性降低，使得该降低在表型上足以提供对干旱条件的耐受性，而不损害在良好浇灌条件下出现的产量。一个或多个ACS多核苷酸、多肽或酶的水平或活性可受到影响。ACS多肽的表达水平可例如通过测定在植物细胞或植物中表达的ACS多肽的量来直接测量，或者例如通过测量植物细胞或植物中的ACS或乙烯合成活性或通过测量植物中的表型变化来间接测量。进行这种测定的方法在本文的其他地方进行了描述。
在本发明的某些实施方案中，通过用表达盒转化植物细胞来降低或消除ACS多肽的活性，该表达盒包含编码能抑制ACS多肽的活性的多肽的多核苷酸。如果ACS多肽的活性为对照植物中的相同ACS多肽的活性的不到100％、99％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％，则该ACS多肽的活性被降低。在具体的实施方案中，经修饰的植物中的ACS多肽的ACS活性为对照植物中的相同多肽的ACS活性的不到60％、不到50％、不到40％、不到30％、不到20％、不到10％或不到5％。ACS多肽的ACS活性当通过本文别处描述的测定方法检测不到时，则根据本发明它“被消除”。测定ACS多肽的活性的改变的方法在本文别处描述。
在其他实施方案中，可通过破坏或切除编码ACS多肽的基因的至少一部分，来降低或消除ACS多肽的活性。携带ACS基因的突变的经诱变的植物，也导致ACS基因的表达降低和/或所编码的ACS多肽的活性降低。
因而，有许多方法可用于降低或消除ACS多肽的活性。可用一种或多种方法来降低单个ACS多肽的活性。可用一种或多种方法来降低多个ACS多肽的活性。
1.基于多核苷酸的方法：
在一些实施方案中，用表达盒来转化植物，该表达盒能够表达能降低ACS多肽的表达的多核苷酸。本文所用的术语“表达”指基因产物的生物合成，包括所述基因产物的转录和/或翻译。例如，能够表达能降低至少一种ACS多肽的表达的多核苷酸的表达盒，是能够产生能抑制至少一种ACS多肽的转录和/或翻译的RNA分子的表达盒。蛋白质或多肽从DNA分子的“表达”或“产生”指该编码序列转录和翻译而产生该蛋白质或多肽，而蛋白质或多肽从RNA分子“表达”或“产生”指该RNA编码序列翻译而产生蛋白质或多肽。
以下给出调节ACS多肽的表达的多核苷酸的实例。
i.有义抑制/共抑制
在一些实施方案中，ACS多肽的表达的下调可通过有义抑制或共抑制来实现。对于共抑制，将表达盒设计为表达这样的RNA分子，该RNA分子以“有义”取向对应于编码ACS多肽的信使RNA的全部或部分。该RNA分子的过表达可导致该天然基因的表达降低。因此，对用该共抑制表达盒转化的多个植株进行筛选以鉴别那些显示出ACS多肽表达下降的植株。
用于共抑制的多核苷酸可对应于编码ACS多肽的序列的全部或部分、ACS多肽转录物的5′和/或3′非翻译区的全部或部分、或者编码ACS多肽的转录物的编码序列和非翻译区二者的全部或部分。在其中该多核苷酸包含ACS多肽的编码区的全部或部分的一些实施方案中，将表达盒设计为消除该多核苷酸的起始密码子，使得不会翻译出蛋白质产物。
共抑制可用来抑制植物基因的表达以产生对于由这些基因编码的蛋白质而言具有不可检测的蛋白质水平的植物。参见(例如)Broin等人，(2002)Plant Cell 14：1417-1432。共抑制还可用来抑制同一植株中的多种蛋白质的表达。参见(例如)第5,942,657号美国专利。使用共抑制来抑制植物中的内源基因的表达的方法在以下文献和专利中有描述：Flavell等人，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：3490-3496；Jorgensen等人，(1996)Plant Mol.Biol.31：957-973；Johansen和Carrington，(2001)Plant Physiol.126：930-938；Broin等人，(2002)Plant Cell 14：1417-1432；Stoutjesdijk等人，(2002)Plant Physiol.129：1723-1731；Yu等人，(2003)Phytochemistry63：753-763以及第5,034,323号、第5,283,184号和第5,942,657号美国专利，将这些文献和专利以引用方式并入本文。共抑制的效率可通过在表达盒中在有义序列的3′和聚腺苷酸化信号的5′位置包括多聚dT区来提高。参见第2002/0048814号美国专利申请公开，将其以引用的方式并入本文。通常，这种核苷酸序列与该内源基因的转录物的全长序列或片段或部分具有实质的序列同一性，通常大于约65％序列同一性，往往大于约85％序列同一性，有时大于约95％序列同一性。参见第5,283,184号和第5,034,323号美国专利，将它们以引用的方式并入本文。
ii.反义抑制
在一些实施方案中，ACS多肽的表达的降低可通过反义抑制来获得。对于反义抑制，将表达盒设计为表达与编码该ACS多肽的信使RNA的全部或部分互补的RNA分子。该反义RNA分子的过量表达可导致天然基因的表达减少。因此，对用反义抑制表达盒转化的多个植株进行筛选以鉴别那些显示出ACS多肽表达的最佳下调的植株。
用于反义抑制的多核苷酸可对应于编码ACS多肽的序列的互补序列的全部或部分、ACS转录物的5′和/或3′非翻译区的互补序列的全部或部分、或者编码ACS多肽的转录物的编码序列和非翻译区二者的互补序列的全部或部分。此外，反义多核苷酸可与目标序列完全互补(即与目标序列的互补序列100％相同)或部分互补(即与目标序列的互补序列的同一性低于100％)。反义抑制还可用来抑制同一植株中的多种蛋白质的表达。参见(例如)第5,942,657号美国专利。此外，反义核苷酸的部分可用来破坏靶基因的表达。通常，可使用至少50个核苷酸、100个核苷酸、200个核苷酸、300、400、450、500、550或更多个核苷酸的序列。使用反义抑制来抑制植物中的内源基因的表达的方法在例如如下文献和专利中有描述：Liu等人，(2002)Plant Physiol.129：1732-1743，和第5,759,829号和第5,942,657号美国专利，将这些参考文献和专利的每一个以引用的方式并入本文。反义抑制的效率可通过在表达盒中在反义序列的3′和聚腺苷酸化信号的5′位置处包括多聚dT区来提高。参见第2002/0048814号美国专利申请公开，将其以引用的方式并入本文。
iii.双链RNA干扰
在本发明的一些实施方案中，ACS多肽的表达的下调可通过双链RNA(dsRNA)干扰来获得。对于dsRNA干扰，有义RNA分子(如上文针对共抑制所描述)和与该有义RNA分子完全或部分互补的反义RNA分子在同一细胞中表达，从而导致对应的内源信使RNA的表达的下调。
有义和反义分子的表达可通将表达盒子设计为同时包含有义序列和反义序列来实现。或者，可将单独的表达盒分别用于有义序列和反义序列。对用(一个或多个)dsRNA干扰表达盒转化的多个植株进行筛选以鉴别显示出ACS多肽表达的最佳下调的植株。使用dsRNA干扰来抑制内源植物基因的表达的方法在以下文献和专利中有描述：Waterhouse等人，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13959-13964，Liu等人，(2002)Plant Physiol.129：1732-1743以及WO 99/49029、WO 99/53050、WO 99/61631和WO00/49035，将每个文献和专利以引用方式并入本文。
iv.发夹RNA干扰和含内含子的发夹RNA干扰
在本发明的一些实施方案中，ACS多肽的表达的下调可通过发夹RNA(hpRNA)干扰或含内含子的发夹RNA(ihpRNA)干扰来获得。这些方法在抑制内源基因表达方面是高度有效的。参见Waterhouse和Helliwell，(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38及其中引用的参考文献。
对于hpRNA干扰，将表达盒设计为表达这样的RNA分子，该RNA分子自身杂交而形成包括单链环区和碱基配对茎的发夹结构。该碱基配对茎区包含对应于编码要对其表达进行抑制的基因的内源信使RNA的全部或部分的有义序列和与该有义序列完全或部分互补的反义序列。反义序列可位于有义序列的“上游”(即反义序列可比有义序列更靠近驱动该hpRNA的表达的启动子)。碱基配对茎区可对应于控制待抑制的基因的表达的启动子序列的一部分。因而，该分子的碱基配对茎区通常决定RNA干扰的特异性。该有义序列和该反义序列通常具有相似长度，但长度可不同。因而，这些序列可以是长度为至少10、19，20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、50、70、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、500、600、700、800或900个核苷酸，或长度为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10kb的部分或片段。该表达盒的环区长度可以变化。因而，环区可以是长度为至少50、80、100、200、300、400、500、600、700、800或900个核苷酸，或长度为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10kb。
hpRNA分子在抑制内源基因的表达方面是高度有效的，并且它们诱导的RNA干扰被植物后代遗传。参见例如Chuang和Meyerowitz，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：4985-4990；Stoutjesdijk等人，(2002)Plant Physiol.129：1723-1731以及Waterhouse和Helliwell，(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38。使用hpRNA干扰来使基因表达降低或沉默的方法在例如以下文献和专利中有描述：Chuang和Meyerowitz，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97：4985-4990；Stoutjesdijk等人，(2002)Plant Physiol.129：1723-1731；Waterhouse和Helliwell，(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38；Pandolfini et al.，BMC Biotechnology 3∶7以及第2003/0175965号美国专利申请公开说明书，将每个文献和专利以引用方式并入本文。hpRNA构建体体内沉默基因表达的效率的瞬时测定法已由Panstruga等人，(2003)Mol.Biol.Rep.30：135-140描述(将其以引用方式并入本文)。
对于ihpRNA，干扰分子具有与hpRNA相同的总体结构，但该RNA分子另外包含内含子，该内含子能够在表达该ihpRNA的细胞中被剪接。内含子的使用使得发夹RNA分子中的环的大小在剪接后最小化，这可提高干扰的效率。在一些实施方案中，内含子是ADH1内含子1。使用ihpRNA干扰来抑制内源植物基因的表达的方法例如在Smith等人，(2000)Nature 407：319-320中有描述。事实上，Smith等人证实使用ihpRNA介导的干扰，内源基因表达受到100％抑制。使用ihpRNA干扰来抑制内源植物基因的表达的方法例如在以下文献和专利中有描述：Smith等人，(2000)Nature 407：319-320；Wesley等人，(2001)Plant J.27：581-590；Wang和Waterhouse，(2001)Curr.Opin.Plant Biol.5：146-150；Waterhouse和Helliwell，(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38；Helliwell和Waterhouse，(2003)Methods 30：289-295以及第2003/0180945号美国专利申请公开说明书，将每个文献和专利以引用方式并入本文。
还可对用于hpRNA干扰的表达盒进行设计，使得有义序列和反义序列不对应于内源RNA。在这个实施方案中，该反义和有义序列在这样的环序列的旁侧，该环序列包含对应于靶基因的内源信使RNA的全部或部分的核苷酸序列。因而，是环区决定了RNA干扰的特异性。参见例如WO02/00904；Mette等人，(2000)EMBO J 19：5194-5201；Matzke等人，(2001)Curr.Opin.Genet.Devel.11：221-227；Scheid等人，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 99：13659-13662；Aufsaftz等人，(2002)Proc.Nat’l.Acad.Sci.99(4)：16499-16506；Sijen等人，Curr.Biol.(2001)11：436-440)，将他们以引用方式并入本文。
v.扩增子介导的干扰
扩增子表达盒包含源自植物病毒的序列，该序列含有靶基因的全部或部分但通常不含有该天然病毒的基因的全部。存在于表达盒的转录产物中的病毒序列使得该转录产物能指导其自身的复制。由该扩增子产生的转录物相对于目标序列(即ACS多肽的信使RNA)可以是有义或反义的。使用扩增子来抑制内源植物基因的表达的方法例如在以下文献和专利中有描述：Angell和Baulcombe，(1997)EMBO J.16：3675-3684，Angell和Baulcombe，(1999)Plant J.20：357-362以及第号美国6,635,805专利，将每个文献和专利以引用方式并入本文。
vi.核酶
在一些实施方案中，由表达盒表达的多核苷酸是对ACS多肽的信使RNA特异性的催化性RNA或具有对ACS多肽的信使RNA特异性的核酶活性。因而，该多核苷酸引起内源信使RNA的降解，从而导致ACS多肽表达的降低。这个方法例如在第4,987,071号美国专利中进行了描述，将该专利以引用的方式并入本文。
调节植物中的干旱耐受性的方法
调节植物中的干旱耐受性的方法也是本发明的特征。将不同程度的干旱耐受性引入到植物中的能力给本发明的使用提供了灵活性：例如在具有较长或较干燥的生长季节的地区引入强干旱耐受性以改进灌浆或进行青贮，相比之下在具有较短生长季节的农业地区引入中等的干旱耐受性以进行青贮。本发明的植物的干旱耐受性的调节可反映以下各方面中的一个或多个：与相应的对照植物相比，(a)至少一种ACC合酶编码mRNA的生成的下降；(b)ACC合酶的生成的下降；(c)ACC的生成的下降；(d)乙烯的生成的下降；(e)植株高度的提高或者(f)(a)-(e)的任何组合。
例如，本发明的方法可包括：(a)选择至少一个要进行突变的ACC合酶基因，从而提供至少一个所需的ACC合酶基因；(b)将该至少一个所需的ACC合酶基因的突变形式引入到植物中；和(c)表达该突变形式，从而调节该植物中的干旱耐受性。由这种方法产生的植物也是本发明的一个特征。
引入到植物中的干旱耐受性的程度可通过多种因素来确定，例如，选择那个ACC合酶基因，突变基因成员是以杂合状态还是纯合状态存在，或者通过这个家族的被失活的成员的数目来确定，或者通过两个或多个这类因素的组合来确定。
一旦选择所需的ACC合酶基因，将该ACC合酶基因的突变形式引入到植物中。在某些实施方案中，突变形式通过农杆菌介导的转移、电穿孔、微粒轰击、同源重组或有性杂交来引入。在某些实施方案中，突变形式包括例如在该至少一个ACC合酶基因中的杂合突变，在该至少一个ACC合酶基因中的纯合突变，或者如果选择超过一个ACC合酶基因的话，纯合突变和杂合突变的组合。在另一个实施方案中，突变形式包括该至少一个所需ACC合酶基因的呈反义、有义或RNA沉默或干扰构型的亚序列。
ACC合酶基因的突变形式的表达可通过多种方式来测定。例如，表达产物的检测是定性进行(是否存在一种或多种所关注的产物)或定量进行(通过监测一种或多种所关注的产物的表达水平)。在一个实施方案中，表达产物为RNA表达产物。本发明任选包括监测本文所指出的核酸或多肽的表达水平以检测植物中或植物群体中的ACC合酶。监测乙烯或ACC的水平也可起到检测ACC合酶基因的表达或活性的下调的作用。
调节植物中的密度耐受性的方法
除了相比于对照植物提高本发明植物的干旱胁迫耐受性之外，本发明还使得能够以较高的密度种植本发明的植物，从而导致每英亩玉米的产量提高。过去一个世纪以来，每英亩玉米产量的提高大部分是来自于提高对密度的耐受性，密度是一种对植物的胁迫。调节植物胁迫应答的方法，例如提高对密度的耐受性，也是本发明的一个特征。例如，本发明的方法可包括：(a)选择至少一个要进行突变的ACC合酶基因，从而提供至少一个所需的ACC合酶基因；(b)将该至少一个所需的ACC合酶基因的突变形式引入到植物中；和(c)表达该突变形式，从而调节该植物中的密度耐受性。由这种方法产生的植物也是本发明的一个特征。当通过所需的ACC合酶基因的突变形式降低植物中的乙烯生成时，该植物对密度的感觉和/或应答降低。因此，本发明的植物可以以比农民目前所实施的密度更高的密度来种植，并且导致种子产量和/或生物量提高。
调节植物中的氮利用效率的方法
除了相比于对照植物提高本发明植物的干旱耐受性和改进密度胁迫耐受性之外，本发明还可提供更高的氮利用效率。例如，本发明的方法可包括：(a)选择至少一个要进行突变的ACC合酶基因，从而提供至少一个所需的ACC合酶基因；(b)将该至少一个所需的ACC合酶基因的突变形式引入到植物中；和(c)表达该突变形式，从而调节该植物中的氮利用效率(NUE)。由这种方法产生的植物也是本发明的一个特征。NUE得到改进的植物可在氮供应充足的可比条件下比对照植物具有更高的生产率，和/或可在氮供应显著降低的情况下维持生产率。改进的NUE可反映在一个或多个属性，如生物量提高、谷粒产量提高、收获指数提高、光合速率提高和对生物或非生物胁迫的耐受性提高。特别是，改进在玉米中的NUE将提高每单位输入氮肥的可收获产量，这在氮肥供应有限的发展中国家和在氮使用水平高的发达国家都如此。
植物或植物细胞的筛选/表征
可通过遗传型法、生物化学法、表型法或通过这些方法中的两种或更多者的组合来筛选和/或表征植物。例如，可对植物进行表征以确定本发明的多核苷酸是否存在和/或表达水平(例如数量、调节，如相比于对照细胞是降低还是提高)；本发明的多肽是否存在、表达和/或酶活性；和/或干旱耐受性的调节、氮利用效率的调节、密度耐受性的调节和/或乙烯生成的调节。
可从细胞提取物回收并测定化学物质，例如乙烯、ACC等。例如，酸性植物提取物中的内部ACC浓度，可通过在碱性次氯酸盐溶液等中进行分解后作为乙烯通过气相色谱-质谱法进行测定。乙烯的浓度可例如通过气相色谱-质谱法等进行测定，参见例如Nagahama等人，(1991)J.Gen.Microbiol.137：2281 2286。例如，可用装有例如基于氧化铝的柱子(如HP-PLOT A1203毛细管柱(Agilent Technologies，Santa Clara，CA))和火焰离子化检测器的气相色谱仪测量乙烯。
表型分析包括例如分析植物的化学组成、形态或生理性质的变化。例如，表型变化可包括但不限于干旱耐受性的提高、密度耐受性的提高、氮利用效率的提高和乙烯生成的下降。
有多种测定法可用于监测干旱耐受性和/或NUE。例如，测定法包括但不限于目视检查，监测光合作用测量，以及测量例如叶子在胁迫和非胁迫条件下的叶绿素、DNA、RNA和/或蛋白质含量水平。
本发明的植物
可用于本发明的植物细胞包括但不限于分生细胞、I型、II型和III型愈伤组织、不成熟胚和配子细胞如小孢子、花粉、精核和卵。在某些实施方案中，本发明的植物细胞来自双子叶植物或单子叶植物。从本发明的植物细胞再生的植物也是本发明的一个特征。
在一个实施方案中，制备细胞是在包含耐干旱表型的植物例如杂种植物中。在另一个实施方案中，植物细胞是在包含不育表型(例如雄性不育表型)的植物中。通过一系列的育种操作，可将影响ACC合酶基因的构建体从一个植株转移到另一个植株。例如，可通过将包含一个或多个ACC合酶基因的经修饰的表达的植物与对照植物进行有性杂交来产生杂种植物。
经修饰的植物细胞也是本发明的一个特征。在第一方面，本发明提供包含至少一个能够抑制内源ACC合酶基因的下调构建体的分离或重组植物细胞；例如，包含与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7的ACS6下调表达构建体的(例如)至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％、约99.5％或更多的序列同一性的核酸序列或其互补序列。将至少一个ACC合酶多核苷酸或蛋白质的表达或活性的下调与缺乏该下调构建体的相应对照植物细胞进行比较。几乎任何植物都可用于本发明的方法和组合物。这类物种包括但不限于禾本科(Poaceae)(以前称Graminae)的成员，包括玉米(Zea mays)(玉米(corn)或玉蜀黍(maize))、黑麦、黑小麦、大麦、稷、水稻、小麦、燕麦等；豆科(Leguminosae)，包括豌豆、豆类(beans)、小扁豆、花生、豆薯、豇豆、藜豆、大豆、三叶草、苜蓿、羽扇豆、野豌豆、莲子、草木犀、柴藤、香豌豆等；菊科(Compositae)，维管植物的最大家族，包括至少1000个属，包括重要的商业作物，如向日葵；蔷薇科(Rosaciae)，包括悬钩子、杏(apricot)、杏(almond)、桃、玫瑰等；以及坚果植物，包括胡桃、美洲山核桃、榛子等，森林树木(包括松属(Pinus)、栎属(Quercus)、Pseutotsuga、北美红杉属(Sequoia)、杨属(Populus)等)以及其他普通的作物，例如棉花、高粱、草坪草、番茄、马铃薯、胡椒、卡诺拉油菜、椰菜、卷心菜等。
另外的植物，以及以上所指明的那些，包括来自以下各属的植物：Acamptoclados、芨芨草属(Achnatherum)、Achnella、凤头黍属(Acroceras)、山羊草属(Aegilops)、Aegopgon、Agroelymus、Agrohordeum、剪棒草属(Agropogon)、冰草属(Agropyron)、Agrositanion、剪股颖属(Agrostis)、银须草属(Aira)、Allolepis、毛颖草属(Alloteropsis)、看麦娘属(Alopecurus)、Amblyopyrum、Ammophila、Ampelodesmos、Amphibromus、Amphicarpum、Amphilophis、Anastrophus、Anatherum、须芒草属(Andropogron)、Anemathele、赖草属(Aneurolepidium)、Anisantha、Anthaenantia、Anthephora、Anthochloa、黄花茅属(Anthoxanthum)、Apera、水蔗草属(Apluda)、Archtagrostis、Arctophila、Argillochloa、三芒草属(Aristida)、燕麦草属(Arrhenatherum)、荩草属(Arthraxon)、内门竹属(Arthrostylidium)、青篱竹属(Arundinaria)、野古草属(Arundinella)、芦竹属(Arundo)、Aspris、Atheropogon、燕麦属(Avena)(例如燕麦)、Avenella、异燕麦属(Avenochloa)、Avenula、地毯草属(Axonopus)、簕竹属(Bambusa)、菵草属(Beckmannia)、Blepharidachne、Blepharoneuron、孔颖草属(Bothriochloa)、格兰马草属(Bouteloua)、臂形草属(Brachiaria)、短颖草属(Brachyelytrum)、短柄草属(Brachypodium)、凌风草属(Briza)、Brizopyrum、Bromelica、Bromopsis、雀麦属(Bromus)、野牛草属(Buchloe)、Bulbilis、拂子茅属(Calamagrostis)、Calamovilfa、Campulosus、Capriola、沿沟草属(Catabrosa)、Catapodium、Cathestecum、狼尾草属(Cenchropsis)、蒺藜草属(Cenchrus)、酸模芒属(Centotheca)、Ceratochloa、Chaetochloa、Chasmanthium、寒竹属(Chimonobambusa)、Chionochloa、虎尾草属(Chloris)、Chondrosum、Chrysopon、丘斯夸竹属(Chusquea)、Cinna、Cladoraphis、空轴茅属(Coelorachis)、薏苡属(Coix)、莎禾属(Coleanthus)、Colpodium、Coridochloa、Cornucopiae、蒲苇属(Cortaderia)、Corynephorus、Cottea、芒麦草属(Critesion)、隐花草属(Crypsis)、Ctenium、Cutandia、Cylindropyrum、香茅属(Cymbopogon)、狗牙根属(Cynodon)、洋狗尾草(Cynosurus)、Cytrococcum、鸭茅属(Dactylis)、龙爪茅属(Dactyloctenium)、扁芒草属(Danthonia)、Dasyochloa、Dasyprum、Davyella、牡竹属(Dendrocalamus)、发草属(Deschampsia)、Desmazeria、野青茅属(Deyeuxia)、Diarina、龙常草属(Diarrhena)、二型花属(Dichanthelium)、双花草属(Dichanthium)、Dichelachne、Diectomus、马唐属(Digitaria)、觿茅属(Dimeria)、Dimorpostachys、弯穗草属(Dinebra)、双稃草属(Diplachne)、Dissanthelium、Dissochondrus、Distichlis、镰序竹属(Drepanostachyum)、Dupoa、Dupontia、稗属(Echinochloa)、Ectosperma、皱稃草属(Ehrharta)、穇属(Eleusine)、Elyhordeum、Elyleymus、Elymordeum、Elymus、Elyonurus、Elysitanion、Elytesion、偃麦草属(Elytrigia)、九顶草属(Enneapogon)、肠须草属(Enteropogon)、Epicampes、画眉草属(Eragrostis)、蜈蚣草属(Eremochloa)、旱禾属(Eremopoa)、旱麦草属(Eremopyrum)、蔗茅属(Erianthus)、Ericoma、Erichloa、Eriochrysis、Erioneuron、类蜀黍属(Euchlaena)、Euclasta、黄金茅属(Eulalia)、拟金茅属(Eulaliopsis)、真穗草属(Eustachys)、箭竹属(Fargesia)、羊茅属(Festuca)、Festulolium、Fingerhuthia、Fluminia、耳稃草属(Garnotia)、Gastridium、Gaudinia、巨竹属(Gigantochloa)、甜茅属(Glyceria)、Graphephorum、Gymnopogon、Gynerium、球穗草属(Hackelochloa)、Hainardia、Hakonechloa、Haynaldia、Heleochloa、异燕麦属(Helictotrichon)、牛鞭草属(Hemarthria)、Hesperochloa、Hesperostipa、黄茅属(Heteropogon)、阴阳竹属(Hibanobambusa)、茅香属(Hierochloe)、Hilaria、绒毛草属(Holcus)、Homalocenchrus、大麦属(Hordeum)(例如大麦)、水包禾属(Hydrochloa)、膜稃草属(Hymenachne)、苞茅属(Hyparrhenia)、Hypogynium、猬草属(Hystrix)、距花黍属(Ichnanthus)、白茅属(Imperata)、箬竹属(Indocalamus)、柳叶箬属(Isachne)、鸭嘴草属(Ischaemum)、Ixophorus、溚草属(Koeleria)、Korycarpus、Lagurus、Lamarckia、Lasiacis、假稻属(Leersia)、千金子属(Leptochloa)、Leptochloopsis、Leptocoryphium、薄稃草属(Leptoloma)、Leptogon、细穗草属(Lepturus)、Lerchenfeldia、银穗草属(Leucopoa)、Leymostachys、赖草属(Leymus)、Limnodea、Lithachne、黑麦草属(Lolium)、Lophochlaena、Lophochloa、Lophopyrum、Ludolfia、Luziola、Lycurus、Lygeum、Maltea、Manisuris、Megastachya、臭草属(Melica)、糖蜜草属(Melinis)、Mibora、小草属(Microchloa)、Microlaena、莠竹属(Microstegium)、粟草属(Milium)、芒属(Miscanthus)、毛俭草属(Mnesithea)、麦氏草属(Molinia)、Monanthochloe、Monerma、Monroa、乱子草属(Muhlenbergia)、Nardus、Nassella、Nazia、Neeragrostis、Neoschischkinia、Neostapfia、类芦属(Neyraudia)、Nothoholcus、Olyra、Opizia、求米草属(Oplismenus)、Orcuttia、稻属(Oryza)(例如水稻)、落芒草属(Oryzopsis)、刚竹属(Otatea)、Oxytenanthera、Panicularia、黍属(Panicum)、冠芒草属(Pappophorum)、假牛鞭草属(Parapholis)、Pascopyrum、类雀稗属(Paspalidium)、雀稗属(Paspalum)、狼尾草属(Pennisetum)(例如稷)、鹬草属(Phalaris)、Phalaroides、Phanopyrum、Pharus、Phippsia、梯牧草属(Phleum)、Pholiurus、芦苇属(Phragmites)、刚竹属(Phyllostachys)、Piptatherum、Piptochaetium、大明竹属(Pleioblastus)、Pleopogon、Pleuraphis、Pleuropogon、早熟禾属(Poa)、Podagrostis、棒头草属(Polypogon)、Polytrias、新麦草属(Psathyrostachys)、Pseudelymus、拟鹅观草属(Pseudoroegneria)、茶秆竹属(Pseudosasa)、细柄茅属(Ptilagrostis)、碱茅属(Puccinellia)、Pucciphippsia、Redfieldia、Reimaria、Reimarochloa、Rhaphis、Rhombolytrum、红毛草属(Rhynchelytrum)、鹅观草属(Roegneria)、Rostraria、筒轴茅属(Rottboellia)、Rytilix、甘蔗属(Saccharum)、囊颖草属(Sacciolepis)、赤竹属(Sasa)、东笆竹属(Sasaella)、华箬竹属(Sasamorpha)、Savastana、Schedonnardus、齿稃草属(Schismus)、裂稃茅属(Schizachne)、裂稃草属(Schizachyrium)、葸劳竹属(Schizostachyum)、硬草属(Sclerochloa)、Scleropoa、Scleropogon、水茅属(Scolochloa)、Scribneria、黑麦属(Secale)(例如黑麦)、业平竹属(Semiarundinaria)、Sesleria、狗尾草属(Setaria)、倭竹属(Shibataea)、Sieglingia、箭竹属(Sinarundinaria)、唐竹属(Sinobambusa)、慈竹属(Sinocalamus)、Sitanion、Sorghastrum、高粱属(Sorghum)、米草属(Spartina)、Sphenopholis、大油芒属(Spodiopogon)、鼠尾栗属(Sporobolus)、Stapfia、Steinchisma、钝叶草属(Stenotaphrum)、针茅属(Stipa)、针禾属(Stipagrostis)、Stiporyzopsis、Swallenia、Syntherisma、带芒草属(Taeniatherum)、Terrellia、Terrelymus、筱竹属(Thamnocalamus)、菅属(Themeda)、偃麦草属(Thinopyrum)、蒭雷草属(Thuarea)、粽叶芦属(Thysanolaena)、Torresia、Torreyochloa、Trachynia、Trachypogon、锋芒草属(Tragus)、Trichachne、三虎尾草属(Trichloris)、Tricholaena、Trichoneura、Tridens、Triodia、Triplasis、草沙蚕属(Tripogon)、磨擦草属(Tripsacum)、Trisetobromus、三毛草属(Trisetum)、小黑麦属(Triticosecale)、小麦属(Triticum)(例如小麦)、Tuctoria、Uniola、Urachne、Uralepis、尾稃草属(Urochloa)、Vahlodea、Valota、Vaseyochloa、Ventenata、香根草属(Vetiveria)、Vilfa、鼠茅属(Vulpia)、Willkommia、玉山竹属(Yushania)、玉米属(Zea)(例如玉米)、菰属(Zizania)、Zizaniopsis和结缕草属(Zoysia)。
分离的、重组的或转基因的植物的再生
可对通过植物转化技术得到的转化植物细胞以及从中得到的分离或重组植物细胞(包括以上所讨论的那些)进行培养，以再生出具有所需的基因型(即包含ACC合酶下调核酸)和/或因此具有所需的表型(例如改进的NUE和/或干旱耐受性表型，密度耐受性表型等)的整株植物。将可通过例如选择或筛选来鉴定的所需细胞在支持再生的培养基中进行培养。然后可让细胞成熟成为植物。例如，这种再生技术可依赖于操纵组织培养生长培养基中的某些植物激素，通常依赖于已与所需的核苷酸序列一起引入到植物中的杀生物剂和/或除草剂标志物。或者，可针对ACC合酶下调核酸序列所赋予的ACC合酶表达和/或活性的下调、乙烯生成的下降等筛选细胞、组织或植物。从培养的原生质体再生出植物，这在以下文献中有描述：Evans等人，(1983)Protoplasts Isolation and Culture，Handbook of PlantCell Culture，第124 176页，Macmillan Publishing Company，New York；Davey，(1983)Protoplasts，第12-29页，Birkhauser，Basal 1983；Dale，(1983)Protoplasts第31-41页，Birkhauser，Basel以及Binding(1985)Regenerationof Plants，Plant Protoplasts第21-73页，CRC Press，Boca Raton。也可从植物愈伤组织、外植体、器官或其部分获得再生。Klee等人，(1987)Ann Revof Plant Phys 38：467-486中概述了这类再生技术。另参见例如Payne和Gamborg。有关玉米的转化和再生，参见例如第5,736,369号美国专利。
转化了植物表达载体的植物细胞可(例如)按照标准的植物组织培养技术从单个细胞、愈伤组织或叶圆片进行再生。本领域公知，几乎任何植物的各种细胞、组织和器官都可成功地进行培养以再生整株植物。从培养的原生质体再生出植物，这在以下文献中有描述：Evans等人，ProtoplastsIsolation and Culture，Handbook of Plant Cell Culture，Macmillilan PublishingCompany，New York，第124-176页(1983)以及Binding，Regeneration ofPlants，Plant Protoplasts，CRC Press，Boca Raton，第21-73页(1985)。
从叶外植体再生出含有通过农杆菌引入的外来基因的植物，可如Horsch等人，(1985)Science 227：1229-1231所述来实现。用农杆菌转化后，通常将外植体转移到选择培养基。技术人员会认识到，选择培养基取决于共转染到外植体中的选择性标志物。在这个程序中，使转化体在选择剂的存在下和在能诱导被转化的植物物种的苗的再生的培养基中生长，如Fraley等人，(1983)Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA，80：4803所述。这个程序通常在例如两到四个星期内产生苗，然后将这些转化体苗(长度通常为约1-2cm)转移到含有选择剂和用于防止细菌生长的抗生素的适当的根诱导培养基。通常在根和苗培养基中维持选择压力。
通常，转化体将在约1-2星期发育出根而形成小植株。在小植株高度达约3-5cm时，将它们放在纤维盆中的无菌土壤中。本领域技术人员会认识到，可使用不同的新环境适应程序来获得不同物种的转化植物。例如，在发育出根和苗后，将转化植物的插条(cutting)以及体细胞胚转移到培养基以建立小植株。有关转化植物的选择和再生的描述，参见例如Dodds和Roberts，(1995)Experiments in Plant Tissue Culture，第3版，CambridgeUniversity Press。转基因植物可以是能繁殖的或者不能繁殖的。
从单纯植物原生质体或者从各种外植体再生出植物，这是本领域公知的。参见例如Methods for Plant Molecular Biology，Weissbach和Weissbach编辑，Academic Press，Inc.，San Diego，Calif.(1988)。这个再生和生长过程包括以下步骤：选择转化体细胞和苗，使转化体苗生根，在土壤中生长小植株。对于玉米细胞培养和再生，主要参见The Maize Handbook，Freeling和Walbot编辑，Springer，NY(1994)；Corn and Corn Improvement，第3版，Sprague和Dudley编辑，American Society of Agronomy，Madison，WI(1988)。
技术人员会认识到，在重组表达盒稳定掺入在转基因植物中并确认有效后，可通过有性杂交将它引入到其他植物中。取决于要杂交的物种，可使用多种标准的育种技术中的任何一种。
在无性繁殖的作物中，可通过获取插条或者通过组织培养技术来繁殖成熟的转基因植物以产生多个相同的植株。可对合乎需要的转基因植株作出选择，并以无性方式获得和繁殖新的品种以供商业用途。在种子繁殖的作物中，可将成熟的转基因植物进行自花传粉以产生纯合的近交植物。近交植物会产生含有新引入的异源核酸的种子。可使这些种子生长以产生出会产生选定的表型的植物。也可将成熟的转基因植物与其他适当的植物进行杂交，通常是另一种近交或杂种植物，包括例如同基因的未转化的近交植物。
从再生的植物获得的部分，如花、种子、叶子、枝条、果实等，被本发明所涵盖，前提是这些部分具有包含下调构建体或其功能片段的细胞。再生的植物的后代和变体和突变体也包括在本发明的范围内，前提是这些植物包含下调构建体或其功能片段。
可例如通过标准的免疫印迹和DNA检测技术，针对下调构建体的转播对表达选择性标志物的转基因植物进行筛选。通常也可评估转基因植株的异源核酸表达水平。最初可在RNA水平上测定表达，以鉴定和定量表达阳性植物。可采用标准的RNA分析技术，它们包括使用被设计来仅扩增异源RNA模板的寡核苷酸引物的PCR扩增测定法，和使用异源核酸特异性探针的溶液杂交测定法。另外，可使用异源核酸特异性寡核苷酸探针按照标准的方案进行原位杂交和免疫细胞化学分析，以定位转基因组织内的表达部位。通常，可针对所掺入的核酸对多个转基因植株进行筛选，以鉴定和选择具有最适当的表达谱的植物。
一些实施方案包括对于所添加的异源核酸而言纯合的转基因植物；即在染色体对的每个染色体上的相应基因座含有两个添加的核酸序列的转基因植物。纯合的转基因植物可如下获得：将含有单个添加的异源核酸的杂合(亦称半合)转基因植物进行有性交配(自交)，使一些所产生的种子发芽，并分析所产生得到的植株相对于对照植物而言的本发明多核苷酸的表达改变。还设想到与亲本植株的回交，以及与非转基因植株或者与相同性状或别的性状的转基因植株的远交。
还预期到，转化的植物将用于传统育种方案，包括第5,706,603号美国专利和第5,704,160号美国专利中所公开的TOPCROSS授粉系统，每个专利的公开内容都以引用方式并入本文。
除了Berger、Ausubel和Sambrook之外，对于植物细胞克隆、培养和再生有用的一般参考资料包括Jones编辑(1995)Plant Gene Transfer andExpression Protocols-Methods in Molecular Biology，Volume 49 Humana PressTowata NJ；Payne等人，(1992)Plant Cell and Tissue Culture in LiquidSystems，John Wiley & Sons，Inc.New York，NY(Payne)以及Gamborg和Phillips编辑(1995)Plant Cell，Tissue and Organ Culture；Fundamental MethodsSpringer Lab Manual，Springer-Verlag(Berlin Heidelberg New York)(Gamborg)。在Atlas和Parks编辑，The Handbook of Microbiological Media(1993)CRC Press，Boca Raton，FL(Atlas)中描述了多种细胞培养基。有关植物细胞培养的更多信息在商业文献中可找到，如获自Sigma-Aldrich，Inc(St.Louis，MO)的Life Science Research Cell Culture Catalogue(1998)(Sigma-LSRCCC)，和例如同样获自Sigma-Aldrich，Inc(St Louis，MO)的PlantCulture Catalogue and supplement(1997)(Sigma-PCCS)。有关植物细胞培养的另外细节在Croy编辑，(1993)Plant Molecular Biology Bios ScientificPublishers，Oxford，UK中可找到。
构建体和性状的“堆叠”
在某些实施方案中，可将本发明的核酸序列与所关注的其他多核苷酸序列组合(“堆叠”)使用，以便产生具有所需表型的植物。本发明的多核苷酸可与任何基因或基因组合进行堆叠，所产生的组合可包括任何一个或多个所关注的多核苷酸的多个拷贝。堆叠可通过分子堆叠或通过常规的育种方法进行。一个或多个转基因在ACS基因座的位点特异性整合也是可能的。所需的组合可影响一个或多个性状；也即，可产生某些组合以调节影响ACC合酶活性和/或乙烯生成的基因表达。可设计其他的组合以产生具有多种所需的性状的植物，包括但不限于对动物饲料而言理想的性状如高油基因(例如，第6,232,529号美国专利)；平衡的氨基酸(例如hordothionin类(第5,990,389号；第5,885,801号；第5,885,802号和第5,703,409号美国专利)；大麦高赖氨酸(Williamson等人，(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106和WO 98/20122)和高甲硫氨酸蛋白质(Pedersen等人，(1986)J.Biol.Chem.261：6279；Kirihara等人，(1988)Gene 71：359和Musumura等人，(1989)Plant Mol.Biol.12：123))；增加的消化性(例如经修饰贮藏蛋白(于2001年11月7日提交的系列号为10/053,410的美国申请)和硫氧还蛋白(于2001年12月3日提交的系列号为10/005,429的美国专利申请))，将上述文献的公开内容以引用的方式并入本文。本发明的多核苷酸还可与昆虫、病害或除草剂抗性所需的性状进行堆叠(例如苏芸金杆菌(Bacillus thuringiensis)毒蛋白(第5,366,892号、第5,747,450号、第5,737,514号、第5723,756号、第5,593,881号美国专利；Geiser等人，(1986)Gene 48：109)；凝集素(Van Damme等人，(1994)Plant Mol.Biol.24：825)；伏马毒素解毒基因(第5,792,931号美国专利)；无毒性和病害抗性基因(Jones等人，(1994)Science 266：789；Martin等人，(1993)Science 262：1432；Mindrinos等人，(1994)Cell 78：1089)；导致除草剂抗性的乙酰乳酸合酶(ALS)突变体，如S4和/或Hra突变；谷氨酰胺合酶的抑制剂，如草胺膦或basta(例如bar基因)和草甘膦抗性(EPSPS和/或草甘膦N-乙酰转移酶(GAT)基因；参见例如第7,462,481号、第7,531,339号、第7,405,075号、第7,666,644号第7,622,641号和第7,714,188号美国专利)；以及对加工或工艺产品而言理想的性状如高油(例如第6,232,529号美国专利)；经修饰的油(例如脂肪酸去饱和酶基因(第5,952,544号美国专利；WO 94/11516))；经修饰的淀粉(例如ADPG焦磷酸化酶(AGP酶)、淀粉合酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)和淀粉脱支酶(SDBE))和聚合物或生物塑料(例如第5,602,321号美国专利；β-酮硫解酶、聚羟基丁酯合酶和乙酰乙酰辅酶A还原酶(Schubert等人，(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847)有利于聚羟基链烷酸酯(PHAs)的表达)，将上述文献中的公开内容以引用的方式并入本文。还可以将本发明的多核苷酸与影响诸如雄性不育(例如参见第5.583,210号美国专利)、茎秆强度、开花时间之类的农艺性状或者诸如细胞周期调控或基因打靶(例如WO 99/61619、WO 00/17364、WO99/25821)之类的转化技术性状的多核苷酸组合，以上专利的公开内容以引用的方式并入本文。
例如，除了ACS下调表达盒(其可以是ACS6下调表达盒)之外，堆叠组合可包括一个或多个提供以下的一项或多项的表达盒：对靶向繁殖组织的ABA感觉/应答的调节(例如驱动拟南芥ABI1突变体的eep1启动子；参见第2004/0148654号美国专利公开说明书)；对细胞分裂素表达或活性的调节(参见例如第2009/0165177号美国专利公开说明书和第6,992,237号美国专利)；对顺式-异戊烯基转移酶表达或活性的调节(参见例如第6,645,747号和第7,273,737号美国专利)；对纤维素合酶的调节(参见例如第7,214,852号和第7,524,933号美国专利)。在这些堆叠中的一个或多个中，ACS下调表达盒可包含组织偏好的启动子(参见例如第2009/0307800号美国专利公开说明书公开的eep5启动子或者第2004/0237147号美国专利公开说明书中公开的eep1启动子)。
这些堆叠的组合可通过任何方法来产生，包括但不限于通过任何常规方法或顶交(TopCross)方法或遗传转化来对植物进行杂交育种。如果性状是通过遗传转化植株来堆叠，则所关注的多核苷酸序列可在任何时间以任何顺序进行组合。例如，可将包括一种或多种期望性状的转基因植物用作靶标，通过后续的转化引入更多性状。可以用共转化规程将性状与目的多核苷酸同时引入，所述多核苷酸由转化盒的任何组合提供。例如，如果将引入两条序列，则可将该两条序列包含在单独的转化盒中(反式)或包含在同一转化盒中(顺式)。所关注的序列的表达可由相同的启动子或由不同的启动子来驱动。在某些实例中，可能合乎需要的是引入会抑制所关注的多核苷酸的表达的转化盒。这可伴随其他抑制盒或超表达盒的任何组合以在植物中产生所需的特性组合。
在育种方法中的应用
本发明的转化植物可用于植物育种方案中。植物育种的目的是在单个品种或杂种中组合多种期望的性状。对于田地作物，这些性状可包括例如对病害和昆虫的抗性、对热和干旱的耐受性、减少作物成熟的时间、较高产量和更好的农艺品质。随着对许多作物的机械化采收，诸如萌发和建植(stand establishment)、生长速率、成熟度以及植株和穗高之类的植物特性的均匀性是所期望的。传统的植物育种是开发新的和改良的商品作物的重要工具。本发明涵盖通过将第一亲本玉米植株与第二亲本玉米植株进行杂交来产生玉米植株的方法，其中所述亲本玉米植株中的一者或两者是如本文所述表现出干旱耐受性表型、不育表型、密度耐受性表型等的转化植物。
本领域知道的和玉米植株育种方案中使用的植物育种技术包括但不限于轮回选择、批量选择(bulk selection)、混合选择、回交、谱系培育、自由授粉育种、限制性片段长度多态性增强的选择、遗传标志物增强的选择、双单倍体和转化。往往使用这些技术的组合。
玉米植株育种方案中玉米杂种的开发，一般需要纯合近交系的开发、这些近交系的杂交和杂交的评估。有许多分析方法可供评估杂交的结果。最古老和最传统的分析方法是观察表型性状。或者，可检查植物的基因型。
已用转化技术工程转入特定的玉米植株中的遗传性状，可用植物育种领域公知的传统育种技术转移到另一株系中。例如，常常使用回交方法来将转基因从转化的玉米植株转移到良种近交系，所得的后代将包含该转基因。另外，如果将近交系用于转化，则可将转基因植物与另一不同的近交系杂交以产生转基因杂种玉米植株。视上下文而定，本文所用的“杂交”可指简单的XY杂交或者指回交过程。
玉米植株育种方案中玉米杂种的开发涉及以下三个步骤：(1)从各种种质库选择植物进行初始育种杂交；(2)将从育种杂交选择的植物自交数代以产生一系列的自交系，这些自交系虽然各不相同，但却是纯育的和高度纯合的；(3)将选定的自交系与不同的自交系杂交以产生杂种。在玉米的近交处理期间，品系的活力降低。当将两种不同的近交系杂交以产生杂种时，活力恢复。自交系的纯合性和同质性的重要后果是，通过将确定的(defined)一对近交系进行杂交而产生的杂种往往将是相同的。一旦鉴定出能产生优异杂种的近交系，可将杂种种子无限期地繁殖，只要近交亲本的同质性得到保持。
本发明的转基因植物可用于产生例如单交杂种、三交杂种或双交杂种。当使两个近交系杂交以产生F1子代时，产生出单交杂种。四个近交系成对杂交(A×B和C×D)，然后两个F1杂种再杂交((A×B)与(C×D))，则产生双交杂种。三个近交系中的两个近交系进行杂交(A×B)，然后所得的F1杂种与第三个近交系进行杂交((A×B)×C)，则产生三交杂种。下一代(F2)中失去了F1杂种所表现出的杂种活力和均匀性的大部分。因此，将杂种所产生的种子消费掉而不是种植。
用于调节干旱耐受性或其他性状的试剂盒
本发明的某些实施方案可任选作为试剂盒提供给使用者。例如，本发明的试剂盒可含有本文所述的一个或多个核酸、多肽、抗体、诊断用核酸或多肽例如抗体、探针组例如cDNA微阵列、一个或多个载体和/或细胞系。试剂盒常常包装在合适的容器中。试剂盒通常还包含一种或多种另外的试剂，例如底物、用于标记表达产物的标记物、引物等，管子和/或其他附件、用于收集样品的试剂、缓冲液、杂交室、盖玻片等。试剂盒任选还包括说明书或用户手册，详细说明使用试剂盒组件来发现或应用基因集(gene set)的优选方法。当按照说明书使用时，试剂盒可例如用于评估植物样品中的表达或多态性，例如评估ACC合酶活性、乙烯生成、密度抗性潜力、不育性等。或者，可按照说明书使用试剂盒以使用至少一条ACC合酶多核苷酸序列来调节植物的干旱耐受性。
作为另一个实例，试剂盒包括容器，该容器含有至少一条包含核酸序列的多核苷酸序列，其中该核酸序列与SEQ ID NO：1、2、3或4或者其亚序列或者其互补序列具有例如至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％、约99.5％或更高的同一性。该试剂盒任选还包括有关在植物中使用该至少一条多核苷酸序列的说明资料。
其他核酸和蛋白质测定法
在本发明的情形中，按照公知的分子生物学方法操作核酸和/或蛋白质。许多这种方法的详细方案在例如以下文献中有描述：Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(补遗至2004年)John Wiley & Sons，New York(“Ausubel”)；Sambrook等人，Molecular Cloning--A LaboratoryManual(第2版)，第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，NY，(1989)(“Sambrook”)以及Berger和Kimmel，Guide toMolecular Cloning Techniques，Methods in Enzymology，第152卷，Academic Press，Inc.，San Diego，CA(“Berger”)。
除了以上参考文献之外，有关可用于例如扩增本发明多核苷酸的体外扩增技术如聚合酶链反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、Qβ-复制酶扩增和其他RNA聚合酶介导技术(例如NASBA)的方案，在以下文献中可找到：Mullis等人，(1987)第4,683,202号美国专利；PCR Protocols A Guideto Methods and Applications(Innis等人编辑)Academic Press Inc.San Diego，CA(1990)(“Innis”)；Arnheim和Levinson，(1990)C&EN 36；The JournalOf NIH Research(1991)3：81；Kwoh等人，(1989)Proc Natl Acad Sci USA86：1173；Guatelli等人，(1990)Proc Natl Acad Sci USA 87：1874；Lomell等人，(1989)J Clin Chem 35：1826；Landegren等人，(1988)Science241：1077；Van Brunt，(1990)Biotechnology 8：291；Wu和Wallace，(1989)Gene 4：560；Barringer等人，(1990)Gene 89：117以及Sooknanan和Malek，(1995)Biotechnology 13：563。可用于在本发明情形中克隆核酸的另外的方法包括Wallace等人，第5,426,039号美国专利。改进的通过PCR扩增大核酸的方法在Cheng等人，(1994)Nature 369：684及其中的参考文献中概述。
本发明的某些多核苷酸可利用各种涉及基于单核苷酸和/或基于三核苷酸的亚磷酰胺偶联化学的固相策略来合成。例如，可通过相续添加活化的单体和/或三聚体以延伸多核苷酸链，来合成核酸序列。参见例如Caruthers等人，(1992)Meth Enzymol 211：3。代替合成所需的序列的是，几乎任何核酸都可从多个商业来源中的任何一个定制，所述商业来源例如The MidlandCertified Reagent Company(mcrcoligos.com)(Midland，TX)、The GreatAmerican Gene Company(www.genco.com)(Ramona，CA)、ExpressGen，Inc.(www.expressgen.com)(Chicago，IL.)、Operon Technologies，Inc.(www.operon.com)(Alameda，CA)及许多其他商业来源。
表1：序列标识
Figure BPA00001530551000561
实施例
提供以下实施例以说明而不是限制所要求保护的本发明。
实施例1：
蛋白质提取
对于总蛋白质分离，在指定的时间收集玉米叶子，在液氮中急冻并研磨为细粉。将1ml提取缓冲液(20mM HEPES(pH 7.6)，100mM KCl，10％甘油)添加至大约0.1g冷冻粉末并彻底混合。将样品以10,000rpm离心10分钟，将上清液移至新试管并根据Bradford，(1976)的方法用分光光度法测定浓度。参见Bradford，(1976)Anal.Biochem.72：248-254。
叶绿素提取
将叶在液氮中冷冻并研磨成细粉。将大约0.1g样品移至1.5ml管并称重。用1ml(或0.8ml)的80％丙酮提取叶绿素5次。将各提取物合并，用另外的80％丙酮将最终体积调整为10ml(或15ml)。根据Wellburn，(1994)的方法用分光光度法测定叶绿素含量(a+b)。参见Wellburn，(1994)J.Plant Physiol.144：307-313。
光合作用的测量
将植物在正常和干旱胁迫条件下的田间栽培。在正常条件下，给植物浇水，水量足以获得最佳的生长和产量。对于干旱胁迫植物，在授粉前大约一周开始并继续至授粉后三周的时间段内可限制水。在限制水供应的时间段内，受干旱胁迫的植物可能显示出萎蔫和卷叶的可见迹象。胁迫的程度可相对于在良好浇灌的条件下获得的产量按产量下降百分数计算。用便携式TPS-1光合系统(PP Systems，Amesbury，MA)测定蒸腾作用、气孔导度和CO2同化。例如在授粉后四十天，可测量植物上的每片叶子。数值通常以六次测定的平均值表示。
DNA和RNA纯化
对于总核酸分离，在所需的时间收集玉米叶子，在液氮中急冻并研磨为细粉。加入十毫升提取缓冲液(100mM Tris(pH 8.0)，50mM EDTA，200mM NaCl，1％ SDS，10μl/ml β-巯基乙醇)，充分混合直到解冻。添加10ml的苯酚/氯仿(1∶1，vol∶vol)并充分混合。将样品以8,000rpm离心10分钟，将上清液移至新的管并在-20℃下使核酸沉淀，然后添加1/10体积的3M乙酸钠和1体积的异丙醇。通过在8,000rpm下离心使总核酸沉淀，并将沉淀再悬浮于1ml TE中。将该制备物的一半用于DNA纯化，剩余的一半用于RNA纯化。或者，可将1cm2的籽苗叶子在液氮中急冻并研磨为细粉，从中提取DNA或总核酸。添加600μl的提取缓冲液[100mM Tris(pH8.0)，50mM EDTA，200mM NaCl，1％ SDS，10μl/ml β-巯基乙醇]并混合样品。将样品用700μl苯酚/氯仿(1∶1)提取，在12,000rpm下离心10分钟。DNA被沉淀下来，然后将其重悬在600μl H2O中。
对于DNA纯化，向管中加入500μg无DNA酶的RNA酶，在37℃下温育1小时。RNA酶消化后，加入等体积的苯酚/氯仿(1∶1，vol∶vol)，充分混合。将样品以10,000rpm离心10分钟，将上清液移至新的管并在添加1/10体积3M乙酸钠和1体积异丙醇后使DNA在-20℃下沉淀。将DNA再悬浮于无菌水中并通过分光光度法测定浓度。为了确定DNA完整性，将20mg DNA在1.8％琼脂糖凝胶上分离并在用溴化乙锭染色后显影。
根据Sambrook等人(同上)描述的方法通过2轮LiCl2沉淀来纯化RNA。
实时RT-PCR分析
将50μg总RNA用RQ1TMDNA酶(Promega)处理以确保不存在污染性DNA。将2μg总RNA直接用于cDNA合成，该合成使用OmniscriptTM逆转录试剂盒(Qiagen)，以oligo-dT(20)作为引物。
用QuantiTectTM SYBR Green PCR试剂盒(Qiagen)完成对转录物丰度的分析。反应含有1X缓冲液、0.5μl逆转录反应物(相当于50ng总RNA)和0.25μM(终浓度)正向引物和反向引物，总反应体积为25μl。
在如下条件下用ABI PRISM 7700序列检测系统进行反应：95℃/15分钟)(1个循环)；95℃/30秒，62℃/30秒，72℃/2分钟(50个循环)；72℃/5分钟(1个循环)。将每种基因分析最少四次。
将各个引物组合最初在琼脂糖凝胶上跑胶并显影以确认正确大小的单一产物的存在。将扩增产物亚克隆进Easy载体系统(Promega)中以用于产生标准曲线，以便将表达数据换算为拷贝/μg RNA。
乙烯测定
可从叶子测量乙烯，如4叶阶段的籽苗的第二完全展开的叶片或者授粉后20、30或40天(DAP)的植物的叶片的末端15cm。在指定的时间收获叶片并让其在湿润的纸巾之间恢复2小时后再收集乙烯。将叶片置于玻璃小瓶中并用橡胶隔片盖上。温育3至4小时后，从每个小瓶取0.9mL顶空气体样品。
可在授粉后的14、21、27和29天(DAP)四个时间点从发育的籽粒测量乙烯。收获籽粒并在循环良好的空气中温育2小时，以释放出任何胁迫乙烯。然后将籽粒放在5mL玻璃小瓶中，立即用气密性subaseal塞子或者crimp tops进行密封，然后将小瓶在暗处在28C下温育24小时。在这个温育之后，从每个小瓶取0.2mL顶空气体样品。
使用带FID检测的GC6890系列气相色谱系统(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)，用以下参数测量乙烯含量：柱子J&W多孔层开口管柱(PLOT)，具有HP-AL/M固定相；尺寸50m×0.535mm×15μm；炉温75℃等温；运行时间2分钟；注射器250℃不分流，压力22psi。所用的标准品获自Praxair(Danbury，CT)，为处于空气平衡的10ppm、50ppm和100ppm乙烯。检测极限(LOD)大约为0.1ppm；定量极限(LOQ)大约为0.5ppm。
蛋白质印记分析
在指定的时间收集叶片并在液氮中研磨为细粉。将1ml提取缓冲液[20mM HEPES(pH 7.6)，100mM KCl，10％甘油，1mM PMSF]添加至大约0.1g冷冻粉末并充分混合。通过在10,000rpm下离心10分钟使细胞碎片沉淀，并如所描述的(Bradford，1976)测定蛋白质浓度。从Tadahiko Mae博士(东北大学，日本仙台)获得针对水稻Rubisco的大亚基的抗血清。用标准SDS-PAGE解析蛋白质提取物并通过电印迹将蛋白质转移至0.22μm硝化纤维膜。转移后，将膜在TPBS(0.1％
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20，13.7mM NaCl，0.27mM KCl，1mM Na2HPO4，0.14mM KH2PO4)中的5％牛奶、0.01％乙基汞硫代水杨酸钠中封闭，然后与一抗温育1.5小时，该一抗通常在具有1％牛奶的TPBS中1∶1000至1∶2000稀释。然后将印迹用TPBS洗涤两次，与稀释到1∶5000至1∶10,000的山羊抗兔辣根过氧化物酶缀合抗体(SouthernBiotechnology Associates，Inc.)温育1小时。将印迹用TPBS洗涤两次，然后通常在1至15分钟之间用化学发光(Amersham Corp)检测信号。
实施例2：通过发夹RNA表达实现ACC合酶下调
如前所指出，可通过引入设定用来实现RNA沉默或干扰的ACC合酶多核苷酸序列来修饰植物细胞和植物。本实施例描述用于修饰例如玉米中的乙烯生成、干旱耐受性、NUE、种子或生物量产量、密度耐受性或其他表型的发夹RNA表达盒。如前所指出，例如通过发夹RNA(hpRNA)表达实现ACC合酶的下调，可得到其中一个或多个ACC合酶表达降低(直到并包括无可检测的表达)的植物或植物细胞。
对一个或多个ACC合酶基因(例如ACC合酶启动子、其他非翻译区或编码区)有特异性hpRNA分子在植物中的表达，可通过RNA干扰改变诸如植物的乙烯生成、干旱耐受性、密度耐受性、种子或生物量产量和/或氮利用效率的表型。
本文所述的hpRNA构建体是通过将泛素启动子连接到ACS基因(如ACS6基因)的编码序列及其反向重复序列的一部分来产生。每个构建体用农杆菌介导的转化技术或者别的已知的转化方法转化到玉米中。用于制备所述构建体和转化玉米的核酸分子和方法是如之前所描述的和本领域知道的；参见例如本文的标题为“植物转化方法”、“其他核酸和蛋白质测定法”的章节和以下实施例“玉米的转化”。
靶向一个或多个ACC合酶基因(如ACS6编码序列)的hpRNA的表达，可得到不表现出对营养生长和繁殖生长的有害效应的玉米植株。包含这种hpRNA构建体(本发明的一种构建体)的质粒的序列在SEQ ID NO：3中提供。图6是代表性的表达盒的示意图；该表达盒序列在SEQ ID NO：7中提供。图1提供包含代表性表达盒的质粒的特征的清单。
实施例3：产量评估-季节1
对包含SEQ ID NO：4的序列的遗传背景1的转化植物评估在四个环境下的产量。八个重复样在环境1中在开花胁迫下种植；6个重复样在环境2中在灌浆胁迫下种植；6个重复样在环境3中在灌浆胁迫下种植；4个重复样在环境4中在雨养条件下种植。将产量与高度重复的构建体无效对照(CN)进行比较，该无效对照包含用该构建体转化的植物的非转基因分离子。数据示于图2-5中。
图2示出了本发明的转化植株在环境1中的开花胁迫下的产量。每根柱条表示一单独的转化事件。示出了转基因阴性分离子的平均产量(139蒲式耳/英亩)作为对照(CN)。总计74％的事件的标称产量比对照植株高。代表18个转基因事件的植株产量超过对照，P＜0.10。
图3示出了本发明的转化植株在环境2的灌浆胁迫下的产量。每根柱条表示一单独的转化事件。示出了转基因阴性分离子的平均产量(176蒲式耳/英亩)作为对照(CN)。十三个事件产量超过CN，P＜0.10。其中，八个事件还在开花胁迫下显示出显著的改善。
图4示出了本发明的转化植株(圆圈表示)以及用另选的ACS6下调载体转化的植株(正方形表示)在环境3的灌浆胁迫下的产量，以相对于对照的百分数表示。每个数据点表示一单独的转化事件。NS＝不显著。对照植株为批量(bulked)转基因阴性分离子。可以看出，相对于对照，64％的本发明事件具有显著较好的产量；仅17％的另选ACS6下调事件具有显著较好的产量。
图5示出了本发明的转化植株(圆圈表示)以及用另选的ACS6下调构建体转化的植株(正方形表示)在环境4的雨养条件下的产量，以相对于对照的百分数表示。每个数据点表示一单独的转化事件。NS＝不显著。对照植株为批量(bulked)转基因阴性分离子。可以看出，所有表现出统计学上显著的产量增加的数据点代表本文所公开的事件。此外，所有表现出统计学上显著的产量降低的数据点是含有另选的ACS6下调构建体的事件。
不想局限于任何具体理论，但还是认为本文所公开的构建体通过调节ACS表达而提供产量和其他表型性状的改进。例如，在ACS6发夹内包含内含子(例如Adh1内含子)可在有效的范围内调节ACS6下调。作为另外一种选择或者除此之外，本发明的构建体可影响其他基因例如ACS2和/或ACS3的表达。
实施例4：在氮限制条件下筛选Gaspe Bay Flint衍生的玉米品系
转基因植物将含有两或三剂量的带一剂量的GS3的Gaspe Flint-3(GS3/(Gaspe-3)2X或GS3/(Gaspe-3)3X)并将对显性转基因1∶1分离。转基因GS3xGaspe T1种子和它们各自的无效对照将种植在含有
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(一种商业盆栽培养基)的4英寸盆中，并每天用1mM KNO3生长培养基和用2mM(或更高的)KNO3生长培养基浇四次。在出苗后，对植株取样以确定哪些是转基因的，哪些是无效的。在花期，收获植株并在70℃炉中干燥72小时，测定苗和穗干重。对结果的统计显著性进行了分析。在与转基因无效对照相比时，转基因的表达得到在1mM KNO3下具有改进的氮利用效率的植株。生物量、绿色和/或开花期穗大小的提高表明NUE提高。
实施例5：NUE测定
将哥伦比亚生态型拟南芥(对照和转基因品系)的种子进行表面消毒(Sánchez等人，2002)，然后接种于含有0.8％(w/v)BactoTM-Agar(Difco)的Murashige和Skoog(MS)培养基上。将平板4℃下黑暗中温育3天以打破休眠(层积)，随后转移至20℃下处于16小时光照/8小时黑暗周期的生长室(Conviron，Manitoba，Canada)。平均光强度为120μE/m2/s。将籽苗培育12天，然后转移至装土壤的盆。如上所述，在生长室中，将盆栽植物在各个1.5英寸盆(Arabidopsis system；Lehle Seeds，Round Rock，TX，USA)中在无营养物质的土壤LB2
Figure BPA00001530551000621
200(Scott’s Sierra Horticultural Products，Marysville，OH，USA)中培育。给植物浇注基于Murashige和Skoog(无氮MS)培养基的营养溶液中的0.6或6.5mM硝酸钾。相对湿度保持在70％左右。十六至十八天后，收集植株苗评估生物量和SPAD(叶绿素)读数。
实施例6：蔗糖生长测定
拟南芥的哥伦比亚系获自拟南芥生物资源中心(Arabidopsis BiologicalResource Center(Columbus，OH))。对于早期分析(哥伦比亚和T3转基因系)，将种子用70％乙醇表面灭菌5分钟，然后用40％
Figure BPA00001530551000622
表面灭菌5分钟，然后用无菌去离子水清洗。将经表面灭菌的种子播到含有95mL无菌培养基的方形培养皿(25cm)上，该培养基的组成为：0.5 Murashige和Skoog(1962)盐(Life Technologies)和4％(w/v)phytagel(Sigma)。该培养基不含补充的蔗糖。将蔗糖以0.1％、0.5％和1.5％浓度添加至培养基。将各板垂直安排在塑料架子中，在4℃冷室中放置3天以使萌发同步。然后将具有经冷层积处理的种子的架子转移至生长室(Conviron，Manitoba，Canada)，日温和夜温分别为22和20℃。在从冷室移走(播种后3天)开始直到在第14天收获籽苗，在16小时光周期发育过程中将莲座型叶丛水平上(at the level of the rosette)的平均光强度保持在110mol/m2/sec1。拍取图像，测量根和苗的总鲜重。
实施例7：低氮籽苗测定方案
将转基因事件的种子分成转基因种子和无效种子。对每一区组54盆(以6行9列布置)作两种不同的随机处理分配，对全部处理采用9次重复。在一种情况下，将相同构建体的5个事件的无效种子混合并用作对照，用于该区组中5个阳性事件的对比，从而在每个区组中构成6个处理组合。在第二种情况下，将3种转基因阳性处理和它们对应的无效处理随机分配给该区组的54个盆，从而对每一区组产生6个处理组合，含有所有处理组合的9个重复。在第一种情况下，将转基因参数与批量(bulked)构建体无效对照进行比较；在第二种情况下，将转基因参数与相应的事件无效对照进行比较。在构建体中有10、15或20个事件的情况下，将这些事件分配成5个事件一组，对每一区组54盆计算方差，但在进行平均值比较前将各区组的区组无效平均值汇集起来。
将每种处理的两粒种子在8英寸错列中心台上的含有MVP的4英寸见方的盆中种植，每天用含有如下营养物质的溶液浇四次：
1mM CaCl2    2mM MgSO4     0.5mM KH2PO4     83ppm Sprint330
3mM KCl      1mM KNO3      1uM ZnSO4        1uM MnCl2
3uM H3BO4    1uM MnCl2     0.1uM CuSO4      0.1uM NaMoO4
出苗后，将植株稀疏至每盆一粒种子。在种植后18天收获籽苗。在收获时，从盆中移取植株，从根部洗去Turface。将根从苗分离，置于纸袋中并在70℃下干燥70小时。将干燥的植物部分(根和苗)称重并置于带有大约20个5/32英寸的钢球的50ml锥形管中，并通过在涂料振荡器中振荡进行研磨。将大约30mg的磨碎的组织在2ml的20％ H2O2和6M H2SO4中在170℃下水解30分钟。冷却后，将水添加至20ml，充分混合，移出50μl的等分试样并添加至950μl 1M Na2CO3。通过将100μl该溶液置于96孔板的各个孔中然后添加50μl OPA溶液，将该溶液中的氨用于估计总还原植物氮。测定荧光(激发＝360nM/发射＝530nM)并将其与溶解于类似溶液并用OPA溶液处理的NH4Cl标准品比较。
OPA溶液-5ul巯基乙醇+1ml OPA储备溶液
将OPA储备溶液-50mg邻苯二醛(OPA-Sigma #P0657)溶于1.5ml甲醇+4.4ml 1M硼酸盐缓冲液pH9.5(3.09g H3BO4+1g NaOH于50ml水中)+0.55ml 20％ SDS
测量以下参数，用t检验将平均值与无效平均参数进行比较：总植物生物量、根生物量、苗生物量、根/苗比、植物氮浓度、总植物氮。
采用最近邻计算法以及通过采用完全随机设计(CRD)模型的方差分析，计算每个区组内的方差。通过将总体区组处理均方除以总体区组误差均方，利用F统计计算每个区组的总体处理效应。
实施例8：玉米的转化
生物弹击法
可通过粒子轰击将载体内所含的多核苷酸转化到胚发生玉米愈伤组织中，Tomes等人，Plant Cell，Tissue and Organ Culture：Fundamental Methods，Gamborg和Phillips编辑，第8章，第197-213页(1995)中对此作了总体描述，在下文中也有简述。可通过用缔合DNA质粒的钨粒子轰击胚发生响应性未成熟胚来产生转基因玉米植株。质粒通常包含选择性标志物和结构基因，或者选择性标志物和ACC合酶下调多核苷酸序列或亚序列等。
粒子的制备
将15mg钨粒子(General Electric)，0.5至1.8μ，优选1至1.8μ，最优选1u，添加至2ml浓硝酸。将这个悬浮液在0℃下超声处理20分钟(450型Branson Sonifier，40％输出功率，恒定负载循环)。通过以10000rpm离心(Biofuge)将钨粒子沉淀一分钟，移除上清液。将两毫升无菌蒸馏水添加至沉淀物，简单进行超声处理以使粒子再次悬浮。使该悬浮液沉淀，将一毫升无水乙醇添加至该沉淀物并简单进行超声处理以使粒子再次悬浮。用无菌蒸馏水再对粒子进行冲洗、离心沉淀并再悬浮两次，最后将粒子再悬浮于两毫升无菌蒸馏水中。将粒子细分成250μl等分试样并冷冻保存。
粒子-质粒DNA缔合物的制备
将钨粒子的原液在水浴超声波仪(450型Branson Sonifier，20％输出功率，恒定负载循环)中简单进行超声处理，然后将50μl转移至微量离心管。载体通常是同域的(cis)：即选择性标志物和所关注的基因(或其他多核苷酸序列)处于同一质粒上。
将质粒DNA添加至所述粒子，最终的DNA量为0.1至10μg，总体积为10μL，简单进行超声处理。优选地，将10μg(TE缓冲液中1μg/μL)总DNA用来混合DNA和粒子以进行轰击。添加五十微升(50μL)2.5M CaCl2无菌水溶液，将混合物短暂超声处理并涡旋。添加二十微升(20μL)0.1M亚精胺无菌水溶液，将混合物短暂超声处理并涡旋。将混合物在室温下温育20分钟，伴随间歇的短暂超声处理。将粒子悬浮液离心并移除上清液。将二百五十微升(250μL)无水乙醇添加至所得沉淀物，然后短暂超声处理。将悬浮液离心沉淀，移除上清液并添加60μl无水乙醇。将悬浮液短暂超声处理，然后将粒子-DNA附聚物加载至巨载体(macrocarrier)上。
组织的制备
玉米品种高型II(High Type II)的不成熟胚是粒子轰击介导的转化的靶标。此基因型是两个纯种遗传系即亲本A和B的F1，由两个已知的玉米近交系A188和B73杂交得到。按照Armstrong等人，(1991)MaizeGenetics Coop.News 65：92，针对高度的体细胞胚发生能力对两个亲本进行选择。
将来自F1植株的穗自交或同胞杂交(sibbed)，并在盾片开始变得不透明时将胚从发育中的颖果无菌切取出来。这个阶段在授粉后约9-13天，最通常授粉后约10天发生，这取决于生长条件。胚为约0.75-1.5毫米长。用20％-50％
Figure BPA00001530551000651
对穗进行表面灭菌30分钟，然后用无菌蒸馏水清洗三次。
在胚发生诱导培养基上以盾片取向朝上培养未成熟胚，该培养基包含N6基础盐、Eriksson维生素、0.5mg/l硫胺素、30g/ml蔗糖、2.88g/ml L-脯氨酸、1mg/l 2，4-二氯苯氧乙酸、2g/ml
Figure BPA00001530551000652
和8.5mg/l AgNO3。Chu等人，(1975)Sci.Sin.18：659；Eriksson，(1965)Physiol.Plant 18：976。将该培养基通过在121℃下高压灭菌15分钟进行灭菌，然后分配进100×25mm培养皿中。将AgNO3过滤灭菌并添加至高压灭菌后的培养基。将组织在28℃下在完全黑暗中培养。约3至7天，最通常约4天后，胚的盾片膨胀至其初始大小的两倍，盾片的胚根鞘表面的隆起指示胚发生组织的开始。最高达100％的胚显示出这个响应，但最通常是，胚发生响应频率为约80％。
当观察到胚发生响应时，将胚转移至由经改进而含有120g/ml蔗糖的诱导培养基构成的培养基。将胚定向，使胚根鞘轴(胚发生响应组织)从培养基朝上。每个培养皿有十个胚放置在培养皿中央直径约2cm的区域中。就在用与质粒DNA缔合的粒子轰击之前，将胚在28℃下在完全黑暗中保持在这个培养基上3至16小时，优选4小时。
为了实现对胚的粒子轰击，用DuPont PDS-1000粒子加速装置加速所述粒子-DNA附聚物。将粒子-DNA附聚物进行短暂超声处理，将10μl沉积于聚载体上，让乙醇蒸发。通过使聚合物隔膜(可裂膜圆片(rupturedisk))破裂将聚载体加速至不锈钢阻挡屏上。通过加压氦气实现破裂。根据可裂膜圆片破裂压力确定粒子-DNA加速的速度。使用200至1800psi的可裂膜圆片压力，650至1100psi是优选的，约900psi是最高度优选的。将多个圆片用于实现一系列破裂压力。
将装有带胚的平板的搁架放置在巨载体平台的底部下面5.1cm(3号搁架)。为了实现对培养的未成熟胚的粒子轰击，将可裂膜圆片和具有干燥的粒子-DNA附聚物的巨载体安装于该装置中。将传递至该装置的氦气压力调节至比可裂膜圆片破裂压力高200psi。将带靶标胚的培养皿放置进真空室内，并定位在加速粒子的弹射途径中。在该室中产生真空，优选约28英寸汞柱。在操作该装置后，释放真空，移出培养皿。
在轰击过程中以及随后的1至4天，使受轰击的胚保持在渗透压调节培养基上。将胚转移至选择培养基，该选择培养基由如下组分构成：N6基础盐、Eriksson维生素、0.5mg/l硫胺素、30g/ml蔗糖、1mg/l 2，4-二氯苯氧乙酸、2g/ml
Figure BPA00001530551000661
0.85mg/l Ag NO3和3mg/l双丙氨膦(Herbiace，Meiji)。双丙氨膦是过滤灭菌添加。以10至14天的间隔将胚分培至新鲜的选择培养基。约7周后，推定转化了选择性和非选择性标志物基因两者的胚胎发生组织从一部分经轰击的胚增殖出来。救援推定的转基因组织，源于各单独胚的组织被视为事件并使其在选择培养基上独立地繁殖。通过视觉选择组织化的(organized)胚发生组织的最小连续片段来实现两个克隆繁殖周期。
处理来自每个事件的组织样品以回收DNA。将DNA用限制性内切核酸酶进行限制性酶切并用引物序列探测，所述引物序列设计用于扩增重叠质粒的ACC合酶和非ACC合酶部分的DNA序列。将具有可扩增序列的胚发生组织发育(advance)至植物再生。
为了再生转基因植物，将胚发生组织分培至100×25mm培养皿中的包含MS盐和维生素(Murashige和Skoog，(1962)Physiol.Plant 15：473)、100mg/l肌醇、60g/ml蔗糖、3g/ml
Figure BPA00001530551000671
0.5mg/l玉米素、1mg/l吲哚-3-乙酸、26.4ng/l顺式-反式-脱落酸和3mg/l双丙氨膦的培养基，于28℃下在黑暗中温育直至见到良好成形的、成熟的体细胞胚的发育。这要求约14天。良好成形的体细胞胚是不透明的且为奶油色的，由可辨认的盾片和胚芽鞘构成。将各胚分别分培至100×25mm培养皿中的包含MS盐和维生素、100mg/l肌醇、40g/ml蔗糖和1.5g/ml
Figure BPA00001530551000672
的发芽培养基，并在16小时光照：8小时黑暗光周期和40meinsteinsm-2sec-1(来自冷白色荧光管)下温育。约7天后，体细胞胚发芽并产生轮廓分明的苗和根。将各单独植株分培至125×25mm玻璃管中的发芽培养基以让植株进一步发育。将植物维持在16小时光照：8小时黑暗光周期和40meinsteinsm-2sec-1(来自冷白色荧光管)下。约7天后，植株良好确立，将其移植至园艺土壤使其茁壮并盆栽至商业温室土壤混合物中，在温室中栽培至性成熟。将优良近交系用作雄株以给再生的转基因植株授粉。
农杆菌介导
为进行农杆菌介导的转化，可采用Zhao等人在第WO 1998/32326号PCT专利公开说明书中的方法，将该专利的内容以引用方式并入本文。简言之，从玉米分离不成熟胚，使胚与农杆菌的悬浮液接触(步骤1：感染步骤)。在该步骤中，优选将未成熟胚浸入农杆菌悬浮液中用于开始接种。将胚与农杆菌共培养一段时间(步骤2：共培养步骤)。优选地，在感染步骤之后，将未成熟胚在固体培养基上培养。在这个共培养期之后，可设想任选的“静息”步骤。在该静息步骤中，将胚在至少一种已知能抑制农杆菌生长的抗生素的存在下进行温育，不添加植物转化体的选择剂(步骤3：静息步骤)。优选将未成熟胚在固体培养基上与抗生素一起培养，但不加选择剂，用于消除农杆菌以及为了受感染细胞的静息期。接着，将接种的胚在含有选择剂的培养基上培养，回收生长的转化愈伤组织(步骤4：选择步骤)。优选地，将未成熟胚在固体培养基上与选择剂一起进行培养，从而导致转化细胞的选择性生长。然后将愈伤组织再生成植株(步骤5：再生步骤)，并优选将在选择性培养基上生长的愈伤组织在固体培养基上进行培养以再生出植株。
实施例9：在单子叶植物中表达转基因
构建出质粒载体，其包含优选的启动子和它所可操作地连接的包含ACC合酶多核苷酸序列或亚序列的分离多核苷酸。然后可通过以下程序将这个构建体引入到玉米细胞中。
从衍自玉米株系的杂交的发育中的颖果切取出不成熟玉米胚。在授粉后10-11天在胚为1.0-1.5mm长时将胚分离。然后将胚以轴侧朝下放置接触琼脂糖固化的N6培养基(Chu等人，(1975)Sci.Sin.Peking 18：659-668)。将胚在27℃下保持在暗处。从这些不成熟胚的盾片增生出由未分化的细胞团组成的脆性胚性愈伤组织，在胚柄结构上具有体细胞原胚状体和胚状体。从原代外植体分离的胚性愈伤组织可在N6培养基上进行培养并每隔2-3周在此培养基上分培。
可将质粒p35S/Ac(Hoechst Ag，德国法兰克福)或等同物用于转化实验以提供选择性标志物。此质粒含有编码草胺膦乙酰转移酶(PAT)的Pat基因(参见第0 242 236号欧洲专利公开说明书)。PAT酶赋予对除草的谷氨酰胺合成酶抑制剂如草胺膦的抗性。p35S/Ac中的pat基因处于来自花椰菜花叶病毒的35S启动子的控制下(Odell等人，(1985)Nature 313：810-812)并包含来自根瘤农杆菌的Ti质粒的T-DNA的胭脂氨酸合酶基因的3′区。
可使用粒子轰击方法(Klein等人，(1987)Nature 327：70-73)将基因转移至愈伤组织培养细胞。根据该方法，用以下技术给金粒子(直径1μm)包被上DNA。将10μg质粒DNA加至50μL的金粒子悬浮液(60mg/mL)。将氯化钙(50μL的2.5M溶液)和亚精胺游离碱(20μL的1.0M溶液)添加至该粒子。在加入这些溶液的过程中将悬浮液旋涡混合。10分钟后，将管子稍作离心(15,000rpm下5秒)，除去上清液。将粒子重悬于200μL的无水乙醇中，再次离心，除去上清液。再次进行乙醇清洗，将粒子重悬于最终体积30μL的乙醇中。可将包被DNA的金粒子的等分试样(5μL)置于Kapton飞碟(flying disc)(Bio-Rad Labs)的中央。然后用BiolisticTM PDS-1000/He生物射弹粒子递药系统(Bio-Rad Instruments，Hercules CA)，以1000psi的氦压力、0.5cm的间隙距离和1.0cm的飞行距离，将粒子加速进玉米组织中。
为了进行轰击，将胚性组织置于覆盖琼脂糖固化的N6培养基的滤纸上。将组织安排成稀草坪(thin lawn)，覆盖大约直径5cm的圆形区域。可将含有组织的培养皿放在PDS-1000/He的腔室中，离终止屏大约8cm。然后将腔室中的空气抽真空至28英寸Hg。使用可裂膜(rupture membrane)以氦冲击波将该巨载体进行加速，该膜在冲击管中的氦压力达到1000psi时破裂。
在轰击后七天，可将组织转移至含有草胺膦(2mg/l)而缺乏酪蛋白或脯氨酸的N6培养基。组织在此培养基上继续缓慢生长。再过2个星期，可将组织转移至含有草胺膦的新鲜N6培养基。6个星期后，可在一些含有补加了草胺膦的培养基的板上鉴定到直径约1cm的活跃生长的愈伤组织区域。这些愈伤组织当在选择性培养基上分培时可继续生长。
可通过首先将组织簇转移至补充有0.2mg/L 2，4-D的N6培养基来从转基因愈伤组织再生植株。两周后，可将组织转移至再生培养基(Fromm等人，(1990)Bio/Technology 8：833-839)。
实施例10：在双子叶植物中表达转基因
如下用质粒轰击大豆胚，该质粒包含可操作连接至异源核苷酸序列的优选启动子，该异源核苷酸序列包含ACC合酶多核苷酸序列或亚序列(例如SEQ ID NO：1和2)。为诱导体细胞胚，将从大豆栽培种A2872的经表面灭菌的不成熟种子切取的3-5mm长的子叶在适当的琼脂培养基上，在26℃下在光照或黑暗中培养六到十周。然后切取产生次级胚的体细胞胚并置于合适的液体培养基中。在重复选择增殖为早期球形期胚的体细胞胚簇后，如下所述维持悬浮液。
可将大豆胚发生悬浮培养物维持在26℃下旋转振荡器(150rpm)上的35ml液体培养基中，使用16∶8小时白天/黑夜时间安排的荧光光照。通过将大约35mg组织接种进35ml液体培养基中，每两周对培养物进行分培。
可然后通过粒子枪轰击方法(Klein等人，(1987)Nature(London)327：70-73、第4,945,050号美国专利)转化大豆胚发生悬浮培养物。可将DuPont BiolisticTM PDS1000/HE仪(氦气改型)用于这些转化。
可用于促进大豆转化的选择性标记基因，是由来自花椰菜花叶病毒的35S启动子(Odell等人，(1983)Nature 313：810-812)、来自质粒pJR225(来自大肠杆菌；Gritz等人，(1985)基因25：179-188)的潮霉素磷酸转移酶基因和来自根瘤农杆菌的Ti质粒的T-DNA的胭脂碱合酶基因的3′区所组成的转基因。包含优选的启动子和异源ACC合酶多核苷酸的所关注表达盒，可作为限制性酶切片段分离。然后可将这个片段插入携带标记基因的载体的独特限制性酶切位点中。
向50μl 60mg/ml 1μm金粒子悬浮液添加(按次序)：5μl DNA(1μg/μl)、20μl亚精胺(0.1M)和50μl CaCl2(2.5M)。然后将粒子制备物搅动三分钟，在微量离心机中离心10秒，移除上清液。然后将DNA包被的粒子在400μl 70％乙醇中洗涤一次并再悬浮于40μl无水乙醇中。可将DNA/粒子悬浮液超声处理三次，每次1秒。然后将五微升DNA包被的金粒子加载至每个巨载体盘上。
将大约300-400mg两周龄悬浮培养物置于空的60×5mm培养皿中，用移液管将残余液60×5体从组织移除。对于每次转化实验，通常轰击大约5-10个板。将膜破裂压力设定为1100psi，将室抽至28英寸汞柱的真空。将组织距离阻滞屏(retaining screen)大约3.5英寸放置，轰击三次。轰击后，可将组织一分为二并放回进液体中，如上所述进行培养。
轰击后五至七天，可将液体培养基与新鲜培养基交换，轰击后七至十二天与含有50mg/ml潮霉素的新鲜培养基交换。可每周更新这个选择培养基。轰击后七至八周，可观察到绿色的转化组织从未转化的坏死的胚发生簇长出来。移出分离的绿色组织并接种进单独的烧瓶中以产生新的、克隆繁殖的、转化的胚发生悬浮培养物。可将每一新品系当作独立的转化事件。然后可将这些悬浮物分培，并作为未成熟胚簇维持或者通过使各单独体细胞胚成熟和发芽而再生成完整植株。
实施例11在氮胁迫和常氮条件下进行的田地试验
将含有ACS下调构建体转基因的玉米杂种在田地中在氮胁迫和常氮条件下种植。在常氮下，以尿素硝酸铵(UAN)的形式施加总共250磅的氮。通过在不添加氮的情况下种植玉米两年耗竭土壤氮储备来实现氮胁迫。监测土壤硝酸盐储备来评估耗竭水平。为实现目标胁迫水平，在V2和VT生长阶段之间通过加肥灌溉或一侧施肥施加UAN达总共50-150磅氮。
将来自构建体的事件与无效事件套种在一起以使田地变化的空间效应减至最低；种植了多个重复。将含有转基因的事件的种子产量与转基因无效对照的产量进行比较。进行统计分析来评估与转基因无效对照相比产量是否存在显著改善，行和列的空间效应考虑在内。
氮肥力减低的小区中的转基因植物和非转基因植物之间的产量、产量构成或其他农艺性状的差异，可表示转基因事件的表达所贡献的氮利用效率改进。在补充推荐的氮肥力率的小区中进行了类似的比较。有效的转基因事件可在氮限制环境和常氮环境中实现相似的产量，或者可在低氮环境中表现得比非转基因对等物更好。
实施例12：ACS6下调构建体在氮降低条件下改进产量
将具有包含SEQ ID NO：4的下调构建体的植物在田地中在氮胁迫和常氮条件下种植。氮胁迫通过对土壤氮储备的定向耗竭来实现，该耗竭是通过先前的玉米生产和/或限制施用氮肥来进行。除了耕作历史外，在产生适当的氮胁迫条件时还考虑土壤类型和其他环境因素。
将含有转基因的植物的谷粒产量与野生型植物或转基因无效对照进行比较。该测试利用随机化完全区组设计，采用6次重复。用ASReml进行统计分析来评估产量的差异，将行和列空间效应和自回归(AR1)调整考虑在内。
表2提供代表两种地理位置中氮胁迫条件下19个转化事件的植物的产量数据，单位为蒲式耳数/英亩。用星号标记的产量为在P＜0.1下显著高于对照。
表2.
  事件   位置1   位置2
  2.12   121   202*
  2.29   124*   199
  2.32   123   211*
  113.2.7   124*   206*
  4.3   124*   204*
  4.8   125*   203*
  1.23   127*   208*
  1.44   126*   207*
  2.15   124*   205*
  2.2   124   201
  2.24   124*   198
  2.38   125*   204*
  2.49   123   202*
  1.14   125*   210*
  2.18   126*   206*
  2.22   124*   208*
  2.8   125*   205*
  2.1   125*   206*
  66.2.7   124*   202*
  对照   120   197
如下在位置2处进行另外的测量。转基因植物的平均产量在正常氮条件下为232蒲式耳/英亩；在氮胁迫条件下，平均产量为203蒲式耳/英亩。在氮胁迫下，至散粉的生长度单位(growing-degree-units to pollen shed)为1273，相比之下，在正常氮条件下为1330。另外，在氮胁迫环境条件下栽培的植物显示出18天的雌雄穗开花间隔天数减少。在1至10的等级(其中10为最不好的)上，低氮环境中的不育计数为1。
实施例13：产量评估-季节2
基本上如图6中所述，通过将试验株系与包含ACS下调构建体的植物进行杂交，产生玉米杂种。这些植物代表背景1中的九个单独的转化事件。评估杂种在季节2在多个位置的产量。将谷粒产量与非转化杂种(WT，野生型)和来自该区组中享有相同背景的所有构建体的批量(bulked)非转基因分离子(BN，批量无效对照(bulk null))的谷粒产量进行比较。结果在图9中显示。
实施例14：产量评估-季节3
基本上如图6中所述，通过将试验株系与包含ACS下调构建体的植物进行杂交，产生四株玉米杂种。十二个分离的转化事件各自在每个杂种组合中代表。将杂种在裂区(split-plot)实验设计中生长，四个试验地点的每一个中有四个重复。来自区组中的所有构建体的批量(bulked)非转基因分离子(BN，批量无效对照(bulk null))，和/或非转化的杂种WT，野生型)，充当每个地点的对照。收集并分析谷粒产量(蒲式耳/英亩)和植株高度数据。使用BLUP(Best Linear Unbiased Predictor)分析(Henderson，(1975)Biometrics 31(2)：423-447；Robinson，(1991)Statistical Science 6(1)：15-32)，测出显著性水平为P＜0.1。如图10中所示，十二个转基因事件中有十个的产量比批量无效对照和野生型对照都高。
实施例15：
ACC合酶(ACS)催化从S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)合成1-氨基环丙烷-1-甲酸(ACC)，SAM是乙烯生物合成的第一个关键步骤。这个步骤是乙烯形成的限速步骤；ACS的表达在转录和后转录水平上都受到严格调节(参见Kende，(1993)Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.44：283-307)。
在拟南芥属，有12个基因被命名为AtACS。后来，AtACS3被鉴定为假基因，AtACS10和AtACS12被发现不编码ACS而是编码氨基转移酶(Yamagami等人，(2003)Journal of Biol.Chem.278(49)：49102-49112)。在玉米中，有三个ACC合酶(ZmACS6、ZmACS2和ZmACS7)之前已得到研究(Gallie和Young，(2004)Mol.Gen.Gen.271：267-281；Wang等人，(2002)Plant Cell 14：S131-151)。之前未报道的、标号为ZmACS3的玉米ACC合酶在SEQ ID NOS：9-11中示出。对ZmACS3的表达的调节(特别是ZmACS3的下调)，单独地或者与对其他基因的调节相结合，可降低乙烯生成，从而导致植物的生长速率提高和胁迫耐受性改进。例如，对玉米中ZmACS6和ZmACS3两者的表达的抑制，可导致在最佳条件和/或胁迫(例如干旱)条件下生长速率更高和产量改进。
调节植物发育的方法和组合物可使用ZmACS3基因的DNA、RNA或蛋白质或者由ZmACS3基因衍生的DNA、RNA或蛋白质。某些实施方案提供选自以下的包含氨基酸序列的分离多肽：(a)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的多肽；(b)与SEQ ID NO：11的全长具有至少80％序列同一性的多肽，其中该多肽具有ACC合酶活性；(c)由在严格条件下与包含SEQ IDNO：10的互补序列的多核苷酸杂交的多核苷酸所编码的多肽；其中该严格条件包括在37℃下50％甲酰胺、1M NaCl、1％ SDS以及在60℃-65℃下在0.1X SSC中洗涤；和(d)具有SEQ ID NO：11的至少70个连续氨基酸的多肽，其中该多肽保持ACC合酶活性。
该ACS3多肽与ACS6蛋白共享中等(59％)的同一性；参见图14的比对。ACS6和ACS3的cDNA序列之间的同一性大约为66％；参见图15的比对。
所谓“ACS3活性”或“ACC合酶3活性”意指ACS3多肽具有代表性的(exemplary)活性，如催化乙烯合成中的某个步骤。测定这种活性的方法是本领域知道的并在本文中有更充分的描述。取决于上下文，“ACS3活性”可指天然ACS3多核苷酸或多肽的活性。这种天然活性可由本文所提供的异源ZmACS3序列的表达调节，例如当在能下调天然ZmACS3的构建体中提供时。
ACS3多肽的水平可例如通过测定植物中的ACS3多肽的水平来直接测量，或者例如通过测量植物中的ACS3多肽的ACS3活性来间接测量。测定ACS3活性的存在的方法在本文别处描述或者是本领域知道的。
还应认识到，可通过采用不能够在转化的植物中引导蛋白质或RNA的表达的多核苷酸，来调节所述多肽的水平和/或活性。例如，本发明的多核苷酸可用来设计可在用于改变或突变生物体中的基因组核苷酸序列或其表达的方法中应用的多核苷酸构建体。这类多核苷酸构建体包括但不限于RNA:DNA载体、RNA:DNA突变载体、RNA:DNA修复载体、混合双链体寡核苷酸、自身互补RNA:DNA寡核苷酸和重组工程寡核苷酸。这类核苷酸构建体和使用方法是本领域已知的。参见第5,565,350号美国专利；第5,731,181号美国专利；第5,756,325号美国专利；第5,760,012号美国专利；第5,795,972号美国专利和第5,871,984号美国专利，所有这些专利都以引用方式并入本文。另参见第WO 98/49350号、第WO 99/07865号和第WO 99/25821号PCT申请公开说明书以及Beetham等人，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：8774-8778，将这些专利和文献以引用方式并入本文。
SEQ ID NO：10所示的Zm-ACS3核苷酸序列可用来产生这样的变体核苷酸序列，其开放阅读框(ORF)核苷酸序列与SEQ ID NO：10的起始未改变的ORF核苷酸序列相比具有约70％、75％、80％、85％、90％或95％核苷酸序列同一性。这些功能变体是用标准的密码子表产生。虽然变体的核苷酸序列被改变，但开放阅读框所编码的氨基酸序列并无变化。
某些实施方案包括具有这样的转基因的植物，该转基因包含可操作地连接到能驱动在植物中的表达的异源启动子的多核苷酸，其中该转基因的表达导致ACS3多核苷酸和/或多肽的表达的调节。其他基因(包括其他ACS基因)的表达的调节，可由于该同一转基因或别的转基因的表达而出现。该转基因的表达可以是组成型表达，或者可被优先导向特定的植物细胞类型或植物组织类型，或者可以是诱导型表达或以别的方式受到控制。提供了相对于对照植物、对照植物细胞或对照植物部分而言调节植物生长和发育的方法，特别是植物对胁迫的响应，尤其是非生物胁迫。受调节的生长或发育可反映在例如生长速率更高、产量更高、形态或外观改变和/或对胁迫的响应改变，包括对胁迫的耐受性改进。在某些实施方案中，胁迫是冷、盐或干旱。在某些实施方案中，在非生物胁迫期间产量得到提高或保持。产量可例如按种植产量、植物生物量产量或(一种或多种)其他植物产物的回收量来测量。结实率可例如通过种子数量、总种子质量、平均种子质量或者这些或其他度量的某种组合来测量。
实施例16：多个ACS基因的下调
如图10-13中所示，具有包含SEQ ID NO：4的hpRNA的植物在多个环境和年份在干旱条件下显示了一致的产量改进，以及显示了一致的株高提高。这个hpRNA包含与ZmACS6和最近鉴定的ZmACS3基因都有同一性的区域。(参见图16；下划线表示相同的碱基。)在一个这种区域中，ZmACS3基因的44个毗连核苷酸与发夹序列相同，这表明SEQ ID NO：4的hpRNA可下调ACS3以及ACS6的表达。此外，ZmACS2和ZmACS7分别与发夹序列共享毗连的24bp和25bp同一性区域，这可导致表达的下调。
实施例17：季节4两个背景和三个浇灌方案中的转基因事件的产量评 估
对于通过将四个试验株系与遗传背景2或背景3的包含SEQ ID NO：4重组多核苷酸的植物杂交所产生的杂种玉米植株，在随机化的嵌套实验(nested experiment)中评估在三个浇灌方案下的产量。各处理为开花胁迫(6个重复)、灌浆胁迫(4个重复)和良好浇灌条件(4个重复)。开花胁迫造成了61％产量下降，而灌浆胁迫造成了47％产量下降，均相对于良好浇灌产量而言。对照为如上所述的批量(bulked)无效分离子(BN)和碱基遗传背景相当的非转基因杂种(WT)。用BLUP(最优线性无偏预测，Best LinearUnbiased Predictor)分析测定显著性为P＜0.1。结果在图13中显示。产量显著高于对照的事件以阴影显示。非阴影数据与对照值没有显著差异。对于背景2，所有十三个事件其产量显著高于对照。对于背景3，十三个事件中有十一个其产量显著高于对照；其他两个的产量结果与对照没有统计学差异。
实施例18-ACC的降低
ACC合酶的下调可反映在ACC水平降低。ACC可(例如)如Methods in Plant Biochemistry and Molecular Biology(1997)CRC Press，W.Dashek编辑，第12章，第158-159页中所述进行测定。对VT阶段的玉米植株的根组织(艾奥瓦州立大学合作推广特别报告第48号，Iowa StateUniversity Cooperative Extension Special Report No.48(1982，1993))评估ACC水平。背景1的包含ACS下调构建体的植物相对于对照显示出ACC水平下降；参见图17。
实施例19-ACS6表达下降
使用本文别处概述的定量rtPCR方法，对转入包含SEQ ID NO：4的ACS6下调构建体的转基因玉米植株分析ACS6表达。对水淹的(flooded)籽苗的根组织进行取样，结果在图18中显示。每个数据点代表生长阶段V3的三个重复的十二个植株。各事件如所指出(TG)，野生型(WT)植物的数据作为对照提供。
应理解，本文所述的实施例和实施方案仅出于说明目的，本领域技术人员根据这些实施例和实施方案将想到各种修饰和变化，这些修饰和变化包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围内。
虽然出于清楚和理解的目的较详细的描述了前述发明，但本领域技术人员阅读了本公开内容后将明白，可在不背离本发明的真实范围的情况下作出各种形式上和细节上的变化。例如，以上所述的所有技术和设备可以以各种组合来使用。本申请中引证的所有出版物、专利、专利申请和/或其他文献都为了所有目的以引用方式整体并入本文，犹如每个单独的出版物、专利、专利申请和/或其他文献单独地被指出为了所有目的以引用方式并入本文。
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Claims (26)

1.一种分离的核酸，其包含在植物中有功能的启动子，且还包含选自SEQ ID NO：1，2和4的多核苷酸。
2.一种分离的核酸，其包含选自SEQ ID NO：3，5，6和7的多核苷酸。
3.根据权利要求1所述的包含在植物中有功能的启动子的分离核酸，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。
4.根据权利要求1所述的分离核酸，其中所述启动子为组成型启动子。
5.根据权利要求1所述的分离核酸，其中所述核酸的表达导致植物细胞中一种或多种内源ACS基因的表达下调。
6.一种植物或植物细胞，其包含权利要求1所述的分离核酸。
7.一种植物或植物细胞，其包含权利要求3所述的分离核酸。
8.一种植物或植物细胞，其包含能有效降低至少一种内源ACS基因的表达的表达盒，其中所述表达盒包含可操作地连接到设定用来实现RNA沉默或RNA干扰的核酸的、在植物中有功能的启动子，其中所述核酸包含SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2的多核苷酸。
9.根据权利要求8所述的植物细胞，其中所述植物细胞来自双子叶植物或单子叶植物。
10.根据权利要求9所述的植物细胞，其中所述双子叶植物或单子叶植物是玉米、小麦、水稻、高粱、大麦、燕麦、草坪草、黑麦、大豆、芸苔或向日葵。
11.从权利要求10所述的植物细胞再生的植物。
12.根据权利要求11所述的植物，其中所述植物与对照植物相比表现出以下的一项或多项：干旱耐受性提高、氮利用效率提高、种子产量提高、生物量产量提高、密度耐受性提高和密度耐受性提高。
13.一种降低植物中的乙烯生成的方法，所述方法包括通过表达包含选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的核苷酸序列的转基因核酸，来降低所述植物中的一种或多种ACC合酶基因的表达。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述转化植物与对照植物相比表现出以下的一项或多项：(a)至少一种ACC合酶mRNA的生成的下降；(b)ACC合酶的生成的下降；(c)ACC的生成的下降；(d)乙烯的生成的下降；(e)干旱耐受性的提高；(f)氮利用效率的提高；(g)密度耐受性的提高；(h)植株高度的提高或者(i)(a)-(h)的任何组合。
15.一种提高植物的产量的方法，所述方法包括通过表达包含选自SEQID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6和SEQ ID NO：7的核苷酸序列的转基因核酸，来下调所述植物中的一种或多种ACC合酶基因的表达。
16.一种提高干旱耐受性而不损害非干旱条件下的产量的方法，所述方法包括降低内源ACS6转录物水平或ACS6活性。
17.一种表达盒，基本上由核苷酸序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2组成，其中所述核苷酸序列被介于其间的多核苷酸隔开。
18.根据权利要求17所述的表达盒，其中所述介于其间的多核苷酸是ZmAdh1内含子1。
19.根据权利要求18所述的表达盒，其中所述ZmAdh1内含子1序列是SEQ ID NO：3的碱基3791-4327。
20.根据权利要求8所述的植物，其中内源ACS转录物水平或ACS活性相对于对照植物下降。
21.根据权利要求20所述的植物，其中ACC合酶的水平或活性低于对照植物的约95％。
22.根据权利要求20所述的植物，其中ACC合酶的水平或活性低于对照植物的约85％。
23.根据权利要求20所述的植物，其中ACC合酶的水平或活性低于对照植物的约75％。
24.根据权利要求20所述的植物，其中ACC合酶的水平或活性低于对照植物的约50％。
25.根据权利要求8所述的植物，其中所述植物是玉米、小麦、水稻、高粱、大麦、燕麦、草坪草、黑麦、大豆、高粱、芸苔或向日葵。
26.根据权利要求8所述的植物的种子，其中所述种子包含所述表达盒。
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