CN102320612A

CN102320612A - 荧光介孔二氧化硅纳米微粒的制备方法及应用

Info

Publication number: CN102320612A
Application number: CN201110137584A
Authority: CN
Inventors: 吕长利; 曲颖; 付玉芹; 何瑶
Original assignee: Northeast Normal University
Current assignee: Northeast Normal University
Priority date: 2011-05-26
Filing date: 2011-05-26
Publication date: 2012-01-18

Abstract

本发明涉及两种荧光介孔二氧化硅纳米微粒的制备方法，属于荧光纳米材料领域。本发明首先采用原位生成的方法，将8-羟基喹啉与络合在介孔二氧化硅内的锌离子直接配位以及将共轭高分子聚对苯撑乙炔前驱体双锍盐直接通过离子交换过程引入介孔二氧化硅纳米粒子内，从而合成得到化学及热力学性质稳定的荧光介孔氧化硅纳米材料，即8-羟基喹啉锌和荧光共轭聚合物功能化的介孔二氧化硅纳米微粒。基于荧光介孔纳米材料的高比表面积，稳定的荧光特性，较好的分散性和生物相容性，以上制备的荧光介孔纳米材料可以应用于药物缓释、细胞标记及基因载体等生物学方面。

Description

荧光介孔二氧化硅纳米微粒的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及两种介孔二氧化硅荧光纳米粒子的制备方法及生物学应用，属于荧光纳米材料技术领域。

背景技术

介孔材料具有均一可调的介孔(2-50nm)孔道、稳定的骨架结构、易于修饰的内表面、一定壁厚且易于掺杂的无定型骨架，以及较高的比表面积。其中介孔SiO₂的热稳定性较高，机械性能稳定，无生物活性和无毒性等众多优点使其在生物学应用中具有极大潜力。特别是介孔二氧化硅纳米微粒由于可被细胞内化，因此可以被用作药物及基因载体，其尺寸小(一般小于300nm)允许通过细胞膜内化，然后将吸附的药物局部释放。目前，人们对介孔二氧化硅材料的研究集中在介孔孔壁的荧光功能化，将磁性粒子引入到孔道内实现外磁场可控以及利用有机硅烷修饰介孔二氧化硅表面，从而加强二氧化硅材料表面和药物分子之间的相互作用力。

本发明以前，将介孔材料荧光功能化常见的方法主要包括直接引入荧光染料、金属配合物，或通过对介孔孔壁改性接枝，在其表面以化学键的方式连接有机发光基团等。这些方法使荧光介孔纳米粒子具有更广泛的生物应用。例如，染料分子、稀土配合物、8-羟基喹啉铝(Alq₃)和半导体纳米晶等已经被引入到介孔材料中来制备荧光介孔纳米材料。例如，最近CN101525533A公开了一种有序介孔二氧化硅基荧光纳米材料的制备方法。采用共嫁接的方法将有机荧光官能团单分散共价嫁接到有序介孔二氧化硅基体的孔道内壁，通过调节荧光官能团的硅烷偶联剂的浓度来调节合成材料的荧光强度。CN 101235285A公开了一种稀土芳香羧酸功能化的红光介孔材料的制备方法。采用二步法，通过溶剂热法合成出配合物后，再将其组装到MCM-41介孔材料的孔道中，从而合成高度有序的红光介孔材料。然而，当前制备的荧光介孔纳米材料大多不容易在水中均匀稳定分散，并且表现出较弱的荧光发射，从而限制了它们在生物学领域中的应用。因此，制备无毒性和高稳定性的荧光功能化介孔二氧化硅纳米材料在实现这一应用中起到关键作用。

本发明分别用八羟基喹啉锌和聚对苯撑乙炔作为发光物质，采用原位生成的方法在介孔二氧化硅纳米粒子中形成荧光物质。获得的高荧光介孔二氧化硅纳米粒子，作为生物检测标记物及载体具有易于识别，单分散性好，粒径可控等优点，在药物缓释、细胞标记及基因载体等生物学领域具有重要的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供两种荧光介孔二氧化硅纳米材料的制备方法，可应用药物缓释，细胞标记及转基因载体等生物学领域。

本发明包括以下四个步骤：

1.巯基功能化的介孔二氧化硅纳米粒子的合成；

2.8-羟基喹啉锌功能化的介孔二氧化硅荧光纳米材料的制备；

3.含聚对苯撑乙炔介孔二氧化硅荧光纳米材料的制备；

4.荧光介孔二氧化硅纳米微粒的生物学应用。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

一、合成巯基功能化介孔二氧化硅纳米粒子：

不同含量巯基功能化的介孔二氧化硅纳米粒子(MSN-SH)的制备：将正硅酸乙酯(TEOS)与巯丙基三乙氧基硅烷(KH-590)和三乙醇胺(TEA)混合均匀，在90℃反应20分钟，然后加入提前预热到60℃的十六烷基三甲基氯化铵(CTACl)溶液，混合物在室温下搅拌4小时。用离心分离，得到固体颗粒样品。每1g样品用100mL模板萃取液在冰浴中超声萃取，最后用蒸馏水洗涤，真空干燥。其中TEOS、KH-590和三乙醇胺(TEA)的摩尔比可为10∶1∶0.19或5∶1∶0.19。模板萃取液是由乙醇和盐酸按体积比8∶1配制。

二、在介孔二氧化硅中原位生成8-羟基喹啉锌配合物：

将上面得到的介孔二氧化硅纳米粒子分散在含有醋酸锌的水溶液中(锌离子浓度为0.05～0.1mol L^-1)，室温搅拌12小时，离心并用乙醇洗几次后得到吸附有锌离子的介孔二氧化硅纳米粒子。然后将得到的样品超声分散在蒸馏水中，并加入8-羟基喹啉的乙醇溶液，在室温下搅拌48小时，离心洗涤获得产物。

三、含聚对苯撑乙炔介孔二氧化硅荧光纳米材料的制备：

(1)不同尺寸含模板剂的二氧化硅纳米粒子的制备：将十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)或十六烷基三甲基氯化铵(CTACl)表面活性剂、水和乙醇混合，搅拌10分钟后加入三乙醇胺(TEA)，搅拌至全部溶解。分别取20mL上述储备液加热到60～80℃时，加入正硅酸乙酯(TEOS)，恒温搅拌2h，离心并用水洗涤后分散在甲醇溶液中保存，TEOS∶CTAC(CTAB)∶TEA∶H₂O的摩尔比为1∶0.178∶8∶120。

(2)含有聚对苯撑乙炔双锍盐前驱体的介孔二氧化硅纳米粒子的制备：将双锍盐前驱体与(1)步骤得到的二氧化硅纳米粒子在甲醇中混合，反应温度75℃，反应时间5小时。其中双锍盐前驱体与二氧化硅纳米粒子的质量比为1.167∶100～0.611∶100。

(3)溶液聚合：将(2)合成的含有不同含量双锍盐的二氧化硅纳米粒子在高沸点的溶剂中超声分散后，通N₂并控温在220～240℃，反应4～6小时后加环己烷离心，洗涤，真空干燥。其中高沸点的溶剂可为十八烯，液体石蜡或聚乙二醇600中的一种。

(4)将(3)步骤得到的二氧化硅纳米粒子用模板萃取液在冰水浴中超声处理3次，除去残留表面活性剂，得到含聚对苯撑乙炔的荧光介孔二氧化硅纳米粒子，最终荧光介孔二氧化硅纳米粒子中聚对苯撑乙炔(PPV)的含量为7～16wt％。

(5)将(4)步骤得到的荧光介孔二氧化硅纳米粒子用有机硅氧烷功能化的聚乙二醇(SiPEG)亲水接枝改性：分别用不同分子量的PEG₆₀₀和PEG₆₀₀₀与对甲苯磺酰氯及3-氨丙基三甲氧基硅完反应合成SiPEG。将SiPEG与荧光介孔二氧化硅纳米微粒(二者质量比为6∶1～3∶1的)加入到体积比为1∶1的水和乙醇溶液中，室温搅拌24～48小时，离心洗涤即可获得接枝SiPEG荧光介孔二氧化硅纳米粒子。

四、荧光介孔二氧化硅纳米粒子的生物学应用：

(1)用于布洛芬(IBU)和万古霉素药物的缓释应用：布洛芬或古霉素药物在介孔二氧化硅纳米粒子的正己烷溶液中装载，负载量为8-11wt％；然后进行压片处理，并在37℃，pH＝7.4的模拟体液中缓释，在48h内缓释量为35-41wt％。

(2)海拉细胞和猪肾细胞的荧光标记应用：荧光介孔二氧化硅纳米粒子溶液的浓度为1mg/mL，荧光介孔二氧化硅纳米粒子对于两种细胞的导入率在48小时达到最高，为80％。

(3)海拉细胞和猪肾细胞的转基因载体应用：荧光介孔二氧化硅纳米粒子溶液的浓度为1mg/mL，用1mg/mL多聚赖氨酸溶液修饰纳米粒子表面，二者质量比可为20∶1，10∶1或5∶1，其中最佳质量比为10∶1。PLL修饰的荧光介孔二氧化硅纳米粒子与pEGFP质粒(绿色荧光蛋白表达质粒)按30∶1，20∶1，10∶1和5∶1的质量比进行混匀。海拉细胞和猪肾细胞培养48小时后，30-40％细胞表达了绿色荧光蛋白。

具体实施方式

下面结合实例对本发明进一步说明，而不仅局限于实施例。

实施例1

巯基功能化介孔二氧化硅纳米粒子的制备(MSN-SH₁)：

将28.6g三乙醇胺(TEA)，4.46mL(20mmol)正硅酸乙酯(TEOS)和0.38mL(2mmol)巯丙基三乙氧基硅烷(KH-590)混合，在油浴中加热至90℃，20min后与加热至60℃的53.4g CTACl水溶液(CTACl，2.5wt％)混合，搅拌速度600转/min，维持温度在23℃，持续搅拌4小时。反应结束后，加入100mL乙醇沉淀，所得样品在9500转/min下离心15min。离心所得样品每次用模板萃取液(乙醇与盐酸体积比为8∶1)冰水浴超声萃取模板三次，每次超声30min，离心并分别用水洗2次，乙醇洗涤1次后，室温真空干燥，即得介孔二氧化硅纳米粒子(MSN-SH₁)。BET比表面积为1134m²g^-1，孔体积为0.66cm³g^-1。

实施例2

巯基功能化介孔二氧化硅纳米粒子的制备(MSN-SH₂)：

用2.23g(10mmol)TEOS和0.38mL(2mmol)巯丙基三乙氧基硅烷(KH-590)替代实施例1中投料比，采用CTAB为模板剂。其他实验条件和方法如实施例1所述。获得的介孔二氧化硅纳米粒子(MSN-SH₂)的BET比表面积为765m²g^-1，孔体积为0.43cm³g^-1。

实施例3

8-羟基喹啉锌功能化的介孔二氧化硅纳米粒子(MSN-SH₁-Znq)：

将巯基功能化介孔二氧化硅纳米粒子(MSN-SH₁)1.0g分散在100mL 0.05mol L^-1醋酸锌水溶液中，室温下搅拌12小时，离心分离、洗涤，得到吸附有锌离子的介孔二氧化硅纳米粒子(Zn-MSN-SH₁)。将0.7g的Zn-MSN-SH₁分散在蒸馏水中，然后加入100mL 4.7×10^-3mol L^-1的八羟基喹啉的乙醇溶液，接着在室温下搅拌48小时，离心洗涤，室温真空干燥。BET比表面积1078m²g^-1，孔体积：0.64cm³g^-1；350nm激发下的荧光发射在506nm。具有优异的荧光稳定性，在pH＝3和pH＝10的水溶液中的荧光强度可保持3个月以上不变。

实施例4

8-羟基喹啉锌功能化的介孔二氧化硅纳米粒子(MSN-SH₁-Znq₂)：

将巯基功能化介孔二氧化硅纳米粒子(MSN-SH₁)1.0g分散在100mL 0.1mol L^-1硝酸锌水溶液中，室温下搅拌12小时，离心分离、洗涤，得到吸附有锌离子的介孔二氧化硅纳米粒子(Zn-MSN-SH₁)。将0.4g的Zn-MSN-SH₁分散在蒸馏水中，然后加入100mL 5.4×10^-3mol L^-1的八羟基喹啉乙醇溶液，接着在室温下搅拌48小时，离心洗涤，室温真空干燥。BET比表面积为1070m²g^-1，孔体积为0.62cm³g^-1；350nm激发下的荧光发射在503nm。

实施例5

8-羟基喹啉锌功能化的介孔二氧化硅纳米粒子(MSN-SH₂-Znq)：

将巯基功能化介孔二氧化硅纳米粒子(MSN-SH₂)1.0g分散在180mL 0.05mol L^-1醋酸锌水溶液中，室温下搅拌12小时，离心分离、洗涤，得到吸附有锌离子的介孔二氧化硅纳米粒子(Zn-MSN-SH₂)。将0.8g的Zn-MSN-SH₂分散在蒸馏水中，然后加入100mL 8×10^-3mol L^-1的八羟基喹啉的乙醇溶液，接着在室温下搅拌48小时，离心洗涤，室温真空干燥。BET比表面积为668m²g^-1，孔体积为0.37cm³g^-1；350am激发下的荧光发射在511nm。

实施例6

1.含模板剂的二氧化硅纳米粒子的合成：

将64mL蒸馏水，10.5mL乙醇和10.4mL25wt％CTACl溶液混合，室温搅拌10min，再加入4.1mL三乙醇胺(TEA)，搅拌直至全部溶解。取出20mL储备液加热到60℃，在搅拌条件下将1.5mL TEOS加入到上面的溶液中继续反应2小时。离心分离，真空干燥，即得平均粒径为60nm的含模板剂的二氧化硅纳米粒子。

2.含聚对苯撑乙炔的荧光介孔二氧化硅纳米粒子的合成：

在甲醇溶液中，加入0.21g二氯苄双锍盐和18g上面合成的含模板剂的介孔二氧化硅纳米粒子，将混合物加热回流5小时后冷至室温。离心10分钟(9500转/分)，再用甲醇反复洗涤3次，干燥得苍白色粉末。将苍白色粉末超声20分钟分散到25mL十八烯中，先室温通N₂20分钟，然后升温至220℃，反应6h。冷却后加少量环己烷离心，再用乙醇反复洗涤2次，最终得到的黄色粉末用15mL浓盐酸和120mL乙醇混合液萃取2次即得样品。最终得到的介孔二氧化硅纳米粒子中含聚对苯撑乙炔的质量分数为16％。BET比表面积368m²g^-1，孔体积为0.42cm³g^-1；340nm激发下的荧光发射在496nm。

实施例7

1.含模板剂的二氧化硅纳米粒子的合成方法如实施例6所述。

2.含聚对苯撑乙炔的荧光介孔二氧化硅纳米粒子的制备：

将0.11g二氯苄双锍盐和18g含模板剂的介孔二氧化硅纳米粒子加入甲醇溶液中，将混合物加热至75℃回流5小时后冷至室温。离心10分钟(9500转/分)，再用甲醇反复洗涤3次，干燥得苍白色粉末。将苍白色粉末超声20分钟分散到25mL液体石蜡中，先室温通N₂20分钟，然后升温至240℃，反应4h。冷却后加少量环己烷离心，再用乙醇反复洗涤2次，最终得到的黄色粉末用15mL浓盐酸和120mL乙醇混合液萃取2次即得样品。最终得到的介孔二氧化硅纳米粒子中含聚对苯撑乙炔的质量分数为7％。补充光学数据：340nm激发下的荧光发射在459nm。

实施例8

1.含模板剂的二氧化硅纳米粒子的合成方法如实施例6所述。

2.含聚对苯撑乙炔的荧光介孔二氧化硅纳米粒子的制备：

投料比和反应过程同实施例6，仅用聚乙二醇600代替十八烯作为反应介质。最终得到的介孔二氧化硅纳米粒子中含聚对苯撑乙炔的质量分数为10％。

实施例9

1.SiPEG的合成：

分别将30g PEG₆₀₀₀溶于10mL THF中，0.864g NaOH溶于40mLH₂O中，混合上述两种溶液，0℃时搅拌1h，其间加入1.37g TsCl溶于10mL THF，再搅拌3h。混合物倒入1mol/L HCl中，蒸馏，移除溶剂。用25mL氯仿萃取3遍，合并有机相，加入MgSO₄干燥24h，蒸馏，移除溶剂。加入1.4mL 3-氨丙基三甲氧基硅烷(KH-550)溶于25mL氯仿，70℃回流8h后，蒸馏，移除溶剂，即得SiPEG₆₀₀₀。

2.聚对苯撑乙炔介孔二氧化硅荧光纳米材料的表面PEG修饰：

将1g聚对苯撑乙炔的荧光介孔二氧化硅纳米粒子分散在20mL水和20mL乙醇的混合溶液中，将6g SiPEG₆₀₀₀，20mL水，20mL乙醇混合均匀，室温搅拌24h。离心洗涤3次，即得样品。

实施例10

1.SiPEG₆₀₀的合成方法如实施例9所述。.

2.聚对苯撑乙炔介孔二氧化硅荧光纳米材料的表面PEG修饰：

将1g聚对苯撑乙炔的荧光介孔二氧化硅纳米粒子分散在20mL水和20mL乙醇的混合溶液中，将3g SiPEG₆₀₀，20mL水，20mL乙醇混合均匀，室温搅拌48h。离心洗涤3次，即得样品。

实施例11

1.布洛芬(IBU)药物负载：

用0.6g 8-羟基喹啉锌功能化的介孔二氧化硅纳米粒子(MSN-SH₁-Znq)为载体，加入25.7mL 35mg/mL布洛芬(IBU)的正己烷溶液，室温25℃搅拌24小时，离心分离，用正己烷洗3次，除去吸附在外表面的布洛芬，60℃真空干燥10小时。热失重分析表明负载布洛芬的量为11wt％。

2.布洛芬(IBU)药物缓释：

对装载布洛芬的样品MSN-SH₁-Znq-IBU进行压片处理：取(1)步骤得到的样品300mg在压片机中制成直径为11mm，厚度为2mm的药片形状。放入60mL的模拟体液(SBF)中，缓释过程中保持温度37℃，pH＝7.4，搅拌速度100转/分。按照预先设定的时间间隔，每次取3.0mL清液并立即补充等体积等温度的新鲜体液(SBF)，注意保持体积恒定。通过波长在263am紫外分光光度计监测在模拟体液中药物释放浓度。缓释结果表明：在48h内释放出41％的IBU。

实施例12

1.布洛芬(IBU)药物负载：

用0.6g 8-羟基喹啉锌功能化的介孔二氧化硅纳米粒子(MSN-SH₁-Znq₂)为载体，布洛芬(IBU)药物负载方法如实施例11所述。热失重分析表明负载布洛芬的量为8wt％。

2.布洛芬(IBU)药物缓释：

装载布洛芬的样品MSN-SH₁-Znq₂-IBU的压片处理及缓释方法如实施例11所述。缓释结果表明：在48h内释放出35％的IBU。

实施例13：

1.万古霉素药物负载：

用0.6g 8-羟基喹啉锌功能化的介孔二氧化硅纳米粒子(MSN-SH₂-Znq)为载体，万古霉素药物负载方法如实施例11所述。热失重分析表明负载布洛芬的量为10wt％。

2.万古霉素药物缓释：

装载万古霉素的样品MSN-SH₂-Znq-IBU的压片处理及缓释方法如实施例11所述。缓释结果表明：在48h内释放出37％的IBU。

实施例14：

1.布洛芬(IBU)药物负载：

用0.6g含聚对苯撑乙炔的荧光介孔二氧化硅纳米粒子为载体，布洛芬(IBU)药物负载方法如实施例11所述。热失重分析表明负载布洛芬的量为5wt％。

2.布洛芬(IBU)药物缓释：

装载布洛芬样品的压片处理及缓释方法如实施例11所述。缓释结果表明：在48h内释放出40％的IBU。

实施例15

荧光介孔二氧化硅纳米粒子标记动物细胞：

1.取1mg荧光介孔二氧化硅纳米粒子，加入pH＝7.2的磷酸钠缓冲液1mL，置于300W，40KHz的超声波仪中进行超声分散60min，制备1mg/mL荧光介孔二氧化硅纳米粒子溶液。紫外照射30min。

2.取100μL上述1mg/m L荧光介孔二氧化硅纳米粒子溶液分别与饥饿处理的hela细胞(海拉细胞)和PK细胞(猪肾细胞)各1mL，37℃共培养。用激光共聚焦显微镜检测24h，48h和72h两种细胞中荧光介孔二氧化硅纳米粒子的导入率。结果表明：荧光介孔二氧化硅纳米粒子在48小时时对两种细胞有最高导入率，导入率达70-80％。

实施例16

荧光介孔二氧化硅纳米粒子作为基因载体介导外源基因转化动物细胞：

1.取1mg荧光介孔二氧化硅纳米粒子，加入pH＝7.2的磷酸钠缓冲液1mL，置于300W，40KHz的超声波仪中进行超声分散60min，制备1mg/m L荧光介孔二氧化硅纳米粒子溶液。

2.取超声分散好的1mg/m L荧光介孔二氧化硅纳米粒子溶液，与1mg/mL多聚赖氨酸按质量比为20∶1，10∶1和5∶1的比例进行充分混匀后，室温放置1小时。Z电位仪分析多聚赖氨酸修饰后的荧光介孔二氧化硅纳米粒子的表面电荷。结果表明：荧光介孔二氧化硅纳米粒子与多聚赖氨酸的质量为10∶1时，Z电位值最高。

3.取按步骤1和2所制备的多聚赖氨酸修饰的荧光介孔二氧化硅纳米粒子紫外照射30min后，与pEGFP质粒(绿色荧光蛋白表达质粒)按30∶1，20∶1，10∶1和5∶1的质量比进行混匀，室温放置30min。琼脂糖凝胶电泳检测荧光介孔二氧化硅纳米与pEGFP质粒的结合状况，发现当结合比例为5∶1时，点样孔内的DNA有溢出现象，说明加入pEGFP质粒的过量。结果说明经多聚赖氨酸修饰的荧光介孔二氧化硅纳米粒子能够有效地与DNA分子结合。

4.取按步骤3制备的多聚赖氨酸修饰的荧光介孔二氧化硅纳米粒子与pEGFP质粒的复合物(质量比为10∶1)100μL，分别与饥饿处理的hela细胞和PK细胞各1mL，37℃共培养。用激光共聚焦显微镜检测共培养24h，48h和72h后绿色荧光蛋白的表达效率。结果在共培养48小时后，检测到30-40％细胞表达了绿色荧光蛋白。

Claims

1.荧光介孔二氧化硅纳米微粒的制备方法及生物学应用，其特征在于：纳米微粒尺寸为40-150纳米，孔径2-5纳米，比表面积＞150m²g^-1。8-羟基喹啉配合物及荧光共轭高分子在二氧化硅介孔孔道中采用原位生成的方法制备。荧光介孔二氧化硅纳米微粒可应用于药物缓释，细胞标记及转基因载体应用。

2.按照权利要求1所述的荧光介孔二氧化硅纳米微粒的制备方法，其特征在于：所述的8-羟基喹啉配合物为8-羟基喹啉与锌离子形成的配合物，包括下述步骤：

(a)将正硅酸乙酯和硅烷偶联剂按摩尔比5∶1或10∶1混合后加入三乙醇胺，在90℃下搅拌使其完全溶解，加入温度为60℃的表面活性剂溶液，混合液室温下搅拌4小时，离心分离，用体积比8∶1的乙醇和盐酸溶液除去表面活性剂，得到巯基功能化的介孔二氧化硅纳米粒子。

(b)将(a)步骤得到的介孔二氧化硅纳米粒子分散在含有锌离子水溶液中，室温搅拌12小时，离心分离，得到吸附有锌离子的介孔二氧化硅纳米粒子，随后分散在水中，加入八羟基喹啉的乙醇溶液，在室温下搅拌48小时，在介孔二氧化硅纳米粒子中原位生成8-羟基喹啉锌配合物。

3.按照权利要求1荧光介孔二氧化硅纳米微粒的制备方法，其特征在于，所述的荧光共轭高分子为聚对苯撑乙炔，包括下述步骤：

(a)在预先合成的未萃取模板剂的二氧化硅纳米粒子的甲醇溶液中直接加入聚对苯撑乙炔的双锍盐前驱体，75℃下搅拌5小时，通过离子交换过程将双锍盐引入到二氧化硅纳米粒子中。

(b)将(a)步骤得到的二氧化硅纳米粒子在高沸点液体中高温溶液聚合，在介孔二氧化硅纳米粒子中原位生成聚对苯撑乙炔共轭高分子。

(c)将(b)步骤得到的二氧化硅纳米粒子用体积比8∶1的乙醇和盐酸混合溶液除去残留表面活性剂，得到含聚对苯撑乙炔的荧光介孔二氧化硅纳米粒子。

(d)将(c)步骤得到的荧光介孔二氧化硅纳米粒子用对有机硅氧烷功能化的聚乙二醇(SiPEG)亲水接枝改性。

4.按照权利要求2或3所述的荧光介孔二氧化硅纳米微粒的制备方法，其特征在于：合成用的硅烷偶联剂为γ-巯丙基三甲氧基硅烷。表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵或十六烷基三甲基氯化铵中的一种，模板剂与硅氧烷的物质的量比为0.08～0.3。

5.按照权利要求2所述的荧光介孔二氧化硅纳米微粒的制备方法，其特征在于：所用锌源为醋酸锌或硝酸锌中的一种，锌离子溶液浓度为0.05～0.1mol L^-1，锌离子在介孔二氧化硅球中的质量含量为2.41～6.44％。

6.按照权利要求3所述的荧光介孔二氧化硅纳米微粒的制备方法，其特征在于：反应介质使用高沸点的溶剂包括十八烯，液体石蜡或聚乙二醇600中的一种，反应温度为220～240℃，反应时间为4～6h。介孔二氧化硅中引入的聚对苯撑乙炔的质量分数为7～16％。

7.按照权利要求3所述的荧光介孔二氧化硅纳米微粒的制备方法，其特征在于：在水和乙醇的混合溶液中，用SiPEG对荧光介孔二氧化硅纳米微粒进行亲水接枝改性时，SiPEG与荧光介孔二氧化硅纳米微粒的质量比为6∶1～3∶1，室温反应时间为24～48小时。

8.按照权利要求1所述的荧光介孔二氧化硅纳米微粒的制备方法及生物学应用，其特征在于：可用于布洛芬(IBU)和万古霉素等的缓释。

9.按照权利要求1所述的荧光介孔二氧化硅纳米微粒的制备方法及生物学应用，其特征在于可作为海拉细胞和猪肾细胞的荧光标记及转基因载体应用。