KR20110104002A - 플라스말로겐 화합물, 그를 함유하는 약제학적 조성물 및 노화의 질병을 치료하는 방법 - Google Patents

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Abstract

화학식(I)의 1-알킬, 2-아실 글리세롤 유도체의 합성 경로 및 치료 용도가 기술된다. 이는 포유동물 생물학적 시스템에 투여되었을 때, 시스템의 에테르 지질 합성 능력과 무관하게 특이적 sn-2 치환된 에탄올아민 플라스말로겐 의 세포내 농도를 증가시킨다. 이 방법으로 특이적 sn-2 치환된 종의 수준을 상승시키는 것은 막 콜레스테롤 수준을 낮추고 아밀로이드 분비를 저하시킬 수 있다. 이들 화합물은 퇴행성 신경질환(알쯔하이머 병, 파킨슨 병, 및 연령-관련된 황반변성을 포함), 인식 장애, 치매, 암(예, 전립선, 폐, 흉부, 난소, 및 신장암들 포함), 골다공증, 조울증 및 혈관 질병(예를 들어, 동맥 경화증, 고콜레스테롤혈증 포함)과 같은 증가된 막 콜레스테롤, 증가된 아밀로이드, 및 증가된 플라스말로겐 수준과 관련된 노화 질병을 치료하거나 예방하는데 사용될 수 있다.

Description

플라스말로겐 화합물, 그를 함유하는 약제학적 조성물 및 노화의 질병을 치료하는 방법{Plasmalogen Compounds, Pharmaceutical Compositions Containing The Same and Methods for Treating Diseases of the Aging}
본 발명은 유용한 생화학적, 생리화학적, 및 임상적 성질을 갖는 신규한 화학적 실재물(entities)의 합성 및 용도에 관한 것이다. 보다 특히는, 질병의 치료 또는 예방을 위해 사용될 수 있는 일련의 1-알킬, 2-아실 글리세롤 유도체가 제공된다. 본 발명은 또한 이러한 화합물을 포함하는 약제학적 조성물 및 키트에 관한 것이다.
암, 치매, 또는 감소된 인식 기능과 같은 많은 다양한 인간 질병이 노화에 따른 발병률에서 증가하고 있다는 것이 잘 알려져 있다. 유행병학상 및 통계적 관점에서, 이들 질병은 종종 매우 유사하게 보인다. 그러나, 임상적 관점에서, 암, 치매, 및 감소된 인식 기능의 각각은 매우 상이하다. 현재, 이들 질환의 가장 큰 위험 인자는 대상의 연령이다. 더욱, 대부분의 암, 치매, 및 감소된 인식 기능은 질병이 존재하나 무증상 징후(sub-clinical) 표시 단계인 장기간 전구증상의 단계(5-15 년)를 갖는다는 것이 잘 알려져 있다. 막 콜레스테롤에서의 연령-관련된 증가1-3 및 증가된 미토콘드리아 막 콜레스테롤4 -6이 보고되어 있다. 막 콜레스테롤에서의 이들 증가는 감소된 막 유동성2, 감소된 이온 채널 기능6 -8, 5'-뉴클레오티다제9 및
Figure pct00001
-세크레타제10, 및 산화 질소와 같은 신호 분자를 위한 변형된 확산 성질1 1을 가져온다.
막 콜레스테롤의 증가를 겪는 환자는 퇴행성 신경질환(알쯔하이머 병, 파킨슨 병, 다중 경화증 및 연령-관련된 황반변성(mascular degeneration), 인식 장애, 치매, 암(예, 전립선, 폐, 흉부, 난소, 및 신장), 골다공증, 조울증 및 혈관 질병(동맥 경화증, 고콜레스테롤혈증)의 증가된 발병률을 나타낸다.
특정 질병과 관련하여, 콜레스테롤이 심각성-의존 방법으로 알쯔하이머 환자의 뇌막에 축적된다12 -14. 이와 관련하여, 막 콜레스테롤을 낮추는 것은 베타- 및 감마-세크레타제의 활성을 감소시켜 베타-아밀로이드의 병원성 진행을 차단하는 것으로 나타났다15 -16. 분자 수준에서, 콜레스테롤은 아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 막 투과 도메인에 결합하여, APP를 베타- 및 감마-세크레타제가 풍부한 콜레스테롤-풍부 막 도메인에의 수송을 활성화시켜, 아밀로이드-베타 생성을 가져온다17. 증가된 콜레스테롤로부터 생기는 시냅스(synaptic)의 막 변화는 콜린성 신경전달(자가카나발리즘(autocannibalism) 개념)을 지지하는 막 인지질의 이용에서 또한 중요한 인자일 수 있다18. 스타틴(statins)의 초기 이용이 또한 알쯔하이머 병 및 파킨슨 병의 개시의 발병 또는 지연을 감소시키기 위하여 제안되었다19. 콜레스테롤 축적은 또한 연령-관련된 황반변성과 관련된 드루젠(drusen)에서 일어난다20. 막 콜레스테롤은 암에서 또한 증가되고21, 미토콘드리아 막 콜레스테롤에서의 증가는 대부분의 암 세포와 관련된 워버그(Warbug) 효과에 이르는 결함이라고 가설이 세워졌다22. 워버그 효과는 에너지를 위해 호흡에 거의 전적으로 의존하는 정상세포와는 달리 암 세포는 에너지를 위해 호흡 및 해당과정(glycolysis) 모두를 이용할 수 있다는 점에서 암세포의 특징을 정의하는 것이다.
콜레스테롤 축적의 복잡한 부정적 막 효과에 덧붙여서, 또한, 증가된 옥시스테롤 생성이 있다23. 이들 옥시스테롤은 세포 독성(아포프토시스 및 괴사)이고, 예비염증이며, GSH를 고갈시키고, 인지질증(phopholipidosis)을 유도한다23 -26. 이들 독성 옥시스테롤이 관여할 수 있는 질병에는 신경퇴행(신경세포성 및 탈수초성), 골다공증, 연령-관련된 황반변성 및 심혈관 질병, 특히 동맥경화증)이 있다23.
콜레스테롤을 감소시키기 위한 현행 임상적 치료는 주로 스타틴으로 콜레스테롤 합성을 억제하거나 에제티미베(ezetimibe)로 위장관으로부터 콜레스테롤 흡수를 차단하는 것으로 이루어졌다. 본 발명자들의 지식에 따르면, 현재 막 밖으로 콜레스테롤 수송을 운용하는 약물은 없다.
본 발명은 비정상적 막 콜레스테롤 수준과 연관된 노화의 질병을 치료하기 위한 화합물 및 방법에 관한 것이다. 상기 화합물은 막 유리 콜레스테롤 수준을 감소시키고 세포막으로부터 운반을 위한 콜레스테롤 에스테르화를 증가시키는 신규의 플라스말로겐 전구체를 포함한다. 그러므로, 이들 화합물은 상승된 막 콜레스테롤 수준을 겪는 대상에서 막 콜레스테롤 수준을 감소시키기에 유용하다. 이들 화합물은 증가된 막 콜레스테롤과 연관된 질병, 예를 들어 퇴행성 신경질환(알쯔하이머 병, 파킨슨 병, 다중 경화증 및 연령-관련된 황반변성(macular degeneration)을 포하나 이에 제한되지는 않음), 인식 장애, 치매, 암(전립선, 폐, 흉부, 난소, 및 신장암을 포함하나 이에 제한되지는 않음), 골다공증, 조울증 및 혈관 질병(동맥 경화증, 고콜레스테롤혈증 포함을 포함하나 이에 제한되지는 않음)을 치료하거나 예방하는데 또한 사용될 수 있다. 더욱이, 이들 화합물은 콜레스테롤 운반 단백질, 예를 들어 아포리포단백질 E의 비정상적 유전적 발현으로 부터 생기는 질환의 치료에 유용하다.
이들 플라스말로겐 전구체는 sn-1에서 알킬 또는 알케닐 지질 치환과 sn-2에서 아실 지질 치환을 갖는 글리세롤 주쇄(backbone)를 함유한다. 극성 치환체가 약제학적 성질을 개선하기 위하여(예를 들어, 안전성 및/또는 생물학적 이용가능성(bioavailabity)을 개선하기 위하여 또는 염으로서 제형화를 위해) sn-3에서 제공된다.
이론에 얽매이는 것을 원하지 않으면서, 특정 구현예에서, sn-3 치환체는 리파제에 의해 절단되고, 결과적인 1-알킬, 2-아실 글리세롤 또는 1-알케닐, 2-아실 글리세롤은 이어서 소포체에서 플라스말로겐으로 전환되고, 이에 의해 노화에 따라 감소된 기능을 보일 수 있는 퍼옥시좀 구획을 우회한다.
따라서, 조성물과 관련하여, 라세미체 또는 단리된 입체이성체(stereoisomer)를 포함하는 하기 화학식 (I)의 화합물 및 그의 약제학적으로 허용되는 염 또는 에스테르가 제공된다:
Figure pct00002
상기 식에서,
R1 및 R2는 같거나 상이하며; 하기 표 1 또는 표 2에서 선택된 알킬 또는 알케닐 탄화수소 쇄이며;
알킬 및 알케닐 탄화수소 그룹
Figure pct00003
Figure pct00004
불포화 시스 지방산 측쇄
Figure pct00005
R3은 지방산, 카르니틴, 아세틸-D/L-카르니틴, 티오카르니틴, 아세틸-D/L-티오카르니틴, 크레아틴, 노르카르니틴, 포스포콜린, 리포산, 디하이드로리포산, 포스포에탄올아민, 포스포세린, N-아세틸시스테인, 표 3에서 나타난 구조의 치환되거나 비치환된 아미노산 및 하기 표 3에 나타난 구조의 그룹들로부터 선택된 그룹이고;
Figure pct00006
R4 및 R5는 같거나 상이하며, 수소 또는 저급 알킬, 예를 들어 메틸 또는 에틸이며;
R6은 수소 또는 저급 알킬, 예를 들어 메틸 또는 에틸이고;
R7 및 R8은 같거나 상이하며, 수소 또는 저급 알킬, 예를 들어 메틸 또는 에틸이다.
본 발명의 또 다른 면은 약제학적으로 허용되는 담체 및 상기 기술된 화합물을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 한 구현예에서, R2는 도코사헥사에노 산(DHA) 측쇄, 또는 CH3CH2(CH=CHCH2)6CH2-일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 화합물은 2-아세톡시-4-(2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-도코사-4,7,10,13,16,19-헥사에노일옥시)-3-(헥사데실옥시)프로폭시)-N,N,N-트리메틸-4-옥소부탄-1-아미늄(aminium)일 수 있다.
Figure pct00007

다른 구현예에서, 상기 화합물은 (4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-1-(5-((R)-1,2-디티오란-3-일)펜타노일옥시)-3-(헥사데실옥시)프로판-2-일 도코사-4,7,10,13,16,19-헥사에노에이트:
Figure pct00008

또는 (4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-1-(2-아세트아미도-3-머캅토프로파노일옥시)-3-(헥사데실옥시)프로판-2-일 도코사-4,7,10,13,16,19-헥사에노에이트일 수 있다:
Figure pct00009

본 발명은 또한 PPI-1009, PPI-1011, PPI-1014, 또는 이들의 조합물을 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다.
이론에 얽매이는 것을 원치 않으면서, 본 명세서에서 기술된 화합물의 특정 구현예들은 플라스말로겐 수준 및 sn-3 위치에서 아세틸-L-카르니틴의 가수분해를 증가시킨다고 믿어지고, (i) 구조, 동역학, 기능 및 재구성(turnover)에서 변형을 가져오는 펩타이드 및 단백질에서 아미노산 및 N-말단 아미노산에서 아미노기(-NH2)및 수산화기(-OH)의 아세틸화; 및/또는 (ii) 보다 큰 분자의 구조, 분자 동역학, 및 기능에서 변화를 가져오는 보다 큰 분자에의 분자 차페론(chaperone)으로서 작용하는 것을 포함하는 가능성 있는(potential) 분자 메카니즘에 참여할 수 있다.
카르니틴(carnitine)은 지방산의 베타 산화에 중요하고, 아세틸 잔기는 아세틸-CoA 수준을 유지하는데에 사용될 수 있다. 아세틸-L-카르니틴(ALCAR) 작용은 (i) 뇌 에너지 및 인지질 대사; (ii) 신경영양 인자 및 호르몬을 포함하는, 세포 거대분자; (iii) 시냅스 형태; 및 (iv) 다중(multiple) 신경 전달 물질의 시냅스 전달을 조절하는 것을 포함한다.
본 발명의 다른 면에 따르면, 투여를 필요로 하는 환자에게 상기 기술된 바의 화합물 또는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 플라스말로겐 결핍에 의한 노화 질병의 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 면에서, 투여를 필요로 하는 환자에게 상기 기술된 바의 화합물 또는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 증가된 막 콜레스테롤, 증가된 아밀로이드 및 감소된 플라스말로겐 수준들과 관련된 노화 질병을 치료하는 방법이 제공된다.
본 발명은 또한 라세미체(racemates) 또는 단리된 입체이성체를 포함하는 하기 화학식 (II)의 구조에 따른 화합물 및 그의 약제학적으로 허용되는 염 또는 에스테르를 제조하는 방법에 관한 것이다:
Figure pct00010
상기 식에서,
R1, 및 R4 내지 R8은 상기 기술된 바와 같고, R9는 차단 그룹이다.
상기 방법은 하기 화학식 (III)의 화합물을 상기 화학식(II)의 화합물을 형성하는 조건에서 적절한 용매중에서 친핵성 촉매, 염기 및 차단제와 반응시키고, 임의로 생성된 화합물을 정제시키는 것을 포함한다.
Figure pct00011

발명을 제한하지 않는 구현예에서, 상기 차단제는 예를 들어 tert-부틸디메틸실릴 할라이드일 수 있고, 이는 이어서 tert-부틸디메틸실릴 그룹인 R9를 생성시킨다.
발명을 제한하지 않는 다른 구현예에서, 친핵성 촉매는 DMAP일 수 있고, 염기는 트리에틸아민일 수 있으며, 용매는 디메틸포름아미드(DMF) 및 CH2Cl2를 포함할 수 있다.
발명을 제한함이 없이, 특정 구현예에서, 차단제 첨가전에 0 내지 5℃에서 적절한 용매중에서 화학식(III)의 화합물, 친핵성 촉매, 및 염기를 포함하는 용액을 제조하고, 이어서 차단제를 첨가하며, 이어서 약 15 내지 약 25℃의 온도에서, 예를 들면, 약 20℃에서 반응을 수행하는 것이 바람직할 수 있다. 이어서 바람직하게는 반응이 완전하게 (20시간까지 될 수 있다) 진행되게 한다.
또한, 라세미체 또는 단리된 입체이성체를 포함하는 화학식(II)의 구조에 따른 중간체 화합물 및 그의 약제학적으로 허용되는 염 또는 에스테르가 제공된다:
Figure pct00012
(II)
상기 식에서,
R1, 및 R4 내지 R9는 상기 기술된 바와 같다.
본 발명의 이들 및 다른 특징이 첨부된 도면을 참조로 하는 하기 기술로부터 보다 명확해질 것이다.
도 1은 본 발명의 한 구현예에 따른 PPI-1009: 2-아세톡시-4-(2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-도코사-4,7,10,13,16,19-헥사노일옥시)-3-(헥사데실옥시)프로폭시)-N,N,N-트리메틸-4-옥소부탄-1-아미늄의 제조를 위한 일반적인 실험 과정을 보여준다.
도 2는 대조군 CHO 세포에 대해 N-Rel 세포에서 총 DHA 플라스말로겐의 감소된 수준이 PPI-1005(R1=16:0; R2=DHA; R3=OH), 72시간 인큐베이션, *p<0/05 대 비히클(veh)에 의해 농도 의존적 방법으로 회복되는 것을 보여준다.
도 3은 (A)플라스말로겐에의 PPI-1009(10μM)의 혼입의 시간 경과 및 (B) N-Rel 세포(0, 6, 12, 24, 48 및 72 시간)의 키밀 알코올 또는 결합된 알케닐-아실-글리세롤의 세포 수준에 대한 효과 결여를 보여준다. 세포 플라스말로겐 및 도코사헥사에노(DHA) 산을 LC-MS/MS로 정량하고, 한편 키밀 알코올은 GS-MS에 의해 정량하였다.
도 4는 (A) PPI-1005 및 PPI-1009에 의한 CHO 세포에서의 DHA 플라스말로겐의 농도-의존적(72 시간) 증가를 보여준다. (B) 키밀 알코올은 N-Rel 세포에서 DHA-플라스말로겐을 증가시키는 한편, CHO 세포에서는 어떤 효과도 없었다. 세포 플라스말로겐을 LC-MS에 의해 정량하였고, CHO 대조군 또는 N-Rel 대조군에 대해 표현했다.
도 5는 16:0(sn-1 알킬)/DHA(sn-2 아실) 글리세롤(PLM-05)와 함께 48시간 배양 후 N-Rel 세포에서의 막 콜레스테롤에서의 감소에 대한 농도 반응을 보여준다. 콜레스테롤 수준은 CHO 세포에 비해 N-Rel 세포에서 의미 있게 상승하는 것(p< 0.05)과 20 μM(PLM-05)에서 막 유리 콜레스테롤은 감소하는 것과 막 콜레스테롤 에스테르가 증가하는 것(p<0.05)을 주목해야 한다.
도 6은 PPI-1005(A; 1 및 5 μM) 및 PPI-1009(B; 0.5, 1, 2, 3 & 10μM)를 갖는 N-Rel 세포의 결합된 플라스말로겐(R1=16:0, R2=22:6, R3=포스포에탄올아민)에로의 구조-특이적 및 농도-의존적 혼입(72 시간)을 보여준다. sn-2에서의 지방산 치환은 또한 탈아실화 및 재아실화를 거쳐 sn-2에서 20:4, 18:3, 18;2 및 18:1을 갖는 결합된 플라스말로겐을 형성하였다. 세포 플라스말로겐은 LC-MS/MS에 의해 정량하여 비히클로 처리된 N-Rel 세포에 대해 표준화시켰다.
도 7은 막 콜레스테롤이 대조군 CHO 세포에 대해 돌연변이 N-Rel 세포에서 증가됨을 보여준다. N-Rel 세포에서 막 콜레스테롤은 sn-2에서의 비포화된 지방산, 특히 DHA와 조합하여 sn-1에서 팔미트산(16:0) 또는 스테아르산(18:0)을 갖는 플라스말로겐 전구체와 48시간 배양후(20 μM) 감소된다(p<0.05). 20 μM에서, 유리 DHA는 막 유리 콜레스테롤 수준을 변경시키는데 효과적이지 않았다. sn-1에서 알킬 결합을 갖는 유사체의 활성과 대조적으로, 디아실 유사체(16:0*:DHA 글리세롤)는 불활성이었다. PPI-1009(16:0/DHA /ALCAR)는 유리 콜레스테롤에서 가장 강한 감소를 생성하고, 에스테르화된 콜레스테롤의 증가를 가져왔다. V, 비히클.
도 8은 20 μM 16:0(sn-1 알킬)/DHA(sn-2 아실)글리세롤, 18:0/DHA 글리세롤, 또는 16:0/18:3 글리세롤과 48시간 배양후 HEK293 세포에서 막 콜레스테롤의 감소(p<0.04)를 보여준다. 20μM에서, 16:0/18:1 글리세롤, 16:0/18:2 글리세롤, 16:0/20:4 글리세롤 및 유리 DHA는 막 유리 콜레스테롤 수준을 변경시키는데 효과적이지 않았다. sn-1에서 알킬 결합을 갖는 유사체의 활성과 대조해서, 디아실 유사체(16:0*:DHA 글리세롤)는 비활성적이었다.
도 9는 16:0(sn-1 알킬)/DHA(sn-2 아실)/아세틸-L-카르니틴(sn-3 아실) 글리세롤(PPI-1009)과 48 시간 배양후 HEK293 세포에서의 막 콜레스테롤의 감소에 대한 농도 반응을 보여준다.
도 10은 PPI-1005(5a, 20μM)가 HEK293 세포에 의한 기본적이고 콜레스테롤(25.8 μM)-자극된 Aβ42 분비를 감소시킴을 보여준다(A). PPI-1009(PLM09, 10μM)도 유사한 방법으로 작용했다(B).
도 11은 토끼 혈장 중의 플라스말로겐에 대한 PPI-1011의 효과를 예시한다. PPI-1011이 젤라틴 캡슐로 200 mg/kg 경구 투여 후 1, 3, 6, 및 12 시간 후 혈장 에탄올아민 플라스말로겐(PlsEtn) 및 포스파티딜에탄올아민(PtdEtn)에 혼입되었다. 탈아실화제를 통한 sn-2으로부터 DHA(유리 22:6)의 방출을 또한 모니터링하였다. 그룹은 3 내지 5마리의 토끼로 구성되었다.
도 12는 플라스말로겐 전구체 PPI-1011의 순환 Pls 16:0/22:6, DHA, Pls 18:0/22:6, Pls 18:1/22:6 및 Ptd 16:0/22:6에로의 혼입의 시간 경과에 따른 플롯(plot)이다. 혈장 에탄올아민 플라스말로겐(Pls) 및 포스파티딜에탄올아민(Ptd)에서의 PPI-1011의 혼입을 젤라틴 캡슐로 200mg/kg으로 경구 투여 후 1, 3, 6, 18, 24 및 48 시간에서 측정하였다. 탈아실화제를 통한 sn-2에서의 DHA의 방출을 또한 모니터링하였다. 그룹은 2 개의 별개의 실험에서 7 마리의 토끼를 포함하는 12시간 시점외에는 3 내지 5 마리의 토끼로 구성되었다.
도 13은 혈장 플라스말로겐 및 포스파티딜에탄올아민에로의 PPI-1011의 투여량-의존적 혼입을 예시한다. 혈장 에탄올아민 플라스말로겐(Pls) 및 포스파티딜에탄올아민 (Ptd)에서의 PPI-1011의 혼입을 젤라틴 캡슐로 10, 75, 200, 500 및 1000 mg/kg의 경구 투여 후 6시간에서 측정하였다. 탈아실화제를 통해 sn-2로부터 DHA의 방출을 또한 모니터링하였다. 그룹은 3 내지 5 마리의 토끼로 구성되었다.
도 14는 토기 신장에서 PPI-1011에 의한 조직 플라스말로겐 및 DHA의 증가를 보여준다. 신장 에탄올아민 플라스말로겐(PlsEtn) 및 포스파티딜에탄올아민(PtdEtn)에서의 PPI-1011의 혼입을 젤라틴 캡슐로 200 mg/kg의 경구 투여 후 측정하였다. 탈아실화제를 통한 sn-2에서의 DHA(유리 22:6)의 방출을 또한 모니터링하였다. 그룹들은 3 내지 5 마리의 토끼로 구성되었다.
도 15는 토끼 신장에서 PPI-1011에 의한 조직 플라스말로겐 및 DHA 증가의 시간 경과를 보여준다. 신장 에탄올아민 플라스말로겐(16:0/22:6)에서의 PPI-1011의 혼입을 젤라틴 캡슐로 200 mg/kg 경구 투여 후 1, 3, 6, 12, 18, 24 및 48 시간 에서 측정하였다. 그룹들은 3 내지 5 마리의 토끼로 구성되었다.
도 16은 토끼 간에서 PPI에 의한 조직 플라스말로겐 및 DHA 증가의 시간 경과를 보여준다. 간 에탄올아민 플라스말로겐(16:0/22:6)에서의 PPI-1011의 혼입을 젤라틴 캡슐로 200 mg/kg으로 경구 투여 후 12, 18, 24 및 48 시간에서 측정하였다. 그룹들은 3 내지 5 마리의 토끼로 구성되었다.
도 17은 72 시간(5, 10 및 20 μM)후 N-Rel 에탄올아민 플라스말로겐(PLsEtn) 및 포스파티딜에탄올아민(PtdEtn)에서 PPI-1014의 구조-특이적 및 농도-의존 혼입을 보여준다. 세포 플라스말로겐을 LC-MS/MS로 정량하고, 비히클로 처리된 N-Rel 세포에 관련하여 표준화시켰다. 그룹들은 세개의 10cm2(plates)로 구성되었다.
도 18은 (A) 콜레스테롤 적재된 HEK293 세포에서의 막 존재 단백질에 대한 증가하는 PPI-1005 농도의 효과를 보여주고, (B) 야생형 HEK293 세포에서 막 존재 단백질에 대한 PPI-1005의 효과를 보여주며, (C) 막-존재 단백질 ADAM10 및 SOAT1에 대한 프라바스타틴(pravastatin)의 효과를 보여준다.
라세미체 또는 단리된 입체이성체를 포함하는 하기 화학식(I)의 구조에 따른 화합물 및 그의 약제학적으로 허용되는 염 또는 에스테르가 여기에 기술된다:
Figure pct00013
상기 식에서,
R1 및 R2는 같거나 상이하며, CH3(CH2)3-, CH3(CH2)5-, CH3(CH2)7-, CH3(CH2)9-, CH3(CH2)11-, CH3(CH2)13-, CH3(CH2)15-, CH3(CH2)17-, CH3(CH2)19-, CH3(CH2)21-, CH3(CH2)23-, CH3(CH2)3CH=CH(CH2)7-, CH3(CH2)5CH=CH(CH2)7-, CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7-, CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7-, CH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)7-, CH3CH2(CH=CH)-, CH3(CH2)3(CH=CH)-, CH3(CH2)5(CH=CH)-, CH3(CH2)7(CH=CH)-, CH3(CH2)9(CH=CH)-, CH3(CH2)11(CH=CH)-, CH3(CH2)13(CH=CH)-, CH3(CH2)15(CH=CH)-, CH3(CH2)17(CH=CH)-, CH3(CH2)19(CH=CH)-, CH3(CH2)21(CH=CH)-, CH3(CH2)3CH=CH(CH2)5(CH=CH)-, CH3(CH2)5CH=CH(CH2)5(CH=CH)-, CH3(CH2)7CH=CH(CH2)5(CH=CH)-, CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)5(CH=CH), CH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)5(CH=CH)-, CH3(CH2)3CH=CH(CH2)7-, CH3(CH2)5CH=CH(CH2)7-, CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7-, CH3(CH2)4(CH=CHCH2)2(CH2)6-, CH3CH2(CH=CHCH2)3(CH2)6-, CH3(CH2)4(CH=CHCH2)4(CH2)2-, CH3CH2(CH=CHCH2)5(CH2)2-, CH3(CH2)7CH=CH(CH2)11, 및 CH3CH2(CH=CHCH2)6CH2-로 구성된 그룹으로부터 선택된 알킬 또는 알케닐 탄화수소 쇄로부터 선택되고;
R3는 지방산, 카르니틴, 아세틸-D/L-카르니틴, 티오카르니틴, 아세틸-D/L-티오카르니틴, 크레아틴, 노르카르니틴, 포스포콜린, 리포산, 디하이드로리포산, 포스포에탄올아민, 포스포세린, N-아세틸시스테인, 치환되거나 비치환된 아미노산 및 하기 구조의 그룹으로부터 선택되는 그룹이며;
Figure pct00014

R4 및 R5는 독립적으로 수소 또는 저급 알킬이고;
R6는 수소 또는 저급 알킬이며; 그리고
R7 및 R8은 독립적으로 수소 또는 저급 알킬이다.
이러한 화합물은 증가된 막 콜레스테롤, 증가된 아밀로이드 또는 감소된 플라스말로겐 수준과 관련된 노화의 질병을 치료하거나 예방하는데 유용하다.
이러한 화합물은 플라스말로겐 결핍에 의한 노화의 질병을 치료하거나 예방하는데에 또한 유용하다.
이러한 화합물은 또한 퇴행성 신경질환(알쯔하이머 병, 파킨슨 병, 및 연령-관련된 황반변성을 포함하나 이에 제한되지는 않음), 인식 장애, 치매, 암(제한되는 것은 아니지만, 전립선, 폐, 흉부, 난소, 및 신장암들 포함), 골다공증, 조울증 및 혈관 질병(동맥 경화증, 고콜레스테롤혈증 포함하나 이에 제한되지는 않음)을 치료하는데 또한 사용될 수 있다.
본 발명에 있어, 화학식(I)의 화합물의 글리세롤 주쇄의 sn-1, sn-2, 및 sn-3 위치의 하이드록시 그룹을 전통적인 플라스말로겐 명명법을 사용하여 명명된다. 즉, 카보닐 그룹 -C=O(아세틸), -C(에테르 결합 형성) 및 -P(포스포릴)에 결합된 글리세롤의 산소 원자가 화학식(I)에서 명명된다.
발명을 제한하지 않는 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 화합물은 하나 이상의 키럴 중심을 함유할 수 있다. 전형적으로, 이러한 화합물은 라세미 혼합물로서 제조될 것이다. 그러나, 원한다면, 이러한 화합물은 순수한 입체이성체로서, 즉 개별적인 에난티오머 또는 디아스테레오머로서 또는 입체이성체-풍부 혼합물로서 제조되거나 단리될 수 있다. 화학식(I)의 화합물의 이러한 모든 입체이성체(및 풍부하게된 혼합물)는 본 발명의 범위내에 포함된다. 순수 입체이성체(또는 풍부하게된 혼합물)는 예를 들어 본 분야에 잘 알려진 광학적 활성 출발 물질 또는 입체선택적 시약을 이용하여 제조할 수 있다. 대안적으로는 이러한 화합물의 라세미 혼합물을 예를 들어 키럴 컬럼 크로마토그래피, 키랄 분할제등을 이용하여 분리할 수 있다.
정의
알킬/아실 지방산(표 1, 표 2) 및 생물학적 활성 화합물(표 3), 본 발명의 약제학적 조성물 및 방법을 기술할 때, 다음 용어들은 달리 특정되지 않으면 다음 의미를 갖는다.
"지방산"은 지방족 모노카복실산이고, 동물 또는 식물 지방, 오일 또는 왁스로 부터 유도되거나 에스테르화된 형태로 함유된다. 천연 지방산은 흔히 포화되거나 불포화일 수 있는 4 내지 28개 탄소(보통 비분지(unbranched) 및 짝수개의 수)의 쇄를 갖는다. 이들은 아실 지방족 카복실산으로서 알려져 있다.
포화된 지방산의 의미에서, 용어 "포화된"은 가능한 한 많은 수소를 함유하는 탄소들(초기 카복실 [-COOH] 그룹으로 부터 떨어진)을 언급한다. 다른 말로는, 오메가(ω) 말단이 3개의 수소 원자(CH3-)를 함유하고, 쇄내의 탄소는 2개의 수소 원자를 함유한다.
불포화 지방산(표 2에 기술된 예들을 포함하나 이에 제한되지는 않음)은 하나 이상의 알케닐 작용기가 쇄를 따라 존재하는 것 외에는 쇄의 단일 결합된 -CH2-CH2- 부분을 이중결합된 -CH=CH- 부분(즉, 또 다른 탄소에 이중결합된 탄소)으로 치환하는 알켄을 가지면서 포화 지방산에 유사한 형태이다. 이들은 시스(CIS)/트랜스(TRANS) 및 C:D(여기에서, C는 탄소 원자들의 수로 알려져 있고, D는 이중 결합으로 알려져 있다)로 명명된다.
"비치환된 및 치환된 아미노산"은 아미노 그룹, 카복실산 그룹 및 가변성 있는 측쇄를 함유하는 임의로 치환된 아미노산 잔기를 언급하며, 이 측쇄는 일반의 아미노산 측쇄, 즉 본 분야에 알려진 바의 단백질 또는 다른 것을 형성하는데 사용되는 것을 포함할 수 있다. 단백질을 형성하는 아미노산 잔기가 특히 바람직하며, 알라닌,아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린 아미노산 그룹을 포함한다. 아미노산 잔기상에서의 치환이 또한 가능하며, 제한되는 것은 아니지만 저급 알킬, 아세테이트, 포스페이트, 지질 및 탄수화물을 함유하는 작용기로의 치환을 포함한다.
용어 "저급 알킬"은 탄소 원자 1 내지 7개(C1-C7)의, 그리고 특정의 발명을 제한하지 않는 구현예에서는 탄소수 1 내지 4개(C1-C4)의 환형, 측쇄 또는 직쇄의 1가 알킬 라디칼을 언급한다. 이 용어는 추가로 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, t-부틸, i-부틸(또는 2-메틸프로필), 사이클로프로필메틸, i-아밀, n-아밀, 헥실, 및 헵틸과 같은 라디칼에 의해 예시된다. 저급 알킬은 또한 비치환되거나 치환될 수 있으며, 여기서, 치환된 알킬의 특정 예는 1,1-디메틸 헵틸이다.
"하이드록실"은 -OH를 언급한다.
"약제학적으로 허용가능한 염"은 생물학적 성질을 유지하면서 생물학적으로나 달리 바람직하지 않은 본 발명의 화합물의 임의의 염을 언급한다. 이러한 염은 본 분야에 잘 알려진 다양한 유기 및 무기 카운터-이온(counter-ions)으로부터 유도될 수 있으며, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 암모늄, 테트라알킬암모늄등을 포함하고; 분자가 염기성 기능을 함유할 때는 유기 또는 무기산의 염, 에를 들어 염화수소, 브롬화수소, 타르트레이트, 메실레이트, 아세테이트, 말리에이트, 옥살레이트등을 포함한다. 용어 "약제학적으로 허용가능한 양이온"은 산성 작용기의 약제학적으로 허용가능한 양이온 카운터 이온을 언급한다. 이러한 양이온은 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 암모늄, 테트라알킬암모늄 양이온등에 의해 예시된다.
"약학적으로 허용가능한 에스테르"는 카복실 그룹을 갖는 화확식(I)의 통상적으로 에스테르화된 화합물을 의미하고, 이 에스테르는 화학식(I)의 화합물의 생물학적 효과 및 성질을 유지하고, 생체내에서(유기체내에서) 상응하는 활성 카복실산으로 절단된다. 에스테르 및 약제학적 화합물의 전달을 위한 에스테르의 용도에 대한 정보는 문헌[Design of Prodrugs. Bundgaard H ed. (Elsevier 1985)]에서 이용가능하다. 또한 문헌[H. Ansel et. al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (6th Ed. 1995) at pp. 108-109] 및 문헌[Krogsgaard-Larsen, et al. Textbook of Drug Design and Development (2 Ed. 1996) at pp. 152-191] 참조하시오.
"약제학적 시약(agent)" 또는 "약물"은 대상에게 적절히 투여했을 때, 원하는 치료 또는 예방 효과를 유도할 수 있는 화학적 화합물 또는 조성물을 언급한다.
용어 "유효량"은 예를 들어 연구자 또는 임상의에 의해 구해지는 조직, 시스템, 동물 또는 인간의 생물학적 또는 의학적 반응을 유도해내는 약물 또는 약제학적 시약의 양을 의미한다. 또한, 용어 "치료적으로 유효량"은 이러한 양을 받지않은 대응되는 대상에 비해 질병, 질환 또는 부작용의 개선된 치료, 치유, 예방, 또는 수정(amelioration), 또는 질병 또는 질환의 진전률의 감소를 가져오는 임의의 양을 의미한다. 이 용어는 그의 범주 안에 정상적인 생리학적 기능을 향상시키는데에 효과적인 양을 포함한다.
모든 화학적인 화합물은 (+) 또는 (-) 입체이성체 어느 한쪽 뿐만 아니라 (+) 및 (-) 입체이성체 둘 모두를 포함한다.
본 명세서에서 다른 화학적인 용어는 문헌[The McGraw-Hill Dictionary(1985) and The Condenced Chemical Dictionary(1981)]에 예시된 바와 같이, 본 분야에 통상적인 사용에 따라 사용된다.
sn-1 및 sn-2에서 지방산에 의한 치환과 sn-3에서 지방산 또는 내생적인(endogenous) 대사 중간체 화합물로의 치환을 갖는 글리세롤 주쇄로부터 유도된 플라스말로겐 전구체를 포함하는, 본 명세서에 기술된 화합물은 도 1에 나타난 하기의 일반적인 방법 및 과정을 이용하여 쉽게 이용가능한 출발물질로부터 제조할 수 있다. 전형적인 또는 바람직한 공정 조건(즉, 반응 온도, 시간, 반응물, 용매, 압력등의 몰 비)이 주어지면, 다른 공정 조건 역시, 달리 언급되지 않으면, 사용될 수 있다. 최적의 반응 조건은 사용된 특별한 반응물 또는 용매에 따라 변할 수 있다. 그러나, 이러한 조건은 본 분야의 숙련된 자에 의해 일상의 최적화 과정으로 결정될 수 있다.
또한, 본 분야에 숙련된 자에게 명백해질 것으로, 통상적인 보호 그룹이 특정의 작용기가 원하지 않는 반응을 겪는 것을 방지하는 데에 필요할 수 있다. 특별한 작용기에 대해 적절한 보호 그룹 뿐만 아니라 보호 및 탈-보호를 위한 적절한 조건들의 선택은 본 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 수 많은 보호 그룹,및 그들의 도입 및 제거는 문헌[T.W. Greene and G. M. Wuts, Protecting Groups in Organic Synthesis, Second Edition, Wiley, new York, 1991] 및 거기에 인용된 참조 문헌에 기술되어 있다.
본 명세서에 기술된 화합물의 합성의 바람직한 방법에서, sn-1 및 sn-2에서 지방산으로 그리고 sn-3에서 지방산 또는 본 명세서에 기술된 바 내생적인 대사 중간체 화합물로의 글리세롤 치환은 글리세롤-주쇄의 하이드록실 그룹을 적절한 보호 그룹으로 보호/탈보호하고, 이어서 화합물, 예를 들어 PPI-1009, PPI-1011 및 PPI-1014의 O-알킬화 및 O-아실화에 의해 이어진다.
의약으로서 이용될 때, 본 명세서에 기술된 화합물은 전형적으로 약제학적 조성물의 형태로 투여된다. 이러한 조성물은 약제학적 분야에서 잘 알려진 과정을 이용하여 제조될 수 있고, 적어도 하나 이상의 활성 화합물을 포함한다.
일반적으로, 본 발명의 화합물은 약제학적 유효량으로 투여된다. 실제적으로 투여되는 화합물의 양은 전형적으로 치료하려는 상태, 투여의 선택된 경로, 투여되는 실제 화합물, 연령, 체중, 및 개개 환자의 반응, 환자 증상의 심각성등을 포함하는 관련 상황의 견지에서 의사에 의해 결정될 것이다.
본 명세서에 기술된 화합물 및 조성물은 예로서 경구, 국소, 직장, 경피, 피하, 정맥내, 근육내, 비강내등을 포함하는 임의의 적절한 경로에 의해 질병을 치료 및/또는 방지하기 위하여 대상, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간에 투여될 수 있다. 전달의 의도된 경로에 따라, 본 발명의 화합물은 바람직하게는 경구, 국소적 또는 주사가능한 조성물로서 제형화된다.
경구 투여용 약제학적 조성물은 벌크(bulk) 액체 용액 또는 현탁액 또는 벌크 분말의 형태를 취할 수 있다. 그러나, 보다 흔히는 이러한 조성물은 정확한 투여를 용이하게 하기 위하여 단위 투여 형태로 제공된다. 용어 "단위 투여 형태"는 인간 대상 및 다른 포유동물용 단위 투여 형태로서 적절한 물리적으로 분리된 단위들을 언급하며, 각 단위는 적절한 약제학적 부형제와 결합하여 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 활성 물질의 미리 결정된 양을 함유한다. 전형적인 단위 투여 형태는 액체 조성물의 미리 채워진, 미리 측정된 앰풀 또는 시린지(syringes) 또는 고체 조성물의 경우에 환약, 정제, 캡슐등을 포함한다.
경구 투여에 적절한 액체 형태는 버퍼, 현탁제 및 분산제, 착색제, 향미제등과 함께 적절한 수성 또는 비수성 비히클을 포함할 수 있다. 고체 형태는 예를 들어 하기 성분 또는 유사한 성질의 화합물의 어느 것을 포함할 수 있다: 결합제, 예를 들어 미세결정성 셀룰로즈, 검 트라칸트 또는 젤라틴; 부형제, 예를 들어 전분 또는 락토즈; 붕해제, 예를 들어 알긴산, 프리모겔(Primogel), 또는 옥수수 전분; 윤활제, 예를 들어 마그네슘 스테아레이트; 유동화제, 예를 들어 콜로이드성 이산화 규소; 감미제, 예를 들어 슈크로즈 또는 사카린; 또는 향미제, 예를 들어 페퍼민트, 메틸 살리실레이트, 또는 오렌지 향미제.
국소적 조성물은 전형적으로 활성 성분(들)을 일반적으로 약 0.01 내지 약 20중량%, 바람직하게는 약 0.1 내지10 중량%, 및 보다 바람직하게는 약 0.5 내지 약 15 중량% 범위의 양으로 함유하는 국소적 연고 또는 크림으로서 제형화 된다. 연고로서 제형화될 때, 활성 성분은 전형적으로 파라핀성 또는 수-혼화성 연고 베이스와 조합된다. 달리는, 활성 성분은 예를 들어 수-중-유 크림 베이스와 함께 제형화 될 수 있다. 이러한 국소적 베이스는 본 분야에 잘 알려져 있고, 일반적으로 활성 성분 또는 제제의 피부 침투 또는 안전성을 향상시키기 위하여 추가의 성분들을 포함한다. 모든 이러한 국소적 제제 및 성분들은 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본 발명의 화합물은 또한 경피 장치를 통해 투여될 수있다. 따라서, 국소적 투여는 저장소(reservoir) 또는 다공성 막 타입, 또는 고체 매트릭스 종류(variety)의 패치를 사용하여 달성될 수 있다.
주사가능한 조성물은 전형적으로 주사가능한 멸균 식염수(sterile saline) 또는 인산염-완충된 식염수 또는 본 분야에 알려진 다른 주사가능한 담체에 기초한다. 전처럼, 이러한 조성물에서 알킬 니트론 화합물은 전형적으로 소수 성분이고, 종종 약 0.05 내지 10중량%이며, 나머지는 주사가능한 담체들이다.
경구적으로 및 국소적으로 투여가능한 또는 주사가능한 조성물용 상기 기술된 성분들은 단지 대표적이다. 다른 물질 및 가공 기법들이 본 명세서에 참고로 혼입되는 문헌[Part 8 of of Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, 1990, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 18042]에 기술되어 있다.
본 발명의 화합물은 또한 서방형으로 또는 서방 약물 전달 시스템으로 투여될 수 있다. 대표적인 서방 물질의 기술은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences]중의 혼입된 물질들에서 발견될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 정제, 캡슐, 액체, 주사 제제, 또는 연고로 제형화될 수 있다. 그러나, 본 발명은 다음 약제학적 조성물로 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 여전히 어느 방법으로도 제한하려 함이 없이, 화학식(I)의 화합물을 대략 5 mg/mL의 적절한 농도로 완충화된 멸균 식염수 주사가능한 수성 매체에 용해시킬 수 있다.
본 발명은 또한 동물에게 약제학적 활성제를 투여하는 것을 단순화시킬 수 있는 키트를 포함한다. 본 발명의 전형적인 키트는 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 단위 투여 형태를 포함한다. 한 구현예에서, 단위 투여 형태는 본 발명의 약제학적 조성물을 함유하면서, 유리하게는 멸균될 수 있는 용기(container)(예를 들어, 바이알, 포우치(pouch), 튜브, 시린지(syringe)등)이다. 키트는 추가로 증상을 치료하거나 예방하는 약제학적 활성제의 사용을 지시하는 라벨 또는 인쇄된 지시서를 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 키트는 본 발명의 약제학적 조성물의 단위 투여 형태 및 점적기, 시린지, 또는 약제학적 조성물을 투여하기 위한 다른 국소장치(applicator)를 포함한다. 전형적으로 키트의 성분들, 예를 들어 단위 투여 형태 및 지시서는 적절한 패키징 물질 안에 포함된다.
본 명세서에서, sn-2에서 도코사헥사에노 산(22:6) 치환을 갖는 생물학적으로 이용가능한(bioavailable) 플라스말로겐 전구체가 막 콜레스테롤 수준을 감소시킨 것이 나타난다. 대조적으로, sn-2에서 스테아르산(18:0), 올레산(18:1), 리노에산(18:2), 아라키돈산(20:4) 또는 리놀렌산(18:3)이 훨씬 덜 활성적이고, 유리(free) DHA는 비활성적 이었다. sn-1에서의 지방산 치환은, 아실 결합이 콜레스테롤-저하 활성을 완전히 제거하면서, 알케닐 결합에 대한 절대적인 요구를 나타냈다. 알케닐 결합은 소포체에서 알킬 전구체(예를 들어, PPI-1009)로부터 생성될 수 있다; 그러나, 합성 알케닐 형태도 또한 가능한 치료 분자일 수 있다. 이들 표적화된 플라스말로겐 전구체의 약제학적 성질은 sn-3에 극성 치환체를 첨가하여 또한 개선될 수 있다. 이 치환은 i)sn-327-28로의 이동으로 sn-2 치환의 안정화; ii) 제제 및 약물 용해 및 흡수를 개선하는 약제학적으로 허용가능한 염의 생성 능력; 및 iii) 전구체가 상응하는 내생 플라스말로겐으로 전환될 수 있도록 리파제에 의해 쉽게 제거되는 sn-3 치환체의 능력29을 포함하는 개선된 약제학적 성질을 제공한다.
따라서, 포유동물 생물학적 시스템에 본 발명의 화합물을 투여하는 것은 시스템의 에테르 지질 합성 능력에 무관하게 특이적 sn-2 치환된 에탄올아민 플라스말로겐의 세포 농도를 증가시킨다. 이들 sn-2 치환된 종(species)의 상승된 수준은 막 콜레스테롤의 수준을 낮추고, 아밀로이드 분비를 저하시켜, 따라서, 이들 화합물을 증가된 막 콜레스테롤, 증가된 아밀로이드, 및 감소된 플라스말로겐 수준과 관련된 노화 질병의 치료 또는 예방에 유용하게 만든다.
이론에 얽매이는 것을 원하지 않으면서, 본 명세서에 기술된 화합물은 퍼옥시좀 에테르 지질 생합성 경로를 우회할 수 있어 플라스말로겐 결핍 대상에서 플라스말로겐 수준의 회복 및 특이적 콜레스테롤 저하 플라스말로겐의 약제학적으로 유효한 콜레스테롤 저하 수준의 전달을 가능하게 한다고 믿어진다. 따라서, 이들 분자는 플라스말로겐의 감소된 수준, 막 콜레스테롤의 증가된 수준 또는 증가된 아밀로이드 수준과 관련된 질병을 치료하거나 예방하는데 사용될 수 있다. 이들 인자들은 광범위한 다양한 인간 질병, 예를 들어 퇴행성 신경질환(제한되는 것은 아니지만 알쯔하이머 병, 파킨슨 병, 및 연령-관련된 황반변성을 포함), 인식 장애, 치매, 암(제한되는 것은 아니지만, 전립선, 폐, 흉부, 난소, 및 신장암들 포함), 골다공증, 조울증 및 혈관 질병(제한되는 것은 아미지만, 동맥 경화증, 고콜레스테롤혈증 포함)에서 원인인 것으로 믿어진다. 따라서, 본 발명은 기술된 플라스말로겐 전구체를 이용하여 이들 질병을 치료하는 것에 관련이 있다. 또한, 이들 유도체는 아포리포단백질 E와 같은 콜레스테롤 운반 단백질의 비정상적 유전적 발현으로부터 생기는 질환의 치료에 유용성을 갖는다.
또한, 1-알킬-2-알킬 글리세롤의 투여가 P1sEtn 정상 및 P1sEtn 결핍 시스템모두에서 P1sEtn 수준의 입체선택적 상승을 가져오는 것이 본 명세서에서 나타난다. 이들 데이타는 또한 처음으로 1-알킬, 2-아실글리세롤이 막 콜레스테롤 수준 및 아밀로이드 수준을 감소시키며, 이들 효과가 sn-2 위치에서 특이적 지방산 치환을 요구한다는 것을 나타낸다.
본 발명자들은 또한 본 명세서에서
1) sn-1에서의 에테르 결합이 안정하고 추가로 불포화화효소(소포체)에 의해 가공되어 플라스말로겐의 특징인 sn-1에서의 필수적인 알케닐 결합을 생성하나, 이 불포화화가 CDP-에탄올아민 트랜스퍼라제(소포체)의 첨가에 의해 포스포에탄올아민의 첨가 후 일어난다는 것;
2) sn-3에서 전하를 띤 치환이 sn-2에서의 지방산 치환을 sn-3으로의 이동27 -28 으로부터 안정화시키는 것;
3) sn-3에서의 전하를 띤 치환이 세포 리파제에 의해 쉽게 절단되어 CDP-에탄올아민 트랜스퍼라제(소포체)에 의한 포스포에탄올아민의 첨가를 위한 유리 하이드록실 그룹을 제공하는 것;
4) sn-2에서의 지방 산 치환체가 세포내의 다른 지방산에 의해 탈아실화 및 재아실화를 겪을 수 있다는 것;
5) sn-2에서의 DHA 치환이 막 콜레스테롤을 저하시키는데 최적이라는 것, 및
6) sn-3에서의 전하를 띤 치환이 새로이 제공된 플라스말로겐 전구체의 약제학적 성질(안전성, 생물학적 이용성 및 염으로서의 제형화)을 개선한다는 것을 밝혀냈다.
본 발명의 화합물은 손상된 플라스말로겐 생합성 능력을 갖는 세포에서 및 손상되지 않은 플라스말로겐 생합성 능력을 갖는 세포에서 P1sEtn 종으로 효과적으로 전환된다. 이들 결과들은 기타의 플라스말로겐 전구체와 관련하여 선행 기술과 직접적으로 대조적이다. 1-알킬, 2-하이드록시 글리세롤(키밀, 바틸, 살라킬 알코올)은 P1sEtn 결핍 시스템에서의 P1sEtn 수준을 대조군 수준들까지 증가시키나 P1sEtn 결핍 시스템 또는 P1sEtn 충분 시스템 어느 쪽에서도 상기 대조군 수준 보다 위로 증가시키지는 않는다는 것을 보여준다. 그러므로, 본 발명의 화합물은 플라스말로겐 결핍에의한 노화 질병의 예방에서 유용하며, 그러나 P1sEtn 결핍 또는 P1sEtn 충분 시스템 어느 쪽에서도 P1sEtn 수준을 상기 대조군 수준 보다 위로 증가시킨다.
상기 언급된 바와 같이, 본 명세서에서 기술된 화합물은 다양한 약물의 전달 시스템에 사용하기에 적절하다; 그러나, 본 발명을 제한하려는 의도는 없이, 화합물들은 특히 캡슐 또는 정제로 경구 전달에 특히 유용하다. 이러한 구현예에서, 최대 총 투여량은 40 내지 80 kg 인간 환자 경우 2g/일을 초과할 것으로 기대되지는 않는다.
다음 실시예에서, 하기 약어들은 하기 의미를 갖는다.
하기에 정의되지 않은 약어는 일반적으로 받아들여지는 의미를 갖는다.
bd = 넓은 이중선
bs = 넓은 단일선
d = 이중선
dd = 이중선으로 갈라진 이중선
dec = 분해된
dH2O = 증류수
ELISA = 효소-결합된 면역흡착제 분석
EtOAc = 에틸 아세테이트
EtOH = 에탄올
g = 그램
h = 시간
Hz = 헤르츠
ip = 복강내
L = 리터
m = 다중선
min = 분
M = 몰
MeOH = 메탄올
mg = 밀리그램
MHz = 메가헤르쯔
mL = 밀리리터
mmol = 밀리몰
m.p. = 융점
N = 노르말
po = 입으로, 경구
q = 사중선
quint. = 오중선
s = 단일선
t = 삼중선
THF = 테트라하이드로푸란
tlc = 박층 크로마토그래피
㎍ = 마이크로그램
μL = 마이크로리터
UV = 자외선
하기 실시예에서, 모든 온도는 달리 나타내지 않는 한 섭씨이다.
하기 합성 및 생물학적 실시예는 본 발명을 예시하기 위하여 제공되며, 어떠한 방법으로든지 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다.
실시예
실시예 1: 화학적 합성
PPI-1009: 2-아세톡시-4-(2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-도코사-4,7,10,13,16,19-헥사노일옥시)-3-(헥사데실옥시)프로폭시)-N,N,N-트리메틸-4-옥소부탄-1-아미늄을 하기 일반적인 실험 과정에 따라 제조하였다.
단계-1
0℃에서 무수(dry) DMF(20 mL)중의 비표지된 PPI -1001(50 g, 158 밀리몰)의 용액에 이미다졸(21.5 g, 316 밀리몰)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 10분 동안 교반하였다. DMF(50 mL)중의 TBDMS-Cl(26.2 g, 174 밀리몰)의 용액을 적가하고, 생성된 용액을 실온에서 4 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물(50 mL)로 희석하고, EtOAc로 2회 추출하였다(2 x 250 mL). 유기 층을 얼음 물로 2회 세척하고(2 x 100 mL), 염수(50 mL)로 세척하며, 건조시키고(Na2SO4), 증발시켜 조 화합물 4를 수득하여 컬럼 크로마토그래피(중성 알루미나, EtOAc-Pet 에테르(0.5:9.5))에 의해 정제하여 화합물 3(45 g, 66%)을 수득하였다. Rf=0.65 (EtOAc-Pet 에테르(1-9)).
단계-2
0℃ 에서, DMF(750 mL)중의 화합물 3(75 g, 174 밀리몰)의 용액에 NaH(오일중의 60% 분산물, 5 g, 209 밀리몰)를 일부씩 첨가하고, 30분 동안 교반하며, 벤질 브로마이드(44.8 g, 262 밀리몰)를 1시간에 걸쳐 적가하고, 서서히 실온으로 되게하며, tlc 분석에 의해 입증되는 바와 같이 화합물 3이 완전히 소모될 때까지 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 0℃까지 냉각시키고, 메탄올(5 mL), 얼음 냉각수(50 mL)를 첨가하며, Et2O로 2회 추출하며(2 x 250 mL), 유기 층을 물로 2회(2 x 50 mL), 염수(50mL)로 세척하며, 건조시키고(Na2SO4), 증발시켜 황색 오일로서, 조 화합물 4 (90 g)(Rf=0.7; EtOAc-Pet 에테르[5-95])를 수득하고, 이를 추가의 정제 없이 다음 단계를 위해 있는 그대로 사용하였다.
단계-3
-15℃에서, 무수(dry) THF(15 mL)중의 화합물 4(1.7 g, 3.26 밀리몰)의 용액에 무수 THF(5 mL)중의 TBAF(1.78 g, 6.53 밀리몰)의 용액을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온으로 서서히 가온시키고 tlc에 분석에 의해 입증된 바와 같이 화합물 4가 완전히 소모될 때 까지 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 물(10 mL)로 반응을 멈추게 하고, EtOAc로 2회 추출하고(2x 50 mL), 유기 층을 염수(20 mL)로 세척하며, 건조시키고(Na2SO4), 증발시켜 조 화합물 6을 수득하고, 이를 섬광 크로마토그래피(100-200 메쉬 실리카 겔, EtOAc-Pet 에테르(3:7))로 정제하여 연한 황색 오일로서 화합물 5(850 mg, 65%)를수득하였다. Rf=0.54(EtOAc-Pet 에테르(3:7).
단계-4
0 ℃에서 무수(dry) CH2Cl2(50 mL)-DMF(3 방울)중의 화합물 7(8 g, 39 밀리몰)의 용액에 옥살릴 클로라이드(4.2 mL, 40 밀리몰)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온으로 서서히 가온하고, 5 시간동안 교반하였다. 과잉 옥살릴 클로라이드를 증발시키고, 잔류물을 톨루엔에 용해시키며, 용매를 증발시켜 화합물 6을 수득하였다. 무수 CH2Cl2(25 mL)중의 화합물 6의 용액을 무수 CH2Cl2(50 mL)중의 화합물 5(11 g, 20 밀리몰)의 용액에 적가하고, 생성된 용액을 tlc 분석에 의해 증거된 입증된 바와 같이 화합물 5가 완전히 소모될 때 까지 아르곤 가스로 깨끗이 했다(purged). 반응 혼합물을 농축시켜 조 화합물 8(14 g)을 수득하고, 이를 추가의 정제없이 다음 단계에서 있는 그대로 사용하였다. Rf=0.54(MeOH-CHCl3(1:4)).
단계-5
EtOH(50 mL)중의 화합물 8(14 g, 조(crude))의 용액을 TLC 분석에 의해 나타난 바와 같이 화합물 8이 완전히 소모될 때 까지 40 psi에서 10% Pd/C상에서 수소화시켰다. 반응 혼합물을 여과하고, 증발시켜 조 화합물 9를 수득하며, 이를 중성 알루미나상에서 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 연갈색 오일로서 화합물 9(두 단계에 걸쳐 6 g, 6 g, 61%)를 수득하였다(Rf=0.25(MeOH-CHCl3(2:3)).
단계-6
0 ℃에서, THF(150 mL)중의 화합물 9(8.2 mg, 16 밀리몰)의 용액에 DAMP의 촉매량(1.9 g, 20 밀리몰), 피리딘(7.6 mL, 90 밀리몰)을 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 무수 CH2Cl2중의 DHA-Cl의 용액(DHA-산(7.7 g, 20 밀리몰)에 0℃에서 무수 CH2Cl2(50 mL)중의 옥살릴 클로라이드 용액(2.5 mL, 28 밀리몰)을 첨가하고 과잉 옥살릴 클로라이드를 증발시켜 DHA-Cl을 얻음)을 0℃에서 반응 혼합물을 적가하고 0.5 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 서서히 가온시키고 24시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물(50 mL)로 희석시키고, EtOAc로 2회 추출하고(2 x 200mL), 염수(50 mL)로 세척하며, 건조시키고(Na2SO4), 증발시켜, 조 생성물을 얻고, 이를 컬럼 크로마토그래피(중성 알루미나 MeOH-CHCl3(5:95))로 정제하여 연갈색 반고체로 PPI -1009(1.2 g, ~ 10%, 1.7 g의 불순물과 함께 HPLC 순도 97%)를 수득하였다. Rf=0.45(MeOH-CHCl3(15:85).
실시예 2: 생물학적 시험
중국 햄스터 난소 (CHO), N-Rel30(퍼옥시좀 효소 디하이드록시아세톤포스페이트 아실트랜스퍼라제에서 결핍된 돌연변이 CHO 세포), 인간 배아(embryonic) 신장(HEK293) 세포를 10 ㎠ 디시(dish)안의 10% FBS를 함유하는 DMEM/Ham's F12(1:1)에서 성장시켰다. 세포를 에탄올(0.1%의 최종 에탄올 농도)중에 용해된 플라스말로겐 전구체와 함께 배양하고 LC-MS-MS31에 의해 플라스말로겐 분석을 위하여 수획하고, 콜레스테롤 및 콜레스테롤 에스테르를 시판되는 비색정량(colorimetric) 키트(BioVision #K613)를 이용하여 분석하였다.
sn-1에서 16:0을 갖고, sn-2에서 DHA를 가지며, sn-3에서 OH 또는 아세틸-L-카르니틴을 갖는 1-알킬, 2-아실 글리세롤, PPI-1005 또는 PPI-1009 각각을 손상된 플라스말로겐 생합성 능력을 갖는 세포(N-ReL, 도 2,3 A)에서 및 비손상된 플라스말로겐 생합성 능력(CHO, 도면 4A)을 갖는 세포에서 효과적으로 P1sEtn 종으로 전환시켰다. 이들 결과는 기타 플라스말로겐 전구체에 대해서 선행 기술에 정반대이다. 1-알킬, 2-하이드록시 글리세롤(키밀, 바틸, 살라킬 알코올)은 PlsEtn 수준을 PlsEtn 결핍 시스템에서는 대조군 수준까지 증가시키는 것으로 보이나, PlsEtn 결핍 또는 PlsEtn 충분 시스템에서 대조군 수준 위까지는 아니다(but not to above control levels in either PlsEtn deficient or PlsEtn sufficient systems). 또한 본 발명에서 기술된 1-알킬, 2-아실 글리세롤의 생물변환은 키밀 알코올 또는 1-알케닐, 2-아실 글리세롤의 어느 것의 수준도 증가시키지 않아(도 3B), 키밀 알코올또는 1-알케닐,2-아실 글리세롤 어느 것도 기술된 분자들의 PlsEtn으로의 생물변환 경로에서 중간체가 아니라는 것을 나타낸다.
화합물 PPI-005는 출원인의 함께 계류중인 출원 PCT/CA2007/001472에 기술되어 있고, 하기에 나타난다:
Figure pct00015
(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-1-(헥사데실옥시)-3-하이드록시프로판-2-일 도코사-4,7,10,13,16,19-헥사에노에이트
5a
세포를 sn-1에서 16:0, sn-2에서 DHA 및 sn-3에서 OH 또는 아세틸-L-카르니틴을 갖는 1-알킬,2-아실 글리세롤로 처리하는 것은 sn-2에서 DHA를 갖는 PlsEtn의 구조-특이적 풍부함을 가져왔다(도 6). 이는 PlsEtn의 구조 특이적 풍부함의 첫번째 기술이다.
PPI -1009는 개선된 약제학적 성질을 갖는 플라스말로겐 전구체이다. 이 분자는 실온에서 염으로 존재하고, 지금까지 보고된 제 1 비-오일계 플라스말로겐 전구체를 나타낸다.
플라스말로겐 합성에서 미리-존재하는 결함을 갖는 생물학적 시스템과 추후 낮은 플라스말로겐 수준을 갖는 생물학적 시스템(N-ReL 대 CHO)은 상승된 막 콜레스테롤 수준을 갖는다(도 5). PPI -1005에 의한 DHA-PlsEtn의 대조군 수준의 80% 까지 상승은 막 콜레스테롤에서 의미 있는 감소를 가져왔다(도 5).
상승된 PlsEtn 수준의 콜레스테롤 저하 효과는 sn-2 치환체에 대해 의존적인 것으로 밝혀졌다(도 7 및 8). 오직 다중불포화된 지방산(DHA, 18:3)이 HEK293 세포에서 콜레스테롤 저하 활성을 갖는 것으로 관찰되었고, 반면에 포화되거나 단불포화 지방산 및 이불포화 지방산은 효과를 갖지 않았다. 오직 DHA-PlsEtn 수준의 회복이 감소된 플라스말로겐 수준의 결과로서 N-Rel 세포에서 관찰되는 상승된 막 콜레스테롤 수준의 강한 감쇠를 가져왔다(도 7). 이들 결과는 다중-불포화 지방산 함유 PlsEtn이 막 콜레스테롤 항상성에 선택적으로 포함되는 것을 나타낸다. PPI -1009는 또한 N-Rel(도 7) 및 HEK293 세포(도 9)에서 농도 의존적으로 막 콜레스테롤 수준을 감소시키는 것으로 나타났다. 이들 결과는 상승된 PlsEtn 수준의 상기 막 저하 효과는 특이적 sn-2 치환을 갖는 PlsEtn 수준을 선택적으로 상승시킬 수 있는 플라스말로겐 전구체의 투여를 요한다.
HEK293 세포를 PPI-1005 또는 PPI-1009 어느 것으로 처리하는 것은 정상 세포 및 콜레스테롤 적재된 세포 모두에서 AB-40 및 Ab-42 모두의 감소된 수준을 가져왔다(도 10). 이들 결과는 추가로 막 단백질 기능을 긍정적으로 조절하는 능력에 의해 플라스말로겐 전구체의 기능적 유용성을 예시한다. 이와 관련하여, 감소된 막 콜레스테롤 수준은 아밀로이드 펩타이드 생산을 부정적으로 조절하는 것으로 알려졌다1 5. HEK293 세포에서, 막 콜레스테롤을 저하시키는 외에, PPI -1005 및 PPI -1009는 또한 아밀로이드 펩타이드의 분비를 감소시키는 것으로 관찰되었다(도 10).
N-Rel 에탄올아민 플라스말로겐(PlsEtn) 및 포스파티딜에탄올아민(PtdEtn)에서의 PPI -1014의 구조-특이적 및 농도-의존적 혼입이 또한 PPI -1014의 5, 10 및 20 μM 농도를 사용하여 72 시간후 관찰되었다(도 17).
실시예 3: PPI -1011의 제조
Figure pct00016

합성 도식:
Figure pct00017
PPI -1011에 대한 합성 도식
Figure pct00018
반응 단계:
Figure pct00019

간략한 과정: 10% NaOH 용액(10.0 L)중의 화합물 1(2.0 Kg, 15.15 몰)의 용액을 80℃에서 1 시간 동안 교반하고, TBAB(992.0g, 3.03 몰)를 첨가하며, 15분 동안 교반하였다. 세틸 브로마이드(5.5 Kg, 18.18 몰)를 서서히 첨가하고, 반응 혼합물을 80℃에서 20시간 동안 교반하였다.(반응 진행은 소량의 분취량을 물로 희석하고, 에틸 아세테이트로 추출하며, 분석 실리카 겔 TLC 플레이트( pet - 에테르중의 30% 에틸 아세테이트)상에 스포팅하고 , Mo 염색 및 KMnO 4 용액을 사용하여 각각의 스포트를 시각화하여 모니터링하였다 ). 다음은 혼합물의 성분들의 Rf이다: 화합물 1(0.1), 화합물 2(0.7).
처리 및 정제: 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고, CH2Cl2로 3회 추출하였다(3 x 3.0 L). 조합된 CH2Cl2 층을 NaHCO3 용액(1.0 L), 물로 2회(2 x 2.0 L), 염수 용액(1.0 L)으로 세척하고, 무수(anhydrous) Na2SO4 상에서 건조시켜, 농축하여 담황색 액체로서 조 화합물 2(2.9 Kg, 조)를 수득하고, 이를 다음 단계에서 사용하였다.
반응 단계:
Figure pct00020

간략한 과정: 20% 수성 HCl(14.5 L)중의 화합물 2(2.9 Kg, 81.23 몰)의 용액을 85℃에서 16시간동안 교반하였다(반응 진행은 소량의 분취량을 물로 희석하고, 에틸 아세테이트로 추출하며, 분석 실리카 겔 TLC 플레이트(pet-에테르중의 40% 에틸 아세테이트)상에 스포팅하고, Mo 염색을 하여 스포트들을 시각화하여 모니터링하였다). 다음은 혼합물의 성분들의 Rf들이다: 화합물 2(0.8), 화합물 3(0.2).
처리 및 정제: 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, CH2Cl2로 3회 추출하였다(3 x 4.0 L). 조합된 유기 층을 NaHCO3 용액(1.0 L), 물로 2회(2 x 2.0 L), 염수 용액(1.0 L)으로 세척하고, 무수 Na2SO4상에서 건조시켜, 농축하여 조 화합물을 수득하고, pet-에테르중에서 5 % 에틸 아세테이트로 분쇄하며(2 x 2.0 L), 건조시켜 백색 고체로서 얻어진 화합물 3(2.0 Kg, 2-단계로부터 42%)을 수득하였다.
반응 단계:
Figure pct00021
간략한 과정:
0℃의 DMF(640.0 mL) 및 CH2Cl2(400.0 mL)중의 화합물 3(1.0 kg, 3.16 몰)의 냉각된 용액에 DMAP(38.6 g, 0.32 몰)를 첨가하고, 트리에틸아민(735.0 g, 7.27 몰)을 첨가하였다. 첨가후, 반응 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반하고, 동등 부분들로(3 부분) TBSCl(572.0 g, 3.79 몰)을 1 시간 동안 첨가하며, 반응 혼합물을 실온에서 20시간 동안 교반하였다.(반응 진행은 소량의 분취량을 물로 희석하고, CH 2 Cl 2 로 추출하며, 분석 실리카 겔 TLC 플레이트( pet - 에테르중의 20% 에틸 아세테 이트)상에 스포팅하고 , Mo 염색 및 KMnO 4 를 사용하여 스포트들을 시각화하여 모니터링하였다 ). 다음은 혼합물의 성분들의 Rf들이다: 화합물 3(0.15), 화합물 4(0.7).
처리 및 정제: 반응 혼합물을 CH2Cl2(2.0 L)로 희석하고, 물(3 x 3.0 L), 염수 용액(1.0 L)으로 세척하며, 무수 Na2SO4상에서 건조시켜, 농축하였다. 수득된 조 화합물을 용출제로서 pet 에테르중의 5% 에틸 아세테이트를 사용하여 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔 100-200 메시)에 의해 정제하여 담황색 오일로서 얻어진 화합물 4(850 g, 90%)를 수득하였다.
반응 단계:
Figure pct00022
간략한 과정: 화합물 5(160.0 g, 0.487 몰)의 냉각된 용액에 0℃의 CH2Cl2(500.0mL)중의 DMF(1.0 mL), 옥살릴 클로라이드(105.0 g, 0.828 몰)를 서서히 30분 동안 첨가하였다. 첨가후, 반응 혼합물을 26℃에서 4시간 동안 교반하였다.(반응 진행은 소량의 분취량을 MeOH 로 반응을 멈추게 하고 분석 실리카 겔 TLC 플레이트( pet 에테르중의 10% 에틸 아세테이트)에 스포팅하며 , KMnO 4 용액을 사용하여 스포트들을 시각화하여 모니터링하였다 ). 다음은 혼합물의 성분들의 Rf들이다:화합물 5(0.3), 화합물 6(0.8).
처리( work up ) 및 정제: 반응 혼합물을 N2 분위기하에서 농축하여 조 화합물 6(175 g, 조)을 수득하였다.
반응 단계:
Figure pct00023

간략한 과정:0℃의 톨루엔(1.25 L)중의 화합물 4(150.0 g, 0.348 몰)의 냉각된 용액에 피리딘(110.0 g, 1.39 몰)을 첨가하고, DMAP(12.2 g, 0.348 몰)을 첨가하며, 10분 동안 교반하였다. 톨루엔(250.0 mL)중의 조 화합물 6(175.0 g, 0.504 몰)의 용액을 15분 동안 첨가하였다. 첨가후, 반응 혼합물을 실온에서 20시간 동안 교반하였다. (반응 진행은 소량의 분취량을 물로 반응을 멈추게 하고, EtOAc 로 추출하며, 분석 실리카 겔 TLC 플레이트( pet - 에테르중의 5% 에틸 아세테이트)상에 스포팅하고 , KMnO 4 용액을 사용하여 스포트들을 시각화하여 모니터링하였다 ). 다음은 혼합물의 성분들의 Rf들이다: 화합물 4(0.2), 화합물 7(0.5).
처리 및 정제: 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(3.0 L)로 희석하고, 물(1.0 L), 0.05 N HCl(500.0 mL), 물(2 x 1.0 L), 염수 용액(500.0 mL)로 세척하며, 무수 Na2SO4 상에서 건조시켜, 농축하여 조 화합물 7을 수득하여, 이를 용출제로서 pet 에테르중의 2 % 에틸 아세테이트를 사용하여 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔 100-200 메시)에 의해 정제하여 담황색 오일로서 얻어진 화합물 7(162 g, 62.7%)을 수득하였다.
반응 단계:
Figure pct00024

간략한 과정: 0℃ THF(10.0 mL) 및 아세트산(52.0 g)중의 화합물 7(160.0 g, 216.21 밀리몰)의 냉각된 용액에 TBAF(226.0, 864.86 밀리몰)를 동등한 분량들로써 30분 동안 첨가하였다. 첨가후, 반응 혼합물을 실온에서 6시간 동안 교반하였다.(반응 진행은 분석 실리카 겔 TLC 플레이트( pet 에테르중의 20% 에틸 아세테이트)상에 스포팅하고 , Mo 염색 및 KMnO 4 용액을 사용하여 스포트를 시각화하여 모니 터링하였다). 하기는 혼합물의 성분들의 Rf들 이다: 화합물 7(0.9), 화합물 PPI -1005(0.4).
처리 및 정제: 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(3.0 L)로 희석하고, 물(2 x 2.0 L), 염수 (500.0 mL)로 세척하며, 무수 Na2SO4상에서 건조시키고, 농축하여 조 화합물을 수득하고, 이를 용출제로서 pet 에테르중의 7% 에틸 아세테이트를 사용하여 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔 100-200 메시)에 의해 정제하여 담황색 오일로서 얻어진 화합물 PPI -1005(72 g, 53%)를 수득하였다.
반응 단계:
Figure pct00025

간략한 과정: 0℃의 THF(500.0 mL)중의 α-리포산 1(12.0g, 58.25 밀리몰)의 냉각된 용액에 트리에틸아민(8.1 mL, 58.25 밀리몰)을 10분 동안 서서히 첨가하고, 2,4,6-트리클로로벤조일 클로라이드(14.2 g, 58.25 밀리몰)를 첨가하였다. 첨가후, 반응 혼합물을 실온으로 되게 하고, 18시간 동안 교반하였다.(반응 진행은 분석 실리카 겔 TLC 플레이트(pet-에테르중의 20% EtOAc)상에 스포팅하고 , 스포트들을 254 nm UV 광 및 Hanessian's 염색을 사용하여 시각화하여 모니터링하였다 ). 다음은 혼합물의 성분들의 Rf들 이다: 화합물 1(0.2), 중간체 (0.6).
반응 혼합물을 여과하고, 고체를 THF(25.0 mL)로 세척하며, 조합된 여액(filtrate)을 N2 분위기하에서 감압을 사용하여 농축하여 조 무수물을 수득하고, 이를 벤젠(500.0 mL)에 용해시키고, 0℃로 냉각시키며, DMAP(7.1 g, 58.25 밀리몰)를 첨가하고, 10분 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 벤젠(100.0 mL)중의 PPI -1005(40.1 g, 64.07 밀리몰)의 용액을 0℃에서 서서히 첨가하였다. 첨가 후, 반응 혼합물을 실온으로 되게 하고, 24시간 동안 교반하였다.(반응 진행은 소량의 분취량을 H2O로 반응을 멈추게하고, 에틸 아세테이트로 추출하며, 분석 실리카 겔 TLC 플레이트(pet-에테르중 15% THF)상에 스포팅하여 254 nm UV 광 및 Hanessian's 염색을 이용하여 스포트들을 시각화하여 모니터링하였다). 다음은 혼합물의 성분들의 Rf들 이다: PPI -1005(0.3), PPI -1011(0.5).
처리 및 정제: 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(2000 mL)로 희석하고, 포화된 NaHCO3 용액(1 x 400 mL), 0.05N HCl(1 x 400 mL), 물(1 x 400 mL), 염수(1 x 400 mL)로 세척하며, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고 농축하여 조 화합물을 수득하고, 이를 용출제로서 pet 에테르중의 2.5 내지 5% THF를 사용하여 컬럼 크로마토그래피(중성 실리카 겔 100-200 메시)에 의해 정제하였다.
표제 화합물 PPI - 1011(28.0 g, 54%)를 엷은 갈색으로서 수득하였다.
실시예 4: PPI -1009를 제조하기 위한 대안적인 방법
Figure pct00026
합성 도식:
Figure pct00027

반응 단계:
Figure pct00028
과정: 10% NaOH 용액(10.0 L)중의 화합물 1(2.0 Kg, 15.15 몰, Alfar Aesar)의 용액을 80℃에서 1 시간 동안 교반하고, TBAB(992.0 g, 3.03 몰, Rajdhani scientific)를 첨가하고 15 분 동안 교반하였다. 세틸 브로마이드(5.5 Kg, 18.18 몰, Alfar Aesar)를 서서히 첨가하고 반응 혼합물을 80℃에서 20 시간 동안 교반하였다. (반응 진행은 소량의 분취량을 물로 희석하고, 에틸아세테이트로 추출하며, 분석 실리카 겔 TLC 플레이트( pet - 에테르중의 30% 에틸 아세테이트)상에 스포팅하 고, Mo 염색 및 KMnO 4 를 사용하여 각각의 스포트를 시각화하여 모니터링하였 다). 다음은 혼합물의 성분들의 Rf들 이다: 화합물 1(0.1), 화합물 2(0.7). 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, CH2Cl2(3 x 3.0 L)로 추출하였다. 조합된 CH2Cl2 층을 NaHCO3 용액(1.0 L), 물(2 x 2.0L), 염수 용액(1.0 L)으로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시켜, 농축하여 담황색 액체로서 조 화합물 2(2.9 Kg, 조)를 수득하고, 이를 다음 단계에서 사용하였다.
반응 단계:
Figure pct00029

과정: 20% 수성 HCl(14.5 L)중의 화합물 2(2.9 Kg, 81.23 몰)의 용액을 85℃에서 16시간 동안 교반하였다. (반응 진행은 소량의 분취량을 물로 희석하고, 에틸아세테이트로 추출하며, 분석 실리카 겔 TLC 플레이트( pet - 에테르중의 40% 에틸 아세테이트)상에 스포팅하고 , Mo 염색을 사용하여 스포트들을 시각화하여 모니터링하였다 ). 다음은 혼합물의 성분들의 Rf들 이다: 화합물 2(0.8), 화합물 3(0.2). 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, CH2Cl2(3 x 4.0 L)로 추출하였다. 조합된 유기 층을 NaHCO3 용액(1.0 L), 물(2 x 2.0 L), 염수 용액(1.0 L)으로 세척하고, 무수 Na2SO4상에서 건조시켜, 농축하여 조 화합물을 수득하고, 이를 pet-에테르중의 5% 에틸 아세테이트(2 x 1.0 L)로 분쇄하며, 건조시켜 백색 고체로서 얻어진 화합물 3(2.0 Kg, 2-단계들로 부터 42%)을 수득하였다.
반응 단계:
Figure pct00030

과정:
0℃의 DMF(640.0 mL) 및 CH2Cl2(400.0 mL)중의 화합물 3(1.0 Kg, 3.16 몰)의 냉각된 용액에 DMAF(38.6 g, 0.32 몰)를 첨가하고, 트리에틸아민(735.0 g, 7.27 몰, Rankem)을 첨가하였다. 첨가 후, 반응 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반하고, 동등 분량들(3 분량)의 TBSCl(572.0 g, 3.79 몰, Fluoro chem 3.0 Kg)을 1 시간 동안 첨가하며, 반응 혼합물을 실온에서 20시간 동안 교반하였다. (반응 진행은 작은 양의 분취량을 물로 반응을 멈추게 하고, CH 2 Cl 2 로 추출하며, 분석 실리카 겔 TLC 플레이트( pet-에테르중의 20% 에틸 아세테이트)상에 스포팅하고 , Mo 염색 및 KMnO 4 를 사용하여 각각의 스포트들을 시각화하여 모니터링하였다 ). 다음은 혼합물의 성분들의 Rf들 이다: 화합물 3(0.15), 화합물 4(0.7). 반응 혼합물을 CH2Cl2(2.0 L)로 희석하고, 물(3 x 3.0 L), 염수 용액(1.0 L)으로 세척하며, 무수 Na2SO4 상에서 건조시켜 농축하였다. 수득된 조 화합물을 용출제로서 pet 에테르중의 5 % 에틸아세테이트를 사용하여 컬럼 크로마토그래피실리카 겔 100-200 메시)에 의해 정제하여 담황색 오일로서 얻어진 화합물 4(850 g, 90%)를 수득하였다.
반응 단계:
Figure pct00031

과정: 0℃의 DMF(2.5 L)중의 화합물 4(734 g, 1.706 몰)의 냉각된 용액에 60% NaH(204.0 g, 5.12 몰)를 일부분씩 30분 동안 첨가하였다. 첨가 후, 반응 혼합물을 0℃에서 추가로 30분 동안 교반하고, 벤질 브로마이드(438.0 g, 2.56 몰, S.D. fine chemicals)를 1 시간 동안 적가하였다. 실온으로 된 반응 혼합물을 20 시간 동안 교반하였다. (반응 진행은 작은 양의 분취량을 물로 반응을 멈추게 하고, EtOAc 로 추출하며, 분석 실리카 겔 TLC 플레이트( pet - 에테르중의 5% 에틸 아세테이트)상에 스포팅하고 , Mo 염색 및 KMnO 4 를 사용하여 스포트들을 시각화하여 모니터링하였다 ). 다음은 혼합물의 성분들의 Rf들 이다: 화합물 4(0.2), 화합물 5(0.5). 반응 혼합물을 메탄올(250 mL), 냉각수(1500 mL)로 반응을 멈추게 하고, 에틸 아세테이트(2 x 2.0 L)를 사용하여 추출하였다. 조합된 에틸 아세테이트 층을 물(3 x 1.0 L), 염수 용액(1.0 L)으로 세척하며, 무수 Na2SO4 상에서 건조시켜 농축하였다. 수득된 조 화합물 5(887 g)를 추가의 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.
반응 단계:

과정: 0℃의 THF(2.0 L)중의 조 화합물 5(887.0 g, 1.702 몰)의 냉각된 용액에 THF(1.0 L)중의 TBAF(1.3 Kg, 5.107 몰, Chemrich fine chemicals)의 용액을 1시간 동안 서서히 첨가하였다. 첨가후, 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다.(반응 진행은 작은 양의 분취량을 물로 반응을 멈추게 하고, EtOAc 로 추출하며, 분석 실리카 겔 TLC 플레이트( pet - 에테르중의 30% 에틸 아세테이트)상에 스 포팅하고, Mo 염색 및 KMnO 4 를 사용하여 스포트들을 시각화하여 모니터링하였다 ). 다음은 혼합물의 성분들의 Rf들 이다: 화합물 5(0.9), 화합물 6(0.3). 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(2.5 L)로 희석하고, 물(2 x1.0 L), 염수(1.0 L)로 세척하며, 무수 Na2SO4상에서 건조시키고, 농축하여 조 화합물을 수득하며, 이를 용출제로서 pet 에테르중의 7% 에틸 아세테이트를 사용하여 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔 100-200 메시)에 의해 정제하여 담황색 오일로서 얻어진 화합물 6(330 g, 2 단계들로부터 48%)을 수득하였다.
반응 단계:
Figure pct00033

과정: 0℃의 CH2Cl2(500.0 mL) 및 DMF(5.0 mL)중의 N-아세틸 카르니텐(carnitene) 8(239.0 g, 1.177 몰, Molecula life)의 냉각된 용액에 옥살릴 클로라이드(179.4 g, 1.412 몰)를 30분 동안 서서히 첨가하고, 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물로부터의 용매를 감압하에서 증류에 의해 제거하고 옥살릴 클로라이드의 트레이스(traces)를 CH2Cl2와 공증류하여 제거하였다. 수득된 조 화합물 9(250 g)를 CH2Cl2(500.0 mL)에 용해시키고, N2 가스의 버블링과 함께 0℃의 CH2Cl2(500.0 mL)중의 화합물 6(334. 0g, 0.823 몰)의 냉각된 용액에 서서히 첨가하였다. 첨가 후, 반응 혼합물을 실온에서 N2 가스의 계속적인 버블링과 함께 20시간 동안 교반하였다. (반응 진행은 작은 양의 분취량을 물로 반응을 멈추게 하고, CH 2 Cl 2 로 추출하며, 분석 실리카 겔 TLC 플레이트(클로로포름중의 25% MeOH)상에 스 포팅하고, Mo 염색 및 KMnO 4 를 사용하여 스포트들을 시각화하여 모니터링하였다 ). 다음은 혼합물의 성분들의 Rf들 이다: 화합물 6(0.8), 화합물 10(0.3). 반응 혼합물을 CH2Cl2(2.0 L)로 희석하고, 염수 용액(250 mL)으로 세척하며, 무수 Na2SO4상에서 건조시키며, 농축하여 조 화합물을 수득하고, 이를 용출제로서 클로포름중의 5% MeOH를 사용하여 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔 100-200 메시)로 정제하여 담황색 오일로서 얻어진 화합물 10(153.0 g, 31.5%)을 수득하였다.
반응 단계:
Figure pct00034

간략한 과정: 에탄올(1.2 L)중의 10% Pd/C(40.0 g, 25% w/w, AlfarAesar)의 현탁액에 화합물 10(150 g, 0.298 몰)을 첨가하고, 실온에서 20 시간 동안 수소화시켰다(H2, 40 psi 압력). (반응 진행은 분석 실리카 겔 TLC 플레이트( 클로로포름중 의 25% MeOH )상에 스포팅하고 , Mo 염색 및 닌히드린 용액을 사용하여 스포트들을 시각화하여 모니터링하였다 ). 다음은 혼합물의 성분들의 Rf들 이다: 화합물 10(0.4), 화합물 11(0.2). 반응 혼합물을 셀라이트 베드를 통해 여과하고, 케이크를 에탄올(2 x 200mL)로 세척하며, 조합된 여액을 농축하여 조 화합물을 수득하고, 용출제로서 클로로포름중의 10% 메탄올을 사용하여 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔 100-200 메시)에 의해 정제하여 담황색 오일로서 얻어진 화합물 11(75 g, 60%)을 수득하였다.
반응 단계:
Figure pct00035

간략한 과정
0℃의 CH2Cl2(300.0 mL) 중의 화합물 5(48.0 g, 0.146 몰, Nu-Chek-Prep Inc.), DMF(1.0 mL)중의 냉각된 용액에 옥살릴 클로라이드(22.3 g, 0.175 몰, Molecular Lifessciences)를 30분 동안 서서히 첨가하였다. 첨가 후, 반 응 혼합물을 26℃에서 4시간 동안 교반하였다. (반응 진행은 작은 양의 분취량을 MeOH 로 반응을 멈추게 하고, 분석 실리카 겔 TLC 플레이트( pet - 에테르중의 10% 에틸 아세테이트)상에 스포팅하고 , KMnO 4 용액을 사용하여 스포트들을 시각화하여 모니터링하였다 ). 다음은 혼합물의 성분들의 Rf들 이다: 화합물 12(0.3), 화합물 13(0.8). 반응 혼합물을 N2 분위기하에서 농축하여 조 화합물 6(57 g, 조)을 수득하였다.
반응 단계:
Figure pct00036

간략한 과정: 0℃의 THF(1.0 L)중의 화합물 11(50.0 g, 0.102 몰)의 냉각된 용액에 피리딘(32.3 g, 0.409 몰)를 첨가하고, DMAP(12.5 g, 0.102 몰)를 첨가하며, 10분 동안 교반하였다. 톨루엔(1.0 mL)중의 조 화합물 13(57.0 g, 0.163 몰)을 15분간 첨가하였다. 첨가후, 반응 혼합물을 실온에서 20시간 동안 교반하였다. (반응 진행은 작은 양의 분취량을 물로 반응을 멈추게 하고, EtOAc 로 추출하며, 분석 실리카 겔 TLC 플레이트(클로로포름중의 20% 메탄올)상에 스포팅하고 , Mo 염색 및 닌히드린 용액을 사용하여 스포트들을 시각화하여 모니터링하였다 ). 다음은 혼합물의 성분들의 Rf들 이다: 화합물 11(0.2), PPI -1009(0.5). 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(2.0 L)로 희석하고, 0.5 N HCl(250 mL), 염수 용액(250.0 mL)으로 세척하며, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고 농축하여 조 화합물을 수득하고, 이를 용출제로서 클로로포름중의 20% 메탄올을 사용하여 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔 100-200 메시)에 의해 정제하여 담황색 오일로서 얻어진 화합물 PPI -1009(27 g, 33.3%)를 수득하였다.
실시예 5: PPI -1014의 제조
표적 분자
Figure pct00037

합성 도식:

반응 단계:
Figure pct00039
반응 시간: 17시간 반응 온도:0℃ 내지 26℃
간략한 과정:
THF(600 mL)중의 PPI -1005(12.0 g, 19.16 밀리몰)의 냉각된 용액에 트리페닐 포스펜(7.5 g, 28.75 밀리몰)을 첨가하고, 0℃에서 10분동안 교반하며, DIEAD(5.8 g, 28.75 밀리몰)를 서서히 첨가하였다. 0℃에서 30분 동안 교반한 후, 반응 혼합물에 N-아세틸 시스틴(4.6 g, 28.75 몰)을 첨가하고, 실온에서 16 시간 동안 교반하였다.((반응 진행은 에틸 아세테이트로 추출하며, 분석 실리카 겔 TLC 플레이트( pet-에테르중의 30% 에틸 아세테이트)상에 스포팅하고 , Mo 염색을 사용하여 스포트들을 시각화하여 모니터링하였다 ). 다음은 혼합물의 성분들의 Rf들 이다: PPI -1005(0.8), PPI -1014(0.4).
처리 및 정제: 반응 혼합물을 물(75 mL)로 희석하고, 에틸 아세테이트(3 x 200 mL)를 사용하여 추출하였다. 조합된 에틸 아세테이트 층을 염수(50 mL)로 세척하고, 무수 Na2SO4상에서 건조시키며, 농축하여 조 화합물을 수득하고, 이를 용출제로서 pet-에테르중의 0 내지 13% 에틸 아세테이트를 사용하여 컬럼 크로마토그래피(100-200 메시 실리카 겔)에 의해 정제하였다.
표제 화합물 PPI -1014(3.2 g, 22%)이 담황색 오일로서 수득되고, 다음 물성을 나타냈다: 1 H NMR (300 MHz , CDCl 3 ): δ 6.35(bs, 1H), 5.39-5.22(m,13H), 4.92-4.88(m, 1H), 4.55-4.22(m, 3H), 3.55-3.41(m, 5H), 3.02-2.97(m, 2H), 2.85-2.77(m, 10H), 2.40(s, 5H), 2.11-2.04(m, 5H), 1.57-1.52(m, 2H), 1.36-1.25(m, 30H), 0.97(t, J = 7.66 Hz;3H), 0.88(t, J =6.63Hz;3H). Mass (M+H): 772.3, HPLC 순도 ~93.68%.
실시예 6: 동물 연구
수컷 뉴질랜드 토끼(1.8-2.5 kg)에 경질 젤라틴 캡슐(크기 3)중의 물을 타지않은 PPI-1011을 경구 투여하였다. 시간 경과 연구동안, 토끼에 200 mg/kg의 PPI-1011를 투여하고, 동물을 1, 3, 6, 12, 18 및 48 시간에서 유테놀(euthenol) 과투여를 통해 희생시켰다. 혈액을 심장에 구멍을 내어 수집하고 혈장을 추후 분석을 위해 -70℃에서 냉동시켰다. 신장 및 간을 또한 수획하고, 추후 분석을 위해 -70℃에서 저장하였다. 이들 연구는 12 시간째에 중복되는 그룹에 대해 2회 실험을 하여 수행했다(실험 1: 1, 3, 6 및 12 시간; 실험 2: 12, 18, 24 및 48 시간). 대조군을 각 시점에 수획했다. 플라스말로겐 및 지질을 추출하고, 미리 보고된 바와 같이(Goodenowe et al., 2007) LC-MS/MS에 의해 분석하였다.
도 11에 나타난 바와 같이, 200 mg/kg의 경구 투여량으로 플라스말로겐 전구체 PPI-1011을 순환 플라스말로겐에 혼입시켰다. 데코사헥사에노 산(DHA)을 방출하는, sn-2에서의 탈아실화가 또한 관찰되었다. 16:0/22:6, 18:0/22:6 및 18:1/22:6 에탄올아민 플라스말로겐 및 포스파티딜에탄올아민에로 가장 많이 혼입되었다. 참조 포스파티딜에탄올아민 16:0/18:0에서는 어떤 변화도 관찰되지 않았다.
혈장에서의 혼입의 시간 경과에 대한 추가의 조사(도 12)에 의해 최대 혼입은 12시간에서 있고, 이 수준의 혼입은 나머지 관찰 기간(48시간)에 걸쳐 유지되는 것이 밝혀졌다. 이는 포스파티딜에탄올아민 및 에탄올아민 플라스말로겐 모두에 대한 경우이었다. 대조적으로, 순환 DHA는 6시간에서 피크를 이뤘고, 18시간까지는 정상 상태가 덜해졌다.
혈장 플라스말로겐 및 포스파티딜에탄올아민에로의 PPI-1011의 투여량-의존적 혼입(도 13)의 연구는 이 순환 인지질에서의 새로운 정상 상태 수준이 10 내지 200 mg/kg의 투여량-의존적 방법에서 얻어진다는 것을 나타냈다. 그러나, 투여량에서 추가의 증가는 플라스말로겐 및 포스파티딜에탄올아민의 정상 상태 수준을 200 mg/kg으로 얻어진 것 이상으로 증가시키지 않았다. 대조적으로, 순환 DHA의 최대로 높은 정상-상태 수준은 500 mg/kg에서 얻어졌고, 1000 mg/kg에서는 추가로 증가하지 않았다.
조직 플라스말로겐 및 DHA의 증가가 또한 신장(도 4 및 5) 및 간 조직(도 6)에서 관찰되었다.
이들 결과는 PPI-1011이 토끼에서 경구적으로 생물학적 이용가능하고, 탈아실화/재아실화 반응을 통하여 DHA-함유 에탄올아민 플라스말로겐 및 포스파티딜에탄올아민으로 전환된다는 것을 나타낸다. 또한, 이들 결과는 내생적 대사 시스템이 약학적으로 증대될 수 있는 최대 증가를 제한할 수 있다는 것을 제시한다.
실시예 7: 플라스말로겐 전구체로 시험관내 막 단백질 풍부의 조절
다음 연구는 막-존재 단백질의 풍부성을 변형시키는데 플라스말로겐 전구체(1-알킬-2-아실 글리세롤)의 효과를 나타낸다. 상기 화합물의 세포 효과는 야생형 세포에서 뿐만 아니라 인위적으로 상승된 막 콜레스테롤의 조건들에서도 나타났다.
야생형 세포에서, 효소 ADAM10 및 콜레스테롤 에스테르화 단백질 SOAT1를 조절하는 아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 상승이 플라스말로겐 전구체 농도에서의 증가와 함께 관찰되었다. 유사한 효과가 콜레스테롤-적재 모델에서도 관찰되었다. 또한, 상이한 APP 가공 효소, BACE1은 오직 콜레스테롤 적재 세포에서만 풍부성에 있어 감소를 나타냈다. 이론에 얽매이는 것을 원하지 않으면서, 이 증거는 알쯔하이머 질병의 상황에서 아밀로이드 적재를 감소시키고, 동시에 상기 시스템의 막 콜레스테롤 함량을 재-평형화시키는 방법을 지지하여, 알쯔하이머 질병외에 동맥경화증 및 고콜레스테롤혈증과 같은 질병을 치료하는 가능성 있는 이익을 제공한다.
APP는 γ-세크레타제(프레스닐린 1/2 유전자에 의해 인코딩됨)) 및 α-세크레타제(ADAM10에 의해 인코딩됨)에 의한 일련의 절단으로 구성되는 정규의(canonical) 경로에 의해 주로 가공된다. APP의 이 비-병리학적 가공은 글루타메이트 독성 및 고혈당증에 대해 보호를 나타내는 신경영양 펩타이드(sAPPα)(Araki et al., 1991; Mattson et al., 1993; Postina et al., 2004; Fahrenholz, 2007)의 형성을 가져온다. 대안적인 APP 가공 경로는 APP가 콜레스테롤-풍부 지질 조각(rafts)내의 γ- 및 β-세크레타제에 의해 절단되는 알쯔하이머 질병에서 그 자신을 입증한다. 이 "비-정규" 경로는 AD의 특징인 세포외기질에서 플라크로 응집되는 경향이 있는 38-43 아미노산 길이의 Aβ 펩타이드의 형성을 가져온다(Selkoe, 2002; Walsh et al., 2002; Selkoe, 2003; Meyer-Luehmann et al.,2008). 초기-개시(early-onset) 일족에 특이한(familial) AD는 APP 또는 APP 가공 효소(PSEN1/2, BACE, ADAM)에서 유전적 손상(lesions)에 의해 설명되는 한편, 늦은-개시 산발성의(sporadic) AD(비-병리학적으로 병리학적인 APP 가공으로의 스위치)의 근원적인 원인은 불분명한 채로 남아있다.
AD의 병인학에서 콜레스테롤 항상성의 중요성이 인간(Corder et al., 1993; Saunders et al., 1993; Blacker et al., 1997; Hofman et al., 1997) 및 동물 모델(Joyce et al., 2002; Singaraja et al., 2002; Van Eck et al., 2006; Wahrle et al., 2008)에서 조사되었다. 혈장 막의 콜레스테롤 함량의 변경은 막 존재 단백질의 기능에 영향을 끼치는 것으로 나타났다(Scanlon et al., Lange et al., 2004). 상승된 뇌 콜레스테롤은 AD를 갖는 대상에서 나타났고, 한편 콜레스테롤-풍부 다이어트로 먹이를 받은 토끼는 뇌에서 플라크를 발달시키는 것으로 나타났다(GHribi et al., 2006). 시험관내 데이타는 인간에서 혈청-플라스말로겐 결핍이 인식 상태에서의 감소와 관련있는 것으로 나타난 한편, 플라스말로겐 결핍 세포는 막에서 상승된 유리-콜레스테롤을 함유함을 나타냈다(Goodenwe et al., 2007). 이들 관찰에 기초해서, 본 발명자들은 콜레스테롤과 플라스말로겐사이의 상호작용을 조사했고, 분비된 Aβ로 표현되는, 상기 둘 사이의 균형이 어떻게 AD의 병리학적 표현에 영향을 주는지를 확인하였다.
작용의 제안된 방식: 막 지질 조절을 통한 APP 가공에서의 변화( shift )
인간 배아 신장(HEK293) 세포는 APP 및 APP를 가공하기 위하여 요구되는 막-결합된 구조를 발현하여, APP 가공을 연구하기 위한 좋은 모델이 된다. 현 시험관내 조사는 콜레스테롤 적재 및/또는 플라스말로겐 전구체 보충을 통한 막 유동성을 조절하는 것은 세포외 Aβ42 함량을 변경시켰다는 점에서 이전의 연구를 확증하였다. HEK293 세포의 콜레스테롤 적재는 48 시간 동안 배양(incubation) 기간에 이어지는 세포에서의 유리 콜레스테롤의 양을 17%(대조군에 비교해서) 증가시킨다. 이 상승은 대조군과 비교해서 조건이 조절된(conditioned) 배지에서 Aβ42 함량의 평행하고 의미 있는 증가(p<0.05)가 수반된다. 아밀로이드에서의 65% 증가는 1차로 β-세크레타제 농도에서의 22% 증가에 기인한다(도 18A, 레인 2); 근본의 APP 수준은 콜레스테롤 적재시 변하지 않고 남아있다. 콜레스테롤 적재된 HEK293 시스템을 플라스말로겐 전구체 PPI-1005로의 처리는 세포 막의 유리(free) 콜레스테롤 함량을 의미있게 감소시켰다(p<0.05). 조건이 조절된 배지에서의 Aβ42 함량은 20 μM 농도에서 콜레스테롤-적재된 수준 아래로 70% 떨어졌고(p=0.0001), 한편, 조건이 조절된 배지에서의 sAPPα함량은 상승되었다. APP 가공에 대한 효과는 APP 발현에서의 변화에 기인한 것으로 보이지 않고, 오히려 APP 가공 효소의 풍부함에서의 변화에 의하여 APP 가공 경로에서의 변화에 기인한 것으로 보인다. β-세크레타제가 PPI-1005의 20μM 농도에서 정상 수준으로 회복되는 동안, sAPPα 종에서의 73% 증가가 조건이 조절된 배지에서 검출되었다. 이 상승은 sAPPα 형성에 관련된 효소인, ADAM10(도 18A, 레인 3)에서의 63% 증가에 의해 설명되었다.
플라스말로겐 보충에 이어지는 세포의 콜레스테롤 프로파일에서의 변화는 유리 콜레스테롤의 에스테르화에 관여하는 효소인 SOAT1이 플라스말로겐 농도 증가와 함께 대략 25% 상향 조절되는 것(콜레스테롤 적재된 조건과 비교해서)(도 18A, 레인 5)이 관찰되는 것에 의해 설명될 수 있다.
별개의 연구에서, PPI-1005의 효과가 콜레스테롤이 적재되지 않은 야생형 HEK293 세포에서 관찰되었다. 도 18B는 ADAM10(35%) 및 SOAT1(50%)의 풍부 상태에서 농도-의존적 증가를 보인다; BACEI 또는 APP 풍부에서 어떤 변화도 관찰되지 않았다. HEK293 세포가 프라바스타틴(pravastatin)에 처리에 의한 HMGCoA 환원효소 억제에 의해 콜레스테롤이 결핍되었지만, ADAM10 및 SOAT1 단백질 수준이 일정하게 남아있었다(도 18C). 플라스말로겐 및 프로바스타틴 모두는 세포안에서 유리 콜레스테롤의 단편(fraction)을 의미 있게 감소시키는 한편, 세포에서 AMDM10 및 SOAT1 수준을 변경시키는 것은 플라스말로겐 처리 단독이었다. 이는 AMDA10 및 SOAT1 풍부에 효과는 막 콜레스테롤 함량보다는 막 플라스말로겐 함량의 효과임을 제시한다.
따라서, 막-존재 단백질의 풍부함은, 본 명세서에 기술된 바와 같이 세포를 플라스말로겐 전구체로 처리하여 얻어지는, 세포의 플라스말로겐 함량을 조절하여 시험관 내에서 변형될 수 있다.
재료 및 방법
콜레스테롤 적재
DMEM, 37℃의 10% FBS, 5% CO2안에서 배양된 HEK 293 세포를 처리전 날 씨딩(seed) 하였다. 다음날, 세포 막에 기술된 바와 같은(Rong, et al., 2003) 콜레스테롤을 전달하는 담체로서 메틸-β-사이클로덱스트린을 이용하여 10㎍/ml의 배지의 농도에서 외부 콜레스테롤을 적재하였다.
콜레스테롤 분석
세포를 플라스말로겐 전구체 PPI-1005 또는 대조군으로서 에탄올로 처리하였다. 세포들을 Versene:TryPle 발현 칵테일을 사용하여 수획하고, PBS로 세척하였다. 지질을 1% 트리톤 X-100을 함유하는 클로로포름으로 추출하였다. 유기 분획을 회수하고, 질소의 흐름하에서 건조시켰다. 건조된 지질을 콜레스테롤 반응 버퍼(Biovision, Moutain View, CA)에 재현탁시키고, 콜레스테롤의 총(total), 유리(free) 및 에스테르화된 분획물을 제조자의 권장대로 콜레스테롤 정량화 키트(Biovision, Mountain View, CA)를 사용하여 정량화하였다. 콜레스테롤을 초기에는 ㎍/밀리온(million) 세포로 계산하고, 각 실험마다 대조군 조건의 퍼센트로 보고하였다.
아밀로이드 분석
HEK293 세포에 기술된 대로 외부 콜레스테롤로 적재하고 PPI 1005 또는 대조군으로서 에탄올로 처리하였다. 처리된 세포로부터 조건이 조절된 배지를 48 시간 배양 기간의 종료시 수집하였다. Aβ1-42 함량을 분석하기 위하여 조건이 조절된 배지를 마이클로플레이트에 적재전 초원심분리(ultracentrifugal) 필터 장치(Millipore, ballerica, MA)를 풍부히 하였다. ELISA를 제조자(Covance Labs, Princeton, NJ)의 권장에 따라 수행하였다. 반응을 기질(substrate)의 첨가하고 25분 후 멈추게 하고, 흡광도를 495 nm에서 읽었다. 실험을 삼중으로 수행하였다. 값들은 조건이 조절된 배지의 pg/ml로서 계산하고, 비처리된 콜레스테롤 적재된 대조군 HEK293 세포로 부터의 조건이 조절된 배지에서 검출된 Aβ의 양에 표준을 맞추었다.
면역 블로팅 및 면역 침전
HEK293 세포를 아밀로이드 분석에서 기술된 대로 처리하였다. 세포 펠릿을 PBS 에서 세척하고, 프로테아제 억제제 칵테일을 함유하는 RIPA 버퍼(Sigma, St. Louis, MI)에서 용해시켰다. 세포 용해물중의 단백질은 Bio-Red 단백질 분석(Bio-Rad, Hercules, CA)을 사용하여 정량화하였다. 다음 항체는 웨스턴 분석을 위하여 사용하였다:APP(Calbiochem, Darmstadt, Germany), BACE1 및 ADAM10(Millipore, Temecula, CA), sAPPα(IBL, Gunma, Japan), SOAT1(Santa Cruz Biotechnology Inc., CA), 및 β-액틴(Sigma, sSt. Louis, MI). 면역침전을 조건이 조절된 배지에서 sAPPα를 측정하기 위하여 수행하였다. 간략하게는, sAPPα에 대한 항체를 조건이 조절된 배지에 첨가하고 4℃에서 16 시간 동안 배양했다. IP는 4℃에서 6시간 동안 단백질 A/G 아가로즈 비드와 함께 배양하여 수행하였다. 비드를 PBS로 세척하고, 용출된 단백질을 안티-sAPPα 항체로 면역블로팅하여 검출하였다. 밴드 강도는 Java(ImageJ) 소프트웨어(National Institutes of Health, Bethesda, MD)에서 영상 가공(Image Processing) 및 분석을 이용하여 정량화하였다.
통계학적 분석
데이터의 통계학적 분석은 MicrosoftTM Office Exel 2007 및 JMP 버젼 8을 사용하여 수행하였다. 다중 비교 Dunnet's 시험을 처리군과 대조군사이의 차이를 분석하기 위하여 적용하였다.
본 분야에 숙련된 자는 다양한 변형 및 변화가 청구범위에 정의된 바의 본 발명의 범주에서 벗어남이 없이 가능하다는 것이 명백할 것이다.
다음 참조 및 상기 제공된 참조들은 본 명세서에 참조로 인용된다.
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Claims (43)

  1. 라세미체 또는 단리된 입체이성체를 포함하는 하기 화학식(I)의 구조에 따른 화합물 및 그의 약제학적으로 허용되는 염 또는 에스테르:
    Figure pct00040


    상기 식에서,
    R1 및 R2는 같거나 상이하며, CH3(CH2)3-, CH3(CH2)5-, CH3(CH2)7-, CH3(CH2)9-, CH3(CH2)11-, CH3(CH2)13-, CH3(CH2)15-, CH3(CH2)17-, CH3(CH2)19-, CH3(CH2)21-, CH3(CH2)23-, CH3(CH2)3CH=CH(CH2)7-, CH3(CH2)5CH=CH(CH2)7-, CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7-, CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7-, CH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)7-, CH3CH2(CH=CH)-, CH3(CH2)3(CH=CH)-, CH3(CH2)5(CH=CH)-, CH3(CH2)7(CH=CH)-, CH3(CH2)9(CH=CH)-, CH3(CH2)11(CH=CH)-, CH3(CH2)13(CH=CH)-, CH3(CH2)15(CH=CH)-, CH3(CH2)17(CH=CH)-, CH3(CH2)19(CH=CH)-, CH3(CH2)21(CH=CH)-, CH3(CH2)3CH=CH(CH2)5(CH=CH)-, CH3(CH2)5CH=CH(CH2)5(CH=CH)-, CH3(CH2)7CH=CH(CH2)5(CH=CH)-, CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)5(CH=CH), CH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)5(CH=CH)-, CH3(CH2)3CH=CH(CH2)7-, CH3(CH2)5CH=CH(CH2)7-, CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7-, CH3(CH2)4(CH=CHCH2)2(CH2)6-, CH3CH2(CH=CHCH2)3(CH2)6-, CH3(CH2)4(CH=CHCH2)4(CH2)2-, CH3CH2(CH=CHCH2)5(CH2)2-, CH3(CH2)7CH=CH(CH2)11, 및 CH3CH2(CH=CHCH2)6CH2-로 구성된 그룹으로부터 선택된 알킬 또는 알케닐 탄화수소 쇄로부터 선택되고;
    R3는 지방산, 카르니틴, 아세틸-D/L-카르니틴, 티오카르니틴, 아세틸-D/L-티오카르니틴, 크레아틴, 노르카르니틴, 포스포콜린, 리포산, 디하이드로리포산, 포스포에탄올아민, 포스포세린, N-아세틸시스테인, 치환되거나 비치환된 아미노산 그룹 및 하기 구조의 그룹으로 구성되는 그룹으로부터 선택되며;
    Figure pct00041


    R4 및 R5는 독립적으로 수소 또는 저급 알킬이고;
    R6는 수소 또는 저급 알킬이며; 그리고
    R7 및 R8은 독립적으로 수소 또는 저급 알킬이다.
  2. 제 1 항에 있어서, R2가 CH3CH2(CH=CHCH2)6CH2-인 화합물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 화합물이 2-아세톡시-4-(2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-도코사-4,7,10,13,16,19-헥사에노일옥시)-3-(헥사데실옥시)프로폭시)-N,N,N-트리메틸-4-옥소부탄-1-아미늄(PPI-1019), (4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-1-(5-((R)-1,2-디티오란-3-일)펜타노일옥시)-3-(헥사데실옥시)프로판-2-일 도코사-4,7,10,13,16,19-헥사에노에이트(PPI-1011) 및 (4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-1-(2-아세트아미도-3-머캅토프로파노일옥시)-3-(헥사데실옥시)프로판-2-일 도코사-4,7,10,13,16,19-헥사에노에이트(PPI-1014)로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 화합물.
  4. 약제학적으로 허용되는 담체, 및 라세미체 또는 단리된 입체이성체를 포함하는 화학식 (I)의 화합물 및 그의 약제학적으로 허용되는 염 또는 에스테르를 포함하는 약제학적 조성물:
    Figure pct00042

    상기 식에서,
    R1 내지 R8은 제 1 항에서 정의된 바와 같다.
  5. 제 4 항에 있어서, R2가 CH3CH2(CH=CHCH2)6CH2-인 화합물.
  6. 제 4 항에 있어서, 상기 화합물이 2-아세톡시-4-(2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-도코사-4,7,10,13,16,19-헥사에노일옥시)-3-(헥사데실옥시)프로폭시)-N,N,N-트리메틸-4-옥소부탄-1-아미늄(PPI-1019), (4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-1-(5-((R)-1,2-디티오란-3-일)펜타노일옥시)-3-(헥사데실옥시)프로판-2-일 도코사-4,7,10,13,16,19-헥사에노에이트(PPI-1011) 및 (4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-1-(2-아세트아미도-3-머캅토프로파노일옥시)-3-(헥사데실옥시)프로판-2-일 도코사-4,7,10,13,16,19-헥사에노에이트(PPI-1014)로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
  7. 투여를 필요로 하는 환자에게 라세미체 또는 단리된 입체이성체를 포함하는 화학식(I)의 화합물 및 그의 약제학적으로 허용되는 염 또는 에스테르, 또는 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합된 상기 화합물을 포함하는 약제학적 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 증가된 막 콜레스테롤, 증가된 아밀로이드 또는 감소된 플라스말로겐 수준들과 관련된 노화 질병을 치료 또는 예방하는 방법:
    Figure pct00043

    상기 식에서,
    R1 내지 R8은 제 1 항에서 정의된 바와 같다.
  8. 제 7 항에 있어서, R2가 CH3CH2(CH=CHCH2)6CH2-인 방법.
  9. 제 7 항에 있어서, 상기 화합물이 2-아세톡시-4-(2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-도코사-4,7,10,13,16,19-헥사에노일옥시)-3-(헥사데실옥시)프로폭시)-N,N,N-트리메틸-4-옥소부탄-1-아미늄(PPI-1019), (4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-1-(5-((R)-1,2-디티오란-3-일)펜타노일옥시)-3-(헥사데실옥시)프로판-2-일 도코사-4,7,10,13,16,19-헥사에노에이트(PPI-1011) 및 (4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-1-(2-아세트아미도-3-머캅토프로파노일옥시)-3-(헥사데실옥시)프로판-2-일 도코사-4,7,10,13,16,19-헥사에노에이트(PPI-1014)로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 방법.
  10. 제 7 항에 있어서, 상기 노화 질병이 퇴행성 신경질환, 인식 장애, 치매, 암, 및 혈관 질병으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 퇴행성 신경 질환이 알쯔하이머 병, 파킨슨 병, 및 연령-관련된 황반변성으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 방법.
  12. 제 10 항에 있어서, 상기 암이 전립선암, 폐암, 흉부암, 난소암, 및 신장암으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 방법.
  13. 제 10 항에 있어서, 상기 혈관 질병이 동맥 경화증 및 고콜레스테롤혈증으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 방법.
  14. 투여를 필요로 하는 환자에게 라세미체 또는 단리된 입체이성체를 포함하는 화학식(I)의 화합물 및 그의 약제학적으로 허용되는 염 또는 에스테르, 또는 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합된 상기 화합물을 포함하는 약제학적 조성물의 유효량을 투여하여, P1sEtn 결핍 또는 P1sEtn 충분 시스템 어느 쪽에서도 P1sEtn 수준을 대조군 보다 위로 증가시켜, 플라스말로겐 결핍에 의한 노화 질병을 치료 또는 예방하는 방법:
    Figure pct00044

    상기 식에서,
    R1 내지 R8은 제 1 항에서 정의된 바와 같다.
  15. 제 14 항에 있어서, R2가 CH3CH2(CH=CHCH2)6CH2-인 방법.
  16. 투여를 필요로 하는 환자에게 라세미체 또는 단리된 입체이성체를 포함하는 화학식(I)의 화합물 및 그의 약제학적으로 허용되는 염 또는 에스테르, 또는 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합된 상기 화합물을 포함하는 약제학적 조성물의 유효량을 투여하여, 콜레스테롤 운반 단백질의 비정상적인 유전적 발현으로부터 생기는 질환을 치료 또는 예방하는 방법:
    Figure pct00045

    상기 식에서,
    R1 내지 R8은 제 1 항에서 정의된 바와 같다.
  17. 제 16 항에 있어서, R2가 CH3CH2(CH=CHCH2)6CH2-인 방법.
  18. 제 16 항에 있어서, 상기 콜레스테롤 운반 단백질이 아포리포단백질 E인 방법.
  19. 라세미체 또는 단리된 입체이성체를 포함하는 화학식(I)의 화합물 및 그의 약제학적으로 허용되는 염 또는 에스테르, 또는 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합된 상기 화합물을 포함하는 약제학적 조성물의 증가된 막 콜레스테롤, 증가된 아밀로이드 또는 감소된 플라스말로겐 수준들과 관련된 노화 질병을 치료 또는 예방하기 위한 용도.
    Figure pct00046

    상기 식에서,
    R1 내지 R8은 제 1 항에서 정의된 바와 같다.
  20. 제 19 항에 있어서, R2가 CH3CH2(CH=CHCH2)6CH2-인 용도.
  21. 제 19 항에 있어서, 상기 노화 질병이 퇴행성 신경질환, 인식 장애, 치매, 암, 및 혈관 질병으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 용도.
  22. 제 21 항에 있어서, 퇴행성 신경 질환이 알쯔하이머 병, 파킨슨 병, 및 연령-관련된 황반변성(mascular degeneration)으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 방법.
  23. 제 21 항에 있어서, 상기 암이 전립선암, 폐암, 흉부암, 난소암, 및 신장암들로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 방법.
  24. 제 21 항에 있어서, 상기 혈관 질병이 동맥 경화증 및 고콜레스테롤혈증으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 용도.
  25. 라세미체 또는 단리된 입체이성체를 포함하는 화학식(I)의 화합물 및 그의 약제학적으로 허용되는 염 또는 에스테르, 또는 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합된 상기 화합물을 포함하는 약제학적 조성물의 P1sEtn 결핍 또는 P1sEtn 충분 시스템 어느 쪽에서도 P1sEtn 수준을 대조군 수준 보다 위로 증가시켜, 플라스말로겐 결핍에 의한 노화 질병을 치료 또는 예방하기 위한 용도:
    Figure pct00047

    상기 식에서,
    R1 내지 R8은 제 1 항에서 정의된 바와 같다.
  26. 제 25 항에 있어서, R2가 CH3CH2(CH=CHCH2)6CH2-인 방법.
  27. 라세미체 또는 단리된 입체이성체를 포함하는 화학식(I)의 화합물 및 그의 약제학적으로 허용되는 염 또는 에스테르, 또는 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합된 상기 화합물을 포함하는 약제학적 조성물의 콜레스테롤 운반 단백질의 비정상적인 유전적 발현으로부터 생기는 질환을 치료 또는 예방하기 위한 용도:
    Figure pct00048

    상기 식에서,
    R1 내지 R8은 제 1 항에서 정의된 바와 같다.
  28. 제 27 항에 있어서, R2가 CH3CH2(CH=CHCH2)6CH2-인 방법.
  29. 제 27 항에 있어서, 콜레스테롤 운반 단백질이 아포리포단백질 E인 용도.
  30. 제 19 항 내지 제 29 항에 따른 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 2-아세톡시-4-(2-((4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-도코사-4,7,10,13,16,19-헥사에노일옥시)-3-(헥사데실옥시)프로폭시)-N,N,N-트리메틸-4-옥소부탄-1-아미늄(PPI-1019), (4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-1-(5-((R)-1,2-디티오란-3-일)펜타노일옥시)-3-(헥사데실옥시)프로판-2-일 도코사-4,7,10,13,16,19-헥사에노에이트(PPI-1011) 및 (4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-1-(2-아세트아미도-3-머캅토프로파노일옥시)-3-(헥사데실옥시)프로판-2-일 도코사-4,7,10,13,16,19-헥사에노에이트(PPI-1014)로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 용도.
  31. 라세미체 또는 단리된 입체이성체를 포함하는 화학식(II)의 구조에 따른 화합물 및 그의 약제학적으로 허용되는 염 또는 에스테르의 제조 방법으로서, 화학식(III)의 화합물을 상기 화학식(II)의 화합물을 형성하는 조건하에서 적절한 용매중에서 친핵성 촉매, 염기 및 차단제와 반응시키고, 임의로 상기 화학식(II)의 화합물을 정제하는 것을 포함하는 제조 방법:
    Figure pct00049

    Figure pct00050

    상기 식에서,
    R1 및 R4 내지 R8은 제 1 항에서 정의된 바와 같고, R9는 차단제이다.
  32. 제 31 항에 있어서, 상기 차단제가 실란 차단제인 방법.
  33. 제 32 항에 있어서, 상기 실란 차단제가 tert-부틸디메틸실릴 할라이드이고, R9가 tert-부틸디메틸실릴 그룹인 방법.
  34. 제 31 항에 있어서, 상기 친핵성 촉매가 DMAP인 방법.
  35. 제 31 항에 있어서, 상기 염기가 트리에틸아민인 방법.
  36. 제 31 항에 있어서, 상기 용매가 디메틸포름아미드(DMF) 및 CH2Cl2를 포함하는 방법.
  37. 제 31 항에 있어서, 상기 용매 중의 화학식(III)의 상기 화합물, 상기 친핵성 촉매, 및 상기 염기의 용액이 상기 차단제의 첨가 전에 0 내지 5℃로 냉각되는 방법.
  38. 제 37 항에 있어서, 상기 반응이 15 내지 25℃의 온도에서 수행되는 방법.
  39. 제 38 항에 있어서, 상기 반응이 약 20℃에서 수행되는 방법.
  40. 제 39 항에 있어서, 상기 반응이 20시간 이하 동안 진행되는 방법.
  41. 라세미체 또는 단리된 입체이성체를 포함하는 화학식(II)의 구조에 따른 화합물 및 그의 약제학적으로 허용되는 염 또는 에스테르:
    Figure pct00051

    상기 식에서,
    R1 및 R4 내지 R8은 제 1 항에서 정의된 바와 같고, R9는 차단 그룹이다.
  42. 제 41 항에 있어서, 상기 차단 그룹은 실릴 차단 그룹인 화합물.
  43. 제 41 항에 있어서, R9는 tert-부틸디메틸실릴 그룹인 화합물.
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