CN108276438B - 一种epa缩醛磷脂的制备方法及其应用 - Google Patents
一种epa缩醛磷脂的制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种EPA缩醛磷脂的制备方法及其应用。本发明从海参中提取制备EPA缩醛磷脂，进行实验验证各组分的EPA缩醛磷脂对动脉粥样硬化的改善作用。本发明以海参为原料制备EPA缩醛磷脂，再进行组分分离，制得的pPC、pPE的纯度均在90%以上。本发明通过动物实验验证了，制得的各个组分的EPA缩醛磷脂能够有效降低动脉粥样硬化斑块面积，即EPA缩醛磷脂均能明显抑制动脉粥样硬化发展，说明了EPA缩醛磷脂能有效预防、改善或治疗动脉粥样硬化。
Description
技术领域
本发明属于活性物质筛选技术领域，涉及一种缩醛磷脂的制备方法及应用，具体涉及海参EPA缩醛磷脂的制备方法及其在预防、改善或治疗动脉粥样硬化制品中的应用。
背景技术
醚型磷脂是在甘油骨架的sn-1位上存在醚键的特殊磷脂，这种醚键有两种类型，一种只含有醚键，被称为醚磷脂；另一种除醚键外还包含一个双键，即为烯醚键，这种含有烯醚键的磷脂被称为缩醛磷脂。缩醛磷脂是脑、心脏和神经中的主要磷脂成分，越来越多证据表明，组织中缩醛磷脂的缺乏与多种疾病相关。但鲜少有直接证据证明缩醛磷脂的代谢及生物活性，其中最大阻碍就是缩醛磷脂的制备困难。
目前从天然产物中提取缩醛磷脂的方法主要为化学法和酶法。化学法通常是利用碱法制备，即将含有普通磷脂及缩醛磷脂的混合样品中加入碱溶液，普通磷脂在碱性条件下发生水解作用，其sn-1位和sn-2位上酯键发生断裂，产生脂肪酸及溶血磷脂，再利用溶剂萃取或柱层析等方法可将缩醛磷脂与水解产物分离，从而使缩醛磷脂提纯。酶法富集缩醛磷脂，目前通常利用磷脂酶A1对非缩醛磷脂sn-1位上的脂肪酸链进行选择性水解，得到sn-2位连接脂肪酸的溶血磷脂，与碱法制备相比，酶法制备稳定性高，温和、专一，能够最大限度地保持缩醛磷脂的天然构型。但利用磷脂酶A1酶解法得到的缩醛磷脂中，同时含有大量溶血磷脂，破坏了磷脂的天然构型，且对后续分离纯化提出了更高的要求。
作为我国传统的药食两用海珍品-海参，已被证明有多种营养功效。海参脂质中，磷脂的含量占总脂的35%左右，对海参脂质的脂肪酸组成分析结果显示，海参体壁中多不饱和脂肪酸的含量丰富，以二十碳五烯酸（C20:5n-3, EPA）和二十碳六烯酸（DHA）为主。对其磷脂组分进行分析发现，海参磷脂以磷脂酰胆碱（PC），磷脂酰乙醇胺（PE）为主，进一步分析表明，PE的主要为缩醛型。
专利200980157183.5中，利用一种化学合成的缩醛磷脂前体物质-PPI-1005，进行细胞实验，结果发现其能够降低细胞中胆固醇负载，推测其对由胆固醇转运异常引起的疾病具有改善作用。但是，缩醛磷脂前体物质并不是缩醛磷脂，其在机体中的代谢、作用方式不一致，另外，胆固醇是否与动脉粥样硬化有直接关系，理论也众说不一。
2004年美国国家食品药品监督管理局（FDA）宣布：“含有EPA成份的是合格健康食品，可以降低心血管疾病的风险”，且目前已将乙酯型EPA应用于治疗高脂血症的处方药，但乙酯型DHA/EPA在体内消化吸收困难及安全性问题一直存在争议。近几年越来越多研究表明，磷脂型DHA/EPA相较于甘油三酯型和乙酯型，能够更有效的改善脂代谢，且生物活性和利用率更高，很可能成为区别于传统鱼油的新型功能性脂质。但磷脂结构中由于sn-1位酯键类型和sn-3位极性基团的不同，具有不同的功效活性，尤其是sn-1位为烯醚键的缩醛磷脂，其对于动脉粥样硬化类心血管疾病的改善所用尚无报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种富含EPA的缩醛磷脂的制备方法及其在改善动脉粥样硬化制品中的应用。
为达到上述目的，本发明采取的具体技术方案为：
EPA缩醛磷脂在改善动脉粥样硬化制品中的应用。
进一步的，所述的EPA缩醛磷脂为sn-1位脂肪酸与甘油骨架以烯醚键相连，sn-2位所连脂肪酸为EPA的缩醛磷脂。
进一步的，所述EPA缩醛磷脂为EPA缩醛磷脂酰胆碱（EPA-pPC）、EPA缩醛磷脂酰乙醇胺（EPA-pPE）、EPA缩醛磷脂酰丝氨酸（EPA-pPS）、EPA缩醛磷脂酰肌醇（EPA-pPI）、EPA缩醛磷脂酸（EPA- pPA）的一种或多种混合。
进一步的，所述EPA缩醛磷脂为从海参中提取的EPA缩醛磷脂。
进一步的，所述EPA缩醛磷脂的制备方法包括以下步骤：
1）干海参粉碎后，制成粉末；
2）取海参干粉，在氯仿和甲醇的混合溶液中抽提过夜，过滤后，用氯化钾溶液抽提，静置分层，收集氯仿层，经减压浓缩得到海参脂质粗提取物；
3）将硅胶经活化装柱后，用氯仿平衡硅胶柱 ；再将步骤 2）得到的海参脂质粗提物用氯仿溶解后，缓慢倒入硅胶柱中，依次用氯仿、氯仿-甲醇9：1、丙酮、氯仿-甲醇2：1进行洗脱，收集洗脱液，洗脱液进行薄层硅胶板层析，并用碘和Dittmer试剂显色确认后减压浓缩去除残留有机溶剂即得到海参磷脂；
4）将磷脂酶D和丝氨酸溶于磷酸盐缓冲液中，将步骤3)所得的海参磷脂，溶于乙醚中，二者混合后于40℃水浴中反应6h，利用磷脂酶D不以缩醛磷脂为底物的特点，催化非缩醛型磷脂全部转化为磷脂酰丝氨酸；利用如步骤3）所示的柱层析方法，依次用氯仿-甲醇2：1和甲醇洗脱，其中氯仿-甲醇2：1洗脱液经减压浓缩后，得到缩醛PE（pPE）；甲醇洗脱液经过减压浓缩后，得到缩醛PC（pPC）。
进一步的，所述的改善动脉粥样硬化制品为食品、饲料或药品；其中，所述EPA缩醛磷脂的总添加质量分数在0.5%-2%。
本发明的有益效果：
本发明从海参中提取富含EPA的缩醛磷脂，并对其进行各组分的具体制备，最后进行实验验证各组分的EPA缩醛磷脂对动脉粥样硬化的改善作用。本发明通过磷脂酶D制备EPA缩醛磷脂，进一步进行组分分离制得的pPC和pPE，且纯度均在90%以上。
通过动物实验验证了，本发明制得的各个组分的EPA缩醛磷脂能够非常有效地降低小鼠动脉粥样硬化斑块面积，即EPA缩醛磷脂能明显抑制动脉粥样硬化发展，且EPA-pPE效果最佳；说明了EPA缩醛磷脂能有效预防、改善或治疗动脉粥样硬化。
附图说明
图1为实施例2中EPA缩醛磷脂对小鼠动脉粥样硬化斑块面积的改善结果图。
具体实施方式
以下采用具体实施例并结合附图来详细说明本发明。
实施例1： EPA缩醛磷脂的制备
（1）将市售的北大西洋瓜参经真空冷冻干燥粉碎后，磨成粉末（200目）；
（2）取海参干粉 10kg，加入 100L 氯仿 / 甲醇 (2:1，v/v)，搅拌，过滤，用0.88%的氯化钾溶液抽提，静置分层，收集氯仿层，浸提 3 次，合并浓缩液，经减压浓缩得到海参脂质粗提取物；
（3）称取硅胶 200g，加入 5％的水，120℃下活化 4h，室温冷却；采用湿法装柱，静置待硅胶沉降完全后，用2倍柱体积氯仿进行压柱，使柱中的硅胶更加密实；取50g的海参粗提取物样品用尽量少氯仿溶解后，用滴管转移该溶液，沿着层析柱内壁均匀加入，先用氯仿适当洗5个柱体积后，用氯仿-甲醇9:1的混合液洗2个柱体积，再用丙酮1个柱体积，最后用氯仿-甲醇2：1洗脱，收集洗脱液，洗脱液进行薄层硅胶板层析 (TLC)，展开剂为氯仿 / 甲醇 / 水(80:15:1，v/v)，并用碘和Dittmer试剂显色确认后减压浓缩去除残留有机溶剂即得到海参磷脂提取物；
（4）将200ml的缓冲液（20 mM 醋酸/醋酸钠溶液，含50 mM CaCl2）放入集热式恒温加热磁力搅拌器中预热，分别将 20g的L-丝氨酸溶于其中，加入10g步骤三中的海参磷脂提取物，最后加入3g的40 U/mL 磷脂酶D，在 40 ℃下搅拌反应，反应6h后，加入适量的HCl，灭活酶，反应终止，用正己烷：异丙醇（4:1，v/v）提取反应产物，减压浓缩后，得到PS和缩醛磷脂混合物；
（5）采用（3）中的柱层析方法，分别用氯仿-甲醇2:1、甲醇洗脱，收集洗脱液，其中氯仿-甲醇2：1洗脱液减压浓缩后得到pPE, 甲醇洗脱液减压浓缩后得到pPC。
实施例2：动物实验
1.材料和方法
（1）动物喂养
实验动物采用ApoE-/-小鼠，雄性，9-10周龄，购自南京青紫兰科技有限公司。动物房湿度65±15%，室温23±2℃，12:12 h明暗交替，小鼠可自由摄食和饮水。小鼠在适应性喂养一周后，将小鼠按体重分为 4组 ：模型对照组、EPA-EE、EPA-pPC、EPA-pPE组，每组 8 只，分别喂食相应的饲料。饲料参照 AIN-93M 啮齿动物饲料配方并加以改良，实验组添加 1％的EPA缩醛磷脂，每日记录和统计摄食量，每隔一天称量记录体重变化，连续喂养8周。
（2）动脉粥样硬化斑块面积分析
将小鼠肝脏摘取之后，用眼科剪将右心耳剪开至少量血液流出，注射器由左心室插入，用PBS冲洗滞留在心脏和主动脉中的血液，待血液冲洗完全之后，改用4%的中性甲醛冲洗，固定心脏和主动脉。最后剥离整条主动脉和心脏，使用眼科剪去除黏附在动脉周围的脂肪和结缔组织，于油红O染液中染色10min，用60%异丙醇溶液洗去血管壁上的多余染液，至动脉壁呈透明状为止。最后用眼科剪将整条主动脉纵向剖开，用针灸针固定在泡沫板上，观察脂质堆积情况，用数码相机采集图像。
（2）统计学处理
实验数据以`x ± SEM表示，采用 SPSS 18.0 软件进行Tukey’s test 分析， 以P < 0.05 为有显著差异。
1.实验结果
EPA缩醛磷脂对小鼠动脉粥样硬化斑块面积的影响如图1所示，与模型组相比，EPA缩醛磷脂组别均能明显的降低小鼠动脉粥样硬化斑块面积，且EPA-pPE的效果最佳，提示EPA缩醛磷脂能够预防、改善或治疗动脉粥样硬化。
Claims (2)
1.EPA缩醛磷脂在制备改善动脉粥样硬化制品中的应用；所述EPA缩醛磷脂为从海参中提取的EPA缩醛磷脂；所述的EPA缩醛磷脂为sn-1位脂肪酸与甘油骨架以烯醚键相连，sn-2位所连脂肪酸为EPA的缩醛磷脂；所述EPA缩醛磷脂为EPA缩醛磷脂酰胆碱、EPA缩醛磷脂酰乙醇胺。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的改善动脉粥样硬化制品为食品、饲料或药品；其中，所述EPA缩醛磷脂的总添加质量分数在0.5%-2%。
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