CN102369193B

CN102369193B - 缩醛磷脂化合物、包含缩醛磷脂化合物的药物组合物和用于治疗衰老性疾病的方法

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Publication number: CN102369193B
Application number: CN200980157183.5A
Authority: CN
Inventors: 阿明·卡恩·M; 保罗·L·伍德; 达扬·古德诺; 里希凯什·曼基迪; 皮尔逊·阿希亚霍努
Original assignee: Phenomenome Discoveries Inc
Current assignee: Phenomenome Discoveries Inc
Priority date: 2008-12-22
Filing date: 2009-12-18
Publication date: 2016-05-04
Anticipated expiration: 2029-12-18
Also published as: US9334235B2; WO2010071988A1; JP2012512816A; JP5740312B2; TW201034662A; TWI475989B; RU2546108C2; IL213409A0; MY169797A; AR117572A2; AU2009329784A1; CA2746831A1; JP2015145388A; UY32359A; US20120035250A1; AU2009329784B2; KR20110104002A; US20130116312A2; CN105859680A; MX2011006795A

Description

缩醛磷脂化合物、包含缩醛磷脂化合物的药物组合物和用于治疗衰老性疾病的方法

发明领域

本发明涉及具有有用的生物化学、物理化学和临床特性的新型化学实体的合成和效用。更具体地，提供了一系列1-烷基，2-酰基甘油衍生物，它们可以用于治疗或预防疾病。本发明还涉及加入所述化合物的药物组合物和试剂盒。

发明背景

众所周知的是许多不同种类的人类疾病诸如癌症、痴呆或认知功能减退随着年龄增长其发病率增加。从流行病学和统计学的角度来看，这些疾病经常看上去非常类似。然而，从临床的角度来看，癌症、痴呆和认知功能减退中的每一种均是非常不同的。目前，对于这些疾病的最大危险因素是受试者的年龄。此外，被充分确定的是大多数癌症、痴呆和认知功能减退具有很长的前驱期(5-15年)，在前驱期中疾病存在但处于亚临床表现。已经报道了与年龄相关的膜胆固醇增加^1-3和线粒体膜胆固醇增加^4-6。这些膜胆固醇的增加导致膜流动性下降²，离子通道功能下降^6-8，一些膜结合酶如5’-核苷酸酶⁹和α-分泌酶¹⁰的活性降低，以及信号传导分子如一氧化氮的扩散特性改变¹¹。

遭受膜胆固醇增加的受试者证明具有增加的下述疾病的患病率：神经变性疾病(例如，阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化和年龄相关的黄斑变性(age-relatedmaculardegeneration))、认知损害、痴呆、癌症(例如，前列腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌和肾癌)、骨质疏松症、双相性精神障碍(bipolardisorder)和血管疾病(动脉粥样硬化、高胆固醇血症)。

就具体疾病而言，阿尔茨海默病患者的脑膜中胆固醇以依赖于严重性的方式积累^12-14。就此而言，降低膜胆固醇已经显示能减少β-和γ-分泌酶的活性，阻断β-淀粉状蛋白的致病性加工^15-16。在分子水平上，胆固醇结合至淀粉状蛋白前体蛋白(APP)的跨膜结构域，激活APP至β-和γ-分泌酶中丰富的富含胆固醇的膜结构域的运输，导致β-淀粉状蛋白的生产¹⁷。由增加的胆固醇导致的突触膜改变也可能是利用膜磷脂支持胆碱能神经传递(自噬代谢(autocannibalism)概念)中的重要因素¹⁸。早期使用他汀类药物也已经被提议用来减少阿尔茨海默病和帕金森病的发病率或延缓它们的发作¹⁹。胆固醇积累也出现在与年龄相关的黄斑变性相关的玻璃疣中²⁰。膜胆固醇也在癌症中增加²¹并且已经假设线粒体膜胆固醇的增加是导致与大多数癌细胞相关的瓦勃效应(Warburgeffect)的缺陷²²。瓦勃效应是癌细胞的确定特征，不象正常细胞几乎完全依赖于呼吸获取能量，癌细胞可以利用呼吸和糖酵解获取能量。

除了胆固醇积累的复杂的不利膜作用以外，还存在增加的氧化固醇产生²³。这些氧化固醇是细胞毒性的(凋亡和坏死)、促炎的、消耗GSH并诱发磷脂质病^23-26。这些毒性氧化固醇可能参与其中的疾病包括神经变性疾病(神经元和脱髓鞘两者)、骨质疏松症、年龄相关的黄斑变性和心血管疾病，尤其是动脉粥样硬化²³。

目前减少胆固醇的临床治疗主要包括用他汀类药物抑制胆固醇合成或用依泽麦布(ezetimibe)阻断胆固醇从胃肠道的吸收。据发明人所了解，目前还没有药物能动员胆固醇从膜运输出去。

发明概述

本发明涉及用于治疗与异常膜胆固醇水平相关的衰老性疾病(diseaseofaging)的化合物和方法。所述的化合物包括新型缩醛磷脂前体，该前体降低膜游离胆固醇水平并增加胆固醇酯化用于从细胞膜转运。因此这些化合物可用于减少遭受升高的膜胆固醇水平的受试者中的膜胆固醇水平。所述化合物还可以用来治疗或预防与增加的膜胆固醇相关的疾病诸如神经变性疾病(包括但不限于阿尔茨海默病，帕金森病，多发性硬化和年龄相关的黄斑变性)，认知损害，痴呆，癌症(包括但不限于，前列腺癌，肺癌，乳腺癌，卵巢癌和肾癌)，骨质疏松症，双相性精神障碍和血管疾病(包括但不限于动脉粥样硬化和高胆固醇血症)。此外，这些化合物可用于治疗由胆固醇转运蛋白诸如载脂蛋白E的异常基因表达所引起的疾病。

这些缩醛磷脂前体包含甘油主链，所述主链在sn-1处有烷基或烯基脂质取代且在sn-2处有酰基脂质取代。在sn-3处提供极性取代基以改善药物性质(诸如提高稳定性和/或生物利用度，或用于配制成盐)。

不希望受理论限制，认为在某些实施方案中，sn-3取代基被脂肪酶裂解，并且得到的1-烷基，2-酰基甘油或1-烯基，2-酰基甘油然后在内质网中被转变成缩醛磷脂，由此绕过(bypass)过氧化氢酶体区室，可以证明过氧化氢酶体的功能随着年龄增加而下降。

因此，关于组合物，提供了式I化合物：

其中：

R₁和R₂可以相同或不同；并且是选自表1或2的烷基或烯基烃链；

表1：烷基和烯基烃基

表2：不饱和顺式脂肪酸侧链

R₃是选自下列的基团：脂肪酸，肉碱，乙酰基-D/L-肉碱，硫代肉碱(thiocarnitine)，乙酰基-D/L-硫代肉碱，肌酸，去甲肉碱(norcarnitine)，磷酸胆碱，硫辛酸，二氢硫辛酸，磷酸乙醇胺，磷酸丝氨酸，N-乙酰半胱氨酸，取代的或未被取代的氨基酸基团和下表3中所示结构的基团。

表3

R₄和R₅相同或不同，并且可以是氢或低级烷基，例如甲基或乙基；

R₆是氢或低级烷基，例如甲基或乙基；和

R₇和R₈相同或不同，并且可以是氢或低级烷基，例如甲基和乙基，

并且还包括所述化合物的外消旋物或分离的立体异构体和所述化合物的药用盐或药用酯。

本发明的另一个方面针对包含药用载体和上述化合物的药物组合物。

在本发明的一个实施方案中，R₂可以是二十二碳六烯酸(DHA)侧链，或CH₃CH₂(CH＝CHCH₂)₆CH₂-。

在另一个实施方案中，该化合物可以是2-乙酰氧基-4-(2-((4Z，7Z，10Z，13Z，16Z，19Z)-二十二-4，7，10，13，16，19-己酰氧基)-3-(十六烷氧基)丙氧基)-N，N，N-三甲基-4-氧代丁-1-铵。

在其他实施方案中，该化合物可以是二十二-4，7，10，13，16，19-已烯酸((4Z，7Z，10Z，13Z，16Z，19Z)-1-(5-((R)-1，2-二硫戊环-3-基)戊酰氧基)-3-(十六烷氧基)丙-2-基)酯：

或二十二-4，7，10，13，16，19-己烯酸((4Z，7Z，10Z，13Z，16Z，19Z)-1-(2-乙酰氨基-3-巯基丙酰氧基)-3-(十六烷氧基)丙-2-基)酯：

本发明还包括包含PPI-1009，PPI-1011，PPI-1014或其组合的药物组合物。

不希望受理论约束，本文所述的化合物的某些实施方案被认为增加缩醛磷脂水平和乙酰基-L-肉碱从sn-3位的水解，并且可能参与潜在的分子机制，所述机制包括：(i)氨基酸中的-NH₂和-OH官能团以及肽和蛋白中的N-末端氨基酸的乙酰化引起它们的结构、动力学、功能和的周转(turnover)的改变；和/或(ii)充当较大分子的分子伴侣导致该较大分子的结构、分子动力学和功能的改变。

肉碱在脂肪酸的β氧化中是很重要的，并且乙酰基结构部分可以用来保持乙酰基-CoA水平。乙酰基-L-肉碱(ALCAR)作用包括下列的调节(i)脑能量和磷脂代谢；(iii)细胞大分子，包括神经营养因子和激素；(iii)突触形态学；和(iv)多种神经递质的突触传递。

根据本发明的另一方面，提供了一种治疗或预防由缩醛磷脂缺乏介导的衰老性疾病的方法，所述方法包括向需要所述方法的患者施用有效量的上述化合物或组合物。

在本发明的另一个方面中，提供了一种治疗与增加的膜胆固醇、增加的淀粉状蛋白和减少的缩醛磷脂水平相关的衰老性疾病的方法，所述方法包括向需要所述方法的患者施用有效量的上述化合物或组合物。

本发明还涉及一种制备根据式II的结构的化合物：

其中R₁和R₄至R₈如上所述且R₉是保护基团，并且包括所述式II化合物的外消旋物或分离的立体异构体和所述式II化合物的药用盐或药用酯的方法。该方法包括使式III化合物：

在合适的溶剂中与亲核催化剂、碱和封端剂在形成所述式II化合物的条件下反应，和任选地纯化所述得到的化合物。

在某些非限制性的实施方案中，所述封端剂可以是硅烷封端剂，例如，叔丁基二甲基甲硅烷基卤化物，则得到R₉为叔丁基二甲基甲硅烷基。

在其他非限制性的实施方案中，所述亲核催化剂可以是DMAP，所述碱可以是三乙胺，并且所述溶剂可以包括二甲基甲酰胺(DMF)和CH₂C1₂。

不希望受到限制，在某些实施方案中优选在0-5℃下在加入封端剂之前在合适的溶剂中制备包含式III化合物、亲核催化剂和碱的溶液，然后加入封端剂，然后在约15-约25℃，例如在约20℃的温度下进行反应。然后优选地使反应继续进行至完成，可能需要至多达20小时。

还提供了根据式II的结构的中间化合物：

其中R₁和R₄至R₉如上所述，包括所述化合物的外消旋物或分离的立体异构体和所述化合物的药用盐或药用酯。

附图简述

从下面参考附图的描述中本发明的这些和其他特征将变得更显而易见，在附图中：

图1显示了根据本发明的实施方案，制备PPI-1009：2-乙酰氧基-4-(2-((4Z，7Z，10Z，13Z，16Z，19Z)-二十二-4，7，10，13，16，19-己酰氧基)-3-(十六烷氧基)丙氧基)-N，N，N-三甲基-4-氧代丁-1-铵的一般实验步骤。

图2显示了PPI-1005以浓度依赖的方式恢复了相对于对照CHO细胞，N-Rel细胞中总DHA缩醛磷脂的降低水平(R₁＝16:0；R₂＝DHA；R₃＝OH)。72hr温育。*p＜0/05vs.载体(veh)

图3显示了(A)PPI-1009(10μM)结合至缩醛磷脂中的时程并缺少对N-Rel细胞的鲛肝醇或相关的烯基-酰基-甘油(B)的细胞水平的作用(0，6，12，24，48和72hr)。细胞的缩醛磷脂和二十二碳六烯酸(DHA)通过LC-MS/MS定量，而鲛肝醇通过GC-MS定量。

图4显示了(A)使PPI-1005和PPI-1009浓度依赖性地(72hr)增加CHO细胞中的DHA缩醛磷脂。在鲛肝醇增加N-Rel细胞中的DHA-缩醛磷脂的同时，对CHO细胞没有作用(B)。细胞的缩醛磷脂通过LC-MS定量，并相对于CHO对照或N-Rel对照表示。

图5显示了在与16:0(sn-1烷基)/DHA(sn-2酰基)甘油(PLM-05)温育48hr后N-Rel细胞中对于膜胆固醇减少的浓度反应。注意相对于CHO细胞，NRel细胞中胆固醇水平明显升高(p＜0.05)并且在20μM时(PLM-05)减少膜游离胆固醇并增加膜胆固醇酯(p＜0.05)。

图6显示用PPI-1005(A；1和5μM)和PPI-1009(B；0.5，1，2，3&10μM)结构特异性和浓度依赖性地结合(72hr)至N-Rel细胞的相关缩醛磷脂(R₁＝16:0，R₂＝22:6，R₃＝磷酸乙醇胺)中。在sn-2的脂肪酸取代经历脱酰基作用和再酰化作用从而在sn-2形成具有20:4，18:3，18:2和18:1的相关的缩醛磷脂。细胞的缩醛磷脂通过LC-MS/MS定量并相对于用载体处理的N-Rel细胞标准化。

图7显示相对于对照CHO细胞，在突变的N-Rel细胞中膜胆固醇是增加的。在与在sn-1具有棕榈酸(16:0)或硬脂酸(18:0)以及在sn-2具有不饱和脂肪酸(尤其是DHA)的缩醛磷脂前体(20μM)温育48hr后N-Rel细胞中的膜胆固醇被减少(p＜0.05)。在20μM，游离的DHA不能有效改变膜游离胆固醇水平。与在sn-1具有烷基连接的类似物的活性相反，二酰基类似物(16:0*：DHA甘油)是无活性的。PPI-1009(16:0/DHA/ALCAR)在导致游离胆固醇减少和酯化胆固醇增加方面与载体相比更为稳健。

图8显示在与20μM16:0(sn-1烷基)/DHA(sn-2酰基)甘油、18:0/DHA甘油或16:0/18:3甘油温育48hr后HEK293细胞中膜胆固醇的减少(p＜0.04。在20μM，16:0/18:1甘油，16:0/18:2甘油，16:0/20:4甘油和游离DHA均不能有效地改变膜游离胆固醇水平。与在sn-1具有烷基连接的类似物的活性相反，二酰基类似物(16:0*：DHA甘油)是无活性的。

图9显示了在与16:0(sn-1烷基)/DHA(sn-2酰基)/乙酰基-L-肉碱(sn-3酰基)甘油(PPI-1009)温育48hr后HEK293细胞中对于膜胆固醇减少的浓度反应。

图10显示了PPI-1005(5a，20μM)减少HEK293细胞的基线和胆固醇(25.8μM)刺激的Aβ42分泌(A)。PPI-1009(PLM09，10μM)以相似的方式作用(B)。

图11图示了PPI-1011对兔血浆中缩醛磷脂的作用。在口服200mg/kg剂量的明胶胶囊后1，3，6和12小时，PPI-1011结合至血浆乙醇胺缩醛磷脂(PlsEtn)和磷脂酰乙醇胺(PtdEtn)中。还监测DHA(游离22:6)经脱酰酶从sn-2的释放。各组由3-5只兔子组成。

图12显示了缩醛磷脂前体PPI-1011结合至循环Pls16:0/22:6，DHA，Pls18:0/22:6，Pls18:1/22:6和Ptd16:0/22:6中的时程的作图。在口服200mg/kg剂量的明胶胶囊后1，3，6，12，18，24和48小时测量血浆乙醇胺缩醛磷脂(Pls)和磷脂酰乙醇胺(Ptd)中PPI-1011的结合。还监测DHA经脱酰酶从sn-2的释放。各组由3-5只兔子组成，例外是12小时时间点，该时间点包括来自两个独立实验的7只兔子。

图13图示了PPI-1011剂量依赖性地结合至血浆缩醛磷脂和磷脂酰乙醇胺中。在口服10，75，200，500和1000mg/kg的剂量的明胶胶囊后6小时测量血浆乙醇胺缩醛磷脂(Pls)和磷脂酰乙醇胺(Ptd)中PPI-1011的结合。还监测DHA经脱酰酶从sn-2的释放。各组由3-5只兔子组成。

图14显示PPI-1011增加兔肾脏中组织缩醛磷脂和DHA。在口服200mg/kg剂量的明胶胶囊后1，3，6和12小时测量肾脏乙醇胺缩醛磷脂(PlsEtn)和磷脂酰乙醇胺(PtdEtn)中PPI-1011的结合。还监测DHA(游离22:6)经脱酰酶从sn-2的释放。各组由3-5只兔子组成。

图15显示兔肾脏中PPI-1011增加组织缩醛磷脂和DHA的时程。在口服200mg/kg剂量的明胶胶囊后1，3，6，12，18，24和48小时测量肾脏乙醇胺缩醛磷脂(16:0/22:6)中PPI-1011的结合。各组由3-5只兔子组成。

图16显示兔肝脏中PPI-1011增加组织缩醛磷脂和DHA的时程。在口服200mg/kg剂量的明胶胶囊后12，18，24和48小时测量肝脏乙醇胺缩醛磷脂(16:0/22:6)中PPI-1011的结合。各组由3-5只兔子组成。

图17显示72小时后，(5，10和20μM)PPI-1014结构特异性和浓度依赖性地结合至N-Rel乙醇胺缩醛磷脂(PlsEtn)和磷脂酰乙醇胺(PtdEtn)中。细胞的缩醛磷脂通过LC-MS/MS定量并相对于用载体处理的N-Rel细胞标准化。各组由三个10cm²板组成。

图18显示(A)增加的PPI-1005浓度对负载胆固醇的HEK293细胞中膜驻留蛋白(membraneresidentprotein)的作用，(B)PPI-1005对野生型HEK293细胞中的膜驻留蛋白的作用，和(C)普伐他汀对膜驻留蛋白ADAM10和SOAT1的作用。β-肌动蛋白用作负载对照。

详述

本文所述是根据式I的结构的化合物：

其中：

R₁和R₂相同或不同并且选自烷基或烯基烃链，所述烷基或烯基烃链选自由下列各项组成的组：CH3(CH2)3-，CH3(CH2)5-，CH3(CH2)7-，CH3(CH2)9-，CH3(CH2)11-，CH3(CH2)13-，CH3(CH2)15-，CH3(CH2)17-，CH3(CH2)19-，CH3(CH2)21-，CH3(CH2)23-，CH3(CH2)3CH＝CH(CH2)7-，CH3(CH2)5CH＝CH(CH2)7-，CH3(CH2)7CH＝CH(CH2)7-，CH3(CH2)4CH＝CHCH2CH＝CH(CH2)7-，CH3CH2CH＝CHCH2CH＝CHCH2CH＝CH(CH2)7-，CH3CH2(CH＝CH)-，CH3(CH2)3(CH＝CH)-，CH3(CH2)5(CH＝CH)-，CH3(CH2)7(CH＝CH)-，CH3(CH2)9(CH＝CH)-，CH3(CH2)11(CH＝CH)-，CH3(CH2)13(CH＝CH)-，CH3(CH2)15(CH＝CH)-，CH3(CH2)17(CH＝CH)-，CH3(CH2)19(CH＝CH)-，CH3(CH2)21(CH＝CH)-，CH3(CH2)3CH＝CH(CH2)5(CH＝CH)-，CH3(CH2)5CH＝CH(CH2)5(CH＝CH)-，CH3(CH2)7CH＝CH(CH2)5(CH＝CH)-，CH3(CH2)4CH＝CHCH2CH＝CH(CH2)5(CH＝CH)，CH3CH2CH＝CHCH2CH＝CHCH2CH＝CH(CH2)5(CH＝CH)-，CH₃(CH₂)₃CH＝CH(CH₂)₇-，CH₃(CH₂)₅CH＝CH(CH₂)₇-，CH₃(CH₂)₇CH＝CH(CH₂)₇-，CH₃(CH₂)₄(CH＝CHCH₂)₂(CH₂)₆-，CH₃CH₂(CH＝CHCH₂)₃(CH₂)₆-，CH₃(CH₂)₄(CH＝CHCH₂)₄(CH₂)₂-，CH₃CH₂(CH＝CHCH₂)₅(CH₂)₂-，CH₃(CH₂)₇CH＝CH(CH₂)₁₁，和CH₃CH₂(CH＝CHCH₂)₆CH₂-；

R₃是选自由下列各项的基团：脂肪酸，肉碱，乙酰基-D/L-肉碱，硫代肉碱，乙酰基-D/L-硫代肉碱，肌酸，去甲肉碱，磷酸胆碱，硫辛酸，二氢硫辛酸，磷酸乙醇胺，磷酸丝氨酸，N-乙酰半胱氨酸，取代的或未被取代的氨基酸和下面所示结构的基团：

R₄和R₅独立地是氢或低级烷基；

R₆是氢或低级烷基；和

R₇和R₈独立地是氢或低级烷基，和

包括所述化合物的外消旋物或分离的立体异构体和所述化合物的药用盐或药用酯。

所述化合物可用于治疗或预防与增加的膜胆固醇、增加的淀粉状蛋白或减少的缩醛磷脂水平相关的衰老性疾病。

所述化合物还可用于治疗或预防由缩醛磷脂缺乏介导的衰老性疾病。

所述化合物还可以用来治疗神经变性疾病(包括但不限于阿尔茨海默病，帕金森病和年龄相关的黄斑变性)，认知损害，痴呆，癌症(包括但不限于前列腺癌，肺癌，乳腺癌，卵巢癌和肾癌)，骨质疏松症，双相性精神障碍和血管疾病(包括但不限于动脉粥样硬化和高胆固醇血症)。

为了本发明的目的，式I化合物的甘油主链的sn-1，sn-2和sn-3位置处的羟基使用常规的缩醛磷脂命名法命名，即在式I指定与羰基-C＝O(乙酰基)，-C(形成醚键)和-P(磷酰基)键合的甘油的氧原子。

在某些非限制性实施方案中，如本文所述的化合物可以包含一个或多个手性中心。典型地，这些化合物将作为外消旋混合物制备。然而如果需要，这些化合物可以作为纯立体异构体，即，作为单独的对映异构体或非对映异构体，或作为富含立体异构体的混合物制备或分离。式I化合物的所有这些立体异构体(和富含立体异构体的混合物)包括在本发明的范围内。纯立体异构体(或富含立体异构体的混合物)可以使用，例如，本领域公知的旋光活性起始物质或立体选择性试剂制备。备选地，这些化合物的外消旋混合物可以使用，例如，手性柱色谱、手性拆分剂等来分离。

定义：

当描述本发明的烷基/酰基脂肪酸(表1，表2)和生物活性化合物(表3)，药物组合物和方法时，下列术语具有下列的含义，除非另外指明。

“脂肪酸”是脂族单羧酸，其来源于或以酯化形式包含在动物或植物脂肪、油或蜡中。天然脂肪酸通常具有4-28个碳的链(通常是无支链的和偶数的)，其可以是饱和的或不饱和的。这些已知为无环脂族羧酸。

在饱和脂肪酸的含义之内，术语“饱和的”是指包含尽可能多的氢的碳(除了原始的羧基[-COOH]以外)。换句话说，omega(ω)端包含3个氢原子(CH₃-)，并且链内的碳包含2个氢原子。

不饱和脂肪酸(包括但不限于表2中所述的实施例)的形式与饱和脂肪酸类似，不同之处在于沿链存在一个或多个烯基官能团，每个烯烃用双键键合的-CH＝CH-部分(即与另一个碳双键键合的碳)取代链的单键键合的-CH2-CH2-部分。这些被命名为CIS/TRANS(顺式/反式)和C:D，其中C已知是碳原子数，和D已知是双键。

“未取代的和取代的氨基酸”是指任选取代的氨基酸结构部分，所述氨基酸结构部分包含氨基、羧酸基团和可变的侧链，所述侧链可以包括普通氨基酸侧链，即，用于形成蛋白的那些，或本领域中已知的其他侧链。形成氨基酸结构部分的蛋白是特别优选的，并且包括丙氨酸，精氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸，半胱氨酸，谷氨酰胺，谷氨酸，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，蛋氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，色氨酸，酪氨酸和缬氨酸氨基酸基团。氨基酸结构部分上的取代也是有可能的，包括用官能团取代，所述官能团包括但不限于低级烷基，乙酸酯，磷酸酯，脂质和碳水化合物。]

术语“低级烷基”是指环状的、支链的或直链的1-7个碳原子(C₁-C₇)的单价烷基，并且在某些非限制性实施方案中为1-4个碳原子(C₁-C₄)。此术语的进一步例证为诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基(或2-甲基丙基)、环丙基甲基、异戊基、正戊基、己基和庚基的基团。低级烷基也可以是未取代的或取代的，其中取代的烷基的具体实例是1，1-二甲基庚基。

″羟基″是指-OH。

“药用盐″是指本发明的化合物的任意盐，该盐保留了其生物学性质，并且不是生物学或其他方面不合乎需要的。这样的盐可以衍生自本领域中熟知的多种有机和无机抗衡离子，并且包括，作为实例的钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、铵盐、四烷基铵盐等；并且当该分子包含碱性官能团时，包括有机或无机酸的盐，诸如盐酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、马来酸盐、草酸盐等。术语“药用阳离子”是指酸性官能团的药用阳离子抗衡离子。这样的阳离子的例子为钠阳离子、钾阳离子、钙阳离子、镁阳离子、铵阳离子、四烷基铵阳离子等。

“药用酯″是指常规酯化的具有羧基的式I化合物，该酯保留了式I化合物的生物学有效性和性质，并且在体内(在生物体中)裂解为相应的活性羧酸。关于酯和酯用于递送药物化合物的用途的信息可见DesignofProdrugs(前药设计).BundgaardH编辑(Elsevier1985)。还参见，H.Ansel等，PharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystems(药物剂型和药物递送系统)(第6版1995)，108-109页；Krogsgaard-Larsen，等，TextbookofDrugDesignandDevelopment(药物设计和开发教科书)(第二版，1996)，152-191页。

″药剂″或″药物″是指当适当地施用于受试者时能够诱导所需的治疗或预防作用的化学化合物或组合物。

术语“有效量”是指将引起例如研究者或临床医生所寻求的组织、系统、动物或人的生物学或医学反应的药物或药剂的量。此外，术语“治疗有效量”是指与不接受此量的相应受试者相比，导致疾病、病症或副作用的治疗、愈合、预防或改善提高，或疾病或病症的进展速度减慢的任何量。该术语的范围还包括有效增强正常生理功能的量。

所有化学化合物包括(+)和(-)立体异构体，以及(+)或(-)立体异构体任一者。

本文中其他化学术语根据本领域中的常规用法使用，其实例是McGraw-Hill化学术语词典(TheMcGraw-HillDictionaryofChemicalTerms)(1985)和简明化学词典(TheCondensedChemicalDictionary)(1981)。

本文所述的化合物包括来源于在sn-1和sn-2用脂肪酸取代和在sn-3用脂肪酸取代的甘油主链或内源性代谢中间化合物的缩醛磷脂前体，其可以从容易获得的起始物质使用下列的一般方法和图1中所述的步骤制备。要理解的是在给定典型的或优选的方法条件(即，反应温度，时间，反应物的摩尔比，溶剂，压力等)的情况下，也可以使用其他方法条件，除非另外说明。最适反应条件可以随着使用的具体反应物或溶剂而变化，但这样的条件可以由本领域技术人员通过常规优化步骤来确定。

另外，如本领域专业技术人员所理解的那样，可能需要常规的保护基团来防止某些官能团不经历不需要的反应。选择用于特定官能团的合适的保护基团以及用于保护和脱保护的合适条件在本领域中公知的。例如，大量的保护基团和它们的引入和移除记载在T.W.Greene和G.M.Wuts，有机合成中的保护基团(ProtectingGroupsinOrganicSynthesis)，第二版，Wiley，NewYork，1991，和本文引用的参考文献。

在本文所述的化合物的优选合成方法中，包括如本文所述的用脂肪酸在sn-1和sn-2取代和在sn-3用脂肪酸取代的甘油或内源性代谢中间化合物的化合物通过用合适的保护基团保护/脱保护甘油主链的羟基，然后进行化合物(例如，PPI-1009，PPI-1011和PPI-1014)的O-烷基化和O-酰基化来制备。

当用作药物时，如本文所述的化合物典型地以药物组合物的形式施用。这样的组合物可以使用制药领域中公知的步骤来制备，并且包含至少一种活性化合物。

通常本发明的化合物以药学有效量来施用。实际施用的化合物的量将典型地由临床医生根据相关的情况来确定，所述相关情况包括待治疗的病症，选择的给药途径，施用的实际化合物，个体患者的年龄、体重和反应，患者症状的严重性等。

本文所述的化合物和组合物可以通过任何合适的途径施用于受试者，优选哺乳动物，更优选人，以治疗和/预防疾病，所述途径包括，作为说明的口服、局部、直肠、经皮、皮下、静脉内、肌内、鼻内等。取决于期望的递送途径，本发明的化合物优选地配制为口服、局部或可注射组合物。

用于口服给药的药物组合物可以采取散装液体溶液或悬浮液，或整装粉剂的形式。然而，更普遍地，这样的组合物以单位剂型存在以便于准确的定量给药。术语“单位剂型”是指适合作为用于人受试者和其他哺乳动物的单位剂量的物理离散单位，每个单位包含预定量的活性物质以及合适的药物赋形剂，所述预定量计算为产生所需的疗效。典型的单位剂型包括预充的、预先测量的安瓿或液体组合物的注射器或在固体组合物的情况下包括丸剂、片剂、胶囊等。

适合于口服给药的液体形式可以包括含有缓冲液、悬浮剂和分散剂、着色剂、调味剂等的合适的水性或非水性载体。固体形式可以包括，例如，下列成分或类似性质的化合物中的任一种：粘合剂诸如微晶纤维素，黄耆胶或明胶；赋形剂诸如淀粉或乳糖，崩解剂诸如海藻酸，Primogel，或玉米淀粉；润滑剂诸如硬脂酸镁；助流剂诸如胶体二氧化硅；甜味剂诸如蔗糖或糖精；或调味剂诸如薄荷油、水杨酸甲酯或相橘调味剂。

典型的组合物被典型地配制为包含一种或多种活性成分的局部用软膏或乳膏，其用量通常为约0.01-约20重量％，优选约0.1-约10重量％和更优选约0.5-约15重量％的范围。当配制为软膏时，活性成分典型地与石蜡族基质或水易混合的软膏基质结合。备选地，活性成分可以配制在乳膏中，所述乳膏例如具有水包油乳膏基质。这样的局部制剂在本领域中是公知的，并且通常包括其他的成分以增强活性成分或制剂的皮肤渗透性或稳定剂。所有这样的已知局部制剂和成分包括在本发明的范围内。

本发明的化合物也可以通过透皮装置施用。因此，局部施用可以使用储库型或多孔膜型的贴剂或固体基质种类的贴剂来实现。

可注射组合物典型地基于可注射无菌盐水或磷酸盐缓冲盐水或本领域中已知的其他可注射载体。如以前一样，在此类组合物中烷基硝酮化合物典型地是次要成分，经常为约0.05-10重量％，余量为可注射载体等。

上述用于可口服和局部施用的或可注射的组合物的组分仅是代表性的。其他材料以及加工技术等参见雷明顿制药科学(Remington′sPharmaceuticalSciences)的第8部分，第18版，1990，MackPublishingCompany，Easton，Pennsylvania，18042，其通过引用合并于本文。

本发明的化合物也可以以持续释放形式施用或从持续释放药物递送系统施用。对代表性的持续释放材料的描述可见雷明顿制药科学(Remington′sPharmaceuticalSciences)中结合的材料。

本发明的药物组合物可以配制成片剂、胶囊、液体、注射制剂或软膏。然而，本发明不限于下列的药物组合物。例如，但不希望以任何方式限制，式I化合物可以溶解在缓冲无菌盐水可注射水性介质中至大约5mg/mL的适当浓度。

本发明还包括试剂盒，所述试剂盒可以简化药用活性剂对动物的给药。本发明的典型试剂盒包括根据本发明的药物组合物的单位剂型。在一个实施方案中，单位剂型是容器(诸如小瓶、小袋、试管、注射器等)，其可以有利地是无菌的，包含本发明的药物组合物。该试剂盒可以进一步包括指导使用药用活性剂来治疗或预防病症的标签或印刷的说明书。在另一个实施方案中，该试剂盒包括本发明的药物组合物的单位剂型和滴管，注射器，或用于施用该药物组合物的其他涂药器。典型地，试剂盒的组分，例如，单位剂型和说明书包括在合适的包装材料内。

在此已知生物可利用的在sn-2具有二十二碳六烯酸(22:6)取代的缩醛磷脂前体降低了膜胆固醇水平。相反，在sn-2处，硬脂酸(18:0)，油酸(18:1)，亚油酸(18:2)，花生四烯酸(20:4)或亚麻酸(18:3)的活性小得多，并且游离DHA是无活性的。在sn-1的脂肪酸取代证明对于烯基连接是绝对必需的，而酰基连接完全消除了降低胆固醇的活性。烯基连接可以在内质网中从烷基前体(例如，PPI-1009)产生；然而，合成的烯基形式也可能是潜在的治疗分子。这些靶向的缩醛磷脂前体的药物特性也可以通过向sn-3添加极性取代基来提高。此取代提供了改善的药物特性，包括：i)稳定sn-2取代不移动至sn-3^27-28ii)产生药用盐以改善制剂和药物溶解和吸收的能力；和iii)通过脂肪酶容易地移除sn-3取代基的能力²⁹使得该前体可以转化为相应的内源性缩醛磷脂。

因此，将本发明的化合物施用于哺乳动物生物学系统导致特异性sn-2取代的乙醇胺缩醛磷脂的细胞浓度增加，而不依赖于该系统的醚脂合成能力。这些特异性sn-2取代的物种的升高水平能够降低膜胆固醇水平并降低淀粉状蛋白分泌，因此使这些化合物可用于治疗或预防与增加的膜胆固醇、增加的淀粉状蛋白和减少的缩醛磷脂水平相关的衰老性疾病。

不希望受理论约束，认为本文所述的化合物能够绕过过氧化物酶体醚脂生物合成途径，能够恢复缩醛磷脂缺乏受试者中的缩醛磷脂水平，以及递送药学上有效降低胆固醇的水平的特异性降低胆固醇的缩醛磷脂。因此，这些分子可用来治疗或预防与降低的缩醛磷脂水平，增加的膜胆固醇水平或增加的淀粉状蛋白水平相关的疾病。这些因素被认为在大量人类疾病中是决定性的，所述疾病诸如神经变性疾病(包括但不限于阿尔茨海默病，帕金森病，和年龄相关的黄斑变性)，认知损害，痴呆，癌症(包括但不限于，前列腺癌，肺癌，乳腺癌，卵巢癌和肾癌)，骨质疏松症，双相性精神障碍和血管疾病(包括但不限于动脉粥样硬化和高胆固醇血症)。因此，本发明涉及使用所述的缩醛磷脂前体治疗这些疾病。此外，这些衍生物具有治疗由胆固醇转运蛋白诸如载脂蛋白E的异常基因表达所引起的疾病的效用。

本文还显示1-烷基-2-烷基甘油的给药导致在PlsEtn正常和PlsEtn缺乏系统中均立体选择性地升高PlsEtn水平。这些数据还首次证明1-烷基，2-酰基甘油降低膜胆固醇水平和淀粉状蛋白水平，并且这些作用需要在sn-2位的特异性脂肪酸取代。

本发明人在本文中还证明：

1)在sn-1处的醚键是稳定的，并且通过脱饱和酶(内质网)进一步加工以产生缩醛磷脂特征性的sn-1处的必要烯基键，但此脱饱和发生在通过CDP-乙醇胺转移酶(内质网)添加磷酸乙醇胺后；

2)在sn-3处带电荷取代稳定sn-2处的脂肪酸取代不移动^27-28至sn-3；

3)在sn-3处的带电荷取代容易被细胞脂肪酶裂解并且提供游离羟基用于CDP-乙醇胺转移酶(内质网)添加磷酸乙醇胺；

4)在sn-2处的脂肪酸取代基能够经历细胞中其他脂肪酸所经历的脱酰基作用和再酰化作用；

5)在sn-2处的DHA取代对于降低膜胆固醇是最佳的，和

6)在sn-3处的带电荷取代改善了新提出的缩醛磷脂前体的药物特性(稳定性，生物利用度和作为盐的制剂)。

本发明的化合物在缩醛磷脂生物合成能力受损的细胞和缩醛磷脂生物合成能力未受损的细胞中有效地转化为PlsEtn种类。这些结果与关于其他缩醛磷脂前体的现有技术直接相反。1-烷基，2-羟基甘油(鲛肝醇、鲨肝醇、salachylalcohols)已经显示将PlsEtn缺乏系统中的PlsEtn水平增加至对照水平但在PlsEtn缺乏或PlsEtn充足系统中均未增加至对照水平之上。因此，本发明的化合物可以用于预防由缩醛磷脂缺乏介导的衰老性疾病，但在PlsEtn缺乏或PlsEtn充足系统中将PlsEtn水平增加至对照水平之上。

如上所讨论的，本文所述的化合物适合用于多种药物递送系统；然而，不希望受限制，所述化合物特别地可用于以胶囊或片剂口服递送。在这样的实施方案中，对于40-80kg人类患者，最大总剂量不期望超过2g/天。

在下面的实施例中，下面的缩写具有下面的含义。未在下面定义的缩写具有其普遍公认的含义。

bd＝宽双峰

bs＝宽单峰

d＝双峰

dd＝双二重峰

dec＝分解

dH₂O＝蒸馏水

ELISA＝酶联免疫吸附测定

EtOAc＝乙酸乙酯

EtOH＝乙醇

g＝克

h＝小时

Hz＝赫兹

ip＝腹膜内

L＝升

m＝多重峰

min＝分钟

M＝摩尔

MeOH＝甲醇

mg＝毫克

MHz＝兆赫

mL＝毫升

mmol＝毫摩尔

m.p.＝熔点

N＝正常

po＝经口，口服

q＝四重峰

quint.＝五重峰

s＝单峰

t＝三重峰

THF＝四氢呋哺

tlc＝薄层色谱

μg＝微克

μL＝微升

UV＝紫外线

在下面的实施例中，所有温度以摄氏度为单位，除非另外指明。

提供下面的合成和生物学实施例来说明本发明，并且不应以任何方式解释为限制本发明的范围。

实施例

实施例1：化学合成

根据下面的一般实验步骤制备PPI-1009：2-乙酰氧基-4-(2-((4Z，7Z，10Z，13Z，16Z，19Z)-二十二-4，7，10，13，16，19-己酰氧基)-3-(十六烷氧基)丙氧基)-N，N，N-三甲基-4-氧代丁-1-铵。

步骤-1

在0℃，向未标记的PPI-1001(50g，158mmol)在无水DMF(20mL)中的溶液加入咪唑(21.5g，316mmol)，将得到的混合物搅拌10min。将TBDMS-Cl(26.2g，174mmol)在DMF(50mL)中的溶液逐滴加入，并且将得到的溶液在室温下搅拌4h。用水(50ml)稀释反应混合物，用EtOAc(2×250mL)萃取。将有机层用冰水(2x100mL)，盐水(50mL)洗涤，干燥(Na₂SO₄)并蒸发以得到粗化合物4，该化合物通过柱色谱纯化(中性氧化铝，EtOAc-Pet醚(0.5∶9.5)以得到化合物3(45g，66％)。R_f＝0.65(EtOAc-Pet醚(1-9))

步骤-2

在0℃，向化合物3(75g，174mmol)在DMF(750mL)中的溶液中逐份地加入NaH(60％油中的分散液，5g，209mmol)，搅拌30min，在1h内逐滴加入苄基溴(44.8g，262mmol)，缓慢升温至室温并搅拌过夜直至通过tlc分析证明化合物3完全被消耗。将反应混合物冷却至0℃，加入甲醇(5mL)，冰水(50mL)，用Et₂O(2×250mL)萃取，将有机层用水(2x50mL)，盐水(50mL)洗涤，干燥(Na₂SO₄)并蒸发以获得黄色油状的粗化合物4(90g)(R_f＝0.7；EtOAc-Pet醚[5-95])，将该化合物原样用于下一步骤，无需进一步纯化。

步骤-3

在-15℃，向化合物4(1.7g，3.26mmol)在无水THF(15mL)的溶液中加入TBAF(1.7g，6.53mmol)在无水THF(5mL)中的溶液，并将反应混合物缓慢地升温至室温，并搅拌过夜，直至通过tlc分析证明化合物4完全被消耗。将反应混合物用水(10mL)猝灭，用EtOAc(2×50mL)萃取，将有机层用盐水(20mL)洗涤，干燥(Na₂SO₄)并蒸发以得到粗化合物6，将该化合物通过快速柱色谱纯化(100-200目硅胶，EtOAc-Pet醚(3∶7)以获得淡黄色油状的化合物5(850mg，65％)。R_f＝0.54(EtOAc-Pet醚(3∶7)。

步骤-4

在0℃，向化合物7(8g，39mmol)在无水CH₂Cl₂(50mL)-DMF(3滴)的溶液中加入草酰氯(4.2mL，40mmol)，并将得到的混合物缓慢地加温至室温，搅拌5h。蒸发掉过量的草酰氯，将残渣溶解在甲苯中，并蒸发溶剂以获得化合物6。将化合物6在无水CH₂Cl₂(25mL)中的溶液逐滴加入至化合物5(11g，20mmol)在无水CH₂Cl₂(50mL)中的溶液，将得到的溶液用氩气吹扫直至通过tlc分析证明化合物5完全被消耗。浓缩反应混合物得到粗化合物8(14g)，将该化合物原样用于下一步骤，而无需进一步纯化。R_f＝0.45(MeOH-CHCl₃(1∶4))。

步聚-5

将化合物8(14g粗制)在EtOH(50mL)中的溶液在10％Pd/C上在40psi氢化，直至通过TLC分析指示化合物8完全被消耗。将反应混合物过滤并蒸发得到粗化合物9，将该化合物通过柱色谱在中性氧化铝上纯化得到浅褐色油状的化合物9(6g，6g，经两步骤61％)R_f＝0.25(MeOH-CHCl₃(2∶3))。

步骤-6

在0℃，向化合物9(8.2mg，16mmol)在THF(150mL)中的溶液加入催化量的DMAP(1.9g，20mmol)，吡啶(7.6mL，90mmol)并在室温下搅拌1小时。向此溶液中，将DHA-Cl(通过在0℃将草酰氯(2.5mL，28mmol)在无水CH₂Cl₂中的溶液加入至DHA-酸(7.7g，20mmol)，蒸发过量的草酰氯得到DHA-Cl进行制备)在CH₂Cl₂(50mL)中的溶液在0℃逐滴加入至反应混合物中并搅拌0.5h。将反应混合物缓慢地升温至室温，并搅拌24h。将反应混合物用水(50mL)稀释，用EtOAc(2×200mL)萃取，用盐水(50mL)洗涤，干燥(Na₂SO₄)并蒸发以获得粗产物，该粗产物通过柱色谱纯化(中性氧化铝MeOH-CHCl₃(5∶95))获得浅褐色半固体状PPI-1009(1.2g，～10％，HPLC纯度97％，以及1.7g不纯的物质)R_f＝0.45(MeOH-CHCl₃(15∶85))。

实施例2：生物学测试

将中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，N-Rel³⁰细胞(一种突变的CHO细胞系，其缺乏过氧化物酶体酶磷酸二羟基丙酮酰基转移酶)，和人胚肾细胞(HEK293)培养在10cm²皿中的包含10％FBS的DMEM/Ham’sF12(1∶1)中。将细胞与溶解在乙醇中的缩醛磷脂前体(乙醇终浓度为0.1％)温育并收获通过LC-MS-MS进行缩醛磷脂分析³¹，并且利用市售的色度法试剂盒(BioVision#K613)进行胆固醇和胆固醇酯分析。

将在sn-1处具有16:0，在sn-2处具有DHA和在sn-3处具有OH或乙酰基-L-肉碱的1-烷基，2-酰基甘油，PPI-1005或PPI-1009分别在缩醛磷脂生物合成能力受损的细胞(N-Rel，图2，3A)和在缩醛磷脂生物合成能力未受损的细胞(CHO，图4A)中有效地转化为PlsEtn种类。这些结果与关于其他缩醛磷脂前体的现有技术直接相反。1-烷基，2-羟基甘油(鲛肝醇、鲨肝醇、salachylalcohols)已经显示将PlsEtn缺乏系统中的PlsEtn水平增加至对照水平，但在PlsEtn缺乏或PlsEtn充足系统中均未增加至对照水平之上(图4B)。另外本发明中所述的1-烷基，2-酰基甘油的生物转化没有导致鲛肝醇或1-烯基，2-酰基甘油的水平增加(图3B)，表明鲛肝醇或1-烯基，2-酰基甘油均不是所述分子至PlsEtn的生物转化途径中的中间体。

化合物PPI-005记述在本申请人共同未决的申请PCT/CA2007/001472中，并显示如下：

二十二-4，7，10，13，16，19-己烯酸((4Z，7Z，10Z，13Z，16Z，19Z)-1-(十六烷氧基)-3-羟基丙-2-基)酯

5a

用在sn-1处具有16:0，在sn-2处具有DHA和在sn-3处具有OH或乙酰基-L-肉碱的1-烷基，2-酰基甘油处理细胞导致在sn-2处具有DHA的PlsEtn的结构特异性的富集(图6)。这是第一次描述PlsEtn的结构特异性富集。

PPI-1009是具有改善的药物特性的缩醛磷脂前体。此分子在室温下作为盐存在，并且代表至今报道的第一个非基于油的缩醛磷脂前体。

在缩醛磷脂合成方面具有预先存在的缺陷并随后具有低缩醛磷脂水平的生物学系统(N-Rel对比CHO)(图1)具有升高的膜胆固醇水平(图5)。PPI-1005将DHA-PlsEtn升高至对照值的80％(图2)导致膜胆固醇的明显减少(图5)。

发现升高的PlsEtn水平的胆固醇降低作用依赖于sn-2取代基(图7和8)。仅观察到多不饱和脂肪酸(DHA，18:3)在HEK293细胞中具有胆固醇降低活性，而饱和的、单和二不饱和的脂肪酸没有作用。仅DHA-PlsEtn水平的恢复导致在N-Rel细胞中观察到的升高的膜胆固醇水平的稳定衰减，该升高的膜胆固醇水平是由于缩醛磷脂水平减少所引起的(图7)。这些结果表明包含PlsEtn的多不饱和脂肪酸选择性地参与膜胆固醇内稳态。PPI-1009也证明是浓度依赖性地减少NRel(图7)和HEK293细胞(图9)中的膜胆固醇水平。这些结果表明升高的PlsEtn水平的膜降低作用需要施用能够选择性地升高PlsEtn水平的具有特异性sn-2取代的缩醛磷脂前体。

用PPI-1005或PPI-1009处理HEK293细胞导致在正常细胞和胆固醇负载的细胞两者中AB-40和AB-42的水平均降低(图10)。这些结果进一步通过缩醛磷脂前体正性调节膜蛋白功能的能力例证了其功能效用。就此而言，已知减少的膜胆固醇水平负性调节淀粉状蛋白肽的产生¹⁵。除了在HEK293细胞中降低膜胆固醇以外，还观察到PPI-1005和PPI-1009降低淀粉状蛋白肽的分泌(图10)。

使用5，10和20μM浓度的PPI-1014还在72小时后观察到PPI-1014结构特异性和浓度依赖性地结合至N-Rel乙醇胺缩醛磷脂(PlsEtn)和磷脂酰乙醇胺(PtdEtn)中(图17)。

实施例3：PPI-1011的制备

合成方案：

PPI-1011的合成方案

反应步骤：

简要步骤：将化合物1(2.0Kg，15.15mol)在10％NaOH溶液(10.0L)中的溶液在80℃下搅拌1h，加入TBAB(992.0g，3.03mol)并搅拌15min。缓慢地加入鲸蜡基溴(5.5kg，18.18mol)，并将反应混合物在80℃下搅拌20h。(反应进程通过用水稀释小量等分试样，用乙酸乙酯萃取并点样在分析性硅胶TLC板上(30％乙酸乙酯/pet-醚)和使用Mo染色和KMnO₄溶液将各个样点显色来进行监测)。下面是混合物的各成分的R_fs：化合物1(0.1)，化合物2(0.7)。

后处理(workup)和纯化：将反应混合物冷却至RT，用CH₂Cl₂(3x3.0L)萃取。将合并的CH₂Cl₂层用NaHCO₃溶液(1.0L)，水(2x2.0L)，盐水溶液(1.0L)洗涤，经无水Na₂SO₄干燥并浓缩得到淡黄色液体的粗化合物2(2.9Kg，粗产物)，该化合物用于下一步骤中。

反应步骤：

简要步骤：将化合物2(2.9Kg，81.23mol)在20％HCl水溶液(14.5L)中的溶液在85℃搅拌16h。(反应进程通过用水稀释小量等分试样，用乙酸乙酯萃取并点样在分析性硅胶TLC板上(40％乙酸乙酯/pet-醚)和使用Mo染色将样点显色来进行监测)。下面是混合物的各成分的R_fs：化合物2(0.8)，化合物3(0.2)。

后处理和纯化：将反应混合物冷却至RT，用CH₂Cl₂(3x4.0L)萃取。将合并的有机层用NaHCO₃溶液(1.0L)，水(2x2.0L)，盐水溶液(1.0L)洗涤，经无水Na₂SO₄干燥并浓缩得到粗化合物，将该粗化合物用5％乙酸乙酯/pet-醚(2x1.0L)研磨并干燥得到作为灰白色固体获得的化合物3(2.0Kg，从2步为42％)。

反应步骤：

简要步骤：在0℃向化合物3(1.0Kg，3.16mol)在DMF(640.0mL)口CH₂Cl₂(400.0mL)中的冷却溶液中加入DMAP(38.6g，0.32mol)，然后加入三乙胺(735.0g，7.27mol)。加入后将反应混合物在0℃搅拌30min并加入等量的多份(3份)TBSCl(572.0g，3.79mol)持续1h并将反应混合物在RT下搅拌20h。(反应进程通过用水猝灭小量等分试样，用CH₂Cl₂萃取并点样在分析性硅胶TLC板上(20％乙酸乙酯/pet醚)和使用Mo染色和KMnO₄将样点显色来进行监测)。下面是混合物的各成分的R_fs：化合物3(0.15)，化合物4(0.7)。

后处理和纯化：将反应混合物用CH₂Cl₂(2.0L)稀释，用水(3x3.0L)，盐水溶液(1.0L)洗涤，经无水Na₂SO₄干燥并浓缩。将获得的粗化合物通过柱色谱纯化(硅胶100-200目)，使用5％乙酸乙酯/pet醚作为洗脱剂得到作为淡黄色油获得的化合物4(850g，90％)。

反应步骤：

简要步骤：在0℃向化合物5(160.0g，0.487mol)，DMF(1.0mL)在CH₂Cl₂(500.0mL)中的冷却溶液中缓慢地加入草酰氯(105.0g，0.828mol)，持续30min。加入后将反应混合物在26℃搅拌4h。(反应进程通过用MeOH猝灭小量等分试样，并点样在分析性硅胶TLC板上(10％乙酸乙酯/pet醚)和使用KMnO₄溶液将样点显色来进行监测。下面是混合物的各成分的R_fs：化合物5(0.3)，化合物6(0.8)。

后处理和纯化：将反应混合物在N₂气氛中浓缩得到粗化合物6(175g，粗产物)。

反应步骤：

简要步骤：在0℃向化合物4(150.0g，0.348mol)在甲苯(1.25L)中的冷却溶液中加入吡啶(110.0g，1.39mol)，然后加入DMAP(122.2g，0.348mol)并搅拌10min。加入粗化合物6(175.0g，0.504mol)在甲苯(250.0mL)中的溶液，持续15min。加入后，将反应混合物在RT搅拌20h。(反应进程通过用水猝灭小量等分试样，用EtOAc萃取并点样在分析性硅胶TLC板上(5％乙酸乙酯/pet醚)和使用KMnO₄溶液将样点显色来进行监测)。下面是混合物的各成分的R_fs：化合物4(0.2)，化合物7(0.5)。

后处理和纯化：将反应混合物用乙酸乙酯(3.0L)稀释，用水(1.0L)，0.05NHCl(500.0mL)，水(2x1.0L)，盐水溶液(500.0mL)洗涤，经无水Na₂SO₄干燥并浓缩以得到相化合物7，将该粗化合物7通过柱色谱纯化(硅胶100-200目)，使用2％乙酸乙酯/pet醚作为洗脱剂得到作为淡黄色油获得的化合物7(162g，62.7％)。

反应步骤：

简要步骤：在0℃向化合物7(160.0g，216.21mmol)在THF(10.0mL)和乙酸(52.0g)中的冷却溶液中加入等量份数的TBAF(226.0g，864.86mmol)，持续30min。加入后，将反应混合物在RT搅拌6h。(反应进程通过点样在分析性硅胶TLC板上(20％乙酸乙酯/pet醚)和使用Mo染色和KMnO₄溶液将样点显色来进行监测)。下面是混合物的各成分的R_fs：化合物7(0.9)，化合物PPI-1005(0.4)。

后处理和纯化：将反应混合物用乙酸乙酯(3.0L)稀释，用水(2x2.0L)，盐水(500.0mL)洗涤，经无水Na₂SO₄干燥并浓缩以得到粗化合物，将该粗化合物通过柱色谱纯化(硅胶100-200目)，使用7％乙酸乙酯/pet醚作为洗脱剂得到作为淡黄色油获得的化合物PPI-1005(72g，53％)。

反应步骤：

简要步骤：在0℃向α-硫辛酸1(12.0g，58.25mmol)在THF(500.0mL)中的冷却溶液中缓慢地加入三乙胺(8.1mL，58.25mmol)，持续10min，然后加入2，4，6-三氯苯甲酰氯(14.2g，58.25mmol)。加入后，使反应混合物至室温并搅拌18h.(反应进程通过点样在分析性硅胶TLC板上(20％EtOAc/pet-醚)并使用254nmUV光和Hanessian’s染色将样点显色来进行监测)。下面是混合物的各成分的R_fs：化合物1(0.2)，中间体(0.6)。

过滤反应混合物，将固体用THF(25.0mL)洗涤，将合并的滤液在N₂气氛中使用减压浓缩得到粗酸酐，将粗酸酐溶解在苯(500.0mL)中，冷却至0℃并加入DMAP(7.1g，58.25mmol)，搅拌10min。在0℃向反应混合物中缓慢加入PPI-1005(40.1g，64.07mmol)在苯(100.0mL)中的溶液。加入后，使反应混合物至室温，并搅拌24h。(反应进程通过用水猝灭小量等分试样，用乙酸乙酯萃取并点样在分析性硅胶TLC板上(15％THF/pet-醚)并使用254nmUV光和Hanessian’s染色将样点显色来进行监测)。下面是混合物的各成分的R_fs：PPI-1005(0.3)，PPI-1011(0.5)。

后处理和纯化：将反应混合物用乙酸乙酯(2000mL)稀释，用饱和NaHCO3溶液(1x400mL)，0.05NHCl(1x400mL)，水(1x400mL)，盐水(1x400mL)洗涤并经无水Na₂SO₄干燥并浓缩以获得粗化合物，将该粗化合物通过柱色谱纯化(中性硅胶100-200目)，使用2.5-5％THF/pet醚作为洗脱剂。

标题化合物PPI-1011(28.0g，54％)作为淡褐色油获得。

实施例4：制备PPI-1009的备选方法

合成方案：

反应步骤：

步骤：将化合物1(2.0Kg，15.15mol，AlfaAesar)在10％NaOH溶液(10.0L)中的溶液在80℃搅拌1h，加入TBAB(992.0g，3.03mol，Rajdhaniscientific)并搅拌15min。缓慢地加入鲸蜡基溴(5.5kg，18.18mol，AlfaAesar)并将反应混合物在80℃搅拌20h。(反应进程通过用水稀释小量等分试样，用乙酸乙酯萃取并点样在分析性硅胶TLC板上(30％乙酸乙酯/pet醚)和使用Mo染色和KMnO₄溶液将各个样点显色来进行监测)。下面是混合物的各成分的R_fs：化合物1(0.1)，化合物2(0.7)。将反应混合物冷却至RT，用CH₂Cl₂(3x3.0L)萃取。将合并的CH₂Cl₂层用NaHCO₃溶液(1.0L)，水(2x2.0L)，盐水溶液(1.0L)洗涤，经无水Na₂SO₄干燥并浓缩得到淡黄色液体的粗化合物2(2.9Kg，粗产物)，将该粗化合物用于下一步骤中。

反应步骤：

步骤：将化合物2(2.9Kg，81.23mol)在20％HCl水溶液(14.5L)中的溶液在85℃搅拌16h。(反应进程通过用水稀释小量等分试样，用乙酸乙酯萃取并点样在分析性硅胶TLC板上(40％乙酸乙酯/pet醚)和使用Mo染色将样点显色来进行监测)。下面是混合物的各成分的R_fs：化合物2(0.8)，化合物3(0.2)。将反应混合物冷却至RT，用CH₂Cl₂(3x4.0L)萃取。将合并的有机层用NaHCO₃溶液(1.0L)，水(2x2.0L)，盐水溶液(1.0L)洗涤，经无水Na₂SO₄干燥并浓缩以得到粗化合物，将该粗化合物用5％乙酸乙酯/pet-醚(2x1.0L)研磨并干燥得到作为灰白色固体获得的化合物3(2.0Kg，从两步42％)。

反应步骤：

步骤：在0℃向化合物3(1.0Kg，3.16mol)在DMF(640.0mL)和CH₂Cl₂(400.0mL)中的冷却溶液中加入DMAP(38.6g，0.32mol)，然后加入三乙胺(735.0g，7.27mol，Rankem)。加入后，将反应混合物在0℃搅拌30min并加入等量的多份(3份)TBSCl(572.0g，3.79mol，Fluorochem3.0kg)，持续1h，并将反应混合物在RT搅拌20h。(反应进程通过用水猝灭小量等分试样，用CH₂Cl₂萃取并点样在分析性硅胶TLC板上(20％乙酸乙酯/pet醚)和使用Mo染色和KMnO₄将样点显色来进行监测)。下面是混合物的各成分的R_fs：化合物3(0.15)，化合物4(0.7)。将反应混合物用CH₂Cl₂(2.0L)稀释，用水(3x3.0L)，盐水溶液(1.0L)洗涤，经无水Na₂SO₄干燥并浓缩。将获得的粗化合物通过柱色谱纯化(硅胶100-200目)，使用5％乙酸乙酯/pet醚作为洗脱剂得到作为淡黄色油获得的化合物4(850g，90％)。

反应步骤：

步骤：在0℃向化合物4(734g，1.706mol)在DMF(2.5L)中的冷却溶液中，逐份地加入60％NaH(204.0g，5.12mol)，持续30min。加入后，将反应混合物在0℃另外搅拌30min并逐滴加入苄基溴(438.0g，2.56mol，S.Dfinechemicals)，持续1h。使达到RT的反应混合物搅拌20h。(反应进程通过用水猝灭小量等分试样，用EtOAc萃取并点样在分析性硅胶TLC板上(5％乙酸乙酯/pet醚)和使用Mo染色和KMnO₄将样点显色来进行监测)。下面是混合物的各成分的R_fs：化合物4(0.2)，化合物5(0.5)。将反应混合物用甲醇(250mL)，冷水(1500mL)猝灭，并使用乙酸乙酯(2x2.0L)萃取。将合并的乙酸乙酯层用水(3x1.0L)，盐水溶液(1.0L)洗涤，经无水Na₂SO₄干燥并浓缩。将获得的粗化合物5(887g)用于下一步骤无需进一步纯化。

反应步骤：

步骤：在0℃向粗化合物5(887.0g，1.702mol)在THF(2.0L)中的冷溶液中缓慢地加入TBAF(1.3Kg，5.107mol，Chemrichfinechemicals)在THF(1.0L)中的溶液，持续1h。加入后，将反应混合物在RT搅拌16h。(将反应进程通过用水猝灭小量等分试样，用EtOAc萃取并点样在分析性硅胶TLC板上(30％乙酸乙酯/pet醚)和使用Mo染色和KMnO₄溶液将样点显色来进行监测)。下面是混合物的各成分的R_fs：化合物5(0.9)，化合物6(0.3)。将反应混合物用乙酸乙酯(2.5L)稀释，用水(2x1.0L)，盐水(1.0L)洗涤，经无水Na₂SO₄干燥并浓缩得到粗化合物，将该粗化合物通过柱色谱纯化(硅胶100-200目)，使用7％乙酸乙酯/pet醚作为洗脱剂，得到作为淡黄色油获得的化合物6(330g，从两步48％)。

反应步骤：

步骤：在0℃向N-乙酰基肉碱8(239.0g，1.177mol，MoleculalifeSciences)在CH₂Cl₂(500.0mL)和DMF(5.0mL)中的冷溶液中缓慢地加入草酰氯(179.4g，1.412mol)，持续30min并在RT搅拌4h。通过减压下蒸馏从反应混合物中去除溶剂，并且通过与CH₂Cl₂共馏去除痕量的草酰氯。将获得的粗化合物9(250g)溶解在CH₂Cl₂(500.0mL)中，并在0℃缓慢地加入化合物6(334.0g，0.823mol)在CH₂Cl₂(500.0mL)中的冷溶液，同时N₂气鼓泡。加入后，将反应混合物搅拌20h，同时在RT下连续N₂鼓泡。(反应进程通过用水猝灭小量等分试样，用CH₂Cl₂萃取并点样在分析性硅胶TLC板上(25％MeOH/氯仿)和使用Mo染色和KMnO₄将样点显色来进行监测)。下面是混合物的各成分的R_fs：化合物6(0.8)和化合物10(0.3)。将反应混合物用CH₂Cl₂(2.0L)稀释，用盐水溶液(250mL)洗涤，经无水Na₂SO₄干燥并浓缩，获得粗化合物，将该粗化合物通过柱色谱纯化(硅胶100-200目)，使用5％MeOH/氯仿作为洗脱剂，得到作为淡黄色油获得的化合物10(153.0g，31.5％)。

反应步骤：

简要步骤：向10％Pd/C(40.0g，25％w/w，AlfaAesar)在乙醇(1.2L)中的悬液中加入化合物10(150g，0.298mol)并在RT下氢化(H₂，40psi压力)20h。(反应进程通过点样在分析性硅胶TLC板上(25％MeOH/氯仿)和使用Mo染色和茚三酮溶液将样点显色来进行监测)。下面是混合物的各成分的R_fs：化合物10(0.4)，化合物11(0.2)。将反应混合物通过硅藻土床过滤，用乙醇(2x200mL)洗涤滤饼，浓缩合并的滤液获得粗化合物，将该粗化合物通过柱色谱纯化(硅胶100-200目)，使用10％甲醇/氯仿作为洗脱剂，得到作为淡黄色油获得的化合物11(75g，60％)。

反应步骤：

简要步骤：在0℃向化合物5(48.0g，0.146mol，Nu-Chek-PrepInc)，DMF(1.0mL)在CH₂Cl₂(300.0mL)中的冷却溶液缓慢地加入草酰氯(22.3g，0.175mol，MoleculaLifesciences)，持续30min。加入后，将反应混合物在26℃搅拌4h。(反应进程通过用MeOH猝灭小量等分试样，并点样在分析性硅胶TLC板上(10％乙酸乙酯/pet醚)和使用KMnO₄溶液将样点显色来进行监测)。下面是混合物的各成分的R_fs：化合物12(0.3)，化合物13(0.8)。将反应混合物在N₂气氛中浓缩得到粗化合物6(57g，粗产物)。

反应步骤：

简要步骤：在0℃向化合物11(50.0g，0.102mol)在THF(1.0L)中的冷却溶液中加入吡啶(32.3g，0.409mol)，然后加入DMAP(12.5g，0.102mol)并搅拌10min。加入粗化合物13(57.0g，0.163mol)在甲苯(1.0mL)中的溶液，持续15min。加入后，将反应混合物在RT下搅拌20h。(反应进程通过用水猝灭小量等分试样，用EtOAc萃取并点样在分析性硅胶TLC板上(20％甲醇/氯仿)和使用Mo染色和茚三酮溶液将样点显色来进行监测)。下面是混合物的各成分的R_fs：化合物11(0.2)和PPI-1009(0.5)。将反应混合物用乙酸乙酯(2.0L)稀释，用0.5NHCl(250mL)，盐水溶液(250.0mL)洗涤，经无水Na₂SO₄干燥并浓缩得到粗化合物，将该粗化合物通过柱色谱纯化(硅胶100-200目)，使用20％甲醇/氯仿作为洗脱剂，得到作为淡黄色油获得的化合物PPI-1009(27g，33.3％)。

实施例5：PPI-1014的制备

靶分子

合成方案：

反应步骤：

反应时间：17h反应温度：0℃至26℃

简要步骤：向PPI-1005(12.0g，19.16mmol)在THF(600mL)中的冷却溶液中加入三苯基膦(Triphenylphosphene)(7.5g，28.75mmol)并在0℃搅拌10min，然后缓慢地加入DIEAD(5.8g，28.75mmol)。在0℃搅拌30min后，向反应混合物加入N-乙酰半胱氨酸(4.6g，28.75mmol)并在RT下搅拌16h。(反应进程通过用乙酸乙酯萃取并点样在分析性硅胶TLC板上(30％乙酸乙酯/pet-醚)和使用Mo染色将样点显色来进行监测)。下面是混合物的各成分的R_fs：PPI-1005(0.8)，PPI-1014(0.4)。

后处理和纯化：将反应混合物用水(75mL)稀释并使用乙酸乙酯(3x200mL)萃取。将合并的乙酸乙酯层用盐水(50mL)洗涤，经无水Na₂SO₄干燥并浓缩以得到粗化合物，将该粗化合物通过柱色谱纯化(100-200目硅胶)，使用0-13％乙酸乙酯/pet醚作为洗脱剂。

标题化合物PPI-1014(3.2g，22％)作为淡黄色油获得，其显示下列的特性。¹HNMR(300MHz，CDCl₃)：δ6.35(bs，1H)，5.39-5.22(m，13H)，4.92-4.88(m，1H)，4.55-4.22(m，3H)，3.55-3.41(m，5H)，3.02-2.97(m，2H)，2.85-2.77(m，10H)，2.40(s，5H)，2.112.04(m，5H)，1.57-1.52(m，2H)，1.36-1.25(m，30H)，0.97(t，J＝7.66Hz；3H)，0.88(t，J＝6.63Hz；3H).质量(M+H)：772.3，HPLC纯度～93.68％。

实施例6：动物研究

将雄性新西兰兔(NewZealandrabbits)(1.8-2.5kg)口服给药处于硬明胶胶囊(3号(size3))中的纯PPI-1011。对于时程研究，将兔子给予200mg/kgPPI-1011并且在1，3，6，12，18，24和48hr时通过给予过量euthenol处死动物。通过心脏穿刺采血，并将血浆在-70℃下冷冻用于后面的分析。还获取肾脏和肝脏并在-70℃下保存用于后面的分析。这些研究作为2次实验进行，两个实验在12hrs时具有重叠的分组(Exp.1：1，3，6，和12hrs；Exp.2：12，18，24和48hrs)。在每个时间点获取对照。提取缩醛磷脂和脂质，并如前所报道的那样通过LC-MS/MS分析(Goodenowe等，2007)。

如图11中所见，使用200mg/kg的口服剂量，将缩醛磷脂前体PPI-1011结合至循环缩醛磷脂中。还观察到在sn-2处的脱酰作用，释放二十二碳六烯酸(DHA)。最大的结合进入16:0/22:6，18:0/22:6和18:1/22:6乙醇胺缩醛磷脂和磷脂酰乙醇胺中。在参照品磷脂酰乙醇胺16:0/18:0中没有观察到变化。

对血浆中结合的时程的进一步检查(图12)表明最大结合在12小时，并且在剩余的观察期(48hr)内维持此结合水平。对于磷脂酰乙醇胺和乙醇胺缩醛磷脂两者均是如此。相反，循环DHA水平在6小时达到峰值，并且在18小时时回落到较低的稳态。

PPI-1011剂量依赖性结合至血浆缩醛磷脂和磷脂酰乙醇胺中的研究(图13)证明从10至200mg/kg以剂量依赖性的方式达到这些循环磷脂的新稳态水平。然而，进一步增加剂量没有将缩醛磷脂和磷脂酰乙醇胺的稳态水平增加至用200mg/kg获得的水平之上。相反，循环DHA的最高稳态水平在500mg/kg下获得并且在1000mg/kg的剂量下没有进一步增加。

在肾脏(图4和5)和肝脏组织(图6)中也观察到组织缩醛磷脂和DHA的增加。

这些结果表明PPI-1011在兔中可通过口服被生物利用，并且经由脱酰化/再酰化反应转变为含DHA的乙醇胺缩醛磷脂和磷脂酰乙醇胺。另外，结果提示内源性代谢系统可能限制在药理学上可以增强的最大增加。

实施例7：体外用缩醛磷脂前体调节膜蛋白的丰度

下列的研究证明缩醛磷脂前体(1-烷基-2酰基甘油)在改变膜驻留蛋白的丰度方面的有效性。在野生型细胞，以及在人工升高的膜胆固醇的条件下证明所述化合物的细胞效应。

在野生型细胞中，在缩醛磷脂前体浓度增加的条件下观察到，淀粉状蛋白前体蛋白(APP)调节酶ADAM10和胆固醇酯化蛋白SOAT1的增加。在胆固醇负载模型中观察到类似的效应。另外，不同的APP加工酶BACE1仅在胆固醇负载细胞中显示有丰度的下降。不希望受理论约束，此证据支持了在阿尔茨海默病的情况下降低淀粉状蛋白负载，和同时重新平衡系统的膜胆固醇含量，从而除阿尔茨海默病以外还在如动脉粥样硬化和高胆固醇血症的疾病的治疗中提供潜在益处的方法。

APP主要通过经典途径被加工，所述经典途径包括γ-分泌酶(由早老蛋白(presenilin)1/2基因编码)和α-分泌酶(由ADAM10编码)的相继切割。APP的此非病理学加工导致神经营养肽(sAPPα)的形成，神经营养肽保护免受谷氨酸盐毒性和低血糖症(Araki等，1991；Mattson等，1993；Postina等，2004；Fahrenholz，2007)。替代APP加工途径本身出现在阿尔茨海默病中，其中APP被富含胆固醇的脂膜筏中的γ-和β-分泌酶切割。此“非经典”途径导致形成38-43个氨基酸长的Aβ肽，其往往在细胞外基质中聚集成斑块，这是AD的标志(Selkoe，2002；Walsh等，2002；Selkoe，2003；Meyer-Luehmann等，2008)。尽管早发性家族性AD被解释为APP或APP加工酶(PSEN1/2，BACE，ADAM)中的遗传病变，迟发性散发性AD的根本原因(从非致病性转换为致病性APP加工)还不清楚。

已经在人类(Corder等，1993；Saunders等，1993；Blacker等，1997；Hofman等，1997)和动物模型(Joyce等，2002；Singaraja等，2002；VanEck等，2006；Wahrle等，2008)中研究了AD病因学中胆固醇内稳态的重要性。改变质膜的胆固醇含量已经显示影响膜驻留蛋白的功能(Scanlon等，2001；Lange等，2004)。在患有AD的受试者中显示升高的脑胆固醇(Mori等，2001)，而以富胆固醇膳食饲养的兔子已经显示在脑中形成斑块(Ghribi等，2006)。体外数据显示缩醛磷脂缺乏的细胞的膜中的游离胆固醇升高，而在人类中，血清缺乏缩醛磷脂已经显示与认知状态的减退相关(Goodenowe等，2007)。基于这些观察，我们研究了胆固醇和缩醛磷脂之间的相互作用，并且鉴定两者之间的平衡如何影响AD的病理表现(就测量分泌的Aβ而言)。

提议的作用模式：经由膜脂质调节的APP加工的转换

人胚肾细胞(HEK293)表达APP和加工APP所需的膜结合机制，使其成为研究APP加工的良好模型。这个体外研究确证了以前的研究，即经由负载胆固醇调节膜流动性和/或补充缩醛磷脂前体改变了细胞外Aβ42含量。在48小时孵育期后，HEK293细胞的胆固醇负载将细胞中游离胆固醇的量增加了17％(与对照相比)。与对照相比，这种升高伴随着条件培养基中Aβ42含量的平行和显著增加(p＜0.05)。淀粉状蛋白的65％增加主要是由β-分泌酶浓度的22％增加引起的(图18A，2道)；随着胆固醇负载，基线APP水平仍未改变。用缩醛磷脂前体PPI-1005处理胆固醇负载的HEK293系统显著地降低了细胞膜的游离胆固醇含量(p＜0.05)。在20μM浓度下，条件培养基中的Aβ42含量在胆固醇负载水平以下下降70％(p＝0.0001)，而条件培养基中的sAPPα含量升高。对APP加工的影响似乎不是由于APP表达的变化引起的，而似乎是由于APP加工酶的丰度改变导致APP加工途径的转换所引起的。尽管在20μM浓度的PPI-1005下，β-分泌酶恢复至正常水平，但在条件培养基中检测到sAPPα种类的73％增加。这种升高被解释为ADAM10的63％增加(图18A，3道)，ADAM10是负责形成sAPPα的酶。

在补充缩醛磷脂后细胞的胆固醇分布的改变可以解释为下面的观察：随着缩醛磷脂浓度增加，SOAT1(负责酯化游离胆固醇的酶)上调约25％(与胆固醇负载条件相比)(图18A，5道)。

在独立的研究中，在未负载胆固醇的野生型HEK293细胞中研究PPI-1005的作用。图18B显示ADAM10(35％)和SOAT1(50％)的丰度的浓度依赖性增加；没有观察到BACE1或APP丰度的变化。尽管当HEK293细胞通过普伐他汀抑制HMGCoA还原酶而消耗胆固醇时，ADAM10和SOAT1蛋白水平仍然没有变化(图18C)。尽管缩醛磷脂的处理和普伐他汀的处理两者均显著减少细胞中游离胆固醇的级分，仅缩醛磷脂处理改变了细胞中的ADAM10和SOAT水平。这提示对ADAM10和SOAT1丰度的作用是膜缩醛磷脂含量的作用而非膜胆固醇含量的作用。

因此，膜驻留蛋白的丰度可以在体外通过调节细胞缩醛磷脂含量而被改变，这通过用如本文所述的缩醛磷脂前体处理细胞来实现。

材料和方法

胆固醇负载

在DMEM，10％FBS中在37℃，5％CO₂下培养的HEK293细胞在处理前一天接种。第二天，将细胞膜用10μg/ml培养基的浓度的外源性胆固醇负载，如所述的那样使用甲基-β-环糊精作为载体来递送胆固醇(Rong等，2003)。

胆固醇测定

将细胞用缩醛磷脂前体PPI-1005处理或用作为对照的乙醇处理。48小时后使用乙二胺四乙酸：TryPLeexpress混合物(Versene：TryPLeexpresscocktail)收获细胞，用PBS洗涤细胞。脂质用包含1％TritonX-100的氯仿萃取。回收有机级分并将其在氮气流中干燥。将干燥的脂质重新悬浮在胆固醇反应缓冲液(Biovision，MountainView，CA)中，使用胆固醇定量试剂盒(Biovision，MountainView，CA)根据生产厂商的建议定量胆固醇的总级分、游离级分和酯化级分。将胆固醇初步计算为μg/百万个细胞，并且对于每个实验报告为对照条件的百分比。

淀粉状蛋白测定

HEK293细胞如所述的那样负载外源性胆固醇，并且用PPI1005或作为对照的乙醇处理。在48小时孵育期结束时收集来自处理细胞的条件培养基。为了测定Aβ_1-42含量，使用Amicon超离心过滤装置(Millipore，Billerica，MA)在负载至微量培养板之前富集条件培养基。根据生产厂商(CovanceLabs，Princeton，NJ)的建议进行ELISA。在加入底物后25分钟猝灭反应，并在495nm读取吸光度。实验一式三份地进行。将值计算为pg/ml条件培养基，并且针对来自未处理的胆固醇负载的对照HEK293细胞的条件培养基中检测到的Aβ的量标准化。

免疫印迹和免疫沉淀

将HEK293细胞如淀粉状蛋白测定中所述的那样处理。将细胞沉淀物在PBS中洗涤，并在含有蛋白酶抑制剂混合物(Sigma，St.Louis，MI)的RIPA缓冲液中溶解。使用Bio-Rad蛋白测定(Bio-RadProteinAssay)(Bio-Rad，Hercules，CA)定量细胞溶胞产物中的蛋白。使用下列的抗体用于western分析：APP(Calbiochem，Darmstadt，Germany)，BACE1和ADAM10(Millipore，Temecula，CA)，sAPPα(IBL，Gunma，Japan)，SOAT1(SantaCruzBiotechnologyInc.，CA)，和β-肌动蛋白(Sigma，St.Louis，MI)。进行免疫沉淀以评估条件培养基中的sAPPα。简言之，将针对sAPPα的抗体加入至条件培养基中并在4℃下孵育16小时。通过与蛋白A/G琼脂糖珠子在4℃孵育6小时进行IP。用PBS洗涤珠子，并且用抗sAPPα抗体进行免疫印迹检测洗脱的蛋白。使用Java语言的图像处理和分析(ImageJ)软件(国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)，Bethesda，MD)定量谱带强度。

统计学分析

使用Microsoft^TMOfficeExcel2007和JMP8版进行数据的统计学分析。应用多重比较Dunnett检验(Dunnett’stests)来分析处理和对照之间的差异。

对于本领域技术人员显而易见的是在不背离如权利要求中定义的本发明的范围的前提下可以作出许多变体和改型。

下面的参考文献，以及上面提供的那些参考文献，通过引用合并于此。

参考文献

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Claims

1.一种根据式I的结构的化合物：

其中R₁选自烷基或烯基烃链，所述烷基或烯基烃链选自由下列各项组成的组：CH₃(CH₂)₃-，CH₃(CH₂)₅-，CH₃(CH₂)₇-，CH₃(CH₂)₉-，CH₃(CH₂)₁₁-，CH₃(CH₂)₁₃-，CH₃(CH₂)₁₅-，CH₃(CH₂)₁₇-，CH₃(CH₂)₁₉-，CH₃(CH₂)₂₁-，CH₃(CH₂)₂₃-，CH₃(CH₂)₃CH＝CH(CH₂)₇-，CH₃(CH₂)₅CH＝CH(CH₂)₇-，CH₃(CH₂)₇CH＝CH(CH₂)₇-，CH₃(CH₂)₄CH＝CHCH₂CH＝CH(CH₂)₇-，CH₃CH₂CH＝CHCH₂CH＝CHCH₂CH＝CH(CH₂)₇-，CH₃CH₂(CH＝CH)-，CH₃(CH₂)₃(CH＝CH)-，CH₃(CH₂)₅(CH＝CH)-，CH₃(CH₂)₇(CH＝CH)-，CH₃(CH₂)₉(CH＝CH)-，CH₃(CH₂)₁₁(CH＝CH)-，CH₃(CH₂)₁₃(CH＝CH)-，CH₃(CH₂)₁₅(CH＝CH)-，CH₃(CH₂)₁₇(CH＝CH)-，CH₃(CH₂)₁₉(CH＝CH)-，CH₃(CH₂)₂₁(CH＝CH)-，CH₃(CH₂)₃CH＝CH(CH₂)₅(CH＝CH)-，CH₃(CH₂)₅CH＝CH(CH₂)₅(CH＝CH)-，CH₃(CH₂)₇CH＝CH(CH₂)₅(CH＝CH)-，CH₃(CH₂)₄CH＝CHCH₂CH＝CH(CH₂)₅(CH＝CH)，CH₃CH₂CH＝CHCH₂CH＝CHCH₂CH＝CH(CH₂)₅(CH＝CH)-，CH₃(CH₂)₃CH＝CH(CH₂)₇-，CH₃(CH₂)₅CH＝CH(CH₂)₇-，CH₃(CH₂)₇CH＝CH(CH₂)₇-，CH₃(CH₂)₄(CH＝CHCH₂)₂(CH₂)₆-，CH₃CH₂(CH＝CHCH₂)₃(CH₂)₆-，CH₃(CH₂)₄(CH＝CHCH₂)₄(CH₂)₂-，CH₃CH₂(CH＝CHCH₂)₅(CH₂)₂-，CH₃(CH₂)₇CH＝CH(CH₂)₁₁，和CH₃CH₂(CH＝CHCH₂)₆CH₂-；

R₂是CH₃CH₂(CH＝CHCH₂)₆CH₂-；

R₃是可由脂肪酶从根据式I的结构的化合物切割的，并且选自由下列各项组成的组：肉碱基团，乙酰基-D/L-肉碱基团，硫代肉碱基团，乙酰基-D/L-硫代肉碱基团，肌酸基团，去甲肉碱基团，硫辛酸基团，二氢硫辛酸基团，取代的或未被取代的氨基酸基团和下面所示结构的基团：

R₄和R₅独立地是氢或环状的、支链的或直链的1-7个碳原子的单价烷基；

R₆是氢或环状的、支链的或直链的1-7个碳原子的单价烷基；和

R₇和R₈独立地是氢或环状的、支链的或直链的1-7个碳原子的单价烷基，

包括所述式I化合物的外消旋物或分离的立体异构体和所述式I化合物的药用盐，

其中所述氨基酸选自由丙氨酸，精氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸，半胱氨酸，谷氨酰胺，谷氨酸，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，蛋氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，色氨酸，酪氨酸和缬氨酸组成的组，其中所述取代的官能团是环状的、支链的或直链的1-7个碳原子的单价烷基，乙酸酯或磷酸酯。

2.权利要求1的化合物，其中R3是N-乙酰半胱氨酸基团。

3.权利要求1所述的化合物，其中所述化合物选自由下列各项组成的组：2-乙酰氧基-4-(2-((4Z，7Z，10Z，13Z，16Z，19Z)-二十二-4，7，10，13，16，19-己酰氧基)-3-(十六烷氧基)丙氧基)-N，N，N-三甲基-4-氧代丁-1-铵(PPI-1009)，二十二-4，7，10，13，16，19-己烯酸((4Z，7Z，10Z，137，16Z，19Z)-1-(5-((R)-1，2-二硫戊环-3-基)戊酰氧基)-3-(十六烷氧基)丙-2-基)酯(PPI-1011)和二十二-4，7，10，13，16，19-已烯酸((4Z，7Z，10Z，13Z，16Z，19Z)-1-(2-乙酰氨基-3-巯基丙酰氧基)-3-(十六烷氧基)丙-2-基)酯(PPI-1014)。

4.一种药物组合物，所述药物组合物包含药用载体和式I化合物：

其中R₁至R₈如权利要求1或2中所定义，

和所述化合物的外消旋物或分离的立体异构体和所述化合物的药用盐。

5.权利要求4所述的药物组合物，其中所述化合物选自由下列各项组成的组：2-乙酰氧基-4-(2-((4Z，7Z，10Z，13Z，16Z，19Z)-二十二-4，7，10，13，16，19-己酰氧基)-3-(十六烷氧基)丙氧基)-N，N，N-三甲基-4-氧代丁-1-铵(PPI-1009)，二十二-4，7，10，13，16，19-已烯酸((4Z，7Z，10Z，13Z，16Z，19Z)-1-(5-((R)-1，2-二硫戊环-3-基)戊酰氧基)-3-(十六烷氧基)丙-2-基)酯(PPI-1011)和二十二-4，7，10，13，16，19-己烯酸(4Z，7Z，10Z，13Z，16Z，19Z)-1-(2-乙酰氨基-3-巯基丙酰氧基)-3-(十六烷氧基)丙-2-基)酯(PPI-1014)。

6.式I化合物、所述式I化合物的外消旋物或分离的立体异构体、所述化合物的药用盐或包含与药用载体混合的所述化合物的药物组合物在制备用于治疗或预防与增加的膜胆固醇、增加的淀粉状蛋白或减少的缩醛磷脂水平相关的衰老性疾病的药物中的用途，

其中R₁至R₈如权利要求1或2中所定义。

7.权利要求6所述的用途，其中所述衰老性疾病选自由下列各项组成的组：神经变性，认知损害，痴呆，癌症和血管疾病。

8.权利要求7所述的用途，其中所述神经变性疾病选自由下列各项组成的组：阿尔茨海默病，帕金森病和年龄相关的黄斑变性。

9.权利要求7所述的用途，其中所述癌症选自由下列各项组成的组：前列腺癌，肺癌，乳腺癌，卵巢癌和肾癌。

10.权利要求7所述的用途，其中所述血管疾病选自由下列各项组成的组：动脉粥样硬化和高胆固醇血症。

11.式I化合物、所述式I化合物的外消旋物或分离的立体异构体、所述式I化合物的药用盐或包含与药用载体混合的所述化合物的药物组合物在制备用于通过在PlsEtn缺乏系统或PlsEtn充足系统中将PlsEtn水平增加至对照水平之上来治疗或预防由缩醛磷脂缺乏介导的衰老性疾病的药物中的用途，

其中

R₃是可由脂肪酶从根据式I的结构的化合物切割的，并且选自由下列各项组成的组：具有4-28个碳的链的脂肪酸基团，肉碱基团，乙酰基-D/L-肉碱基团，硫代肉碱基团，乙酰基-D/L-硫代肉碱基团，肌酸基团，去甲肉碱基团，磷酸胆碱基团，硫辛酸基团，二氢硫辛酸基团，磷酸乙醇胺基团，磷酸丝氨酸基团，取代的或未被取代的氨基酸基团和下面所示结构的基团：

并且R₁，R₂和R₄至R₈如权利要求1或2中所定义，

12.权利要求11所述的用途，其中R3是N-乙酰半胱氨酸基团。

13.式I化合物、所述式I化合物的外消旋物或分离的立体异构体、所述式I化合物的药用盐或包含与药用载体混合的所述化合物的药物组合物在制备用于治疗或预防由胆固醇转运蛋白的异常基因表达引起的疾病的药物中的用途，

其中

并且R₁，R₂和R₄至R₈如权利要求1中所定义，

14.权利要求13所述的用途，其中R3是N-乙酰半胱氨酸基团。

15.权利要求13所述的用途，其中所述胆固醇转运蛋白是载脂蛋白E。

16.权利要求6-15中任一项所述的用途，其中所述化合物选自由下列各项组成的组：2-乙酰氧基-4-(2-((4Z，7Z，10Z，13Z，16Z，19Z)-二十二-4，7，10，13，16，19-己酰氧基)-3-(十六烷氧基)丙氧基)-N，N，N-三甲基-4-氧代丁-1-铵(PPI-1009)，二十二-4，7，10，13，16，19-己烯酸((4Z，7Z，10Z，13Z，16Z，19Z)-1-(5-((R)-1，2-二硫戊环-3-基)戊酰氧基)-3-(十六烷氧基)丙-2-基)酯(PPI-1011)和二十二-4，7，10，13，16，19-己烯酸((4Z，7Z，10Z，13Z，16Z，19Z)-1-(2-乙酰氨基-3-巯基丙酰氧基)-3-(十六烷氧基)丙-2-基)酯(PPI-1014)。

17.式I化合物：

包括所述化合物的外消旋物或分离的立体异构体和所述化合物的药用盐用于制备治疗或预防神经变性疾病的药物的用途，所述神经变性疾病选自由阿尔茨海默病，帕金森病和年龄相关的黄斑变性组成的组，其中

R₁选自烷基或烯基烃链，所述烷基或烯基烃链选自由下列各项组成的组：CH₃(CH₂)₃-，CH₃(CH₂)₅-，CH₃(CH₂)₇-，CH₃(CH₂)₉-，CH₃(CH₂)₁₁-，CH₃(CH₂)₁₃-，CH₃(CH₂)₁₅-，CH₃(CH₂)₁₇-，CH₃(CH₂)₁₉-，CH₃(CH₂)₂₁-，CH₃(CH₂)₂₃-，CH₃(CH₂)₃CH＝CH(CH₂)₇-，CH₃(CH₂)₅CH＝CH(CH₂)₇-，CH₃(CH₂)₇CH＝CH(CH₂)₇-，CH₃(CH₂)₄CH＝CHCH₂CH＝CH(CH₂)₇-，CH₃CH₂CH＝CHCH₂CH＝CHCH₂CH＝CH(CH₂)₇-，CH₃CH₂(CH＝CH)-，CH₃(CH₂)₃(CH＝CH)-，CH₃(CH₂)₅(CH＝CH)-，CH₃(CH₂)₇(CH＝CH)-，CH₃(CH₂)₉(CH＝CH)-，CH₃(CH₂)₁₁(CH＝CH)-，CH₃(CH₂)₁₃(CH＝CH)-，CH₃(CH₂)₁₅(CH＝CH)-，CH₃(CH₂)₁₇(CH＝CH)-，CH₃(CH₂)₁₉(CH＝CH)-，CH₃(CH₂)₂₁(CH＝CH)-，CH₃(CH₂)₃CH＝CH(CH₂)₅(CH＝CH)-，CH₃(CH₂)₅CH＝CH(CH₂)₅(CH＝CH)-，CH₃(CH₂)₇CH＝CH(CH₂)₅(CH＝CH)-，CH₃(CH₂)₄CH＝CHCH₂CH＝CH(CH₂)₅(CH＝CH)，CH₃CH₂CH＝CHCH₂CH＝CHCH₂CH＝CH(CH₂)₅(CH＝CH)-，CH₃(CH₂)₃CH＝CH(CH₂)₇-，CH₃(CH₂)₅CH＝CH(CH₂)₇-，CH₃(CH₂)₇CH＝CH(CH₂)₇-，CH₃(CH₂)₄(CH＝CHCH₂)₂(CH₂)₆-，CH₃CH₂(CH＝CHCH₂)₃(CH₂)₆-，CH₃(CH₂)₄(CH＝CHCH₂)₄(CH₂)₂-，CH₃CH₂(CH＝CHCH₂)₅(CH₂)₂-，CH₃(CH₂)₇CH＝CH(CH₂)₁₁，和CH₃CH₂(CH＝CHCH₂)₆CH₂-；

R₂是CH₃CH₂(CH＝CHCH₂)₆CH₂-；

18.权利要求17所述的用途，其中R3是N-乙酰半胱氨酸基团。

19.权利要求17所述的用途，其中所述化合物选自由下列各项组成的组：2-乙酰氧基-4-(2-((4Z，7Z，10Z，13Z，16Z，19Z)-二十二-4，7，10，13，16，19-己酰氧基)-3-(十六烷氧基)丙氧基)-N，N，N-三甲基-4-氧代丁-1-铵(PPI-1009)，二十二-4，7，10，13，16，19-己烯酸((4Z，7Z，10Z，13Z，16Z，19Z)-1-(5-((R)-1，2-二硫戊环-3-基)戊酰氧基)-3-(十六烷氧基)丙-2-基)酯(PPI-1011)和二十二-4，7，10，13，16，19-己烯酸((4Z，7Z，10Z，13Z，16Z，19Z)-1-(2-乙酰氨基-3-巯基丙酰氧基)-3-(十六烷氧基)丙-2-基)酯(PPI-1014)。

20.式I化合物、所述化合物的外消旋物或分离的立体异构体、或所述化合物的药用盐在制备用于治疗或预防血管疾病的药物中的用途，

所述血管疾病选自由动脉粥样硬化和高胆固醇血症组成的组，其中

R₂是CH₃CH₂(CH＝CHCH₂)₆CH₂-；

21.权利要求20所述的用途，其中R3是N-乙酰半胱氨酸基团。

22.权利要求20所述的用途，其中所述化合物选自由下列各项组成的组：2-乙酰氧基-4-(2-((4Z，7Z，10Z，13Z，16Z，19z)-二十二-4，7，10，13，16，19-己酰氧基)-3-(十六烷氧基)丙氧基)-N，N，N-三甲基-4-氧代丁-1-铵(PPI-1009)，二十二-4，7，10，13，16，19-己烯酸((4Z，7Z，10Z，13Z，16Z，19Z)-1-(5-((R)-1，2-二硫戊环-3-基)戊酰氧基)-3-(十六烷氧基)丙-2-基)酯(PPI-1011)和二十二-4，7，10，13，16，19-己烯酸((4Z，7Z，10Z，13Z，16Z，19Z)-1-(2-乙酰氨基-3-巯基丙酰氧基)-3-(十六烷氧基)丙-2-基)酯(PPI-1014)。